特開 2023-85924 １，４－ジオキサン分解菌、１，４－ジオキサン分解剤、１，４－ジオキサン分解剤の製造方法、及び１，４－ジオキサンの処理方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023085924

(43)【公開日】2023-06-21

(54)【発明の名称】１，４－ジオキサン分解菌、１，４－ジオキサン分解剤、１，４－ジオキサン分解剤の製造方法、及び１，４－ジオキサンの処理方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20230614BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20230614BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12N1/00 R ZNA

C12N1/20 F

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021200244

(22)【出願日】2021-12-09

(71)【出願人】

【識別番号】000000549

【氏名又は名称】株式会社大林組

(71)【出願人】

【識別番号】500433225

【氏名又は名称】学校法人中部大学

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(72)【発明者】

【氏名】大島 義徳

(72)【発明者】

【氏名】西田 憲司

(72)【発明者】

【氏名】福武 健一

(72)【発明者】

【氏名】森 一星

(72)【発明者】

【氏名】福田 雅夫

(72)【発明者】

【氏名】澤入 駿哉

(72)【発明者】

【氏名】野口 泰良

(72)【発明者】

【氏名】宮田 茂

(72)【発明者】

【氏名】倉根 隆一郎

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA45X

4B065BA22

4B065CA56

(57)【要約】

【課題】１，４－ジオキサン分解速度に優れた新規な１，４－ジオキサン分解菌を提供する。
【解決手段】１，４－ジオキサン分解菌は、受託番号NITE P-03327として寄託された３ｅ株である。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号NITE P-03327として寄託された３ｅ株である１，４－ジオキサン分解菌。

【請求項2】

請求項１に記載の１，４－ジオキサン分解菌を含有する１，４－ジオキサン分解剤。

【請求項3】

請求項２に記載の１，４－ジオキサン分解剤の製造方法であって、
環状エーテル又はグリコールの存在下にて、１，４－ジオキサン分解菌の培養を行う培養工程を備えている１，４－ジオキサン分解剤の製造方法。

【請求項4】

請求項１に記載の１，４－ジオキサン分解菌と１，４－ジオキサンとを接触させる接触工程を有する１，４－ジオキサンの処理方法。

【請求項5】

１，４－ブタンジオールの存在下にて、前記接触工程を行う請求項４に記載の１，４－ジオキサンの処理方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１，４－ジオキサン分解菌、１，４－ジオキサン分解剤、１，４－ジオキサン分解剤の製造方法、及び１，４－ジオキサンの処理方法に関する。

【背景技術】

【0002】

１，４－ジオキサンは、化学工場等で、有機合成反応用の溶媒等として使用される難分解性物質である。１，４－ジオキサンは、有害性が示唆されることから環境基準値が設定されており、汚染水や汚染土壌等の浄化が求められている。１，４－ジオキサンを含む汚染水や汚染土壌等の浄化を行う方法として、促進酸化法といった化学的分解手法が知られている。特許文献１、２に記載されるように、促進酸化法とは、オゾン処理、オゾン処理と過酸化水素処理との組み合わせ、オゾン処理と紫外線処理との組み合わせ等によって生成したラジカルにより、汚染土壌や汚染水中の１，４－ジオキサンを酸化分解する手法である。

【0003】

しかし、促進酸化法で用いられる薬剤は比較的高価であり、オゾン発生装置や紫外線照射装置は運転に大量の電力を必要とする。また、汚染水や汚染土壌等には促進酸化法の反応を阻害する物質や、分解対象として競合的にラジカルを消費する物質が含まれる場合が多く、膨大な量の薬剤や電力が必要になる。そのため、コスト的には不利である。さらに、紫外線処理と組み合わせる手法は、紫外線を透過しない汚染土壌や、濁分を含む汚染水への適用が困難である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００５－１０３４０１号公報

【特許文献2】特開２００５－５８８５４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

一方、汚染水等の浄化を行う方法として、微生物分解法が知られている。１，４－ジオキサン分解活性を有する微生物と汚染水等とを接触させることで、微生物が１，４－ジオキサンを経時的に分解する。微生物にとっての好適な環境下で１，４－ジオキサンと接触させると、選択的に効率よく１，４－ジオキサンを分解するため、コスト的に有利である。

【0006】

本発明は、１，４－ジオキサン分解能に優れた新規な微生物を発見したことに基づくものであり、新規な１，４－ジオキサン分解菌、１，４－ジオキサン分解剤、１，４－ジオキサン分解剤の製造方法、及び１，４－ジオキサンの処理方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するため、本発明の１，４－ジオキサン分解菌は、受託番号NITE P-03327として寄託された３ｅ株である。
上記の課題を解決するため、本発明の１，４－ジオキサン分解剤は、上記１，４－ジオキサン分解菌を含有する。

【0008】

上記の課題を解決するため、本発明の１，４－ジオキサン分解剤の製造方法は、環状エーテル又はグリコールの存在下にて、１，４－ジオキサン分解菌の培養を行う培養工程を備えている。

【0009】

上記課題を解決するため、本発明の１，４－ジオキサンの処理方法は、上記１，４－ジオキサン分解菌と１，４－ジオキサンとを接触させる接触工程を有する。
上記の構成において、１，４－ブタンジオールの存在下にて、前記接触工程を行うことが好ましい。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、新規な１，４－ジオキサン分解菌により、汚染水等に含まれる１，４－ジオキセンを低コストで処理することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含む培地での３ｅ株の増殖曲線を示す図である。

【図2】テトラヒドロピランを唯一の炭素源として含む培地での３ｅ株の増殖曲線を示す図である。

【図3】３ｅ株の１，４－ジオキサン分解活性について示す図である。

【図4】３ｅ株の１，４－ジオキサン分解活性について示す図である。

【図5】３ｅ株の１，４－ジオキサン分解活性について示す図である。

【図6】２１９株の１，４－ジオキサン分解活性について示す図である。

【図7】接触工程での１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示す図であり、（ａ）は、１，４－ジオキサン単独下、（ｂ）は１，４－ブタンジオール共存下、（ｃ）は、テトラヒドロフラン共存下での１，４－ジオキサン濃度の経時変化である。

【図8】１，４－ジオキサン分解剤として用いる３ｅ株培養時の環状エーテル、グリコールの影響について示す図であって、その後の接触工程での１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示す図である。（ａ）は、富栄養培地のＬＢ培地で培養した培養液を接触した場合、（ｂ）は、１，４－ブタンジオールを添加したＬＢ培地で培養した培養液を接触した場合、（ｃ）は、テトラヒドロフランを添加したＬＢ培地で培養した培養液を接触した場合の１，４－ジオキサン濃度の経時変化である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、本発明の実施の形態について説明する。
＜１，４－ジオキサン分解菌３ｅ株について＞
本発明の１，４－ジオキサン分解菌は、化学工場近郊の河川水から単離した。単離した１，４－ジオキサン分解菌を、３ｅ株と命名した。３ｅ株は、国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０２０年１１月２７日付けで寄託されている。その受託番号はNITE P-03327である。

【0013】

単離した３ｅ株を栄養平板培地で生育させて得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出は、栄養平板培地で生育させた３ｅ株から３つのコロニーを選択して行った。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅して解析した。プライマーは、バクテリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のほぼ全長を増幅することのできる２７Ｆ（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；配列番号１）及び１４９２Ｒ（TACGGHTACCTTGTTACGACTT；配列番号２）を使用した。３つのコロニーから、それぞれ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を得た。３つの部分塩基配列を、配列番号３、配列番号４、配列番号５として配列表に示した。

【0014】

３ｅ株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列に対して米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）16s ribosomal RNA sequencesのデータベースにおけるＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索を行った。その結果、配列番号５の塩基配列は、Rhodococcus ruberの基準株であるDSM43338株と１００％（１３７１／１３７１）の相同性を示した。配列番号３、４の塩基配列は、Rhodococcus ruberの基準株であるDSM43338株と９９．９３％（１３７１／１３７２）の相同性を示した。３ｅ株は、Rhodococcus ruber（以下、R.ruberという。）に属する菌であることが推定された。

【0015】

３ｅ株は、環状炭化水素の炭素を酸素で置換した構造を持つ環状エーテルを分解する活性を有しており、環状エーテルを炭素源として生育可能である。環状エーテルとしては、１，４－ジオキサン以外にも、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等が挙げられる。また、３ｅ株は、１，４－ブタンジオール、エチレングリコール等のグリコールを分解する活性を有しており、グリコールを炭素源としても生育可能である。

【0016】

３ｅ株は、１，４－ブタンジオールのようなグリコールの共存下において、１，４－ジオキサン分解活性が向上する。一方、テトラヒドロフランの共存下において、１，４－ジオキサン分解活性が一時的に抑制される。

【0017】

R.ruberに属する１，４－ジオキサン分解菌として、R.ruber Ｔ１株、Ｔ５株（以下、Ｔ１株、Ｔ５株という。）が知られている。Ｔ１株、Ｔ５株については、非特許文献であるJournal of Water and Environmental Technology Vol.11,No.1,P.11-19,(2013)に記載されている。Ｔ１株、Ｔ５株はいずれも、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源とする培地では生育することができない。Ｔ１株、Ｔ５株はいずれも、テトラヒドロフラン等の１，４－ジオキサン以外の環状エーテルや、１，４－ブタンジオール等のグリコールの共存下において、１，４－ジオキサンを分解することのできるいわゆる共代謝菌に属する。一方、３ｅ株は、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として資化することができる資化性菌である。Ｔ１株、Ｔ５株とは明らかに異なる菌である。

【0018】

R.ruberに属し、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として資化することのできる資化性１，４－ジオキサン分解菌として、R.ruber ２１９株（以下、２１９株という。）が知られている。２１９株については、非特許文献であるApplied Microbiology and Biotechnology Vol.36,No.1,p120-123,(1991)に記載されている。３ｅ株は、２１９株と同様にR.ruber属の資化性菌であるが、２１９株に比べて顕著に高い１，４－ジオキサン分解活性を有している。

【0019】

＜１，４－ジオキサン分解剤について＞
３ｅ株は、１，４－ジオキサン分解剤として利用することができる。
１，４－ジオキサン分解剤の形態は、特に限定されるものではないが、保管の容易性や使いやすさの点から、液状又は粉末状であることが好ましい。具体的な形態としては、３ｅ株の培養液、培養液を濃縮した濃縮液、培養液を遠心分離して得られた菌体、培養液を凍結保存して得られた菌体、培養液を凍結乾燥して得られた菌体、菌体を固定化した固定化担体等が挙げられる。また、粉末状の菌体を、各種多孔質物質等と混合して吸着させて製剤化してもよい。こうした１，４－ジオキサン分解剤を、河川水、地下水、工場排水、下水等の汚染水や、汚染土壌等と接触させることによって、汚染水や汚染土壌等に含まれる１，４－ジオキサンを分解処理することができる。

【0020】

＜１，４－ジオキサン分解剤の製造方法について＞
１，４－ジオキサン分解剤の製造方法は、３ｅ株を培養して必要量の菌体を得る培養工程、必要に応じて、菌体を含む培養液等を後処理する後処理工程を有する。

【0021】

培養工程では、３ｅ株を、液体培地或いは平板培地にて、１５～３５℃の温度範囲で半日～１週間程度培養することが好ましい。例えば、画線培養した３ｅ株のシングルコロニーを掻きとって液体培地に懸濁し、３０℃で２日程度振とう培養する。

【0022】

培養工程で使用する培地としては、例えば、R.ruberに属する微生物が生育可能な培地を適宜選択して使用することができる。具体的には、Ｒ２Ａ培地、Ｗ培地、ＬＢ培地等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0023】

培養工程では、これら公知の培地に、環状エーテルやグリコールを適宜添加して行うことが好ましい。環状エーテルとしては、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等が挙げられる。グリコールとしては、１，４－ブタンジオール、エチレングリコール等が挙げられる。３ｅ株の培養液中に環状エーテルやグリコールが存在していると、１，４－ジオキサン分解酵素の酵素誘導がかかり、１，４－ジオキサンを処理する際の接触工程での１，４－ジオキサン分解活性が向上する。

【0024】

培養工程での培地中の環状エーテルやグリコールの濃度は、数～数十ｍｇ／Ｌ程度に調製することが好ましい。
後処理工程では、例えば、３ｅ株の培養液等を濃縮したり、凍結保存したり、凍結乾燥したりする。また、遠心分離等して得られた菌体を、適宜の担体に固定化してもよい。

【0025】

＜１，４－ジオキサンの処理方法について＞
１，４－ジオキサンを処理する方法は、３ｅ株と１，４－ジオキサンとを接触させる接触工程を有する。

【0026】

例えば、地盤中から揚水した１，４－ジオキサン汚染地下水を処理する場合、曝気槽内に汚染地下水を供給して、上記各形態の１，４－ジオキサン分解剤を曝気槽内に適宜の割合で混入させる。これにより、３ｅ株と１，４－ジオキサンとを接触させる。接触工程は、１５～３５℃の温度範囲で、１～７日程度行うことが好ましい。接触工程は、連続式で行ってもバッチ式で行ってもよい。

【0027】

汚染地下水には、おおよそ、数十ｍｇ／Ｌ程度～地下水環境基準値の１，４－ジオキサンが含まれるが、接触工程によって、１，４－ジオキサン濃度を地下水環境基準値である０．０５ｍｇ／Ｌ程度にまで低下させることが可能である。接触工程によって１，４－ジオキサンが分解処理された汚染地下水は、処理水として元の地盤中に復水することが可能となる。

【0028】

接触工程では、１，４－ジオキサン分解剤とともに、環状エーテルやグリコールを適宜の割合で混入させることが好ましい。環状エーテルとしては、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等が挙げられる。グリコールとしては、１，４－ブタンジオール、エチレングリコール等が挙げられる。１，４－ブタンジオールが存在していると、３ｅ株の１，４－ジオキサン分解速度が速くなる。また、テトラヒドロフランが存在していると、１，４－ジオキサンより先にテトラヒドロフランの分解が進む傾向にあるが、テトラヒドロフラン分解後の１，４－ジオキサン分解速度は、１，４－ブタンジオールの共存下より速くなる傾向がある。

【0029】

本実施形態によれば、次のような効果を得ることができる。
（１）１，４－ジオキサン分解菌は、受託番号NITE P-03327として寄託された３ｅ株である。また、１，４－ジオキサン分解剤は、１，４－ジオキサン分解菌である３ｅ株を含有している。

【0030】

そのため、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として増殖可能である３ｅ株により、１，４－ジオキサンを分解することができる。汚染土壌や汚染水に酸化剤を添加することによって、１，４－ジオキサンを分解する促進酸化法に比べて、低コストで１，４－ジオキサンを分解処理することができる。また、従来知られている２１９株より高い分解活性で、１，４－ジオキサンを効果的に分解することができる。

【0031】

（２）１，４－ジオキサンの処理方法は、１，４－ジオキサン分解菌である３ｅ株と１，４－ジオキサンとを接触させる接触工程を有している。そのため、汚染水、汚染土壌中の１，４－ジオキサンを、促進酸化法より低コストで、自然環境に放出可能なレベルにまで分解して処理することができる。また、実際の１，４－ジオキサン汚染現場では比較的低濃度の汚染が散見されるが、３ｅ株は１，４－ジオキサン濃度が比較的低濃度の状況でも高い１，４－ジオキサン分解活性を有する。そのため、実際の汚染現場への適用性が高い。

【0032】

（３）１，４－ジオキサン分解剤の製造方法は、環状エーテル又はグリコールの存在下にて、１，４－ジオキサン分解菌の培養を行う培養工程を備えている。そのため、環状エーテル又はグリコールにより１，４－ジオキサン分解酵素の酵素誘導がかかり、１，４－ジオキサン分解剤を１，４－ジオキサンと接触させる接触工程での１，４－ジオキサン分解活性が向上する。

【0033】

（４）１，４－ジオキサンの処理方法は、１，４－ブタンジオールの存在下にて接触工程を行う。そのため、３ｅ株の１，４－ジオキサン分解速度を早くすることができて、１，４－ジオキサンを効率的に分解することができる。

【実施例0034】

（実施例１；１，４－ジオキサン分解菌の単離）
炭素源として１，４－ブタンジオールを添加したＷ培地１０ｍｌに、化学工場近郊で採取した河川水を加えて長期馴養を行った。１，４－ブタンジオールは、８ｍｇ／Ｌとなるよう添加した。馴養開始から３週間経過後、１ｍｌの馴養液を集積培養に供試した。

【0035】

集積培養では、２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを含むＷ培地９ｍｌに１ｍｌの馴養液を添加し、３０℃で３日から４日間培養して１回目の培養を行った。２回目以降は、培養液５ｍｌを２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを含むＷ培地５ｍｌに添加して３０℃で３日から４日間培養することを、１週間に２回の頻度で繰り返した。１０回目の培養を行ったところで集積培養を終了し、培養液を凍結保存した。

【0036】

集積培養液における１，４－ジオキサン分解菌の存在は、凍結保存した集積培養液の一部を１，４－ジオキサン存在下で培養し、１，４－ジオキサンの減少を調べて確認した。凍結保存した集積培養液を一白金耳採取し、２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを含むＷ培地１０ｍｌに添加して３０℃で１週間培養した後、遠心分離機にて細菌細胞を回収した。回収した細菌細胞を１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンを含むＷ培地１ｍｌに懸濁し、２０ｍｌ容量のバイアルに密封して３０℃で２０時間培養した後、気相における１，４－ジオキサン濃度を測定した。１，４－ジオキサン濃度の測定は、以下の条件のガスクロマトグラフィーにより行った。

【0037】

使用カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ，ＤＢ－６２４カラム、長さ３０ｍ×内径３２０μｍ
昇温条件；４０℃、１ｍｉｎ→５℃／ｍｉｎ→１５０℃、５ｍｉｎ
ＦＩＤ温度；３００℃
流量；４００ｍｌ／ｍｉｎ
注入量；２．５ｍｌ
１，４－ジオキサン分解菌は、上記の１，４－ブタンジオール培養液からの画線培養により単離した。凍結保存した集積培養液を一白金耳採取し、２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを含むＷ培地１０ｍｌに添加して３０℃で１週間培養した後、Ｒ２Ａ培地に１５ｇ／Ｌの寒天を加えたＲ２Ａ平板培地上に培養液を画線接種し、３０℃、３～４日培養した。生じたコロニーを色や形状等から種類ごとに選んで１，４－ジオキサンの分解活性を調べた。コロニーの一部を２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを含むＷ培地１０ｍｌに接種し、上記の通り、１週間培養した細菌細胞を１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンを含むＷ培地１ｍｌに懸濁して２０時間培養後、気相における１，４－ジオキサン濃度を測定した。１，４－ジオキサン分解活性を示したコロニーについて更に画線培養をおこなって、１，４－ジオキサン分解菌３ｅ株を単離した。

【0038】

単離した３ｅ株をＲ２Ａ平板培地で生育させ、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出して、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ゲノムＤＮＡの抽出は、上述のとおり、Ｒ２Ａ平板培地で生育させた３ｅ株から３つのコロニーを選択して行った。３つのコロニーから得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を、配列番号３、配列番号４、配列番号５として配列表に示した。

【0039】

（実施例２；３ｅ株の基質代謝能の評価）
３ｅ株の基質代謝能ならびに薬剤等・重金属等への耐性を、Biolog GEN III Microplate（登録商標）を使用して評価した。その結果を表１に示した。表中のウェル番号は、Biolog GEN III Microplate（登録商標）のウェル番号に対応する。評価結果は、ウェル中で３ｅ株による当該基質の代謝や生育に伴う酸化還元反応試薬の発色が確認できたものを「＋」、確認できなかったものを「－」として示している。

【0040】

【表1】

（実施例３；３ｅ株が１，４－ジオキサン資化性菌であることの確認）
１，４－ジオキサンを唯一の炭素源としてＷ平板培地で生育させた３ｅ株のシングルコロニーを掻きとって、１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含むＷ培地に懸濁して菌液を調製した。菌液を３０℃で１週間振とう培養して前培養液を得た。前培養液を、上記と同様のＷ培地に植え継いで、さらに３０℃で１週間振とう培養して培養液を得た。振とう培養中の培養液の波長６００ｎｍでのＯＤを、紫外可視分光光度計（ベックマン・コールター株式会社製、ＤＵ－８００）により２日毎に測定して、３ｅ株の増殖曲線を得た。

【0041】

１，４－ジオキサン存在下での３ｅ株の増殖曲線を図１に示した。３ｅ株は、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として生育可能な資化性菌であることが確認できた。
（実施例４；３ｅ株が他の環状エーテルを炭素源として増殖可能であることの確認）
テトラヒドロピランを唯一の炭素源として実施例３と同様に、Ｗ平板培地で生育させた３ｅ株のコロニーを２０ｍｇ／Ｌのテトラヒドロピランを含むＷ培地に接種して前培養液を得た。前培養液を２０ｍｇ／Ｌのテトラヒドロピランを含むＷ培地に接種して、３０℃で１週間振とう培養した。振とう培養中の培養液の波長６００ｎｍでのＯＤを、実施例３と同様に測定して、３ｅ株の増殖曲線を得た。

【0042】

テトラヒドロピラン存在下での３ｅ株の増殖曲線を図２に示した。３ｅ株は、テトラヒドロピランを唯一の炭素源として生育可能であることが確認できた。テトラヒドロピランは、炭素５つと酸素１つの飽和六員環からなる有機化合物であり、炭素４つと酸素１つの飽和五員環であるテトラヒドロフランより、炭素４つと酸素２つの飽和六員環である１，４－ジオキサンに形状的に近い。

【0043】

しかし、実施例３での４日後のＯＤ６００が約０．０１５であったのに対し、実施例４での４日後のＯＤ６００は約０．００４であった。１，４－ジオキサン存在下での３ｅ株の初期の増殖速度は、テトラヒドロピラン存在下での増殖速度よりも速いことが確認できた。一方、１，４－ジオキサン存在下では、３ｅ株の増殖はＯＤ６００＝０．０１６で留まり、最終的な増殖量はテトラヒドロピランが１，４－ジオキサンを上回ることが予想された。

【0044】

また、図示はしていないが、テトラヒドロフランを炭素源として増殖可能であるか、又はエチレングリコールを炭素源として増殖可能であるかについても確認した。炭素源となる基質をシャーレのフタに滴下して気体として供給し、３ｅ株をＷ平板培地に画線接種して３０℃で培養した。基質を供給しない場合を対照として、コロニーの大きさを比較して生育能を判定した。

【0045】

テトラヒドロフラン存在下では、テトラヒドロピランより劣るものの明確な増殖が示唆された。また、エチレングリコール存在下では、テトラヒドロピラン存在下を超える増殖が示唆された。

【0046】

（実施例５；３ｅ株の１，４－ジオキサン分解活性の評価）
画線培養した１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含むＷ平板培地からシングルコロニーを掻きとってＲ２Ａ培地に懸濁し、３０℃、１８時間振とう培養して前培養液を得た。前培養液を遠心分離（１３５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、２４℃）して上清を除いた後、生理食塩水に菌体を懸濁して菌液を得た。Ｒ２Ａ培地の持ち込み防止のために、これを２回繰り返した。２回繰り返した後の菌液の波長６８０ｎｍでのＯＤを、紫外可視分光光度計（株式会社島津製作所製、ＵＶ－１８５０）により測定した。波長６８０ｎｍでのＯＤは０．０３４であった。

【0047】

続いて、菌液を遠心分離して上清を除いた後、菌体ペレットをＢＳＭ培地２０ｍｌに懸濁して、菌体入りＢＳＭ培地を得た。
菌体入りＢＳＭ培地を、５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．０５ｍｌずつガラス瓶に計りとり、１０ｇ／Ｌの１，４－ジオキサン溶液及びＢＳＭ培地を添加して、最終液量が１０ｍｌとなるように調製して、試験液１～３を得た。また、コントロールとして、菌体入りＢＳＭ溶液が０ｍｌのものを調製して試験液４を得た。各試験液での１，４－ジオキサンの最終濃度は１０ｍｇ／Ｌである。

【0048】

各試験液中の菌体入りＢＳＭ培地量、１０ｇ／Ｌの１，４－ジオキサン溶液量、及びＢＳＭ培地量を表２に示した。

【0049】

【表2】

０、５、２４、４８、７２時間経過後に５０μｌずつ各試験液を採取した。採取した各試験液に９８％エタノール１００μｌを添加して、１，４－ジオキサン分解反応を停止させた。各試験液中の１，４－ジオキサン濃度を、ＧＣ－ＭＳ（株式会社島津製作所製、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ）により測定した。１，４－ジオキサン濃度の経時変化の結果を図３に示した。なお、１，４－ジオキサン濃度０．１ｍｇ／Ｌが定量下限値である。

【0050】

図３に示すように、試験液１～３では経時的に１，４－ジオキサン濃度が減少すること、試験液１～３中の菌体の濃度依存的に１，４－ジオキサン分解速度が上昇することが確認できた。

【0051】

（実施例６；３ｅ株の１，４－ジオキサン分解剤としての評価）
河川水、地下水、土壌等、１，４－ジオキサン汚染水や汚染土壌中に含まれる１，４－ジオキサンの濃度は、おおよそ数十ｍｇ／Ｌ～地下水環境基準値である。このレベルでの３ｅ株の培養液からなる１，４－ジオキサン分解剤の１，４－ジオキサン処理能力について評価した。

【0052】

（実施例６－１）
画線培養した３ｅ株のシングルコロニーを掻きとってＬＢ培地に懸濁し、３０℃、２日間振とう培養して前培養液を得た。前培養液を遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含有するＷ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。培養開始時の培養液中の１，４－ジオキサンの濃度は１０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。培養開始時の培養液のＯＤを、紫外可視分光光度計（ベックマン・コールター株式会社製、ＤＵ－８００）により測定したところ、波長６００ｎｍでのＯＤは、１．０であった。

【0053】

培養液をクリンプバイアルに１ｍｌずつ分注し、クリンプキャップでそれぞれ密封した後、培養器内にて３０℃で静置培養した。１時間ごとに３本のクリンプバイアルを培養器から取り出して、培養液中の１，４－ジオキサン濃度を、上記の条件でガスクロマトグラフィー（アジレント・テクノロジー株式会社製、７８９０Ａ）により測定した。各経過時間での１，４－ジオキサン濃度は、３本のクリンプバイアルの測定値の平均とした。

【0054】

図４に、培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。
（実施例６－２）
画線培養した３ｅ株のシングルコロニーを掻きとってＬＢ培地に懸濁し、３０℃、１８時間振とう培養して前培養液を得た。前培養液を遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、２４℃）して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含有するＢＳＭ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。培養開始時の培養液中の１，４－ジオキサンの濃度は１０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。培養開始時の培養液のＯＤを、紫外可視分光光度計（株式会社島津製作所製、ＵＶ－１８５０）により測定したところ、波長５７８ｎｍでのＯＤは２．１であった。

【0055】

培養液を３０℃、１００ｒｐｍで振とう培養した。１時間ごとに培養液を採取して、培養液中の１，４－ジオキサン濃度を、上記の条件でＧＣ－ＭＳ（株式会社島津製作所製、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ）により測定した。図５に、培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0056】

図４に示すように、実施例６－１の培養液中の１，４－ジオキサン濃度は、時間経過によりほぼ直線的に減少した。１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンが７時間後にはほぼ消失して測定不能となった。１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンが７時間で消失したことから、その分解速度を計算すると、約１．４３ｍｇ／Ｌ・ｈｒであった。その結果を表３に示した。

【0057】

また、図５に示すように、実施例６－２の培養液中の１，４－ジオキサン濃度は、培養開始から３時間までは、時間軸に対してほぼ直線的に減少し、培養開始から３～４時間後の間にほぼ消失して測定不能となったと推定された。培養開始から３時間までの１，４－ジオキサン分解速度を計算すると、約２．７４ｍｇ／Ｌ・ｈｒであった。その結果を表３に示した。

【0058】

なお、実施例６－１と実施例６－２では、培養開始時の培養液の測定波長が異なっているが、３ｅ株の培養液の波長６００ｎｍにおけるＯＤと、波長５７８ｎｍにおけるＯＤとは、ほぼ同じ値となることを確認している。

【0059】

一方、図６は、２１９株について記載された上記非特許文献であるApplied Microbiology and Biotechnology, Vol.36, No.1, p120-123,(1991)から転載した図である。図６は、R.ruber ２１９株の増殖曲線及び１，４－ジオキサン分解活性を示している。ここでは、１０ｍＭ１，４－ジオキサンを含む無機培地に、R.ruber ２１９株を接種して、３０℃、１７５ｒｐｍで振とう培養し、２４時間毎に波長５７８ｎｍでのＯＤと、培養液中の１，４－ジオキサン濃度を測定している。

【0060】

培養開始時の培養液中の１，４－ジオキサンの濃度は、１０ｍＭ（８８１．１ｍｇ／Ｌ）であり、培養液の５７８ｎｍでのＯＤは、約４．３である。
図６によれば、R.ruber ２１９株では、培養開始後７２時間までは、培養液中の１，４－ジオキサン濃度は、時間軸に対してほぼ直線的に減少しているものの、培養液中の１，４－ジオキサン濃度が約０．７４ｍＭ（＝６５．２０ｍｇ／L）となった７２時間経過後以降には減少速度が鈍化している。

【0061】

１，４－ジオキサン汚染水や汚染土壌等に含まれる１，４－ジオキサンの濃度は、おおよそ数十ｍｇ／Ｌ～地下水環境基準値レベルである。つまり、汚染水や汚染土壌を処理することを想定した場合、この濃度範囲では、２１９株の１，４－ジオキサン分解速度は非常に遅いということがわかる。図６から、９６時間経過後の培養液中の１，４－ジオキサン濃度が約０．１０ｍＭ（＝８．８１ｍｇ／Ｌ）として、７２～９６時間経過後の間の２１９株の分解速度を算出すると、２．３５ｍｇ／Ｌ・ｈｒとなる。その結果を表３に示した。

【0062】

表３の右欄には、３ｅ株の１，４－ジオキサン分解速度、２１９株の１，４－ジオキサン分解速度を、それぞれ菌体濃度（ＯＤ）で割った値を示した。３ｅ株の結果から、菌体濃度（ＯＤ）と１，４－ジオキサン分解速度は比例することがわかる。また、３ｅ株の分解速度と２１９株の分解速度の比較から、３ｅ株は、２１９株に比べて２．４～２．６倍の１，４－ジオキサン分解能力があることが確認できた。実際の汚染水、汚染土壌を処理するレベルでは、３ｅ株は、２１９株より顕著に高い１，４－ジオキサン分解活性を有する菌である。

【0063】

【表3】

（実施例７；他の環状エーテル、グリコール共存下での１，４－ジオキサン分解剤としての評価）
（実施例７－１）
実施例６－１と同様に培養した前培養液を遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサン及び１，４－ブタンジオールを含有するＷ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。培養開始時の培養液中の１，４－ジオキサンの濃度は１０ｍｇ／Ｌ、１，４－ブタンジオールの濃度は２０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。実施例６－１と同様に、培養液をクリンプバイアルに１ｍｌずつ分注し、１時間ごとに３本の１，４－ジオキサン濃度を測定した。図７（ｂ）に、培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0064】

（実施例７－２）
実施例６－１と同様に培養した前培養液を、同様に遠心分離して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサン及びテトラヒドロフランを含有するＷ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。培養開始時の培養液中の１，４－ジオキサンの濃度は１０ｍｇ／Ｌ、テトラヒドロフランの濃度は２０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。実施例６－１と同様に、培養液をクリンプバイアルに１ｍｌずつ分注し、１時間ごとに３本の１，４－ジオキサン濃度を測定した。図７（ｃ）に、培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0065】

テトラヒドロフランや１，４－ブタンジオール非存在下での１，４－ジオキサン処理能力を示す図として、図７（ａ）に実施例６－１（図４）の結果を再掲した。
図７（ａ）に示すように、１，４－ジオキサン単独では、１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンの分解に７時間かかっているが、図７（ｂ）に示した２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールの共存下では、１，４－ジオキサンは４時間で消失した。１，４－ブタンジオールによって１，４－ジオキサン分解活性が増強されることが確認された。これは、共代謝菌でも知られているように、１，４－ブタンジオールの存在によって、１，４－ジオキサン分解酵素の誘導がかかることによると推測される。

【0066】

また、図７（ｃ）に示すように、２０ｍｇ／Ｌのテトラヒドロフランの共存下では、当初、１，４－ジオキサン濃度の減少は少なく、５時間経過後に急激に減少した。５時間経過後の１，４－ジオキサン分解速度は、図７（ｂ）に示す１，４－ブタンジオールの共存下での１，４－ジオキサン分解速度より速かった。テトラヒドロフランの共存下では、テトラヒドロフラン分解後に１，４－ジオキサンが分解されると考えられるが、その分解速度は、１，４－ジオキサン単独の場合より速いことがわかった。テトラヒドロフランの存在によって、１，４－ジオキサン分解酵素の誘導がかかることによると推測される。

【0067】

（実施例８；他の環状エーテル、グリコール共存下で培養した１，４－ジオキサン分解剤の評価）
他の環状エーテル、グリコール非存在下で３ｅ株を培養した場合、及び、他の環状エーテル、グリコール共存下で３ｅ株を前培養した場合の、１，４－ジオキサン処理能力について評価した。

【0068】

（実施例８－１）
画線培養した３ｅ株のシングルコロニーを掻きとってＬＢ培地に懸濁し、３０℃、２日間振とう培養して前培養液を得た。前培養液を遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含有するＷ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。培養開始時の菌懸濁液中の１，４－ジオキサンの濃度は１０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。

【0069】

実施例６－１と同様に、培養液をクリンプバイアルに１ｍｌずつ分注し、１時間ごとに３本の１，４－ジオキサン濃度をガスクロマトグラフィー（アジレント・テクノロジー株式会社製、７８９０Ａ）により測定した。図８（ａ）に、実施例８－１の培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0070】

（実施例８－２）
画線培養した３ｅ株のシングルコロニーを掻きとってＬＢ培地に懸濁し、３０℃、１日間振とう培養した後、１，４－ブタンジオールを添加して、さらに１日間振とう培養して前培養液を得た。前培養液中の１，４－ブタンジオールの濃度は、２０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。実施例８－１と同様の条件で、前培養液を遠心分離して菌体ペレットを得た後、１，４－ジオキサンを唯一の炭素源として含有するＷ培地に菌体を懸濁して培養液を得た。実施例６－１と同様に、培養液をクリンプバイアルに１ｍｌずつ分注し、１時間ごとに３本の１，４－ジオキサン濃度を測定した。図８（ｂ）に、実施例８－２の培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0071】

（実施例８－３）
実施例８－２の１，４－ブタンジオールに代えて、テトラヒドロフランを添加した以外は実施例８－２と同様にして行った。前培養液中のテトラヒドロフランの濃度は、２０ｍｇ／Ｌとなるように調製した。図８（ｃ）に、実施例８－３の培養液中の１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示した。

【0072】

図８（ａ）に示すように、１，４－ブタンジオール、テトラヒドロフラン非存在下で３ｅ株を培養した培養液では、１０ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンの分解に４時間かかっていた。一方、図８（ｂ）に示すように、２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールを炭素源として３ｅ株を培養した培養液では、１，４－ジオキサンは１時間で消失した。また、図８（ｃ）に示すように、２０ｍｇ／Ｌのテトラヒドロフランを炭素源として３ｅ株を培養した培養液では、１，４－ジオキサンは１時間で急速に分解が進み、２時間で消失した。

【0073】

１，４－ブタンジオールやテトラヒドロフランの存在下で３ｅ株を培養することにより、１，４－ジオキサン分解酵素の誘導がかかるものと推測され、１，４－ジオキサン分解剤としての処理能力が向上すると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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