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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023083233
(43)【公開日】2023-06-15
(54)【発明の名称】大腸ガン細胞の浸潤阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/37 20060101AFI20230608BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230608BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/7032 20060101ALI20230608BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230608BHJP
【ＦＩ】
A61K31/37
A61P1/00 ZNA
A61P35/00
A61K31/7032
A61P43/00 121
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022188196
(22)【出願日】2022-11-25
(31)【優先権主張番号】P 2021197387
(32)【優先日】2021-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501333397
【氏名又は名称】公益財団法人河野臨牀医学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000800
【氏名又は名称】弁理士法人創成国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】常盤 孝義
(72)【発明者】
【氏名】山崎 泰助
(72)【発明者】
【氏名】横山 孝
(72)【発明者】
【氏名】松崎 安孝
(72)【発明者】
【氏名】勅使河原 大吾
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA19
4C086EA07
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】大腸ガン細胞の浸潤を阻害するのに有用な新規素材を提供する。
【解決手段】イソフラキシジン及びクロロゲン酸を有効成分とする大腸ガン細胞の浸潤阻害剤である。この阻害剤にあっては、大腸ガン細胞に対し毒性を示さずに浸潤阻害を示す有効濃度範囲を有することが好ましい。また、大腸ガン細胞のＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するものであることが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】イソフラキシジン及びクロロゲン酸を有効成分とする大腸ガン細胞の浸潤阻害剤である。この阻害剤にあっては、大腸ガン細胞に対し毒性を示さずに浸潤阻害を示す有効濃度範囲を有することが好ましい。また、大腸ガン細胞のＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するものであることが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イソフラキシジン及びクロロゲン酸を有効成分とする大腸ガン細胞の浸潤阻害剤。
【請求項2】
大腸ガン細胞に対し毒性を示さずに浸潤阻害を示す有効濃度範囲を有する、請求項１記載の大腸ガン細胞の浸潤阻害剤。
【請求項3】
大腸ガン細胞のＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するものである、請求項１又は２記載の大腸ガン細胞の浸潤阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大腸ガン細胞の浸潤阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ガン浸潤転移は腫瘍関連死の９０％以上に関与しているといわれ、ガン浸潤転移抑制剤の開発は喫緊の課題である。種々のガンにおける浸潤転移においては、ガン細胞自身が産生するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の関与がしばしば指摘されている。ＭＭＰは、基底膜や間質成分を分解するタンパク分解酵素群であり、現在２０種以上が知られている。創傷治癒などの生理現象のみならず、炎症やガンの進行などの病的過程にも関与していることが知られている。例えば、ＭＭＰ７には、ガン細胞の浸潤転移抑制の防壁となっている生体基底膜を破壊する働きがあり、ガン細胞はその破壊された基底膜を潜り抜けて浸潤転移することが考えられている。また、大腸ガンの場合、特にＭＭＰ７発現の増強とステージの進展との関連が指摘されている（非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｍｅｈｌｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．「Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ａ ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｆｅ ｏｒ ｄｅａｔｈ」Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ６：ｐ４４９－４５８（２００６）
【非特許文献2】Ｍｏｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」Ｃａｎｃｅｒ ７５：ｐ１５１６－１５１９（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従来技術に鑑み、本発明の目的は、大腸ガン細胞の浸潤を阻害するのに有用な新規素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記目的を達成するため、本発明者らは、種々研究した結果、漢方生薬である五加皮の原料となるエゾウコギの成分として知られているイソフラキシジンならびにクロロゲン酸には、大腸ガン細胞の浸潤を阻害する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
すなわち、本発明は、イソフラキシジン及びクロロゲン酸を有効成分とする大腸ガン細胞の浸潤阻害剤を提供するものである。
【0007】
本発明による大腸ガン細胞の浸潤阻害剤においては、大腸ガン細胞に対し毒性を示さずに浸潤阻害を示す有効濃度範囲を有するものであることが好ましい。
【0008】
また、大腸ガン細胞のＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、植物由来成分であるイソフラキシジンならびにクロロゲン酸を利用して、大腸ガン細胞の浸潤を阻害するのに有用な新規素材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】試験例１において、ＭＴＴ試験法によりＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）に対するイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸による毒性を調べた結果を示す図表である。
【図2】試験例１において、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸で処理したＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）の位相差顕微鏡像である。
【図3】試験例２において、マトリゲルをコーティングしたインサートメンブレンに備わる細孔の周縁にＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）の存在を認めた場合、有効な浸潤が認められたとみなし、インサートあたりの細孔数をカウントした結果を示す図表である。
【図4】試験例２において、マトリゲルをコーティングしたインサートメンブレンの細孔の周縁に浸潤したＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）の浸潤像である。
【図5】試験例３において、ＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）におけるＭＭＰ７遺伝子のｍＲＮＡ発現量におよぼすイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の影響をリアルタイムＰＣＲにより調べた結果を示す図表である。
【図6】試験例４において、活性型ＭＭＰ７に対する特異抗体を用いてＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）の表面におけるＭＭＰ７タンパク質の発現におよぼすイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の影響を調べた結果を示す図表である。
【図7】試験例５において、ＥＲＫ１／２タンパク質あるいはリン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質に対する特異抗体を用いてＨＴ－２９細胞（大腸ガン細胞）におけるＥＲＫ１／２のリン酸化におよぼすイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の影響を調べた結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤は、イソフラキシジン及びクロロゲン酸を用いて、これをヒト又はヒト以外の動物に投与することで、大腸ガン細胞の浸潤を阻害しようとするものである。
【0012】
このとき、大腸ガン細胞に対し毒性を示さないものであることが好ましい。ここで、毒性を示さないとは、通常のＭＴＴ試験において、イソフラキシジンないしはクロロゲン酸の濃度０～２００μＭの範囲で、生細胞数に応じて測定されるシグナルに影響がないことをいう。また、大腸ガン細胞のＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するものであることが好ましい。ここで、ＭＭＰ７遺伝子の発現を抑制する作用を有するとは、通常の培養培地にイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の濃度０～２００μＭの範囲で添加したとき、添加しない場合に比べて有意にＭＭＰ７遺伝子のｍＲＮＡあるいは活性型ＭＭＰ７タンパクの発現量が低下することをいう。
【0013】
本発明に用いるイソフラキシジンないしはクロロゲン酸は、漢方生薬である五加皮の原料となるエゾウコギの成分として知られており、人体に対する摂取の安全性についてはすでに一定の評価が確立している化合物である。
【0014】
本発明において、イソフラキシジンないしはクロロゲン酸は、合成物でもよく、植物等の天然資源に由来するものであってもよい。また、薬学的に許容される各種形態、例えば、塩、溶媒和物、エーテル化物、エステル化物等であってもよい。あるいは、所定量のイソフラキシジンないしはクロロゲン酸を含むように調製された植物エキスなどのイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材であってもよい。よって、例えば、エゾウコギからの植物エキスなども好ましく使用され得る。すなわち、任意の素材の形態で生体に投与したとき、これに含まれるイソフラキシジンないしはクロロゲン酸が有効に作用するようにすればよい。
【0015】
植物からイソフラキシジンないしはクロロゲン酸を抽出するには、当業者に周知の一般的な手段を採用することができ、例えば、植物の乾燥物を適当な大きさに裁断して、抽出溶媒を加えて、所定時間、浸漬、加熱、加圧、減圧等の条件下に作用させたうえで、固液分離して、液部を回収することなどの方法が挙げられる。植物部位としては、特に制限はなく、例えば、枝、幹、葉、樹皮、根、茎、花、種子、果実、地上部、地下部、全木などが挙げられる。例えば、エゾウコギから抽出する場合には、これらの中でも根茎、根皮が好ましく、特には根皮が好ましい。得られた抽出液は、減圧濃縮したり、凍結乾燥したりして、使用した抽出溶媒を除去して、目的とする抽出物を調製することができる。乾燥手段は、減圧乾燥や噴霧乾燥であってもよい。抽出溶媒としては、例えば、水、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトン、ｎ－ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられる。これら有機溶媒は二種以上を混合して用いることもできる。また、水と有機溶媒との混合含水溶媒を用いてもよい。得られた一次的な抽出物は、これをゲルろ過、ＨＰＬＣクロマトグラフィーなど、当業者に周知の分離手段に供して、更にイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の濃度を高めてもよい。
【0016】
以上に説明したように、本発明に用いるイソフラキシジンないしはクロロゲン酸としては、植物エキスやエキス末など、イソフラキシジンないしはクロロゲン酸を所定量で含有するイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材を用いてもよい。この場合、該素材中のイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有量としては、乾燥物換算での含有量として、例えば、０．００１～９９．９質量％の範囲であってよく、０．１～５０質量％の範囲であってよく、１０～３０質量％の範囲であってよい。
【0017】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤の投与量は、対象者の健康状態や年齢などに応じて適宜設定すればよく、特に制限はない。典型的に、例えば、イソフラキシジンないしはクロロゲン酸の摂取量として、０．００１ｍｇ～１００ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、０．０１ｍｇ～２０ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよく、０．１ｍｇ～１０ｍｇ／日／ｋｇ体重の範囲であってよい。
【0018】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤の投与方法は、特に限定されず、例えば、対象者が自身の生活状況に合わせて経口的に摂取するようにしてもよい。あるいは、医療行為者の処方に従い、経口、注射、経腸、病巣局所への投与等、医療的な方法であってもよい。この場合、上記したイソフラキシジンないしはクロロゲン酸、又はそれを含むイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材の各種の形態とした場合の含有量は、それが使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよい。典型的に、例えば、任意の形態中の乾燥物換算での含有量にして、０．００１～９９．９質量％の範囲であってよく、０．１～５０質量％の範囲であってよく、１０～３０質量％の範囲であってよい。また、イソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有量に換算して、０．００１～９９．９質量％の範囲であってよく、０．１～５０質量％の範囲であってよく、１０～３０質量％の範囲であってよい。
【0019】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤は、食品組成物の形態で提供されてもよい。すなわち、上記したイソフラキシジンないしはクロロゲン酸、又はそれを含むイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材を、そのまま、あるいは他の食品用原料と組み合わせて、大腸ガン細胞の浸潤阻害のための食品組成物と成してもよい。例えば、健康食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品などに利用してもよい。この場合、例えば、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、ドリンク、ゼリーなどの形態で提供されてもよい。
【0020】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤は、医薬組成物の形態で提供されてもよい。すなわち、上記したイソフラキシジンないしはクロロゲン酸、又はそれを含むイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材を、そのまま、あるいは他の医薬用原料と組み合わせて、大腸ガン細胞の浸潤阻害のための医薬組成物と成してもよい。上記したイソフラキシジンないしはクロロゲン酸、又はそれを含むイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材に組み合わせる他の医薬用原料に特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤等の形態にして、これを経口剤として利用することができる。
【0021】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤は、動物食餌組成物の形態で提供されてもよい。すなわち、上記したイソフラキシジンないしはクロロゲン酸、又はそれを含むイソフラキシジンないしはクロロゲン酸の含有素材を、そのまま、あるいは他の動物飼料用原料と組み合わせて、大腸ガン細胞の浸潤阻害のための動物食餌組成物と成してもよい。例えば、家畜、競走馬、鑑賞用動物、ペット等、動物用の飼料に利用してもよい。
【0022】
本発明にかかる大腸ガン細胞の浸潤阻害剤は、限定されないが、例えば、大腸ガンと診断された患者であってステージ０、I、又はＩＩの進行度と診断された患者に適用されることが好ましい。これによれば、大腸の上皮側に生じた病巣が大腸壁の深部に進達するのを防いで、ガンの進行度が悪化するのを効果的に防ぐことができる。ただし、ステージＩＩを超える進行度と診断された患者への適用が妨げられるものではない。また、他の抗ガン剤と併用してもよい。
【実施例0023】
以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0024】
〔１．細胞〕
ヒト大腸ガン由来細胞株であるＨＴ－２９細胞（ＪＣＲＢ０２２４、別名ＷｉＤｒ）を、ＪＣＲＢ細胞バンク（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所）から入手し、使用した。
ヒト大腸ガン由来細胞株であるＨＴ－２９細胞（ＪＣＲＢ０２２４、別名ＷｉＤｒ）を、ＪＣＲＢ細胞バンク（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所）から入手し、使用した。
【0025】
〔２．培地〕
ＤＭＥＭ：Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｇｉｂｃｏ社製）
ＤＭＥＭ：Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Ｇｉｂｃｏ社製）
【0026】
〔３．試薬〕
イソフラキシジン（ｉｓｏｆｒａｘｉｄｉｎ）（分子量２２２．１９）（富士フィルム和光試薬社製）
クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）（分子量３５４．３１）（関東化学社製）
ＴＰＡ：１２－Ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ａｃｅｔａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
ＭＴＴ：３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（富士フィルム和光試薬社製）
イソフラキシジン（ｉｓｏｆｒａｘｉｄｉｎ）（分子量２２２．１９）（富士フィルム和光試薬社製）
クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）（分子量３５４．３１）（関東化学社製）
ＴＰＡ：１２－Ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ａｃｅｔａｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
ＭＴＴ：３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（富士フィルム和光試薬社製）
【0027】
〔４．細胞の継代・培養〕
細胞は、入手時点で大量に培養して凍結保存したものを、使用時に融解して実験に供した。培地は、牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を１０％濃度で添加したＤＭＥＭ培地、又は牛胎児血清非添加のＤＭＥＭ培地を用いた。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。細胞の継代には０．２５％トリプシン－１ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（富士フィルム和光純薬）を使用した。
細胞は、入手時点で大量に培養して凍結保存したものを、使用時に融解して実験に供した。培地は、牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を１０％濃度で添加したＤＭＥＭ培地、又は牛胎児血清非添加のＤＭＥＭ培地を用いた。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。細胞の継代には０．２５％トリプシン－１ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（富士フィルム和光純薬）を使用した。
【0028】
〔５．ＭＴＴ試験〕
ＭＴＴ試験は、化学物質の毒性を細胞死として検出する試験法である。同法はＭＴＴ（テトラゾリウム塩化合物）がミトコンドリア内膜の脱水素酵素によって分解され、生成されるホルマザンが生細胞数に比例することを原理としている。
ＭＴＴ試験は、化学物質の毒性を細胞死として検出する試験法である。同法はＭＴＴ（テトラゾリウム塩化合物）がミトコンドリア内膜の脱水素酵素によって分解され、生成されるホルマザンが生細胞数に比例することを原理としている。
【0029】
〔６．細胞浸潤試験〕
細胞浸潤試験は、ガン細胞の浸潤を阻害する候補物質のスクリーニングに向けた定量性のあるシステムである。Ｆａｌｃｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のメンブレンに、基底膜マトリゲルをコートし、ガン細胞の浸潤を評価する。
細胞浸潤試験は、ガン細胞の浸潤を阻害する候補物質のスクリーニングに向けた定量性のあるシステムである。Ｆａｌｃｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のメンブレンに、基底膜マトリゲルをコートし、ガン細胞の浸潤を評価する。
【0030】
〔７．リアルタイムＰＣＲ〕
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニターして解析する方法であり、電気泳動が不要で、迅速性、定量性などで優れた方法である。専用ＰＣＲ装置として、小型リアルタイムＰＣＲ装置（「ＭｙＧｏ Ｍｉｎｉ Ｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ」、ＩＴ－ＩＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニターして解析する方法であり、電気泳動が不要で、迅速性、定量性などで優れた方法である。専用ＰＣＲ装置として、小型リアルタイムＰＣＲ装置（「ＭｙＧｏ Ｍｉｎｉ Ｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ」、ＩＴ－ＩＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。
【0031】
〔８．免疫細胞染色〕
活性型ＭＭＰ７に対する特異抗体（ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、１：５００）を用いた免疫染色により、大腸ガン細胞の表面における活性型ＭＭＰ７の動向を検出した。
活性型ＭＭＰ７に対する特異抗体（ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、１：５００）を用いた免疫染色により、大腸ガン細胞の表面における活性型ＭＭＰ７の動向を検出した。
【0032】
〔９．ウエスタンブロット〕
ウエスタンブロットは、タンパク質サンプル中に含まれる特定のタンパク質の発現量を特異抗体を用いて確かめるために使われる方法である。細胞増殖制御などに関わる細胞内シグナル経路として知られるＥＲＫ１/２のリン酸化について検討する。
ウエスタンブロットは、タンパク質サンプル中に含まれる特定のタンパク質の発現量を特異抗体を用いて確かめるために使われる方法である。細胞増殖制御などに関わる細胞内シグナル経路として知られるＥＲＫ１/２のリン酸化について検討する。
【0033】
＜試験例１＞ 〔ＭＴＴ試験〕
大腸ガン由来細胞株であるＨＴ－２９細胞において、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸による細胞毒性についてＭＴＴ試験法により調べた。
大腸ガン由来細胞株であるＨＴ－２９細胞において、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸による細胞毒性についてＭＴＴ試験法により調べた。
【0034】
（試験群）
以下には、試験に供した化合物の化学構造式を示す。
以下には、試験に供した化合物の化学構造式を示す。
【0035】
【化1】
【0036】
【化2】
【0037】
（試験方法）
（１－１）ＨＴ－２９細胞を、９６ウェルプレート（細胞培養マルチプレート、住友ベークライト）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．２ｍＬずつ播種し、培養する。
（１－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養。２４時間後、各ウェルの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、各種濃度のイソフラキシジン又はクロロゲン酸を溶解した血清非添加のＤＭＥＭ培地を０．２ｍＬずつウェルに添加し、更に培養する。
（１－３）２４時間後、各ウェルの培地を除去し、０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように培地（血清非添加のＤＭＥＭ培地）に溶解したＭＴＴ溶液を２００μＬずつ添加し、４時間、３７℃で培養する。
（１－４）培養終了後、培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄後、１００μＬのＤＭＳＯで色素を抽出する。
（１－５）室温でプレートミキサーを使って撹拌後、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）（５４０ｎｍ）を用いて測定する。
（１－１）ＨＴ－２９細胞を、９６ウェルプレート（細胞培養マルチプレート、住友ベークライト）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．２ｍＬずつ播種し、培養する。
（１－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養。２４時間後、各ウェルの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、各種濃度のイソフラキシジン又はクロロゲン酸を溶解した血清非添加のＤＭＥＭ培地を０．２ｍＬずつウェルに添加し、更に培養する。
（１－３）２４時間後、各ウェルの培地を除去し、０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように培地（血清非添加のＤＭＥＭ培地）に溶解したＭＴＴ溶液を２００μＬずつ添加し、４時間、３７℃で培養する。
（１－４）培養終了後、培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄後、１００μＬのＤＭＳＯで色素を抽出する。
（１－５）室温でプレートミキサーを使って撹拌後、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）（５４０ｎｍ）を用いて測定する。
【0038】
その結果、図１に示されるように、０～２００μＭの濃度範囲でイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の処理（２４ｈｒ）による毒性は認められなかった。
【0039】
また、図２に示されるように形態的にも毒性は認められなかった。
【0040】
以上から、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸は、少なくとも２００μＭまでの濃度では毒性を示さないことが判明した。
【0041】
＜試験例２＞ 〔細胞浸潤試験〕
悪性のガン細胞は、癌巣を離脱後、基底膜を破壊して正常な周辺組織に入り込み、血管を通って別の組織に運ばれる。このようなガン細胞の浸潤、転移の現象をアッセイするため、生体における基底膜を模倣した細胞浸潤モデルを作製し、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸による抑制効果について調べた。具体的には、以下のようにして細胞浸潤試験を行った。
悪性のガン細胞は、癌巣を離脱後、基底膜を破壊して正常な周辺組織に入り込み、血管を通って別の組織に運ばれる。このようなガン細胞の浸潤、転移の現象をアッセイするため、生体における基底膜を模倣した細胞浸潤モデルを作製し、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸による抑制効果について調べた。具体的には、以下のようにして細胞浸潤試験を行った。
【0042】
（試験群）
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジン（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、クロロゲン酸（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジン（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、クロロゲン酸（２００μＭ）添加
【0043】
（試験方法）
（２－１）疑似基底膜としてマトリゲルのコーティングのために、凍結下にあるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を解凍し、コーティングバッファー（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．７％ＮａＣｌ)で希釈し、２００μｇ／ｍＬとする。その１００μＬを２４ウェルプレート(細胞培養マルチプレート、住友ベークライト社製）に設置したメンブレンインサート（「Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）半透明高密度ＰＥＴメンブレンインサート」、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、メンブレン細孔サイズ８μｍ）内に注入し、２時間、３７℃で培養する。
（２－２）ＨＴ－２９細胞を、血清非添加のＤＭＥＭ培地に懸濁し、２４プレートの各ウェル内に置かれたインサート内に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．５ｍＬずつ播種する。このとき、細胞浮遊液には、試験群に対応してＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を含むようにする。
（２－３）更に、２４ウェルプレートには１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地０．７５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で培養する。
（２－４）培養終了後、綿棒を用い、インサートメンブレンの内側に残る非浸潤細胞をこすり取る。
（２－５）同一の行為を２回行い、顕微鏡下でメンブレン上の細胞が完全に除去されていることを確認する。
（２－６）その後、インサートメンブレンを１００％メタノール内に浸し、更に浸潤細胞を確認するため、ギムザ染色し、空気乾燥後、顕微鏡観察して周縁に浸潤細胞の存在を認めた細孔数をカウントする。
（２－１）疑似基底膜としてマトリゲルのコーティングのために、凍結下にあるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を解凍し、コーティングバッファー（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．７％ＮａＣｌ)で希釈し、２００μｇ／ｍＬとする。その１００μＬを２４ウェルプレート(細胞培養マルチプレート、住友ベークライト社製）に設置したメンブレンインサート（「Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）半透明高密度ＰＥＴメンブレンインサート」、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、メンブレン細孔サイズ８μｍ）内に注入し、２時間、３７℃で培養する。
（２－２）ＨＴ－２９細胞を、血清非添加のＤＭＥＭ培地に懸濁し、２４プレートの各ウェル内に置かれたインサート内に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．５ｍＬずつ播種する。このとき、細胞浮遊液には、試験群に対応してＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を含むようにする。
（２－３）更に、２４ウェルプレートには１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地０．７５ｍＬを添加し、２４時間、３７℃で培養する。
（２－４）培養終了後、綿棒を用い、インサートメンブレンの内側に残る非浸潤細胞をこすり取る。
（２－５）同一の行為を２回行い、顕微鏡下でメンブレン上の細胞が完全に除去されていることを確認する。
（２－６）その後、インサートメンブレンを１００％メタノール内に浸し、更に浸潤細胞を確認するため、ギムザ染色し、空気乾燥後、顕微鏡観察して周縁に浸潤細胞の存在を認めた細孔数をカウントする。
【0044】
図３には、周縁に浸潤細胞を認めた細孔数を、試験群（ｎ＝３）ごとインサートあたりカウントして平均した結果を示す。
【0045】
その結果、図３に示されるように、発がんプロモータであるＴＰＡの添加によって、ＨＴ－２９細胞の浸潤活性の有意な増加が認められた。そしてその浸潤活性はイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を培地中に２００μＭの濃度で添加することによって有意な低下を認めた。
【0046】
以上から、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸は、大腸ガン細胞の浸潤阻止に有効性を示すことが明らかとなった。
【0047】
＜試験例３＞ 〔リアルタイムＰＣＲ〕
臨床的に大腸ガンは、細胞外マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であるＭＭＰ７を過剰発現し、発現の増強とガンステージの進展との関連があること、ならびにそのようなＭＭＰ７は発がんプロモータであるフォルボールエステル（ＴＰＡ：１２－Ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）で誘導可能であることなどが知られている。そこで、ＨＴ－２９細胞においてその点を確認するとともに、ＴＰＡで誘導されたＭＭＰ７のｍＲＮＡ発現について、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸の影響を調べた。
臨床的に大腸ガンは、細胞外マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であるＭＭＰ７を過剰発現し、発現の増強とガンステージの進展との関連があること、ならびにそのようなＭＭＰ７は発がんプロモータであるフォルボールエステル（ＴＰＡ：１２－Ｏ－ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）で誘導可能であることなどが知られている。そこで、ＨＴ－２９細胞においてその点を確認するとともに、ＴＰＡで誘導されたＭＭＰ７のｍＲＮＡ発現について、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸の影響を調べた。
【0048】
（試験群）
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（５０μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（５０μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
【0049】
（試験方法）
（３－１）ＨＴ－２９細胞を、３．５ｃｍプラスチックシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で２ｍＬずつ播種する。
（３－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（３－３）２４時間後、各シャーレの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各２ｍＬをシャーレに添加し、更に２４時間培養する。
（３－４）培養後、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、各シャーレからＲＮＡ分離キット（「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」、Ｑｉａｇｅｎ社製）のプロトコルに従い、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。
（３－５）リアルタイムＰＣＲは、キット（「Ｍｙ Ｇｏ Ｇｒｅｅｎ １－Ｓｔｅｐ Ｌｏｗ Ｒｏｘ」、ＩＴ－ＩＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）のプロトコルに従い、反応組成としては、ＴｏｔａｌＲＮＡ１００ｎｇ、反応試薬（「２×ＭｙＧｏ Ｇｒｅｅｎ １－
Ｓｔｅｐ Ｍｉｘ」、同キット製）１０μＬ、センス及びアンチセンスプライマー溶液（１０μＭ）をそれぞれ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤溶液（「２０×ＲＴａｓｅ」、同キット製）１μＬを加え、ＰＣＲグレード水（「ＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ」、同キット製）で総量２０μＬとする。
（３－６）反応条件は、４５℃（１０分間）×１サイクル→９５℃（２分間）×１サイクル→｛９５℃（１０秒間）→６０℃（３０秒間）｝×４０サイクルとする。
（３－１）ＨＴ－２９細胞を、３．５ｃｍプラスチックシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で２ｍＬずつ播種する。
（３－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（３－３）２４時間後、各シャーレの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各２ｍＬをシャーレに添加し、更に２４時間培養する。
（３－４）培養後、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、各シャーレからＲＮＡ分離キット（「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」、Ｑｉａｇｅｎ社製）のプロトコルに従い、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。
（３－５）リアルタイムＰＣＲは、キット（「Ｍｙ Ｇｏ Ｇｒｅｅｎ １－Ｓｔｅｐ Ｌｏｗ Ｒｏｘ」、ＩＴ－ＩＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）のプロトコルに従い、反応組成としては、ＴｏｔａｌＲＮＡ１００ｎｇ、反応試薬（「２×ＭｙＧｏ Ｇｒｅｅｎ １－
Ｓｔｅｐ Ｍｉｘ」、同キット製）１０μＬ、センス及びアンチセンスプライマー溶液（１０μＭ）をそれぞれ０．５μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤溶液（「２０×ＲＴａｓｅ」、同キット製）１μＬを加え、ＰＣＲグレード水（「ＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ」、同キット製）で総量２０μＬとする。
（３－６）反応条件は、４５℃（１０分間）×１サイクル→９５℃（２分間）×１サイクル→｛９５℃（１０秒間）→６０℃（３０秒間）｝×４０サイクルとする。
【0050】
表１には、使用したＰＣＲプライマーの塩基配列を示す。
【0051】
【表1】
【0052】
図５には、ＭＭＰ７のｍＲＮＡ発現量を、試験群（ｎ＝２）ごと平均し、ＴＰＡ非添加の試験群のｍＲＮＡ発現量に対する相対比として結果を示す。
【0053】
その結果、ＴＰＡ存在下、イソフラキシジンはＭＭＰ７遺伝子のｍＲＮＡ発現量を統計上、有意ではないが抑制的に、クロロゲン酸は有意に抑制した。
【0054】
以上から、イソフラキシジンならびにクロロゲン酸は、発がんプロモータであるＴＰＡにより誘発されるＭＭＰ７のｍＲＮＡ発現を抑制ないし抑制的に作用することが明らかとなった。よって、このＭＭＰ７のｍＲＮＡ発現の抑制が、大腸ガン細胞の浸潤阻止に寄与していると考えられた。
【0055】
＜試験例４＞ 〔免疫細胞染色〕
試験例３の結果によれば、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸による大腸ガン細胞の浸潤阻止は、ＭＭＰ７の発現抑制を介していることが示唆された。そこで、活性型ＭＭＰ７特異抗体を用いた免疫染色により、活性型ＭＭＰ７発現の抑制がイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸処理により認められるか否かを検討した。
試験例３の結果によれば、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸による大腸ガン細胞の浸潤阻止は、ＭＭＰ７の発現抑制を介していることが示唆された。そこで、活性型ＭＭＰ７特異抗体を用いた免疫染色により、活性型ＭＭＰ７発現の抑制がイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸処理により認められるか否かを検討した。
【0056】
（試験群）
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
【0057】
（試験方法）
（４－１）ＨＴ－２９細胞を、８ウェルチャンバースライド（ＳＰＬ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．５ｍＬずつ播種する。
（４－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（４－３）２４時間後、各ウェルの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各０．５ｍＬをウェルに添加し、更に２４時間培養する。
（４－４）培養終了後、免疫細胞染色用キットである「Vector stain Universal ABC kit PK-6200」（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、以下のようにして免疫細胞染色を行う。
・固定：ウェルから培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（富士フィルム和光純薬）で、１０分間固定する。
・ブロッキング：２．５％正常血清を含むＰＢＳ（同時に抗体希釈バッファーとして使用する）で、２０分間処理する。
・一次抗体処理：ブロッキング液除去後、抗体希釈バッファーで希釈した活性型ＭＭＰ７抗体（ａｎｔｉ－ＭＭＰ７（ａｃｔｉｖｅ）ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＲＧ６６４２４）（ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、１：５００）を加え、６０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。この場合、抗体希釈バッファーのみで抗体無添加のコントロール群を用意し、同様に行う。
・二次抗体処理：抗体希釈バッファーで希釈したビオチン標識二次抗体を加え、３０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・シグナル増感：染色シグナル増感剤としてアビジン－ビオチン標識酵素複合体試薬（「ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｋｉｔ」、ＶＥＣＴＯＲ社製、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を加え、３０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・発色：パーオキシダーゼ基質試薬（「ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ ＤＡＢ ＳＫ－４１００」、ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いて発色させる。その後、流水で洗浄する。
（４－１）ＨＴ－２９細胞を、８ウェルチャンバースライド（ＳＰＬ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で０．５ｍＬずつ播種する。
（４－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（４－３）２４時間後、各ウェルの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各０．５ｍＬをウェルに添加し、更に２４時間培養する。
（４－４）培養終了後、免疫細胞染色用キットである「Vector stain Universal ABC kit PK-6200」（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、以下のようにして免疫細胞染色を行う。
・固定：ウェルから培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（富士フィルム和光純薬）で、１０分間固定する。
・ブロッキング：２．５％正常血清を含むＰＢＳ（同時に抗体希釈バッファーとして使用する）で、２０分間処理する。
・一次抗体処理：ブロッキング液除去後、抗体希釈バッファーで希釈した活性型ＭＭＰ７抗体（ａｎｔｉ－ＭＭＰ７（ａｃｔｉｖｅ）ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＲＧ６６４２４）（ａｒｉｇｏ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、１：５００）を加え、６０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。この場合、抗体希釈バッファーのみで抗体無添加のコントロール群を用意し、同様に行う。
・二次抗体処理：抗体希釈バッファーで希釈したビオチン標識二次抗体を加え、３０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・シグナル増感：染色シグナル増感剤としてアビジン－ビオチン標識酵素複合体試薬（「ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｋｉｔ」、ＶＥＣＴＯＲ社製、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を加え、３０分間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・発色：パーオキシダーゼ基質試薬（「ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ ＤＡＢ ＳＫ－４１００」、ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いて発色させる。その後、流水で洗浄する。
【0058】
図６には、染色細胞の光学顕微鏡写真の結果を示す。
【0059】
その結果、図６Ａ（ａ）に比較して図６Ｂ（ｂ）に示されるように、活性型ＭＭＰ７タンパク質に対する特異抗体を用いた免疫細胞染色により、多数の細胞の細胞質にびまん性に発色（陽性細胞）が認められた。よって、タンパク質の発現レベルでも、発がんプロモータであるＴＰＡにより活性型ＭＭＰ７タンパク質が誘発されていることが明らかとなった。なお、ＭＭＰ７タンパク質は、生体において細胞外でプラスミンなどにより活性化されると考えられているが、本法においても、ＨＴ－２９細胞表面に存在するプラスミンによって活性化されたとものと考えられた。
【0060】
これに対して、図６Ｃ（ｃ）、Ｄ（ｄ）に示されるように、ＴＰＡ存在下、イソフラキシジン添加では、陽性細胞数は減少したが、なお少なからず認められた。一方、クロロゲン酸添加では、陽性細胞数はほとんど認められず、活性型ＭＭＰ７発現はイソフラキシジンでは抑制傾向、クロロゲン酸では大きく抑制された。以上より、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸による大腸ガン細胞の浸潤阻止は、活性型ＭＭＰ７発現の抑制を介していることが強く示唆された。
【0061】
＜試験例５＞ 〔ウエスタンブロット〕
ＥＲＫ１／２のリン酸化に対するイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の影響を調べるためにウエスタンブロットを実施した。
ＥＲＫ１／２のリン酸化に対するイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸の影響を調べるためにウエスタンブロットを実施した。
【0062】
（試験群）
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（５０μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
・ＴＰＡ非添加（イソフラキシジン、クロロゲン酸のいずれも非添加）
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）のみ添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（５０μＭ）添加
・ＴＰＡ（８０ｎＭ）添加、イソフラキシジンあるいはクロロゲン酸（２００μＭ）添加
【0063】
（試験方法）
（５－１）ＨＴ－２９細胞を、３．５ｃｍプラスチックシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で２ｍＬずつ播種する。
（５－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（５－３）２４時間後、各シャーレの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各２ｍｌをシャーレに添加し、更に２４時間培養する。
（５－４）培養終了後、以下のようにしてウエスタンブロッティングを行う。
＜ウエスタンブロッティング＞
・サンプル作製：シャーレから培地を除去し、ＰＢＳで2回洗浄後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ＰＥ ＬＢ (Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製)を添加し、氷上で、３０分間インキュベートし、細胞抽出液を得る。さらに、同抽出液を１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清をサンプルとする。
・タンパク濃度測定：「Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」(ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いる。
・電気泳動：サンプルをＳＤＳ（５ｘ）サンプルバッファーで処理し、１０％ＳＤＳ－
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ電気泳動を行う。
トランスファー：泳動終了後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーする。
・ブロッキング：抗体の非特異的結合の回避のため、メンブレンをＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解した５％スキムミルクでブロッキングする。
・一次抗体処理：メンブレンを、ＴＢＳバッファーで希釈（１：１０００）したａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－ｐ４４／４２ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＡＰ）ｋｉｎａｓｅ（Ｋ） ＥＲＫ１/２抗体あるいはａｎｔｉ－ｐ４４／４２ＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）液中に浸し、２４時間、４oＣインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・二次抗体処理：メンブレンをＴＢＳで希釈（１：２０００）したウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－結合抗体(Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製)液中に浸し、１時間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・検出：ＥＣＬＰｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）においてターゲットタンパクを検出する。
（５－１）ＨＴ－２９細胞を、３．５ｃｍプラスチックシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で２ｍＬずつ播種する。
（５－２）培養には１０％牛胎児血清添加のＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃で培養する。
（５－３）２４時間後、各シャーレの培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ＴＰＡやイソフラキシジンあるいはクロロゲン酸を試験群に対応して各種濃度で含む血清非添加のＤＭＥＭ培地を作製し、各２ｍｌをシャーレに添加し、更に２４時間培養する。
（５－４）培養終了後、以下のようにしてウエスタンブロッティングを行う。
＜ウエスタンブロッティング＞
・サンプル作製：シャーレから培地を除去し、ＰＢＳで2回洗浄後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ ＰＥ ＬＢ (Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製)を添加し、氷上で、３０分間インキュベートし、細胞抽出液を得る。さらに、同抽出液を１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清をサンプルとする。
・タンパク濃度測定：「Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」(ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いる。
・電気泳動：サンプルをＳＤＳ（５ｘ）サンプルバッファーで処理し、１０％ＳＤＳ－
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ電気泳動を行う。
トランスファー：泳動終了後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーする。
・ブロッキング：抗体の非特異的結合の回避のため、メンブレンをＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解した５％スキムミルクでブロッキングする。
・一次抗体処理：メンブレンを、ＴＢＳバッファーで希釈（１：１０００）したａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－ｐ４４／４２ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＡＰ）ｋｉｎａｓｅ（Ｋ） ＥＲＫ１/２抗体あるいはａｎｔｉ－ｐ４４／４２ＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）液中に浸し、２４時間、４oＣインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・二次抗体処理：メンブレンをＴＢＳで希釈（１：２０００）したウサギＩｇＧ、ＨＲＰ－結合抗体(Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製)液中に浸し、１時間、室温でインキュベートする。その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
・検出：ＥＣＬＰｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）においてターゲットタンパクを検出する。
【0064】
図７には、ウエスタンブロットの結果を示す。
【0065】
発現量ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，ＵＳｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ）によって数値化した結果は、ＥＲＫ１/２のリン酸化がＴＰＡによって誘導されること、更に、リン酸化は、イソフラキシジン添加では抑制されなかったが、クロロゲン酸では抑制されることを示した。この抑制の有無が先に示したイソフラキシジンとクロロゲン酸によるＭＭＰ７ｍＲＮＡ抑制度の差異ならびに免疫染色による活性型ＭＭＰ７タンパクによる染色度の差異を反映していると考えられた。
【0066】
以上の結果から、クロロゲン酸によるＭＭＰ７発現の抑制にはＥＲＫ１/２のリン酸化が介在している可能性が高いが、イソフラキシジンの場合は異なるシグナル経路の関与の可能性が示唆される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】