(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023085289
(43)【公開日】2023-06-20
(54)【発明の名称】肝臓オルガノイド疾患モデルおよびその作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20230613BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230613BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230613BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230613BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12N1/00 B
C12Q1/02
C12N1/00 G
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023036651
(22)【出願日】2023-03-09
(62)【分割の表示】P 2019522226の分割
【原出願日】2017-11-03
(31)【優先権主張番号】62/517,414
(32)【優先日】2017-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/417,371
(32)【優先日】2016-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＮＯＮＩＤＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】500469235
【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター
(71)【出願人】
【識別番号】503360115
【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】武部 貴則
(72)【発明者】
【氏名】大内 梨江
(72)【発明者】
【氏名】木村 昌樹
(57)【要約】 （修正有）
【課題】脂肪毒性オルガノイドモデルを作製し使用する方法を提供する。
【解決手段】特定の態様では、方法は肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み得る。一態様において、ＦＦＡ組成物は、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【選択図】なし
【解決手段】特定の態様では、方法は肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み得る。一態様において、ＦＦＡ組成物は、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み、前記ＦＦＡ組成物がオレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせ、好ましくはオレイン酸を含む、脂肪毒性オルガノイドモデルの作製方法。
【請求項2】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルが脂肪肝疾患のモデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルが脂肪性肝炎のモデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルが肝硬変モデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルが、非経口栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）のモデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルがＮＡＦＬＤのモデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記脂肪毒性オルガノイドモデルが、細胞骨格フィラメント組織崩壊、ＲＯＳ増加、ミトコンドリア膨化、トリグリセリド蓄積、線維症、肝細胞バルーニング、ＩＬ６分泌、脂肪症、炎症、バルーニングおよびマロリー体様（Ｍａｌｌｏｒｙ’ｓ ｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ）、組織硬化、細胞死、およびそれらの組み合わせを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
ＮＡＦＬＤおよび／または胆汁うっ滞を含む、肝疾患の治療のための薬物をスクリーニングする方法であって、候補薬物を請求項１に記載の脂肪毒性オルガノイドモデルと接触させるステップを含む方法。
【請求項9】
前記栄養補助食品／ＴＰＮを請求項１に記載の脂肪毒性オルガノイドモデルと接触させるステップを含む、栄養補助食品／ＴＰＮの有効性をアッセイする方法。
【請求項10】
脂肪肝疾患の三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデルであって、前記オルガノイドが、脂肪症、炎症、バルーニングおよびマロリー体、ＲＯＳ蓄積およびミトコンドリア過負荷、線維症および組織硬化、ならびに細胞死を特徴とする、オルガノイドモデル。
【請求項11】
薬物誘発性肝毒性および炎症／線維症の三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデル。
【請求項12】
非経口栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）の三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデル。
【請求項13】
前記モデルが、炎症性細胞、例えばＴ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まない、請求項１～１２のいずれかに記載の肝臓オルガノイドモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，３７１号、および２０１６年６月９日に出願された第６２／５１７，４１４号の優先権および利益を主張するものであり、これらの各内容は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４７１，３７１号、および２０１６年６月９日に出願された第６２／５１７，４１４号の優先権および利益を主張するものであり、これらの各内容は全ての目的のために参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
不可逆的な上皮臓器のリモデリングは、世界中の死と病気の主な要因であり、ヘルスケアシステムに毎年何十億ドルもの費用がかかる（Ｈｙｎｄｓ ａｎｄ Ｇｉａｎｇｒｅｃｏ，２０１３）。上皮のリモデリングの疾患には、肺癌および胃腸癌、ならびに肝硬変、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および炎症性腸疾患などの慢性疾患が含まれる（Ｈｙｎｄｓ ａｎｄ Ｇｉａｎｇｒｅｃｏ，２０１３）。残念なことに、主に動物で行われているほとんどの上皮器官研究はこれらの病気のための新しい治療法を生み出すことができず、そして死亡率は容認できないほど高いままである。これは、製薬業界で膨大な数の化合物ライブラリーの有効性を試験するための予測的ヒトシステムの欠如によるものであり、臨床的に適切な治療法開発に向けてヒトの炎症および線維症をモデル化するための高忠実度システムを開発する根本的な課題を強いている。
【0003】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、致命的な肝障害を発症する可能性を高めるため、先進国で克服すべき主要な課題の１つであるが、今のところ効果的な治療法はない。同様に、医原性の非経口栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）は、非経口栄養から生じる障害であり、現在有効な治療法はない。脂肪性肝炎および／または脂肪滴の蓄積および膀胱骨格フィラメント組織崩壊、脂肪症、および肝細胞膨化などの肝疾患の臨床病理学的特徴を有するモデル、ならびにこれらおよび他の肝障害または病状に対処するために使用することができるものが必要とされている。患者の幹細胞を用いた疾患モデルの有望にもかかわらず、現在のアプローチは、単細胞、単遺伝子性、および比較的単純な病状へのそれらの適用において限定され、上皮臓器線維症などのより一般的かつ複雑な疾患病状を捉えられない。
【0004】
ヒトの肝臓は、脂質代謝、アンモニウムおよび胆汁産生、凝固、ならびに外因性化合物の解毒など、生命に不可欠な多くの代謝機能を提供する重要な臓器である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術を使用して、患者の肝反応のインビトロ再構成は、再生療法、創薬、および薬物毒性研究を含む多数の有望な用途により、製薬業界にとって魅力的である。この目的のために、現在、従来のインビトロアプローチは、肝細胞を生成するために二次元（２－Ｄ）および３－Ｄ分化プラットフォームを研究している。しかしながら、報告された方法のほとんどは細胞を主に標的上皮細胞型に分化させ、線維化促進性および／または炎症性細胞型などの必須の支持成分を完全に欠いている。あるいは、出願人らは、上皮系列と支持系列を混合することによる共培養ベースのアプローチを提案したが、これらのアッセイは非常に可変的であり、上皮細胞培地（ＥＣＭ）およびそれらを同時に維持することができる培地を選択することの困難性などの多くの人為的な変化によってしばしば混乱させられる。したがって、支持系統を疾患モデル化およびさらなるスクリーニング適用のために共同開発する、新しくて頑強なアッセイシステムの確立の必要性がある。
【発明の概要】
【0005】
本明細書に開示されているのは、脂肪毒性オルガノイドモデルを作製し使用する方法である。特定の態様では、方法は肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み得る。一態様において、ＦＦＡ組成物は、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0006】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するだろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
【0007】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の謄本は、請求および必要な料金の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。
【0008】
【図1】ヒトｉＰＳＣ－肝臓オルガノイドにおける前線維化系統と炎症性系統の同時分化（Ｃｏ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ） Ａ．レチノイン酸（ＲＡ）ベースの肝臓オルガノイド分化方法および２０日目の肝臓オルガノイドの明視野像の概略図。 スケールバー、１００μｍ。Ｂ．４日間のＲＡの存在下および非存在下での培養後２０日目のＭａｔｒｉｇｅｌ中の肝臓オルガノイドの明視野像。Ｃ．４日間のＲＡの存在下（黒色バー）および非存在下（灰色のバー）での培養後２０日目にオルガノイド数を手動で測定した。Ｄ．４日間のＲＡの存在下（黒色バー）および非存在下（灰色のバー）での培養後２０日目にオルガノイドの直径を、Ｉｍａｇｅ Ｊによって認識させおよび測定した。Ｅ．４日間のＲＡあり（黒色バー）およびなし（灰色バー）でＭａｔｒｉｇｅｌ中での肝臓オルガノイドの２２～２５日間培養後２４時間で収集した培養上清から、アルブミン産生を測定した。Ｆ．４日間のＲＡの存在下および非存在下で培養後２５日目に、内部管腔構造を有するオルガノイドを手動で計数した。赤と灰色のバーは、それぞれ内部管腔あり（ＨＬＯ）／なし（スフェロイド）のオルガノイドの割合を示す。Ｇ．胆汁輸送活性は、培養培地中で、肝細胞のエステラーゼ加水分解後にフルオレセイン（緑色）に変わり、蛍光の流れを追跡する、フルオレセインジアセテート（ＦＤ）によってモニターした。結果は平均値±標準偏差で表し、ｎ＝３である。Ｅｐｃａｍ、ＣＤ１６６、およびＣＤ６８陽性集団の割合をフローサイトメトリーによって決定した。結果は平均値±標準偏差で表し、ｎ＝２～３である。Ｈ．単細胞ＲＮＡ配列決定ヒトｉＰＳＣ、ヒトｉＰＳＣ由来胚体内胚葉、前腸スフェロイド、ＨＬＯ、ヒト成人肝組織、およびヒト胎児肝組織によって発現される肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、および内皮関連遺伝子についてのＦＰＫＭ（ｌｏｇ２）値。Ｉ．Ｅｐｃａｍ、ＣＤ１６６、ＣＤ６８、およびＦ４／８０陽性集団の割合をフローサイトメトリーによって決定した。結果は平均値±標準偏差で表し、ｎ＝３である。Ｊ．アルブミン、ＣＤ６８、ビメンチン、ＧＦＡＰおよびＥｐｃａｍについての２５日目のＨＬＯの免疫蛍光（ＩＦ）染色。白い矢印は、ＣＤ６８、ＧＦＡＰ、およびビメンチンについての陽性の細胞の局在を示している。結果は平均値±標準偏差で表し、ｎ＝３である。Ｋ．食細胞活性を、食作用を反映するｐＨｒｏｄｏインジケーターを用いて細胞内ｐＨをモニターすることによって分析した（赤）。蛍光発現は共焦点顕微鏡下で捕獲した。結果は平均値±標準偏差で表し、ｎ＝６である。
【図2】脂肪酸処理による脂肪性肝炎オルガノイド（ｓＨＬＯ）の生成 Ａ．脂肪性肝炎ＨＬＯ（ｓＨＬＯ）の生成方法の概略図 Ｂ．脂肪滴（緑色）、膜（赤色）、核（青色）の生細胞イメージング）画像は、１０～２０枚のＺスタック画像を重ね合わせて採用した。用量依存的に、脂肪滴蓄積の増加ならびに脂肪滴および細胞の拡大が観察された。Ｃ．各オルガノイドサイズによって正規化された代表的な総脂質体積。バーは総脂質体積の平均を示す。脂肪滴は、０（黒）、２００μＭ ＯＡ（赤）、４００μＭ ＯＡ（緑）、および８００μＭ ＯＡ（青）に応じて用量依存的に増加した。Ｄ．ＨＬＯ中のトリグリセリドの定量化。ＨＬＯを１つのＭａｔｒｉｇｅｌ液滴から単離し、オレイン酸（８００μＭ）の存在下（青色バー）または非存在下（黒色バー）でＨＣＭ培地に分け、そして３日間培養した。Ｅ．オレイン酸（８００μＭ）の存在下または非存在下で培養し、３日間培養した２０～３０のＨＬＯを含むウェルから得た培養上清を用いたＩＬ－６のＥＬＩＳＡ測定。最終値は各ウェル中のオルガノイドの数によって正規化した。未処理（黒色バー）と比較した場合、８００μＭ ＯＡ処理（青色バー）においてＩＬ－６は２．２倍放出された。Ｆ．炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－８の遺伝子発現。それらは１８Ｓによって正規化された。ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－８遺伝子発現は両方とも、未処理（黒色バー）と比較して、２００μＭ ＯＡ（赤色バー）および８００μＭ ＯＡ（青色バー）においてアップレギュレートされた。Ｇ．１０～２０個のＨＬＯを、０、４００、８００μＭのＯＡを含むＨＣＭ培地中で３日間培養した。培養上清を各ウェルから回収し、それらの上清との膜貫通を使用することによってＴＨＰ－１遊走を測定した。遊走した細胞を計数し、各ウェル中の正確な数のオルガノイドによって正規化した。Ｈ．２５日目のＨＬＯのトリクローム染色で、ＨＬＯ（黒色バー）、ｓＨＬＯ（赤色バー）およびｃＨＬＯ（青色バー）集団におけるトリクローム染色されたＨＬＯの割合結果は平均±標準偏差で表し、ｎ＝８～２０のオルガノイドである。Ｉ．２５日目のＨＬＯのＥｐｃａｍおよびビメンチンについてのＩＦ染色で、ＨＬＯ（黒色バー）、ｓＨＬＯ（赤いバー）およびｃＨＬＯ（青色バー）集団におけるＥｐｃａｍおよびビメンチン陽性ＨＬＯの割合。結果は平均±標準偏差で表し、ｎ＝８～２０オルガノイドである。Ｊ．２０～３０個のＨＬＯを、オレイン酸（８００μＭ）の存在下（青色バー）または非存在下で５日間培養した。これらの上清を用いてＰ３ＮＰをＥＬＩＳＡにより測定した。最終値は、各ウェル内の正確な数のオルガノイドによって正規化した。Ｐ３ＮＰは、未処理（黒色バー）と比較した場合、８００μＭ ＯＡ処理（青色バー）において２．８倍増加した。
【図3】ＡＦＭによって測定した脂肪性肝炎ＨＬＯの硬変転移Ａ．ＡＦＭによってＨＬＯの硬化を測定するための概略図。各単一ＨＬＯ（２５×２５平方μｍに１４×１４マトリックス）の上部領域をＡＦＭカンチレバーで走査し、これは、ＨＬＯのトポグラフィー的および機械的情報の空間的マッピングを提供することができる。スケールバー、１００μｍ。Ｂ．単一ＨＬＯの計算されたヤング率（ＨＬＯの硬化；Ｅ、ｋＰａ）の代表的ヒストグラムはガウス様分布を示し、そのピーク値および幅は０（黒）、２００（赤）、４００（緑）および８００（青）μＭ ＯＡに応じて用量依存的に増加した。Ｃ．ヤング率（ＨＬＯの硬化）を７～１２個のオルガノイドから決定し、箱ひげ図を伴うドットプロットによってまとめた。中央値の増加は、用量依存的に０（黒）、２００（赤）、４００（緑）および８００（青）μＭ ＯＡで観察された。
【図4】ｃＨＬＯの硬さは、ウォルマン病の臨床表現型を要約している。Ａ．健康人（３１７Ｄ６）、ＮＡＦＬＤ患者（ＮＡＦＬＤ１５０、ＮＡＦＬＤ７７、およびＮＡＦＬＤ２７）、およびウォルマン病患者（ＷＤ９０、ＷＤ９２、およびＷＤ９１）を含むいくつかのｉＰＳＣ系統から確立されたＨＬＯおよびｃＨＬＯの明視野像。Ｂ．いくつかのｉＰＳＣ系統に由来した単一のＨＬＯおよびｃＬＯの平均のヤング率（ＨＬＯの硬化：Ｐａ）。
【図5A】ｉＰＳＣ－ｓＨＬＯを使用した脂肪症のヒト表現型変異のモデリング Ａ．肝臓ＴＧ含有量の増加に関与するＰＮＰＬＡ３、ＧＣＫＲ、およびＴＭ６ＳＦ２の代表的な対立遺伝子機能。
【図5B】Ｂ．３つのリスク対立遺伝子の全多遺伝子性スコアリング（ｔｏｔａｌ ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ）に基づく公的に利用可能な２５０４細胞株のパーセント分布を示す円グラフ：０．６<ｘ（緑色領域）、０．３<ｘ≦０．６（黄色領域）、ｘ<＝０．３（茶色領域）。
【図5C】Ｃ．この表は、さらなる研究において割り当てられた多遺伝子性スコアを含むドナーの特徴を要約する。
【図5D】Ｄ．３つの対立遺伝子の３つの群の全多遺伝子性スコアリングにおける脂肪滴（緑色）および核（青色）の生細胞イメージング：０．６<ｘ、０．３<ｘ<＝０．６、ｘ<＝０．３。画像は、１０～２０枚のＺスタック画像を重ね合わせて採用した。
【図5E】Ｅ．３つの対立遺伝子の３つの群の全多遺伝子性スコアリングの各オルガノイドサイズによって正規化された代表的な総脂質体積：０．６<ｘ、０．３<ｘ<＝０．６、ｘ<＝０．３。赤と紺のバーは、それぞれ８００μＭ ＯＡと２００μＭ ＯＡで処理されたｓＨＬＯを示す。
【図5F】Ｆ．３つの対立遺伝子の３つの群の全多遺伝子性スコアリングにおける炎症誘発性サイトカインの代表的な遺伝子発現：０．６<ｘ（黒いバー）、０．３<ｘ<０．６（赤いバー）、ｘ<＝０．３（青いバー）。
【図5G】Ｇ．３つの対立遺伝子の３つの群の全多遺伝子性スコアリングにおける単一ｃＬＯの平均のヤング率（ＨＬＯの硬化：Ｐａ）：０．６<ｘ（黒点）、０．３<ｘ<＝０．６（赤点）、ｘ<＝０．３（青点）Ｈ．ＯＣＡ応答
【図6】ＴＨＰ－１の食細胞活性
【図7】８００μＭのＯＡ、ＰＡ、ＬＡおよびＳＡの脂質蓄積比較。
【図8】４００および８００μＭのＯＡによるＴＨＰ－１の実際の遊走細胞数
【図9】Ａ．Ｅ－ｃａｄ－ｍｒｕｂｙオルガノイド、ＨｅｐＧ２、ＬＸ－２、およびＴＨＰ－１からのＥ－ｃａｄ陽性および陰性ソート済み再構成スフェロイドの写真。Ｂ．炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－８の遺伝子発現。Ｃ．Ｐ３ＮＰのＥＬＩＳＡ測定。
【図10】肝臓オルガノイドのＲＯＳ産生に対するレスベラトロールの効果がないこと。
【図11】ＢＯＤＩＰＹ陽性細胞（脂質）の割合をフローサイトメトリーで測定した。結果は平均値±標準偏差を表し、ｎ＝５である。
【図12】４００μＭイントラリピッドの存在下および非存在下におけるオルガノイド中の脂質蓄積
【図13】未処理培養、８００μＭのＯＡ単独培養、および８００μＭのＯＡと４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９培養における肝臓オルガノイドの明視野像。
【発明を実施するための形態】
【0009】
特に明記しない限り、用語は当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
【0010】
「約」もしくは「およそ」という用語は、当業者による決定に従って、例えば、測定システムの制限の、その値がどのように測定され、または、決定されるかに依存する、特定の値に対して許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務に従って、１以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲であることを意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【0011】
本明細書中で使用されるとき、用語「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）は、胚性細胞型および胚体外細胞型に分化することのできる幹細胞である。そのような細胞は完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能性である。
【0012】
本明細書で使用されるとき、用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内胃壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系））を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞に分化できる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前の胚盤胞の内細胞塊細胞の子孫であり得るか、または特定の遺伝子の発現を強制することによって、成体体細胞などの非多能性細胞の誘導により得ることができる。多能性幹細胞は、任意の適切な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例には、ヒト、げっ歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳動物の供給源が含まれる。
【0013】
本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、成体体細胞などの通常は非多能性細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種を指す。ｈｉＰＳＣはヒトｉＰＳＣを指す。
【0014】
本明細書中で使用されるとき、用語「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」はまた一般にＥＳ細胞とも略され、多能性であり、かつ初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本発明の目的のために、用語「ＥＳＣ」は、胚性生殖細胞も場合により包含するように広く使用される。
【0015】
本明細書中で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、１つ以上の前駆細胞がそれ自体を再生する能力または１つ以上の特殊化細胞型に分化する能力を獲得することになる、本明細書に記載の方法において使用され得る任意の細胞を包含する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば増殖因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔまたはｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞；多能性幹細胞（誘導型または非誘導型）；多分化能性幹細胞；オリゴ分化能性幹細胞および単分化能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、幼児、子供、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処置を介して付与されるような処置を受ける体細胞であり得る。
【0016】
胚性細胞由来の多能性幹細胞
いくつかの実施形態では、１つのステップは、多能性であるかまたは多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は当技術分野において周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本明細書に記載されている例示的な実施形態において使用されるが、本明細書に記載されている方法およびシステムは任意の幹細胞に適用可能であることは当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、１つのステップは、多能性であるかまたは多能性になるように誘導され得る幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、また、この胚性幹細胞は哺乳動物初期胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は当技術分野において周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本明細書に記載されている例示的な実施形態において使用されるが、本明細書に記載されている方法およびシステムは任意の幹細胞に適用可能であることは当業者には理解されよう。
【0017】
本発明に従う実施形態において使用され得るさらなる幹細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）；ＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ａｔ ｔｈｅ Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）；Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）；ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）；Ｔｅｃｈｎｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）；ならびにＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａが保有するｔｈｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって提供されるものか、それらが保有するデータベースに記載されているものを含むが、これらに限定されない。本発明に従う実施形態において使用され得る例示的な胚性幹細胞は、ＳＡ０１（ＳＡ００１）；ＳＡ０２（ＳＡ００２）；ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）；ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）；ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）；ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）；ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）；ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）；ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）；ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）；ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）；ＴＥ０３（１３）；ＴＥ０４（１４）；ＴＥ０６（１６）；ＵＣ０１（ＨＳＦ１）；ＵＣ０６（ＨＳＦ６）；ＷＡ０１（Ｈ１）；ＷＡ０７（Ｈ７）；ＷＡ０９（Ｈ９）；ＷＡ１３（Ｈ１３）；ＷＡ１４（Ｈ１４）を含むが、これらに限定されない。
【0018】
胚性幹細胞についてのさらなる詳細は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２ （５３９１）：１１４５－１１４７；Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ"，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３３：１５２６－１５３０；Ｍａｒｔｉｎ １９８０，"Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９（４４５８）：７６８－７７６；Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ"，Ｎａｔｕｒｅ ２９２（５８１９）：１５４－１５６；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ"，Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６３６－１６４１において見出すことができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0019】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは典型的には、レトロウイルスのようなウイルスベクターを通して達成される。トランスフェクトされた遺伝子はマスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることが示唆されている。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似するようになり、通常は形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通じて単離される。本明細書中で使用されるとき、ｉＰＳＣには、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス系を用いて、４つの中心遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを用いて、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の実施形態では、レンチウイルス系を用いて体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換する。発現がｉＰＳＣにおいて誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ－３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）；Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、成体線維芽細胞などの非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは典型的には、レトロウイルスのようなウイルスベクターを通して達成される。トランスフェクトされた遺伝子はマスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることが示唆されている。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似するようになり、通常は形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通じて単離される。本明細書中で使用されるとき、ｉＰＳＣには、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、レトロウイルス系を用いて、４つの中心遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを用いて、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の実施形態では、レンチウイルス系を用いて体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換する。発現がｉＰＳＣにおいて誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ－３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）；Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）；Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
【0020】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを作製するために非ウイルス系技術が使用される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚および肝臓細胞のＤＮＡに輸送し、その結果、胚性幹細胞と同一の細胞を得ることができる。アデノウイルスはそれ自身の遺伝子のいずれも標的宿主に組み込まないので、腫瘍を作り出す危険性が排除される。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非常に低い効率ではあるが、ウイルストランスフェクション系を全く用いることなく、プラスミドを介して達成することができる。他の実施形態では、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを作製し、したがってウイルスまたは遺伝子改変の必要性を排除する。いくつかの実施形態では、マウスｉＰＳＣ細胞の作製は、類似の方法論を使用して可能であり、ポリアルギニンアンカーを介して細胞内に導かれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態では、多能性誘導遺伝子の発現はまた、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによっても増加させることができる。
【0021】
胚性幹細胞に関するさらなる詳細は、Ｋａｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，"Ｖｉｒｕｓ ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ"，Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７７１－７７５；Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，"ｐｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ"，Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７６６－７７０；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４９－９５３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００８，"Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４５－９４９；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ"，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（５）：３８１－３８４において見出すことができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0022】
いくつかの実施形態では、例示的なｉＰＳ細胞株には、ｉＰＳ－ＤＦ１９－９；ｉＰＳ－ＤＦ１９－９；ｉＰＳ－ＤＦ４－３；ｉＰＳ－ＤＦ６－９；ｉＰＳ（包皮）；ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）；およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）が含まれるが、これらに限定されない。
【0023】
ＤＥ発生に関連するシグナル伝達経路の機能に関するさらなる詳細は、例えば、ＺｏｒｎおよびＷｅｌｌｓ，２００９，"Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ"，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：２２１－２５１；Ｄｅｓｓｉｍｏｚ ｅｔ ａｌ．，２００６，"ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｇｕｔ ｔｕｂｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ"，Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １２３：４２－５５；ＭｃＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，"Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"，１３４：２２０７－２２１７；ＷｅｌｌｓおよびＭｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１５６３－１５７２；ｄｅ Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ"，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０（７）：１３２２－１３３２において見出すことができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0024】
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＵＳ９７／１９０６８Ｂ２（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．），"Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ"，およびＵＳ２０１７／０２４０８６６Ａ１（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．），"Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｇａｓｔｒｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ"に記載されている。いくつかの実施形態では、多能性細胞は桑実胚に由来し得る。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は幹細胞であり得る。これらの方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞を含み得るが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊または胚の生殖巣堤に由来し得る。胚性幹細胞または生殖細胞は、ヒトを含む種々の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない種々の動物種に由来し得る。いくつかの実施形態において、ヒト胚性幹細胞は胚体内胚葉を産生するために使用される。いくつかの実施形態において、ヒト胚性生殖細胞は、胚体内胚葉を産生するために使用される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは胚体内胚葉を産生するために使用される。本発明において使用することができるＤＥ細胞を取得または作製するためのさらなる方法としては、米国特許第．７，５１０，８７６号（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第７，３２６，５７２号（Ｆｉｓｋ ｅｔ ａｌ．）；Ｋｕｂｏ１ ｅｔ ａｌ．，２００４，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ"，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１：１６５１－１６６２；Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ"，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１５３４－１５４１；およびＡｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，"Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｌｉｎｅａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＨＮＦ３／ｆｏｒｋｈｅａｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ"，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１９：１３０１－１３１５に記載されたものを含むが、これらに限定されない。
【0025】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、致命的な肝障害を発症する可能性を高めるために先進国で克服すべき主要な課題の１つであるが、今のところ効果的な治療法はない。同様に、医原性の親栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）は、現在効果的な治療法がない疾患である。脂肪性肝炎および／または脂肪滴の蓄積および膀胱骨格フィラメント組織崩壊、脂肪症、および肝細胞膨化などの肝疾患の臨床病理学的特徴を有するモデルが必要とされている。患者の幹細胞を用いた疾患モデルの有望にもかかわらず、現在のアプローチは、単細胞、単遺伝子性、および比較的単純な病状へのそれらの適用において限定され、上皮臓器線維症などのより一般的かつ複雑な病的病状を捉えられない。
【0026】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルを作製する方法が開示される。この方法は、本明細書に記載の方法に従って作製された肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み得る。ＦＦＡ組成物は、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせ、好ましくはオレイン酸を含み得る。ＦＦＡの量は当業者によって決定され得る。一態様では、ＦＦＡ、好ましくはオレイン酸は、約１０μＭ～約１０，０００μＭ、または約２０μＭ～約５，０００μＭ、または約３０μＭ～約２５００μＭ、または約４０μＭ～約１２５０μＭまたは約５０μＭ～約１０００μＭ、または約７５μＭ～約９００μＭまたは約８０μＭ～約８００μＭ、または約９０μＭ～約７００μＭ、または約１００μＭ～約５００μＭ、または約２００μＭ～約４００μＭ、の量で肝臓オルガノイドと接触させることができる。ＦＦＡは、肝臓オルガノイドと、約１時間～約１０日間、または約２時間～約９日間、または約３時間～約８日間、または約４時間～約７日間、または約５時間～約６日間、または約６時間～約５日間、または約７時間～約４日間、または約８時間～約３日間、または約９時間～約２日間、または約１０時間～約１日間、接触させることができる。一態様では、範囲は約３～約５日間、±２４時間である。
【0027】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルは脂肪肝疾患のモデルである。
【0028】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルは脂肪性肝炎のモデルである。
【0029】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルは肝硬変のモデルである。
【0030】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルは、非経口栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）のモデルである。
【0031】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルはＮＡＦＬＤのモデルである。
【0032】
一態様では、脂肪毒性オルガノイドモデルは、細胞骨格フィラメント組織崩壊、ＲＯＳ増加、ミトコンドリア膨化、トリグリセリド蓄積、線維症、肝細胞バルーニング、ＩＬ６分泌、脂肪症、炎症、バルーニングおよびマロリー体様（Ｍａｌｌｏｒｙ’ｓ ｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ）、組織硬化、細胞死およびそれらの組み合わせを特徴とし得る。
【0033】
一態様では、ＮＡＦＬＤおよび／または胆汁うっ滞を含む、肝疾患の治療のための薬物をスクリーニングする方法が開示されている。この方法は、本明細書に開示されているように、候補薬物を脂肪毒性オルガノイドモデルと接触させるステップを含み得る。
【0034】
一態様では、栄養補助食品／ＴＰＮの有効性をアッセイする方法が開示されている。この方法は、栄養サプリメント／ＴＰＮを本明細書に開示されているような脂肪毒性オルガノイドモデルと接触させるステップを含み得る。
【0035】
一態様では、脂肪肝疾患の三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデルが開示され、オルガノイドは脂肪症、炎症、バルーニングおよびマロリー体、ＲＯＳ蓄積およびミトコンドリア過負荷、線維症および組織硬化、ならびに細胞死を特徴とする。
【0036】
一態様では、三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデルは、薬物誘発性肝毒性および炎症／線維症のモデルである。
【0037】
一態様では、三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデルは、非経口栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）のモデルである。
【0038】
一態様では、三次元（３Ｄ）肝臓オルガノイドモデルは炎症性細胞、例えばＴ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まない。
【0039】
前述の方法において使用され得る、および／または前述の組成物を得るために使用され得る、ｉＰＳＣ細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法もまた開示される。方法は、以下のステップを含み得る。
【0040】
ａ）後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１～約３日間、ｉＰＳＣ細胞由来の胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦ経路活性化剤およびＧＳＫ３阻害剤と接触させる工程と、ｂ）肝臓オルガノイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１～約５日間、好ましくは約４日間、レチノイン酸（ＲＡ）の存在下で、ステップａで得られた後部前腸スフェロイドをインキュベートする工程と、を含み得る。
【0041】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用はＦＧＦシグナル伝達に必須であることが示されている。適切なＦＧＦ経路活性化剤は、当業者には容易に理解されよう。例示的なＦＧＦ経路活性化剤としてはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを用いてこれらの経路を活性化してもよい。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＤＥ培養物は、１０ｎｇ／ｍｌ以上；２０ｎｇ／ｍｌ以上；５０ｎｇ／ｍｌ以上；７５ｎｇ／ｍｌ以上；１００ｎｇ／ｍｌ以上；１２０ｎｇ／ｍｌ以上；１５０ｎｇ／ｍｌ以上；２００ｎｇ／ｍｌ以上；５００ｎｇ／ｍｌ以上；１，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１，２００ｎｇ／ｍｌ以上；１，５００ｎｇ／ｍｌ以上；２，０００ｎｇ／ｍｌ以上；５，０００ｎｇ／ｍｌ以上；７，０００ｎｇ／ｍｌ以上；１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上；または１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の本明細書に記載のシグナル伝達経路の１つ以上の分子で処置される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子の濃度は処置の間、一定に維持される。他の実施形態では、シグナル伝達経路の分子の濃度は、処置の過程で変化する。いくつかの実施形態において、本発明によるシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上の濃度であり得る。当業者は、本明細書に記載されるレジメンが、限定されるものではないがＦＧＦシグナル伝達経路における任意の分子を含む、本明細書に記載されるシグナル伝達経路の任意の既知の分子に単独でまたは組み合わせて適用可能であることを理解するであろう。
【0043】
適切なＧＳＫ３阻害剤は、当業者には容易に理解されよう。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ３βを阻害するＣｈｉｒｏｎ／ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、開示された方法を実施するのに適したＧＳＫ３阻害剤を認識するであろう。ＧＳＫ３阻害剤は、約１μＭ～約１００μＭ、または約２μＭ～約５０μＭ、または約３μＭ～約２５μＭの量で投与されてもよい。当業者は、適切な量および期間を容易に認識するであろう。
【0044】
一態様において、幹細胞は、哺乳動物、またはヒトのｉＰＳＣであり得る。
【0045】
一態様において、前腸スフェロイドは、例えば、商標名Ｍａｔｒｉｇｅｌとして販売されている市販の基底膜マトリックスなどの基底膜マトリックス中に埋め込むことができる。
【0046】
一態様において、肝臓オルガノイドは、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、ＨＮＦ４ａ、Ｅ－カドヘリン、ＤＡＰＩ、およびＥｐｃａｍを発現し得ることを特徴とし得る。そのような発現は、例えば、４０日目～５０日目に起こり得る。発現レベルは、ヒト肝細胞において観察されるもの、例えば、成体肝細胞のものと類似していてもよい。
【0047】
一態様において、肝臓オルガノイドは、胆汁輸送活性を有することを特徴とし得る。
【0048】
一態様において、肝臓オルガノイドは幹細胞に由来してもよく、内在化微絨毛細胞および間葉系細胞をさらに含む管腔構造を含んでもよい。管腔構造は、極性肝細胞および基底膜によって囲まれていてもよい。肝臓オルガノイドは、機能的星細胞および機能的クッパー細胞を含み得る。
【0049】
ある特定の態様において、肝臓オルガノイドは、以下：胆汁産生能、胆汁輸送活性、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｈ発現、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｂ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ３発現、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ４発現、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のフィブリノゲン産生、および少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のアルブミン産生、のうちの１つ以上を有することを特徴とし得る。一態様において、肝臓オルガノイドは、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｍＬ １ｘｅ６細胞／２４時間の総肝臓タンパク質発現を有することを特徴とし得る。肝臓オルガノイドは、ＰＲＯＸ１、ＲＢＰ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＢＣＣ１１、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ５、ＡＬＢ、ＦＢＧ、ＭＲＰ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ６８、ＣＤ３４、ＣＤ３１から選択される１つ以上の遺伝子を発現し得ることを特徴とし得る。一態様において、肝臓オルガノイドは、例えば、ＣＹ２Ｃ９＊２変異体などの薬物代謝シトクロム変異体を含む細胞を含み得る。肝臓オルガノイドは、ＵＳ２０１６／０１７７２７０に記載されているもののような血管系を含み得る。
【0050】
一態様において、肝臓オルガノイドは、肝臓オルガノイドが炎症細胞、例えば、Ｔ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まないことを特徴とし得る。
【実施例0051】
３Ｄ組織の高次機能を達成したヒトオルガノイド系は、健康および疾患においてインビボの臓器構造によく似ているが、炎症および線維症などのより一般的で複雑な病状を捉えることができなかった。ここで、出願人は脂肪性肝炎の本質的な特徴を示す多細胞ヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）モデルを開発した。培養上の脂肪酸曝露は持続的な脂肪症の誘導を可能にし、続いてＨＬＯで大規模な線維症を発症する炎症誘発性および線維性の系統の進行性の活性化が続く。興味深いことに、脂肪性肝炎の表現型の発現は臨床的に報告された遺伝的要因によって強く影響される。原子間力顕微鏡測定は、全体的なオルガノイド硬化が炎症および線維症の重症度と相関することを明らかにした。臨床表現型に対する測定の忠実度は、３つの一遺伝子性の脂肪性肝炎特異的ｉＰＳＣ株を用いて確認された。さらに、本出願人は、オルガノイドにおいて医原性の親の栄養関連肝疾患（ＰＮＡＬＤ）モデルを確立した。
【0052】
レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達は、初期器官特定化期（ｅａｒｌｙ ｏｒｇａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の間、前腸内胚葉からの甲状腺、肺、および膵臓のよく知られた重要な指定子（ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ）であるが、モデル生物における肝臓の特定化には明らかに必須ではない（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｄｒｙｓｄａｌｅ，２０１５ゼブラフィッシュを除く（Ｎｅｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。実際、アフリカツメガエルとニワトリは、ＲＡを欠く胚で肝臓の特定化が生じるので哺乳動物と似ている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓｔａｆｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。逆に、いくつかの動物実験は、ＲＡが間葉からの肝星状細胞分化を促進することを示唆し、これは、ＳＴＭおよび星状細胞で発現されるジンクフィンガー転写因子ＷＴ１によって部分的に制御される（Ｉｊｐｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。さらに、いくつかの研究は、バランスのとれたＲＡ調節がヒト幹細胞からの単球の運命特定を誘導することを示唆している（Ｐｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｒｏｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。また、その後の肝芽の成長は、未知のメカニズムを介したＲＡシグナル伝達によって促進される（Ｚｏｒｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，２００９）。実質細胞および非実質細胞の両方の特定化に対するＲＡのより広い役割を考えると、出願人は、時限的ＲＡ曝露が炎症誘発性系統を含む肝間質細胞の系統多様化に影響を及ぼし、それによって炎症および線維症をモデル化するためのヒト肝臓オルガノイドの創製を容易にし得ると仮定した。
【0053】
最近、ＰＳＣからの前腸スフェロイド生成による腸オルガノイドへの指向性分化が報告されている（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。これらのオルガノイドは、上皮細胞を生成するだけでなく、間葉系細胞成分も同時発生する。ここで、この前腸生成法を利用することによって、本出願人は、肝臓オルガノイドへの適時のＲＡパルスは、ヒトｉＰＳＣからの肝特異化後の支持系統を優先的に同時分化させるという仮説を試験した。それらが同時発生することができる４－Ｄ状態で上皮系統と支持系統との間の密接な相互作用を促進することによって、出願人は、炎症および線維症をモデル化するための肝臓オルガノイドの適用性を実証した。出願人はまた、生きている状態において単一のオルガノイドレベルで硬化を評価することによって線維症の重症度を決定するためのスクリーニングプラットフォームを確立した。本方法は、薬物開発および個別化治療に向けた上皮器官の炎症および線維症の研究のための非常に貴重な適用プラットフォームとして役立つ。
【0054】
結果
ヒトｉＰＳＣからのＲＡに基づく肝臓オルガノイドモデルの生成
ＲＡシグナル伝達が間質細胞に対する系統分化の決定に影響を与えるかどうかを明らかにするために、出願人は、ＲＡの一過性誘導によるヒトｉＰＳＣからの肝臓オルガノイドモデルを確立した。以前に記載されているように（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、出願人は、最初にｉＰＳＣを胚体内胚葉（ＤＥ）の特定化を介して前腸スフェロイドに分化させた。前腸スフェロイドを同じウェルで増殖した付着細胞と混合し、混合物をＭａｔｒｉｇｅｌに包埋した。ＲＡは環境依存プロセスを介した多様な系統に対する既知の指定子であるので、出願人は、肝細胞培養培地（ＨＣＭ）中で培養されて、図１、Ａに示すように２０日目に確立されたオルガノイドに特徴付けられる肝細胞成熟プロセスの前の初期ＲＡシグナル伝達の持続時間を設定した。培養培地中の最高濃度のアルブミンは、０～５日の様々な期間のＲＡの中で４日間のＲＡ曝露で観察されたので、確立されたオルガノイドのさらなる特徴付けをＲＡ曝露０～４日間の２つの条件間で比較した。ＲＡの処理されたウェルでは、未処理のものと比較してオルガノイドの数は１．８倍増加し、サイズはＲＡ処理後に１．５倍に増加した（図１、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。アルブミン分泌は、未処理（０．５～３．５μｇ／ｍｌ、図１、Ｅ）と比較した場合、ＲＡ処理群（３．０～６．５μｇ／ｍｌ）において２倍増加した。注目すべきことに、アルブミン分泌が、アルブミンが最初に検出された２０日後から４０日以上維持された（データは示さず）。興味深いことに、内部管腔構造は９５％のＲＡ処理オルガノイドに現れたが、未処理オルガノイドの１２％にしか検出されず、オルガノイドの内腔化はＲＡシグナル伝達に依存することを示した（図１、Ｆ）。
ヒトｉＰＳＣからのＲＡに基づく肝臓オルガノイドモデルの生成
ＲＡシグナル伝達が間質細胞に対する系統分化の決定に影響を与えるかどうかを明らかにするために、出願人は、ＲＡの一過性誘導によるヒトｉＰＳＣからの肝臓オルガノイドモデルを確立した。以前に記載されているように（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、出願人は、最初にｉＰＳＣを胚体内胚葉（ＤＥ）の特定化を介して前腸スフェロイドに分化させた。前腸スフェロイドを同じウェルで増殖した付着細胞と混合し、混合物をＭａｔｒｉｇｅｌに包埋した。ＲＡは環境依存プロセスを介した多様な系統に対する既知の指定子であるので、出願人は、肝細胞培養培地（ＨＣＭ）中で培養されて、図１、Ａに示すように２０日目に確立されたオルガノイドに特徴付けられる肝細胞成熟プロセスの前の初期ＲＡシグナル伝達の持続時間を設定した。培養培地中の最高濃度のアルブミンは、０～５日の様々な期間のＲＡの中で４日間のＲＡ曝露で観察されたので、確立されたオルガノイドのさらなる特徴付けをＲＡ曝露０～４日間の２つの条件間で比較した。ＲＡの処理されたウェルでは、未処理のものと比較してオルガノイドの数は１．８倍増加し、サイズはＲＡ処理後に１．５倍に増加した（図１、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。アルブミン分泌は、未処理（０．５～３．５μｇ／ｍｌ、図１、Ｅ）と比較した場合、ＲＡ処理群（３．０～６．５μｇ／ｍｌ）において２倍増加した。注目すべきことに、アルブミン分泌が、アルブミンが最初に検出された２０日後から４０日以上維持された（データは示さず）。興味深いことに、内部管腔構造は９５％のＲＡ処理オルガノイドに現れたが、未処理オルガノイドの１２％にしか検出されず、オルガノイドの内腔化はＲＡシグナル伝達に依存することを示した（図１、Ｆ）。
【0055】
次に、出願人は、肝細胞における排出輸送のマーカーである、肝細胞中のエステラーゼ加水分解後にフルオレセインに変わるフルオレセインジアセテートを培養培地中に添加することによって胆汁輸送活性を試験し、そして蛍光の流れを追跡した。蛍光物質は、フルオレセインジアセテート添加後数分以内にオルガノイドの細胞に吸収され、その後細胞から内腔に排泄された（図１、Ｇ）。対照的に、蛍光はスフェロイドでは検出されなかった。胆汁輸送活性は肝臓の重要な機能であるので、今後ＨＬＯと定義されるヒト肝臓オルガノイドは、アルブミン分泌および胆汁輸送機能を含む複数のヒト肝細胞機能を表すモデルとして使用され得る。
【0056】
ヒトｉＰＳＣ肝臓オルガノイドにおける線維化前および炎症性系統の同時分化
興味深いことに、ＲＡ処理ＨＬＯの単細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析は、星状細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＤＥＳ、ＰＤＧＦＲＢ）、クッパー細胞マーカー（ＣＤ６８、ＩＲＦ７）、および内皮細胞マーカー（ＯＩＴ３、ＤＰＰ４、Ｃ１ＱＴＮＦ１；図１、Ｈ）によって証明されるように、星状細胞、肝内在性マクロファージ、クッパー細胞、および内皮細胞に特異的な発現痕跡を示した（Ｂａｈａｒ Ｈａｌｐｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｅｌ Ｔａｇｈｄｏｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５、ｖａｎ ｄｅ Ｇａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。星状細胞およびクッパー細胞の存在を確認するために、出願人は、上皮細胞マーカーＥｐＣＡＭ、星状細胞マーカーＣＤ１６６／ＡＬＣＡＭ、ならびにクッパー細胞マーカーＣＤ６８およびＦ４／８０を用いてＦＡＣＳによる定量分析を行った（Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＥｐＣＡＭ＋細胞の頻度はＨＬＯの７８．８５±７．３５％であったが、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ１６６＋、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６８＋、およびＥｐＣＡＭ－Ｆ４／８０＋発現細胞はそれぞれ３２．４±１．２％、１．６９±０．３％、および１．６８±０．２％であった（図１、Ｉ）。免疫組織化学により、ＣＤ６８細胞の発現もＨＬＯで検出され、ＣＤ６８発現は内腔側の細胞に局在していた（図１、Ｊ）。ヒト肝星状細胞の新規マーカーであり、げっ歯類における星状細胞の分化転換のプロセスに必要であると報告されているビメンチンおよびＧＦＡＰ（Ｇｅｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｋｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は両方ともＨＬＯで検出され、同じ細胞中で同時発現し（図１、Ｊ）、これは星状細胞がＨＬＯに存在することを示している。
興味深いことに、ＲＡ処理ＨＬＯの単細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析は、星状細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＤＥＳ、ＰＤＧＦＲＢ）、クッパー細胞マーカー（ＣＤ６８、ＩＲＦ７）、および内皮細胞マーカー（ＯＩＴ３、ＤＰＰ４、Ｃ１ＱＴＮＦ１；図１、Ｈ）によって証明されるように、星状細胞、肝内在性マクロファージ、クッパー細胞、および内皮細胞に特異的な発現痕跡を示した（Ｂａｈａｒ Ｈａｌｐｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｅｌ Ｔａｇｈｄｏｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５、ｖａｎ ｄｅ Ｇａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。星状細胞およびクッパー細胞の存在を確認するために、出願人は、上皮細胞マーカーＥｐＣＡＭ、星状細胞マーカーＣＤ１６６／ＡＬＣＡＭ、ならびにクッパー細胞マーカーＣＤ６８およびＦ４／８０を用いてＦＡＣＳによる定量分析を行った（Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＥｐＣＡＭ＋細胞の頻度はＨＬＯの７８．８５±７．３５％であったが、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ１６６＋、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ６８＋、およびＥｐＣＡＭ－Ｆ４／８０＋発現細胞はそれぞれ３２．４±１．２％、１．６９±０．３％、および１．６８±０．２％であった（図１、Ｉ）。免疫組織化学により、ＣＤ６８細胞の発現もＨＬＯで検出され、ＣＤ６８発現は内腔側の細胞に局在していた（図１、Ｊ）。ヒト肝星状細胞の新規マーカーであり、げっ歯類における星状細胞の分化転換のプロセスに必要であると報告されているビメンチンおよびＧＦＡＰ（Ｇｅｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｋｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は両方ともＨＬＯで検出され、同じ細胞中で同時発現し（図１、Ｊ）、これは星状細胞がＨＬＯに存在することを示している。
【0057】
ＣＤ６８発現細胞がクッパー細胞と同様にＨＬＯにおいて機能的に活性であるかどうかを調べるために、出願人は、ＴＨＰ１ヒトマクロファージ細胞において観察されたように、食作用において生じる高ｐＨから低ｐＨへの環境シフトに応答して蛍光（赤）の劇的な増加を受けるｐＨ感受性ローダミンベースの生細胞色素を用いて、肝臓に存在するクッパー細胞において活性であると報告されている、ＨＬＯにおける食作用活性をモニターした（図８）。ＨＬＯでは、ＣＤ６８発現細胞と同様に活性が検出され局在したが、スフェロイドでは検出されることはまれであった（図１、Ｋ）。これらの所見は、ＲＡベースの肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）が、ヒトｉＰＳＣから星状細胞およびクッパー細胞を含む多系統の肝臓間質細胞を自然に発生させる独特の肝臓モデルであることを示している。
【0058】
遊離脂肪酸によるＨＬＯの炎症反応と線維化誘導
現在、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）がインビトロの脂肪毒性肝細胞モデルを確立するための開始因子として広く使用されているが、しかしながら、脂肪蓄積が唯一の表現型である（Ｋａｎｕｒｉ ａｎｄ Ｂｅｒｇｈｅｉｍ，２０１３）。肝細胞とクッパー細胞の代替共培養モデルは、ＩＬファミリーサイトカイン、マクロファージ関連サイトカイン、およびＭＭＰ関連サイトカインの発現増加などの炎症反応を示したが、その後の線維症は示さなかった（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。包括的なトランスクリプトーム解析によって示される脂質代謝機能関連遺伝子を有する肝細胞、星状細胞およびクッパー様細胞の存在を考えると、出願人は、ＦＦＡ曝露が自然に炎症反応および結果として生じるＨＬＯにおける線維性反応を引き起こすと仮定した。この仮説を検証するために、出願人はＦＦＡを用いて３～５日間ＨＬＯを処理した。出願人は、３日および５日のＯＡ処理ＨＬＯを脂肪性肝炎（ｓ）ＨＬＯおよび肝硬変（ｃ）ＨＬＯとして示した（図４、Ａ）。ｓＨＬＯは、３日間オレイン酸で処理したＨＬＯであり、脂質蓄積および炎症を示す。ｃＨＬＯは、５日間オレイン酸で処理されたＨＬＯであり、脂質蓄積および炎症に加えて線維症（ＨＬＯは硬化する）を示す。最初に、脂質蓄積に関して、オレイン酸（ＯＡ、１８：１ ｎ９）、リノール酸（ＬＡ、１８：２）、パルミチン酸（ＰＡ、１６：０）、およびステアリン酸（ＳＡ、１８：０）を含む複数のＦＦＡの効果を比較するため、生細胞イメージングを、ＦＦＡ曝露の３日後に脂質色素ＢＯＤＩＰＹを用いて実施した。図７が示すように、ＯＡは肝細胞様細胞における脂質蓄積の誘導に最も効果的であり、ＳＡは最も効果が低かった。ＯＡが大量の脂質蓄積を引き起こすことを考慮して、ｓＨＬＯにおける炎症反応を引き起こすためにＯＡの濃度を変えた（０、２００、４００、および８００μＭ）。生細胞イメージングおよびその後の定量化により、脂質蓄積が用量依存的にｓＨＬＯにおいて上昇したことが示された（１８倍まで；図４、ＢおよびＣ）。脂質蓄積の増加に加えて、脂肪滴のサイズは拡大した（図４、Ｂ）。肝細胞バルーニング（拡大）は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）活性（ＮＡＳスコアリング）を決定するための病理学的等級付け指標の１つであり、これは、細胞膜のライブイメージングにより８００μＭのＯＡ処理ｓＨＬＯにおいて確認された（図４Ｂ）。肝臓に蓄積された脂質の主成分であるトリグリセリドも、８００μＭの処理されたｓＨＬＯにおいて検出されたが、未処理のｓＨＬＯでは検出されなかった（図４、Ｄ）。より重要なことに、培養上清のＥＬＩＳＡは、未処理のものと比較した場合、ＩＬ－６が８００μＭのＯＡ処理ｓＨＬＯ培地中で２．２倍分泌されたことを示した（図４、Ｅ）。ＩＬ－８およびＴＮＦ－アルファもまた、２００μＭまたは８００μＭのＯＡ処理条件下でアップレギュレートされた（それぞれ１０倍および２倍の増加；図４、Ｆ）。さらに、ＯＡ処理ｓＨＬＯ馴化培地を用いて、トランスウェルで培養してから２４時間後にＴＨＰ１の遊走を評価し、ＴＨＰ－１遊走細胞は、ＯＡ処理ｓＨＬＯ中で上昇し、これは、ＦＦＡ処理が、おそらく肝細胞様細胞にストレスを引き起こすことによってｓＨＬＯにおいて炎症反応を自然に誘発したことを示唆している（最大２倍：図４、Ｇおよび図８）。これらの炎症および線維症の特徴がＨＬＯに特異的であるかどうかを確認するために、出願人はＥ－ｃａｄ ｍＲｕｂｙ胚性幹（ＥＳ）細胞由来のオルガノイドから上皮マーカーＥ－ｃａｄを単離し、Ｅ－ｃａｄ陽性または陰性細胞のいずれかからスフェロイドを再構築し、そしてＩＬ６およびＰ３ＮＰについてのＥＬＩＳＡならびにＩＬ８およびＴＮＦ－αについてのＲＮＡ発現に適用した。図９が示すように、Ｅ－ｃａｄ陽性細胞も陰性細胞由来スフェロイドも、Ｐ３ＮＰおよびＩＬ－６分泌産生を引き起こさず、炎症マーカーの遺伝子発現を過剰発現しなかった。出願人はまた、ヒト肝細胞細胞株ＨｅｐＧ２、マクロファージ細胞株ＴＨＰ－１、および肝星状細胞ＬＸ－２を用いて同じ実験を試験し、そしてＥ－ｃａｄ陽性および陰性細胞の同様の結果を有した。結果は、肝臓オルガノイドが炎症および線維症反応に対するＦＦＡ治療にのみ反応することを示した。
現在、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）がインビトロの脂肪毒性肝細胞モデルを確立するための開始因子として広く使用されているが、しかしながら、脂肪蓄積が唯一の表現型である（Ｋａｎｕｒｉ ａｎｄ Ｂｅｒｇｈｅｉｍ，２０１３）。肝細胞とクッパー細胞の代替共培養モデルは、ＩＬファミリーサイトカイン、マクロファージ関連サイトカイン、およびＭＭＰ関連サイトカインの発現増加などの炎症反応を示したが、その後の線維症は示さなかった（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。包括的なトランスクリプトーム解析によって示される脂質代謝機能関連遺伝子を有する肝細胞、星状細胞およびクッパー様細胞の存在を考えると、出願人は、ＦＦＡ曝露が自然に炎症反応および結果として生じるＨＬＯにおける線維性反応を引き起こすと仮定した。この仮説を検証するために、出願人はＦＦＡを用いて３～５日間ＨＬＯを処理した。出願人は、３日および５日のＯＡ処理ＨＬＯを脂肪性肝炎（ｓ）ＨＬＯおよび肝硬変（ｃ）ＨＬＯとして示した（図４、Ａ）。ｓＨＬＯは、３日間オレイン酸で処理したＨＬＯであり、脂質蓄積および炎症を示す。ｃＨＬＯは、５日間オレイン酸で処理されたＨＬＯであり、脂質蓄積および炎症に加えて線維症（ＨＬＯは硬化する）を示す。最初に、脂質蓄積に関して、オレイン酸（ＯＡ、１８：１ ｎ９）、リノール酸（ＬＡ、１８：２）、パルミチン酸（ＰＡ、１６：０）、およびステアリン酸（ＳＡ、１８：０）を含む複数のＦＦＡの効果を比較するため、生細胞イメージングを、ＦＦＡ曝露の３日後に脂質色素ＢＯＤＩＰＹを用いて実施した。図７が示すように、ＯＡは肝細胞様細胞における脂質蓄積の誘導に最も効果的であり、ＳＡは最も効果が低かった。ＯＡが大量の脂質蓄積を引き起こすことを考慮して、ｓＨＬＯにおける炎症反応を引き起こすためにＯＡの濃度を変えた（０、２００、４００、および８００μＭ）。生細胞イメージングおよびその後の定量化により、脂質蓄積が用量依存的にｓＨＬＯにおいて上昇したことが示された（１８倍まで；図４、ＢおよびＣ）。脂質蓄積の増加に加えて、脂肪滴のサイズは拡大した（図４、Ｂ）。肝細胞バルーニング（拡大）は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）活性（ＮＡＳスコアリング）を決定するための病理学的等級付け指標の１つであり、これは、細胞膜のライブイメージングにより８００μＭのＯＡ処理ｓＨＬＯにおいて確認された（図４Ｂ）。肝臓に蓄積された脂質の主成分であるトリグリセリドも、８００μＭの処理されたｓＨＬＯにおいて検出されたが、未処理のｓＨＬＯでは検出されなかった（図４、Ｄ）。より重要なことに、培養上清のＥＬＩＳＡは、未処理のものと比較した場合、ＩＬ－６が８００μＭのＯＡ処理ｓＨＬＯ培地中で２．２倍分泌されたことを示した（図４、Ｅ）。ＩＬ－８およびＴＮＦ－アルファもまた、２００μＭまたは８００μＭのＯＡ処理条件下でアップレギュレートされた（それぞれ１０倍および２倍の増加；図４、Ｆ）。さらに、ＯＡ処理ｓＨＬＯ馴化培地を用いて、トランスウェルで培養してから２４時間後にＴＨＰ１の遊走を評価し、ＴＨＰ－１遊走細胞は、ＯＡ処理ｓＨＬＯ中で上昇し、これは、ＦＦＡ処理が、おそらく肝細胞様細胞にストレスを引き起こすことによってｓＨＬＯにおいて炎症反応を自然に誘発したことを示唆している（最大２倍：図４、Ｇおよび図８）。これらの炎症および線維症の特徴がＨＬＯに特異的であるかどうかを確認するために、出願人はＥ－ｃａｄ ｍＲｕｂｙ胚性幹（ＥＳ）細胞由来のオルガノイドから上皮マーカーＥ－ｃａｄを単離し、Ｅ－ｃａｄ陽性または陰性細胞のいずれかからスフェロイドを再構築し、そしてＩＬ６およびＰ３ＮＰについてのＥＬＩＳＡならびにＩＬ８およびＴＮＦ－αについてのＲＮＡ発現に適用した。図９が示すように、Ｅ－ｃａｄ陽性細胞も陰性細胞由来スフェロイドも、Ｐ３ＮＰおよびＩＬ－６分泌産生を引き起こさず、炎症マーカーの遺伝子発現を過剰発現しなかった。出願人はまた、ヒト肝細胞細胞株ＨｅｐＧ２、マクロファージ細胞株ＴＨＰ－１、および肝星状細胞ＬＸ－２を用いて同じ実験を試験し、そしてＥ－ｃａｄ陽性および陰性細胞の同様の結果を有した。結果は、肝臓オルガノイドが炎症および線維症反応に対するＦＦＡ治療にのみ反応することを示した。
【0059】
ＨＬＯが線維症様状態に向かって進行するかどうかをさらに決定するために、出願人はｓＨＬＯおよびｃＨＬＯに対してマッソントリクローム染色を行った。トリクローム陽性ＨＬＯはｓＨＬＯでは観察されなかったが、ｃＨＬＯでは有意に増加した（図２、Ｈ）。さらに、上皮マーカーＥｐｃａｍおよび線維症マーカービメンチンのＩＦ染色は、ｃＨＬＯにおいてＥｐｃａｍ陽性ＨＬＯの増加およびビメンチン陽性ＨＬＯの減少を示し（図２、Ｉ）、これは、ＯＡ処理が、ｃＨＬＯにおいて線維性集団ならびにマトリックス沈着の選択的増加を誘導したことを示唆している。さらに、Ｐ３ＮＰのＥＬＩＳＡも、ＯＡ曝露の５日目に測定された。未処理のものと比較した場合、Ｐ３ＮＰ分泌は、８００μＭのＯＡ処理ＨＬＯの培地中で２．８倍増加した（図４、Ｊ）。まとめると、これらの観察は、ＦＦＡ曝露が単にトリグリセリドの蓄積を引き起こすだけでなく、ＨＬＯにおける炎症反応および線維症も引き起こしたことを示した。
【0060】
単細胞レベルでのＦＦＡ処理による炎症および線維症のｃＨＬＯプロファイル
ＡＦＭによる線維症のハイスループット定量
蓄積された証拠は、肝臓の硬化が肝線維症の重症度とよく相関していることを示し（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８）、それによりＨＬＯの硬化を測定することはＨＬＯの線維症の重症度を評価する可能性がある。平滑筋アクチン免疫染色の出願人の予備的定性分析は、ＯＡ曝露による用量依存性線維症進行を示す（図２、Ｈ、Ｉ、およびＪ）。スクリーニング可能なフォーマットにおいてより定量的な洞察を得るために、出願人はこのように、ＨＬＯ線維症が原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた微小押し込み（ｍｉｃｒｏ－ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて用量依存的に硬化を増大させることができるかどうかを生きた状態で評価した。図４のＡに示すように、各単一ＨＬＯの上部領域（２５×２５μｍ四方の１４×１４マトリックス）をＡＦＭカンチレバーで走査し、これは、ＨＬＯのトポグラフィー的および機械的情報の空間マッピングを提供することができる。単一ＨＬＯの計算されたヤング率（Ｅ、ｋＰａ）の代表的なヒストグラムは、明らかにガウス様分布を示し、そのピーク値および幅は、ＯＡ濃度に従って増加した（図４、Ｂ；０、２００、４００、８００μＭ）。ＨＬＯから決定されたヤング率は、箱ひげ図によるドットプロットによって要約され（図４、Ｃ）、これは、ＨＬＯの硬さが０から８００μＭ ＯＡまで徐々に上昇すること、すなわち中央値の緩やかなシフトおよび硬化範囲の拡大が、ＯＡ濃度の上昇に従って観察された。エメディアン値は、０、２００、４００、および８００μＭのＯＡ処理オルガノイドについて、それぞれ１．２ｋＰａ、１．６ｋＰａ、２．４ｋＰａ、および２．８ｋＰａであった。さらに、９０パーセンタイルと１０パーセンタイルとの間の差（ΔＰ９０－１０）は、未処理オルガノイドについては３．２ｋＰａであり、８００μＭ ＯＡ処理オルガノイドについては７．０ｋＰａであった。図３、Ｆが示すように、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－８もまた、ＮＡＦＬＤ患者における線維症の重症度と相関することが知られているＯＡ添加によってアップレギュレートされた（Ａｊｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これらの結果は、ＨＬＯの硬化が線維症の重症度について定量化可能な測定値となり得、したがって線維症のハイスループットスクリーニングに潜在的に適用され得ることを示す。
ＡＦＭによる線維症のハイスループット定量
蓄積された証拠は、肝臓の硬化が肝線維症の重症度とよく相関していることを示し（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８）、それによりＨＬＯの硬化を測定することはＨＬＯの線維症の重症度を評価する可能性がある。平滑筋アクチン免疫染色の出願人の予備的定性分析は、ＯＡ曝露による用量依存性線維症進行を示す（図２、Ｈ、Ｉ、およびＪ）。スクリーニング可能なフォーマットにおいてより定量的な洞察を得るために、出願人はこのように、ＨＬＯ線維症が原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた微小押し込み（ｍｉｃｒｏ－ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて用量依存的に硬化を増大させることができるかどうかを生きた状態で評価した。図４のＡに示すように、各単一ＨＬＯの上部領域（２５×２５μｍ四方の１４×１４マトリックス）をＡＦＭカンチレバーで走査し、これは、ＨＬＯのトポグラフィー的および機械的情報の空間マッピングを提供することができる。単一ＨＬＯの計算されたヤング率（Ｅ、ｋＰａ）の代表的なヒストグラムは、明らかにガウス様分布を示し、そのピーク値および幅は、ＯＡ濃度に従って増加した（図４、Ｂ；０、２００、４００、８００μＭ）。ＨＬＯから決定されたヤング率は、箱ひげ図によるドットプロットによって要約され（図４、Ｃ）、これは、ＨＬＯの硬さが０から８００μＭ ＯＡまで徐々に上昇すること、すなわち中央値の緩やかなシフトおよび硬化範囲の拡大が、ＯＡ濃度の上昇に従って観察された。エメディアン値は、０、２００、４００、および８００μＭのＯＡ処理オルガノイドについて、それぞれ１．２ｋＰａ、１．６ｋＰａ、２．４ｋＰａ、および２．８ｋＰａであった。さらに、９０パーセンタイルと１０パーセンタイルとの間の差（ΔＰ９０－１０）は、未処理オルガノイドについては３．２ｋＰａであり、８００μＭ ＯＡ処理オルガノイドについては７．０ｋＰａであった。図３、Ｆが示すように、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－８もまた、ＮＡＦＬＤ患者における線維症の重症度と相関することが知られているＯＡ添加によってアップレギュレートされた（Ａｊｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これらの結果は、ＨＬＯの硬化が線維症の重症度について定量化可能な測定値となり得、したがって線維症のハイスループットスクリーニングに潜在的に適用され得ることを示す。
【0061】
ｃＨＬＯ硬さはウォルマン病の臨床表現型を再現する
多能性幹細胞由来の線維症および肝硬変に関するモデルの臨床的関連性は、患者における遺伝的影響の未確定の性質のために不明である。線維症の素因はおそらくこのモデルでは捉えられないであろう。したがって、出願人は、健常人（３１７Ｄ６）、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者（ＮＡＦＬＤ１５０、７７、および２７）およびウォルマン病患者（ＷＤ９０、９１、および９２）を含むｉＰＳＣ由来の先天性脂肪性肝炎患者を評価することによって臨床表現型に対するアッセイの忠実度を調べた（図５、Ａ）。具体的には、出願人は、致命的な脂肪性肝炎を伴う単一遺伝性疾患である３つのウォルマン病患者特異的ｉＰＳＣ株を確立し、特に臨床診断当時の酵素活性との顕著な相関を伴う正常ｉＰＳＣ株由来オルガノイドと比較して有意な硬さ増加を確認した（図５、Ｂ）。
多能性幹細胞由来の線維症および肝硬変に関するモデルの臨床的関連性は、患者における遺伝的影響の未確定の性質のために不明である。線維症の素因はおそらくこのモデルでは捉えられないであろう。したがって、出願人は、健常人（３１７Ｄ６）、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者（ＮＡＦＬＤ１５０、７７、および２７）およびウォルマン病患者（ＷＤ９０、９１、および９２）を含むｉＰＳＣ由来の先天性脂肪性肝炎患者を評価することによって臨床表現型に対するアッセイの忠実度を調べた（図５、Ａ）。具体的には、出願人は、致命的な脂肪性肝炎を伴う単一遺伝性疾患である３つのウォルマン病患者特異的ｉＰＳＣ株を確立し、特に臨床診断当時の酵素活性との顕著な相関を伴う正常ｉＰＳＣ株由来オルガノイドと比較して有意な硬さ増加を確認した（図５、Ｂ）。
【0062】
ｉＰＳＣ‐ｓＨＬＯを用いた脂肪症のヒト表現型変異のモデリング
第二に、出願人は脂肪性肝炎の進行に対する多遺伝子効果を評価するためにこの新しいオルガノイドモデルを拡張した。大規模なＧＷＡＳにより、肝臓トリグリセリド含有量（ＨＴＧＣ）の独立した決定因子であることが繰り返し示されている、３つのタンパク質コーディング配列変異体ＰＮＰＬＡ３（パタチン様ホスホリパーゼ３）ｐ．Ｉ１４８Ｍ、ＴＭ６ＳＦ２（膜貫通型６スーパーファミリーメンバー２）ｐ．Ｅ１６７Ｋ、およびＧＣＫＲ（グルコキナーゼ調節蛋白質）ｐ．Ｐ４４６Ｌ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（Ｚａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図６、Ａ）。したがって、出願人は大規模セルバンクにアプローチし、以下に示す、報告された効果の大きさβ（ＳＮＰ）（Ｓｔｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、加重投与量を乗算する標準化ＨＴＧＣおける対立遺伝子ごとの変化、の合計により、２５０４個の細胞株を多遺伝子スコア（図６、Ｂ）でマッピングした：Σ｛β（ＳＮＰ）×（リスク対立遺伝子の投与量）｝。３つの異なる閾値を有するｉＰＳＣ株の獲得後（図６、ＢおよびＣ）、出願人は７つのｉＰＳＣオルガノイドを生成し、そして表現型に対する多遺伝子性の影響を推定するために脂肪肝炎を誘発した。驚くべきことに、出願人は、「脂肪症」（ライブイメージングによる、図６、ＤおよびＥ）と「炎症」（ｑＲＴ－ＰＣＲ、図６、Ｆ）との顕著な相関関係を見出したが、「線維症」（ＡＦＭに基づく硬化測定、図６、Ｇ）については多遺伝子性スコアとの相関関係は見出せなかった。出願人はまた、細胞株間でＯＣＡ応答が異なり、ＯＣＡに対する応答はＳＮＰ数に依存することを見出した（図６Ｈ）。
第二に、出願人は脂肪性肝炎の進行に対する多遺伝子効果を評価するためにこの新しいオルガノイドモデルを拡張した。大規模なＧＷＡＳにより、肝臓トリグリセリド含有量（ＨＴＧＣ）の独立した決定因子であることが繰り返し示されている、３つのタンパク質コーディング配列変異体ＰＮＰＬＡ３（パタチン様ホスホリパーゼ３）ｐ．Ｉ１４８Ｍ、ＴＭ６ＳＦ２（膜貫通型６スーパーファミリーメンバー２）ｐ．Ｅ１６７Ｋ、およびＧＣＫＲ（グルコキナーゼ調節蛋白質）ｐ．Ｐ４４６Ｌ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（Ｚａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図６、Ａ）。したがって、出願人は大規模セルバンクにアプローチし、以下に示す、報告された効果の大きさβ（ＳＮＰ）（Ｓｔｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、加重投与量を乗算する標準化ＨＴＧＣおける対立遺伝子ごとの変化、の合計により、２５０４個の細胞株を多遺伝子スコア（図６、Ｂ）でマッピングした：Σ｛β（ＳＮＰ）×（リスク対立遺伝子の投与量）｝。３つの異なる閾値を有するｉＰＳＣ株の獲得後（図６、ＢおよびＣ）、出願人は７つのｉＰＳＣオルガノイドを生成し、そして表現型に対する多遺伝子性の影響を推定するために脂肪肝炎を誘発した。驚くべきことに、出願人は、「脂肪症」（ライブイメージングによる、図６、ＤおよびＥ）と「炎症」（ｑＲＴ－ＰＣＲ、図６、Ｆ）との顕著な相関関係を見出したが、「線維症」（ＡＦＭに基づく硬化測定、図６、Ｇ）については多遺伝子性スコアとの相関関係は見出せなかった。出願人はまた、細胞株間でＯＣＡ応答が異なり、ＯＣＡに対する応答はＳＮＰ数に依存することを見出した（図６Ｈ）。
【0063】
討論
ヒトＰＳＣからの多細胞肝臓オルガノイド
一連の最近の研究は、内皮細胞（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、間葉系細胞（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、および神経堤細胞（Ｗｏｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を実験的に組み合わせることによって支持系統の内胚葉由来オルガノイドへの統合の成功を報告した。ＲＡ脈動に基づく方法は、細胞を持続的な細胞極性で多様化するように自然に関与させ、そして合理的な費用で著しく再現性がありそして拡張性がある。支持系統の正確な性質が発生的に関連するものであるか肝臓特異的なものであるかにかかわらず、間質集団はＬＰＳおよび脂肪酸を含む既知の線維症誘発物質に対して完全に反応性であり、多細胞および複雑な病理学をモデル化するための新しい方法を開く。
ヒトＰＳＣからの多細胞肝臓オルガノイド
一連の最近の研究は、内皮細胞（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、間葉系細胞（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、および神経堤細胞（Ｗｏｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を実験的に組み合わせることによって支持系統の内胚葉由来オルガノイドへの統合の成功を報告した。ＲＡ脈動に基づく方法は、細胞を持続的な細胞極性で多様化するように自然に関与させ、そして合理的な費用で著しく再現性がありそして拡張性がある。支持系統の正確な性質が発生的に関連するものであるか肝臓特異的なものであるかにかかわらず、間質集団はＬＰＳおよび脂肪酸を含む既知の線維症誘発物質に対して完全に反応性であり、多細胞および複雑な病理学をモデル化するための新しい方法を開く。
【0064】
炎症と線維症を分析するための機械的オルガノイドスクリーニングの見込み
将来のスクリーニングの観点からは、単一のオルガノイドベースの肝臓測定は、その堅牢性、正規化、および比較的単純さのために非常に魅力的な読み出し情報である。例えば、オルガノイドのライブ蛍光イメージング分析に基づいて、嚢胞性線維症患者の腸オルガノイドについて機能的膨潤アッセイが確立され、効果的な薬物選択が実証された（Ｓａｉｎｉ，２０１６）。ｉＰＳＣからの単一の肝臓オルガノイドのライブ硬さ評価は、線維症の重症度を予測するための効果的な方法である。脂肪肝疾患患者では、肝臓の硬化の測定値と線維症の病期との間に有意な相関関係がエラストグラフィによって臨床的に報告されている（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。さらに、超音波検査で定義されたＮＡＦＬＤを有する対象のサブグループにおいて、肝臓の硬化の増加と真性糖尿病（ＤＭ）の存在および／またはより高いインスリン抵抗性との間の強い関連性が観察された（Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。興味深いことに、ヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）硬化は、炎症性サイトカイン産生および線維芽細胞増殖を伴って、ＬＰＳおよびＦＦＡの両方に比例して増加した。多数の上皮臓器線維症が多様な病理学的メカニズムを介して同様の表現型を共有することを考慮すると、オルガノイドに基づく硬さ検出アッセイは、肺、腎臓、心臓および腸オルガノイドを用いて線維症を分析するために使用できる。
将来のスクリーニングの観点からは、単一のオルガノイドベースの肝臓測定は、その堅牢性、正規化、および比較的単純さのために非常に魅力的な読み出し情報である。例えば、オルガノイドのライブ蛍光イメージング分析に基づいて、嚢胞性線維症患者の腸オルガノイドについて機能的膨潤アッセイが確立され、効果的な薬物選択が実証された（Ｓａｉｎｉ，２０１６）。ｉＰＳＣからの単一の肝臓オルガノイドのライブ硬さ評価は、線維症の重症度を予測するための効果的な方法である。脂肪肝疾患患者では、肝臓の硬化の測定値と線維症の病期との間に有意な相関関係がエラストグラフィによって臨床的に報告されている（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。さらに、超音波検査で定義されたＮＡＦＬＤを有する対象のサブグループにおいて、肝臓の硬化の増加と真性糖尿病（ＤＭ）の存在および／またはより高いインスリン抵抗性との間の強い関連性が観察された（Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。興味深いことに、ヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）硬化は、炎症性サイトカイン産生および線維芽細胞増殖を伴って、ＬＰＳおよびＦＦＡの両方に比例して増加した。多数の上皮臓器線維症が多様な病理学的メカニズムを介して同様の表現型を共有することを考慮すると、オルガノイドに基づく硬さ検出アッセイは、肺、腎臓、心臓および腸オルガノイドを用いて線維症を分析するために使用できる。
【0065】
肝臓オルガノイドでは、ハイコンテンツイメージングシステムを使用して複数の測定値を生体内にて評価することができる。事実、脂肪処理した肝臓オルガノイドでは、脂肪滴の数とサイズ、胆汁輸送活性、食細胞の増加、細胞形態の劣化を効果的にイメージできる。したがって、オルガノイドベースのアッセイプラットフォームを使用して、脂肪肝疾患のヒト特有のメカニズムをよりよく理解し、これらの疾患に対する創薬のためのハイコンテンツなスクリーニングを確立することができる。化合物ライブラリーおよび栄養代謝産物と組み合わせると、オルガノイドベースの機械的スクリーニングは、そうでなければ前臨床的に試験することができない、ヒトにおける有効な治療を意味するための非常に魅力的なモデル系であろう。
【0066】
栄養精密医学（治療の個別化）
患者特異的なｉＰＳＣ由来のオルガノイドは、個別化された薬効と上皮反応を予測するために使用されるかもしれない。ヒトｉＰＳＣは、健康な人と病気の人の両方から樹立することができる。集団ｉＰＳＣパネルの確立と並行して、患者のｉＰＳ細胞の使用は、脂肪毒性、薬効および安全性に関する個人間の差異をモデル化することが期待される（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。そうすることで、肝臓オルガノイドベースのプラットフォームを用いた表現型スクリーニングは、障害に対する非常に効果的な介入の個別選択を促進するだろう。例えば、栄養補給は個人に応じて変更され得るので、開示されたシステムは投与前に栄養関連状態を反映するための非常に適合性のあるアッセイであり得る。具体的には、肝脂肪症および線維症（ＰＮＡＬＤ）への起こり得る進行を最小限に抑える目的で、患者特異的ｉＰＳＣ由来オルガノイドを使用して、各患者に対してＰＮ製剤をカスタマイズすることができる。実際、診療所では、ＰＮ製剤はしばしばカスタマイズされており（Ｍｅｒｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、なぜなら、肥満で体液制限を必要とし、肝／腎機能障害を示すことが多い、重症患者のカロリー、アミノ酸、および電解質のニーズを市販の溶液は満たさないからである（Ｂｏｕｌｌａｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。栄養上の必要性を超えて、ＰＮ製品に関連して起こり得る悪影響の低減についての洞察を得ることが緊急の必要性である。したがって、肝臓オルガノイドは、特にＰＮＡＬＤリスク評価についての安全上の懸念を評価するのに有用であり、各患者に対するＰＮ製剤のカスタマイズ戦略を容易にする。
患者特異的なｉＰＳＣ由来のオルガノイドは、個別化された薬効と上皮反応を予測するために使用されるかもしれない。ヒトｉＰＳＣは、健康な人と病気の人の両方から樹立することができる。集団ｉＰＳＣパネルの確立と並行して、患者のｉＰＳ細胞の使用は、脂肪毒性、薬効および安全性に関する個人間の差異をモデル化することが期待される（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ａ、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ｂ）。そうすることで、肝臓オルガノイドベースのプラットフォームを用いた表現型スクリーニングは、障害に対する非常に効果的な介入の個別選択を促進するだろう。例えば、栄養補給は個人に応じて変更され得るので、開示されたシステムは投与前に栄養関連状態を反映するための非常に適合性のあるアッセイであり得る。具体的には、肝脂肪症および線維症（ＰＮＡＬＤ）への起こり得る進行を最小限に抑える目的で、患者特異的ｉＰＳＣ由来オルガノイドを使用して、各患者に対してＰＮ製剤をカスタマイズすることができる。実際、診療所では、ＰＮ製剤はしばしばカスタマイズされており（Ｍｅｒｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、なぜなら、肥満で体液制限を必要とし、肝／腎機能障害を示すことが多い、重症患者のカロリー、アミノ酸、および電解質のニーズを市販の溶液は満たさないからである（Ｂｏｕｌｌａｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。栄養上の必要性を超えて、ＰＮ製品に関連して起こり得る悪影響の低減についての洞察を得ることが緊急の必要性である。したがって、肝臓オルガノイドは、特にＰＮＡＬＤリスク評価についての安全上の懸念を評価するのに有用であり、各患者に対するＰＮ製剤のカスタマイズ戦略を容易にする。
【0067】
全体として、出願人は、４－Ｄオルガノイド培養において上皮系統と間質系統との間のクロストークを可能にすることが、肝臓の脂肪症および線維症に関連する臨床的に関連する病理をモデル化するのに有用であることを実証した。このモデルは最終的に、人口高齢化の高まりで懸念される、ＮＡＦＬＤやＮＡＳＨのようなより一般的な病理学の分析につながるであろう。より広くは、本出願人は、現在進化しているオルガノイド技術と相まって、人間的で複雑な病理学をモデル化するための実行可能な戦略を確立し（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４）、単一オルガノイドレベルで回復不可能な疾患に対する効果的な治療法を発見する新しい方法を切り開いた。
【0068】
方法
ｈＰＳＣ維持この研究で使用されたＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉの好意により提供された。ヒトｉＰＳＣ株を、以前に記載されたように維持した（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。５％ ＣＯ２、９５％空気中、１／３０希釈で３７℃のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）でコーティングしたプレート上で、未分化ｈｉＰＳＣをｍＴｅＳＲ１培地中でフィーダー不含条件下で維持した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）。
ｈＰＳＣ維持この研究で使用されたＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉの好意により提供された。ヒトｉＰＳＣ株を、以前に記載されたように維持した（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。５％ ＣＯ２、９５％空気中、１／３０希釈で３７℃のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）でコーティングしたプレート上で、未分化ｈｉＰＳＣをｍＴｅＳＲ１培地中でフィーダー不含条件下で維持した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）。
【0069】
胚体内胚葉誘導以前に記載された方法にわずかな修飾を加えて使用して、ヒトｉＰＳＣを胚体内胚葉に分化させた（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡単に説明すると、ヒトｉＰＳＣのコロニーをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）中で単離し、１５０，０００細胞／ｍＬをＭａｔｒｉｇｅｌコート組織培養プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に蒔いた。１日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）および５０ｎｇ／ｍＬの骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、２日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に、ならびに３日目には、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に、培地を交換した。４～６日目に、細胞を、５００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｕＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含有するＢ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を伴うアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）中で培養した。細胞を、９５％空気で５％ＣＯ２中、３７℃で維持し、培地は毎日交換した。分化の７日目にスフェロイドがプレート上に現れた。
【0070】
ＨＬＯ誘導７日目に、スフェロイドと付着細胞を静かにピペットで移してディッシュから剥がす。それらを８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後にＢ２７、Ｎ２および２μＭのレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２中のディッシュ上で１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴に包埋し、４日間培養する。ＲＡ処理後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴に包埋されたスフェロイドを、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＮＪ、ＵＳＡ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む肝細胞培養培地（ＨＣＭ；Ｌｏｎｚａ、ＭＤ、ＵＳＡ）で培養した。ＨＬＯ誘導のための培養物を９５％空気を含む５％ＣＯ２中で３７℃に維持し、培地を２～３日毎に交換した。ＨＬＯ（２０～３０日目）を分析するために、引っかきおよびピペッティングによってオルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから単離した。
【0071】
アルブミン、ＩＬ－６、およびＰ３ＮＰ ＥＬＩＳＡ。ＨＬＯのアルブミン分泌レベルを測定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋したＨＬＯから２００μＬの培養上清を回収した。ＩＬ－６およびＰ３ＮＰについては、２０～３０個のオルガノイドを超低接着マルチウェルプレート９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し培養した。各ウェルのオルガノイドの正確な数を規定し、最後にＩＬ－６とＰ３ＮＰの分泌レベルを数で正規化するために、オルガノイドをキーエンス（ＫＥＹＥＮＣＥ）ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡で捕獲した。培養上清を培養後２４時間（アルブミンの場合）、９６時間（ＩＬ－６の場合）および１２０時間（Ｐ３ＮＰ）の時点で集め、そして使用するまで－８０℃で保存した。上清を１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離して破片をペレットにし、得られた上清をＨｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ，ＵＳＡ）、およびＨｕｍａｎ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩＩ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＩＩＩＮＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｍｙ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造業者の説明書に従ってアッセイした。有意性検定はスチューデントのｔ検定によって行われた。
【0072】
胆汁輸送活性オルガノイド中の胆汁輸送活性を評価するためにフルオレセインジアセテートを使用した。１０ｍｇ／ｍＬフルオレセインジアセテート（Ｓｉｇｍａ）をＨＬＯと共に培養したＨＣＭ培地に添加し、５分間静置し、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス、大阪、日本）を使用して捕獲した。
【0073】
食細胞、脂質、ＲＯＳ生細胞イメージング。超低接着６マルチウェルプレートで培養した後、５～１０個のＨＬＯをピックアップし、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ ８ウェルガラスボトムプレート（Ｉｂｉｄｉ、ＷＩ、ＵＳＡ）に播種し、生細胞染色を行った。以下の抗体を使用した：食細胞活性のためのｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（登録商標）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、脂質のためのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、膜のためのＤｉ－８－ＡＮＥＰＰＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、およびＲＯＳ検出のためのＣｅｌｌＲＯＸ ｇｒｅｅｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）。核染色は、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によってマークされた。ｈＬＯＨＬＯを６０倍の水浸対物レンズを用いてニコンＡ１倒立共焦点顕微鏡（日本）で可視化し、走査した。最終的な脂肪滴量は、ＩＭＡＲＩＳ８によって計算され、各オルガノイドサイズによって正規化された。脂肪滴量およびＲＯＳ産生（％）についての有意性検定は、スチューデントのｔ検定によって行った。
【0074】
ＨＥ染色と免疫組織化学ＨＬＯをＭａｔｒｉｇｅｌから単離し、４％パラホルムアルデヒド中で固定しそしてパラフィン中に包埋した。切片をＨＥ染色および免疫組織化学染色にかけた。以下の一次抗体を使用した：抗アルファ平滑筋アクチン抗体（１：２００希釈；ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、Ｄｅｓｍｉｎ抗体（予備希釈されもの；Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＣＤ６８抗体（１：２００希釈、ａｂｃａｍ）。
【0075】
フローサイトメトリーＨＬＯを１０個のＭａｔｒｉｇｅｌ液滴から単離し、１×ＰＢＳで洗浄した。トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）、フェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ）の１０分間の処理によって、ＨＬＯを単細胞に解離させた。ＰＢＳ洗浄後、単細胞をＢＶ４２１結合Ｅｐｃａｍ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ結合ＣＤ１６６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＰＥ／Ｃｙ７－ＣＤ６８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてフローサイトメトリーに供した。ＤＮＡをヨウ化プロピジウム染色により測定した。
【0076】
ＬＰＳおよびＦＦＡへの曝露ならびにＯＣＡおよびＦＧＦ１９による処理Ｍａｔｒｉｇｅｌから単離し、１×ＰＢＳで洗浄した２０～３０個のＨＬＯを各条件に分け、超低接着６マルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。ＨＬＯをＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、ＯＡ（Ｓｉｇｍａ）、ＬＡ（Ｓｉｇｍａ）、ＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、またはＰＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に培養し、培養後１および３日目（ＬＰＳ ＨＬＯの場合）および３および５日目（ＯＡの場合）に収集した。ＨＬＯに対するＯＣＡ（ＩＮＴ－７４７、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびヒトＦＧＦ１９組換え体（Ｓｉｇｍａ）の阻害効果を試験するために、２０～３０個のＨＬＯをオレイン酸（８００μＭ）の存在下または非存在下にＨＣＭ培地で培養し、１μＭのＯＣＡおよび４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１９を８００μＭのＯＡ条件に添加した。ＨＬＯは、脂質生細胞イメージングのために３日目に集められ、そして硬化測定のために５日目に集められた。
【0077】
全組織標本免疫蛍光法。ＨＬＯを４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０で１５分間透過処理した。ＨＬＯを１×ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートした。次にＨＬＯを一次抗体、抗α平滑筋アクチン抗体（１：５０希釈；ａｂｃａｍ）と４℃で一晩インキュベートした。ＨＬＯを１×ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液中の二次抗体中、室温で３０分間インキュベートした。ＨＬＯを洗浄し、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ封入剤（ａｂｃａｍ）を用いてマウントした。染色されたＨＬＯを６０倍の水浸対物レンズを用いてニコンＡ１倒立共焦点顕微鏡（日本）で可視化し、走査した。
【0078】
ＲＮＡ単離、ＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを単離した。製造元のプロトコルに従ってＲＴ－ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて逆転写を行った。ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）上でＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。各標的遺伝子についての全てのプライマーおよびプローブ情報は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｑｐｃｒ．ｐｒｏｂｅｆｉｎｄｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｇａｎｉｓｍ．ｊｓｐ）から入手した。有意性検定はスチューデントのｔ検定によって行われた。
【0079】
ＡＦＭによるＨＬＯ硬化測定０、５０２００、１４００、２８００ｎｇ／ｍＬμＭのＬＰＳＯＡで処理したＨＬＯを、ＡＦＭ（ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ ＩＶ、ＪＰＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた硬化測定に使用した。窒化ケイ素カンチレバー（ＣＳＣ３７、ｋ＝０．３Ｎ／ｍ、ＭｉｋｒｏＭａｓｃｈ、Ｂｕｌｇａｒｉａ）を有するＡＦＭヘッドを、Ｚ軸ピエゾステージ（ＪＰＫ ＣｅｌｌＨｅｓｉｏｎモジュール、ＪＰＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と連結した蛍光立体顕微鏡（Ｍ２０５ ＦＡ、Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に取り付け、これにより約１００μｍの深度まで押込み測定が可能になる。オルガノイドの基質として、フィブロネクチンコーティング皿を使用した。組織培養皿（φ＝３４ｍｍ、ＴＰＰ Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を最初に１μｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、組織培養皿を蒸留水で２回洗浄し、１時間乾燥した。その後、５１日間ＯＡＬＰＳとインキュベートしたＨＬＯをフィブロネクチンコーティング皿に入れ、３７℃で１時間インキュベートした。次に試料皿をＡＦＭステージ上に置き、２５×２５μｍ四方の１４×１４マトリックスの力－距離曲線を各ＨＬＯから測定した。最後に、得られた力－距離曲線を修正Ｈｅｒｔｚモデル（Ｓｎｅｄｄｏｎ、１９６５）と適合させることによって、ＨＬＯのヤング率（Ｅ、Ｐａ）を求めた。有意性検定のためにＤｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆｅ検定を行った。
【0080】
ＴＨＰ－１細胞遊走アッセイ。Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉから寄贈されたＴＨＰ－１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）中で維持した。ＴＨＰ－１浮遊細胞を収集し、そして２００，０００個の細胞を、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）９６Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（５μｍ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｏｒｍａｔ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）の膜チャンバーに無血清Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２と共に添加した。１０～２０個のＨＬＯを、超低接着９６マルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて０、４００、８００μＭのＯＡを含むＨＣＭ培地中で３日間培養した。各ウェルのオルガノイドの正確な数を規定し、最後に最終的に遊走した細胞をその数で正規化するために、オルガノイドをキーエンスＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡で捕獲した。ＨＬＯの培養上清１５０μＬを収集し、キットのフィーダートレイに加えた。キットを５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。遊走した細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて計数した。有意性検定はスチューデントのｔ検定によって行われた。
【0081】
トリグリセリドアッセイトリグリセリドの定量的測定のために、ＨＬＯを１つのＭａｔｒｉｇｅｌ液滴から単離し、オレイン酸（８００μＭ）の存在下または非存在下でＨＣＭ培地に分けた。それらを、超低接着６マルチウェルプレート上で３日間培養した。肝臓トリグリセリド蓄積の定量的推定は、ＥｎｚｙＣｈｒｏｍ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いるトリグリセリド質量の酵素アッセイによって実施した。
【0082】
ＨＬＯ生存アッセイＨＬＯをＭａｔｒｉｇｅｌから収集し、１×ＰＢＳで洗浄した。３０～４０個のオルガノイドを、超低接着６マルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。ＨＬＯは毎日キーエンスＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡で捕獲した。生き残った、そして死んだオルガノイドを写真から手動で数えた。丸みを帯びた形状を有するＨＬＯは生存しているものとして数えが、形状が異なるオルガノイドは死んだものとして数えた。同じ時点でＯＡ処理ＨＬＯの生存率を評価するために、３Ｄセルタイターグローアッセイ（３Ｄ ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ ａｓｓａｙ）を使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉ、ＵＳＡ）。
【0083】
統計と再現性対応のない両側スチューデントのｔ検定、Ｄｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆｅ検定、またはＷｅｌｃｈのｔ検定を使用して統計分析を行った。結果は平均±標準誤差で示した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。特に明記しない限り、Ｎ値は生物学的に独立した複製を指す。
【0084】
参考文献
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Ｄａｓｈ，Ａ．，Ｆｉｇｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍａｒｕｋｉａｎ，Ｓ．，Ｃｏｌｌａｄｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏａｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｃｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｎｋａ，Ｄ．，Ｃｏｌｅ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ－ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ３９，９３－１０３．
Ｅｌ Ｋａｓｍｉ，Ｋ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，Ｍ．Ｗ．，Ｖｕｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．，Ｋａｒｐｅｎ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｏｋｏｌ，Ｒ．Ｊ．（２０１３）．Ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，２０６ｒａ１３７．
Ｅｌ Ｔａｇｈｄｏｕｉｎｉ，Ａ．，Ｎａｊｉｍｉ，Ｍ．，Ｓａｎｃｈｏ－Ｂｒｕ，Ｐ．，Ｓｏｋａｌ，Ｅ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｇｒｕｎｓｖｅｎ，Ｌ．Ａ．（２０１５）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ８，１４．
Ｇｅｅｒｔｓ，Ａ．，Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｎｉｋｉ，Ｔ．，Ｗｉｅｌａｎｔ，Ａ．，Ｖａｅｙｅｎｓ，Ｆ．，ａｎｄ Ｐｅｋｎｙ，Ｍ．（２００１）．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｄｅｓｍｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｖｉｍｅｎｔｉｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３，１７７－１８８．
Ｈａｓｓａｎ，Ｗ．，Ｒｏｎｇｙｉｎ，Ｇ．，Ｄａｏｕｄ，Ａ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｈａｎｇ，Ｊ．（２０１４）．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ ｉｎ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ ２０１４，３１３６０２．
Ｈｙｎｄｓ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ Ｇｉａｎｇｒｅｃｏ，Ａ．（２０１３）．Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ：ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，４１７－４２２．
Ｉｊｐｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｐｅｒｅｚ－Ｐｏｍａｒｅｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕａｄｉｘ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｍｏｎａ，Ｒ．，Ｐｏｒｔｉｌｌｏ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｖ．，Ｍａｃｉａｓ，Ｄ．，Ｈｏｈｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｍｉｌｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｓｔｉｅ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ－Ｃｈａｐｕｌｉ，Ｒ．（２００７）．Ｗｔ１ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３１２，１５７－１７０．
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Ｎａｎｄｉｖａｄａ，Ｐ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｉ．，Ｃｏｗａｎ，Ｅ．，Ｇｕｒａ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ Ｐｕｄｅｒ，Ｍ．（２０１３）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｎｕｔｒ ４，７１１－７１７．
Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｇａｉ，Ｙ．，Ａｓａｏｋａ，Ｙ．，Ｏｈｎｏ，Ｍ．，Ｎａｍａｅ，Ｍ．，Ｍｉｔａｎｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，Ｔｅｒａｉ，Ｓ．，Ｓａｋａｉｄａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｗｎｔ２ｂｂ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｅｄａｋａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１，１０３７－１０４５．
Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ－Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．，Ｌｏｏｍｂａ，Ｒ．，Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．，Ｌａｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｖａｎ Ｎａｔｔａ，Ｍ．Ｌ．，Ａｂｄｅｌｍａｌｅｋ，Ｍ．Ｆ．，Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．，Ｄａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｍｅｅｄ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ，ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ （ＦＬＩＮＴ）：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８５，９５６－９６５．
Ｏｒｓｏ，Ｇ．，Ｍａｎｄａｔｏ，Ｃ．，Ｖｅｒｏｐａｌｕｍｂｏ，Ｃ．，Ｃｅｃｃｈｉ，Ｎ．，Ｇａｒｚｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｖａｊｒｏ，Ｐ．（２０１６）．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ：Ｎｏｖｅｌ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８，２１５－２２２．
Ｐｕｒｔｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．（２０００）．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ９５，４７０－４７７．
Ｒｏｎｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．，Ｍｏｒａｇｈｅｂｉ，Ｒ．，Ｃｈａｖｅｓ，Ｐ．，Ｓａｘｅｎａ，Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｎ．Ｂ．（２０１５）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４，２６９－２８１．
Ｓａｉｎｉ，Ａ．（２０１６）．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ Ｍｉｎｉ Ｇｕｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９，４２５－４２７．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ ４７０，１０５－１０９．
Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．，Ｈｏｒｎｂｒｕｃｈ，Ａ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｅ，Ｖ．Ｅ．（２００４）．Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１４，４３２－４４１．
Ｓｔｅｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｚｌｉｔｉｎａ，Ｊ．，Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．，Ｔｙｂｊａｅｒｇ－Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．，Ｈｏｂｂｓ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．（２０１７）．Ａｄｉｐｏｓｉｔｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｉｓｋ ｏｆ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｃｉ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４９，８４２－８４７．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｅ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｕｅｎｏ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｏｙｏｈａｒａ，Ｔ．，Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｏｒｇａｎ Ｂｕｄｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｖｉａ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １６，５５６－５６５．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｇａｅｒｉ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｕｅｎｏ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４９９，４８１－４８４．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｅ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｎ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９，３９６－４０９．
Ｔｓｅｄｅｎｓｏｄｎｏｍ，Ｏ．，ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｋ．Ｃ．（２０１３）．ＲＯＳ：ｒｅｄｕｘ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘ ｉｎ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５８，１２１０－１２１２．
ｖａｎ ｄｅ Ｇａｒｄｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｏｖｉｔａ，Ｄ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅ，Ｍ．，Ｈｅｒｓｃｈｋｅ，Ｆ．，Ｄｅ Ｊｏｎｇｈｅ，Ｓ．，Ｇａｍａ，Ｌ．，Ｂｏｏｎｓｔｒａ，Ａ．，ａｎｄ Ｖａｎｗｏｌｌｅｇｈｅｍ，Ｔ．（２０１６）．Ｌｉｖｅｒ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｋｕｐｆｆｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｍａｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｕｒｉｎｇ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１，ｅ０１６６０９４．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓａｎｇ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏ，Ｗ．（２０１３）．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ，ｌｉｖｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２８ Ｓｕｐｐｌ １，１１２－１１５．
Ｗａｒｒｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｊａｑｕｉｓｈ，Ｃ．Ｅ．，ａｎｄ Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．（２０１７ａ）．Ｔｈｅ ＮｅｘｔＧｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：Ａ Ｆｏｒａｙ ｉｎｔｏ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，４３１－４３３．
Ｗａｒｒｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｐ．，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｍｏｒｎｉｎｇｓｔａｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｃｈｏｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７ｂ）．Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷＡＳ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，５４７－５５７ ｅ５４７．
Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｔｒｉｓｎｏ，Ｓ．，Ｐｏｌｉｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｆ．，Ｓｃｈｉｅｓｓｅｒ，Ｊ．，Ａｕｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３，４９－５９．
Ｘｕ，Ｒ．，Ｔａｏ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｇ．（２０１５）．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３ ｇｅｎｅ （ＰＮＰＬＡ３） ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ＨｕＧＥ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，９２８４．
Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｎｉｗａ，Ａ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｈｏｎｄａ－Ｏｚａｋｉ，Ｆ．，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｊ．，Ｔｏｍｉｄａ，Ｓ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｓｅｒｕｍ－ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ５９２４３．
Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｍａｗａｔａｒｉ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．，Ｅｎｄｏ，Ｈ．，Ｉｉｄａ，Ｈ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｙ．，Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｋ．，Ｈｉｇｕｒａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ （ＮＡＦＬＤ）．Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４０，３７１－３７８．
Ｚａｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｚ．，ａｎｄ Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｒ．（２０１５）．Ｃｏｍｍｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｒｓ７８００９４ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ３０，２１－２７．
Ｚａｍｂｒａｎｏ，Ｅ．，Ｅｌ－Ｈｅｎｎａｗｙ，Ｍ．，Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ，Ｒ．Ａ．，Ｚｅｌｔｅｒｍａｎ，Ｄ．，ａｎｄ Ｒｅｙｅｓ－Ｍｕｇｉｃａ，Ｍ．（２００４）．Ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ ａｕｔｏｐｓｙ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ２４ ｎｅｗｂｏｒｎ ｃａｓｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ７，４２５－４３２．
Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５，２２１－２５１．
Ａｊｍｅｒａ，Ｖ．，Ｐｅｒｉｔｏ，Ｅ．Ｒ．，Ｂａｓｓ，Ｎ．Ｍ．，Ｔｅｒｒａｕｌｔ，Ｎ．Ａ．，Ｙａｔｅｓ，Ｋ．Ｐ．，Ｇｉｌｌ，Ｒ．，Ｌｏｏｍｂａ，Ｒ．，Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．，Ａｏｕｉｚｅｒａｔ，Ｂ．Ｅ．，ａｎｄ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｎ．Ｃ．Ｒ．（２０１７）．Ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６５，６５－７７．
Ｂａｈａｒ Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｋ．，Ｓｈｅｎｈａｖ，Ｒ．，Ｍａｔｃｏｖｉｔｃｈ－Ｎａｔａｎ，Ｏ．，Ｔｏｔｈ，Ｂ．，Ｌｅｍｚｅ，Ｄ．，Ｇｏｌａｎ，Ｍ．，Ｍａｓｓａｓａ，Ｅ．Ｅ．，Ｂａｙｄａｔｃｈ，Ｓ．，Ｌａｎｄｅｎ，Ｓ．，Ｍｏｏｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｌｏｂａｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏｕｒ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｉｖｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５４２，３５２－３５６．
Ｂｏｕｌｌａｔａ，Ｊ．Ｉ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｋ．，Ｓａｃｋｓ，Ｇ．，Ｌａｂｏｓｓｉｅｒｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｒｉｌｌ，Ｃ．，Ｇｏｄａｙ，Ｐ．，Ｋｕｍｐｆ，Ｖ．Ｊ．，Ｍａｔｔｏｘ，Ｔ．Ｗ．，Ｐｌｏｇｓｔｅｄ，Ｓ．，Ｈｏｌｃｏｍｂｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａ．Ｓ．Ｐ．Ｅ．Ｎ．ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｒｄｅｒｉｎｇ，ｏｒｄｅｒ ｒｅｖｉｅｗ，ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ，ｌａｂｅｌｉｎｇ，ａｎｄ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ．ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ ３８，３３４－３７７．
Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｐａｎ，Ｆ．Ｃ．，Ｂｒａｎｄｅｓ，Ｎ．，Ａｆｅｌｉｋ，Ｓ．，Ｓｏｌｔｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｐｉｅｌｅｒ，Ｔ．（２００４）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｅｎｓｅ ｏｆ ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２７１，１４４－１６０．
Ｄａｓｈ，Ａ．，Ｆｉｇｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍａｒｕｋｉａｎ，Ｓ．，Ｃｏｌｌａｄｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏａｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｃｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｎｋａ，Ｄ．，Ｃｏｌｅ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ－ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ３９，９３－１０３．
Ｅｌ Ｋａｓｍｉ，Ｋ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，Ｍ．Ｗ．，Ｖｕｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．，Ｋａｒｐｅｎ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｏｋｏｌ，Ｒ．Ｊ．（２０１３）．Ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，２０６ｒａ１３７．
Ｅｌ Ｔａｇｈｄｏｕｉｎｉ，Ａ．，Ｎａｊｉｍｉ，Ｍ．，Ｓａｎｃｈｏ－Ｂｒｕ，Ｐ．，Ｓｏｋａｌ，Ｅ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｇｒｕｎｓｖｅｎ，Ｌ．Ａ．（２０１５）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ８，１４．
Ｇｅｅｒｔｓ，Ａ．，Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｃ．，Ｎｉｋｉ，Ｔ．，Ｗｉｅｌａｎｔ，Ａ．，Ｖａｅｙｅｎｓ，Ｆ．，ａｎｄ Ｐｅｋｎｙ，Ｍ．（２００１）．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｄｅｓｍｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｖｉｍｅｎｔｉｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３，１７７－１８８．
Ｈａｓｓａｎ，Ｗ．，Ｒｏｎｇｙｉｎ，Ｇ．，Ｄａｏｕｄ，Ａ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｈａｎｇ，Ｊ．（２０１４）．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ ｉｎ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ ２０１４，３１３６０２．
Ｈｙｎｄｓ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ Ｇｉａｎｇｒｅｃｏ，Ａ．（２０１３）．Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ：ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，４１７－４２２．
Ｉｊｐｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｐｅｒｅｚ－Ｐｏｍａｒｅｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕａｄｉｘ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｒｍｏｎａ，Ｒ．，Ｐｏｒｔｉｌｌｏ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｖ．，Ｍａｃｉａｓ，Ｄ．，Ｈｏｈｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｍｉｌｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｓｔｉｅ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ－Ｃｈａｐｕｌｉ，Ｒ．（２００７）．Ｗｔ１ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３１２，１５７－１７０．
Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｓａｋｕｍａ，Ｓ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｒａｉ，Ｆ．（２０１６）．Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＨＵＶＥＣ／ＭＳＣ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｆｏｒｃｅ Ｓｅｎｓｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ－Ｂａｓｅｌ ７．
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Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｌｏｍｐｅｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｄａｒｗｉｓｈ Ｍｕｒａｄ，Ｓ．，Ｔａｉｍｒ，Ｐ．，Ｌｅｅｂｅｅｋ，Ｆ．Ｗ．，Ｈｏｆｍａｎ，Ａ．，Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，Ｂ．Ｈ．，Ｃａｓｔｅｒａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｎｄ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｉｎ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ ｓｔｕｄｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６３，１３８－１４７．
Ｋｏｒｄｅｓ，Ｃ．，Ｓａｗｉｔｚａ，Ｉ．，Ｇｏｔｚｅ，Ｓ．，Ｈｅｒｅｂｉａｎ，Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｕｓｓｉｎｇｅｒ，Ｄ．（２０１４）．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４，５５０３－５５１５．
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Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｊ．Ａ．（２０１４）．Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｄｉｓｈ：ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１２４７１２５．
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ａｉｈａｒａ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｒｏｄａ，Ｔ．，Ｔｒｅｇｕｉｅｒ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１７）．Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｕｎｄｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４１，１８２－１８７．
Ｍｅｒｃａｌｄｉ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ Ｔｕｒｐｉｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｈｏｓｐｉｔａｌ－ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｍｉｘｅｄ ｍｕｌｔｉｃｈａｍｂｅｒ ｂａｇｓ ｉｎ ａ ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｃｌａｉｍｓ ｄａｔａｂａｓｅ．ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ ３６，３３０－３３６．
Ｎａｎｄｉｖａｄａ，Ｐ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｉ．，Ｃｏｗａｎ，Ｅ．，Ｇｕｒａ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ Ｐｕｄｅｒ，Ｍ．（２０１３）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｎｕｔｒ ４，７１１－７１７．
Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｇａｉ，Ｙ．，Ａｓａｏｋａ，Ｙ．，Ｏｈｎｏ，Ｍ．，Ｎａｍａｅ，Ｍ．，Ｍｉｔａｎｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，Ｔｅｒａｉ，Ｓ．，Ｓａｋａｉｄａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｗｎｔ２ｂｂ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｅｄａｋａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１，１０３７－１０４５．
Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ－Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．，Ｌｏｏｍｂａ，Ｒ．，Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．，Ｌａｖｉｎｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｖａｎ Ｎａｔｔａ，Ｍ．Ｌ．，Ａｂｄｅｌｍａｌｅｋ，Ｍ．Ｆ．，Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．，Ｄａｓａｒａｔｈｙ，Ｓ．，Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｍｅｅｄ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ，ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ （ＦＬＩＮＴ）：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８５，９５６－９６５．
Ｏｒｓｏ，Ｇ．，Ｍａｎｄａｔｏ，Ｃ．，Ｖｅｒｏｐａｌｕｍｂｏ，Ｃ．，Ｃｅｃｃｈｉ，Ｎ．，Ｇａｒｚｉ，Ａ．，ａｎｄ Ｖａｊｒｏ，Ｐ．（２０１６）．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ：Ｎｏｖｅｌ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８，２１５－２２２．
Ｐｕｒｔｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．（２０００）．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ９５，４７０－４７７．
Ｒｏｎｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｕｉｂｅｎｔｉｆ，Ｃ．，Ｍｏｒａｇｈｅｂｉ，Ｒ．，Ｃｈａｖｅｓ，Ｐ．，Ｓａｘｅｎａ，Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｎ．Ｂ．（２０１５）．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４，２６９－２８１．
Ｓａｉｎｉ，Ａ．（２０１６）．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ Ｍｉｎｉ Ｇｕｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９，４２５－４２７．
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｌａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．Ｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ ４７０，１０５－１０９．
Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．，Ｈｏｒｎｂｒｕｃｈ，Ａ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ Ｐｒｉｎｃｅ，Ｖ．Ｅ．（２００４）．Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ ２１４，４３２－４４１．
Ｓｔｅｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｋｏｚｌｉｔｉｎａ，Ｊ．，Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．，Ｔｙｂｊａｅｒｇ－Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．，Ｈｏｂｂｓ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．（２０１７）．Ａｄｉｐｏｓｉｔｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｉｓｋ ｏｆ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｃｉ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４９，８４２－８４７．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｅ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｕｅｎｏ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｔｏｙｏｈａｒａ，Ｔ．，Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｏｒｇａｎ Ｂｕｄｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｖｉａ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １６，５５６－５６５．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｇａｅｒｉ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｕｅｎｏ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４９９，４８１－４８４．
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｅ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｎ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９，３９６－４０９．
Ｔｓｅｄｅｎｓｏｄｎｏｍ，Ｏ．，ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｋ．Ｃ．（２０１３）．ＲＯＳ：ｒｅｄｕｘ ａｎｄ ｐａｒａｄｏｘ ｉｎ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５８，１２１０－１２１２．
ｖａｎ ｄｅ Ｇａｒｄｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｏｖｉｔａ，Ｄ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｄｅ，Ｍ．，Ｈｅｒｓｃｈｋｅ，Ｆ．，Ｄｅ Ｊｏｎｇｈｅ，Ｓ．，Ｇａｍａ，Ｌ．，Ｂｏｏｎｓｔｒａ，Ａ．，ａｎｄ Ｖａｎｗｏｌｌｅｇｈｅｍ，Ｔ．（２０１６）．Ｌｉｖｅｒ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｋｕｐｆｆｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｍａｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｕｒｉｎｇ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１，ｅ０１６６０９４．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓａｎｇ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏ，Ｗ．（２０１３）．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ，ｌｉｖｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２８ Ｓｕｐｐｌ １，１１２－１１５．
Ｗａｒｒｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｊａｑｕｉｓｈ，Ｃ．Ｅ．，ａｎｄ Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．（２０１７ａ）．Ｔｈｅ ＮｅｘｔＧｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：Ａ Ｆｏｒａｙ ｉｎｔｏ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，４３１－４３３．
Ｗａｒｒｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｍ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｐ．，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｍｏｒｎｉｎｇｓｔａｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｃｈｏｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７ｂ）．Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＷＡＳ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，５４７－５５７ ｅ５４７．
Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｔｒｉｓｎｏ，Ｓ．，Ｐｏｌｉｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｆ．，Ｓｃｈｉｅｓｓｅｒ，Ｊ．，Ａｕｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３，４９－５９．
Ｘｕ，Ｒ．，Ｔａｏ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｇ．（２０１５）．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３ ｇｅｎｅ （ＰＮＰＬＡ３） ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ＨｕＧＥ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，９２８４．
Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｎｉｗａ，Ａ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，Ｈｏｎｄａ－Ｏｚａｋｉ，Ｆ．，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｊ．，Ｔｏｍｉｄａ，Ｓ．，Ｏｓｈｉｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｓｅｒｕｍ－ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ５９２４３．
Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｍａｗａｔａｒｉ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．，Ｅｎｄｏ，Ｈ．，Ｉｉｄａ，Ｈ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｙ．，Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｋ．，Ｈｉｇｕｒａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ （ＮＡＦＬＤ）．Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４０，３７１－３７８．
Ｚａｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｚ．，ａｎｄ Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｒ．（２０１５）．Ｃｏｍｍｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｒｓ７８００９４ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ３０，２１－２７．
Ｚａｍｂｒａｎｏ，Ｅ．，Ｅｌ－Ｈｅｎｎａｗｙ，Ｍ．，Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ，Ｒ．Ａ．，Ｚｅｌｔｅｒｍａｎ，Ｄ．，ａｎｄ Ｒｅｙｅｓ－Ｍｕｇｉｃａ，Ｍ．（２００４）．Ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ａｎ ａｕｔｏｐｓｙ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ２４ ｎｅｗｂｏｒｎ ｃａｓｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ７，４２５－４３２．
Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５，２２１－２５１．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝臓オルガノイドを遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物と接触させるステップを含み、前記ＦＦＡ組成物がオレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、またはそれらの組み合わせ、好ましくはオレイン酸を含む、脂肪毒性オルガノイドモデルの作製方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0004】
ヒトの肝臓は、脂質代謝、アンモニウムおよび胆汁産生、凝固、ならびに外因性化合物の解毒など、生命に不可欠な多くの代謝機能を提供する重要な臓器である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術を使用して、患者の肝反応のインビトロ再構成は、再生療法、創薬、および薬物毒性研究を含む多数の有望な用途により、製薬業界にとって魅力的である。この目的のために、現在、従来のインビトロアプローチは、肝細胞を生成するために二次元（２－Ｄ）および３－Ｄ分化プラットフォームを研究している。しかしながら、報告された方法のほとんどは細胞を主に標的上皮細胞型に分化させ、線維化促進性および／または炎症性細胞型などの必須の支持成分を完全に欠いている。あるいは、出願人らは、上皮系列と支持系列を混合することによる共培養ベースのアプローチを提案したが、これらのアッセイは非常に可変的であり、上皮細胞培地（ＥＣＭ）およびそれらを同時に維持することができる培地を選択することの困難性などの多くの人為的な変化によってしばしば混乱させられる。したがって、支持系統を疾患モデル化およびさらなるスクリーニング適用のために共同開発する、新しくて頑強なアッセイシステムの確立の必要性がある。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 国際公開第２０１５／１８５７１４号
（非特許文献）
（非特許文献１） Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．"Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｎｏｎ ａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｌｉｖｅｒ－ｏｎ－ａ－Ｃｈｉｐ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ"，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（７）：ｅ０１５９７２９． Ｄｏｉ１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５９７２９，Ｊｕｌｙ ２０，２０１６．
（非特許文献２） Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．"Ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐａｌｍｉｔｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ"，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（２），１０３：１１０，Ｊｕｎｅ ２０１１．
（非特許文献３） Ｎａｎｄｉｖａｄａ ｅｔ ａｌ．"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ"，Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．４：７１１－７１７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３．
（非特許文献４） Ｃａｂｅｚａｓ ｅｔ ａｌ．"Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｖｉｅｗ"，Ｎｏｂｕｍｉ Ｔａｇａｙａ，ＩＳＢＮ ９７８－９５３－５１－０８５３－５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２１，２０１２．
（非特許文献５） Ｋｒｕｉｔｗａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ａｄｕｌｔ Ｆｅｌｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ" Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ．８，ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ １，２０１７．
（非特許文献６） Ｋｒｕｉｔｗａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ２６ｔｈ ＥＣＶＩＭ－ＣＡ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ－２０１６０９０８ ｔｏ ２０１６０９１－ＳＣＨ－Ｏ－５ ＬＯＮＧ－ＴＥＲＭ ＡＤＵＬＴ ＦＥＬＩＮＥ ＬＩＶＥＲ ＯＲＧＡＮＯＩＤ ＣＵＬＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＨＥＰＡＴＩＣ ＬＩＰＩＤＯＳＩＳ"， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ．３１，ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１７
（非特許文献７） Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．"Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １，２００８．
（非特許文献８） Ｎａｎｔａｓａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．"Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ： Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ａｒｅ ａ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ：Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．３．Ｊａｎｕａｒｙ ２１，２０１６．
（非特許文献９） Ｒｉｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｌｅｉｃ ａｎｄ ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，ｎｏ．５，Ｍａｙ １，２００９．
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 国際公開第２０１５／１８５７１４号
（非特許文献）
（非特許文献１） Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．"Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｎｏｎ ａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｌｉｖｅｒ－ｏｎ－ａ－Ｃｈｉｐ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ"，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（７）：ｅ０１５９７２９． Ｄｏｉ１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５９７２９，Ｊｕｌｙ ２０，２０１６．
（非特許文献２） Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．"Ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐａｌｍｉｔｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ"，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（２），１０３：１１０，Ｊｕｎｅ ２０１１．
（非特許文献３） Ｎａｎｄｉｖａｄａ ｅｔ ａｌ．"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ"，Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．４：７１１－７１７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３．
（非特許文献４） Ｃａｂｅｚａｓ ｅｔ ａｌ．"Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｖｉｅｗ"，Ｎｏｂｕｍｉ Ｔａｇａｙａ，ＩＳＢＮ ９７８－９５３－５１－０８５３－５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２１，２０１２．
（非特許文献５） Ｋｒｕｉｔｗａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ａｄｕｌｔ Ｆｅｌｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ" Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ．８，ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ １，２０１７．
（非特許文献６） Ｋｒｕｉｔｗａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ２６ｔｈ ＥＣＶＩＭ－ＣＡ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ－２０１６０９０８ ｔｏ ２０１６０９１－ＳＣＨ－Ｏ－５ ＬＯＮＧ－ＴＥＲＭ ＡＤＵＬＴ ＦＥＬＩＮＥ ＬＩＶＥＲ ＯＲＧＡＮＯＩＤ ＣＵＬＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ＭＯＤＥＬＬＩＮＧ ＯＦ ＨＥＰＡＴＩＣ ＬＩＰＩＤＯＳＩＳ"， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ．３１，ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１７
（非特許文献７） Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．"Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １，２００８．
（非特許文献８） Ｎａｎｔａｓａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．"Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ： Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ａｒｅ ａ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ：Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．３．Ｊａｎｕａｒｙ ２１，２０１６．
（非特許文献９） Ｒｉｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｌｅｉｃ ａｎｄ ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ" Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，ｎｏ．５，Ｍａｙ １，２００９．
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