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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023084009
(43)【公開日】2023-06-16
(54)【発明の名称】抗体組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 49/16 20060101AFI20230609BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20230609BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230609BHJP
【ＦＩ】
A61K49/16
G01N33/531 B
C07K16/00 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021198067
(22)【出願日】2021-12-06
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】305060567
【氏名又は名称】国立大学法人富山大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】川畑 隆司
(72)【発明者】
【氏名】北澤 宏明
(72)【発明者】
【氏名】黒澤 信幸
(72)【発明者】
【氏名】磯部 正治
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA19
4C085HH20
4C085JJ02
4C085KA04
4C085KA16
4C085KB42
4C085KB74
4C085LL20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】物理的ストレスによる抗体の凝集を効果的に抑制可能である組成物の提供。
【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物が開示される。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物が開示される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
【請求項2】
モルモット抗体のＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
【請求項3】
前記抗体が６．８５以上の等電点（ｐＩ）を有する、請求項１又は２に記載の抗体組成物。
【請求項4】
前記抗体が７．３５以上の等電点（ｐＩ）を有する、請求項１～３のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項5】
前記抗体が８．４５以上の等電点（ｐＩ）を有する、請求項１～４のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項6】
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．００１～１％（ｗ／ｖ）である請求項１～５のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項7】
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．０１～０．３％（ｗ／ｖ）である請求項１～６のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項8】
前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である請求項１～７のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項9】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である請求項１～８のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項10】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及びポロキサマー１８８からなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である請求項１～９のいずれかに記載の抗体組成物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む診断薬用キット。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む研究試薬用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
溶液中の抗体は、貯蔵時に構造変化を起こしやすい。構造変化に関与するプロセスは、物理的なもの（例えば、四次、三次、又は二次構造の喪失、凝集、粒子形成など）と化学的なもの（すなわち、共有結合的変化を伴うプロセス、例えば、脱アミド化、アスパラギン酸異性化、酸化、加水分解的クリッピングなど）に分けることができる。構造変化物（例えば、可溶性凝集種、不溶性凝集種、及び化学修飾変種など）の各々は、抗体の生物学的活性、毒性、又は免疫原性に影響を及ぼし得る。
【0003】
医薬用抗体にはマウス抗体が多く用いられるが、免疫原性を低下させるために抗体のヒト型化が行われており、ヒト型化マウス抗体が医薬抗体では主流となっている。医薬用抗体においては、安定性の面も厳しく管理する必要があり、安定性の高い抗体水溶液を得るために、抗体配列自体の最適化又は組成の最適化が試みられている。例えば、ヒト型化抗ＩＬ－６レセプターモノクローナル抗体を含む溶液に界面活性剤を添加することを特徴とする、限外濾過における当該溶液中の凝集物の生成又は白濁化の抑制方法が提案されている（特許文献１）。
【0004】
診断薬用抗体又は研究試薬用抗体においては、マウス抗体又はウサギ抗体が多く用いられる。診断薬用抗体又は研究試薬用抗体においては、免疫原性や安全性に対する要求が低いため、抗体配列自体の最適化は一般的になされていない。また組成の最適化に関しても一般的には実施されていない。
【0005】
近年、モルモットを免疫動物として診断薬用抗体又は研究試薬用抗体を取得した報告がなされている（特許文献２）。モルモットから取得した抗体が抗原に対して高い反応性を有することが示されているが、その安定性に関しては何ら言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第４８１２２２８号公報
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、モルモット抗体を含む組成物の安定性を調べたところ、モルモット抗体はマウス抗体と比較して組成物（例えば一般的な緩衝液）中での安定性が低く、低濃度であっても物理的ストレスにより凝集体が生じやすいことを見出した。さらに、本発明者らは、Ｆｃ領域の配列に由来する物性（特に等電点）の違いなどにより、マウス抗体と比較してモルモット抗体の組成物中での安定性が低下することを見出した。したがって、本発明は、特定のＦｃ領域を有する抗体を含む組成物であって、物理的ストレスによる前記抗体の凝集を効果的に抑制可能である組成物の提供を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、特定のＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む組成物が、物理的ストレスによる前記抗体の凝集を効果的に抑制できることを見出し、斯かる知見を基に更に鋭意研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【0009】
本発明は、代表的には、以下の態様を包含する。
項１．
配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
項２．
モルモット抗体のＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
項３．
前記抗体が６．８５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１又は２に記載の抗体組成物。
項４．
前記抗体が７．３５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１～３のいずれかに記載の抗体組成物。
項５．
前記抗体が８．４５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１～４のいずれかに記載の抗体組成物。
項６．
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．００１～１％（ｗ／ｖ）である項１～５のいずれかに記載の抗体組成物。
項７．
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．０１～０．３％（ｗ／ｖ）である項１～６のいずれかに記載の抗体組成物。
項８．
前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である項１～７のいずれかに記載の抗体組成物。
項９．
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１～８のいずれかに記載の抗体組成物。
項１０．
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及びポロキサマー１８８からなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１～９のいずれかに記載の抗体組成物。
項１１．
項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む診断薬用キット。
項１２．
項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む研究試薬用キット。
なお、本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、下記の通りである。SARTTAPSVFPLAASCVDTSGSMMTLGCLVKGYFPEPVTVKWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSLTSMVTVPSSQKKATCNVAHPASSTKVDKTVEPIRTPQPNPCTCPKCPPPENLGGPSVFIFPPKPKDTLMISLTPRVTCVVVDVSQDEPEVQFTWFVDNKPVGNAETKPRVEQYNTTFRVESVLPIQHQDWLRGKEFKCKVYNKALPAPIEKTISKTKGAPRMPDVYTLPPSRDELSKSKVSVTCLIINFFPADIHVEWASNRVPVSEKEYKNTPPIEDADGSYFLYSKLTVDKSAWDQGTVYTCSVMHEALHNHVTQKAISRSPGK
項１．
配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
項２．
モルモット抗体のＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物。
項３．
前記抗体が６．８５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１又は２に記載の抗体組成物。
項４．
前記抗体が７．３５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１～３のいずれかに記載の抗体組成物。
項５．
前記抗体が８．４５以上の等電点（ｐＩ）を有する、項１～４のいずれかに記載の抗体組成物。
項６．
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．００１～１％（ｗ／ｖ）である項１～５のいずれかに記載の抗体組成物。
項７．
前記抗体組成物全体に対する前記界面活性剤の濃度が０．０１～０．３％（ｗ／ｖ）である項１～６のいずれかに記載の抗体組成物。
項８．
前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である項１～７のいずれかに記載の抗体組成物。
項９．
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１～８のいずれかに記載の抗体組成物。
項１０．
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及びポロキサマー１８８からなる群より選ばれる少なくとも１種類の界面活性剤である項１～９のいずれかに記載の抗体組成物。
項１１．
項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む診断薬用キット。
項１２．
項１～１０のいずれかに記載の抗体組成物を含む研究試薬用キット。
なお、本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、下記の通りである。SARTTAPSVFPLAASCVDTSGSMMTLGCLVKGYFPEPVTVKWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSLTSMVTVPSSQKKATCNVAHPASSTKVDKTVEPIRTPQPNPCTCPKCPPPENLGGPSVFIFPPKPKDTLMISLTPRVTCVVVDVSQDEPEVQFTWFVDNKPVGNAETKPRVEQYNTTFRVESVLPIQHQDWLRGKEFKCKVYNKALPAPIEKTISKTKGAPRMPDVYTLPPSRDELSKSKVSVTCLIINFFPADIHVEWASNRVPVSEKEYKNTPPIEDADGSYFLYSKLTVDKSAWDQGTVYTCSVMHEALHNHVTQKAISRSPGK
【発明の効果】
【0010】
本発明により、例えば、特定のＦｃ領域を有する抗体を含む組成物であって、物理的ストレスによる前記抗体の凝集を効果的に抑制可能である組成物を提供することができる。当該組成物は、診断薬、研究試薬などの用途に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の抗体組成物は、一実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）Ｆｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物であることが好ましい。前記Ｆｃ領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又はこれに対して８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）ことが好ましい。
【0013】
本発明の抗体組成物は、一実施形態において、モルモット抗体のＦｃ領域を有する抗体及び界面活性剤を含む抗体組成物であって、（１）前記抗体組成物全体に対する前記抗体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以下である、及び／又は、（２）前記抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１未満である抗体組成物であることが好ましい。前記抗体はモルモット抗体の定常領域を有することが好ましい。また、前記抗体はキメラ抗体であっても完全モルモット抗体であってもよい。
【0014】
本発明の抗体組成物は、任意の形態であってよく、例えば、溶液、懸濁液又は分散液などの液状であってもよいし、抗体溶液の凍結乾燥などによって得られる凍結乾燥品などの固形状又は半固形状であってもよい。これらの中でも抗体組成物は、液状であることが好ましく、水溶液などの溶液であることが好ましい。
【0015】
本発明の抗体組成物中の抗体は、最も広い意味で使用され、特定のＦｃ領域を有する限り特に制限されない。前記抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、前記抗体は、全長抗体であってもよく、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃなどの抗体断片であってもよい。これらの中でも前記抗体はモノクローナル全長抗体であることが好ましい。
【0016】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であるものをいう。
【0017】
モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、例えば、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体であってもよい。
【0018】
モノクローナル抗体は、例えば、哺乳類の脾臓細胞とミエローマ細胞を細胞融合させるハイブリドーマ法、抗体ファージライブラリーから標的分子に対して親和性を有する抗体を選択するファージディスプレイ法等でも作製することができ、免疫動物（好ましくは、モルモット）から抗原特異的形質細胞を選別し、抗体遺伝子（全長又は可変領域等の一部）を単離して、抗原に親和性の高い組換え抗体を取得する方法によっても作製できる。
【0019】
抗原特異的形質細胞を選別する方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２８号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法が挙げられる。
【0020】
抗原特異的形質細胞から抗体遺伝子を取得する方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、抗体遺伝子のクローニング等が挙げられるが、これらに限定されない。後者の方法としては、例えば、抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出して逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成することで抗体遺伝子を取得する方法等が挙げられ、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０８７９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法であってもよい。当該方法は、磁気ビーズを用いて抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲにより抗体遺伝子を取得する方法であり、任意に洗浄工程を含む、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの増幅等の複数の逐次反応を並列的に実施できる反応治具を利用する方法である。
【0021】
抗体遺伝子から組換え抗体を取得する方法は、例えば、抗体遺伝子を含む抗体発現ベクターを作製し、この抗体発現ベクターから抗体を発現させる方法であってもよい。当該方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２３００９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１１／１１７６０９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法等が挙げられる。前者の方法では、標的遺伝子配列を含むＰＣＲ増幅産物に一つ以上の二本鎖ＤＮＡ断片を連結させることで、前記ＰＣＲ増幅産物を精製することなく、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む連結ＤＮＡ断片を特異的に作製できる。後者の方法では、線状化されたベクターの両端の相同組換え領域に、増幅用プライマーと標的遺伝子のみに存在する増幅用プライマー配列の内側の配列を保持させることで、標的ＤＮＡ断片を選択的に相同組換えしてベクターを構築できる。
【0022】
本発明の抗体組成物中の抗体は、上記の方法によって取得した抗体又はその断片のアミノ酸配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により得ることもできる。例えば、軽鎖ＣＤＲ１～３が上記の方法によって取得した抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有し、且つ、重鎖ＣＤＲ１～３が上記の方法によって取得した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有するように設計した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、当該分野で公知の任意の宿主細胞で発現させること等によっても取得することができる。
【0023】
抗体を取得する免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト、ヒツジ、ウシ、イヌ、ロバ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、サル、ブタ、ウマ、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なかでも、製造される抗体の等電点が高い傾向を有し、当該抗体の物理的ストレスによる凝集を特に抑制する観点からモルモットが好ましい。またファージディスプレイなどの遺伝子工学的手法によって取得される抗体に対しても適用されうる。
【0024】
さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、人為的に改変されたキメラ抗体であってもよい。抗体がモノクローナル抗体である場合は、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域は天然に存在する重鎖定常領域又は軽鎖定常領域において１個以上のアミノ酸が欠失、付加、置換、及び／又は挿入されたモノクローナル抗体も、本発明の抗体に包含される。１個以上のアミノ酸が欠失、付加、置換、及び／又は挿入されたモノクローナル抗体は、例えば、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)］などの周知の技術により作製できる。欠失、付加、置換、及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個（例えば、１個、２個、３個、４個、又は５個）である。
【0025】
本発明の抗体組成物中の抗体は、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質（例えば、抗体）などを、化学的又は遺伝子工学的に直接又はリンカーを介して結合させたもの（以下、抗体の誘導体）も、本発明に使用することができる。
【0026】
本明細書において、凝集とは、抗体組成物中に目視にて判別される不溶物のことである。通常、抗体組成物の濁度ＯＤ６６０が０．０１以上である場合に凝集が発生している。凝集の発生要因は、物理的ストレスである限り特に限定されるものではない。例えば、凝集は抗体組成物をフィルターろ過することで発生し得るものを含み、混合等により発生し得るものも含まれる。凝集は抗体組成物を孔径０．４５μｍ以下のフィルターでフィルターろ過することで発生するものを含むことが好ましい。
【0027】
本発明の抗体組成物中の抗体の等電点（ｐＩ）は6.85以上であることが好ましく、より好ましくは7.35以上であり、更に好ましくは8.45以上である。前記抗体の等電点は、通常、11以下である。
【0028】
前記等電点は、当業者公知の等電点電気泳動により測定することが可能であり、測定方法としては、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）又はイオン交換クロマトグラフィー法（ＩＥＸ）などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【0029】
等電点電気泳動法の条件として、抗体５μｇ及び等電点マーカーを等電点電気泳動ゲル及び等電点電気泳動用Bufferを用いて等電点電気泳動した後、加温した０．２５％クマシーブリリアントブルー溶液にて浸透しながら３０分間染色し、浸透しながら水での洗浄１０分間を３回繰り返した後に、等電点マーカーと比較分析する方法が例示される。この際、抗体では、複数のバンドが得られるため、本条件で検出されるもっとも低ｐＩのバンドを基準として該抗体のｐＩを決定することができる。
【0030】
本発明の抗体組成物中の界面活性剤とは、界面活性を有する物質であれば特に限定されない。当該界面活性剤の一例としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（例：Ｔｗｅｅｎ－２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例：Ｔｗｅｅｎ－８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（例：Ｔｗｅｅｎ－６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（例：Ｔｗｅｅｎ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例：ポロキサマー１８８等のポロキサマー）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンオクチルフェニルエーテル（例：ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン又はその誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等が挙げられる。当該界面活性剤の別の例としては、陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩（例：炭素原子数１０～１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩）；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（例：エチレンオキシドの平均付加モル数が２～４でアルキル基の炭素原子数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩）；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等のアルキルスルホコハク酸エステル塩（例：アルキル基の炭素原子数が８～１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩）等が挙げられる。当該界面活性剤の更に別の例としては、天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２～１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの界面活性剤の１種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、非イオン界面活性剤である。非イオン界面活性剤の中でも、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－４０、Ｔｗｅｅｎー６０、Ｔｗｅｅｎ－８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが好ましく、Ｔｗｅｅｎ－２０及び／又は８０が特に好ましい。また、非イオン界面活性剤として、ポリオキシエチエレンオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００など）に代表されるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及び／又は、ポロキサマー（ポロキサマー１８８など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましく、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び／又はポロキサマー１８８が特に好ましい。界面活性剤のＨＬＢは、特に制限されないが、６～１８であることが好ましい。
【0031】
本発明の抗体組成物全体に対する界面活性剤の濃度は、凝集抑制効果などの観点を考慮すると、０．００１％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、０．００５％（ｗ／ｖ）以上がより好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上が更に好ましく、０．０１５％（ｗ／ｖ）以上が更により好ましく、０．０２％（ｗ／ｖ）以上が更により好ましく、０．０２５％（ｗ／ｖ）以上が特に好ましい。当該界面活性剤の濃度の上限は特に限定されないが、例えば、１％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．３％（ｗ／ｖ）以下、又は０．２％（ｗ／ｖ）以下である。当該界面活性剤の濃度は、０．００１～１％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは０．００５～０．５％（ｗ／ｖ）であり、更に好ましくは０．０１～０．３％（ｗ／ｖ）であり、特に好ましくは０．０２５～０．２％（ｗ／ｖ）である。
【0032】
本発明の抗体組成物は、緩衝剤を含まなくてもよいが、ｐＨを安定化するために、緩衝剤をさらに含むことが好ましい。緩衝剤は、抗体安定性を強化するように選択することもできる。好適には、緩衝剤は、リン酸、コハク酸、グリシン、ヒスチジン、クエン酸、マレイン酸、グリシン、ヒスチジン、トリス、２，４，６－トリクロロフェノール、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、酢酸、３，３－ジメチルグルタル酸、カコジル酸、イミダゾール、コリジン、ジメチルアミノエチルアミン、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ‘－ビス（２－エタンスルホン酸））、ビストリスプロパン、エチレンジアミン、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、アルセニック酸、クロラミンクロライド、ｐ－ニトロフェノール、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキエチル）－2－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。また、緩衝剤は、適宜塩の形で水溶液に添加することもできる。例えば、リン酸の塩としては、リン酸ナトリウム（Na３PO４）、リン酸水素ナトリウム（Na２HPO４）、リン酸二水素ナトリウム（NaH２PO４）、リン酸カリウム（K３PO４）、リン酸水素カリウム（K２HPO４)、リン酸二水素カリウム（KH２PO４）、並びにこれらの混合物などが挙げられる。好ましい実施形態では、抗体組成物はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳバッファー）又はクエン酸バッファーを含む。
【0033】
本発明の抗体組成物全体に対する緩衝剤の濃度は、緩衝能を有する範囲であれば特に限定されない。緩衝剤の濃度は、１～２００ｍＭ、好ましくは２～１００ｍＭ、より好ましくは５～５０ｍＭ（mmol／L）である。例えば、緩衝剤の濃度は、１０～２０ｍＭ程度であってもよい。
【0034】
本発明の抗体組成物は、抗体を安定化させるために、塩をさらに含むことが好ましい。塩は、抗体安定性を強化するように選択することもできる。一実施形態において、塩は無機塩若しくは有機塩又はこれらのうちの１つ若しくは複数の組み合わせである。一実施形態において、塩は塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、アルギニン塩酸塩、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0035】
一実施形態において、塩は塩化ナトリウム又は塩化マグネシウムであり、任意選択で他の塩と組み合わせられる。一実施形態において、塩はアルギニン塩酸塩を含む。一実施形態において、塩は無機塩及びアルギニン塩酸塩の組み合わせである。
【0036】
一実施形態において、塩はアミノ酸であり、当該アミノ酸はＬ－立体異性体が用いられ得る。一実施形態において、塩はアルギニン、グリシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、アルギニン又はグリシンであることが好ましく、Ｌ－アルギニンなどのアルギニンであることがより好ましい。塩の型でも又は遊離型でも何でも適切な型のアミノ酸を抗体組成物に添加することが可能である。
【0037】
抗体組成物全体に対する塩（又は塩の組み合わせ）の濃度は、例えば、０～３％（ｗ／ｖ）である。抗体組成物全体に対する塩の総濃度は、好ましくは２．９％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは１．８％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは０．９％（ｗ／ｖ）以下である。抗体組成物全体に対する塩の総濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）以上である。
【0038】
本発明の抗体組成物全体に対する抗体の濃度は、低濃度であっても物理的ストレスによる凝集が生じやすいことから、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは９ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６ｍｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは５ｍｇ／ｍｌ以下である。抗体の濃度は更に低濃度であってもよく、例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下などであってもよい。当該抗体の濃度は、通常、０．１ｍｇ／ｍＬ以上である。
【0039】
本発明の抗体組成物のｐＨは、好ましくは４～１１、より好ましくは５～１０、さらに好ましくは６～９である。当該ｐＨは、ｐＨ計により室温（例えば、２５℃）で測定することができる。
【0040】
本発明の抗体組成物の濁度ＯＤ６６０は、０．０１未満であることが好ましく、０．００９以下、０．００７以下、又は０．００５以下であってもよい。当該ＯＤ６６０は、分光光度計により測定することができる。
【0041】
本発明の抗体組成物は、診断薬又は研究試薬の用途に好適に用いられるが、これらに限定されない。診断薬用途としては、特に制限されないが、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法、放射免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集法等が挙げられる。研究試薬用途としては、特に限定されないが、核酸増幅用試薬であることが好ましい。
【0042】
本発明は、上述したような抗体組成物を含む診断薬用キット又は研究試薬用キットを包含する。当該キットは、容器を備えていてもよく、当該容器に抗体組成物が含まれていてもよい。また、当該キットは、当該キットの使用に必要な器具や説明書を更に備えていてもよい。
【実施例0043】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例により、特に限定されるものではない。
【0044】
（実施例１）
抗体の調製法
抗体発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培養上清から分泌された抗体を回収した。AKTA pure 25（Cytiva社）を用いて、培養上清をHiTrap ProteinA HPカラム（Cytiva社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Buffer（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Buffer（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出し、精製抗体とした。取得した精製抗体はＰＤ－１０カラム（Cytiva社、17085101）を用いて、各実施例に記載のBufferに置換して評価した。
抗体の調製法
抗体発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培養上清から分泌された抗体を回収した。AKTA pure 25（Cytiva社）を用いて、培養上清をHiTrap ProteinA HPカラム（Cytiva社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Buffer（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Buffer（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出し、精製抗体とした。取得した精製抗体はＰＤ－１０カラム（Cytiva社、17085101）を用いて、各実施例に記載のBufferに置換して評価した。
【0045】
（実施例２）
抗体の取得
（１）抗体水溶液の作製
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従ってモルモット又はマウスを免疫して得られたモルモットモノクローナル抗体Ａ、Ｂ、及びマウスモノクローナル抗体を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に置換した。
（２）等電点電気泳動
上記抗体水溶液を、2×Sample Buffer(pH3-10、Invitrogen社)と等量混合し、下記条件にて電気泳動した。
ゲル：Novex IEF gel pH3-10(Invitrogen社)
マーカー：Isoelectic Focusing Calibration Kit Broad Range(pH3-10、GE社)
泳動：100V 1hr → 200V 1hr → 500V 0.5hr
洗浄：蒸留水で洗浄×3回
固定：12%TCA溶液 30min
染色：SimplyBlue SafeStainで染色 10min
脱色：蒸留水で脱色10min×3回
（３）結果
モルモットモノクローナル抗体Ａ、Ｂ、及びマウスモノクローナル抗体の等電点電気泳動の結果を図１に示す。モルモットモノクローナル抗体Ａでは等電点電気泳動のバンドが≧ｐＩ ９．３０の位置に、モルモットモノクローナル抗体Ｂでは等電点電気泳動のバンドがｐＩ ７．３５～８．４５の位置に出現したが、マウスモノクローナル抗体ではｐＩ ５．８５～６．８５付近にバンドが確認され、取得したモルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢの等電点が高いことがわかる。
また、モルモット抗体Ａ及びＢについてアミノ酸配列解析を行った。その結果、モルモット抗体ではＦｃ領域において塩基性アミノ酸の割合が高く、このＦｃ領域により高等電点の特徴的な抗体となっていることが推察された（モノクローナル抗体Ａ及びＢのＦｃ領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す）。
抗体の取得
（１）抗体水溶液の作製
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従ってモルモット又はマウスを免疫して得られたモルモットモノクローナル抗体Ａ、Ｂ、及びマウスモノクローナル抗体を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）に置換した。
（２）等電点電気泳動
上記抗体水溶液を、2×Sample Buffer(pH3-10、Invitrogen社)と等量混合し、下記条件にて電気泳動した。
ゲル：Novex IEF gel pH3-10(Invitrogen社)
マーカー：Isoelectic Focusing Calibration Kit Broad Range(pH3-10、GE社)
泳動：100V 1hr → 200V 1hr → 500V 0.5hr
洗浄：蒸留水で洗浄×3回
固定：12%TCA溶液 30min
染色：SimplyBlue SafeStainで染色 10min
脱色：蒸留水で脱色10min×3回
（３）結果
モルモットモノクローナル抗体Ａ、Ｂ、及びマウスモノクローナル抗体の等電点電気泳動の結果を図１に示す。モルモットモノクローナル抗体Ａでは等電点電気泳動のバンドが≧ｐＩ ９．３０の位置に、モルモットモノクローナル抗体Ｂでは等電点電気泳動のバンドがｐＩ ７．３５～８．４５の位置に出現したが、マウスモノクローナル抗体ではｐＩ ５．８５～６．８５付近にバンドが確認され、取得したモルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢの等電点が高いことがわかる。
また、モルモット抗体Ａ及びＢについてアミノ酸配列解析を行った。その結果、モルモット抗体ではＦｃ領域において塩基性アミノ酸の割合が高く、このＦｃ領域により高等電点の特徴的な抗体となっていることが推察された（モノクローナル抗体Ａ及びＢのＦｃ領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す）。
【0046】
(実施例３)
界面活性剤を含まない抗体水溶液の安定性確認
（１）方法
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢ、並びにマウスモノクローナル抗体を、表１に示す界面活性剤を含まない水溶液（ＰＢＳ又は５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように溶解し、抗体組成物を調製した。その後、孔径０．２μmのフィルター（KURABO社、S-2502）用いたろ過を行い、目視によりろ過後の凝集の有無を判別した。併せて、ろ過後の抗体水溶液の濁度ＯＤ６６０を吸光度計で測定した。これらの結果を表１に示す。凝集が見られない場合を○、凝集が見られる場合を×と表記した。
界面活性剤を含まない抗体水溶液の安定性確認
（１）方法
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢ、並びにマウスモノクローナル抗体を、表１に示す界面活性剤を含まない水溶液（ＰＢＳ又は５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍＬ濃度となるように溶解し、抗体組成物を調製した。その後、孔径０．２μmのフィルター（KURABO社、S-2502）用いたろ過を行い、目視によりろ過後の凝集の有無を判別した。併せて、ろ過後の抗体水溶液の濁度ＯＤ６６０を吸光度計で測定した。これらの結果を表１に示す。凝集が見られない場合を○、凝集が見られる場合を×と表記した。
【0047】
【表1】
【0048】
（２）結果
表１から明らかなように、界面活性剤を含まない抗体水溶液において、マウスモノクローナル抗体ではフィルターろ過操作によって凝集の発生が認められなかったが、モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢでは、このような低濃度の抗体水溶液の場合でもフィルターろ過操作によって凝集の発生が確認された。
表１から明らかなように、界面活性剤を含まない抗体水溶液において、マウスモノクローナル抗体ではフィルターろ過操作によって凝集の発生が認められなかったが、モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢでは、このような低濃度の抗体水溶液の場合でもフィルターろ過操作によって凝集の発生が確認された。
【0049】
（実施例４）
界面活性剤を含む抗体水溶液の安定性確認
（１）方法
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを、表２に示す界面活性剤を含む水溶液又は界面活性剤を含まない水溶液で５ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解して、抗体組成物を調製した。さらに、モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを表３に示す界面活性剤を含む水溶液で５ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解して、抗体組成物を調製した。その後、実施例３（１）と同じ方法でフィルターろ過操作を行い、目視による凝集の有無の判別と濁度ＯＤ６６０の測定を実施した。結果を表２と表３に示す。凝集が見られない場合を○、凝集が見られる場合を×で表記する。
界面活性剤を含む抗体水溶液の安定性確認
（１）方法
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを、表２に示す界面活性剤を含む水溶液又は界面活性剤を含まない水溶液で５ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解して、抗体組成物を調製した。さらに、モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを表３に示す界面活性剤を含む水溶液で５ｍｇ／ｍＬ濃度に溶解して、抗体組成物を調製した。その後、実施例３（１）と同じ方法でフィルターろ過操作を行い、目視による凝集の有無の判別と濁度ＯＤ６６０の測定を実施した。結果を表２と表３に示す。凝集が見られない場合を○、凝集が見られる場合を×で表記する。
【0050】
【表2】
【0051】
【表3】
【0052】
（２）結果
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを、表２に示す界面活性剤を含む水溶液にて調製しフィルターろ過操作を行って、目視により凝集の有無を判別し、更に濁度ＯＤ６６０を測定した結果を表２に示す。界面活性剤として０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０又は０．１%（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加した結果、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ及びクエン酸バッファーでフィルターろ過操作による凝集発生が抑制されることを確認した。
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢを、表２に示す界面活性剤を含む水溶液にて調製しフィルターろ過操作を行って、目視により凝集の有無を判別し、更に濁度ＯＤ６６０を測定した結果を表２に示す。界面活性剤として０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０又は０．１%（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加した結果、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ及びクエン酸バッファーでフィルターろ過操作による凝集発生が抑制されることを確認した。
【0053】
モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢに関して、表３に示すＴｗｅｅｎ２０を０．０２５～０．２%（ｗ／ｖ）の抗体水溶液としてフィルターろ過操作を行って、目視により凝集の有無を判別し、更に濁度ＯＤ６６０を測定した結果、フィルターろ過操作による凝集発生が抑制されることを確認した。
【0054】
（実施例５）
ＥＬＩＳＡによる結合能評価
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従って得られたモルモットモノクローナル抗体Ｃ（モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢと同じＦｃ領域を有するように設計された抗体））を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、又はBuffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、０．０５％ （ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）に置換した。このモルモットモノクローナル抗体Ｃの濃度は５ｍｇ／ｍＬとした。
炭酸緩衝液を用いて、市販のマウス抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）をＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社、ＭＳ－８８９６Ｆ）に固相化した。各ウェルを洗浄後に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（グロブリンフリー、ナカライテスク社）を含む１×ＴＢＳ（ナカライテスク社）を用いてブロッキングを実施した。各ウェルを洗浄後に１×ＴＢＳ－Ｔ（ナカライテスク社）で希釈した抗原（whole Taq）を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後にBufferにて希釈した高等電点を有するモルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に、Goat Anti-Guinea pig IgG H&L（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ社）を５００００倍希釈して添加した。各ウェルを洗浄後に、ＴＭＢ溶液（TMBW-1000-01、SURMODICS社）を添加して発色させ、１Ｎ硫酸（ナカライテスク社）を添加して反応を停止させたのちに、プレートリーダで４５０～６２０ｎｍの波長を測定した。ＥＬＩＳＡによるシグナル強度を比較した結果、モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体のBuffer中のＴｗｅｅｎ－２０の有無によりシグナル強度に差違は見られなかった。
ＥＬＩＳＡによる結合能評価
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従って得られたモルモットモノクローナル抗体Ｃ（モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（モルモットモノクローナル抗体Ａ及びＢと同じＦｃ領域を有するように設計された抗体））を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、又はBuffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、０．０５％ （ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）に置換した。このモルモットモノクローナル抗体Ｃの濃度は５ｍｇ／ｍＬとした。
炭酸緩衝液を用いて、市販のマウス抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）をＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社、ＭＳ－８８９６Ｆ）に固相化した。各ウェルを洗浄後に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（グロブリンフリー、ナカライテスク社）を含む１×ＴＢＳ（ナカライテスク社）を用いてブロッキングを実施した。各ウェルを洗浄後に１×ＴＢＳ－Ｔ（ナカライテスク社）で希釈した抗原（whole Taq）を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後にBufferにて希釈した高等電点を有するモルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に、Goat Anti-Guinea pig IgG H&L（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ社）を５００００倍希釈して添加した。各ウェルを洗浄後に、ＴＭＢ溶液（TMBW-1000-01、SURMODICS社）を添加して発色させ、１Ｎ硫酸（ナカライテスク社）を添加して反応を停止させたのちに、プレートリーダで４５０～６２０ｎｍの波長を測定した。ＥＬＩＳＡによるシグナル強度を比較した結果、モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体のBuffer中のＴｗｅｅｎ－２０の有無によりシグナル強度に差違は見られなかった。
【0055】
（実施例６）
ＰＣＲ試薬における抗体の機能性確認
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従って得られたモルモットモノクローナル抗体Ｃ（モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性ドメインに結合する抗体））を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、又はBuffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）に置換した。このモルモットモノクローナル抗体Ｃの濃度は５ｍｇ／ｍＬとした。
Ｔａｑポリメラーゼ及びモルモットモノクローナル抗体Ｃを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、モルモットモノクローナル抗体Ｃが保有する性能を有するか否か確認した。
ＰＣＲ試薬における抗体の機能性確認
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載された方法に従って得られたモルモットモノクローナル抗体Ｃ（モルモット抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体（Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性ドメインに結合する抗体））を実施例１に記載の方法で精製し、Buffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、又はBuffer（５０ｍＭ クエン酸、０．９％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）に置換した。このモルモットモノクローナル抗体Ｃの濃度は５ｍｇ／ｍＬとした。
Ｔａｑポリメラーゼ及びモルモットモノクローナル抗体Ｃを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、モルモットモノクローナル抗体Ｃが保有する性能を有するか否か確認した。
【0056】
（１）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
下記に示す組成のＰＣＲ用ミックスを調製した。
ＰＣＲ用ミックス：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
マウス抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体
（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
［ＰＣＲ用ミックス］
下記に示す組成のＰＣＲ用ミックスを調製した。
ＰＣＲ用ミックス：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
マウス抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体
（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
【0057】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブの混合液として、TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブの混合液として、TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
【0058】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Human HeLa Cell Total RNA（636543、タカラバイオ株式会社）及びSuperPrep（商標）II Cell Lysis&RT Kit for qPCR（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Human HeLa Cell Total RNA（636543、タカラバイオ株式会社）及びSuperPrep（商標）II Cell Lysis&RT Kit for qPCR（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0059】
（２）反応
ＰＣＲ用ミックスに、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。各Bufferのモルモットモノクローナル抗体Ｃについては、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応）
反応液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲ用ミックスに、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。各Bufferのモルモットモノクローナル抗体Ｃについては、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応）
反応液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0060】
（３）結果
反応液について、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値及びＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、表４に示す。
モルモットモノクローナル抗体Ｃを含まない反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、ＲＰＳ１９遺伝子を検出できなかった。これに対して、モルモットモノクローナル抗体Ｃを添加して、２５℃で２４時間曝露した反応液では、―２０℃で２４時間曝露した場合と比較して、同等のＣｔ値でＲＰＳ遺伝子を検出できた。また、モルモットモノクローナル抗体Ｃを添加した場合は、Ｔｗｅｅｎ２０の有無にかかわらず、プローブ分解が抑制され、プローブ分解率は５％以下となった。このことから、モルモットモノクローナル抗体Ｃが有するプローブ分解抑制能が、Ｔｗｅｅｎ－２０の添加の有無により影響を受けないことが確認された。
プローブ分解率［（Ｆ３－Ｆ１）÷（Ｆ２－Ｆ１）×１００］（％）
Ｆ１：モルモットモノクローナル抗体Ｃの非存在下で－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２：モルモットモノクローナル抗体Ｃの非存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３：モルモットモノクローナル抗体Ｃの存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
反応液について、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値及びＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、表４に示す。
モルモットモノクローナル抗体Ｃを含まない反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、ＲＰＳ１９遺伝子を検出できなかった。これに対して、モルモットモノクローナル抗体Ｃを添加して、２５℃で２４時間曝露した反応液では、―２０℃で２４時間曝露した場合と比較して、同等のＣｔ値でＲＰＳ遺伝子を検出できた。また、モルモットモノクローナル抗体Ｃを添加した場合は、Ｔｗｅｅｎ２０の有無にかかわらず、プローブ分解が抑制され、プローブ分解率は５％以下となった。このことから、モルモットモノクローナル抗体Ｃが有するプローブ分解抑制能が、Ｔｗｅｅｎ－２０の添加の有無により影響を受けないことが確認された。
プローブ分解率［（Ｆ３－Ｆ１）÷（Ｆ２－Ｆ１）×１００］（％）
Ｆ１：モルモットモノクローナル抗体Ｃの非存在下で－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２：モルモットモノクローナル抗体Ｃの非存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３：モルモットモノクローナル抗体Ｃの存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
【0061】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0062】
本発明は、水溶液中の低濃度の抗体の凝集を抑制することができ、特に有用である。本発明は、診断薬や研究試薬などの抗体を含む実験系において、抗体の凝集による悪影響を与えないため、産業上も非常に有用である。
【図1】
【配列表】