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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023083256
(43)【公開日】2023-06-15
(54)【発明の名称】エキソソームの産生及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230608BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230608BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230608BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230608BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230608BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20230608BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20230608BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230608BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230608BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230608BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230608BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230608BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230608BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230608BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C07K19/00 ZNA
C12N15/85
C07K16/28
C07K14/705
C12N15/113 110Z
A61K35/12
A61K45/00
A61K31/704
A61K31/337
A61K33/243
A61K31/675
A61K31/282
A61K31/7068
A61K31/519
A61K39/395 T
A61K31/7105
A61P35/00
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022193265
(22)【出願日】2022-12-02
(31)【優先権主張番号】63/285,493
(32)【優先日】2021-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509075457
【氏名又は名称】中國醫藥大學
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ９１， Ｈｓｕｅｈ－Ｓｈｉｈ Ｒｏａｄ， Ｎｏｒｔｈ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｔａｉｃｈｕｎｇ， Ｔａｉｗａｎ
(71)【出願人】
【識別番号】516144245
【氏名又は名称】中國醫藥大學附設醫院
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
(71)【出願人】
【識別番号】522118311
【氏名又は名称】聖安生醫股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈｉｎｅ－Ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】陳怡文
(72)【発明者】
【氏名】周徳陽
(72)【発明者】
【氏名】方信元
(72)【発明者】
【氏名】謝明佑
(72)【発明者】
【氏名】潘志明
(72)【発明者】
【氏名】甘▲カイ▼▲ウェン▼
(72)【発明者】
【氏名】陳正祐
(72)【発明者】
【氏名】余旻樺
(72)【発明者】
【氏名】邱紹智
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA17
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB01
4C085CC23
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086CB05
4C086DA38
4C086EA10
4C086EA16
4C086EA17
4C086HA12
4C086HA28
4C086NA13
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087CA04
4C087NA13
4C087ZB26
4C206AA01
4C206AA02
4C206JB16
4C206KA01
4C206NA13
4C206ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】融合タンパク質を含むエキソソームを含む組成物、該組成物の使用およびエキソソームの産生を促進するための方法を提供する。
【解決手段】細胞を刺激してエキソソームを放出する周期的引張バイオリアクターを用いることにより、エキソソームを大規模で産生するための方法を提供する。加えて、がんに特異的な抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を有するエキソソームも提供し、エキソソームは、がんを治療するための治療剤を送達するための送達ビヒクルとして使用される。
【選択図】図１４
【解決手段】細胞を刺激してエキソソームを放出する周期的引張バイオリアクターを用いることにより、エキソソームを大規模で産生するための方法を提供する。加えて、がんに特異的な抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を有するエキソソームも提供し、エキソソームは、がんを治療するための治療剤を送達するための送達ビヒクルとして使用される。
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質を含むエキソソームを含む組成物であって、前記融合タンパク質が、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、前記標的タンパク質が、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、前記抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列が、配列番号２を含む、組成物。
【請求項2】
前記エキソソーム膜貫通タンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記エキソソームが、抗がん剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記抗がん剤が、がんを治療するための化学療法剤またはマイクロＲＮＡを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
がんを治療するための薬物を調製するための組成物の使用であって、前記組成物が、治療用エキソソームを含み、前記治療用エキソソームが、融合タンパク質及び抗がん剤を含み、前記融合タンパク質が、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、前記標的タンパク質が、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、前記抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列が、配列番号２を含む、使用。
【請求項6】
前記エキソソーム膜貫通タンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記がんが、乳癌、肺癌、口腔癌、肝癌、大腸癌、膠芽腫、髄芽腫、膀胱癌、膵癌、または卵巣癌を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項8】
前記抗がん剤が、がんを治療するための化学療法剤またはマイクロＲＮＡを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項9】
前記化学療法剤が、ドキソルビシン、タキソテール、シスプラチン、ハーセプチン、パージェタ、エピルビシン、シクロホスファミド、カルボプラチン、ゲムシタビン、またはペメトレキセド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項10】
がんを治療するためのマイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－３４ａを含む請求項８に記載の使用。
【請求項11】
エキソソームの産生を促進するための方法であって、前記方法が、（ａ）周期的引張バイオリアクターを提供することであって、前記周期的引張バイオリアクターが、培養チャンバと、成長刺激促進構造を有する生体適合性ポリマー材料と、複数の引張成分とを備え、前記生体適合性ポリマー材料及び前記複数の引張成分が、前記培養チャンバ内に配置され、前記生体適合性ポリマー材料が、エキソソーム産生細胞を含み、前記生体適合性ポリマー材料の両端部が、前記複数の引張成分で連結される、提供することと；（ｂ）周期的引張力を加えるための前記複数の引張成分によって、前記生体適合性高分子材料を繰り返し伸展することと；（ｃ）前記複数の引張成分によって加えられる前記周期的引張力によって前記エキソソーム産生細胞から放出された前記エキソソームを回収することと、を含む、方法。
【請求項12】
前記生体適合性高分子材料が、メタクリロイル系ポリマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記生体適合性高分子材料の濃度が、０．１～５０重量％の範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記生体適合性高分子材料が、複数の細孔を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記複数の引張成分によって加えられる前記周期的引張力が、２．５～５０％の引張ひずみである、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記複数の引張成分によって加えられる前記周期的引張力が、周波数０．１～４Ｈｚにおけるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記ステップ（ｃ）において前記エキソソームを回収することは、前記周期的引張力が加わってから１～２ヶ月後に行われる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞を刺激してエキソソームを放出する周期的引張バイオリアクターを用いることにより、エキソソームを大規模で産生する方法に関する。また、本発明は、がんに特異的な抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を有するエキソソームに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、様々な製薬会社が、低分子薬物または生物製剤をより効率的かつ正確に送達することが期待される新規薬物担体の開発に多くのリソースを投入している。エキソソームは、免疫原性が低く、生体適合性が高く、生物学的活性が高く、細胞に対する拒絶反応が低く、微小環境に対してナノサイズであるため、薬物担体の非常に優れた候補であると考えられている。従来の利点のみでなく、エキソソームは、高い親和性、標的細胞による貪食の容易さ、細胞内の薬物の分解及び放出の容易さならびに免疫系による消費の回避など、他の優れた特性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、エキソソームの産生を促進するための方法を提供し、この方法は、（ａ）周期的引張バイオリアクターを提供することであって、周期的引張バイオリアクターは、培養チャンバと、成長刺激促進構造を有する生体適合性ポリマー材料と、複数の引張成分とを備え、生体適合性ポリマー材料及び複数の引張成分が、培養チャンバ内に配置され、生体適合性ポリマー材料は、エキソソーム産生細胞を含み、生体適合性ポリマー材料の両端部は、複数の引張成分で連結される、提供することと；（ｂ）複数の引張成分を用いて、周期的引張力を加えることによって、生体適合性高分子材料を繰り返し伸展することと；（ｃ）複数の引張成分によって加えられる周期的引張力によってエキソソーム産生細胞から放出されたエキソソームを回収することと、を含む。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明はまた、融合タンパク質を含むエキソソームを提供し、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含む。本発明はさらに、がんを有する対象に組成物を投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供し、ここで、組成物は、治療用エキソソームを含み、治療用エキソソームは、上記の融合タンパク質及び抗がん剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1A】カーゴ工学技術を有するもの、有さないもののエキソソームの形態の検証結果を示す図である。
【図1B】カーゴ工学技術を有するもの、有さないもののエキソソームのサイズの検証結果を示す図である。Ｅｘｏ：エキソソーム；及びＣＡＲＥｘｏ：カーゴエキソソーム。
【図2A】ウェストブロットを用いることによるエキソソームのバイオマーカー（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、Ａｌｉｘ、ＨＳＰ－７０及びβ－チューブリン）の同定を示す図である。
【図2B】フローサイトメトリーを用いることによるエキソソームのバイオマーカー（ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９）の同定を示す図である。ＰＥ－Ａ：フィコエリトリン領域。
【図3】共焦点顕微鏡を用いたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（Ｆアクチン：赤、核：青）内のエキソソーム（緑）の保持の評価を示す図である。エキソソーム：緑、Ｆアクチン：赤、核：青。
【図4】標的機能を有するもの、有さないものの、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及び正常乳房細胞（ＭＣＦ－１０Ａ）における、蛍光染色を用いることによるエキソソームの取り込み効果の比較を示す図である。エキソソーム：緑、Ｆアクチン：赤、核：青。
【図5】標的機能を有するもの、有さないものの、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及び正常乳房細胞（ＭＣＦ－１０Ａ）による、フローサイトメトリーを用いることによるエキソソームの取り込み効果の比較を示す図である。
【図6】蛍光染色を用いた、共培養系における乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及び正常乳房細胞（ＭＣＦ－１０Ａ）による標的エキソソームの取り込み効果の比較を示す図である。エキソソーム：緑、Ｆアクチン：赤、核：青。ＨＰＦ：ヒト肺線維芽細胞。
【図7】標的機能を有するもの、有さないものの、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及び正常乳房細胞（ＭＣＦ－１０Ａ）に対するエキソソームの細胞傷害性の評価を示す図である。Ｃｔｌ：対照。
【図8】ＣＡＲＥｘｏの生体内分布のｉｎ ｖｉｖｏ処置能の評価を示す図である。本発明では、ＭＤ－ＭＢＡ－２３１細胞を用いることによって、異種移植マウスモデルを構築する。
【図9】エキソソームに同時取り込みしたｍｉＲＮＡ及びＤＯＸの量を示す図である。ＤＯＸ：ドキソルビシン。
【図10】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１にｍｉＲＮＡ及びＤＯＸを取り込んだエキソソームの細胞傷害性の評価を示す図である。Ｃｔｌ：対照。
【図11】蛍光染色による細胞内でのｍｉＲＮＡ放出に対するｍｉＲＮＡ含有エキソソーム（ｍｉＲ－３４ａ＠ＣＡＲＥｘｏ）の効果の評価を示す図である。
【図12A】Ｉｎ ｖｉｖｏで乳癌腫瘍を阻害する際のｍｉＲＮＡ／ＤＯＸ含有ＣＡＲＥｘｏの有効性の検証結果を示す図である。
【図12B】他の臓器の腫瘍転移におけるｍｉＲＮＡ／ＤＯＸ含有ＣＡＲＥｘｏの有効性の評価結果を示す図である。Ｃｔｌ：対照。
【図13】標的機能を有するもの、有さないものの、ＭＢ１１（膠芽腫）、Ａ５４９（非小細胞肺癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＯＥＣＭ（口腔扁平上皮癌）、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞株）、及びＴ２４（膀胱癌）におけるエキソソームの取り込み効果を蛍光染色で比較を示す図である。エキソソーム：緑、Ｆアクチン：赤、核：青。
【図14】標的機能を有するもの、有さないものの、乳癌（ＭＢ２３１）、肺癌（ＨＣＣ８２７）、口腔癌（ＯＥＣＭ）、肝癌（ＨｅｐＧ２）、大腸癌（ＣａＣＯ２）、髄芽腫（Ｕ８７）、膀胱癌（Ｔ２４）、膵癌（ＭＩＡ ＰａＣａ－２）、及び卵巣腺癌（ＳＫＯＶ３）におけるＤＯＸ含有エキソソームの細胞傷害性の比較を示す図である。乳房上皮細胞（ＭｅＰｉｃ）及びヒト肺線維芽細胞（ＨＰＦ）は、正常細胞である。
【図15】標的機能を有するもの、有さないものの、乳癌（ＭＢ２３１）における、様々な化学療法剤含有エキソソームの細胞傷害性の比較を示す図である。Ｃｔｌ：対照。
【図16A】細胞含有ＦＧｅｌＭａヒドロゲルの調製及び周期的伸展培養系の使用を示す図である。細胞含有成長刺激促進ヒドロゲルを調製するために使用される手順を示すスキームを示す。
【図16B】細胞含有ＦＧｅｌＭａヒドロゲルの調製及び周期的伸展培養系の使用を示す図である。調製したままの成長刺激促進ヒドロゲルを培養培地に浸漬させて示す図である。
【図16C】細胞含有ＦＧｅｌＭａヒドロゲルの調製及び周期的伸展培養系の使用を示す図である。細胞含有成長刺激促進ヒドロゲルを動的引張培養系に適用し、その結果、２０％のひずみ及び周波数０．４８Ｈｚで、周期的伸展下で培養したことを示す図である。
【図17】引張培養系におけるＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場によって産生されたエキソソームの収率と単一細胞によって分泌されるエキソソームの収率との比較を示す図である。
【図18】周期的引張培養系におけるＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場の細胞形態及びＹＡＰタンパク質染色の差を示す図である。
【図19A】周期的引張培養系におけるＹＡＰ阻害剤（ベルテポルフィン）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場の細胞形態及びＹＡＰタンパク質染色の差を示す図である。
【図19B】周期的引張培養系におけるＹＡＰ阻害剤（ベルテポルフィン）を用いたＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場のエキソソーム分泌の差を示す図である。
【図20】ＨＥＫ２９３Ｔ関連エキソソームの形態、サイズ、及びバイオマーカーの静的培養系と動的培養系とでの差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本発明は、親細胞培養パラメータを調整することにより、高品質かつ大量産生工学技術的改変エキソソームプラットフォームを確立する。親細胞（ＨＥＫ２９３）は、３Ｄ動的刺激プロセスを介して、生物学的産物として大量の高純度エキソソームを分泌する。本発明では、ＨＬＡ－Ｇを標的とする遺伝子改変膜、エキソソーム大量産生系、併用薬物取り込み設計など、３つのプラットフォームを形成した。本発明は、いくつかの結果を達成することができる：１）動的培養環境下でＨＥＫ２９３から分泌されるエキソソームの量は、高発現のＣＤ６３を有するエキソソームの４５～３００倍を生成することができ、これにより、治療のための高品質及び量のエキソソームがもたらされる。２）化学療法剤の取り込みが少ないため、副作用なく、がん細胞を高効率で殺傷させる。３）ＣＡＲＥｘｏｓは、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質及びｍｉＲＮＡ ３４ａを運び、これにより、腫瘍の進行を抑制し、腫瘍転移プロセスを減速させる。４）ＣＡＲＥｘｏｓは、モデル動物において、優れた腫瘍サイズコントロールを示し、転移は示さなかった。本発明は、ＣＡＲＥｘｏｓが将来、患者にとって効率的な抗がん兵器となる高い可能性を有し、大きい可能性及びビジネス機会を有すると考えられている。
【0007】
本明細書で使用される用語「一」または「一つ」は、本発明の要素及び構成要素について記載する。この用語は、説明の便宜上、及び本発明の基本的な考えを与えるためにのみ使用される。この説明は、１つまたは少なくとも１つを含むと理解されるべきであり、別段に示されていることが明らかでない限り、単数形は、複数形も含む。特許請求の範囲において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と組み合わせて使用される場合、用語「一」は、１つまたは複数を意味し得る。
【0008】
本明細書において特許請求の範囲で使用される用語「または（ｏｒ）」は、他の選択肢のみを意味することが明示的に示されていない限り、または他の選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／または」を意味する。
【0009】
本発明は、エキソソームの産生を促進するための方法を提供し、この方法は、（ａ）周期的引張バイオリアクターを提供することであって、周期的引張バイオリアクターは、培養チャンバと、成長刺激促進構造を有する生体適合性ポリマー材料と、複数の引張成分とを備え、生体適合性ポリマー材料及び複数の引張成分が、培養チャンバ内に配置され、生体適合性ポリマー材料は、エキソソーム産生細胞を含み、生体適合性ポリマー材料の両端部は、複数の引張成分で連結される、提供することと；（ｂ）周期的引張力を加えるための複数の引張成分によって、生体適合性高分子材料を繰り返し伸展することと；（ｃ）複数の引張成分によって加えられる周期的引張力によってエキソソーム産生細胞から放出されたエキソソームを回収することと、を含む。
【0010】
一実施形態では、生体適合性高分子材料は、メタクリロイル系ポリマーを含む。好ましい実施形態では、メタクリロイル系ポリマーは、ゼラチンメタクリロイル（ＧｅｌＭａ）、コラーゲンメタクリロイル、ヒアルロン酸メタクリロイル（ＨＡＭａ）、コンドロイチン硫酸メタクリロイル、キトサンメタクリロイル、アルギン酸メタクリロイル、またはメタクリロイルを有する脱細胞化細胞外マトリックス（ｄＥＣＭＭａ）を含む。より好ましい実施形態では、ゼラチンメタクリロイルは、フィッシュゼラチンメタクリロイル（ＦＧｅｌＭａ）またはブタゼラチンメタクリロイル（ＰＧｅｌＭａ）を含む。さらに、ゼラチンメタクリルアミドは、魚類またはブタ由来のゼラチンと、メタクリル酸無水物及び任意の溶液（例えばリン酸緩衝溶液）とによって調製される。したがって、メタクリルアミド系ポリマーは、生分解性及び生体適合性である。
【0011】
本発明では、生体適合性高分子材料の濃度は、生体適合性高分子材料の成長刺激促進機能に影響を及ぼし、この成長刺激促進機能は、さらにエキソソームの産生に影響を及ぼす。したがって、本発明は、エキソソームの収率に影響を与えるために異なる濃度を有する生体適合性高分子材料を使用する。例えば、ＧｅｌＭａの濃度は、５重量％～３０重量％の範囲であり、アルギン酸メタクリロイルの濃度は、１重量％～１０重量％の範囲であり、コラーゲンメタクリロイルの濃度は、０．５重量％～１０重量％の範囲であり、ＨＡＭａの濃度は、１重量％～１０重量％の範囲であり、ｄＥＣＭＭａの濃度は、１重量％～１０重量％の範囲である。一実施形態では、生体適合性高分子材料の濃度は、０．１重量％～５０重量％の範囲である。好ましい実施形態では、生体適合性高分子材料の濃度は、０．２重量％～４０重量％の範囲である。より好ましい実施形態では、生体適合性高分子材料の濃度は、０．５重量％～３０重量％の範囲である。
【0012】
本発明では、生体適合性高分子材料の濃度は、希釈により調節される。例えば、生体適合性高分子材料がＦＧｅｌＭａである場合、２０ｇのＦＧｅｌＭａを８０ｇの蒸留水と混合することによって、２０重量％のＦＧｅｌＭａを調製する。
【0013】
さらに、成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料は、裂かれることなく、引張成分によって加えられる引張ひずみの少なくとも５％に耐えることができる。一実施形態では、成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料の機械的強度は、２．５～５０％の引張ひずみに耐える。好ましい実施形態では、成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料の機械的強度は、５～４０％の引張ひずみに耐える。より好ましい実施形態では、成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料の機械的強度は、１０～３０％の引張ひずみに耐える。
【0014】
いくつかの態様では、用語「引張ひずみ」は、引張力または応力の適用による固体の変形または伸長として定義される。換言すれば、引張ひずみは、加えられた力がそれを伸展させようとして、本体の長さが長くなるときに生じる。引張ひずみは、次式で数学的に表すことができる：ε＝ΔＬ／Ｌ、式中、ε＝引張ひずみ、ΔＬ＝長さの変化、及びＬ＝元の長さである。
【0015】
本発明では、生体適合性高分子材料は、本体よりも広い両端を有する、ダンベル様形状になるように設計する。したがって、生体適合性高分子材料は、２つの部分に分けることができる：１つの部分は、成長刺激促進構造を有する第１の高分子材料であり、他方の部分は、剛性構造を有する２つの第２の高分子材料を含む。したがって、剛性構造を有する各第２の高分子材料の機械的強度は、成長刺激促進構造を有する第１の高分子材料の機械的強度よりも高い。これら２つの第２の高分子材料は、それぞれ第１の高分子材料の両端に接続されている。細胞は、第１の高分子材料の成長刺激促進構造に取り込まれる。したがって、第１の高分子材料は、細胞を取り込むために使用され、第２の高分子材料は、第１の高分子材料と複数の引張成分との間に適切な接続をもたらすために使用される。
【0016】
一実施形態では、生体適合性高分子材料は、第１の高分子材料及び２つの第２の高分子材料を含む。好ましい実施形態では、これら２つの第２の高分子材料は、それぞれ第１の高分子材料の両端に接続されている。より好ましい実施形態では、第１の高分子材料は、エキソソーム産生細胞を取り込むために使用され、第２の高分子材料は、第１の高分子材料と複数の引張成分とを接続するために使用される。別の実施形態では、第１の高分子材料は、ＦＧｅｌＭａであり、第２の高分子材料は、ＧｅｌＭａである。
【0017】
このエキソソーム産生細胞は、公知の方法によって生体適合性高分子材料または第１の高分子材料に取り込むことができる。エキソソーム産生細胞が、成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料に取り込まれた後、本発明は、細胞含有成長刺激促進足場を得ることができる。本発明では、生体適合性高分子材料は、細胞含有ＦｇｅｌＭａであり、細胞含有ＦｇｅｌＭａは、エキソソーム産生細胞とＦＧｅｌＭａとを混合することによって得られる。
【0018】
エキソソーム産生細胞は、例えば初代細胞、細胞株、多細胞生物中に存在する細胞、または本質的に任意の他の型の細胞源及びエキソソーム産生細胞材料の形態で存在し得る。用語「エキソソーム産生細胞」は、好適な条件下で、例えば浮遊培養または接着培養中または任意の他の種類の培養系において、エキソソームを産生することができる任意の型の細胞に関連すると理解され得る。エキソソーム産生細胞には、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてエキソソームを産生する細胞も含まれる。エキソソーム産生細胞は、浮遊培養または接着培養において成長し得るか、または浮遊成長に適合され得る広範囲の細胞及び細胞株から選択され得る。エキソソーム産生細胞は、間葉系幹または間質細胞（例えば骨髄、脂肪組織、ホウォートンゼリー、周産期組織、胎盤、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には、様々な初期マーカーを任意により発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞、Ｍ２分極マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞などを含む群から選択され得る。特に目的の細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、微小血管またはリンパ管内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、異なる起源の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺によってもしくは胎盤から得られた任意の細胞、または気道もしくは肺胞からの上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが挙げられる。また、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞も本発明の範囲内であり、本質的には、エキソソームを産生することができる任意の種類の細胞も本明細書に包含される。一般に、エキソソームは、本質的に任意の細胞源、初代細胞源または不死化細胞株に由来し得る。特に目的の細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、無血清ＨＥＫ２９３細胞、浮遊ＨＥＫ２９３細胞、内皮細胞株、例えば、微小血管またはリンパ管内皮細胞、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、異なる起源のＭＳＣ、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺によってまたは胎盤から得られた任意の細胞、気道または肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞が挙げられる。一実施形態では、エキソソーム産生細胞は、哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、エキソソーム産生細胞は、胚性腎細胞を含む。より好ましい実施形態では、エキソソーム産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。したがって、エキソソーム産生細胞は、エキソソームの生物学的性質を保持するエキソソームを産生することができ、エキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＨＳＰ７０の発現を有し得る。
【0019】
本発明においては、生体適合性高分子材料または第１の高分子材料中に複数の細孔が存在する。複数の細孔は、生体適合性高分子材料または第１の高分子材料中での成長刺激促進構造の成長刺激促進機能を増大させるように設計する。加えて、複数の細孔は、培養液を細胞培養用の生体適合性高分子材料または第１の高分子材料に流入させることができる。一実施形態では、生体適合性高分子材料または第１の高分子材料は、複数の細孔を含む。また、複数の細孔は、成長刺激促進の必要性に応じて様々な種類を有する。一実施形態では、細孔の形状は、球状、楕円体形状、菱形体形状、または紡錘状形状を含む。好ましい実施形態では、細孔の形状は、紡錘状形状である。別の実施形態では、細孔の紡錘状形状は、長さ１～５ｍｍ、幅０．１～０．５ｍｍで設計される。好ましい実施形態では、紡錘状形状の細孔は、長さ２～４ｍｍ、幅０．２～０．４ｍｍで設計される。さらに、複数の細孔は、生体適合性高分子材料または第１の高分子材料の構造を貫通するように設計される。
【0020】
いくつかの実施形態では、培養チャンバは、培養液で満たされ、生体適合性高分子材料は、培養液中に入れる。一実施形態では、培養チャンバは、培養液を含有する。
【0021】
様々な実施形態では、周期的引張力は、複数の引張成分によって加えられる。成長刺激促進構造を有する生体適合性高分子材料は、複数の引張成分の周期的引張力によって訓練される。一実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、２．５～５０％の引張ひずみである。好ましい実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、５～４０％の引張ひずみである。より好ましい実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、１０～３０％の引張ひずみである。別の実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、周波数０．１～４Ｈｚにおけるものである。好ましい実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、周波数０．２～２Ｈｚにおけるものである。より好ましい実施形態では、複数の引張成分によって加えられる周期的引張力は、周波数０．３～１Ｈｚにおけるものである。一実施形態では、複数の引張成分は、生体適合性高分子材料に周期的一軸引張力をもたらす。別の実施形態では、複数の引張成分の周期的引張力は、生体適合性高分子材料と共に水平方向に加えられる。したがって、エキソソーム産生細胞を含む生体適合性高分子材料は、エキソソームを放出するように細胞を刺激するための周期的引張力により処理される。
【0022】
本発明において、生体適合性高分子材料は、１週間以上にわたって周期的引張力で処理され、次いで、生体適合性高分子材料中のエキソソーム産生細胞からエキソソームが回収される。一実施形態では、ステップ（ｃ）におけるエキソソームの回収は、周期的引張力が加えられてから約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月、約２ヶ月、または約３ヶ月後に行われる。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）におけるエキソソームの回収は、周期的引張力が加えられてから約１～２ヶ月後に行われる。別の実施形態では、周期力が加えられてから１ヶ月後に回収されたエキソソームの数は、細胞あたり０．１ｘ１０６～２ｘ１０６である。好ましい実施形態では、周期力が加えられてから１ヶ月後に回収されたエキソソームの数は、細胞あたり０．５ｘ１０６～１．５ｘ１０６である。
【0023】
細胞に周期的引張力を加えたときに、細胞は、単一細胞から自己組織化三次元（３Ｄ）細胞スフェロイドに変化し、大量のＹｅｓ関連タンパク質（ＹＡＰ）を発現する。本発明では、周期的引張力が細胞を刺激して、大量のＹＡＰタンパク質を発現させることができ、ＹＡＰタンパク質により、細胞は３Ｄスフェロイドを形成させることができ、その結果、エキソソームの分泌が大幅に増加することを示している。一実施形態では、エキソソーム産生細胞の形態は、周期的引張力下で３Ｄ細胞スフェロイドに変化する。別の実施形態では、エキソソーム産生細胞は、周期的引張力下で大量のＹＡＰタンパク質を発現する。このように、本発明の周期的引張バイオリアクターを用いた３Ｄ細胞培養法は、エキソソームを大規模に産生することができる。
【0024】
本発明はまた、融合タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）タンパク質を含む。
【0025】
また、融合タンパク質をコードする配列は、核酸配列である。いくつかの態様では、融合タンパク質をコードする配列は、標的タンパク質をコードする第１の配列と、エキソソーム膜貫通タンパク質をコードする第２の配列とを含む。一実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、配列番号１を含む。好ましい実施形態では、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質（標的タンパク質）を包含する第１の配列は、配列番号１を含む。
【0026】
本発明において、エキソソーム膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質または膜会合タンパク質である。別の実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ－１、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ－２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン－１、シンデカン－２、シンデカン－３、シンデカン－４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＡＲＲＤＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、またはこれらの組み合わせを含む。好ましい実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む。より好ましい実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３を含む。
【0027】
本発明において、ポリヌクレオチドは、プロモーターをさらに含み、これは、融合タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。本明細書において使用される場合、「プロモーター」は、細胞内の核酸の発現を付与する、活性化させるまたは増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／またはその空間的発現及び／または時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、駆動して、融合タンパク質をコードする配列の上流に連結することができる。連結できるプロモーターとしては、標的細胞においてプロモーター活性を示す限り、特に限定されない。融合タンパク質をコードする配列に連結することができるプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＥＦＳプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＭＨＣプロモーター、ＭＹＯＤプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲａｌｐｈプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする配列を調節するために使用されるプロモーターをさらに含む。
【0028】
さらに、本発明はさらに、ベクターを提供し、ここで、ベクターは、ポリヌクレオチドを担持している。したがって、融合タンパク質をコードする配列を有するポリヌクレオチドは、ベクター中にある。本発明においては、それぞれ異なる配列断片を担持する１つ以上のベクターが使用される。
【0029】
一実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用するプラスミドベクターは特に限定されず、任意のプラスミドベクター（クローニングプラスミドベクター及び発現プラスミドベクターなど）であってよい。本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターは、公知の方法により本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することによって調製される。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスまたはセンダイウイルスベクターを含む。本明細書において、「ウイルスベクター」には、その誘導体も含む。本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。別の実施形態では、非ウイルスベクターは、リポソームまたは脂質ナノ粒子を含む。
【0030】
いくつかの態様では、エキソソーム産生細胞は、ポリヌクレオチドを担持するベクターでトランスフェクトされる。したがって、エキソソーム産生細胞は、通常、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。したがって、正常にトランスフェクトされた細胞は、単一、二重または多重に安定な細胞株を産生することができる。単一の安定細胞株は、単一のポリヌクレオチドのトランスフェクションのみを必要とすることによりエキソソームの産生が簡素化されるので有利である。
【0031】
好ましくは、エキソソーム産生細胞は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより安定にトランスフェクトされ、これにより、安定な細胞株が生成されるようになる。この利点により、均一な品質及び収量のエキソソームが一貫して産生される。エキソソーム産生細胞は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための本質的に任意の非ウイルスまたはウイルスの方法を用いて、少なくとも１つのポリヌクレオチドで遺伝子改変され得る。ポリヌクレオチドをエキソソーム産生細胞に導入するための好適な方法としては、ＰＥＩなどのポリカチオンを用いたトランスフェクション、リポフェクタミン（ＲＴＭ）などの脂質ベースのトランスフェクション試薬、レンチウイルス形質導入、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド挿入、Ｆｌｐ－Ｉｎシステム、トランスポゾンシステム、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション、及びリン酸カルシウムトランスフェクションが挙げられる。エキソソーム産生細胞にポリヌクレオチドを導入する方法の選択は、細胞源の選択、ベクターの性質及び特性（例えば、ベクターがプラスミドまたはミニサークルの場合、例えば、直鎖状ＤＮＡポリヌクレオチドまたはｍＲＮＡである場合）、ならびに必要なコンプライアンス及び制御のレベルなど、様々なパラメータに依存する。同様に、安定な細胞株を作製するためのエキソソーム産生細胞の不死化は、ｈＴＥＲＴ媒介不死化、転写因子不死化、Ｅ１／Ｅ２不死化または他のウイルス媒介不死化技術など、細胞株開発の技術分野において周知の技術を使用することによって達成することができる。これにより、正常にトランスフェクトされたエキソソーム産生細胞は、融合タンパク質を有するエキソソームを放出することができる。
【0032】
追加の態様では、本発明は、融合タンパク質を含むエキソソームの産生方法を提供し、本方法は、（１）ポリヌクレオチドをエキソソーム産生細胞に導入することであって、ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードする配列を含み、融合タンパク質が、タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、タンパク質が、抗ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）タンパク質を含む、導入することと；（２）エキソソーム産生細胞が融合タンパク質を含むエキソソームを産生できるようになることと、を含む。
【0033】
一実施形態では、エキソソーム産生細胞は、哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、エキソソーム産生細胞は、胚性腎細胞を含む。より好ましい実施形態では、エキソソーム産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。
【0034】
本発明はまた、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含む融合タンパク質を提供し、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。配列番号２のペプチド配列は、配列番号１の核酸配列によって生成される。
【0035】
本発明はまた、融合タンパク質を含む細胞を提供し、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。一実施形態では、細胞は、エキソソーム産生細胞である。
【0036】
いくつかの態様では、標的タンパク質は、エキソソーム膜貫通タンパク質と直接接続して融合タンパク質を形成する。エキソソーム膜貫通タンパク質を使用することにより、エキソソーム膜の外側に標的タンパク質を構成することが可能になる。この構成は、組織上の分子への結合を可能にするために、標的タンパク質を外部に露出させる補助を行う。好適なエキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＩＣＡＭ、インテグリン、ＡＲＲＤＣ１、アネキシン、及び任意の他のエキソソームポリペプチド、ならびにそれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または領域を含む群から選択され得る。非限定的な例は、ＣＤ６３などのタンパク質であり得る。
【0037】
本発明はまた、融合タンパク質を含むエキソソームを提供し、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。一実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む。好ましい実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３を含む。
【0038】
一実施形態では、エキソソームは、治療剤をさらに含む。好ましい実施形態では、治療剤は、抗体、抗体断片、抗体誘導体、単一ドメイン抗体、イントラボディ、一本鎖可変断片、アフィボディ親和性体、酵素、輸送体、腫瘍抑制因子、ウイルスまたは細菌阻害剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害剤及び誘導因子、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜輸送体、ヌクレオチド結合タンパク質、熱ショックタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及びこれらの組み合わせを含む。治療剤は、エキソソームに取り込むことができる。したがって、治療用エキソソームは、融合タンパク質を含むエキソソームに治療剤を導入／取り込むことによって得られる。
【0039】
一実施形態では、治療剤は、抗がん剤を含む。好ましい実施形態では、抗がん剤は、化学療法剤を含む。より好ましい実施形態では、抗がん剤は、がんを治療するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を含む。
【0040】
別の実施形態では、化学療法剤は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチナ、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、アリサ（登録商標）、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、ＣＰＴ－１１、インターフェロンアルファ、ｐｅｇ化インターフェロンアルファ（例えば、ＰＥＧイントロン－Ａ）、カペシタビン、シスプラチン、ハーセプチン、パージェタ、エピルビシン、ペメトレキセド、チオテパ、フルダラビン、リポソームダウノルビシン、シタラビン、パシリタキセル、ビンブラスチン、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート（ｐａｌｍｉｔｒｏｎａｔｅ）、バイアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、ガンシクロビル、アドリアマイシン、ナトリウム（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、スリンダク、エトポシド、またはこれらの組み合わせを含む。好ましい実施形態では、化学療法剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソテール（Ｔａｘｏ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐ）、ハーセプチン、パージェタ、エピルビシン（Ｅｐｉｒ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅ）、またはこれらの組み合わせを含む。より好ましい実施形態では、化学療法剤は、ドキソルビシンを含む。
【0041】
別の実施形態では、がんを治療するためのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ、ｍｉＲ－３４ｃ、ｍｉＲ－４９７、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２９０、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３３９－５ｐまたはｍｉＲ－４０９－３ｐを含む。別の実施形態では、がんを治療するためのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－３４ａを含む。
【0042】
本発明は、融合タンパク質を含むエキソソームを含む組成物を提供し、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。
【0043】
本発明は、がんを有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、がんを有する対象に組成物を投与することを含み、組成物は、治療用エキソソームを含み、治療用エキソソームは、融合タンパク質及び抗がん剤を含み、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。一実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む。好ましい実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３を含む。
【0044】
本発明は、がんを治療するための薬物を調製するための組成物の使用を提供し、組成物は、治療用エキソソームを含み、治療用エキソソームは、融合タンパク質及び抗がん剤を含み、融合タンパク質は、標的タンパク質及びエキソソーム膜貫通タンパク質を含み、標的タンパク質は、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を含み、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質の配列は、配列番号２を含む。一実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１を含む。好ましい実施形態では、エキソソーム膜貫通タンパク質は、ＣＤ６３を含む。
【0045】
「治療する」という用語は、これらに限定するものではないが、がん細胞の成長を減少させる、阻害するまたは制限すること、がん細胞の転移、がん細胞または転移の浸潤性を減少させる、阻害するまたは制限すること、がんまたはその転移の１つ以上の症状を減少させる、阻害するもしくは制限することを包含する。本明細書において使用される場合、「がん細胞の成長を阻害する」とは、がん細胞の増殖及び／もしくは遊走の速度を低下させる、がん細胞の増殖及び／もしくは遊走を停止させる、がん細胞を殺傷させる、または細胞生存率を低下させることを指し、これにより、未処置の対照がん細胞の成長が観察されたかまたは予測された成長殖速度と比較して、がん細胞成長速度が低下するものを指す。「成長を阻害する」という用語はまた、がん細胞または腫瘍のサイズの減少または消失、ならびにその転移能の減少を指すこともできる。好ましくは、細胞レベルでのそのような阻害は、サイズを縮小する、成長を阻止する、及び腫瘍の存在を減少させることが可能である。
【0046】
本明細書において使用される用語「がん」または「腫瘍」は、細胞の集団が、調節されていない細胞の成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または記載する。がんは、非固形腫瘍または固形腫瘍であり得る。がんの例としては、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。このようながんのより具体的な例としては、特に、乳癌、口腔癌、髄芽腫、前立腺癌、扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、卵巣腺癌、肝癌、膀胱癌、肝腫、結腸癌、大腸癌、胃癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、及び様々な種類の頭頸部癌、血液悪性腫瘍、急性骨髄性白血病、リンパ腫、及び白血病、及び黒色腫が挙げられる。一実施形態では、がんは、乳癌、肺癌、口腔癌、肝癌、大腸癌、膠芽腫、髄芽腫、膀胱癌、膵癌、または卵巣癌を含む。好ましい実施形態では、がんは、乳癌を含む。
【0047】
一実施形態では、対象は、動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【0048】
別の実施形態では、抗がん剤は、がんを治療するための化学療法剤及び／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を含む。好ましい実施形態では、化学療法剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソテール（Ｔａｘｏ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐ）、ハーセプチン、パージェタ、エピルビシン（Ｅｐｉｒ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃ）、またはペメトレキセド（Ｐｅｍｅ）、またはこれらの組み合わせを含む。より好ましい実施形態では、化学療法剤は、ドキソルビシンを含む。別の実施形態では、がんを治療するためのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－３４ａを含む。
【0049】
本発明において、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質とは、抗ＨＬＡ－Ｇ機能を有するタンパク質またはペプチドである。したがって、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、ＨＬＡ－Ｇ分子に特異的に結合することができる。特に、本発明における配列番号２の配列は、ＨＬＡ－Ｇに対してより高い親和性を呈する。いくつかの態様では、ＨＬＡ－Ｇ分子は、がん細胞上に発現する。したがって、抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質を有するエキソソームは、がん細胞に特異的に結合することができ、がんの治療における薬物送達手段として使用される。
【0050】
いくつかの実施形態では、治療用エキソソームは、薬学的に許容される担体と共に投与される。用語「薬学的に許容される担体」は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに有害ではない任意の担体、希釈剤または賦形剤を指す。薬学的に許容される担体は、選択された投与経路及び標準的な薬学的慣行に基づいて選択することができる。治療用エキソソームは、医薬調製物の分野における標準的な慣行に従って、製剤化して、剤形にすることができる。好適な剤形としては、これらに限定されないが、例えば、液剤、非経口液剤、注射用液剤、トローチ剤、坐剤、または懸濁液が挙げられる。
【0051】
治療用エキソソームを含む本発明の組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入による、頬側投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、及び関節内、またはそれらの組み合わせなど、様々な経路によって対象に投与することができる。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内または非経口投与によって投与される。別の実施形態では、組成物は、腫瘍への直接注射によって投与される。
【0052】
非経口投与の場合、活性剤は、好適な担体または希釈剤、例えば、これらに限定されないが、水、油（例えば、植物油）、エタノール、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水または生理食塩水）、水性デキストロース（グルコース）及び関連糖溶液、グリセロール、またはプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールと混合することができる。安定化剤、抗酸化剤及び防腐剤も添加され得る。好適な抗酸化剤としては、これらに限定されないが、亜硫酸塩、アスコルビン酸、クエン酸及びその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。好適な防腐剤としては、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベン、及びクロルブタノールが挙げられる。非経口投与のための組成物は、水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョンの形態をとり得る。
【0053】
本発明によれば、治療用エキソソームを含む組成物の投与量は、治療に有効な量である限り、特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、投与方法などに応じて適宜最適化することができる。組成物は、好ましくは、単位剤形である。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割される。
【0054】
がんを治療するための方法は、がんの成長を減少させる、阻害するまたは制限するために治療有効量の治療用エキソソームを投与することを含む。用語「治療有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的結果及び／または臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。一実施形態では、「治療有効量」は、未処置の対照がんの観察されたかまたは予測された成長速度と比較して、がん細胞の成長を阻害する、減少させるまたは制限するのに十分な量である。
【0055】
抗がん剤、ｍｉＲまたは治療用エキソソームの投与量は、典型的には、約０．０００１または０．００１または０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、他の要因の中でも、組成物の活性、その生物学的利用能、投与様式、及び上で論じた様々な要因に応じて、より多くまたは少なくすることができる。投与量及び間隔は、治療効果または予防効果を維持するのに十分なエキソソームの局所及び／または全身濃度をもたらすために個別に調節することができる。例えば、組成物は、特に、投与様式、治療される特定の適応症、及び処方する医師の判断に応じて、週に１回、週に数回（例えば、１日おき）、１日１回、または１日に複数回投与することができる。当業者であれば、過度の実験なく、効果的な局所投与量を最適化することができる。一実施形態では、化学療法剤の治療有効量は、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の実施形態では、がんを治療するためのマイクロＲＮＡの治療有効量は、０．０１～１ｍｇ／ｋｇ重量である。
【0056】
また、本発明においては、融合タンパク質を含むエキソソーム産生細胞を、本発明の周期的引張バイオリアクターに適用することができる。エキソソームは、免疫原性の欠如及び異なる臓器内に効率的にホーミングする能力など、様々な利点のため、送達ビヒクルとして有利である。したがって、本発明の周期的引張バイオリアクターを用いた培養方法は、エキソソームの生物学的性質を保持し、融合タンパク質を含有するエキソソームの一貫した大規模産生に好適であり、これらのエキソソームが薬剤（例えば治療剤）の送達手段として好適になる。
【実施例0057】
本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載の実施例に限定して解釈されるべきではない。記載された実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【0058】
材料及び方法
ベクターの構築及び細胞株の樹立
抗ＨＬＡ－Ｇ ＶＨＨ／ＣＤ６３融合タンパク質をコードする配列を合成し、分子クローニング技術によりｐｃＤＮＡ３．４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直列に挿入して、抗ＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．４－αＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３）を作製した。インサートのＤＮＡ配列は、サンガーシーケンシング法によって検証した。安定した発現細胞株を樹立するために、２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．４－αＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３でトランスフェクトした。トランスフェクション後、安定にトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をＧ４１８（８００μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）での培養により選択した。２９３Ｔ細胞は、抗ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ６３融合タンパク質を有するエキソソームをカーゴエキソソーム（ＣＡＲＥｘｏ）として産生することができた。
ベクターの構築及び細胞株の樹立
抗ＨＬＡ－Ｇ ＶＨＨ／ＣＤ６３融合タンパク質をコードする配列を合成し、分子クローニング技術によりｐｃＤＮＡ３．４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直列に挿入して、抗ＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．４－αＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３）を作製した。インサートのＤＮＡ配列は、サンガーシーケンシング法によって検証した。安定した発現細胞株を樹立するために、２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．４－αＨＬＡ－Ｇ－ＣＤ６３でトランスフェクトした。トランスフェクション後、安定にトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をＧ４１８（８００μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）での培養により選択した。２９３Ｔ細胞は、抗ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ６３融合タンパク質を有するエキソソームをカーゴエキソソーム（ＣＡＲＥｘｏ）として産生することができた。
【0059】
抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列は：ＡＧＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＡＧＡＴＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＴ（配列番号１）である。
【0060】
抗ＨＬＡ－Ｇタンパク質のペプチド配列は：ＳＡＧＨＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＫＬＳＣＶＴＳＡＹＴＦＳＡＳＧＮＣＭＧＷＬＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＩＡＡＴＹＴＲＳＡＫＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＧＬＫＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＶＡＲＣＡＧＲＰＤＲＳＴＬＴＳＦＡＷＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＬＥＴＧ（配列番号２）である。
【0061】
Ｅｘｏ及びＣＡＲＥｘｏの作製及び特徴付け
エキソソーム（ＥｘｏまたはＣＡＲＥｘｏ）を得るために、培地を２０００ｇで１５分間遠心分離して、細胞デブリを除去し、０．２２μｍの濾紙で濾過した。次いで、上清を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ，３０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、５０００ｇで８分間濃縮した。回収した上清をタンジェンシャルフロー濾過（ＭＡＰ．０３プラスＴＦＦシステム、Ｌｅｆｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を使用して、分子量３００ｋＤａのメンブレンで順次濾過し、上記で詳述したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）によって再懸濁した。すべてのサンプルは、即時使用に４℃で操作したが、さらに使用するために－８０℃で保存した。単離後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを１％グルタルアルデヒドで、４℃で一晩固定した。洗浄後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏをホルムバーカーボンコーティンググリッドに添加し、リンタングステン酸水溶液で１分間陰性染色した。Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの超微細構造を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって解析した。
エキソソーム（ＥｘｏまたはＣＡＲＥｘｏ）を得るために、培地を２０００ｇで１５分間遠心分離して、細胞デブリを除去し、０．２２μｍの濾紙で濾過した。次いで、上清を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ，３０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、５０００ｇで８分間濃縮した。回収した上清をタンジェンシャルフロー濾過（ＭＡＰ．０３プラスＴＦＦシステム、Ｌｅｆｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を使用して、分子量３００ｋＤａのメンブレンで順次濾過し、上記で詳述したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）によって再懸濁した。すべてのサンプルは、即時使用に４℃で操作したが、さらに使用するために－８０℃で保存した。単離後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを１％グルタルアルデヒドで、４℃で一晩固定した。洗浄後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏをホルムバーカーボンコーティンググリッドに添加し、リンタングステン酸水溶液で１分間陰性染色した。Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの超微細構造を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって解析した。
【0062】
これらのＥｘｏは、エキソソームのサイズ分布及び濃度を分析するために、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ，ＺｅｔａＶｉｅｗ（登録商標）、ＰＰａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ ＧｍｂＨ，Ｍｅｅｒｂｕｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってもアッセイした。バイオマーカーを分析するために、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを、抗ＣＤ９抗体（ａｂ２３９６８５，Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ６３抗体（ａｂ２３９６８６，Ａｂｃａｍ）及び抗ＣＤ８１抗体（ａｂ２３９６８７，Ａｂｃａｍ）でコーティングした磁気キャプチャビーズと室温で１２時間浸漬し、穏やかに混合した。事前に結合させたＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを洗浄し、ＤｙｎａＭａｇ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０分間置いた後、上清を廃棄した。ビーズ結合したＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏをバッファーに再懸濁し、ＰＥ抗ＣＤ９抗体（Ｅ－ＡＢ－Ｆ１０８６Ｄ，Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、またはＰＥ抗ＣＤ６３抗体（ａｂ２０５５４０，Ａｂｃａｍ）、または抗ＣＤ８１抗体（Ｅ－ＡＢ－Ｆ１０７３Ｄ，Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ）と共に４℃で２時間インキュベートした。ＰＥ（フィコエリトリン）標識ビーズ結合Ｅｘｏを、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。さらに、ウエスタンブロッティングを使用して、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ７０、Ａｌｉｘ、βチューブリン（Ａｂｃａｍ）などの特定のＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏバイオマーカーを決定した。
【0063】
Ｅｘｏ取り込みアッセイ
ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを２ｍＬ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ１０Ａ培地（１０９Ｅｘｏ／ｍＬ）で混合した。最初に、これら２つの細胞株をμスライドウェル（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｇｒａｆｅｌｆｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で６０％コンフルエントまで成長させて、次いで培地を、ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏを含む培地と交換した。６時間、１２時間、及び２４時間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、固定し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ファロイジン及びＤＡＰＩで染色した。洗浄後、細胞の画像を蛍光顕微鏡（ＢＸ５３，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影した。
ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを２ｍＬ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ１０Ａ培地（１０９Ｅｘｏ／ｍＬ）で混合した。最初に、これら２つの細胞株をμスライドウェル（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｇｒａｆｅｌｆｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で６０％コンフルエントまで成長させて、次いで培地を、ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏを含む培地と交換した。６時間、１２時間、及び２４時間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、固定し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ファロイジン及びＤＡＰＩで染色した。洗浄後、細胞の画像を蛍光顕微鏡（ＢＸ５３，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影した。
【0064】
細胞生存率
細胞は、異なる時点で回収するために、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを含む９６ウェルで培養し、培養培地を回収し、ＰＢＳ溶液で洗浄してあらゆる残留培地を除去した。テトラゾリウム色素ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：９の比率で新鮮培地に混合し、呼吸鎖に作用することによって機能する細胞生存率を評価するために行った。３時間の反応後、ＭＴＴ剤を除去し、ＤＭＳＯを加えて２０分間放置し、ホルマザン結晶を溶解し、９６ウェルに均等に再分配した。吸光度は、細胞生存率を評価するために波長５７０ｎｍで測定することによって定量した。
細胞は、異なる時点で回収するために、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを含む９６ウェルで培養し、培養培地を回収し、ＰＢＳ溶液で洗浄してあらゆる残留培地を除去した。テトラゾリウム色素ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：９の比率で新鮮培地に混合し、呼吸鎖に作用することによって機能する細胞生存率を評価するために行った。３時間の反応後、ＭＴＴ剤を除去し、ＤＭＳＯを加えて２０分間放置し、ホルマザン結晶を溶解し、９６ウェルに均等に再分配した。吸光度は、細胞生存率を評価するために波長５７０ｎｍで測定することによって定量した。
【0065】
免疫蛍光
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－１０Ａ細胞（密度５ｘ１０４細胞／ｍＬ）をカバースリップ付き３５ｍｍディッシュに播種し、１２時間接着させた。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－１０Ａ細胞を、いずれかのナノプローブ（０μＭ及び５μＭ）の存在下で、３７℃で６時間培養した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳと共に４％パラホルムアルデヒドを用いて同時に透過処理した。次に、０．１Ｍグリシンを含むＰＢＳでクエンチし、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡで、４℃で一晩ブロッキングした。固定し、透過処理した細胞を、指示のとおり、一次抗体及び二次抗体で染色した。次いで、細胞を、室温で５分間、ＤＡＰＩ溶液により染色した。ヤギ抗マウスＩｇＧ ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）（ａｂ１５０１１５）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ ｈ＆ＬＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）（ａｂ１５００７７）をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手した。細胞形態は、レーザー共焦点顕微鏡（Ｚｅｓｓｉｓ，ＬＳＭ８００，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－１０Ａ細胞（密度５ｘ１０４細胞／ｍＬ）をカバースリップ付き３５ｍｍディッシュに播種し、１２時間接着させた。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－１０Ａ細胞を、いずれかのナノプローブ（０μＭ及び５μＭ）の存在下で、３７℃で６時間培養した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳと共に４％パラホルムアルデヒドを用いて同時に透過処理した。次に、０．１Ｍグリシンを含むＰＢＳでクエンチし、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡで、４℃で一晩ブロッキングした。固定し、透過処理した細胞を、指示のとおり、一次抗体及び二次抗体で染色した。次いで、細胞を、室温で５分間、ＤＡＰＩ溶液により染色した。ヤギ抗マウスＩｇＧ ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）（ａｂ１５０１１５）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ ｈ＆ＬＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）（ａｂ１５００７７）をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手した。細胞形態は、レーザー共焦点顕微鏡（Ｚｅｓｓｉｓ，ＬＳＭ８００，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
【0066】
ｍｉＲＮＡ及びドキソルビシン（ＤＯＸ）含有Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの調製
Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏに外因性カーゴを取り込むために、ｍｉＲ－３４ａ及びドキソルビシンをエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの量は、１ｘ１０９（ＮＴＡで測定）であり、エレクトロポレーション前にｍｉＲ－３４ａを含むバッファーと混合した。エレクトロポレーション後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを３７℃で１時間静置した。その後、ドキソルビシン１ｍｇと混合し、３７℃で６０分間反応させた後、４℃に切り替えて３０分間反応させ、その後、２０μＬのＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えて十分に混合し、４℃で１６時間反応させた。反応後、１５００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を吸引除去し、２００μＬ ＰＢＳを加えて洗浄し、遠心分離により除去し、上記のＰＢＳ洗浄を２回繰り返し、最後に１００μＬ ＰＢＳを加えてエキソソームを均一に分散させた。完了したときに、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの数をＮＴＡにより再分析し、薬物送達中に喪失したＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの数を分析した。
Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏに外因性カーゴを取り込むために、ｍｉＲ－３４ａ及びドキソルビシンをエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの量は、１ｘ１０９（ＮＴＡで測定）であり、エレクトロポレーション前にｍｉＲ－３４ａを含むバッファーと混合した。エレクトロポレーション後、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏを３７℃で１時間静置した。その後、ドキソルビシン１ｍｇと混合し、３７℃で６０分間反応させた後、４℃に切り替えて３０分間反応させ、その後、２０μＬのＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えて十分に混合し、４℃で１６時間反応させた。反応後、１５００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を吸引除去し、２００μＬ ＰＢＳを加えて洗浄し、遠心分離により除去し、上記のＰＢＳ洗浄を２回繰り返し、最後に１００μＬ ＰＢＳを加えてエキソソームを均一に分散させた。完了したときに、Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの数をＮＴＡにより再分析し、薬物送達中に喪失したＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの数を分析した。
【0067】
生体分布
本発明は、腫瘍異種移植マウスモデル（ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウス）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの腫瘍標的効果を評価した。ＰＢＳ、Ｅｘｏ、及びＣＡＲＥｘｏは、１００μＬ（５ｘ１０１０Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏ）の尾静脈を介して注射させた。マウスは、異なる時点で走査し、２４時間で屠殺した。
本発明は、腫瘍異種移植マウスモデル（ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウス）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥｘｏ／ＣＡＲＥｘｏの腫瘍標的効果を評価した。ＰＢＳ、Ｅｘｏ、及びＣＡＲＥｘｏは、１００μＬ（５ｘ１０１０Ｅｘｏ／ＣＡＲＥｘｏ）の尾静脈を介して注射させた。マウスは、異なる時点で走査し、２４時間で屠殺した。
【0068】
Ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
異種移植片腫瘍モデルは、０．１ｍＬのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞懸濁液（５ｘ１０６／１００μＬ）を右脇腹ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）ヌードマウスに注射することによって作製した。確立されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍（１５０～２００ｍｍ３）担持マウスを無作為に群に分類し、その群を次のように処置した：（ｉ）対照としてのＰＢＳ；（ｉｉ）Ｅｘｏ－ｍｉＲ；（ｉｉｉ）Ｅｘｏ－薬物；（ｉｖ）Ｅｘｏ－薬物－ｍｉＲ（薬物当量は、５ｍｇ／ｋｇ、ｍｉＲ当量は０．１ｎｍｏＬ／ｋｇ）。薬物は、７週間連続して尾静脈から毎週注射した。マウスの体重を測定し、腫瘍を４日毎にノギスにより測定した。腫瘍体積は、次式を用いて計算した：腫瘍体積＝（長さｘ幅ｘ幅）／２。
異種移植片腫瘍モデルは、０．１ｍＬのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞懸濁液（５ｘ１０６／１００μＬ）を右脇腹ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）ヌードマウスに注射することによって作製した。確立されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍（１５０～２００ｍｍ３）担持マウスを無作為に群に分類し、その群を次のように処置した：（ｉ）対照としてのＰＢＳ；（ｉｉ）Ｅｘｏ－ｍｉＲ；（ｉｉｉ）Ｅｘｏ－薬物；（ｉｖ）Ｅｘｏ－薬物－ｍｉＲ（薬物当量は、５ｍｇ／ｋｇ、ｍｉＲ当量は０．１ｎｍｏＬ／ｋｇ）。薬物は、７週間連続して尾静脈から毎週注射した。マウスの体重を測定し、腫瘍を４日毎にノギスにより測定した。腫瘍体積は、次式を用いて計算した：腫瘍体積＝（長さｘ幅ｘ幅）／２。
【0069】
組織回収及びヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色
マウスは、１ｍＬ／ｋｇの用量で、水和クロラール水溶液（３％ｗ／ｖ）の腹腔内注射を使用して麻酔した。その後、屠殺させ、血液のサンプルを採取し、腹腔を露出させた。肝臓、肺、脾臓、心臓及び腎臓のサンプルを回収し、ヘマトキシリン－エオジン染色の前に１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に一時的に保存した。
マウスは、１ｍＬ／ｋｇの用量で、水和クロラール水溶液（３％ｗ／ｖ）の腹腔内注射を使用して麻酔した。その後、屠殺させ、血液のサンプルを採取し、腹腔を露出させた。肝臓、肺、脾臓、心臓及び腎臓のサンプルを回収し、ヘマトキシリン－エオジン染色の前に１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に一時的に保存した。
【0070】
ＮＢＦ（ｐＨ７．２～７．４）は、ホルムアルデヒドの４０％ｖ／ｖ水溶液１００ｍＬ、無水リン酸水素二ナトリウム（６．５ｇ）、リン酸二水素ナトリウム（４．０ｇ）及び蒸留水（９００ｍＬ）から調製した。肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓の組織を１０％ＮＢＦ溶液から回収した。組織切片を脱水し、パラフィン包埋し、切断し、ヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。
【0071】
３Ｄスフェロイドモデルの構築
すべての細胞をそれぞれの適切な培地で培養した。培養培地は、２日または３日ごとに交換した。脱細胞化肺ＥＣＭ包埋培養の前に、本発明では、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）溶液で処理することによって、各細胞型を回収し、１２００ｒｐｍで、１０分間、遠心分離によって細胞を回収し、細胞を各培養培地に分散させた。細胞懸濁液を、様々な細胞について最終濃度５ｘ１０６細胞ｍｌ－１となるようにＥＣＭのプレゲル溶液（４重量％）と混合した。各細胞封入プレゲル溶液のアリコートをマルチウェルプレートのウェルに移し、３７℃のインキュベーターに１時間入れた。ゲル化後、がんまたは内皮細胞用の培養培地をウェルに添加した。各培養培地は、２日または３日ごとに交換した。
すべての細胞をそれぞれの適切な培地で培養した。培養培地は、２日または３日ごとに交換した。脱細胞化肺ＥＣＭ包埋培養の前に、本発明では、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）溶液で処理することによって、各細胞型を回収し、１２００ｒｐｍで、１０分間、遠心分離によって細胞を回収し、細胞を各培養培地に分散させた。細胞懸濁液を、様々な細胞について最終濃度５ｘ１０６細胞ｍｌ－１となるようにＥＣＭのプレゲル溶液（４重量％）と混合した。各細胞封入プレゲル溶液のアリコートをマルチウェルプレートのウェルに移し、３７℃のインキュベーターに１時間入れた。ゲル化後、がんまたは内皮細胞用の培養培地をウェルに添加した。各培養培地は、２日または３日ごとに交換した。
【0072】
成長刺激促進構造を有する細胞含有ＦＧｅｌＭａヒドロゲルの調製
本発明では、鋳型成形プロセスを経て、成長刺激促進構造を有するヒドロゲルを作製した。成長刺激促進構造を有する細胞含有ヒドロゲルは引張バイオリアクターと適合性があるべきであることを考慮して、構築物を製造するために３つの成分、すなわちＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７溶液、ＧｅｌＭａ、及び細胞含有ＦＧｅｌＭａを使用した。押込み金型は、ＢｉｏＸバイオプリンタ（Ｃｅｌｌｉｎｋ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を蒸留水中３０重量％の濃度で用いて、設計し、印刷した。図１６Ａ～図１６Ｃは、成長刺激促進構築物の代表的な単位細胞を示す。金型印刷では、ステレオリソグラフィー（ＳＴＬ）モデルが、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓを使用して設計し、開発された。ＳＴＬファイルは、ｇコードファイルに変換させ、ｓｌｉ３ｅｒソフトウェアを使用して、バイオプリンタの動き及び印刷経路を決定するために使用した。内径１５０μｍのルアーロックノズルを備えたシリンジバレルに変色性（ｆｕｇｉｔｉｖｅ）インクを収容後、移動速度２５ｍｍ／ｓのシリンジを用いて、空気圧１７０ｋＰａを加えてスライドガラス上に変色性インクを堆積させ、直径約２５０μｍを有するフィラメントを形成した。成長刺激促進構築物の変色性型は、構築物の最終厚が２．１ｍｍに達するまで、層ごと（１層あたり１５０μｍ）に作製した。次に、１５重量％のＧｅｌＭａ及び０．５重量％のＩ－２９５９を含む加温した（３７℃）ＰＢＳを上記型に入れ、引張バイオリアクターに接続可能な、両側に２つの開口部を有する固定部を形成した（ＡＴＭＳ Ｂｏｘｅｒ ＱＱＡ Ｃｙｃｌｉｃ Ｓｔｒｅｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｅｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）（図１６Ａ）。細胞含有ＦＧｅｌＭａは、ＨＥＫ２９３Ｔ（または他の正常細胞株及び初代細胞）を、１０重量％ＦＧｅｌＭａを含む０．５％Ｉ－２９５９含有ＰＢＳと混合することによって得た。培養培地で培養したコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、密度５ｘ１０６細胞／ｍＬで加温したＦＧｅｌＭａ溶液に再懸濁した。次いで、細胞含有ヒドロゲルを試料の成長刺激促進部分に取り込んだ。試料を３７℃で１分間インキュベートして、ＧｅｌＭａ及びＦＧｅｌＭａを液体化した。ＵＶ照射（３６５ｎｍ）に９０秒間曝露後、試料を冷（４℃）ＰＢＳに１０分間浸漬し、変色性Ｆ－１２７を溶解した（図１６Ｂ）。周期的引張力を加えるために、試料を引張バイオリアクターに固定し、培養培地８ｍＬを加えた。培養期間中、細胞含有ヒドロゲルに２０％の引張ひずみを０．４８Ｈｚの周波数で連続的に加えた。静置条件下で培養した試料を対照群とした（図１６Ｃ）。すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、３７℃で５％ＣＯ２及び１００％湿度の細胞培養インキュベーターで実施し、培地は、２日ごとに新鮮なものにした。
本発明では、鋳型成形プロセスを経て、成長刺激促進構造を有するヒドロゲルを作製した。成長刺激促進構造を有する細胞含有ヒドロゲルは引張バイオリアクターと適合性があるべきであることを考慮して、構築物を製造するために３つの成分、すなわちＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７溶液、ＧｅｌＭａ、及び細胞含有ＦＧｅｌＭａを使用した。押込み金型は、ＢｉｏＸバイオプリンタ（Ｃｅｌｌｉｎｋ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を蒸留水中３０重量％の濃度で用いて、設計し、印刷した。図１６Ａ～図１６Ｃは、成長刺激促進構築物の代表的な単位細胞を示す。金型印刷では、ステレオリソグラフィー（ＳＴＬ）モデルが、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓを使用して設計し、開発された。ＳＴＬファイルは、ｇコードファイルに変換させ、ｓｌｉ３ｅｒソフトウェアを使用して、バイオプリンタの動き及び印刷経路を決定するために使用した。内径１５０μｍのルアーロックノズルを備えたシリンジバレルに変色性（ｆｕｇｉｔｉｖｅ）インクを収容後、移動速度２５ｍｍ／ｓのシリンジを用いて、空気圧１７０ｋＰａを加えてスライドガラス上に変色性インクを堆積させ、直径約２５０μｍを有するフィラメントを形成した。成長刺激促進構築物の変色性型は、構築物の最終厚が２．１ｍｍに達するまで、層ごと（１層あたり１５０μｍ）に作製した。次に、１５重量％のＧｅｌＭａ及び０．５重量％のＩ－２９５９を含む加温した（３７℃）ＰＢＳを上記型に入れ、引張バイオリアクターに接続可能な、両側に２つの開口部を有する固定部を形成した（ＡＴＭＳ Ｂｏｘｅｒ ＱＱＡ Ｃｙｃｌｉｃ Ｓｔｒｅｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｅｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）（図１６Ａ）。細胞含有ＦＧｅｌＭａは、ＨＥＫ２９３Ｔ（または他の正常細胞株及び初代細胞）を、１０重量％ＦＧｅｌＭａを含む０．５％Ｉ－２９５９含有ＰＢＳと混合することによって得た。培養培地で培養したコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、密度５ｘ１０６細胞／ｍＬで加温したＦＧｅｌＭａ溶液に再懸濁した。次いで、細胞含有ヒドロゲルを試料の成長刺激促進部分に取り込んだ。試料を３７℃で１分間インキュベートして、ＧｅｌＭａ及びＦＧｅｌＭａを液体化した。ＵＶ照射（３６５ｎｍ）に９０秒間曝露後、試料を冷（４℃）ＰＢＳに１０分間浸漬し、変色性Ｆ－１２７を溶解した（図１６Ｂ）。周期的引張力を加えるために、試料を引張バイオリアクターに固定し、培養培地８ｍＬを加えた。培養期間中、細胞含有ヒドロゲルに２０％の引張ひずみを０．４８Ｈｚの周波数で連続的に加えた。静置条件下で培養した試料を対照群とした（図１６Ｃ）。すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、３７℃で５％ＣＯ２及び１００％湿度の細胞培養インキュベーターで実施し、培地は、２日ごとに新鮮なものにした。
【0073】
ＦＧｅｌＭａの合成及び特徴付け、ならびに引張バイオリアクターの設計及び適用は、Ｙｉ－Ｗｅｎ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｄｅｓｉｇｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １９５，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０２０，１０８９８２）に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0074】
ＹＡＰ阻害剤ＹＡＰの治療
以前の結果において、本発明は、ＨＥＫ２９３Ｔの引張刺激の存在は、細胞挙動において重要な役割を有する機械感受性転写活性化因子であるＹＡＰタンパク質の細胞活性化を介するものであると考えられた。したがって、最終的に、本発明は、ＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場をＹＡＰ阻害剤であるベルテポルフィン（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に曝露した。特定の日培養後、本発明では、免疫蛍光染色及び骨形成関連タンパク質を使用して、引張刺激におけるＹＡＰの役割を評価した。
以前の結果において、本発明は、ＨＥＫ２９３Ｔの引張刺激の存在は、細胞挙動において重要な役割を有する機械感受性転写活性化因子であるＹＡＰタンパク質の細胞活性化を介するものであると考えられた。したがって、最終的に、本発明は、ＨＥＫ２９３Ｔ含有成長刺激促進足場をＹＡＰ阻害剤であるベルテポルフィン（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に曝露した。特定の日培養後、本発明では、免疫蛍光染色及び骨形成関連タンパク質を使用して、引張刺激におけるＹＡＰの役割を評価した。
【0075】
結果
カーゴ工学技術を有するもの、有さないものの、エキソソームの特徴を検証した。形態学的結果は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）技術からのＥｘｏ及びＣＡＲＥｘｏの単離のＴＥＭ画像で確認した。結果は、カーゴ工学技術によるものであっても、同様のレベルのエキソソームサイズを示した（図１Ａ）。それらは、小胞中空特徴及び表面膜を明確に示した。ＮＴＡ分析では、直径のメインピークが１１０ｎｍ（Ｅｘｏ）及び１２０ｎｍ（ＣＡＲＥｘｏ）に別々にあることが示された（図１Ｂ）。これらの結果により、カーゴ工学技術による処置後も、エキソソームの形態が安定していることが判明した。
カーゴ工学技術を有するもの、有さないものの、エキソソームの特徴を検証した。形態学的結果は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）技術からのＥｘｏ及びＣＡＲＥｘｏの単離のＴＥＭ画像で確認した。結果は、カーゴ工学技術によるものであっても、同様のレベルのエキソソームサイズを示した（図１Ａ）。それらは、小胞中空特徴及び表面膜を明確に示した。ＮＴＡ分析では、直径のメインピークが１１０ｎｍ（Ｅｘｏ）及び１２０ｎｍ（ＣＡＲＥｘｏ）に別々にあることが示された（図１Ｂ）。これらの結果により、カーゴ工学技術による処置後も、エキソソームの形態が安定していることが判明した。
【0076】
エキソソーム表面膜上で一般的に濃縮されたＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ７１及びＡｌｉｘの存在を、抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ８１、抗ＨＳＰ７０、及び抗Ａｌｉｘを用いたウエスタンブロッティング分析を用いて分析した（図２Ａ）。細胞質マーカーβ－チューブリンは、エキソソーム中に存在しなかった。本発明の結果は、ＣＡＲＥｘｏが同様のエキソソーム特性マーカーの発現を有していたことを示した。フローサイトメトリー分析では、エキソソームマーカーＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１のレベルが、Ｅｘｏ群で検出されたことを示した（図２Ｂ）。さらに、カーゴ工学技術によるエキソソームの表面修飾は、親エキソソームの性能に影響を与えるものではなかった。
【0077】
多くの研究により、エキソソームは、特定の細胞標的に対する治療効果の理想的なカーゴとして使用できることが示されている（図３）。したがって、本発明では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１核におけるＣＡＲＥｘｏの取り込みについてさらに調べた。エキソソームトラッカー試薬ＰＫＨ６７（緑色）を用いてＣＡＲＥｘｏを染色後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と２４時間共培養した。その後、本発明では、Ｆ－アクチン細胞骨格試薬（赤）及び核試薬ＤＡＰＩ（青）をさらに用いて染色し、これらの画像は、共焦点顕微鏡により、エキソソームが核層（ＹＺ切片）に取り込まれていることを示した。したがって、ＣＡＲＥｘｏが、がんの精密治療に対して高い可能性を有することが重要な鍵であった。
【0078】
さらに、ＣＡＲＥｘｏが乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を特異的に標的とすることができることをさらに確認するために、本発明では、比較のために正常乳房細胞（ＭＣＦ１０Ａ）を用いた（図４）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－１０Ａを、異なる時点でＥｘｏ及びＣＡＲＥｘｏと別々にインキュベートし、６時間、１２時間、及び２４時間後に、免疫蛍光検出を実施した。この結果では、２３１細胞がＣＡＲＥｘｏに対して良好な親和性を有することが示された。１２時間後、大量のＣＡＲＥｘｏが取り込まれる可能性はあったが、Ｅｘｏの量は比較的少なかった。
【0079】
エキソソーム標的率は、フローサイトメトリーにより測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－１０ＡをＣＡＲＥｘｏ及びＥｘｏで６時間及び２４時間処置した（図５）。６時間では、２群において発現差はなかった。しかし、ＣＡＲＥｘｏで２４時間処置することにより、本発明では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１亜集団の大幅な増加を検出したが、Ｅｘｏでは、ほとんど変化がなかった。ＣＡＲＥｘｏは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を正確に標的とし、ＭＣＦ－１０Ａよりも効果的であった。
【0080】
ＣＡＲＥｘｏをがん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、赤）及び正常細胞（ＨＤＦ、薄緑色）と共培養した実験では、ＣＡＲＥｘｏ（緑）ががん細胞中に集中していることもわかり、これにより、ＣＡＲＥｘｏが、がん細胞に対して特異性を有することがさらに確認できた（図６）。
【0081】
図７は、ＭＤ－ＭＢＡ－２３１、ＭＣＦ１０Ａ細胞に対するＣＡＲＥｘｏ、Ｅｘｏ、及び対照（Ｃｔｌ）の細胞傷害性の評価を示す。共培養の６時間、１２時間、２４時間、４８時間後、ＣＡＲＥｘｏまたはＥｘｏのいずれも示さず、細胞生存の定量化は、これらのエキソソームが細胞傷害性を全く有さないことを示した。これらの結果は、３つの独立した実験を代表するものであった。
【0082】
ＣＡＲＥｘｏのｉｎ ｖｉｖｏ治療可能性における生体内分布をさらに評価するために、本発明では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いることによって、異種移植マウスモデルを構築した（図８）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果と一致して、ＣＡＲＥｘｏは、腫瘍を有意に標的としていたため、正常エキソソームの保存場所である肺及び脾臓ではほとんどシグナルが検出されなかった。
【0083】
さらに、理想的なエレクトロポレーションパラメータは、６００ｍＶ～８００ｍＶの範囲であり、これにより、エキソソームは、ｍｉＲ－３４ａを安定して運ぶことができた（図９）。その結果、７００ｍＶが最も優れた送達効率を示し、ＣＡＲＥｘｏは、３０ｎｇ ｍｉＲ－３４ａを検出でき、これを網羅する効率が、薬物送達の適用される高い可能性を有することを示唆するものである。ＣＡＲＥｘｏは、がん標的薬ドキソルビシン（Ｄｏｘ）を７００ｍＶの高効率で提供した。結果はさらに、Ｄｏｘを２０ｎｇのｍｉＲ－３４ａと一緒に送達させた場合に、優れた効率を示した。以上の結果は、このエレクトロポレーションパラメータにより、エキソソームに、２つの薬物を同時に安定して運ばせることができることを示した。
【0084】
次いで、本発明では、試験群をさらに６群：対照、薬物、ｍｉＲ、ＣＡＲＥｘｏ、ＣＡＲＥｘｏ－薬物及びＣＡＲＥｘｏ－ｍｉＲ－薬物に増加させて、がん細胞殺傷効力の検証結果を識別する（図１０）。２４時間後及び４８時間後、Ｅｘｏ－ｍｉＲ－薬物は、他の群よりも最良の細胞殺傷を示した。一方、ＣＡＲＥｘｏまたは薬物のみの効果は、約５０％であった。エキソソームのカクテルは、初回にがん細胞を効果的かつ迅速に殺傷させることができることが確認できる。
【0085】
次に、本発明をそれぞれＣＡＲＥｘｏ及びｍｉＲ－３４ａトラッカーで染色した（図１１）。予測どおり、ここでも、ＣＡＲＥｘｏ（緑）が、共局在現象を示す可能性のあるｍｉＲ－３４ａ（赤）を封入したことを検証する。
【0086】
本発明は、ＣＡＲＥｘｏエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍抑制に対して相加効果を有することをさらに示すことにした（図１２Ａ～１２Ｂ）。本発明では、４つの群：対照（Ｃｔｌ）、ＣＡＲＥｘｏ－ｍｉＲ（ｍｉＲ－３４ａ含有カーゴエキソソーム）、ＣＡＲＥｘｏ－薬物（ドキソルビシン含有カーゴエキソソーム）、及びＣＡＲＥｘｏ－薬物－ｍｉＲ（ｍｉＲ－１３４ａ及びドキソルビシン含有カーゴエキソソーム）を設計した。動物実験により、ＣＡＲＥｘｏ－薬物－ｍｉＲをマウスに皮下注射し、異なる時点で観察した。腫瘍形成に対する抑制効果は、他の群よりも優れていることを見出した（図１２Ａ）。腫瘍体積及び重量は、ＣＡＲＥｘｏ－薬物－ｍｉＲにおいて有意に減少した。次に、本発明では、他の臓器に対する細胞傷害性を確認することにした。治療試験では、肝臓及び肺、ならびに心臓、腎臓、及び脾臓などの他の臓器に焦点を当てた。ＨＥ染色は、上記の臓器が元の形態を保持していることを示した（図１２Ｂ）。ＣＡＲＥｘｏ－薬物－ｍｉＲが、腫瘍部位で安全かつ正確な標的であることが判明した。
【0087】
図１３では、本発明はまた、異なるがんモデル：ＭＢ１１（膠芽腫）、Ａ５４９（非小細胞肺癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＯＥＣＭ（口腔扁平上皮癌）、ＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞株）、及びＴ２４（膀胱癌）を用いて、ＣＡＲＥｘｏの有効性を試験した。
【0088】
加えて、本発明では、７つの群；対照（Ｃｔｌ）、ＤＯＸ（ドキソルビシン）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン含有リポソーム）、Ｅｘｏ（エキソソーム）、ＣＡＲＥｘｏ（カーゴエキソソーム）、ＤＯＸ＠Ｅｘｏ（ドキソルビシン含有エキソソーム）及びＤＯＸ＠ＣＡＲＥｘｏ（ドキソルビシン含有カーゴエキソソーム）を設計し、異なるがん細胞株を試験する。同様の結果は、異なるがん細胞株でも見られた（図１４）。乳癌（ＭＢ２３１）に加えて、肺癌（ＨＣＣ８２７）、口腔癌（ＯＥＣＭ）、肝癌（ＨｅｐＧ２）、大腸癌（ＣａＣＯ２）、膵癌（ＭＩＡＰａＣａ－２）、髄芽腫（Ｕ８７）、膀胱癌（Ｔ２４）、卵巣腺癌（ＳＫＯＶ３）などを対象とした。ＤＯＸ＠ＣＡＲＥｘｏが、良好な細胞傷害性を示し得ることが判明した。さらに、正常細胞では、ＣＡＲＥｘｏの細胞傷害性もＤＯＸ及びＬｉｐｏ－ＤＯＸの細胞傷害性よりも低かった。
【0089】
さらに、本発明は、エキソソームを介して、異なる化学療法剤（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、タキソテール（Ｔａｘｏ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃ）、及びペメトレキセド（Ｐｅｍｅ））を担持し、がん細胞を殺傷させるための担体として機能することもできる（図１５）。その結果、ＣＡＲＥｘｏに含有させた化学療法剤は、ＥＸＯよりもがん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）の殺傷効果が高く、ＤＯＸの以前の結果と同じ傾向を有していた。
【0090】
異なる濃度（１０％、１２．５％、及び１５％）を有するヒドロゲル足場では、様々な時点で周期的引張力を処理していたが、エキソソーム分泌効率に顕著な変化があった（図１７）。１５％ＦＧｅｌＭａ足場では、エキソソームは、１２．５％及び１０％より多く放出された。さらに、本発明は、細胞あたりのエキソソーム分泌の効率も評価した。１ヶ月間の周期引張処理後、エキソソーム分泌量は、１５％、１１．５％、及び１０％ＦＧｅｌＭａヒドロゲル足場において、それぞれ細胞あたり約１．０３ｘ１０６、細胞あたり０．９２ｘ１０６、及び細胞あたり０．８１ｘ１０６であった。本発明はまた、この実験を、エキソソームの産生に特化した市場のバイオリアクターと比較した。これらの結果から、ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ系は、長時間連続してエキソソームを回収できるが、１ヶ月後の収率は、１細胞あたり約０．４４ｘ１０６細胞であり、本発明の系よりもはるかに少ないことを見出すことができた。もう一方のＣｅｌＣｒａｄｌｅ（商標）は、浮遊培養に似た種類のバイオリアクターであった。長期間エキソソームを回収できなかったため、約２週間のみ試験を行うことができ、収率も本発明の系よりも少なかった。
【0091】
本発明はさらに、細胞骨格（Ｆ－アクチン、緑）、メカノセンシングマーカー（ＹＡＰ、赤）、及び核（青）の蛍光染色を使用して、伸展刺激によるヒドロゲル足場の細胞封入の変化を同定した（図１８）。図１８に示すとおり、細胞を３日間周期的引張により伸展させた後、細胞は、単一細胞から自己組織化三次元細胞スフェロイドに変化する一方で、静置培養群の細胞は、依然として単一細胞であることを見出すことができた。また、機械的力の刺激によって形成された三次元細胞スフェロイドは、スフェロイドの周囲に大量のＹＡＰタンパク質を発現するが、静置培養細胞ではほとんど発現しないため、本発明では、機械的な力の刺激を受けた細胞が、大量のＹＡＰタンパク質を発現し、三次元スフェロイドの形成後にエキソソームの分泌を増強させたと推測した。
【0092】
続いて、ＹＡＰタンパク質（ベルテポルフィン）阻害剤を周期的引張刺激のプロセスで添加した。蛍光染色から、阻害剤を添加しない群では、ＹＡＰタンパク質の発現、細胞スフェロイドの形態、及び分泌されるエキソソームの量が以前の結果と一致していることが示された（図１９Ａ）。阻害剤を添加した群の細胞形態は、自己組織化して三次元スフェロイドを形成することができない単一細胞であり、これは静的培養細胞に類似しており、エキソソームの分泌も大幅に減少して、周期的引張刺激群の５％となった（図１９Ｂ）。したがって、三次元培養下では、継続的な機械的刺激により、ＹＡＰタンパク質を活性化することにより細胞を三次元球状に形成させ、エキソソームの分泌を大幅に増加させることができることが推測された。
【0093】
静的／動的伸展後に細胞によって分泌されるエキソソームの出現を確認するために、本発明は、標準ＴＦＦプロトコールによって細胞外小胞を単離した（図２０）。透過型電子顕微鏡及びＮａｎｏｓｉｇｈｔサイズ分布分析により、５０～３５０ｎｍの小さい円形粒子の集団、及び１２２ｎｍのメインピークが示された。ウエスタンブロット分析では、テトラスパニンエキソソームマーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、及び細胞質マーカーβチューブリンが動的伸展下で著しく濃縮されることが示された。別のエキソソームマーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１のより適度な濃縮が静的伸展下で見られた。これらの結果は、組み合わせて、動的伸展からのエキソソーム様粒子の単離の成功が確認された。
【0094】
当業者は、寄託された出願情報を伝達するために使用される方法の説明として上記の概念を理解するであろう。当業者は、これらは例示にすぎず、多くの等価物が可能であることを認識している。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【配列表】
【外国語明細書】