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特開2023-85503補体依存性細胞溶解のエフェクター機能の調節のための修飾されたヒトＩｇＭ定常領域
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023085503
(43)【公開日】2023-06-20
(54)【発明の名称】補体依存性細胞溶解のエフェクター機能の調節のための修飾されたヒトＩｇＭ定常領域
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230613BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230613BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230613BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230613BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230613BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230613BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230613BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/00 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023062508
(22)【出願日】2023-04-07
(62)【分割の表示】P 2019554816の分割
【原出願日】2018-04-06
(31)【優先権主張番号】62/483,087
(32)【優先日】2017-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】517252624
【氏名又は名称】アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】バリガ ラメッシュ
(72)【発明者】
【氏名】エング ディーン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】補体固定及び結果として生じる補体依存性細胞障害（ＣＤＣ活性）を減らし得るまたは排除し得るＩｇＭ重鎖定常領域を提供する。
【解決手段】野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて１つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域であって、少なくとも１つのアミノ酸置換が、特定の配列からなるアミノ酸配列のＴ３０２からＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域である。
【選択図】なし
【解決手段】野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて１つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域であって、少なくとも１つのアミノ酸置換が、特定の配列からなるアミノ酸配列のＴ３０２からＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて１つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域であって、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項2】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｔ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２に存在する、請求項１に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項3】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、請求項２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項4】
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位に存在する、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０が、アラニン（Ｌ３１０Ａ）、セリン（Ｌ３１０Ｓ）、アスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）、またはグリシン（Ｌ３１０Ｇ）で置換されている、請求項４に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項6】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０がアラニン（Ｌ３１０Ａ）で置換されている、請求項５に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項7】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５を含む、請求項６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項8】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０がアスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）で置換されている、請求項５に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項9】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む、請求項８に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項10】
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位に存在する、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項11】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１が、アラニン（Ｐ３１１Ａ）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）で置換されている、請求項１０に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項12】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１がアラニン（Ｐ３１１Ａ）で置換されている、請求項１１に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項13】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む、請求項１２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項14】
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位に存在する、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項15】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３が、アラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）で置換されている、請求項１４に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項16】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３がセリン（Ｐ３１３Ｓ）で置換されている、請求項１５に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項17】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む、請求項１６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項18】
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位に存在する、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項19】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５が、アラニン（Ｋ３１５Ａ）、セリン（Ｋ３１５Ｓ）、アスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）、グルタミン（Ｋ３１５Ｑ）、またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）で置換されている、請求項１８に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項20】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５がアラニン（Ｋ３１５Ａ）で置換されている、請求項１９に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項21】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を含む、請求項２０に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項22】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５がアスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）で置換されている、請求項１９に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項23】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む、請求項２２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項24】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５がグルタミン（Ｋ３１５Ｑ）で置換されている、請求項１９に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項25】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５を含む、請求項２４に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項26】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位及びＰ３１３位においてアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項27】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１がアラニン（Ｐ３１１Ａ）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３がアラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）で置換されている、請求項２６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項28】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１がアラニン（Ｐ３１１Ａ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３がセリン（Ｐ３１３Ｓ）で置換されている、請求項２７に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項29】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含む、請求項２８に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項30】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ３１０がアラニン（Ｌ３１０Ａ）またはセリン（Ｌ３１０Ｓ）で置換されており且つＫ３１５がアラニン（Ｋ３１５Ａ）またはセリン（Ｋ３１５Ｓ）で置換されている、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項31】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含む、請求項３０に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項32】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＰ３１１位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ３１０がアラニン（Ｌ３１０Ａ）で置換されており且つＰ３１１がアラニン（Ｐ３１１Ａ）で置換されている、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項33】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む、請求項３２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項34】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＰ３１３位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ３１０がアラニン（Ｌ３１０Ａ）で置換されており且つＰ３１３がセリン（Ｐ３１３Ｓ）で置換されている、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項35】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む、請求項３４に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項36】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ３１１がアラニン（Ｐ３１１Ａ）で置換されており且つＫ３１５がアラニン（Ｋ３１５Ａ）で置換されている、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項37】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む、請求項３６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項38】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ３１３がセリン（Ｐ３１３Ｓ）で置換されており且つＫ３１５がアラニン（Ｋ３１５Ａ）で置換されている、請求項３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項39】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む、請求項３８に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項40】
前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体によって用量反応アッセイ法において達成される最大のＣＤＣ活性が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少する、請求項１～３９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項41】
５０％ＣＤＣ活性（ＥＣ５０）をもたらす、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の抗体濃度が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、及び少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加する、請求項１～３９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
【請求項42】
請求項１～４１のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域と、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、標的抗原に特異的に結合し、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項43】
５つまたは６つの二価ＩｇＭ結合単位をそれぞれ含む五量体抗体または六量体抗体であり、各結合単位が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれが含む２本のＩｇＭ重鎖と、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれが含む２本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項４２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項44】
五量体であり且つＪ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをさらに含む、請求項４３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項45】
Ｊ鎖またはその断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸２３～１５８またはその機能的断片またはその機能的バリアントを含む、請求項４４に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項46】
前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに直接または間接的に融合されている、請求項４４または請求項４５に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項47】
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片に融合されている、請求項４６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項48】
前記ペプチドリンカーが、少なくとも５個のアミノ酸であるが２５個を超えないアミノ酸を含む、請求項４７に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項49】
前記ペプチドリンカーが
から成る、請求項４８に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項50】
前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に、または、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端とＣ末端の双方に融合されている、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項51】
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項４６～５０のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項52】
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片である、請求項５１に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項53】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５２に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項54】
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、請求項５３に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項55】
前記異種ポリペプチドがＣＤ３εに特異的に結合することができる、請求項５１～５４のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項56】
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（Ｖ１５Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（Ｊ１５Ｖ）を含む、請求項５５に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項57】
前記修飾されたＪ鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項５６に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項58】
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（Ｖ１５Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（Ｊ１５Ｖ）を含む、請求項５７に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項59】
前記標的抗原を発現している細胞のＴ細胞媒介殺滅を指示することができ、前記Ｔ細胞媒介殺滅が、前記修飾されたＩｇＭ定常領域を除いては前記修飾されたヒトＩｇＭ抗体と同一である対応するＩｇＭ抗体のものと同等である、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項60】
前記標的抗原を発現している細胞が真核細胞である、請求項４２～５９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
【請求項61】
請求項１～４０のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードする核酸配列または請求項４２～５９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項62】
請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項63】
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項64】
前記軽鎖ポリペプチドサブユニットが、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項65】
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが別々のベクター上に存在する、請求項６３または請求項６４に記載の組成物。
【請求項66】
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが単一のベクター上に存在する、請求項６３または請求項６４に記載の組成物。
【請求項67】
Ｊ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、請求項６２～６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項68】
前記Ｊ鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片に直接または間接的に融合されている、請求項６７に記載の組成物。
【請求項69】
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とが、単一のベクター上に存在する、請求項６７または請求項６８に記載の組成物。
【請求項70】
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とがそれぞれ、別々のベクター上に存在する、請求項６７または請求項６８に記載の組成物。
【請求項71】
請求項６６または請求項６９に記載のベクター。
【請求項72】
請求項６５または請求項７０に記載のベクター。
【請求項73】
請求項６１に記載のポリヌクレオチド、請求項６２～７０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７１もしくは請求項７２に記載のベクターを含み、請求項１～４０のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域、または請求項４２～５９のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体、またはその機能的断片を発現することができる、宿主細胞。
【請求項74】
請求項７３に記載の宿主細胞を培養すること、及び請求項１～４０のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域または請求項４２～６０のいずれか１項に記載の修飾されたヒトＩｇＭ抗体を回収することを含む、前記定常領域または前記抗体を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１７年４月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４８３，０８７号の利益を主張する。
本出願は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１７年４月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４８３，０８７号の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
補体依存性細胞障害は、自然免疫系の成分を働かせて侵入微生物を破壊するために抗体が利用するエフェクター機能である。治療用抗体は補体系を働かせて、抗体が標的とする細胞、たとえば、腫瘍細胞を攻撃するために補体系を利用することができる。補体のカスケードは、ＩｇＧのＦｃ領域またはＩｇＭのＦｃ Ｍｕ領域への第１成分Ｃ１ｑの結合に端を発する。抗体の六量体化は、下流の補体成分をさらに始動させて膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成させることとなる六量体Ｃ１ｑ複合体の形成を生じ、この膜侵襲複合体は細胞膜の穿孔及び結果として生じる浸透圧ショックによって細胞死を引き起こす。ＩｇＭアイソタイプの抗体は多量体（五量体及び六量体）であり、Ｃ１ｑの結合及び多量体化に特によく適している。実際、ＩｇＭ抗体は対応するＩｇＧ抗体よりも３０～１００倍良好に補体を固定することができる。
補体依存性細胞障害は、自然免疫系の成分を働かせて侵入微生物を破壊するために抗体が利用するエフェクター機能である。治療用抗体は補体系を働かせて、抗体が標的とする細胞、たとえば、腫瘍細胞を攻撃するために補体系を利用することができる。補体のカスケードは、ＩｇＧのＦｃ領域またはＩｇＭのＦｃ Ｍｕ領域への第１成分Ｃ１ｑの結合に端を発する。抗体の六量体化は、下流の補体成分をさらに始動させて膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成させることとなる六量体Ｃ１ｑ複合体の形成を生じ、この膜侵襲複合体は細胞膜の穿孔及び結果として生じる浸透圧ショックによって細胞死を引き起こす。ＩｇＭアイソタイプの抗体は多量体（五量体及び六量体）であり、Ｃ１ｑの結合及び多量体化に特によく適している。実際、ＩｇＭ抗体は対応するＩｇＧ抗体よりも３０～１００倍良好に補体を固定することができる。
【0003】
ＩｇＭ抗体を用いて細胞表面の受容体を多量体化して下流のシグナル伝達に影響を与える適応については、しかしながら、この強力な補体固定能を保持することが常に望ましいとは限らない。たとえば、ＩｇＭ抗体は、ＣＤ４０、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲのようなＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを働かせることによってＴ細胞を活性化するのに使用されてもよい。いずれの場合にも、多量体化が動かす下流のシグナル伝達を用いてＴ細胞の強力なアゴニスト活性及び増殖を引き起こすことができる。しかしながら、ＩｇＭ抗体の補体固定活性がインタクトのままであれば、これらの標的上ではそれはＩｇＭ抗体のアゴニスト活性に潜在的に対抗し得る。このような訳で、補体固定及び結果として生じる補体依存性細胞障害（ＣＤＣ活性）を減らし得るまたは排除し得るＩｇＭ重鎖定常領域の突然変異を同定するニーズが当該技術にある。
【0004】
マウスＩｇＭにおけるＣＤＣ活性を高めるまたは低下させる突然変異は同定されている。たとえば、Ａｒｙａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１２０６－１２１２（１９９４）（非特許文献１）、Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１１２２１－１１２２６（１９８８）（非特許文献２）、及びＷｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０５０６－１０５１３（１９８９）（非特許文献３）を参照のこと。改変されたＣＤＣ活性を持つ修飾されたヒトＩｇＭ抗体を同定及び特徴決定するニーズが当該技術で残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ａｒｙａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１２０６－１２１２（１９９４）
【非特許文献2】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１１２２１－１１２２６（１９８８）
【非特許文献3】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０５０６－１０５１３（１９８９）
【発明の概要】
【0006】
概要
本開示は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて１つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を提供し、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体は、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体に比べて、標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す。
本開示は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて１つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を提供し、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２に及ぶＣμ３ドメイン中のある位置に存在し、且つ、修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体は、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体に比べて、標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す。
【0007】
特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、少なくとも１つのアミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｔ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２に存在することを含む。たとえば、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位、またはそれらの任意の組み合わせに存在する少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことができる。
【0008】
特定の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位に存在することができ、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０はアラニン（Ｌ３１０Ａ）、セリン（Ｌ３１０Ｓ）、アスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）、またはグリシン（Ｌ３１０Ｇ）によって置換することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０はアラニン（Ｌ３１０Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５を含むことができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０はアスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含むことができる。
【0009】
特定の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位に存在することができ、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）によって置換することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むことができる。
【0010】
特定の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位に存在することができ、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３はアラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）によって置換することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３はセリン（Ｐ３１３Ｓ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含むことができる。
【0011】
特定の態様では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位に存在することができ、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５はアラニン（Ｋ３１５Ａ）、セリン（Ｋ３１５Ｓ）、アスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）、グルタミン（Ｋ３１５Ｑ）またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）によって置換することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５はアラニン（Ｋ３１５Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を含むことができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５はアスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含むことができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５はグルタミン（Ｋ３１５Ｑ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５を含むことができる。
【0012】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は２つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位、Ｐ３１１位、Ｐ３１３位、またはＫ３１５位の２つ以上でアミノ酸置換を含むことができる。
【0013】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位及びＰ３１３位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）によって置換することができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３はアラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）によって置換することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）によって置換することができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３はセリン（Ｐ３１３Ｓ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むことができる。
【0014】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、Ｌ３１０はアラニン（Ｌ３１０Ａ）またはセリン（Ｌ３１０Ｓ）によって置換することができ、Ｋ３１５はアラニン（Ｋ３１５Ａ）またはセリン（Ｋ３１５Ｓ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含むことができる。
【0015】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＰ３１１位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、Ｌ３１０はアラニン（Ｌ３１０Ａ）によって置換することができ、Ｐ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含むことができる。
【0016】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位及びＰ３１３位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、Ｌ３１０はアラニン（Ｌ３１０Ａ）によって置換することができ、Ｐ３１３はセリン（Ｐ３１３Ｓ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含むことができる。
【0017】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、Ｐ３１１はアラニン（Ｐ３１１Ａ）によって置換することができ、Ｋ３１５はアラニン（Ｋ３１５Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含むことができる。
【0018】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位及びＫ３１５位においてアミノ酸置換を含むことができる。たとえば、Ｐ３１３はセリン（Ｐ３１３Ｓ）によって置換することができ、Ｋ３１５はアラニン（Ｋ３１５Ａ）によって置換することができ、たとえば、修飾されたＩｇＭ定常領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含むことができる。
【0019】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体によって用量反応アッセイにおいて達成される最大のＣＤＣ活性は、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少する。
【0020】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の５０％ＣＤＣ活性（ＥＣ５０）をもたらす抗体濃度は、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加する。
【0021】
本開示はさらに、修飾されたヒトＩｇＭ抗体を提供し、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含み、且つ修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、標的抗原に特異的に結合し、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す。特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、５つまたは６つの二価のＩｇＭ結合単位をそれぞれ含む五量体抗体または六量体抗体であることができ、各結合単位は、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれが含む２つのＩｇＭ重鎖と、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれが含む２つの免疫グロブリン軽鎖とを含む。特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをさらに含む五量体であることができる。特定の態様では、Ｊ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸２３～１５８またはその機能的断片またはその機能的バリアントを含むことができる。特定の態様では、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントは、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であることができ、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに直接または間接的に融合される。特定の態様では、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＪ鎖またはその断片に融合することができ、たとえば、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸であるが２５個を超えないアミノ酸を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーは
を含むことができるか、それから本質的に成ることができるか、またはそれから成ることができる。特定の態様では、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に、または、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の双方に融合されることができる。特定の態様では、異種ポリペプチドには、結合ドメイン、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、たとえば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。特定の態様では、修飾されたＪ鎖にはｓｃＦｖ断片を挙げることができる。特定の態様では、異種ポリペプチドはＣＤ３εに特異的に結合することができる。特定の態様では、修飾されたＪ鎖には、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（Ｖ１５Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（Ｊ１５Ｖ）を挙げることができる。特定の態様では、修飾されたＪ鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができ、たとえば、修飾されたＪ鎖にはアミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（Ｖ１５Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（Ｊ１５Ｖ）を挙げることができる。特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、修飾されたＩｇＭ定常領域を除いては修飾されたＩｇＭ抗体と同一である対応するＩｇＭ抗体の活性レベルと同等の活性レベルで、標的抗原を発現している細胞のＴ細胞媒介殺滅を指示することができる。特定の態様では、標的抗原を発現している細胞は真核細胞である。
【0022】
本開示はさらに、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードする核酸配列または本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。提供されるのはまた、提供されているポリヌクレオチドを含む組成物である。特定の態様では、組成物はさらに、軽鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列を含む。特定の態様では、軽鎖ポリペプチドのサブユニットは、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む。特定の態様では、重鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と軽鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列とは、別々のベクター上に存在することができる。特定の態様では、重鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と軽鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列とは単一のベクター上に存在することができる。特定の態様では、組成物はさらに、Ｊ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む。特定の態様では、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントは、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、異種ポリペプチドはＪ鎖またはその断片に直接または間接的に融合される。特定の態様では、重鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と、軽鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と、Ｊ鎖をコードする核酸配列とは単一ベクター上に存在することができる。特定の態様では、重鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と、軽鎖ポリペプチドのサブユニットをコードする核酸配列と、Ｊ鎖をコードする核酸配列とはそれぞれ別々のベクター上に存在することができる。そのような１つのベクターまたは複数のベクターはすべて本開示によってさらに提供される。本開示はさらに、提供されているポリヌクレオチド、組成物、１つのベクター、または複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の態様では、宿主細胞は、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域、または本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体、またはその任意の機能的断片を発現することができる。本開示はさらに、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域、または本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体を作製する方法を提供し、方法は、提供されている宿主細胞を培養すること、および定常領域または抗体を回収することを含む。
[本発明1001]
野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて1つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域であって、
少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＴ302からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ322に及ぶＣμ3ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1002]
前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のアミノ酸Ｔ302、Ｃ303、Ｔ304、Ｖ305、Ｔ306、Ｈ307、Ｔ308、Ｄ309、Ｌ310、Ｐ311、Ｓ312、Ｐ313、Ｌ314、Ｋ315、Ｑ316、Ｔ317、Ｉ318、Ｓ319、Ｒ320、Ｐ321、及び／またはＫ322に存在する、本発明1001の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1003]
前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315位、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、本発明1002の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1004]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1005]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310が、アラニン（Ｌ310Ａ）、セリン（Ｌ310Ｓ）、アスパラギン酸（Ｌ310Ｄ）、またはグリシン（Ｌ310Ｇ）で置換されている、本発明1004の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1006]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されている、本発明1005の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1007]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：15を含む、本発明1006の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1008]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310がアスパラギン酸（Ｌ310Ｄ）で置換されている、本発明1005の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1009]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む、本発明1008の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1010]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1011]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311が、アラニン（Ｐ311Ａ）、セリン（Ｐ311Ｓ）、またはグリシン（Ｐ311Ｇ）で置換されている、本発明1010の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1012]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されている、本発明1011の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1013]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2を含む、本発明1012の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1014]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1015]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313が、アラニン（Ｐ313Ａ）、セリン（Ｐ313Ｓ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1014の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1016]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1015の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1017]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3を含む、本発明1016の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1018]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1019]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315が、アラニン（Ｋ315Ａ）、セリン（Ｋ315Ｓ）、アスパラギン酸（Ｋ315Ｄ）、グルタミン（Ｋ315Ｑ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1018の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1020]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1021]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16を含む、本発明1020の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1022]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がアスパラギン酸（Ｋ315Ｄ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1023]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む、本発明1022の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1024]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がグルタミン（Ｋ315Ｑ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1025]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：25を含む、本発明1024の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1026]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位及びＰ313位においてアミノ酸置換を含む、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1027]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）、セリン（Ｐ311Ｓ）、またはグリシン（Ｐ311Ｇ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がアラニン（Ｐ313Ａ）、セリン（Ｐ313Ｓ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1026の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1028]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1027の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1029]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4を含む、本発明1028の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1030]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）またはセリン（Ｌ310Ｓ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）またはセリン（Ｋ315Ｓ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1031]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：17またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：18を含む、本発明1030の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1032]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＰ311位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されており且つＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1033]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む、本発明1032の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1034]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＰ313位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されており且つＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1035]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む、本発明1034の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1036]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1037]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む、本発明1036の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1038]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1039]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む、本発明1038の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1040]
前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体によって用量反応アッセイ法において達成される最大のＣＤＣ活性が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または100％減少する、本発明1001～1039のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1041]
50％ＣＤＣ活性（ＥＣ50）をもたらす、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の抗体濃度が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、及び少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍増加する、本発明1001～1039のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1042]
本発明1001～1041のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域と、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、標的抗原に特異的に結合し、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1043]
5つまたは6つの二価ＩｇＭ結合単位をそれぞれ含む五量体抗体または六量体抗体であり、各結合単位が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれが含む2本のＩｇＭ重鎖と、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれが含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本発明1042の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1044]
五量体であり且つＪ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをさらに含む、本発明1043の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1045]
Ｊ鎖またはその断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7のアミノ酸23～158またはその機能的断片またはその機能的バリアントを含む、本発明1044の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1046]
前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに直接または間接的に融合されている、本発明1044または本発明1045の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1047]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片に融合されている、本発明1046の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1048]
前記ペプチドリンカーが、少なくとも5個のアミノ酸であるが25個を超えないアミノ酸を含む、本発明1047の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1049]
前記ペプチドリンカーが
から成る、本発明1048の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1050]
前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に、または、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端とＣ末端の双方に融合されている、本発明1046～1049のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1051]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1046～1050のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1052]
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片である、本発明1051の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1053]
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1052の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1054]
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、本発明1053の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1055]
前記異種ポリペプチドがＣＤ3εに特異的に結合することができる、本発明1051～1054のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1056]
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9（Ｖ15Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11（Ｊ15Ｖ）を含む、本発明1055の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1057]
前記修飾されたＪ鎖がシグナルペプチドをさらに含む、本発明1056の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1058]
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8（Ｖ15Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10（Ｊ15Ｖ）を含む、本発明1057の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1059]
前記標的抗原を発現している細胞のＴ細胞媒介殺滅を指示することができ、前記Ｔ細胞媒介殺滅が、前記修飾されたＩｇＭ定常領域を除いては前記修飾されたヒトＩｇＭ抗体と同一である対応するＩｇＭ抗体のものと同等である、本発明1055～1058のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1060]
前記標的抗原を発現している細胞が真核細胞である、本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1061]
本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードする核酸配列または本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1062]
本発明1061のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1063]
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
前記軽鎖ポリペプチドサブユニットが、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1063の組成物。
[本発明1065]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが別々のベクター上に存在する、本発明1063または本発明1064の組成物。
[本発明1066]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが単一のベクター上に存在する、本発明1063または本発明1064の組成物。
[本発明1067]
Ｊ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1062～1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
前記Ｊ鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片に直接または間接的に融合されている、本発明1067の組成物。
[本発明1069]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とが、単一のベクター上に存在する、本発明1067または本発明1068の組成物。
[本発明1070]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とがそれぞれ、別々のベクター上に存在する、本発明1067または本発明1068の組成物。
[本発明1071]
本発明1066または本発明1069のベクター。
[本発明1072]
本発明1065または本発明1070のベクター。
[本発明1073]
本発明1061のポリヌクレオチド、本発明1062～1070のいずれかの組成物、または本発明1071もしくは本発明1072のベクターを含み、本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域、または本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体、またはその機能的断片を発現することができる、宿主細胞。
[本発明1074]
本発明1073の宿主細胞を培養すること、及び本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域または本発明1042～1060のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体を回収することを含む、前記定常領域または前記抗体を作製する方法。
[本発明1001]
野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて1つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域であって、
少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＴ302からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ322に及ぶＣμ3ドメイン中のある位置に存在し、且つ、前記修飾されたＩｇＭ定常領域と標的抗原に特異的な重鎖可変領域とを含む修飾されたＩｇＭ抗体が、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて、前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1002]
前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のアミノ酸Ｔ302、Ｃ303、Ｔ304、Ｖ305、Ｔ306、Ｈ307、Ｔ308、Ｄ309、Ｌ310、Ｐ311、Ｓ312、Ｐ313、Ｌ314、Ｋ315、Ｑ316、Ｔ317、Ｉ318、Ｓ319、Ｒ320、Ｐ321、及び／またはＫ322に存在する、本発明1001の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1003]
前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315位、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、本発明1002の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1004]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1005]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310が、アラニン（Ｌ310Ａ）、セリン（Ｌ310Ｓ）、アスパラギン酸（Ｌ310Ｄ）、またはグリシン（Ｌ310Ｇ）で置換されている、本発明1004の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1006]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されている、本発明1005の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1007]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：15を含む、本発明1006の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1008]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310がアスパラギン酸（Ｌ310Ｄ）で置換されている、本発明1005の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1009]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む、本発明1008の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1010]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1011]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311が、アラニン（Ｐ311Ａ）、セリン（Ｐ311Ｓ）、またはグリシン（Ｐ311Ｇ）で置換されている、本発明1010の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1012]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されている、本発明1011の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1013]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2を含む、本発明1012の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1014]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1015]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313が、アラニン（Ｐ313Ａ）、セリン（Ｐ313Ｓ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1014の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1016]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1015の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1017]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3を含む、本発明1016の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1018]
前記アミノ酸置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315位に存在する、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1019]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315が、アラニン（Ｋ315Ａ）、セリン（Ｋ315Ｓ）、アスパラギン酸（Ｋ315Ｄ）、グルタミン（Ｋ315Ｑ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1018の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1020]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1021]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16を含む、本発明1020の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1022]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がアスパラギン酸（Ｋ315Ｄ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1023]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む、本発明1022の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1024]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＫ315がグルタミン（Ｋ315Ｑ）で置換されている、本発明1019の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1025]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：25を含む、本発明1024の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1026]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位及びＰ313位においてアミノ酸置換を含む、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1027]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）、セリン（Ｐ311Ｓ）、またはグリシン（Ｐ311Ｇ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がアラニン（Ｐ313Ａ）、セリン（Ｐ313Ｓ）、またはグリシン（Ｐ313Ｇ）で置換されている、本発明1026の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1028]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されており、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1027の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1029]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4を含む、本発明1028の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1030]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）またはセリン（Ｌ310Ｓ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）またはセリン（Ｋ315Ｓ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1031]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：17またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：18を含む、本発明1030の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1032]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＰ311位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されており且つＰ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1033]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む、本発明1032の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1034]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＬ310位及びＰ313位においてアミノ酸置換を含み、Ｌ310がアラニン（Ｌ310Ａ）で置換されており且つＰ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1035]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む、本発明1034の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1036]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ311位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ311がアラニン（Ｐ311Ａ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1037]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む、本発明1036の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1038]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1のＰ313位及びＫ315位においてアミノ酸置換を含み、Ｐ313がセリン（Ｐ313Ｓ）で置換されており且つＫ315がアラニン（Ｋ315Ａ）で置換されている、本発明1003の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1039]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む、本発明1038の修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1040]
前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体によって用量反応アッセイ法において達成される最大のＣＤＣ活性が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または100％減少する、本発明1001～1039のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1041]
50％ＣＤＣ活性（ＥＣ50）をもたらす、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の抗体濃度が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、及び少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍増加する、本発明1001～1039のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域。
[本発明1042]
本発明1001～1041のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域と、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、標的抗原に特異的に結合し、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて前記標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少を示す、修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1043]
5つまたは6つの二価ＩｇＭ結合単位をそれぞれ含む五量体抗体または六量体抗体であり、各結合単位が、前記修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれが含む2本のＩｇＭ重鎖と、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれが含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本発明1042の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1044]
五量体であり且つＪ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをさらに含む、本発明1043の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1045]
Ｊ鎖またはその断片が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7のアミノ酸23～158またはその機能的断片またはその機能的バリアントを含む、本発明1044の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1046]
前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントが、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに直接または間接的に融合されている、本発明1044または本発明1045の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1047]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片に融合されている、本発明1046の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1048]
前記ペプチドリンカーが、少なくとも5個のアミノ酸であるが25個を超えないアミノ酸を含む、本発明1047の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1049]
前記ペプチドリンカーが
[本発明1050]
前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に、または、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端とＣ末端の双方に融合されている、本発明1046～1049のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1051]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1046～1050のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1052]
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片である、本発明1051の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1053]
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1052の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1054]
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、本発明1053の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1055]
前記異種ポリペプチドがＣＤ3εに特異的に結合することができる、本発明1051～1054のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1056]
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9（Ｖ15Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11（Ｊ15Ｖ）を含む、本発明1055の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1057]
前記修飾されたＪ鎖がシグナルペプチドをさらに含む、本発明1056の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1058]
前記修飾されたＪ鎖が、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8（Ｖ15Ｊ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10（Ｊ15Ｖ）を含む、本発明1057の修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1059]
前記標的抗原を発現している細胞のＴ細胞媒介殺滅を指示することができ、前記Ｔ細胞媒介殺滅が、前記修飾されたＩｇＭ定常領域を除いては前記修飾されたヒトＩｇＭ抗体と同一である対応するＩｇＭ抗体のものと同等である、本発明1055～1058のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1060]
前記標的抗原を発現している細胞が真核細胞である、本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体。
[本発明1061]
本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードする核酸配列または本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体の重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1062]
本発明1061のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1063]
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
前記軽鎖ポリペプチドサブユニットが、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1063の組成物。
[本発明1065]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが別々のベクター上に存在する、本発明1063または本発明1064の組成物。
[本発明1066]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列とが単一のベクター上に存在する、本発明1063または本発明1064の組成物。
[本発明1067]
Ｊ鎖またはその機能的断片またはその機能的バリアントをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1062～1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
前記Ｊ鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む修飾されたＪ鎖であり、前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片に直接または間接的に融合されている、本発明1067の組成物。
[本発明1069]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とが、単一のベクター上に存在する、本発明1067または本発明1068の組成物。
[本発明1070]
前記重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と前記Ｊ鎖をコードする核酸配列とがそれぞれ、別々のベクター上に存在する、本発明1067または本発明1068の組成物。
[本発明1071]
本発明1066または本発明1069のベクター。
[本発明1072]
本発明1065または本発明1070のベクター。
[本発明1073]
本発明1061のポリヌクレオチド、本発明1062～1070のいずれかの組成物、または本発明1071もしくは本発明1072のベクターを含み、本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域、または本発明1042～1059のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体、またはその機能的断片を発現することができる、宿主細胞。
[本発明1074]
本発明1073の宿主細胞を培養すること、及び本発明1001～1040のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ定常領域または本発明1042～1060のいずれかの修飾されたヒトＩｇＭ抗体を回収することを含む、前記定常領域または前記抗体を作製する方法。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】五量体及び六量体の集合体を示すための非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル泳動を示す図である。対照、ＩｇＭ（純粋）、ＩｇＭ＋Ｊ（純粋）、及びＩｇＭ、及びＩｇＭ変異体Ｓ２８３Ｎ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１１Ａ、及びＤ２９４Ｇの上清調製物（すべてＪ鎖なし）についてのゲルのパターンを示す。
【図2】（１）補体の非存在下で調べた対照の抗ＣＤ２０抗体（１．５．３ ＩｇＧ及び１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ）、（２）補体の存在下で調べた対照のＩｇＭ（Ｊ鎖を持たない１．５．３ ＩｇＭ）、ならびに（３）補体の存在下で調べ、すべてＪ鎖を持たない、対応する１．５．３ ＩｇＭ変異体、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｄ２９４Ｇ、及びＳ２８３Ｎについての補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）活性のパーセントを示す図である。
【図3】対照の１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ抗体ならびに対応する１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ変異体Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｄ２９４Ｇ、及びＳ２８３Ｎを含む、抗ＣＤ３で修飾されたＪ鎖を伴う抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３二重特異性ＩｇＭ抗体についてのＣＤＣ活性のパーセントを示す図である。
【図4】抗ＣＤ３で修飾されたＪ鎖を欠く対照の抗ＣＤ２０ ＩｇＭ、ならびに対照抗体１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、及び対応する１．５．３×Ｖ１５Ｊ ＩｇＭ変異体、Ｄ２９４Ｇ、Ｓ２８３Ｎ、Ｐ３１３Ｓ、及びＰ３１１Ａを含む、抗ＣＤ３で修飾されたＪ鎖（Ｖ１５Ｊ）を含有する二重特異性ＩｇＭ抗体についてのＴ細胞活性化アッセイ法を示す図である。
【図5】１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、ならびに対応する１．５．３×Ｖ１５Ｊ ＩｇＭ変異体、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、及び二重変異体Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３Ｓについてのハイブリッドゲル及び還元ゲルを示す図である。二重変異体は、単一変異体のそれぞれと同様に発現し、会合する。
【図6】１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、ならびに対応する１．５．３×Ｖ１５Ｊ ＩｇＭ変異体、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、及び二重変異体Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３ＳについてのＣＤＣ活性を示す図である。二重変異体はＣＤＣ活性の完全な消失を示している。
【図7】１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、ならびに対応する１．５．３×Ｖ１５Ｊ ＩｇＭ変異体、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、及び二重変異体Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３ＳについてのＴ細胞活性化アッセイ法を示す図である。二重変異体は、単一変異体のそれぞれと同様にＴ細胞を活性化するのに効果的である。
【図8】Ｊ鎖を伴わない１．５．３ ＩｇＭ、１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、対応する１．５．３×Ｖ１５Ｊ ＩｇＭ変異体、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｌ３１０Ａ、Ｋ３１５Ａ及び二重変異体Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３ＳについてのＣＤＣ活性を示す図である。二重変異体はＣＤＣ活性の完全な消去を示している。
【発明を実施するための形態】
【0024】
詳細な説明
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の実体はその実体の１つ以上を指し、たとえば、「結合分子」は１つ以上の結合分子を表すと理解される。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は本明細書では相互交換可能に使用することができる。
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の実体はその実体の１つ以上を指し、たとえば、「結合分子」は１つ以上の結合分子を表すと理解される。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は本明細書では相互交換可能に使用することができる。
【0025】
さらに、「及び／または」は本明細書で使用される場合、他のものの有無にかかわらず、２つの特定された特徴または成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。従って、用語「及び／または」は、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用されるとき、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に用語「及び／または」は、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような語句で使用されるとき、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図される。
【0026】
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本開示が関連する当該技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。たとえば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは本開示で使用されている多数の用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【0027】
単位、接頭辞、及び記号は、その国際単位系（ＳＩ）で承認された形態で示される。数的な範囲は範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列はアミノ方向からカルボキシ方向に左から右に記述する。本明細書で提供される見出しは本開示の種々の態様または態様の限定ではなく、それは全体が本明細書を参照することによって有され得る。従って、直下で定義されている用語は全体が本明細書を参照することによってさらに完全に定義される。
【0028】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含するように意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）で構成された分子を指す。用語「ポリペプチド」は２つ以上のアミノ酸の1つの鎖または複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」またはアミノ酸の1つの鎖または２つ以上のアミノ酸の複数の鎖を指すのに使用される他の用語は「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」はこれらの用語の代わりに、またはこれらの用語と相互交換可能に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すようにも意図される。ポリペプチドは、生物学的起源に由来することができ、または組換え法によって製造することができるが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。それは化学合成によるものを含めて任意の方法で生成することができる。
【0029】
本明細書で開示されているようなポリペプチドは約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであることができる。ポリペプチドは必ずしも定義された三次元構造を有さないが、そのような構造を有することができる。定義された三次元構造を持つポリペプチドを折り畳まれたと呼び、定義された三次元構造を持たないが、むしろ、多数の異なる立体構造に適応することができるポリペプチドを折り畳まれないと呼ぶ。本明細書で使用されるとき、糖タンパク質という用語はアミノ酸、たとえば、セリンまたはアスパラギンのようなアミノ酸の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に連結される少なくとも１つの糖質部分に結合されたタンパク質を指す。
【0030】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体によって、その自然環境にはないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要とされない。たとえば、単離されたポリペプチドはそのネイティブの環境または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現される組換えで産生させたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技法によって分離されているか、分画されているか、または部分的にもしくは実質的に精製されているネイティブのまたは組換えのポリペプチドであるため、本明細書で開示されているように単離されたと見なされる。
【0031】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しないポリペプチド」またはそのあらゆる文法的変形は、裁判官または行政機関または裁判機関によって「天然に存在する」と判定されるもしくは解釈されるまたは判定されてもよいもしくは解釈されてもよいポリペプチドの形態を明白に排除するが、排除するにすぎない条件付き定義である。
【0032】
本明細書で開示されている他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、及びそれらの任意の組み合わせである。本明細書で開示されているような用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」、及び「類似体」には、対応するネイティブの抗体またはポリペプチドの特性の少なくとも一部、たとえば、抗原に特異的に結合することを保持する任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、たとえば、本明細書の他のどこかで考察されている特異的な抗体断片に加えて、欠失断片と同様にタンパク分解断片が挙げられる。たとえば、ポリペプチドのバリアントには、上記に記載されているような断片、及びアミノ酸の置換、欠失、または挿入のせいで変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドも挙げられる。特定の態様では、バリアントは天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは当該技術で既知の変異誘発法を用いて作製することができる。バリアントポリペプチドは、保存的なまたは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元々のポリペプチドで見いだされない追加の特徴を示すように変えられているポリペプチドである。例には融合タンパク質が挙げられる。バリアントポリペプチドは本明細書では「ポリペプチド類似体」とも呼ぶことができる。本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」は機能的な側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上のアミノ酸を有する主題のポリペプチドを指すこともできる。「誘導体」として挙げられるのはまた、２０種類の標準アミノ酸の１つ以上の誘導体を含有するペプチドである。たとえば、プロリンの代わりに４－ヒドロキシプロリンを使用することができ、リシンの代わりに５－ヒドロキシリシンを使用することができ、ヒスチジンの代わりに３－メチルヒスチジンを使用することができ、セリンの代わりにホモセリンを使用することができ、リシンの代わりにオルニチンを使用することができる。
【0033】
「保存的なアミノ酸置換」は１つのアミノ酸が類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて当該技術で定義されている。たとえば、チロシンに代わるフェニルアラニンの置換は保存的な置換である。特定の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列中の保存的な置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、結合分子が結合する抗原への結合を無効にすることはない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当該技術で周知である（たとえば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１，１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：．４１２－４１７（１９９７）を参照のこと）。
【0034】
用語「ポリヌクレオチド」は複数形の核酸と同様に単数形の核酸を包含するように意図され、単離された核酸分子または核酸構築物、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは従来のホスホジエステル結合または従来ではない結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見いだされるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」または「核酸配列」はポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指す。
【0035】
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによってネイティブの環境から分離されている核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態が意図される。たとえば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードするゲル精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは「単離された」と見なされることになる。また、クローニング用の制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドのセグメント、たとえば、ＰＣＲ産物も「単離された」と見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、または緩衝液中もしくは生理食塩水中のような非ネイティブ溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子にはポリヌクレオチドの試験管内または生体内のＲＮＡ転写物が挙げられ、この転写物は自然界で見いだされるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成で製造されるそのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、たとえば、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような調節性エレメントであることができ、またはそれを含むことができる。
【0036】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しないポリヌクレオチド」またはそのあらゆる文法的変形は、裁判官または行政機関または裁判機関によって「天然に存在する」と判定されるもしくは解釈されるまたは判定されてもよいもしくは解釈されてもよい核酸またはポリヌクレオチドの形態を明白に排除するが、排除するにすぎない条件付き定義である。
【0037】
本明細書で使用されるとき、「コーディング領域」はアミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それはコーディング領域の一部と見なすことができるが、隣接配列、たとえば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等はコーディング領域の一部ではない。２つ以上のコーディング領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、たとえば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、たとえば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは単一のコーディング領域を含有することができるか、または２つ以上のコーディング領域を含むことができ、たとえば、単一のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコーディング領域に融合されたまたは融合されていない異種のコーディング領域を含むことができる。異種のコーディング領域には、限定はされないが、特殊化したエレメントまたはモチーフ、たとえば、分泌シグナルペプチドまたは異種の機能的ドメインをコードするものが挙げられる。
【0038】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは普通、１つ以上のコーディング領域と操作可能に結合したプロモーター及び／または他の転写もしくは翻訳の制御エレメントを含むことができる。操作可能な結合は、遺伝子産物、たとえば、ポリペプチドのコーディング領域が、調節性配列の影響下または制御下に遺伝子産物の発現を置くような方法で１つ以上の調節性配列と結合する場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドのコーディング領域及びそれと結合するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらせば、及び、２つのＤＮＡ断片の間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨害しなければ、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力を妨害しなければ、「操作可能に結合」されている。従って、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができれば、プロモーター領域はポリペプチドをコードするその核酸と操作可能に結合していることになる。プロモーターは、所定の細胞においてＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的なプロモーターであることができる。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、たとえば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、ポリヌクレオチドに操作可能に結合して細胞特異的な転写を指示することができる。
【0039】
種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定はされないが、たとえば、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａと組み合わせた前初期プロモーター）、サルウイルス４０（早期プロモーター）、及びレトロウイルス（たとえば、ラウス肉腫ウイルス）に由来するプロモーター及びエンハンサーのセグメントのような、しかし、これらに限定されない、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられる。他の転写制御領域には、たとえば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子の発現を制御することができる他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサーならびにリンホカイン誘導性のプロモーター（たとえば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【0040】
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結のコドン、及びピコナウイルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれている内部リボソーム侵入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態でのＲＮＡであることができる。
【0042】
ポリヌクレオチド及び核酸のコーディング領域は、本明細書で開示されているようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコーディング領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、増えているタンパク質鎖の粗面小胞体からの運び出しがいったん開始されたら成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドがポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することができ、それは完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断され、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態を生じることを承知している。特定の実施形態では、ネイティブのシグナルペプチド、たとえば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、または、操作可能に結合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的な誘導体が使用される。或いは、異種の哺乳類シグナルペプチドまたはその機能的な誘導体を使用することができる。たとえば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置き換えることができる。
【0043】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ２０」はＢリンパ球の表面上で発現される膜タンパク質を指す。ＣＤ２０タンパク質は、他の名称、たとえば、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０、Ｂリンパ球細胞表面抗原Ｂ１、Ｂｐ３５、ＣＶＩＤ５、ＬＥＵ－１６、膜貫通４－ドメインサブファミリーＡメンバー１、またはＭＳ４Ａ２によって文献において参照されている。特定の多価抗ＣＤ２０結合分子、たとえば、本明細書で開示されているようなＩｇＭ抗体またはその断片はさらに、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公報番号ＷＯ／２０１６／１４１３０３に記載されている。
【0044】
本明細書で開示されているのは、特定の結合分子、または抗原結合断片、そのバリアント、または誘導体である。フルサイズの抗体を具体的に指さない限り、用語「結合分子」にはフルサイズの抗体と同様に抗原結合サブユニット、そのような抗体の断片、バリアント、類似体、または誘導体、たとえば、抗体分子に類似する方法で抗原に結合するが、異なる足場を使用する操作された抗体分子または断片が含まれる。
【0045】
本明細書で使用されるとき、用語「結合分子」はその最も広い意味で、標的または分子決定基、たとえば、エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書でさらに記載されているように、結合分子は、本明細書に記載されている１つ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定例は、抗原特異的な結合を保持している抗体またはその断片である。
【0046】
本明細書で使用されるとき、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」はエピトープに特異的に結合するのに十分である結合分子の領域を指す。たとえば、「Ｆｖ」、たとえば、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、２つの別々のポリペプチドサブユニットとして、または単鎖として「結合ドメイン」であると見なされる。他の抗原結合ドメインには、限定はされないが、ラクダ種に由来する抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）、またはフィブロネクチンの足場で発現される６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載されているような「結合分子」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
【0047】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は本明細書では相互交換可能に使用することができる。抗体（または本明細書で開示されているようなその断片、バリアント、もしくは誘導体）には少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ種について）または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインが含まれる。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は相対的によく理解されている（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８を参照のこと）。特に述べられない限り、用語「抗体」は、抗体の小さな抗原結合断片からフルサイズの抗体、たとえば、２つの完全な重鎖と２つの完全な軽鎖とを含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖と４つの完全な軽鎖とを含み、Ｊ鎖及び／または分泌成分を含むことができるＩｇＡ抗体、または１０または１２個の完全な重鎖と１０または１２個の完全な軽鎖とを含み、Ｊ鎖を含むことができるＩｇＭ抗体までに及ぶどんなものでも包含する。
【0048】
以下でさらに詳細に考察されるように、用語「免疫グロブリン」は生化学的に区別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は重鎖がそれらの間で一部のサブクラス（たとえば、γ１～γ４またはα１～α２）を伴ってガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類されることを十分に理解するであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「アイソタイプ」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（亜型）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２は十分に特徴決定されており、機能的特性を付与することが知られている。これら免疫グロブリンそれぞれの修飾された型は本開示を考慮して当業者に容易に認識でき、従って本開示の範囲の中にある。特定の実施形態では、本開示は修飾されたヒトＩｇＭ抗体を提供する。
【0049】
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖のクラスはカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾部」部分は、免疫グロブリンが、たとえば、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって発現される場合、共有結合性のジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ形状の分岐した末端でのＮ末端から各鎖の下部でのＣ末端まで続く。特定の抗体、たとえば、ＩｇＧ抗体の基本構造には、ジスルフィド結合を介して共有結合して本明細書では「Ｈ２Ｌ２」構造または「結合単位」とも呼ばれる「Ｙ」構造を形成する２つの重鎖サブユニットと２つの軽鎖サブユニットとが含まれる。
【0050】
用語「結合単位」は、標準の免疫グロブリン構造、たとえば、２つの重鎖またはその断片と２つの軽鎖またはその断片、または、たとえば、ラクダもしくはコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）の抗体に由来する２つの重鎖またはその断片に相当する結合分子、たとえば、抗体またはその抗原結合断片の部分を指すのに本明細書で使用される。特定の態様では、たとえば、結合分子が二価のＩｇＧ抗体またはその抗原結合断片である場合、用語「結合分子」及び「結合単位」は同義である。他の態様では、結合分子がＩｇＭ五量体またはＩｇＭ六量体である場合、結合分子は、２つ以上の「結合単位」、ＩｇＭの五量体または六量体の場合、それぞれ５つまたは６つの「結合単位」を含む。結合単位は完全長の抗体の重鎖及び軽鎖を含む必要はないが、通常、二価であり、すなわち、以下で定義されるように２つの「抗原結合ドメイン」を含むであろう。本開示で提供されている特定のＩｇＭに由来する結合分子は五量体または六量体であり、ＩｇＭの定常領域、たとえば、修飾されたヒトＩｇＭの定常領域またはその断片を含む５つまたは６つの二価結合単位を含む。本明細書で使用されるとき、２つ以上の結合単位、たとえば、５つまたは６つの結合単位を含む結合分子は「多量体」と呼ばれることができる。
【0051】
用語「Ｊ鎖」、「ネイティブ配列のＪ鎖」、または「ネイティブのＪ鎖」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７として提示される成熟ヒトＪ鎖を含む、任意の動物種のネイティブ配列のＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体のＪ鎖を指す。
【0052】
用語「修飾されたＪ鎖」は、異種部分、たとえば、異種ポリペプチド、たとえば、ネイティブ配列に導入された外来性の結合ドメインを含む、ネイティブ配列のＪ鎖ポリペプチドのバリアントを指すのに本明細書で使用される。導入は、異種ポリペプチドもしくは他の部分の直接融合もしくは間接融合を含む任意の手段によって、またはペプチドリンカーもしくは化学リンカーを介した連結によって達成することができる。用語「修飾されたヒトＪ鎖」は、限定はされないが、異種部分、たとえば、異種ポリペプチド、たとえば、外来性の結合ドメインの導入によって修飾されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列のネイティブ配列のヒトＪ鎖またはその機能的断片を包含する。特定の態様では、異種部分はＩｇＭの五量体への効率的な重合及びそのようなポリマーの標的への結合を妨害しない。例となる修飾されたＪ鎖は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１５／１５３９１２、ＰＣＴ公報番号ＷＯ／２０１７／０５９３８７、及びＰＣＴ公報番号ＷＯ／２０１７／０５９３８０において見いだすことができる。
【0053】
用語「価数」、「二価」、「多価」、及び文法的に同等のものは、所与の結合分子または結合単位における抗原結合ドメインの数を指す。そのようなものとして、所与の結合分子、たとえば、ＩｇＭ抗体またはその断片を参照して用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、それぞれ２つの抗原結合ドメイン、４つの抗原結合ドメイン、及び６つの抗原結合ドメインの存在を意味する。各結合単位が二価である典型的なＩｇＭに由来する結合分子では、結合分子自体は１０または１２の価数を有することができる。二価または多価の結合分子は単一特異性であることができ、すなわち、抗原結合ドメインのすべてが同一であり、または二重特異性もしくは多重特異性であることができ、たとえば、２つ以上の抗原結合ドメインが異なる場合、たとえば、同一抗原上の異なるエピトープに結合する、または全く異なる抗原に結合する。
【0054】
用語「エピトープ」には抗体への特異的な結合が可能である任意の分子決定基が含まれる。特定の態様では、エピトープは、たとえば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性がある表面基群を含むことができ、特定の態様では、三次元の構造特性及びまたは特異的な電荷特性を有することができる。エピトープは抗体が結合する標的の領域である。
【0055】
用語「標的」は結合分子が結合することができる物質を含めるのに最も広い意味で使用される。標的は、たとえば、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質、または他の分子であることができる。さらに、「標的」は、たとえば、結合分子が結合することができる結合されたエピトープを含む細胞、臓器または生物であることができる。
【0056】
軽鎖及び重鎖は双方とも構造的な及び機能的な相同性の領域に分けられる。用語「定常」及び「可変」は機能的に使用される。この点で、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）の部分双方の可変ドメインは抗原認識及び特異性を決定することが十分に理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常領域（ＣＬ）及び重鎖の定常領域（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）は、たとえば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等のような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗原結合部位または抗体のアミノ末端からさらに遠くなるにつれて増える。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３（ＩｇＭの場合ＣＨ４）ドメイン及びＣＬドメインはそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端に存在する。
【0057】
「完全長ＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）と、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）と、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）と、尾部を含むことができる抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）とを含むポリペプチドである。
【0058】
上記で示されたように、可変領域（すなわち、「抗原結合ドメイン」）は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合できるようにする。すなわち、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン（またはラクダもしくはコンドリクトイドの抗体については単にＶＨドメイン（ＶＨＨと表される））、または結合分子、たとえば、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって抗原結合ドメインを形成することができる。さらに具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲ（またはＶＨＨにおける３つのＣＤＲ）によって定義することができる。特定の抗体は、より大きな構造を形成する。たとえば、ＩｇＭは、２、５、または６つのＨ２Ｌ２結合単位と、任意で、ジスルフィド結合を介して操作可能に共有結合したＪ鎖とを含む二量体、五量体または六量体の分子を形成することができる。
【0059】
抗体の抗原結合ドメイン中に存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその三次元構造を前提とするような抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続な配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残りは少ない分子間可変性を示す。フレームワーク領域は大部分はβシート立体構造を採用し、ＣＤＲは接続するループを形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい方向性でＣＤＲを位置づけるのに備える足場を形成するように作用する。位置づけられたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは免疫反応性抗原におけるエピトープに相補性の表面を規定する。この相補性表面が同族エピトープへの抗体の非共有結合性の結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ構成する、アミノ酸は、種々の異なる方法で定義されているので、任意の所与の重鎖または軽鎖の可変領域について当業者が容易に同定することができる（全体が参照によって本明細書に組み入れられる“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；ならびにＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照のこと）。
【0060】
当該技術の範囲内で使用されかつ／または受け入れられる用語の２つ以上の定義がある場合、用語の定義は本明細書で使用されるとき、明白に反対に述べられない限り、そのような意味すべてを含むように意図される。具体例は、重鎖及び軽鎖双方のポリペプチドの可変領域内で見いだされる非連続的な抗原組み合わせ部位を記載するための用語「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の使用である。これらの領域は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって及びＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載されている。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義には、互いに比較するとアミノ酸の重複またはサブセットが含まれている。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義（または当業者に既知の他の定義）の適用は、特に指示されない限り、本明細書で定義され、使用されるような用語の範囲内にあるように意図される。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されたようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸が比較として以下で表１において述べられている。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸の数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考えてどのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
【0061】
（表１）ＣＤＲ定義＊
*表１におけるＣＤＲ定義のすべての番号付けはＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（以下を参照のこと）によって示された番号付けの慣例に従う。
【0062】
たとえば、ＩＭＧＴ情報システム（ｗｗｗ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を用いて免疫グロブリン可変ドメインも分析してＣＤＲを含む可変領域のセグメントを同定することができる。たとえば、Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：Ｗ５０３－５０８（２００８）を参照のこと。
【0063】
Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．は、どんな抗体にも適用できる可変領域及び定常領域の配列についての番号付け方式も定義した。当業者は、配列自体以上の任意の実験データを頼りにすることなく、「Ｋａｂａｔの番号付け」のこの方式をあらゆる可変ドメインの配列に明らかに割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔの番号付け」はＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって述べられた番号付け方式を指す。しかしながら、Ｋａｂａｔの番号付け方式の使用が明白に言及されない限り、本開示ではアミノ酸配列には連続的な番号付けが使用される。別の番号付けスキームは、ＩｇＧについてのＥｕ番号付け方式（Ｅｄｅｌｍａｎ，ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：７８－８５（１９６９））であり、それはＩｇＭを含む他の免疫グロブリンに適合させられている（たとえば、Ａｒｙａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１２０６－１２１２（１９９４）を参照のこと）。
【0064】
結合分子、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、たとえば、Ｆａｂ，Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ，単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨのいずれかのドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって作製される断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術で既知であり、たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【0065】
「特異的に結合する」によって、結合分子、たとえば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、且つその結合が抗原結合ドメインとエピトープの間で何らかの相補性を伴うことを一般に意味する。この定義によれば、結合分子は、それが無作為で無関係なエピトープに結合するよりも容易に抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すると、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対的親和性を限定するのに本明細書で使用される。たとえば、結合分子「Ａ」は所与のエピトープについて結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有すると考えることができ、または結合分子「Ａ」は関連するエピトープ「Ｄ」についてそれが有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【0066】
本明細書で開示されている結合分子、たとえば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０－２秒－１、１０－２秒－１、５×１０－３秒－１、１０－３秒－１、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、もしくは１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１もしくは１０－７秒－１より低いオフ速度（ｋ（オフ））または５×１０－２秒－１、１０－２秒－１、５×１０－３秒－１、１０－３秒－１、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、または１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１または１０－７秒－１のオフ速度（ｋ（オフ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【0067】
本明細書で開示されている結合分子、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、５×１０４Ｍ－１秒－１、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、もしくは５×１０６Ｍ－１秒－１もしくは１０７Ｍ－１秒－１を超えるオン速度（ｋ（オン））または１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、５×１０４Ｍ－１秒－１、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、もしくは５×１０６Ｍ－１秒－１もしくは１０７Ｍ－１秒－１のオン速度（ｋ（オン））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【0068】
結合分子、たとえば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、それが参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープへの結合をある程度阻止する程度にそのエピトープに優先的に結合するならば、参照抗体または抗原結合断片のそのエピトープへの結合を競合して阻害すると言われ得る。競合阻害は、当該技術で既知の任意の方法、たとえば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ法によって測定することができる。結合分子は、参照抗体または抗原結合断片の所与のエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合して阻害すると言われ得る。
【0069】
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は１つ以上の抗原結合ドメイン、たとえば、免疫グロブリン分子のものとの個々のエピトープの結合の強度の測定を示す。たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７～２８ページを参照のこと。本明細書で使用されるとき、用語「結合活性」は抗原結合ドメインの集団と抗原の間での複合体の全体的な安定性を指す。たとえば、Ｈａｒｌｏｗの２９～３４ページを参照のこと。結合活性は、集団中の個々の抗原結合ドメインの特定のエピトープとの親和性と免疫グロブリン及び抗原の価数との双方に関連する。たとえば、二価のモノクローナル抗体と高度に反復するエピトープ構造を持つ抗原、たとえば、ポリマーとの間の相互作用は高い結合活性のものである。細胞表面上に高密度で存在する受容体との二価のモノクローナル抗体間との間の相互作用も高い結合活性のものである。
【0070】
本明細書で開示されているような結合分子またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体はその交差反応性という点でも記載または特定され得る。本明細書で使用されるとき、用語「交差反応性」は、１つの抗原に特異的な結合分子、たとえば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体の第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の同系性の測定を指す。従って、結合分子は、その形成を誘導したもの以外のエピトープに結合すれば、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に誘導エピトープと同じ相補性の構造特性の多くを含有し、場合によっては原型よりも実際良好に適合することができる。
【0071】
結合分子、たとえば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、抗原へのその結合親和性という点でも記載または特定され得る。たとえば、結合分子は、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、または１０－１５Ｍを超えない解離定数またはＫＤで抗原に結合することができる。
【0072】
単鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含む抗体断片は、単独で存在することができるか、または以下のうちの１つ以上と組み合わせて存在することができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４のドメイン、Ｊ鎖また分泌成分。含まれるのはまた、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４のドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分の１つ以上との可変領域の任意の組み合わせを含むことができる抗原結合断片である。結合分子、たとえば、抗体またはその抗原結合断片は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源に由来することができる。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体であることができる。別の実施形態では、可変領域は起源においてコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（たとえば、サメ由来）であることができる。本明細書で使用されるとき、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、ヒト免疫グロブリンのライブラリから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックである動物から単離された抗体が挙げられ、場合によっては、それは、上記及び、たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、内在性の免疫グロブリンを発現することができるし、できないこともある。
【0073】
本明細書で使用されるとき、用語「重鎖サブユニット」は免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、重鎖サブユニットを含む結合分子、たとえば、抗体は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば、上部、中間及び／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはそれらのバリアントもしくは断片の少なくとも１つを含むことができる。たとえば、結合分子、たとえば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、限定はされないが、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメインとヒンジとＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメインとヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むことができる。特定の態様では、結合分子、たとえば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメインとＣＨ４ドメインとＪ鎖を含むことができる。さらに、本開示で使用するための結合分子は特定の定常領域の一部、たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部を欠くことができる。これらのドメイン（たとえば、重鎖サブユニット）は、それらが原型の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列で異なるように修飾することができることが当業者によって理解されるであろう。
【0074】
本明細書で使用されるとき、用語「軽鎖サブユニット」は免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは少なくともＶＬを含むことができ、且つＣＬ（たとえば、ＣκまたはＣλ）ドメインをさらに含むことができる。
【0075】
結合分子、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識するまたは特異的に結合する抗原のエピトープまたは一部という点で記載または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分が「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープ、または少なくとも２つのエピトープを含むことができ、且つ抗原のサイズ、立体構造及び種類に応じて任意の数のエピトープを含むことができる。
【0076】
本明細書で使用されるとき、用語「ジスルフィド結合」には２つのイオウ原子間で形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、第２のチオール基と共にジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。
【0077】
本明細書で使用されるとき、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性の領域または部位が第１の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（インタクトであり得る、部分的であり得るか、または修飾され得る）が第２の種から得られる抗体を指す。一部の実施形態では、標的結合の領域または部位は非ヒト起源（たとえば、マウスまたは霊長類）に由来するであろうし、定常領域はヒトである。
【0078】
用語「多重特異性抗体」、たとえば、「二重特異性抗体」は、単一抗体分子内で２つ以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体を指す。基準の抗体構造に加えて他の結合分子を２つの結合特異性と共に構築することができる。二重特異性抗体または多重特異性抗体によるエピトープ結合は同時であることができるか、または逐次であることができる。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。二重特異性抗体は組換え手段によっても構築することができる（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７－９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ ａｎｄ Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３－９（２０１０））。二重特異性抗体はダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）であることもできる。
【0079】
本明細書で使用されるとき、用語「操作された抗体」は、重鎖及び軽鎖のいずれかまたは双方における可変ドメイン及び／または定常領域が、ＣＤＲ、フレームワーク、及び／または定常領域における１つ以上のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって変えられている抗体を指す。特定の態様では、既知の特異性の抗体に由来するＣＤＲ全体を異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替のＣＤＲはフレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたは同等のサブクラスの抗体に由来することができるが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体、たとえば、異なる種の抗体に由来することもできる。既知の特異性の非ヒト抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒトの重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に移植されている操作された抗体は本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。特定の態様では、ＣＤＲのすべてがドナーの可変領域に由来する完全なＣＤＲで置き換えられるわけではなく、その上、ドナーの抗原結合能をレシピエントの可変ドメインにさらに移すことができる。たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号で述べられた説明を考えると、機能的な操作されたまたはヒト化された抗体を入手することは、日常の実験を行うことによって、または試行錯誤試験によって当業者の能力の十分に範囲内であろう。
【0080】
本明細書で使用されるとき、用語「操作された」には、合成手段による（たとえば、組換え法、試験管内のペプチド合成による、ペプチドの酵素的または化学的なカップリングまたはこれらの技法の何らかの組み合わせによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
【0081】
本明細書で使用されるとき、用語「連結される」、「融合される」、もしくは「融合」、または他の文法的に同等のものは、相互交換可能に使用することができる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むどんな手段によっても２つ以上のエレメントまたは成分を一緒にすることを指す。「インフレーム融合」は、元々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳リーディングフレームを維持する方法で連続的なさらに長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドのＯＲＦの結合を指す。従って、組換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに相当する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（そのセグメントは自然界では普通そのように結合されない）。リーディングフレームは融合されたセグメント全体にわたってこうして連続にされるが、たとえば、インフレームリンカー配列によってセグメントを物理的にまたは空間的に分離することができる。たとえば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはインフレームで融合することができるが、「融合された」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンのフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
【0082】
ポリペプチドの文脈では、「線状配列」または「配列」は、配列において互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの一次構造で連続する、アミノ末端からカルボキシ末端への方向の、ポリペプチド中のアミノ酸の順序である。ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端」または「Ｎ末端」側にあるポリペプチドの部分は一連のポリペプチド鎖において先に来るその部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端」または「Ｃ末端」側にあるポリペプチドの部分は一連のポリペプチド鎖において後に来るその部分である。たとえば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域に対して「Ｎ末端」側にあり、定常領域は可変ドメインに対して「Ｃ末端」側にある。
【0083】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子が生化学的なもの、たとえば、ポリペプチドを生成する過程を指す。過程には、限定はされないが、遺伝子のノックダウンならびに一時的な発現及び安定した発現の双方を含む、細胞内での遺伝子の機能的存在の何らかの明示が含まれる。限定はされないが、ＲＮＡ、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。最終的な所望の産物が生化学的なものであれば、発現にはその生化学的なもの及び任意の前駆体を生成することが含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、遺伝子の転写によって生成される核酸、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかである。本明細書に記載されている遺伝子産物にはさらに、転写後修飾、たとえば、ポリアデニル化を伴う核酸、または翻訳後修飾、たとえば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断等を伴うポリペプチドが挙げられる。
【0084】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療」または「治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」または「緩和すること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」または「緩和すること（ｔｏ ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」のような用語は現存する診断された病状または疾病の症状を治癒させる、落ち着かせる、減らす、及び／またはその進行を止めるまたは減速する治療方針を指す。「防ぐ」、「予防」、「回避する」、「阻止」等のような用語は、診断されていない標的とされる病状または疾病の発生を防ぐ予防的なまたは予防上の方針を指す。従って、「治療を必要とするもの」は、すでに疾病を持つもの、疾病を有しがちなもの、及び疾病が予防されるべきであるものを含むことができる。
【0085】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」によって診断、予後診断または治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家畜、産業動物、及び動物園動物、スポーツ用動物またはペット動物、たとえば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ等が挙げられる。
【0086】
本明細書で使用されるとき、「治療から利益を得る対象」及び「治療を必要とする動物」のような語句には、１つ以上の抗原結合ドメインを含む抗体のような結合分子の投与から利益を得る対象、たとえば、哺乳類対象が含まれる。そのような結合分子、たとえば、抗体は、たとえば、疾患の診断法及び／または治療または予防に使用することができる。
【0087】
ＩｇＭ結合分子
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、５日の半減期で血清中に１．５ｍｇ／ｍｌ前後で存在する。ＩｇＭは通常五量体または六量体の分子である。ＩｇＭの結合単位は通常、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む。ＩｇＧが３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する一方でＩｇＭの重鎖（μ）はさらに、Ｃ末端の「尾部」を含む第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含有する。ヒトＩｇＭの定常領域は通常、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（表３を参照）を含む。ヒトＣμ１の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸５からほぼアミノ酸１０２に及び；ヒトＣμ２の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸１１４からほぼアミノ酸２０５に及び；ヒトＣμ３の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸２２４からほぼアミノ酸３１９に及び；ヒトＣμ４の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸３２９からほぼアミノ酸４３０に及び；尾部はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸４３１からほぼアミノ酸４５３に及ぶ。
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、５日の半減期で血清中に１．５ｍｇ／ｍｌ前後で存在する。ＩｇＭは通常五量体または六量体の分子である。ＩｇＭの結合単位は通常、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む。ＩｇＧが３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する一方でＩｇＭの重鎖（μ）はさらに、Ｃ末端の「尾部」を含む第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含有する。ヒトＩｇＭの定常領域は通常、アミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（表３を参照）を含む。ヒトＣμ１の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸５からほぼアミノ酸１０２に及び；ヒトＣμ２の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸１１４からほぼアミノ酸２０５に及び；ヒトＣμ３の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸２２４からほぼアミノ酸３１９に及び；ヒトＣμ４の領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸３２９からほぼアミノ酸４３０に及び；尾部はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸４３１からほぼアミノ酸４５３に及ぶ。
【0088】
５つのＩｇＭ結合単位が追加の小さなポリペプチド鎖（Ｊ鎖）と共に複合体を形成し、ＩｇＭ抗体を形成することができる。前駆体のヒトＪ鎖はアミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む（表３）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の最初の２２のアミノ酸は分泌シグナルペプチドであり、成熟ヒトＪ鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸２３で開始する。Ｊ鎖がなければ、ＩｇＭ結合単位は通常六量体になる。理論に束縛されるのを望まないが、ＩｇＭ結合単位が集合して六量体または五量体の結合分子になるには、Ｃμ３、Ｃμ４、及び尾部のドメインが関与すると考えられている。従って、本開示で提供されている六量体または五量体の結合分子は通常、少なくともＣμ３、Ｃμ４、及び尾部のドメインを含むＩｇＭ定常領域を含む。
【0089】
ＩｇＭの重鎖定常領域はさらに、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＭの重鎖ドメインを含むことができる。特定の態様では、本明細書で提供されるような結合分子は、完全なＩｇＭ重鎖（μ）定常領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含むことができる。
【0090】
補体系及び補体依存性細胞障害
補体系は３０個を超える糖タンパク質を含み、そのうち、２０個は血漿に存在し、１０個は細胞に関連する調節因子または受容体である。補体カスケードの活性化は、細胞溶解、貪食作用、走化性及び免疫細胞の活性化を含む多様な免疫エフェクター機能を誘導する。補体は、３つの異なる経路：すべてＣ３タンパク質のレベルに集中し、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成による標的細胞の補体依存性細胞障害をもたらす、古典経路、副経路及びマンノース結合レクチン経路によって活性化することができる。免疫複合体におけるＩｇＭ及び特定のサブクラスのＩｇＧ抗体は古典的補体経路を活性化する。抗原・抗体複合体の形成は、補体系のＣ１成分についての結合部位を暴露するＩｇＭまたはＩｇＧ分子のＦｃ部分における立体構造の変化を誘導する。血清中のＣ１はＣ１ｑとＣ１ｒ及びＣ１ｓのそれぞれの２つの分子とから成る高分子複合体である。Ｃ１ｑのＦｃ結合部位への結合はＣ１ｒ及びＣ１ｓにおける立体構造の変化を誘導する。それに続いてタンパク質分解で活性化されたＣ１ｒがＣ１ｓを切断し、Ｃ１ｓの活性化を生じる。次いでＣ１ｓはＣ２及びＣ４を切断してＣ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ及びＣ４ｂを生成する。Ｃ２ａ及びＣ４ｂは一緒にＣ３変換酵素を形成する。Ｃ３変換酵素による中心的な成分Ｃ３の切断は、Ｃ３ｂの形成をもたらし、その一部が標的細胞の細胞膜に結合する。膜に結合したＣ３ｂはＣ３変換酵素と相互作用し、Ｃ５変換酵素の形成をもたらす。その結果、Ｃ５はＣ５ａ及びＣ５ｂに切断される。最終経路の活性化は、オプソニン化された標的細胞の膜へのＣ５ｂ～Ｃ９成分の沈着をもたらして膜侵襲複合体を形成し、最終的に補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を引き起こす。
補体系は３０個を超える糖タンパク質を含み、そのうち、２０個は血漿に存在し、１０個は細胞に関連する調節因子または受容体である。補体カスケードの活性化は、細胞溶解、貪食作用、走化性及び免疫細胞の活性化を含む多様な免疫エフェクター機能を誘導する。補体は、３つの異なる経路：すべてＣ３タンパク質のレベルに集中し、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成による標的細胞の補体依存性細胞障害をもたらす、古典経路、副経路及びマンノース結合レクチン経路によって活性化することができる。免疫複合体におけるＩｇＭ及び特定のサブクラスのＩｇＧ抗体は古典的補体経路を活性化する。抗原・抗体複合体の形成は、補体系のＣ１成分についての結合部位を暴露するＩｇＭまたはＩｇＧ分子のＦｃ部分における立体構造の変化を誘導する。血清中のＣ１はＣ１ｑとＣ１ｒ及びＣ１ｓのそれぞれの２つの分子とから成る高分子複合体である。Ｃ１ｑのＦｃ結合部位への結合はＣ１ｒ及びＣ１ｓにおける立体構造の変化を誘導する。それに続いてタンパク質分解で活性化されたＣ１ｒがＣ１ｓを切断し、Ｃ１ｓの活性化を生じる。次いでＣ１ｓはＣ２及びＣ４を切断してＣ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ及びＣ４ｂを生成する。Ｃ２ａ及びＣ４ｂは一緒にＣ３変換酵素を形成する。Ｃ３変換酵素による中心的な成分Ｃ３の切断は、Ｃ３ｂの形成をもたらし、その一部が標的細胞の細胞膜に結合する。膜に結合したＣ３ｂはＣ３変換酵素と相互作用し、Ｃ５変換酵素の形成をもたらす。その結果、Ｃ５はＣ５ａ及びＣ５ｂに切断される。最終経路の活性化は、オプソニン化された標的細胞の膜へのＣ５ｂ～Ｃ９成分の沈着をもたらして膜侵襲複合体を形成し、最終的に補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を引き起こす。
【0091】
補体依存性の細胞溶解の最終結果は、膜の完全性を破壊する、細胞の脂質二重層膜における孔の形成である。補体依存性細胞障害アッセイ法（ＣＤＣアッセイ法）は、補体免疫経路を活性化して膜侵襲複合体及び標的とされた細胞の溶解を開始する抗体の有効性を調べる。ＣＤＣアッセイのための１つの方法は、補体系の成分を含有する添加剤、たとえば、血清と、評価される抗体が結合した標的細胞を混合し、且つ、次いで細胞死を測定することである。細胞死は、たとえば、細胞死の際、細胞から放出される放射性化合物で標的細胞を予め負荷することによって測定することができ、細胞死媒介するための抗体の有効性は、放射性レベルによって測定される。非放射性のＣＤＣアッセイ法、たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａから入手できるＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）アッセイ法は、蛍光または発光の測定によってＡＴＰのような豊富な細胞成分の放出を測定する。ＣＤＣの事象では、混合は細胞溶解と、存在するＡＴＰの量に比例した発光シグナルの生成を生じる。ＡＴＰの量は培養物中に存在する細胞の数に直接比例する。
【0092】
減少したＣＤＣ活性を有する修飾されたヒトＩｇＭ定常領域
本開示は、細胞上で発現される標的抗原に向けられた修飾された標的特異的なヒトＩｇＭ抗体の一部として発現させると、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて補体の存在下で細胞の減少したＣＤＣ活性を示す修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を提供する。「対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体」は、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす定常領域中の1つの修飾または複数の修飾を除いては修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む抗体と同一である、野生型ＩｇＭ抗体を意味する。たとえば、「対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体」は、同一のＶＨ及びＶＬの領域、及び修飾されたヒトＩｇＭ抗体がＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾以外で有し得る任意の他の修飾または切り詰めを含むであろう。特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、たとえばＣμ３ドメイン中にまたはその近傍に、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｔ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｋ３２２まで伸びる領域中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、たとえば、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２の位置において少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。理論に束縛されることを望まないが、補体のＣ１ｑ成分はＣμ３ドメイン中に存在する少なくとも特定のアミノ酸残基を介してヒトＩｇＭ定常領域と結合すると考えられている。ＣＤＣを測定するアッセイ法は当業者に周知であり、例となるアッセイ法は本明細書に記載されている。
本開示は、細胞上で発現される標的抗原に向けられた修飾された標的特異的なヒトＩｇＭ抗体の一部として発現させると、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて補体の存在下で細胞の減少したＣＤＣ活性を示す修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を提供する。「対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体」は、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす定常領域中の1つの修飾または複数の修飾を除いては修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む抗体と同一である、野生型ＩｇＭ抗体を意味する。たとえば、「対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体」は、同一のＶＨ及びＶＬの領域、及び修飾されたヒトＩｇＭ抗体がＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾以外で有し得る任意の他の修飾または切り詰めを含むであろう。特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、たとえばＣμ３ドメイン中にまたはその近傍に、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｔ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｋ３２２まで伸びる領域中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、たとえば、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２の位置において少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。理論に束縛されることを望まないが、補体のＣ１ｑ成分はＣμ３ドメイン中に存在する少なくとも特定のアミノ酸残基を介してヒトＩｇＭ定常領域と結合すると考えられている。ＣＤＣを測定するアッセイ法は当業者に周知であり、例となるアッセイ法は本明細書に記載されている。
【0093】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位において野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて置換を含む。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位において野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて置換を含む。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位において野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて置換を含む。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位において野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて置換を含む。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位のうちの２つ以上において野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて置換の組み合わせを含有する。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１１Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１３位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）によって置換することができる。本明細書で提供されているような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、セリン（Ｌ３１０Ｓ）、グリシン（Ｌ３１０Ｇ）またはアスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）によって置換することができる。本明細書で提供されているような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｋ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、セリン（Ｋ３１５Ｓ）、グリシン（Ｋ３１５Ｇ）、アスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）またはグルタミン（Ｋ３１５Ｑ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位及びＰ３１３位において、たとえば、それぞれアラニン（Ｐ３１１Ａ）及びセリン（Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、またはアラニン、セリン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＫ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、またはセリン（Ｌ３１０Ｓ、Ｋ３１５Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＰ３１１位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１１Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＰ３１３位において、たとえば、それぞれアラニン及びセリン（Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位及びＫ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１１Ａ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１３位及びＫ３１５位において、たとえば、それぞれセリン及びアラニン（Ｐ３１３Ｓ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。
【0094】
特定の態様では、たとえば、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５におけるアミノ酸置換、たとえば、Ｌ３１０Ａ、Ｌ３１０Ｓ、Ｌ３１０Ｇ、Ｌ３１０Ｄ、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１１Ｓ、Ｐ３１１Ｇ、Ｐ３１３Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１３Ｇ、Ｋ３１５Ａ、Ｋ３１５Ｓ、Ｋ３１５Ｇ、Ｋ３１５Ｄ、及び／もしくはＫ３１５Ｑ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性は、対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少させることができる。
【0095】
特定の態様では、たとえば、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５におけるアミノ酸置換、たとえば、Ｌ３１０Ａ、Ｌ３１０Ｓ、Ｌ３１０Ｇ、Ｌ３１０Ｄ、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１１Ｓ、Ｐ３１１Ｇ、Ｐ３１３Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１３Ｇ、Ｋ３１５Ａ、Ｋ３１５Ｓ、Ｋ３１５Ｇ、Ｋ３１５Ｄ、及び／またはＫ３１５Ｑ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含む標的特異的なＩｇＭ抗体の５０％ＣＤＣ活性をもたらす抗体濃度（ＥＣ５０）は、対応する野生型ＩｇＭ抗体に比べて、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加させることができる。
【0096】
本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域は、当業者に周知の標準の変異誘発法によって構築することができるか、または種々の供給業者から入手することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列変異の方法は当該技術で周知である。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ.（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８－４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；米国特許第４，８７３，１９２号；及びそれらの中で引用された参考文献を参照のこと。対象とするポリペプチドの生物活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＤａｙｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９７８），ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．），ｐｐ．３４５－３５２のモデルにおいて見いだすことができる。Ｄａｙｈｏｆｆらのモデルは、受容点突然変異（ＰＡＭ）アミノ酸類似性マトリクス（ＰＡＭ２５０マトリクス）を使用して好適な保存的アミノ酸置換を決定する。特定の態様では、保存的置換、たとえば、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換することが使用される。ＤａｙｈｏｆｆらのモデルのＰＡＭ２５０マトリクスによって教示されるような保存的アミノ酸置換の例には、Ｇｌｙ←→Ａｌａ、Ｖａｌ←→Ｉｌｅ←→Ｌｅｕ、Ａｓｐ←→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ←→Ａｒｇ、Ａｓｎ←→Ｇｌｎ、及びＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
五量体または六量体の修飾されたヒトＩｇＭ抗体
別の態様では、本開示は修飾されたヒトＩｇＭ抗体を提供し、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含み、且つ修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、標的抗原に特異的に結合し（単独でまたは軽鎖可変領域（ＶＬ）との組み合わせで）、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少及び／または５０％ＣＤＣ活性をもたらす抗体濃度（ＥＣ５０）の増加を示す。特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、たとえばＣμ３ドメイン中にまたはその近傍に、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｔ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｋ３２２まで伸びる領域において１つ以上のアミノ酸置換を含み、たとえば、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２の位置において少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、またそれ以上のアミノ酸置換を含む。理論に束縛されることを望まないが、補体のＣ１ｑ成分はＣμ３ドメイン中に存在する特定のアミノ酸残基を少なくとも介してヒトＩｇＭ定常領域と結合すると考えられている。ＣＤＣを測定するアッセイ法は当業者に周知であり、例となるアッセイ法は本明細書に記載されている。
別の態様では、本開示は修飾されたヒトＩｇＭ抗体を提供し、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を含み、且つ修飾されたヒトＩｇＭ定常領域に対してアミノ末端側に位置する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、重鎖可変領域（ＶＨ）は、標的抗原に特異的に結合し（単独でまたは軽鎖可変領域（ＶＬ）との組み合わせで）、且つ、対応する野生型ヒトＩｇＭ抗体、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、標的抗原を発現している細胞の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の減少及び／または５０％ＣＤＣ活性をもたらす抗体濃度（ＥＣ５０）の増加を示す。特定の態様では、修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、たとえばＣμ３ドメイン中にまたはその近傍に、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｔ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のほぼアミノ酸Ｋ３２２まで伸びる領域において１つ以上のアミノ酸置換を含み、たとえば、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２、Ｃ３０３、Ｔ３０４、Ｖ３０５、Ｔ３０６、Ｈ３０７、Ｔ３０８、Ｄ３０９、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｓ３１２、Ｐ３１３、Ｌ３１４、Ｋ３１５、Ｑ３１６、Ｔ３１７、Ｉ３１８、Ｓ３１９、Ｒ３２０、Ｐ３２１、及び／またはＫ３２２の位置において少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、またそれ以上のアミノ酸置換を含む。理論に束縛されることを望まないが、補体のＣ１ｑ成分はＣμ３ドメイン中に存在する特定のアミノ酸残基を少なくとも介してヒトＩｇＭ定常領域と結合すると考えられている。ＣＤＣを測定するアッセイ法は当業者に周知であり、例となるアッセイ法は本明細書に記載されている。
【0098】
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位において野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて置換を含む。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位において野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて置換を含有する。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位において野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて置換を含有する。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位において野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて置換を含有する。他の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３位、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５位のうちの２つ以上において野生型ヒトＩｇＭ抗体と比べて置換の組み合わせを含有する。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１１Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１３位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、セリン（Ｌ３１０Ｓ）、グリシン（Ｌ３１０Ｇ）またはアスパラギン酸（Ｌ３１０Ｄ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｋ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、セリン（Ｋ３１５Ｓ）、グリシン（Ｋ３１５Ｇ）、アスパラギン酸（Ｋ３１５Ｄ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）またはグルタミン（Ｋ３１５Ｑ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）によって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位及びＰ３１３位において、たとえば、それぞれアラニン（Ｐ３１１Ａ）及びセリン（Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、またはアラニン、セリン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＫ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、またはセリン（Ｌ３１０Ｓ、Ｋ３１５Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＰ３１１位において、たとえば、アラニン（Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１１Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されているような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｌ３１０位及びＰ３１３位において、たとえば、それぞれアラニン及びセリン（Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１３Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１１位及びＫ３１５位において、たとえば、アラニン（Ｐ３１１Ａ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。本明細書で提供されているような修飾されたＩｇＭ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸Ｐ３１３位及びＫ３１５位において、たとえば、それぞれセリン及びアラニン（Ｐ３１３Ｓ、Ｋ３１５Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、またはアラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、及び／もしくはグリシンの任意の組み合わせによって置換することができる。
【0099】
特定の態様では、たとえば、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５におけるアミノ酸置換、たとえば、Ｌ３１０Ａ、Ｌ３１０Ｓ、Ｌ３１０Ｇ、Ｌ３１０Ｄ、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１１Ｓ、Ｐ３１１Ｇ、Ｐ３１３Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１３Ｇ、Ｋ３１５Ａ、Ｋ３１５Ｓ、Ｋ３１５Ｇ、Ｋ３１５Ｄ、及び／またはＫ３１５Ｑ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書で提供されるような修飾されたＩｇＭ抗体の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性は、対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いては同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少させることができる。
【0100】
特定の態様では、たとえば、Ｌ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５におけるアミノ酸置換、たとえば、Ｌ３１０Ａ、Ｌ３１０Ｓ、Ｌ３１０Ｇ、Ｌ３１０Ｄ、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１１Ｓ、Ｐ３１１Ｇ、Ｐ３１３Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１３Ｇ、Ｋ３１５Ａ、Ｋ３１５Ｓ、Ｋ３１５Ｇ、Ｋ３１５Ｄ、及び／またはＫ３１５Ｑ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書で提供されるようなＩｇＭ抗体の５０％ＣＤＣ活性をもたらす抗体濃度（ＥＣ５０）は、対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べて、すなわち、修飾されたヒトＩｇＭ定常領域を除いて同一である野生型標的特異的なＩｇＭ抗体と比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加させることができる。
【0101】
本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、本明細書で定義されるような５つまたは６つのＩｇＭ「結合単位」を含む六量体または五量体であることができ、それらＩｇＭ「結合単位」のうちの１つ以上は対象とする標的抗原に特異的に結合することができる。本開示は、任意の標的抗原に特異的に結合する修飾されたヒトＩｇＭ抗体を包含する。特定の態様では、標的抗原は細胞、たとえば、真核細胞の表面での発現が可能である。標的抗原には、限定はされないが、腫瘍抗原、他の腫瘍性標的、たとえば、免疫チェックポイント阻害剤のような免疫・腫瘍性標的、たとえば、感染した細胞の表面で発現されるウイルス抗原のような感染症抗原、血管脳関門の輸送に関与する標的抗原、神経変性疾患及び神経炎症性疾患に関与する標的抗原、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。標的抗原の非限定例、ならびにそのような標的抗原に結合する抗体結合ドメインの非限定例は、たとえば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１６／１４１３０３、同ＷＯ２０１６／１６８７５８、同ＷＯ２０１６／１５４５９３、同ＷＯ２０１６／１１８６４１、同ＷＯ２０１５／１５３９１２、同ＷＯ２０１５／０５３８８７、同ＷＯ２０１３／１２００１２、同ＷＯ／２０１７／０５９３８７、同ＷＯ／２０１７／０５９３８０、同ＷＯ／２０１８／０１７８８８、同ＷＯ／２０１８／０１７８８９、同ＷＯ／２０１８／０１７７６１、及び同ＷＯ／２０１８／０１７７６３において見いだすことができ、その開示は全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0102】
特定の態様では、本開示は、５つまたは６つの二価結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体の修飾されたヒトＩｇＭ抗体を提供し、各結合単位は、本明細書で提供されるような２つの修飾されたヒトＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む。
【0103】
本明細書で提供される修飾されたヒトＩｇＭ抗体が五量体である場合、抗体はさらに、Ｊ鎖またはその機能的断片またはそのバリアントを含むことができる。特定の態様では、Ｊ鎖は、１つの異種部分または１つ以上の異種部分、たとえば、異種ポリペプチド配列、たとえば、ネイティブの配列に導入された外来性の結合ドメインを含む、修飾されたＪ鎖である。特定の態様では、外来性の結合ドメインはＣＤ３、たとえば、ＣＤ３εに特異的に結合する。特定の態様では、修飾されたＪ鎖はＶ１５Ｊ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）またはＪ１５Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を含む。
【0104】
定常領域が修飾されたヒトＩｇＭ抗体における所望の機能に役立つことができる、たとえば、第２のＩｇＭ定常領域と結合して結合単位を形成する、または他の結合単位と結合して六量体または五量体を形成することができるという条件で、ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ３ドメイン（本明細書で提供されるように、Ｃμ３は１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる）、及び／またはＣμ４ドメインの１つ以上を含むことができる。特定の態様では、個々の結合単位内での２つの修飾されたヒトＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、修飾されたＣμ３ドメイン（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＬ３１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰ３１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３１５、及び／もしくはそれらの任意の組み合わせの１つ以上での置換を伴う）もしくはその断片、Ｃμ４ドメインもしくはその断片、尾部（ＴＰ）もしくはその断片、または修飾されたＣμ３ドメインとＣμ４ドメインとＴＰもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の態様では、個々の結合単位の範囲内での２つの修飾されたヒトＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれさらに、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、またはＣμ１ドメインもしくはその断片及びＣμ２ドメインもしくはその断片を含む。
【0105】
特定の態様では、所与の結合単位における２つの修飾されたヒトＩｇＭ重鎖定常領域のそれぞれは、抗原結合ドメイン、たとえば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）またはＦｖ部分、たとえば、抗体のＶＨ及びＶＬと結合する。
【0106】
修飾されたＪ鎖
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は修飾されたＪ鎖を組み込んで二重特異性であることができる。本明細書及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１５／１５３９１２、同ＷＯ／２０１７／０５９３８７、及び同ＷＯ／２０１７／０５９３８０において提供されているように、修飾されたＪ鎖は、異種部分、たとえば、異種ポリペプチドを含むことができ、たとえば、標的に特異的に結合することができるポリペプチド結合ドメインを含むことができる、たとえば、外来性の結合ドメインを含むことができる。結合ドメインは、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、抗体・薬剤コンジュゲートまたはその抗原結合断片、または抗体様分子であることができる。ポリペプチド結合ドメインは、付加の位置及び種類（たとえば、直接または間接の融合、化学連結等）を適宜選択することによってＪ鎖に導入することができる。
特定の態様では、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は修飾されたＪ鎖を組み込んで二重特異性であることができる。本明細書及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１５／１５３９１２、同ＷＯ／２０１７／０５９３８７、及び同ＷＯ／２０１７／０５９３８０において提供されているように、修飾されたＪ鎖は、異種部分、たとえば、異種ポリペプチドを含むことができ、たとえば、標的に特異的に結合することができるポリペプチド結合ドメインを含むことができる、たとえば、外来性の結合ドメインを含むことができる。結合ドメインは、たとえば、抗体またはその抗原結合断片、抗体・薬剤コンジュゲートまたはその抗原結合断片、または抗体様分子であることができる。ポリペプチド結合ドメインは、付加の位置及び種類（たとえば、直接または間接の融合、化学連結等）を適宜選択することによってＪ鎖に導入することができる。
【0107】
特定の態様では、結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、及び多重特異性の抗体及び抗体断片を含む抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。抗体断片は、限定はされないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２断片、単鎖抗体分子、ミニボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であることができる。特定の態様では、抗体断片はｓｃＦｖである。
【0108】
他の態様では、結合ドメインは、抗体様分子、たとえば、ヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子、ダイアボディ、ジダイアボディ（ｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ）、二重可変ドメイン抗体、積層可変ドメイン抗体、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、サロボディ（Ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ）、鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）－ボディ、またはＴａｎｄＡｂであることができる。
【0109】
結合ドメインは、レシピエントＩｇＭ分子のその1つの結合標的もしくは複数の結合標的への結合またはＩｇＭ五量体に効率的に組み込むＪ鎖の能力を妨害しないで結合ドメインの結合標的への結合を可能にする任意の位置でネイティブのＪ鎖配列に導入することができる。特定の態様では、Ｃ末端でもしくはその近傍で、成熟Ｎ末端（たとえば、シグナルペプチドの切断後のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸番号２３）でもしくはその近傍で、またはＪ鎖の三次元構造に基づいてアクセスできる内部の位置で、結合ドメインを挿入することができる。特定の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヒトＪ鎖のＣ末端から約１０残基欠いてまたは成熟Ｎ末端（アミノ酸２３）から約１０残基欠いて結合ドメインをネイティブ配列Ｊ鎖に導入することができる。別の態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のシステイン残基１１３と１２２の間でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のネイティブ配列ヒトＪ鎖に、または別のネイティブ配列Ｊ鎖の同等の位置で、結合ドメインを導入することができる。さらなる態様では、グリコシル化部位でまたはその近傍で、結合ドメインをネイティブ配列Ｊ鎖、たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のＪ鎖に導入することができる。特定の態様では、Ｃ末端から約１０残基以内においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のネイティブ配列ヒトＪ鎖に結合ドメインを導入することができる。
【0110】
導入は、直接融合または間接的融合によって、すなわち、ペプチドリンカーの有無にかかわらず、コーディングヌクレオチド配列のインフレーム組み合わせによる１つのポリペプチド鎖におけるＪ鎖と結合ドメインとの組み合わせによって達成することができる。ペプチドリンカー（間接的融合）は使用されるならば、約１～５０、または約１～４０、または約１～３０、または約１～２０、または約１～１０、または約１０～２０アミノ酸長であることができ、Ｊ鎖配列に導入される結合ドメインの末端の一方または双方に存在することができる。特定の態様では、ペプチドリンカーは約１０～２０または１０～１５アミノ酸長である。特定の態様では、ペプチドリンカーは１５アミノ酸長である。特定の態様では、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）である。
【0111】
複数の異種ポリペプチド、たとえば、複数の結合ドメインまたは他の部分をＪ鎖に導入することも可能である。
【0112】
修飾されたＪ鎖は、修飾されたＪ鎖をコードする核酸を好適な原核宿主生物または真核宿主生物において発現させることによって、組換えＤＮＡ技術の周知の技法により作製することができる。
【0113】
修飾されたＪ鎖は、本明細書のどこか他に記載されているようなレシピエントの修飾されたヒトＩｇＭ抗体の重鎖及び軽鎖と同時発現させることもできる。レシピエント抗体は、修飾されたＪ鎖の組み込みに先立って、単一特異性、二重特異性または多重特異性であることができ、たとえば、単一特異性、二重特異性または多重特異性の修飾されたヒトＩｇＭ抗体であることができる。抗体を含む二重特異性または多重特異性のＩｇＭ抗体は、たとえば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１５／０５３８８７及び同ＷＯ２０１５／１２０４７４に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に明白に組み入れられる。
【0114】
特定の態様では、本明細書に記載されているような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球のような免疫エフェクター細胞に対して結合特異性を持つ修飾されたＪ鎖を含むことができる。特定の態様では、エフェクター細胞はＴ細胞であり、結合標的はＣＤ３である（以下で考察される）。エフェクター細胞、たとえば、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のようなエフェクターＴ細胞を活性化し、対象とする標的抗原を発現している細胞に向け直すことによって、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体は標的抗原に対して高いエフェクター反応を生じることができ、それによってさらに効能及び有効性を高める。特定の態様では、本明細書で提供されるような二重特異性の修飾されたヒトＩｇＭ抗体の修飾されたＪ鎖を介したＣＤ３への結合によるＴ細胞媒介細胞障害を引き出す能力は、対応する野生型ＩｇＭ抗体と比べてＣＤＣを減少させるＩｇＭ定常領域中の修飾によって影響を受けない。
【0115】
Ｔ細胞の場合、分化抗原群３（ＣＤ３）は歴史的にはＴ３複合体として知られる多量体タンパク質複合体であり、二量体の３つのペア（εγ、εδ、ζζ）として集合して機能する４つの異なるポリペプチド鎖（ε、γ、δ、ζ）で構成される。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と非共有結合性に結合するＴ細胞共受容体として役立つ。このＣＤ３複合体の成分、特にＣＤ３εは本明細書で提供されている二重特異性ＩｇＭまたはＩｇＡ結合分子の修飾されたＪ鎖にとって標的であることができる。
【0116】
特定の態様では、Ｊ鎖がＣＤ３εに結合するように修飾される場合、二重特異性の修飾されたヒトＩｇＭ抗体が提供される。
【0117】
特定の態様では、本明細書で提供されている修飾されたＪ鎖の抗ＣＤ３ε結合ドメインはｓｃＦｖである。抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、直接、またはｓｃＦｖとＪ鎖配列の間に導入される合成リンカー、たとえば、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）によって間接的にＪ鎖のＮ末端でもしくはその近傍で、またはＪ鎖のＣ末端でもしくはその近傍で融合することができる。特定の態様では、ｓｃＦｖはビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。特定の態様では、修飾されたＪ鎖は、ビシリズマブのＶＨと、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーと、ビシリズマブのＶＬとを含むｓｃＦｖを含む。
【0118】
特定の態様では、修飾されたＪ鎖は、１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してヒトＪ鎖のＮ末端に融合されたビシリズマブのｓｃＦｖを含み、本明細書ではＶ１５Ｊと呼ばれる修飾されたＪ鎖である。Ｖ１５Ｊはさらに、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体への輸送及び集合を容易にするためのシグナルペプチドをさらに含むことができる。成熟Ｖ１５Ｊタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９として提示され、１９アミノ酸の免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む前駆体型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として提示される。特定の態様では、修飾されたＪ鎖は、１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してヒトＪ鎖のＣ末端に融合されたビシリズマブのｓｃＦｖを含み、本明細書ではＪ１５Ｖと呼ばれる修飾されたＪ鎖である。Ｊ１５Ｖはさらに、本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体への輸送及び集合を容易にするためのシグナルペプチドを含むことができる。成熟Ｊ１５Ｖタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１として提示され、２２アミノ酸のヒトＪ鎖シグナルペプチドを含む前駆体型はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として提示される。特定の態様では、他のシグナルペプチドを使用することができる。修飾されたＪ鎖の発現、分泌及び本明細書で提供されるような修飾されたヒトＩｇＭ抗体への組み込みを容易にするための好適なシグナルペプチドの選択及び包含は、当業者の能力の十分に範囲内である。
【0119】
本開示は、特に指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用する。そのような技法は文献において完全に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
【0120】
抗体工学の一般的な原理はＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）において述べられている。タンパク質工学の一般的な原理はＲｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）において述べられている。抗体及び抗体・ハプテンの結合の一般的な原理はＮｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）において述べられている。さらに、当該技術で既知の且つ具体的に記載されていない免疫学における常法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）にあるように倣うことができる。
【0121】
免疫学の一般的な原理を述べている標準的な参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）；Ｒｏｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
【0122】
上記で引用されている参考文献すべてならびに本明細書で引用されている参考文献すべては全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0123】
以下の実施例は説明の目的で提供され、限定の目的で提供されるのではない。
【実施例0124】
実施例１：ＩｇＭ会合に対するＣμ３ドメインの突然変異の効果
Ｃμ３ドメイン中の単一部位突然変異であるＰ３１１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｐ３１３Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｐ３１１ＡとＰ３１３Ｓの双方（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｄ２９４Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、及びＳ２８３Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を伴う修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードするｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＭ＊０３のプラスミドバリアントを設計し、合成のために供給業者に提出した。野生型のまたは修飾されたＩｇＭ定常領域を含む野生型のまたは修飾されたヒト五量体または六量体のＩｇＭ抗体を発現することができる、且つＣＤ２０に特異的に結合することができる例となるプラスミド構築物は以下の方法によって作製した。
Ｃμ３ドメイン中の単一部位突然変異であるＰ３１１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｐ３１３Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｐ３１１ＡとＰ３１３Ｓの双方（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｄ２９４Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、及びＳ２８３Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を伴う修飾されたヒトＩｇＭ定常領域をコードするｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＭ＊０３のプラスミドバリアントを設計し、合成のために供給業者に提出した。野生型のまたは修飾されたＩｇＭ定常領域を含む野生型のまたは修飾されたヒト五量体または六量体のＩｇＭ抗体を発現することができる、且つＣＤ２０に特異的に結合することができる例となるプラスミド構築物は以下の方法によって作製した。
【0125】
重鎖及び軽鎖の発現ベクターへのサブクローニングのための５’末端でのＥｃｏＲＶ制限部位と３’末端でのＸｂａＩ制限部位とを持つ、１．５．３のＶＨ領域及びＶＬ領域（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及び１４）をコードするＤＮＡ断片は供給業者（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）によって合成された。合成されたＤＮＡ構築物を１μｇ／ｍｌでＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁した。ＤＮＡ試料（１μｇ）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化し、合成したＶＨ及びＶＬを電気泳動によってキャリアプラスミドＤＮＡから分離した。標準の分子生物学の技法によって、消化したＤＮＡを予め消化したプラスミドＤＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから入手できるｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＭ＊０３、またはＩｎｖｉｖｏｇｅｎから入手できるμ鎖について上記に記載された修飾された構築物であるカッパ鎖についてのｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ）にライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡでコンピテント細菌中に形質転換し、複数の選択性抗生物質と共にＬＢプレートに播いた。幾つかの細菌コロニーを取り出し、標準の分子生物学の技法によってＤＮＡ調製物を作製した。重鎖及び軽鎖をコードしている構築物は配列決定によって検証した。
【0126】
すべて常法に従って、ＩｇＭの重鎖と軽鎖をコードするまたは重鎖と軽鎖とＪ鎖をコードするプラスミド構築物をＣＨＯ細胞に同時形質移入し、Ｊ鎖の有無にかかわらず野生型または修飾されたＣＤ２０ ＩｇＭ抗体を発現している細胞を選択した。
【0127】
製造元のプロトコールに従ってＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＭ（Ｃａｔａｌｏｇ ２８９０．０５，ＢＡＣ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、細胞上清中に存在する抗体を回収した。たとえば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１６／１４１３０３において以前記載されたような会合を示すために非還元条件下での（図１及び図５）、または特定の二重特異性抗体のための還元条件下での（図５）ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて抗体を評価した。
【0128】
対照抗体（ＩｇＭ（純粋）、ＩｇＭ＋Ｊ（純粋）（野生型Ｊ鎖を持つＩｇＭ抗体）及びＩｇＭ（Ｊ鎖を欠いているＩｇＭ））、及びＩｇＭのＣμ３ドメイン突然変異体、Ｓ２８３Ｎ、Ｐ３１３Ｓ、Ｐ３１１Ａ、及びＤ２９４Ｇは抗体の会合を示すために非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて評価した。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ３～１２％ビス－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＢＮ１００３）上に負荷する前にＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を試料に加えた。ゲル電気泳動にはＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－酢酸塩ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＡ００４１）を用いた。色素の先頭がゲルの底に達するまでゲルを泳動させた。電気泳動の後、コロイド状ブルー染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＣ６０２５）でゲルを染色した。
【0129】
図１で示された結果は、ＩｇＭのＣμ３ドメイン突然変異体抗体が対照抗体と同様に会合することを実証している。
【0130】
対照の二重特異性抗体（１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５Ｊ）及び１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５ＪのＣμ３ドメイン突然変異体であるＰ３１３Ｓ、Ｐ３１１Ａ、及びＰ３１１Ａ／Ｐ３１３Ｓ二重突然変異体は、非還元（「ハイブリッド」）条件下及び抗体の会合を示すために還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて評価した。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ３～１２％ビス－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＢＮ１００３）上に負荷する前にＮｕＰａｇｅＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を試料に加えた。ゲル電気泳動にはＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－酢酸塩ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＡ００４１）を用いた。色素の先頭がゲルの底に達するまでゲルを泳動させた。電気泳動の後、コロイド状ブルー染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＣ６０２５）でゲルを染色した。
【0131】
図５で示された結果は、二重特異性ＩｇＭのＣμ３ドメイン突然変異体抗体が対照抗体と同様に会合することを実証している。
【0132】
実施例２：ＩｇＭ Ｃμ３突然変異体の補体依存性細胞障害活性
ＣＤ２０を発現しているＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９６）細胞株はＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから入手した。５０，０００個の細胞を９６穴プレートに播いた。細胞を野生型対照抗体、１．５．３ ＩｇＭ、１．５．３ ＩｇＧ及び１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、ならびにＩｇＭのＣμ３ドメイン単一突然変異体（Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｄ２９４Ｇ、及びＳ２８３Ｎ）で処理した。１０％の最終濃度でヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を抗体処理した細胞に加えた。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２）を各ウェル中に存在する培養用培地の体積と等しい体積で加えた。プレートを２分間振盪し、室温で１０分間インキュベートし、ルミノメーターで発光を測定した。
ＣＤ２０を発現しているＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９６）細胞株はＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから入手した。５０，０００個の細胞を９６穴プレートに播いた。細胞を野生型対照抗体、１．５．３ ＩｇＭ、１．５．３ ＩｇＧ及び１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、ならびにＩｇＭのＣμ３ドメイン単一突然変異体（Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１３Ｓ、Ｄ２９４Ｇ、及びＳ２８３Ｎ）で処理した。１０％の最終濃度でヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を抗体処理した細胞に加えた。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２）を各ウェル中に存在する培養用培地の体積と等しい体積で加えた。プレートを２分間振盪し、室温で１０分間インキュベートし、ルミノメーターで発光を測定した。
【0133】
結果を図２に示す。２つのＩｇＭのＣμ３単一突然変異体Ｐ３１１Ａ及びＰ３１３Ｓは補体の存在下で対照の１．５．３ ＩｇＭ抗体よりもほぼ５０％少ない細胞殺滅を示した。ＩｇＭのＣμ３突然変異体Ｓ２８３Ｎ及びＤ２９４Ｇは対照の野生型ＩｇＭと同様の補体による細胞殺滅を示した。補体の非存在下では、最少の細胞殺滅が、１．５．３ ＩｇＧ抗体及び１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ抗体について観察された。
【0134】
実施例３：二重特異性抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３ ＩｇＭ Ｃμ３突然変異体の補体依存性細胞障害
ＣＤ２０を発現しているＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９６）細胞株はＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから入手した。５０，０００個の細胞を９６穴プレートに播いた。細胞を対照抗体、１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、及び二重特異性ＩｇＭのＣμ３ドメイン突然変異体（Ｐ３１１Ａ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、Ｄ２９４Ｇ×Ｖ１５Ｊ、及びＳ２８３Ｎ×Ｖ１５Ｊ）で処理した。抗体はすべて、以前記載されたように生成され、発現させたＣＤ２０及びＣＤ３について二重特異性のＪ鎖を含んだ。ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１６／１４１３０３を参照のこと。１０％の最終濃度でヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を抗体で処理した細胞に加えた。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２）を各ウェル中に存在する培養用培地の体積と等しい体積で加えた。プレートを２分間振盪し、室温で１０分間インキュベートし、ルミノメーターで発光を測定した。
ＣＤ２０を発現しているＲａｍｏｓ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９６）細胞株はＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから入手した。５０，０００個の細胞を９６穴プレートに播いた。細胞を対照抗体、１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ、及び二重特異性ＩｇＭのＣμ３ドメイン突然変異体（Ｐ３１１Ａ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、Ｄ２９４Ｇ×Ｖ１５Ｊ、及びＳ２８３Ｎ×Ｖ１５Ｊ）で処理した。抗体はすべて、以前記載されたように生成され、発現させたＣＤ２０及びＣＤ３について二重特異性のＪ鎖を含んだ。ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１６／１４１３０３を参照のこと。１０％の最終濃度でヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号Ａ１１３）を抗体で処理した細胞に加えた。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２）を各ウェル中に存在する培養用培地の体積と等しい体積で加えた。プレートを２分間振盪し、室温で１０分間インキュベートし、ルミノメーターで発光を測定した。
【0135】
結果を図３及び図６に示す。二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体Ｐ３１１Ａ及びＰ３１３Ｓは補体による最大半分のＲａｍｏｓ細胞殺滅を示した一方で、対照１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ及び二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体Ｄ２９４Ｇ及びＳ２８３Ｎは補体の存在下でほぼ最大の補体依存性細胞障害（９０～１００％有効）を達成した。図６に示すアッセイ法では、二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体Ｐ３１１Ａは補体による約４６％の最大殺滅を示した（ＥＣ５０は不明確であった）一方で、Ｐ３１３Ｓ突然変異体は補体による３１％の最大殺滅を示した（ＥＣ５０は２４３ｐＭであった）。補体媒介殺滅は二重突然変異体Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３Ｓでは本質的に消失した（図６、表２も参照のこと）。
【0136】
実施例４：二重特異性抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３ ＩｇＭ Ｃμ３突然変異体のＴ細胞活性化潜在能力
操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７６４０３）及びＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補完したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。白色３８４穴アッセイプレートにおける２０μＬ中で、連続希釈した二重特異性１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ抗体及び二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体、Ｄ２９４Ｇ×Ｖ１５Ｊ、Ｓ２８３Ｎ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１１Ａ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、及び１．５．３ ＩｇＭ（Ｊ鎖なし）を７５００個のＲＰＭＩ８２２６細胞と共に３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。操作したＪｕｒｋａｔ細胞（２５０００個）を混合物に加え、４０μＬの最終体積とした。混合物を３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。次いで、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標））を含有する２０μＬの溶解緩衝液と細胞混合物を混合し、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。光の出力をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーによって測定した。ＥＣ５０はＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて４パラメーター曲線適合によって決定した。
操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７６４０３）及びＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補完したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。白色３８４穴アッセイプレートにおける２０μＬ中で、連続希釈した二重特異性１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ抗体及び二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体、Ｄ２９４Ｇ×Ｖ１５Ｊ、Ｓ２８３Ｎ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１１Ａ×Ｖ１５Ｊ、Ｐ３１１Ａ／Ｐ３１３Ｓ×Ｖ１５Ｊ、及び１．５．３ ＩｇＭ（Ｊ鎖なし）を７５００個のＲＰＭＩ８２２６細胞と共に３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。操作したＪｕｒｋａｔ細胞（２５０００個）を混合物に加え、４０μＬの最終体積とした。混合物を３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。次いで、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標））を含有する２０μＬの溶解緩衝液と細胞混合物を混合し、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。光の出力をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーによって測定した。ＥＣ５０はＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて４パラメーター曲線適合によって決定した。
【0137】
結果を図４及び図７に示す。二重特異性ＩｇＭのＣμ３突然変異体はすべて、二重特異性の対照抗体（１．５．３ ＩｇＭ×Ｖ１５Ｊ）と同様に効果的にＴ細胞を活性化した。二重特異性Ｊ鎖を欠くＩｇＭ対照（１．５．３ ＩｇＭ）ではＴ細胞の活性化は観察されなかった。
【0138】
実施例５：追加の二重特異性抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３ ＩｇＭ Ｃμ３突然変異体の補体依存性細胞障害
Ｃμ３突然変異のＣＤＣ活性に対する効果をさらに評価するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２までの各位置で計画的な単一アミノ酸Ａｌａ置換を行った。これら突然変異体ＩｇＭ定常領域のそれぞれを実施例１に記載されているような１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５ＪのＣμ３ドメイン突然変異体として構築し、実施例３に記載されているようなＣＤＣ活性及び実施例４に記載されているようなＴ細胞の活性化について調べた。Ｐ３１１及びＰ３１３での以前評価された突然変異に加えて、Ｌ３１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）及びＫ３１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）における１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５ＪのＣμ３ドメインでのＡｌａ置換は、Ｔ細胞の活性化に有意に影響を及ぼすことなく（データは示さず）、図８及び表２で示すようにＥＣ５０の増加と共にＣＤＣ活性を穏やかに減少させた。
Ｃμ３突然変異のＣＤＣ活性に対する効果をさらに評価するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＴ３０２からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＫ３２２までの各位置で計画的な単一アミノ酸Ａｌａ置換を行った。これら突然変異体ＩｇＭ定常領域のそれぞれを実施例１に記載されているような１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５ＪのＣμ３ドメイン突然変異体として構築し、実施例３に記載されているようなＣＤＣ活性及び実施例４に記載されているようなＴ細胞の活性化について調べた。Ｐ３１１及びＰ３１３での以前評価された突然変異に加えて、Ｌ３１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）及びＫ３１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）における１．５．３ ＩｇＭ Ｖ１５ＪのＣμ３ドメインでのＡｌａ置換は、Ｔ細胞の活性化に有意に影響を及ぼすことなく（データは示さず）、図８及び表２で示すようにＥＣ５０の増加と共にＣＤＣ活性を穏やかに減少させた。
【0139】
Ｌ３１０位、Ｐ３１１位、Ｐ３１３位、及びＫ３１５位のうちの２つにおける二重置換の種々の組み合わせも実施例１に記載されているように構築し、実施例３に記載されているようにＣＤＣ活性について調べた。これらには、二重突然変異体Ｌ３１０Ａ、Ｋ３１５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、Ｌ３１０Ｓ、Ｋ３１５Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、Ｌ３１０Ａ、Ｐ３１３Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、Ｐ３１１Ａ、Ｋ３１５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、及びＰ３１３Ｓ、Ｋ３１５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）が含まれた。野生型ヒトＩｇＭと比べたこれら二重突然変異体のＣＤＣ活性を表２に要約する。Ｌ３１０Ａ、Ｋ３１５Ａ二重突然変異体は単一突然変異体のいずれかと比べてＣＤＣ活性における大きな減少を示した。
【0140】
Ｌ３１０位及びＫ３１５位における追加のアミノ酸置換を評価してＣＤＣ活性に対する荷電アミノ酸または極性アミノ酸の効果を判定した。Ｌ３１０を負に荷電したアスパラギン酸（Ｄ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で置換し、Ｋ３１５をアスパラギン酸（Ｄ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）または極性アミノ酸グルタミン（Ｑ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）で置換した。これらの突然変異体を実施例３に記載されているようにＣＤＣ活性について調べた。結果を図９Ａ及び図９Ｂ及び表２に示す。３１０位または３１５位における負に荷電したアミノ酸の導入は中性Ａｌａの置換よりも大きくＣＤＣ活性を破壊した。
【0141】
（表２）ヒトＩｇＭ Ｃμ３突然変異体のＣＤＣ活性
【0142】
（表３）配列
【0143】
本開示の幅広さ及び範囲は、上述の例となる実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲及びその同等物に従ってのみ定義されるべきである。
【0144】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> IGM BIOSCIENCES, INC.
<120> MODIFIED HUMAN IGM CONSTANT REGIONS FOR MODULATION OF
COMPLEMENT-DEPENDENT CYTOLYSIS EFFECTOR FUNCTION
<150> US 62/483,087
<151> 2017-04-07
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 453
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
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Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln
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Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
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210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
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Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
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130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
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Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln
180 185 190
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Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
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Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
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Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Ala Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
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Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
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420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450
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<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 3
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
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Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln
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195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Ser Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450
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<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
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50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
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Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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405 410 415
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435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
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1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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35 40 45
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Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
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<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Asn Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
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450
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<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 7
Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
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85 90 95
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130 135 140
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145 150 155
<210> 8
<211> 412
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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65 70 75 80
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
195 200 205
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
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260 265 270
Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys
275 280 285
Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro
290 295 300
Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn
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Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe
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Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val
340 345 350
Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp
355 360 365
Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys
370 375 380
Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val
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Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
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Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
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Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
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260 265 270
Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp
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Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu
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Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His
305 310 315 320
Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp
325 330 335
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
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Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
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Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
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Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro
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Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
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Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
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Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Thr Met
195 200 205
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr
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Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys Asp
225 230 235 240
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
245 250 255
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
260 265 270
Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
275 280 285
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
305 310 315 320
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
325 330 335
Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
340 345 350
Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
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Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 11
Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala
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Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp
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Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu
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Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His
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Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
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Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
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Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr
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260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
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Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
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Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
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<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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<210> 18
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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450
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<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 25
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 27
Asp Ala Pro Ser Pro Leu Lys Gln
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 28
Asp Leu Ala Ser Pro Leu Lys Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 29
Asp Leu Pro Ser Ser Leu Lys Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Asp Leu Pro Ser Pro Leu Ala Gln
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 31
Asp Asp Pro Ser Pro Leu Lys Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 32
Asp Leu Pro Ser Pro Leu Asp Gln
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 34
Asp Ala Pro Ser Pro Leu Ala Gln
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Asp Ser Pro Ser Pro Leu Ser Gln
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 36
Asp Ala Ala Ser Pro Leu Lys Gln
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 37
Asp Ala Pro Ser Ser Leu Lys Gln
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 38
Asp Leu Ala Ser Pro Leu Ala Gln
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 39
Asp Leu Pro Ser Ser Leu Ala Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Asp Leu Ala Ser Ser Leu Lys Gln
1 5
SEQUENCE LISTING
<110> IGM BIOSCIENCES, INC.
<120> MODIFIED HUMAN IGM CONSTANT REGIONS FOR MODULATION OF
COMPLEMENT-DEPENDENT CYTOLYSIS EFFECTOR FUNCTION
<150> US 62/483,087
<151> 2017-04-07
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 453
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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<220>
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<220>
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 9
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
325 330 335
Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
340 345 350
Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
355 360 365
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
370 375 380
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
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Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
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polypeptide
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Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp
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Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu
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Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
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340 345 350
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
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peptide
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<220>
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polypeptide
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
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100 105 110
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 21
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Asp Leu Ala Ser Ser Leu Lys Gln
1 5
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願の明細書に記載される発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】