特開 2023-85160 メナキノンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023085160

(43)【公開日】2023-06-20

(54)【発明の名称】メナキノンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/66 20060101AFI20230613BHJP

【ＦＩ】

C12P7/66 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】書面

(21)【出願番号】P 2021211588

(22)【出願日】2021-12-08

(71)【出願人】

【識別番号】000210067

【氏名又は名称】池田食研株式会社

(72)【発明者】

【氏名】中村 直樹

(72)【発明者】

【氏名】佐野 優一

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AD93

4B064CA02

4B064CC12

4B064CE03

4B064CE16

4B064DA01

4B064DA10

(57)【要約】

【課題】 培養中に溶存酸素濃度を調整することで、変異処理した微生物によるメナキノン－４の生産量を増大させる方法が知られていたが、培養中に微生物の増殖に応じて溶存酸素濃度を制御する必要があり、煩雑な点から、より簡便で生産性に優れたメナキノンの製造方法が求められていた。
【解決手段】 メナキノン生産菌の培養において、酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気させることによって、メナキノンの生産性が向上することを見出し、本発明を完成した。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体培地に酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気させ、メナキノン生産菌を培養することで、培養物中にメナキノンを生成させることを特徴とする、メナキノンの製造方法。

【請求項2】

酸素１００容量％を通気する場合に比べて、メナキノンの生産性が少なくとも１．３倍である、請求項１記載のメナキノンの製造方法。

【請求項3】

酸素濃縮器により調製した気体を使用する、請求項１又は２記載のメナキノンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メナキノンの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＫは、脂溶性ビタミンの一つであり、血液凝固や骨形成等に関与している。天然起源形態のビタミンＫには、植物に由来するフィロキノン（ビタミンＫ１）と微生物等に由来するメナキノン（ビタミンＫ２）の２つの分子ファミリーが知られている。

【0003】

メナキノン生産菌としては、スタフィロコッカス属、バチルス属、アノキシバチルス属、ロドシュードモナス属等に属する微生物が知られており（非特許文献１及び特許文献１～３）、特許文献４には、変異処理により得られた、メナキノン－４を生産する能力を有するフラボバクテリウム属に属する微生物を培養してメナキノン－４を生産するに際し、微生物の増殖を実質的に制限することなく、かつ、培養液中の溶存酸素濃度が該微生物の対数増殖期において実質的に０～０．５ｐｐｍとしたのちに上昇するように該溶存酸素濃度を制御して該微生物を培養して該微生物の菌体内のメナキノン－４の含有率を増大させることを特徴とするメナキノン－４の製造法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第３４３１５７４号公報

【特許文献2】特許第６４７７７１０号公報

【特許文献3】特開昭５７－２０２２９５号公報

【特許文献4】特公平０７－５２０７０号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｏｍｂｏｏｎ Ｔａｎａｓｕｐａｗａｔ、他４名、“ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＣＡＲＮＯＳＵＳ ＳＴＲＡＩＮＳ ＦＲＯＭ ＦＥＲＭＥＮＴＥＤ ＦＩＳＨ ＡＮＤ ＳＯＹ ＳＡＵＣＥ ＭＡＳＨ”、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（日本）、１９９１年、第３７巻、第６号、ｐ．４７９－４９４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

培養中に溶存酸素濃度を調整することで、変異処理した微生物によるメナキノン－４の生産量を増大させる方法が知られていたが、培養中に微生物の増殖に応じて溶存酸素濃度を制御する必要があり、煩雑な点から、より簡便で生産性に優れたメナキノンの製造方法が求められていた。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明者らは、メナキノン生産菌の培養において、酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気させることによって、メナキノンの生産性が向上することを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［３］の態様に関する。
［１］液体培地に酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気させ、メナキノン生産菌を培養することで、培養物中にメナキノンを生成させることを特徴とする、メナキノンの製造方法。
［２］酸素１００容量％を通気する場合に比べて、メナキノンの生産性が少なくとも１．３倍である、［１］記載のメナキノンの製造方法。
［３］酸素濃縮器により調製した気体を使用する、［１］又は［２］記載のメナキノンの製造方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によって、メナキノン生産菌の培養において、通気中の酸素濃度を適切な濃度範囲内に設定することで、メナキノンの生産性が向上し、簡便で生産性に優れたメナキノンの製造方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】各酸素濃度における、スタフィロコッカス・カルノサス培養液１ｇ当たりのメナキノン濃度（ｐｐｍ）及び菌体数（×１０^９個）を示す。

【図2】酸素８０容量％／二酸化炭素酸素２０容量％、酸素８０容量％／窒素２０％又は酸素１００％における、スタフィロコッカス・カルノサス培養液１ｇ当たりのメナキノン濃度（ｐｐｍ）及び菌体数（×１０^９個）を示す。

【図2】酸素８０容量％／二酸化炭素酸素２０容量％又は酸素１００％における、バチルス・サブチリス培養液１ｇ当たりのメナキノン濃度（ｐｐｍ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明のメナキノンの製造方法は、液体培地に酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気させ、メナキノン生産菌を培養することで、培養物中に効率的にメナキノンを生成させることができる。生成されるメナキノンは、メナキノン－４、６～１０等が例示でき、生産菌により主に生成されるメナキノンは異なるが、メナキノン－６又はメナキノン－７の生産菌が好ましく、変異等によりメナキノン－４を生成できるメナキノン生産菌も利用できる。メナキノン生産菌であれば特に限定されず、グラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよく、好気性菌でも通性嫌気性菌でもよいが、スタフィロコッカス属、バチルス属、アノキシバチルス属、ロドシュードモナス属、フラボバクテリウム属等に属する菌が例示でき、詳細には、スタフィロコッカス・カルノサス、バチルス・サブチルス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキバチルス・コンタミナンス、ロドシュードモナス・カブスラタ、フラボバクテリウム・アクアタイル等が例示でき、１種又は２種以上を使用することができる。

【0012】

メナキノン生産菌の培養には、メナキノン生産菌が増殖可能な成分であれば特に限定されず、通常の細菌培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物、その他菌が必要とする微量栄養素等を含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、シュクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、ソルビトール、クエン酸、糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ－アラニン、Ｌ－グルタミン酸等のアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機塩としては、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、リン酸塩、亜鉛塩等が使用できる。

【0013】

培養条件は、適宜設定できるが、通気、振盪、攪拌等により好気的に液体培養するのが好ましく、培養温度は例えば１０～５０℃が例示でき、２０～４０℃が好ましく、培養時間は例えば２～７２時間が例示でき、４～４８時間が好ましく、６～３６時間がより好ましく、培地のｐＨは例えば４．０～９．０が例示でき、５．０～８．０が好ましい。培養中に例えば前記範囲でｐＨ調整をしてもよく、６．５～７．５の範囲に調整するのが好ましい。ｐＨ調整は、水酸化ナトリウム、アンモニア等を用いることができる。

【0014】

通気には、酸素濃度が２５～９５容量％の気体を使用し、３０～９３容量％が好ましく、酸素以外の気体は、メナキノン生産菌が生育可能であれば特に限定されず、窒素、二酸化炭素等が例示できる。前記濃度の酸素は、酸素とその他の気体を混合してもよく、空気を濃縮してもよく、酸素濃縮器により前記酸素濃度に調製した気体を通気に使用するのが好ましい。同じメナキノン生産菌の培養において、酸素濃度が２５～９５容量％の気体を通気に使用することで、酸素１００容量％を通気する場合に比べて、メナキノンの生産性を高めることができ、好ましくは少なくとも１．３倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、さらに好ましくは少なくとも１．７倍に生産性を向上でき、上限は特に限定されないが例えば２．５倍、３倍、３．５倍程度である。培養物中のメナキノン含有量は、特に限定されないが、培養液１ｇあたり１０ｐｐｍ以上が好ましく、１２ｐｐｍ以上がより好ましく、１５ｐｐｍ以上がさらに好ましい。

【0015】

培養後に殺菌してもよく、殺菌条件は一般的な方法であれば特に限定されないが、例えば加熱温度は、７０～１５０℃であり、加熱時間は、温度に応じて決定すればよいが、通常１～６０分である。

【0016】

前記培養により生成されたメナキノンは、培養物中に含まれており、培養物をそのまま利用してもよいが、菌体を集菌することで回収するのが好ましく、遠心分離機等で培地を除去した後、緩衝液、生理食塩水、滅菌水等で菌体を洗浄し、さらに、エアードライ、スプレードライ、真空及び／又は凍結乾燥等を行って粉末化してもよい。

【0017】

本発明の培養物を、各種飲食品等に添加することにより、メナキノン含有飲食品等を製造できる。これにより、メナキノンが有する各種機能性成分を容易に各種飲食品等に付加することができる。添加する飲食品等は特に限定されないが、飲料、食品、調味料、機能性食品、サプリメント等の各種飲食品の他、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料等にも利用できる。

【実施例0018】

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。尚、本発明において、％は別記がない限り全て容量％である。

【0019】

［試験例１］
液体培地（グリセリン：５重量％、酵母エキス：５重量％、水：９０重量％、ｐＨ７．０）に前培養したスタフィロコッカス・カルノサスＮＢＲＣ１０９６２２を１％接種し、酸素：窒素＝９：１（酸素濃度：９０％）（実施例１－１）、酸素：窒素＝８：２（酸素濃度：８０％）（実施例１－２）、酸素：窒素＝５：５（酸素濃度：５０％）（実施例１－３）もしくは酸素：窒素＝３：７（酸素濃度：３０％）（実施例１－４）の混合気体、空気（酸素濃度：約２１％）（比較例１－１）、酸素（酸素濃度：１００％）（比較例１－２）又は窒素（酸素濃度：０％）（比較例１－３）を０．５Ｌ／ｍｉｎで通気、攪拌し、２０重量％水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整しながら、３７℃で２０時間培養した。

【0020】

実施例１－１～１－４、比較例１－１及び１－２で得られた培養液について、バクテリア計算盤を用いて培養液１ｇ当たりの菌体数を測定すると共に、集菌後、菌体をジメチルスルホキシドで抽出し、メナキノン－７の濃度を下記ＨＰＬＣ測定条件にて測定し、培養液１ｇ当たりのメナキノン－７含有量（ｐｐｍ）として図１に示し、比較例１－２の酸素１００％通気時のメナキノン濃度を１とした場合の、各実施例におけるメナキノン生産性（倍）を表１に示した。また、比較例１－１及び１－３のＯＤ６００を測定し、表２に示した。

【0021】

＜ＨＰＬＣ測定条件＞
・検出器：ＵＶ検出器（２７０ｎｍ）
・カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）
・移動相：メタノール
・流速：１．０ｍｌ／分
・カラム温度：４０℃
・標品：メナキノン－７標準品（純度：９８重量％、富士フィルム和光純薬株式会社製）をエタノールに溶解して、検量線を作成した。
・検体：各試料をエタノールに溶解した後、適宜希釈したもの。

【0022】

【表1】

【0023】

【表2】

【0024】

図１及び表１より、通気に空気（酸素濃度：約２１％）又は酸素（酸素濃度：１００％）を使用した場合に比べて、酸素濃度が３０～９０％の気体を使用した方が、培養液１ｇあたりの菌体数が多く、特に酸素１００％の通気に比べて、メナキノンの生産性が１．８～２．０倍に向上することが分かった。

【0025】

また、表２より、通気に窒素を使用した場合に比べて、空気（酸素濃度：約２１％）を使用した方が、７倍以上の濁度となり、スタフィロコッカス・カルノサスは、酸素存在下の方が菌体の生育がよいことが分かった。

【実施例0026】

窒素の代わりに二酸化炭素を用いて、酸素：二酸化炭素＝８：２（酸素濃度：８０％）の気体を使用する以外は、実施例１－２と同様の培養条件で培養した。

【0027】

実施例２で得られた培養液について、試験例１と同様に培養液１ｇ当たりの菌体数を測定すると共に、メナキノン－７の濃度を測定し、培養液１ｇ当たりのメナキノン－７含有量（ｐｐｍ）として、酸素：窒素＝８：２（酸素濃度：８０％）の気体を用いた実施例１－２及び酸素１００％を用いた比較例１－２と共に図２に示した。

【0028】

比較例１－２の酸素１００％通気時のメナキノン濃度を１とした場合の、実施例２のメナキノン生産性（倍）を算出したところ、２．０倍だった。酸素濃度８０％の気体を用いることで、混合する気体が二酸化炭素又は窒素の何れの場合でも、酸素濃度１００％の培養に比べて、培養液１ｇあたりの菌体数が多く、メナキノン－７の生産性が高いことが分かった。

【0029】

［試験例２］
液体培地（ソルビトール：１０重量％、酵母エキス：５重量％、水：８５重量％、ｐＨ

Ｓｐｏ（特許第６０１９５２８号公報参照）を１％接種し、酸素：窒素＝８：２（酸素濃度：８０％）（実施例３）又は酸素（酸素濃度：１００％）（比較例２）を０．５Ｌ／ｍｉｎで通気、攪拌し、２０重量％水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整しながら、３７℃で２０時間培養した。

【0030】

実施例３及び比較例２で得られた培養液について、試験例１と同様にメナキノン－７の濃度を測定し、培養液１ｇ当たりのメナキノン－７含有量（ｐｐｍ）として図３に示した。

【0031】

比較例２の酸素１００％通気時のメナキノン濃度を１とした場合の、実施例３のメナキノン生産性（倍）を算出したところ、２．０倍だった。酸素濃度８０％の気体を用いることで、バチルス・サブチリスによるメナキノン生産においても、酸素濃度１００％の培養に比べて、メナキノン－７の生産性が高いことが分かった。