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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023086132
(43)【公開日】2023-06-21
(54)【発明の名称】アミロイドベータに対する抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230614BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230614BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230614BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230614BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230614BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230614BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230614BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230614BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230614BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20230614BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230614BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230614BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230614BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/18
A61K39/395 N
A61P25/28
G01N33/531 A
G01N33/53 D
C07K16/46
C12P21/08
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023039300
(22)【出願日】2023-03-14
(62)【分割の表示】P 2020502655の分割
【原出願日】2018-07-18
(31)【優先権主張番号】PCT/CA2017/050866
(32)【優先日】2017-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CA
(31)【優先権主張番号】62/622,126
(32)【優先日】2018-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】15/808,842
(32)【優先日】2017-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】300066874
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
(71)【出願人】
【識別番号】514316411
【氏名又は名称】プロミス、ニューロサイエンシズ、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＭＩＳ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】キャッシュマン，ニール アール．
(72)【発明者】
【氏名】プロトキン，スティーブン エス．
(72)【発明者】
【氏名】カプラン，ヨハンネ
(72)【発明者】
【氏名】シルバーマン，ジュディス マックスウェル
(72)【発明者】
【氏名】ギブス，エブリマ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アミロイドベータオリゴマーと結合する抗体ならびに前記抗体を作製および使用する方法を提供する。
【解決手段】キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、アミロイドベータオリゴマーと結合する抗体の作製方法、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象のアミロイドベータのレベルを測定する方法、必要とする対象に投与して、アミロイドベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害する方法を含む前記抗体を使用する方法、ならびに前記抗体を含むキットを提供する。
【選択図】図２
【解決手段】キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、アミロイドベータオリゴマーと結合する抗体の作製方法、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象のアミロイドベータのレベルを測定する方法、必要とする対象に投与して、アミロイドベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害する方法を含む前記抗体を使用する方法、ならびに前記抗体を含むキットを提供する。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本出願の明細書または図面に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
本ＰＣＴ出願は、２０１７年７月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／０５０８６６号および２０１８年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６２２，１２６号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体に組み込まれる。
本ＰＣＴ出願は、２０１７年７月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／０５０８６６号および２０１８年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６２２，１２６号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その全体に組み込まれる。
【0002】
（分野）
本開示は、アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）オリゴマーに対して選択的なヒト化抗体ならびにその組成物および使用に関する。
本開示は、アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）オリゴマーに対して選択的なヒト化抗体ならびにその組成物および使用に関する。
【0003】
配列表
ＥＦＳ－ＷＥＢから提出され、２０１８年７月１８日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表「Ｐ５０４４２ＰＣ０２ＳＬ＿ａｓｆｉｌｅｄ．ｔｘｔ」（８２，０２８バイト）が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢから提出され、２０１８年７月１８日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表「Ｐ５０４４２ＰＣ０２ＳＬ＿ａｓｆｉｌｅｄ．ｔｘｔ」（８２，０２８バイト）が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
３６～４３アミノ酸ペプチドとして存在するアミロイドベータ（Ａベータ）は、酵素であるβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から解離する生産物である。ＡＤ患者では、Ａベータは可溶性モノマー、不溶性線維および可溶性オリゴマーの形で存在し得る。モノマー型のＡベータは、主として構造化されていないポリペプチド鎖として存在する。線維型のＡベータは、株と呼ばれることの多い異なる形態に凝集し得る。これらの構造のうち固体ＮＭＲにより明らかにされているものがいくつかある。
【0005】
例えば、原子分解三次元構造データに関する結晶データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、３回対称性Ａβ構造（ＰＤＢエントリー、２Ｍ４Ｊ）；Ａβ－４０モノマーの２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）およびＡβ－４２モノマーの一本鎖平行ｉｎ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）を含めた、いくつかの線維株の構造が入手可能である。
【0006】
２Ｍ４Ｊの構造はＬｕら［８］に報告されており、２ＭＸＵの構造はＸｉａｏら［９］に報告されている。２ＬＭＮの構造はＰｅｔｋｏｖａら［１０］に報告されている。
【0007】
Ａベータオリゴマーは、培養した細胞系およびニューロンを死滅させ、スライス培養物および動物生体では記憶を促進し、長期増強（ＬＴＰ）と呼ばれる極めて重要なシナプス活性を遮断することが示されている。
【0008】
これまでにオリゴマーの構造は決定されていない。さらに、ＮＭＲおよびその他の証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することがわかっている。さらに、毒性オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維の濃度よりはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
【0009】
Ａベータと結合する抗体が記載されている。
【0010】
「ＵＳＥ ＯＦ ＡＮＴＩ－ＡＭＹＬＯＩＤ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＮ ＯＣＵＬＡＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ」と題する国際公開第２００９０４８５３８（Ａ２）号は、Ａベータ上の１つまたは複数の結合部位を認識し、眼疾患の治療に有用なキメラ抗体を開示している。
【0011】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＭＹＬＯＩＤ ＯＲ ＡＭＹＬＯＩＤ－ＬＩＫＥ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」と題する米国特許第９２２１８１２（Ｂ２）号は、アミノ酸残基１２～２４の間のエピトープを含むＡベータと結合するアミロイド関連疾患治療のための医薬組成物および不連続な抗体について記載している。
【0012】
「ＡＮＴＩ－ＡＭＹＬＯＩＤ ＢＥＴＡ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥ」と題する国際公開第２００３０７０７６０（Ａ２）号は、Ａベータの不連続エピトープを認識し、第一の領域がアミノ酸配列ＡＥＦＲＨＤＳＧＹまたはそのフラグメントを含み、第二の領域がアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧまたはそのフラグメントを含む抗体を開示している。
【0013】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＡＭＹＬＯＩＤＯＳＥＳ」と題する米国特許第２０１１０１７１２４３（Ａ１）号は、ＨＱＫＬＶＦおよび／またはＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤと結合する抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの形成を誘導することが可能なペプチドミモトープおよびその使用を開示している。
【0014】
国際公開第２００８０８８９８３（Ａ１）号および国際公開第２００１０６２８０１（Ａ２）号は、Ａベータのアミノ酸１３～２８と結合するペグ化抗体フラグメントおよびＡベータ関連疾患治療へのその使用を開示している。ソラネズマブおよびクレネズマブはＡベータ上のアミノ酸１６～２６と結合する。クレネズマブはモノマー、オリゴマーおよび線維と相互作用する。ソラネズマブ（ピコモル濃度の親和性）およびクレネズマブ（ナノモル濃度の親和性）を含めたＭｉｄｒｅｇｉｏｎ抗体は、単量体Ａベータと優先的に結合するものと思われる［１３］。
【0015】
「ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＳＹＭＰＴＯＭＳ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＰＡＲＫＩＮＳＯＮ’Ｓ ＤＩＳＥＡＳＥ」と題する国際公開第２００９１４９４８７（Ａ２）号は、ＥＶＨＨＱＫＬ、ＨＱＫＬＶＦおよびＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤなどのＡベータエピトープに特異的な抗体に対する結合能を有するペプチドを含む化合物について記載している。
【0016】
ＨＨＱＫ（配列番号７）ドメインは、Ｇｉｕｌｉａｎ Ｄら［１１］およびＷｉｎｋｌｅｒら［１２］に記載されているように、ヒトミクログリアでの斑による神経毒性の誘導に関与するとされている。ＨＨＱＫ（配列番号７）と結合するタンパク質フォールディング疾患の治療のための非抗体治療剤が開示されている（米国特許第２０１５０１０５３４４（Ａ１）号、国際公開第２００６１２５３２４（Ａ１）号）。
【0017】
米国特許第５，７６６，８４６号；同第５，８３７，６７２号；および同第５，５９３，８４６号（参照により本明細書に組み込まれる）は、Ａβペプチドの中央ドメインに対するマウスモノクローナル抗体の作製について記載している。国際公開第０１／６２８０１号は、Ａベータのアミノ酸１３～２８と結合する抗体について記載している。国際公開第２００４０７１４０８号はヒト化抗体を開示している。
【0018】
「ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＡＮＤ ＰＲＯＰＨＹＬＡＸＩＳ ＯＦ ＡＭＹＬＯＩＤＯＳＩＳ」と題する国際公開第２００９０８６５３９（Ａ２）号は、アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）のＣ末端領域由来のＡＡフラグメントなどのネオエピトープを含むペプチドおよび凝集アミロイドタンパク質のネオエピトープに特異的な抗体、例えばＡＡ線維のＣ末端領域に特異的な抗体を投与することによる、アミロイドーシスおよびアミロイド軽鎖アミロイドーシスに関するものである。
【0019】
「ＡＮＴＩ－ＡＭＹＬＯＩＤ ＢＥＴＡ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥ」と題する国際公開第２００３０７０７６０号は、Ｒ－Ａ４ペプチドの２つの領域であって、第一の領域がアミノ酸配列ＡＥＦＲＨＤＳＧＹまたはそのフラグメントを含み、第二の領域がアミノ酸配列ＶＨＨＡＥＤＶＦＦＡＥＤＶＧまたはそのフラグメントを含む領域を特異的に認識することが可能な抗体分子に関するものである。
【0020】
「ＨＵＭＡＮＩＺＥＤ ＡＭＹＬＯＩＤ ＢＥＴＡ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＩＭＰＲＯＶＩＮＧ ＣＯＧＮＩＴＩＯＮ」と題する国際公開第２００６０６６０８９号は、ベータアミロイドによる疾患の治療のための改善された薬剤および方法、特に、Ａβペプチドと特異的に結合し、アミロイド原性障害（例えば、ＡＤ）による斑の量を減少させる効果のある、モノクローナル抗体１２Ａ１１の同定および特徴付けに関するものである。
【0021】
「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＧＡＩＮＳＴ ＡＭＹＬＯＩＤ ＢＥＴＡ ４ ＷＩＴＨ ＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＥＤ ＩＮ ＴＨＥ ＶＡＲＩＡＢＬＥ ＲＥＧＩＯＮ」と題する国際公開第２００７０６８４２９号は、少なくとも１つの抗原結合部位が重鎖（ＶＨ）の可変領域にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含むことを特徴とする精製抗体分子調製物に関するものである。
【0022】
国際公開第０３／０１６４６６号は、重鎖のＣＤＲ２内のＮグリコシル化部位を欠くよう設計された２６６のバリアント抗体、その医薬組成物ならびにそのバリアント抗体を発現させるのに有用なポリヌクレオチド配列、ベクターおよび形質転換細胞に関するものである。このバリアントは、ヒト体液由来の可溶性Ａベータペプチドを捕捉し、アミロイドベータペプチドの１３～２８位内に含まれるエピトープと特異的に結合すると記載されている。
【0023】
Ｙｕらは、ＰＡＤＲＥまたは毒素由来担体タンパク質と融合した六価の折畳み型Ａβ１－１５（６Ａβ１５）について記載している。Ｗａｎｇら（２０１６）は、この抗体の末梢投与により老年性アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルのアルツハイマー病様病態および認知低下が軽減されることを報告している［１４］、［１５］。
【0024】
モノマーもしくは線維またはモノマーと線維の両方よりもＡベータオリゴマーと優先的または選択的に結合する抗体が望ましい。
【発明の概要】
【0025】
一態様は、配列番号７４～７９または配列番号１～６または配列番号１、２、８０および４～６または配列番号１、２、８０～８３を含むか、これよりなるＣＤＲを有し、表４Ａまたは４Ｂの配列から選択される配列を有するか、少なくとも表４Ａまたは４Ｂの配列から選択される配列と５０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有し、ＣＤＲアミノ酸配列が、そこに示されるものであるか、配列番号７４～７９または配列番号１～６または配列番号１、２、８０および４～６または配列番号１、２、８０～８３から選択されるものである、単離ヒト化抗体を含む。
【0026】
一実施形態では、ヒト化抗体は、配列番号１２の直鎖状ペプチドより同じ配列を有する環状ペプチドと選択的または特異的に結合するか、あるいはＡベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりオリゴマーＡベータと選択的または特異的に結合する。
【0027】
別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される、本明細書に記載される抗体の抗体結合フラグメントである。
【0028】
一態様は、本明細書に記載されるヒト化抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲートを含む。
【0029】
一実施形態では、検出可能な標識は、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む。
【0030】
一態様は、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを任意選択で希釈剤とともに含む、組成物を含む。
【0031】
一態様は、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子を含む。
【0032】
一態様は、本明細書に記載される核酸を含む、ベクターを含む。
【0033】
一態様は、本明細書に記載される抗体を発現する細胞を含み、任意選択で、細胞は、本明細書に記載されるベクターを含む、ハイブリドーマである。
【0034】
一態様は、本明細書に記載される抗体、本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、本明細書に記載される組成物、本明細書に記載される核酸分子、本明細書に記載されるベクターまたは本明細書に記載される細胞を含む、キットを含む。
【0035】
一態様は、生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．生体試料と、本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。
ａ．生体試料と、本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。
【0036】
一実施形態では、生体試料はＡベータオリゴマーを含有し、方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載されるヒト化抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【0037】
別の実施形態では、複合体の量を測定する。
【0038】
別の実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む。
【0039】
別の実施形態では、試料はヒト試料である。
【0040】
別の実施形態では、試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する。
【0041】
別の実施形態では、特に限定されないが、ＳＰＲ、Ｋｉｎｅｘａ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、ＥＬＩＳＡ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ、ＬｕｍｉｎｅｘおよびＳｉｍｏａを含めた分析アッセイによりＡベータのレベルを検出する。
【0042】
一態様は、対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、本明細書に記載されるヒト化抗体を含み、ヒト化抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む、方法を含む。
【0043】
一実施形態では、標識は陽電子放出放射性核種である。
【0044】
一態様は、Ａベータオリゴマー伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させて、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法を含む。
【0045】
一態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象に１）有効量の本明細書に記載されるキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはイムノコンジュゲートまたは前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）必要とする対象に１の抗体をコードする核酸または１の抗体をコードする核酸を含むベクターを投与することを含む、方法を含む。
【0046】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。
【0047】
別の実施形態では、抗体、イムノコンジュゲート、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。
【0048】
以下の詳細な説明から本開示のその他の特徴と利点が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から本開示の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および改変が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、単に説明を目的として記載されるものであることが理解されるべきである。
【0049】
これより本開示の実施形態を図面と関連させて説明する。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡベータオリゴマーの伝播に対する抗体の効果を報告するグラフである。
【図2】ヒト化抗体の方がＡＤ抽出物の毒性オリゴマー高含有ＬＭＷ画分に対して有意に優れた結合を示すことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0051】
（本開示の詳細な説明）
本明細書には、表２に示す配列を有するＣＤＲを含み、かつ／あるいは表４Ａおよび４Ｂのいずれかに記載される可変領域配列を有する、キメラ抗体およびヒト化抗体、その免疫療法組成物ならびにその使用方法が提供される。前記抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連するオリゴマー種を含めた、Ａベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る。
本明細書には、表２に示す配列を有するＣＤＲを含み、かつ／あるいは表４Ａおよび４Ｂのいずれかに記載される可変領域配列を有する、キメラ抗体およびヒト化抗体、その免疫療法組成物ならびにその使用方法が提供される。前記抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連するオリゴマー種を含めた、Ａベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る。
【0052】
実施例で示すように、ＨＨＱＫ（配列番号７）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた抗体は、オリゴマーＡベータと優先的に結合し、かつ／または同じ配列（例えば、対応する直鎖状配列）の直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドと選択的に結合する。実験結果が記載されており、合成モノマーと比較して合成オリゴマーと選択的に結合し、対照ＣＳＦよりもＡＤ患者のＣＳＦと優先的に結合し、かつ／または対照の可溶性脳抽出物よりもＡＤ患者の可溶性脳抽出物と優先的に結合する、エピトープ特異的かつ立体配座選択的な抗体が特定される。さらに、ＡＤ脳組織の染色では、斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体が特定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、抗体がＡβオリゴマーの伝播および凝集を阻害することがわかった。
【0053】
実施例でさらに示すように、ヒト化抗体３０１－１７には、マウスモノクローナル抗体と比較して特性の改善、例えばオリゴマーＡベータとの結合の改善などがみられた。ヒト化抗体には、親モノクローナルと比較しても特異性の改善がみられた。
【0054】
したがって、いくつかの実施形態では、ヒト化抗体には、マウスモノクローナル抗体と比較して、オリゴマーＡベータ、任意選択で、脳エキス抽出物またはその他の生体試料などの試料の低分子量画分中に存在するオリゴマーＡベータに対して、例えば５０％の増大または最大２００％の増大（またはその間の任意の数）などの結合の増大がみられる。
【0055】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「Ａベータ」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ、Ａベータまたは「Ａβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、３６～４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号７３で示されるものである。
本明細書で使用される「Ａベータ」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ、Ａベータまたは「Ａβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、３６～４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号７３で示されるものである。
【0056】
本明細書で使用される「Ａベータモノマー」という用語は、Ａベータ（例えば、１～４０、１～４２、１～４３）ペプチドの個々のサブユニット型のいずれかを指す。
【0057】
本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、本明細書では、複数（例えば、少なくとも２つ）のＡベータモノマーが非共有結合によって、約１００個未満またはより通常には約５０個未満のモノマーからなり、立体配座に柔軟性があり、部分的に規則的である三次元の小球に凝集したＡベータサブユニットのいずれか複数のものを指す。例えば、オリゴマーは、３個、４個、５個またはそれ以上のモノマーを含み得る。本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、合成Ａベータオリゴマーおよび／または天然Ａベータオリゴマーの両方を包含する。「天然Ａベータオリゴマー」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＡＤを有する対象の脳およびＣＳＦ内で形成されるＡベータオリゴマーを指す。
【0058】
本明細書で使用される「Ａベータ線維」という用語は、電子顕微鏡下で線維構造を示す個々のＡベータペプチドが非共有結合により会合した集合体を含む分子構造を指す。線維構造は通常、「クロスベータ」構造であり、理論上、多量体の大きさに上限はなく、線維は数千個または何千個ものモノマーを含み得る。線維は数千個単位で凝集し、ＡＤに特徴的な主な病理学的形態の１つである老人斑を形成し得る。
【0059】
「ＨＨＱＫ」という用語は、配列番号７で示されるヒスチジン、ヒスチジン、グルタミン、リジンというアミノ酸配列を意味する。アミノ酸配列に言及する場合、それは文脈に応じて、Ａベータまたは単離ペプチドの配列、例えば環状化合物のアミノ酸配列などを指し得る。
【0060】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および修飾されたＬ－アミノ酸をすべて包含する。アミノ酸の原子は様々な同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に代わるジュウテリウム、窒素１４に代わる窒素１５および炭素１２に代わる炭素１３ならびにその他の同様の変化を含み得る。
【0061】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびその他のキメラ抗体ならびに例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントを含めた上記の結合フラグメントを包含するものとする。抗体は、組換え供給源由来のものおよび／またはウサギ、ラマ、サメなどの動物で産生されたものであり得る。また、トランスジェニック動物で産生され得る、もしくは生化学技術を用いて作製され得る、またはファージライブラリーなどのライブラリーから単離され得るヒト抗体も包含される。ヒト化抗体またはその他のキメラ抗体は、１種類または２種類以上のアイソタイプもしくはクラスまたは種由来の配列を含み得る。
【0062】
「単離抗体」という語句は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、抗体を産生した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマまたはその他の細胞系（抗体を産生する組換え昆虫、酵母または細菌細胞など）から取り出された抗体を指す。単離抗体は任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であることを意味する。
【0063】
本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖の一部または一部分であって、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含み、抗原と結合する、またはインタクトの抗体と競合するものを指す。例示的結合フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元する処理を実施して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントの形成を引き起こすことができる。また、組換え発現技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントならびにその他のフラグメントを構築することもできる。
【0064】
当該技術分野で認められている「ＩＭＧＴ番号付け」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基より可変性のある（すなわち、超可変性の）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
【0065】
本明細書で使用される「立体配座エピトープ」という用語は、エピトープアミノ酸配列が特定の三次元構造を有し、その三次元構造の少なくとも一面が別の形態、例えば対応する直鎖状ペプチドまたはＡベータモノマー中に存在しないか、または存在する可能性が低く、コグネイト抗体によって特異的かつ／または選択的に認識されるエピトープを指す。立体配座特異的エピトープと特異的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープの１つまたは複数のアミノ酸の空間的配置を認識する。例えば、ＨＨＱＫ（配列番号７）立体配座エピトープは、抗体によって選択的に、例えば直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号７）を用いて生じさせた抗体の少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍もしくは１０００倍またはそれ以上選択的に認識される、ＨＨＱＫ（配列番号７）のエピトープを指す。ある抗体がエピトープ、例えばＨＨＱＫ（配列番号７）などの立体配座エピトープなどと選択的に結合すると言う場合、それは、抗体が、特定の残基またはその一部を含む１つまたは複数の特定の立体配座と、別の立体配座の前記残基と結合する場合より高い親和性で優先的に結合することを意味する。例えば、ある抗体が、ＨＨＱＫまたは関連エピトープを含むシクロペプチドと、対応する直鎖状ペプチドより選択的に結合すると言う場合、その抗体は、直鎖状ペプチドと結合する場合の少なくとも２倍の親和性でシクロペプチドと結合する。同様に、ある抗体がオリゴマーＡベータと選択的に結合すると言う場合、その抗体は、Ａベータモノマーおよび／または斑線維と結合する場合の少なくとも２倍の親和性でオリゴマー種と結合する。
【0066】
本明細書で抗体に関して使用される「斑との結合が全くまたはほとんどみられない」または「斑と結合しない、またはほとんど結合しない」という用語は、抗体が（例えば、任意選択でＡベータ抗体６Ｅ１０でみられる斑染色と比較した、ｉｎ ｓｉｔｕの）免疫組織化学法で典型的な斑の染色形態を示さず、染色のレベルが、ＩｇＧ陰性の（例えば、無関係な）アイソタイプ対照でみられるレベルと同等である、またはその２倍以下であることを意味する。
【0067】
「単離ペプチド」という用語は、例えば組換え技術または合成技術によって作製され、ペプチドを作製した組換え細胞または残存ペプチド合成反応物などの供給源から取り出されたペプチドを指す。単離ペプチドは、任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度および任意選択で医薬品等級の純度であることを意味する。
【0068】
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載されるペプチドまたは化合物内に付加または導入することができるペプチド配列（ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグまたはＮＥタグなど）、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することが可能な部分を指す。例えば、標識は、（例えば、ＰＥＴ撮像に使用する）放射線不透性の陽電子放出放射性核種もしくは放射性同位元素、例えば３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど；蛍光化合物（フルオロフォア）もしくは化学発光化合物（発色団）、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリンなど；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなど；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を用いて間接的に検出可能なものであり得る。
【0069】
通常使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の抗体結合部位、通常、ポリペプチドセグメントを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」はまた、記載される集団座標法を用いてＡベータ上で特定され得るアミノ酸配列またはその一部を指すこともある。例えば、特定された標的領域ＨＨＱＫ（配列番号７）を含む環状化合物に対応する単離ペプチドに対して作製した抗体は、前記エピトープ配列の一部または全部を認識する。エピトープが抗体による結合に接触可能な場合、それは本明細書において「接触可能な」ものである。
【0070】
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより強く（Ｋｏｎ）かつ／または小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより高い親和性を有する。これと同様に、本明細書の「より低い親和性」は、抗体Ｘが標的Ｚより弱くかつ／または大きい解離定数で標的Ｙと結合する場合の抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性はＫＡ＝１／ＫＤで表すことができ、式中、ＫＤ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆである。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて測定することができる。環状化合物、例えば任意選択の環状ペプチド中に提示される立体配座に選択的な抗体は、環状化合物（例えば、環状ペプチド）に対する親和性が直鎖状形態の対応する配列（例えば、非環化配列）より大きい。
【0071】
環状化合物に関する「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学的部分を含む、またはこれよりなるが、直鎖状（すなわち、非環状）形態であり、例えば直鎖状ペプチドの溶液中でみられ得る特性を有する、化合物、任意選択でペプチドを指す。例えば、対応する直鎖状化合物は、環化されていない合成ペプチドであり得る。
【0072】
ある抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、その抗体がエピトープ配列を認識し、最小限の親和性でその標的抗原と結合することを意味する。例えば、多価抗体は、その標的と少なくとも１ｅ－６、少なくとも１ｅ－７、少なくとも１ｅ－８、少なくとも１ｅ－９または少なくとも１ｅ－１０のＫＤで結合する。少なくとも１ｅ－８より高い親和性が好ましいものであり得る。例えば、ＫＤはナノモルの範囲またはピコモルの範囲内であり得る。可変ドメインを１つ含むＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用の１０倍または１００倍低い親和性でその標的と結合する。
【0073】
ある形態のＡベータ（例えば、線維、モノマーまたはオリゴマー）または環状化合物と選択的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的に結合する」という用語は、その抗体が上記の形態と少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍もしくは少なくとも１０００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、オリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態のペプチドおよび／または直鎖状ペプチドの少なくとも２倍などの親和性で特定の形態のＡベータと優先的に結合する。
【0074】
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意選択でヒトを包含または除外した哺乳動物を含めた動物界のあらゆるメンバーを包含する。
【0075】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の特性を打ち消すことなく、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換わるアミノ酸置換のことである。適切な保存的アミノ酸置換は、疎水性、極性およびＲ鎖長が互いに類似したアミノ酸同士を置き換えることにより実施することができる。保存的アミノ酸置換の例としては以下のものが挙げられる：
【表1】
【0076】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内のある位置が第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は上記の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例には、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７で改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムがある。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムにはそのようなアルゴリズムが組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し、本願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを例えばスコア－５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムがある。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと類似した技術を用いて２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を算出する際には通常、完全一致のみをカウントする。
【0077】
抗体に関しては、抗体配列をＩＭＧＴまたはその他のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの慣例）により最大限に整列させたとき、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較している場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセンテージ配列同一性は、ギャップをカウントせず、対象抗体領域および参照抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占められている位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数で除したものに１００を乗じてパーセンテージに変換したものとする。
【0078】
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合よりなるヌクレオシドモノマーまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然のモノマーまたはその一部分を含む修飾または置換された配列を包含する。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含めた天然の塩基を含み得る。配列はまた、修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、ミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列およびコドン最適化等価物または同義コドン等価物を包含する。本明細書で使用される「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作製した場合は実質的に細胞物質も培地も含まない核酸、あるいは化学的に合成した場合は実質的に化学的前駆体もその他の化学物質も含まない核酸を指す。単離核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然の状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’側および３’側に位置する配列）を実質的に含まない。
【0079】
「作動可能に連結されている」は、核酸の発現が可能なようにその核酸が制御配列と連結されていることを意味するものとする。適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。適切な制御配列の選択は、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【0080】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子を例えば、原核細胞および／または真核細胞内に導入し、かつ／あるいはゲノム内に組み込むことを可能にする前記核酸分子の任意の中間運搬体を含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどがこれに包含される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は一般に、通常は環状ＤＮＡ二本鎖であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物を指す。
【0081】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者には、核酸の二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）またはこれと類似した方程式）によって決まることが認識されよう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータはナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子に類似しているが同一ではない分子を特定するには、１％のミスマッチによりＴｍが約１℃低下するものと考えられ、例えば、同一性が９５％を上回る核酸分子を探索するのであれば、最終洗浄温度は約５℃低下することになる。当業者は、これらの考慮事項に基づき、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能であろう。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施し得る：上の方程式に基づき、Ｔｍを－５℃とし、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションを実施し、次いで、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄段階が含まれる。ただし、上のものに代わる緩衝液、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１にみることができる。
【0082】
本明細書で使用され、当該技術分野で十分に理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得る方法を意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、検出可能なものであるか検出不可能なものであるかを問わず、１つまたは複数の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患再発の減少および寛解（部分寛解または完全寛解を問わない）が挙げられる。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」はまた、予防的治療を包含する。例えば、初期段階のＡＤを有する対象を本明細書に記載される化合物、抗体、免疫原、核酸または組成物で治療して進行を予防することができる。
【0083】
本明細書で使用される「投与される」という用語は、細胞または対象への治療有効量の開示の化合物または組成物の投与を意味する。
【0084】
本明細書で使用される「有効量」という語句は、所望の結果を得るのに必要な投与回数および期間で効果が得られる量を意味する。対象に投与する場合、有効量は対象の病状、年齢、性別、体重などの因子によって異なり得る。最適な治療反応を得るために投与レジメンを調整し得る。
【0085】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または補形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、その被投与者に対して実質的に有害でないことを意味する。
【0086】
１つまたは複数の記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分とともに含有し得る。
【0087】
本開示の範囲を理解するにあたって、本明細書で使用される「～よりなる」という用語およびその派生語は、記載される特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を明記し、また他の記載されていない特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を排除する、制限的用語であるものとする。
【0088】
本明細書で端点により数値範囲が記載されている場合、その範囲内に含まれる数および端数がいずれも含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が含まれる）。また、数およびその端数はすべて「約」という用語によって修飾されることが考えられることを理解するべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含することを理解するべきである。「約」という用語は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％または１０～４０％、好ましくは１０～２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【0089】
さらに、当業者であれば理解するように、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちそれらが適しているものに適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がさらに詳細に定義される。そのように定義された各態様は、そうでないことが明記されない限り、１つまたは複数の他の任意の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴と、好ましいまたは有利であると示されている１つまたは複数の他の任意の特徴とを組み合わせ得る。
【0090】
冠詞の単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物をその混合物も含め包含し得る。
【0091】
ＩＩ．抗体および核酸
本明細書に特定の抗体およびその使用を開示する。
本明細書に特定の抗体およびその使用を開示する。
【0092】
実施例で示すように、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）を用いて生じさせた抗体は配列が決定され、対応する直鎖状ペプチドより環状化合物と選択的に結合し、モノマーよりＡベータオリゴマーと選択的に結合し、かつ／またはＡＤ組織で認識できる斑染色はみられなかった。さらに、前記抗体はＡベータ凝集の伝播をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することができた。
【0093】
したがって、一態様は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号１～３および４～６の配列を含む、抗体を含む。
【0094】
一実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号９で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１、２および３で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号１、２および３で示される保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。
【0095】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号１１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【0096】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0097】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、かつ／または軽鎖可変領域が、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【0098】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、本明細書に配列番号１～６で記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0099】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドならびに／あるいは配列番号９の重鎖可変鎖配列および／または配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む抗体を有するヒトＡベータオリゴマー。
【0100】
別の態様は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号１、２、８０および４～６の配列を含む、立体配座に特異的かつ／または選択的な単離抗体を含む。
【0101】
一実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号８５で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１、２および８０で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号１、２および８０で示される、保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。
【0102】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号８７で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【0103】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８４で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号８６で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0104】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、かつ／または軽鎖可変領域が、配列番号８７で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【0105】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、本明細書に配列番号１、２、８０、４～６で記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0106】
別の実施形態では、抗体は、配列番号８５の重鎖可変鎖配列および／または配列番号８７の軽鎖可変領域配列を含む抗体とともに、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーと結合する、抗体である。
【0107】
別の態様は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が配列番号１、２、８０および８１～８３の配列を含む、立体配座に特異的かつ／または選択的な単離抗体を含む。
【0108】
一実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号８５で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１、２および８０で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号１、２および８０で示される保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。
【0109】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号８９で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号８９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号８１、８２および８３で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号８１、８２および８３で示される保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【0110】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８４で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号８８で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0111】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、かつ／または軽鎖可変領域が、配列番号８９で示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【0112】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、本明細書に配列番号１、２、８０～３で記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0113】
別の実施形態では、抗体は、配列番号８５の重鎖可変鎖配列および／または配列番号８９の軽鎖可変領域配列を含む抗体とともに、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーと結合する、抗体である。
【0114】
一実施形態では、抗体は、任意選択で実施例に記載する条件下で、配列ＨＨＱＫ（配列番号７）を含む直鎖状ペプチドと結合することはなく、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるのに使用する環状配列の直鎖型である。
【0115】
一実施形態では、抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するＡベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、ＨＨＱＫ（配列番号７）またはその一部を含むか、これよりなる。
【0116】
一実施形態では、抗体は、ＨＨＱＫ（配列番号７）からなる直鎖状ペプチドと特異的に結合することはなく、かつ／またはこれに対して選択的ではない。本明細書に記載されるように、選択的結合はＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を用いて測定することができる。
【0117】
一実施形態では、抗体は、任意選択でシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）とＨＨＱＫ（配列番号７）を含む直鎖状ペプチドとを、任意選択で直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号１２）との関連で比較して、ＨＨＱＫ（配列番号７）またはその一部を含む環状化合物と選択的に結合する。例えば、一実施形態では、抗体は、環状立体配座のＨＨＱＫ（配列番号７）と選択的に結合し、例えば任意選択で本明細書に記載される方法を用いるＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴による測定で、環状立体配座のＨＨＱＫ（配列番号７）に対し、対応する直鎖状化合物などの直鎖状化合物のＨＨＱＫ（配列番号７）の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍の選択性を示す。
【0118】
一実施形態では、抗体は、エピトープ配列を含む環状化合物と直鎖状ペプチドより選択的に、またはＡベータオリゴマーなどのＡベータ種とモノマーより選択的に結合する。一実施形態では、環状化合物および／またはＡベータオリゴマーに対する選択性は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維から選択されるＡベータ種ならびに／あるいは直鎖状ＨＨＱＫ（配列番号７）、任意選択で直鎖状ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号１２）の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
【0119】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナルの作製については実施例に記載する。
【0120】
モノクローナル抗体を作製するには、本明細書に記載される免疫原で免疫感作した対象から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合し、それにより上記の細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５））ならびにその他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０－６７（１９８６））およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）など）。所望のエピトープと特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞を免疫学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【0121】
特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントはまた、細胞表面成分とともに細菌内で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌内で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１：５４４－５４６（１９８９）；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）。
【0122】
一実施形態では、抗体は、任意選択で表２のＣＤＲと、任意選択で配列番号４２の重鎖可変領域、配列番号４２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＩｇＧ４フレームワークとを含み、ＣＤＲ配列が、配列番号７４～７６または配列番号４２の保存的に置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ配列が配列番号７４～７６の配列である、キメラ抗体である。
【0123】
一実施形態では、抗体は、任意選択で表２のＣＤＲと、任意選択で配列番号５６の軽鎖可変領域、配列番号５６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＩｇＧ４フレームワークとを含み、ＣＤＲ配列が、配列番号７７～７９または配列番号５６の保存的に置換されたアミノ酸配列であり、ＣＤＲ配列が配列番号７７～７９の配列である、キメラ抗体である。
【0124】
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。実施例で示すように、特異的ヒト化抗体が記載されている。
【0125】
非ヒト種からの抗体のヒト化については文献に記載されている。例えば、欧州特許第０２３９４００号（Ｂ１）ならびにＣａｒｔｅｒおよびＭｅｒｃｈａｎｔ １９９７（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８，４４９－４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手できる（例えば、イギリス、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホーリーロード２番のＳｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）。
【0126】
ヒト化型のげっ歯類抗体は、ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７，１９８８）によって作製することができる。この方法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループと、対応するヒトフレームワーク領域とを結合させる。ＣＤＲ移植では、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を及ぼし得ることから、親和性が低下した抗体が得られることが多い（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２４：４８７－４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するには多くの場合、部位特異的変異誘発またはその他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換える必要があり、コンピュータによる抗原結合部位のモデル化を援用することもある（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８－２９７６，１９９４）。
【0127】
実施例に記載される方法を用いることもできる。
【0128】
例えば、可変領域をヒトフレームワーク内に移植することができ、例えば、ＣＤＲの外部にある可変領域内に特異的変異の導入を実施することができる。
【0129】
ヒト化型の抗体は任意選択で、リサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３５：９５９－９７３，１９９４）によって得られる。この方法では、げっ歯類抗体の表面残基のみをヒト化する。
【0130】
一実施形態では、ヒト化抗体は、表２に示されるＣＤＲを含む。
【0131】
具体的なヒト化配列を表４Ａおよび４Ｂに記載する。
【0132】
一態様は、表４Ａもしくは４Ｂに記載される配列を含むか、または表４Ａもしくは４Ｂに示される配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、ＣＤＲアミノ酸配列がそこに示される通りのものである配列を有する、ヒト化抗体を含む。
【0133】
一実施形態では、ヒト化抗体は、ｉ）配列番号１６、１８、２０、２２、２４および２６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号１６、１８、２０、２２、２４および２６のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１、２および３で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号１、２および３で示される保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。
【0134】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列が配列番号４、５および６で示される、保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【0135】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１５、１７、１９、２１、２３および２５のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0136】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号１６、１８、２０、２２、２４および２６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、かつ／または軽鎖可変領域が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【0137】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータ、任意選択でヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、表４Ａに示される重鎖配列を含み、任意選択で表４Ａに示される軽鎖配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0138】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータ、任意選択でヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、配列番号１６、１８、２０、２２、２４および２６のいずれか１つの重鎖可変鎖配列および／または配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０のいずれか１つで示される軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0139】
一実施形態では、抗体は、配列番号１６と３０；配列番号１８と３２；配列番号２０と３４；配列番号２２と３６；配列番号２４と３８；もしくは配列番号３６と４０またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、ＣＤＲが表２に示される通りに維持されている配列を含む。
【0140】
別の実施形態では、ヒト化抗体は、表４Ｂに示される配列を含む。
【0141】
一実施形態では、ヒト化抗体は、ｉ）配列番号４４、４６、４８、５０、５２および５４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号４４、４６、４８、５０、５２および５４のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列がそこの下線部分で（配列番号７４～７６でも）示される配列である、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列がそこの下線部分（例えば、配列番号７４～７６）で示される配列である、保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。
【0142】
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列がそこの下線部分で（配列番号７７～７９でも）示される配列である、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）ＣＤＲ配列がそこの下線部分で（配列番号７７～７９でも）示される配列である、保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【0143】
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号４３、４５、４７、４９、５１および５３のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列；またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号５７、５９、６１、６３、６５および６７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【0144】
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号４４、４６、４８、５０、５２および５４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、かつ／あるいは軽鎖可変領域が、配列番号５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。
【0145】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、表４Ｂに示される重鎖配列を含み、任意選択で表４Ｂに示される軽鎖配列をさらに含む抗体と競合する、抗体である。
【0146】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、配列番号４４、４６、４８、５０、５２および５４のいずれか１つの重鎖可変鎖配列ならびに／あるいは配列番号５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれか１つの軽鎖可変領域配列を含む抗体と競合する、抗体である。
【0147】
一実施形態では、抗体は、配列番号４４と５８；配列番号４６と６０；配列番号４８と６２；配列番号５０と６４；配列番号５２と６６；もしくは配列番号５４と６８またはそれと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、ＣＤＲがそこの下線部分で（配列番号７４～７９でも）示される通りに維持されている配列を含む。
【0148】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ｉ）配列番号７０および／または７２で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号７０および／または７２のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を有する、定常領域を含む。
【0149】
別の実施形態では、重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号６９で示されるヌクレオチド配列；またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは抗体が、配列番号７１で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【0150】
一実施形態では、ヒト化抗体はＶＨ２Ｖｋ５の配列を含む。
【0151】
一実施形態では、ヒト化抗体はＦａｂフラグメントである。
【0152】
一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、表４Ａおよび４Ｂのいずれかの可変領域を含む。一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、ＶＨ２Ｖｋ５を含む。
【0153】
さらなる実施形態では、抗体は、表５のＩｇＧ４のＣＨ１部分および／またはＣＬ部分、その保存的バリアントあるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８９％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、抗体は、表５の配列、その保存的バリアントまたはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８９％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【0154】
一実施形態では、抗体は、配列番号１２の配列の環状ペプチドに対するＫＤが、少なくとも、もしくは約１×１０－１０、少なくとも、もしくは約８×１０－１１、少なくとも、もしくは約６×１０－１１、少なくとも、もしくは約４×１０－１１、または少なくとも、もしくは約２×１０－１１である。
【0155】
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９－９０３，１９９４）によって特定され得る。１つの方法では、特異的抗原に対するげっ歯類抗体の重鎖をクローン化し、ヒト軽鎖のレパートリーと対にして、繊維状ファージ上にＦａｂフラグメントとして提示させる。抗原との結合によりファージを選択する。次いで、選択されたヒト軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと対にしてファージ上に提示させ、再び抗原との結合によりファージを選択する。その結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントとなる。別の方法では、メンバーがその外表面に様々なヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示するファージのライブラリーを作製する（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号）。特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により、所望の特異性を有する抗体を提示するファージを選択する。いずれかの方法で特定されたヒトＦａｂフラグメントまたはヒトＦｖフラグメントを再クローン化して、哺乳動物細胞でヒト抗体として発現させ得る。
【0156】
任意選択で、ヒト抗体をトランスジェニック動物から得る（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。この方法では、キメラマウスまたは生殖系列変異体マウスの重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子を欠失させる。次いで、そのような変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する。次いで、得られたトランスジェニックマウスは抗原曝露時にヒト抗体の全レパートリーを作製することが可能になる。
【0157】
ヒト化抗体は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントまたは重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として作製される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体はモノマー型またはポリマー型で存在し得る。ヒト化抗体は任意選択で、１本の非ヒト鎖と１本のヒト化鎖（すなわち、１本のヒト化重鎖または軽鎖）とを含む。
【0158】
ヒト化抗体またはヒト抗体を含めた抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択される。ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つまたは２つ以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。
【0159】
配列番号７４～７９で示されるＣＤＲを有する抗体をコドン最適化し、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａアイソタイプにした。配列を表８に示す。
【0160】
一実施形態では、抗体は、表８に記載される配列またはその一部分を有し、その一部分は少なくともＣＤＲ、任意選択で重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、一部分は、表８の配列から選択される配列の可変鎖部分である。
【0161】
表８に示される定常領域（例えば、本明細書に記載される配列番号４２および５６などの他の配列と比較することにより決定可能である）を、配列番号１～６または１、２、８０、４～６または１、２、８０～８３を有するＣＤＲを有する抗体の可変配列と組み合わせることもできる。
【0162】
さらに、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、任意選択で、本発明の疾患特異的エピトープを用いることにより抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、その疾患特異的エピトープに特異的な抗体フラグメントを特定する。任意選択で、特定した抗体フラグメントを用いて、本発明の様々な実施形態に有用な様々な組換え抗体を作製する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えばＸｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）から市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で周知である。
【0163】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体、例えば表２に記載されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などである。
【0164】
別の実施形態では、表２に挙げるＣＤＲ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、任意選択で一本鎖抗体の形で含む、抗体が提供される。
【0165】
本明細書の抗体は一本鎖抗体であり得る。記載されるヒト化抗体はまた、一実施形態では一本鎖抗体である。
【0166】
記載したように、配列番号１２の配列を有する環状ペプチドおよび／またはヒトＡベータオリゴマーとの結合に関して、表２に記載されるＣＤＲ配列を含むか、または表３、４Ａ、４Ｂおよび８のいずれか１つに記載される配列を含む抗体と競合する、抗体も含まれる。
【0167】
抗体間の競合は、例えば、被験抗体が参照抗体と共通の抗原との特異的結合を阻害する能力を評価するアッセイを用いて判定することができる。競合結合アッセイによる測定で、過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合することになる。
【0168】
一実施形態では、抗体は単離されている。一実施形態では、抗体は外来抗体である。
【0169】
一実施形態では、抗体は、例えば実施例に記載する条件下で、単量体Ａベータと結合することはない。一実施形態では、抗体は、例えば実施例に記載する条件下で、例えばＡＤ脳組織においてｉｎ ｓｉｔｕで、老人斑のＡベータと結合することはない。
【0170】
別の実施形態では、抗体は、天然または合成のオリゴマーＡベータと比較して単量体Ａベータと選択的に結合することはない。
【0171】
一実施形態では、Ａベータオリゴマーは、Ａベータの１～４２サブユニットを含む。
【0172】
一実施形態では、抗体は、例えば免疫組織化学による測定で、Ａベータ線維斑（老人斑とも呼ばれる）染色を示さない。斑染色がみられないことは、Ａベータ特異的抗体である６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）または２Ｃ８（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミングデール、ニューヨーク州）などの陽性対照ならびにアイソタイプ対照と比較することにより評価することができる。本明細書に記載される抗体は、その抗体が典型的な斑形態染色を示さず、染色のレベルがＩｇＧ陰性アイソタイプ対照でみられるレベルの２倍と同等またはそれ以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さない、またはほとんど示さないことになる。尺度は、例えば、アイソタイプ対照での染色レベルを１に設定し、６Ｅ１０での染色レベルを１０に設定することができる。抗体は、そのような尺度で染色レベルが２以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さないことになる。実施形態では、抗体は、例えば上記の尺度で、最小限のＡベータ線維斑染色を示し、そのレベルのスコアは少なくとも３程度または３未満である。
【0173】
さらなる態様は、治療剤、検出可能な標識または細胞毒性物質とコンジュゲートした抗体である。一実施形態では、検出可能な標識は陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えばＰＥＴ撮像で使用され得る。
【0174】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体および／またはその結合フラグメントとオリゴマーＡベータとを含む、抗体複合体に関する。
【0175】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体またはその一部をコードする、単離核酸である。
【0176】
重鎖もしくは軽鎖またはその一部をコードする核酸、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２および／またはＣＤＲ－Ｈ３領域を含む重鎖をコードする、または本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２および／またはＣＤＲ－Ｌ３領域を含む軽鎖、本明細書に記載される可変鎖をコードする核酸ならびにそのコドン最適化型およびコドン縮重型も提供される。
【0177】
本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列のバリアントを提供する。例えば、バリアントとしては、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列またはコドン縮重配列もしくはコドン最適化配列が挙げられる。別の実施形態では、バリアント核酸配列は、表２、３、４Ａ、４Ｂおよび８に示されるいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【0178】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体をコードする単離核酸、例えば、表２、３、４Ａ、４Ｂおよび８のいずれかに示される核酸である。
【0179】
別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む発現カセットまたはベクターである。一実施形態では、ベクターは単離ベクターである。
【0180】
ベクターは、抗体および／またはその結合フラグメントの作製あるいは本明細書に記載されるペプチド配列の発現に適したベクターを含めた任意のベクターであり得る。
【0181】
核酸分子を既知の方法で、タンパク質を確実に発現させる適切な発現ベクター内に組み込み得る。考え得る発現ベクターとしては、特に限定されないが、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは使用する宿主細胞と適合性のあるものであるべきである。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適した」ものであり、これは、その発現ベクターが、本明細書に記載されるエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含んでいることを意味する。
【0182】
一実施形態では、ベクターは、遺伝子治療により例えば一本鎖抗体を発現させるのに適したものである。ベクターは、例えば神経特異的プロモーターなどを用いて、神経組織での特異的発現に適合させることができる。一実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を送達するのに用いることができる。
【0183】
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。
【0184】
このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
【0185】
一実施形態では、制御配列は、神経組織および／または細胞での発現を指令する、または増大させる。
【0186】
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【0187】
組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載される抗体またはエピトープペプチドを発現させるためにベクターにより形質転換、感染または形質移入した宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。
【0188】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性を増大させる；組換えペプチドの溶解度を増大させる；ならびに例えば本明細書に記載されるタグおよび標識を含めたアフィニティー精製のリガンドとして作用することにより標的組換えペプチドの精製を補助する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする、発現カセットを含み得る。さらに、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加して、融合タンパク質精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させるものである。
【0189】
例えばニューロンおよび神経組織内にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で遺伝子を導入するシステムとしては、ウイルス、中でもとりわけ単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスを含めたレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。これに代わる遺伝子送達の方法としては、裸のプラスミドＤＮＡおよびリポソーム－ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる。また別の方法として、ＤＮＡをポリカチオン濃縮して脂質に封入し、脳内遺伝子送達により脳内に導入する、ＡＡＶプラスミドの使用（Ｌｅｏｎｅら，米国特許出願公開第２００２０７６３９４号）がある。
【0190】
したがって、別の態様では、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターおよび抗体をリポソーム、ナノ粒子およびウイルスタンパク質粒子などの小胞に製剤化し、例えば、本明細書に記載される抗体、化合物、免疫原および核酸を送達し得る。特に、ポリマーソームを含めた合成ポリマー小胞を用いて抗体を投与することができる。
【0191】
別の態様では、本明細書に記載される抗体を発現する、または本明細書に開示されるベクターを含む細胞、任意選択で単離細胞および／または組換え細胞も提供される。
【0192】
組換え細胞は、ポリペプチドの産生に適した、例えば抗体および／またはその結合フラグメントの産生に適した任意の細胞を用いて作製することができる。例えば、核酸（例えば、ベクター）を細胞内に導入するには、用いるベクターに応じて、細胞に形質移入し得る、細胞を形質転換し得る、または細胞に感染させ得る。
【0193】
適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させ得る。
【0194】
一実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、蠕虫細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
【0195】
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞である。
【0196】
一実施形態では、細胞は神経細胞である。
【0197】
抗体またはペプチドを発現させるのに適した酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、特に限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の様々な種が挙げられる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌を形質転換させるプロトコルは当業者に周知である。
【0198】
適切であり得る哺乳動物細胞としては、特にＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ－１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来のもの）ならびにその他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。
【0199】
一実施形態では、細胞はハイブリドーマ細胞などの融合細胞であり、ハイブリドーマ細胞は、例えばＡベータモノマーよりＡベータオリゴマーと選択的に結合する、直鎖状化合物より環状化合物中に存在するエピトープ配列と選択的に結合する、または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない抗体を含めた、本明細書に記載されるエピトープまたはエピトープ配列に特異的かつおよび／または選択的な抗体を産生する。
【0200】
さらなる態様は、本明細書に記載されるＣＤＲのセットを含む抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞系である。
【0201】
ＩＩＩ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載される核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
さらなる態様は、本明細書に記載される核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
【0202】
一実施形態では、組成物は希釈剤を含む。
【0203】
核酸に適した希釈剤としては、特に限定されないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。
【0204】
抗体もしくはそのフラグメントを含めたポリペプチドおよび／または細胞に適した希釈剤としては、特に限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液あるいはポリペプチドおよび／または細胞を凍結させるのに適した他の溶液が挙げられる。
【0205】
一実施形態では、組成物は、本明細書に開示される抗体、核酸またはベクターのいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
【0206】
本明細書に記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製する既知の方法それ自体により、任意選択でワクチンとして、有効量の活性物質が薬学的に許容される溶媒との混合物の形で組み合わさるように調製することができる。
【0207】
医薬組成物としては、特に限定されないが、凍結乾燥粉末剤または水性もしくは非水性の無菌注射用液剤もしくは無菌注射用懸濁剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を目的とする被投与者の組織または血液に実質的に適合させる溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に存在し得るその他の成分としては、例えば水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。無菌粉末剤、顆粒剤、錠剤または濃縮した液剤もしくは懸濁剤から即時注射液剤および即時注射懸濁剤を調製し得る。組成物は、例えば、特に限定されないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構築する凍結乾燥粉末として供給され得る。
【0208】
医薬組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。適切な薬学的に許容される担体は、実質的に化学的に不活性かつ無毒性であり医薬組成物の生物活性の効果に干渉しない組成物を含む。適切な医薬担体の例としては、特に限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル－エタノールアミン（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ－ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）およびリポソームが挙げられる。このような組成物は、患者に直接投与する形態になるように、治療有効量の化合物を適量の担体とともに含有するべきである。
【0209】
組成物は薬学的に許容される塩の形態であり得、このような塩としては、特に限定されないが、遊離アミノ基を用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などおよび遊離カルボキシル基とともに形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアルニノエタノール（２－ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ ｅｔｈａｎｏｌ）に由来する塩などが挙げられる。
【0210】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体と希釈剤とを含む。一実施形態では、組成物は無菌組成物である。
【0211】
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体とＡベータ、任意選択でＡベータオリゴマーとを含む、抗体複合体を含む。複合体は、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏで、溶液中のもの、または組織中に含まれるものであり得る。
【0212】
ＩＶ．キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入ったｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）前記抗体またはその一部の核酸、ｉｉｉ）本明細書に記載される抗体、核酸または細胞を含む組成物あるいはｉｖ）本明細書に記載される組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入ったｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）前記抗体またはその一部の核酸、ｉｉｉ）本明細書に記載される抗体、核酸または細胞を含む組成物あるいはｉｖ）本明細書に記載される組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
【0213】
一実施形態では、キットは、収集バイアル、標準緩衝液および検出試薬のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。
【0214】
別の実施形態では、キットは、アルツハイマー病またはオリゴマーＡベータが関与する病態の診断またはモニタリングのためのものである。
【0215】
Ｖ．方法
本明細書に記載される抗体を作製する方法が含まれる。
本明細書に記載される抗体を作製する方法が含まれる。
【0216】
具体的には、本明細書に記載される抗体を用いてＨＨＱＫ（配列番号７）の立体配座エピトープに選択的な本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、対象、任意選択で非ヒト対象に本明細書に記載されるエピトープ配列を含む環状化合物を投与することと、抗体産生細胞または本明細書に記載されるＣＤＲを含む抗体を単離することとを含む、方法が提供される。
【0217】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するためのものである。
【0218】
別の実施形態では、キメラ抗体またはその結合フラグメントを作製する方法が提供され、この方法は、組換え技術を用いて、本明細書に記載される抗体（重鎖および／または軽鎖）の可変領域をコードする核酸を任意選択でＦｃ部分を有するか有さないヒト抗体定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）をコードする核酸を含むベクターにサブクローニングし、キメラ抗体ベクターを作製することと；キメラ抗体ベクターを細胞内で発現させることと；抗体を単離することとを含む。一実施形態では、キメラはマウスヒトキメラである。
【0219】
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、ヒト化抗体を作製するためのものである。一実施形態では、この方法は、キメラ中間体を作製することを含む。キメラ中間体の可変領域に例えば変異を誘発して、ＣＤＲ領域外部の１つまたは複数のアミノ酸変化を導入する。別の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数のＣＤＲコード配列をヒト抗体スキャフォールドに挿入する。
【0220】
環状化合物を用いて作製した抗体を本明細書および実施例に記載される通りに選択する。一実施形態では、この方法は、任意選択で本明細書に記載される方法を用いて、直鎖状ペプチドより環状ペプチドと特異的または選択的に結合し、エピトープ配列に特異的であり、オリゴマーと特異的に結合し、かつ／あるいはｉｎ ｓｉｔｕの斑および／または対応する直鎖状ペプチドと結合しない、またはほとんど結合しない抗体を単離することを含む。
【0221】
さらなる態様では、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出する方法であって、生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること、および／または何らかの抗体複合体の存在を検出することを含む、方法が提供される。一実施形態では、この方法は、生体試料がオリゴマーＡベータを含むかどうかを検出するためのものである。
【0222】
一実施形態では、この方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の生成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の生成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
【0223】
一実施形態では、形成された複合体のレベルを、適切なＩｇ対照または無関係な抗体などの被験抗体と比較する。
【0224】
一実施形態では、検出を定量化し、生成した複合体の量を測定する。測定は、例えば標準物質に対して相対的なものであり得る。
【0225】
一実施形態では、測定された量を対照と比較する。
【0226】
別の実施形態では、この方法は、
（ａ）抗体－抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の被験試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと；
（ｂ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を測定することと；
（ｃ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を対照と比較することと
を含み、
対照と比較して被験試料中に抗体－抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。
（ａ）抗体－抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の被験試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと；
（ｂ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を測定することと；
（ｃ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を対照と比較することと
を含み、
対照と比較して被験試料中に抗体－抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。
【0227】
対照は、試料対照（例えば、ＡＤを有さない対象または軽度、中等度もしくは進行型といった特定の型のＡＤを有する対象に由来するもの）または対象のＡベータオリゴマーレベルの変化をモニターするための同じ対象由来の以前の試料であり得る。あるいは、対照は、ＡＤの有無を問わない複数の患者から得た値であり得る。
【0228】
一実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるＣＤＲ配列を有する抗体である。一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体である。
【0229】
一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含む。一実施形態では、試料は、全血、血漿または血清を含む。一実施形態では、試料はヒト対象から採取されるものである。一実施形態では、対象は、ＡＤが疑われる、ＡＤのリスクがある、またはＡＤを有する。
【0230】
本明細書に記載される抗体を用いてＡベータ：抗体複合体を検出し、それにより試料中にＡベータオリゴマーが存在するかどうかを判定するには、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲおよび免疫沈降とそれに続くＳＤＳ－ＰＡＧＥ免疫細胞化学などの免疫測定法を含めたいくつかの方法を用いることができる。
【0231】
実施例に記載するように、表面プラズモン共鳴技術を用いて立体配座特異的結合を評価することができる。抗体を標識する、または複合体の抗体に特異的で検出可能に標識した二次抗体を用いる場合、その標識を検出することができる。一般に用いられる試薬としては、蛍光発光抗体およびＨＲＰ標識抗体が挙げられる。定量的方法では、発生したシグナルの量を標準物質または対照との比較により測定することができる。測定はまた、相対的なものであり得る。
【0232】
さらなる態様は、対象または組織中のＡベータのレベルを測定する、またはそのようなＡベータを撮像する方法であって、任意選択で、測定または撮像するＡベータがオリゴマーＡベータである、方法を含む。一実施形態では、この方法は、ＡＤを有するリスクがある、ＡＤを有することが疑われる、またはＡＤを有する対象に検出可能な標識とコンジュゲートした本明細書に記載の抗体を投与することと；標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することとを含む。標識は、一実施形態では、例えばＰＥＴ撮像に使用することができる陽電子放出放射性核種である。
【0233】
この方法を他のＡＤまたは認知障害の検査法と組み合わせてもよい。例えば、ＣＳＦ中のＳＮＡＰ－２５またはシナプス小胞糖タンパク質２ａ（ＳＶＧ２ａ）などのシナプスタンパク質（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６ Ｊｕｌ ２０；８（３４８）：３４８ｒａ９６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｆ６６６７）のレベルを測定することができる。例えば、フロウロデオキシグルコース（ｆｌｏｕｒｏｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）ＰＥＴ（ＦＤＧ－ＰＥＴ）をシナプス代謝の間接的測定に用いる。
【0234】
本明細書に記載される抗体を使用するＡベータレベル検出を単独で、または治療に対する反応をモニターする他の方法と組み合わせて用いることができる。
【0235】
本明細書では、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）に対して生じさせた、本明細書に記載されるＣＤＲのセットを含む抗体が、Ａベータオリゴマーと特異的かつ／または選択的に結合することが可能であることを示す。オリゴマーＡベータ種は、ＡＤにおいて毒性のある伝播性の種であると考えられる。さらに、図１に示し実施例に記載するように、これらの抗体は、オリゴマーに特異的であり、Ａベータの凝集およびＡベータオリゴマーの伝播を阻害した。したがって、Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載のＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体を、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させて、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマーの伝播を阻害することを含む、方法も提供される。実施例に記載するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイをモニターすることができる。
【0236】
抗体はまた、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患の治療に有用であり得る。例えば、レビー小体型認知症のバリアントおよび封入体筋炎（筋肉疾患の１つ）では、ＡＤと類似した斑がみられ、Ａベータが脳アミロイド血管症に関与する凝集体を形成することもある。記載されるように、ＣＤＲのセットを含み、本明細書に記載されるヒト化抗体の配列中にある抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＤの毒素原性のＡベータ種であると考えられるオリゴマーＡベータと結合し、毒素原性Ａベータオリゴマーの形成を阻害する。
【0237】
したがって、さらなる態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象に有効量の本明細書に記載のＣＤＲのセットを含む本明細書に記載の抗体、任意選択で表４Ａもしくは４Ｂに記載される、または選択的なヒト化抗体を、あるいは必要とする対象に前記抗体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。他の実施形態では、任意選択で対象に核酸を送達するのに適したベクターを用いて、本明細書に記載される抗体をコードする核酸を対象に投与することもできる。
【0238】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料のＡベータの存在またはレベルを評価する。一実施形態では、検出可能なＡベータレベル（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される、または撮像により測定されるＡベータ抗体複合体）を有する対象を抗体で治療する。
【0239】
抗体、ペプチドおよび核酸を例えば、本明細書に記載される医薬組成物に含ませ、例えば小胞に製剤化して送達を改善することができる。
【0240】
ＨＨＱＫ（配列番号７）を標的とする１つまたは複数の抗体を組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書に開示される抗体をベータセクレターゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ阻害剤などの１つまたは複数の他の治療剤とともに投与することができる。
【0241】
また、ＡＤまたはＡベータアミロイド関連疾患の治療への組成物、抗体、単離ペプチドおよび核酸の使用が提供される。
【0242】
本明細書に記載される組成物、抗体、単離ペプチドおよび核酸、ベクターなどを、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼窩内投与、点眼、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾール投与または経口投与により投与することができる。
【0243】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。
【0244】
他の実施形態では、医薬組成物を脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。例えば、このような方法は、埋込み型カテーテルおよびポンプの使用を含み、これらはカテーテルを通して注入部位に所定用量を放出するものである。当業者にはさらに、カテーテルは、それを可視化して脳内の所望の投与部位または注入部位に隣接する位置に配置することが可能な外科技術により埋め込まれ得ることが理解されよう。このような技術は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｙ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ」に記載されている。また、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号（ＫａｐｌｉｔｔおよびＤｕｒｉｎｇ，「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｆｕｓｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ」）に記載されているものなどの方法が企図される。脳およびＣＮＳの他の部分に薬物を送達する装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＥＬ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、ミネアポリス、ミネソタ州）。
【0245】
別の実施形態では、血液脳関門を通過する受容体介在型輸送が可能になるよう投与する化合物を修飾するなどの方法を用いて、医薬組成物を脳に投与する。
【0246】
他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、抗体、単離ペプチドおよび核酸と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との共投与が企図される。
【0247】
また、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、抗体、単離ペプチドおよび核酸を、血液脳関門を通過させて投与する方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されている、血液脳関門の透過性を一時的に増大させることを目的とする方法などが企図される。
【0248】
上の開示は本願を全体的に説明するものである。以下の具体例を参照することにより、さらに十全に理解することができる。これらの例は単に説明を目的として記載されるものであって、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって好都合であることが示唆される、または好都合である場合、形態の変更および均等物による置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明的な意味で意図されるものであって、限定を目的とするものではない。
【0249】
以下の非限定的な例は本開示を例示するものである。
【0250】
（実施例）
実施例１
抗体作製
方法および材料
免疫原
シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）ペプチド（環状および直鎖状の両方）をＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で作製し、トリフルオロ酢酸塩対イオンプロトコルを用いてＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。同じ配列ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号１２）の直鎖状ペプチドも作製した。
実施例１
抗体作製
方法および材料
免疫原
シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）ペプチド（環状および直鎖状の両方）をＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で作製し、トリフルオロ酢酸塩対イオンプロトコルを用いてＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。同じ配列ＣＧＨＨＱＫＧ（配列番号１２）の直鎖状ペプチドも作製した。
【0251】
抗体
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を作製した。
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を作製した。
【0252】
融合／ハイブリドーマの発育
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。ＨＡＴ選択を用いて融合細胞を培養した。
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。ＨＡＴ選択を用いて融合細胞を培養した。
【0253】
ハイブリドーマの解析
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド－ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。選択されたクローンについて抗体捕捉ＥＬＩＳＡによりアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、選択されたクローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性およびリンカー反応性を評価した。抗体をＳＰＲ解析でもスクリーニングした。
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド－ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。選択されたクローンについて抗体捕捉ＥＬＩＳＡによりアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、選択されたクローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性およびリンカー反応性を評価した。抗体をＳＰＲ解析でもスクリーニングした。
【0254】
ＥＬＩＳＡ抗体スクリーニング
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロペプチドコンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェル；２）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ペプチドコンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド １００ｕＬ／ウェルでコートした。３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルの一次抗体：ハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１：１０，０００の１００ｕＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロペプチドコンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェル；２）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ペプチドコンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド １００ｕＬ／ウェルでコートした。３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルの一次抗体：ハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１：１０，０００の１００ｕＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
【0255】
ＳＰＲ結合アッセイ
抗体と環状ペプチド、Ａベータモノマーおよびオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
Ａベータモノマーおよびオリゴマーの調製：氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭにすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間～７日間インキュベートした。
抗体と環状ペプチド、Ａベータモノマーおよびオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
Ａベータモノマーおよびオリゴマーの調製：氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭにすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間～７日間インキュベートした。
【0256】
環状ペプチド、Ａベータモノマーおよびオリゴマー結合のＳＰＲ解析：高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて、全ＳＰＲ測定を実施した。ＳＰＲ直接結合アッセイを用いて組織培養上清の一次スクリーニングを実施し、このアッセイでは、Ｈｉｇｈ Ａｍｉｎｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）の個々のフローセル上にＢＳＡコンジュゲートペプチド、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に抗体を流した。各試料を希釈し、固定化したペプチドおよびＢＳＡ参照の表面に二重反復で注入し、次いで、解離相にのみランニング緩衝液を注入した。解析サイクル毎に、センサーチップ表面を再生した。ＢＳＡ参照表面およびブランクランニング緩衝液注入から結合を減算することによりセンサグラムを二重参照し、解離相の結合応答報告点を収集した。
【0257】
プロテインＧで精製したｍＡｂを、ＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いて二次スクリーニングで解析し、このアッセイでは、プロテインＡ誘導体化センサーチップ（ＸａｎＴｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ社、デュッセルドルフ、ドイツ）上に抗体を固定化し、表面にＡベータ４０モノマー、Ａベータ４２オリゴマー、プールした可溶性脳抽出物を流した。ＳＰＲ直接結合アッセイで、ＨＡＣセンサーチップの個々のフローセル上にＡベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に精製ｍＡｂを流すことにより抗体の特異性を検証した。
【0258】
抗体のシーケンシング
重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域のシーケンシングを実施した。標準的なＲＴ－ＰＣＲを用いて、ハイブリドーマが発現した免疫グロブリン遺伝子転写物をハイブリドーマ細胞から得たｃＤＮＡから増幅し、標準的なダイターミネーターキャピラリーシーケンシング法を用いてシーケンシングを実施した。
重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域のシーケンシングを実施した。標準的なＲＴ－ＰＣＲを用いて、ハイブリドーマが発現した免疫グロブリン遺伝子転写物をハイブリドーマ細胞から得たｃＤＮＡから増幅し、標準的なダイターミネーターキャピラリーシーケンシング法を用いてシーケンシングを実施した。
【0259】
ヒト化抗体
３０１－１７のヒト化ＩｇＧ４抗体構築物を調製し、シーケンシングを実施した（Ａｂｚｅｎａ社、ケンブリッジ、イギリス）。
３０１－１７のヒト化ＩｇＧ４抗体構築物を調製し、シーケンシングを実施した（Ａｂｚｅｎａ社、ケンブリッジ、イギリス）。
【0260】
簡潔に述べれば、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて、ハイブリドーマ３０１－１７細胞ペレットからＲＮＡを抽出した。マウス抗体シグナル配列の縮重プライマープールをＩｇＧおよびＩｇκそれぞれの定常領域プライマーとともに用いて、Ｖ領域をＲＴ－ＰＣＲにより増幅した。ＶＨシグナル配列に特異的な６つの縮重プライマープール（Ａ～Ｆ）からなるセットをＩｇＧ特異的定常領域プライマーとともに用いて、重鎖Ｖ領域ｍＲＮＡを増幅した。７つがカッパクラスター（Ｉｇκ－Ａ～Ｉｇκ－Ｇ）、１つがラムダクラスター（Ｉｇλ）に対するものである８つのシグナル配列特異的縮重プライマープールをκまたはλ定常領域プライマーとともに用いて、軽鎖Ｖ領域ｍＲＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、「ＴＡ」クローニングベクター（ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）にクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、個々のコロニーについてシーケンシングを実施した。
【0261】
可変領域を用いてハイブリドーマからキメラ構築物（Ｖ０Ｈ０およびＶ０ｋ０）を調製し、それをヒトＩｇＧ４フレームワーク内にクローン化した。次いで、キメラ構築物をヒト化して６つのヒト化重鎖（ＶＨ１～６）および６つの軽鎖（Ｖｋ１～６）を作製した。ＶＨ１～６構築物およびＶｋ４～６構築物を混合して、様々なヒト化抗体、例えばＶＨ２Ｖｋ４を作製した。
【0262】
Ｓ２４１Ｐヒンジバリアントは、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）のＮ末端にあるＣｙｓ（Ｋａｂａｔ位置１２７）のＳｅｒへの変異およびＣＨ１のＣ末端の様々な位置（位置２２７～２３０）へのＣｙｓの導入により、ＩｇＧ４分子のジスルフィド結合の配置が変化している。ＬＣ－ＣＨ１間ジスルフィド結合が形成される［１７］。
【0263】
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術を用いて完全ヒト化抗体を調製した。ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐヒンジバリアント）重鎖定常ドメインとヒトカッパ軽鎖定常ドメインとをコードするベクターにヒト化可変領域遺伝子をクローン化した。ＣＨＯ細胞にキメラ抗体およびヒト化抗体を一過性に発現させ、プロテインＡを精製し、試験した。いずれの３０１－１７ヒト化抗体も、ＢＳＡとコンジュゲートした環状ペプチドと選択的に結合し、結合親和性が、参照キメラ抗体の２倍以内であり、参照モノクローナル抗体の１０倍および約２０倍を上回るものであった。環状ペプチドに対して、キメラ抗体およびヒト化抗体はＫＤ（Ｍ）が約２×１０－１１であったのに対し、モノクローナル抗体のＫＤは４×１０－１０であった。このことは、図２に示されるように、オリゴマーＡベータに対する親和性が改善されたと解釈される。
【0264】
単一サイクルＢｉａｃｏｒｅ解析を用いて結合を明らかにした。抗体を２つの別個の実験で解析した。
【0265】
ヒト化抗体配列を表４Ｂに示す（３０１－１７）。各抗体配列のＣＤＲ配列を太字および下線で示す。３０１－１１または本明細書に記載される任意の他の抗体のＣＤＲを、例えば表４Ａに示されるヒト化構築物のＣＤＲの代わりに用いることができる。
【0266】
結果
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンが直鎖状ペプチドよりシクロペプチドと優先的に結合することがわかった。シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）に対して生じさせたクローン３０１－３、３０１－１１および３０１－１７をさらなる解析に選択した。
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンが直鎖状ペプチドよりシクロペプチドと優先的に結合することがわかった。シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）に対して生じさせたクローン３０１－３、３０１－１１および３０１－１７をさらなる解析に選択した。
【0267】
アイソタイピングでは、３０１－３、３０１－１１および３０１－１７がＩｇＧ３サブタイプであることがわかった。
【0268】
抗体が上記の通りに調製した環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ１～４２モノマーおよびＡベータ１～４２オリゴマーと結合する能力を１つまたは複数のアッセイで試験した。
【0269】
ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲアッセイにより、上記のクローンが直鎖状ペプチドよりシクロペプチドと優先的に結合し（かつ無関係な環状ペプチドとの交差反応を示さず）かつ／またはモノマーよりＡβオリゴマーと優先的に結合することが確認された。ハイブリドーマ培養上清にＳＰＲを用いた結合解析の結果を表１Ａに示す。
【0270】
ハイブリドーマ上清から精製した抗体を固定化し、そのＡベータオリゴマーとの結合能をＳＰＲによりアッセイした。その結果を表１Ｂに示す。
【0271】
【表2】
【0272】
【表3】
【0273】
抗体の配列
クローン３０１－３、３０１－１１および３０１－１７抗体のシーケンシングを実施した。３０１－３および３０１－１１のＣＤＲ配列を表２に記載する。３０１－１７のＣＤＲを配列番号７４～７９に記載する。抗体の重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびポリペプチド配列を表３に記載する。
クローン３０１－３、３０１－１１および３０１－１７抗体のシーケンシングを実施した。３０１－３および３０１－１１のＣＤＲ配列を表２に記載する。３０１－１７のＣＤＲを配列番号７４～７９に記載する。抗体の重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびポリペプチド配列を表３に記載する。
【0274】
表２に示されるように、３０１－３と３０１－１１の重鎖ＣＤＲはＣＤＲ１およびＣＤＲ２が一致しており、ＣＤＲ３が１つの位置で異なっていた。
【0275】
２つの軽鎖のシーケンシングを実施した。１つの軽鎖は３０１－１１の軽鎖とほぼ一致していた。
【0276】
３０１－１７のヒト化抗体を調製しシーケンシングを実施した（Ａｂｚｅｎａ社、ケンブリッジ、イギリス）。ヒト化抗体の配列を表４Ａ（３０１－１１）および４Ｂ（３０１－１７）に記載する。各抗体の配列のＣＤＲ配列を太字および下線で示す。
【0277】
【表4】
【0278】
【表5】
【0279】
【表6】
【0280】
【表7】
【0281】
【表8】
【0282】
実施例２
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的染色をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびに精製抗体３０１－１１および３０１－１７。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率でキャプチャーした。Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ Ａｕｔｏ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的染色をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびに精製抗体３０１－１１および３０１－１７。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率でキャプチャーした。Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ Ａｕｔｏ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。
【0283】
脳抽出物：ＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（Ｃ０４－０５９５）から承認を受け、メリーランド大学のＢｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋからヒト脳組織を入手した。ＡＤの可能性があるという臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準［５］に基づくものとした。
【0284】
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳおよび無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ラヴァル、ケベック州、カナダ）に浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホノジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）した。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかた（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、－８０℃で保管した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求めた。
【0285】
抗体６Ｅ１０を用いて脳抽出物での陽性結合を確認した。
ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
【0286】
結果
脳抽出物、ＣＳＦおよび免疫組織化学
死体健常対照およびＡＤの脳の可溶性脳抽出物、ＣＳＦおよび組織試料中での抗体のＡベータとの結合能を試験し、結果を表６に示す。表６の陽性強度は正符号の数で示されている。
脳抽出物、ＣＳＦおよび免疫組織化学
死体健常対照およびＡＤの脳の可溶性脳抽出物、ＣＳＦおよび組織試料中での抗体のＡベータとの結合能を試験し、結果を表６に示す。表６の陽性強度は正符号の数で示されている。
【0287】
抗体３０１－１１および３０１－１７はそれぞれ、対照患者と比較してＡＤ患者の脳ホモジネートおよびＣＳＦで陽性の結合を示した。
【0288】
表６に示されるように、精製抗体は、可溶性脳抽出物およびＣＳＦ中で非ＡＤよりＡＤとの優先的な結合を示し、ＩＨＣによる斑線維とはあまり結合しなかった。
【0289】
【表9】
【0290】
実施例３
Ａベータ合成オリゴマーとの結合
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、精製抗体をセンサーチップに共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（１ｍｉｃｒｏＭ）（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）の表面に注入した。
Ａベータ合成オリゴマーとの結合
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、精製抗体をセンサーチップに共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（１ｍｉｃｒｏＭ）（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）の表面に注入した。
【0291】
抗体３０１－３、３０１－１１および３０７－１７は安定なＡベータ４２オリゴマー（１ｍｉｃｒｏＭ）と結合し、結合応答単位（ＢＲＵ）の平均値はそれぞれ１４．５（３０１－３）、１９．３（３０１－１１）および３０（３０１－１７）であった。比較すると、陰性対照ＩｇＧ１はオリゴマーと有意に結合することはなく（結合の平均値はＢＲＵ２．５）、汎Ａβ陽性対照抗体６Ｅ１０は平均ＢＲＵ９０で結合した。
【0292】
実施例４
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
抗体３０１－１１、３０１－１７を用いてヒトＡＤ脳組織切片を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を選択した抗体クローンとともに含めた。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が画像を盲検的に解析した。
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
抗体３０１－１１、３０１－１７を用いてヒトＡＤ脳組織切片を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を選択した抗体クローンとともに含めた。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が画像を盲検的に解析した。
【0293】
下の表７に示されるように、固定組織を用いると、被験抗体は老人斑アミロイドの特異的染色が陰性であった。陽性対照として用いた６Ｅ１０抗体は強い斑染色を示した。
【0294】
【表10】
【0295】
実施例５
組換えＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体
ハイブリドーマ由来３０１－１７のＣＤＲをマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの主鎖に移植することにより組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ３０１－１７構築物を作製した（ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）。その配列を表８に記載する。
組換えＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体
ハイブリドーマ由来３０１－１７のＣＤＲをマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの主鎖に移植することにより組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ３０１－１７構築物を作製した（ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）。その配列を表８に記載する。
【0296】
【表11】
【0297】
以下に記載するように、組換え３０１－１７ ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体の結合特性を試験し、親ハイブリドーマ精製ＩｇＧ３抗体と比較した。
【0298】
３０１－１７ ＩｇＧ２ａのＡｂＯとのＰｒｏｔｅＯｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＢｉｏＲａｄ社）結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ２ａおよびハイブリドーマ精製３０１－１７ ＩｇＧ３を抗マウスＩｇＧまたはアミンカップリングによりＰｒｏｔｅｏｎ ＧＬＭ Ｓｅｎｓｏｒチップ上で捕捉し、ＡｂＯ結合（ＳｙｎＡｇｉｎｇ ＡｂＯ）を試験した。ＡｂＯ ３倍希釈物：１ｕＭ、０．３３ｕＭ、０．１１ｕＭ、３７ｎＭ、１２．３ｎＭを使用した。アッセイ緩衝液はＰＢＳ－Ｅ＋Ｔｗｅｅｎ２０＋２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとした。
【0299】
結果：
およその動態値は次の通りであった：
ハイブリドーマ：ＫＤ＝２６．９ｎＭ
ＩｇＧ２ａ－３０１－１７抗体：ＫＤ＝１６．２～１９．５ｎＭ
対照マウスＩｇＧでは結合は検出されなかった。
およその動態値は次の通りであった：
ハイブリドーマ：ＫＤ＝２６．９ｎＭ
ＩｇＧ２ａ－３０１－１７抗体：ＫＤ＝１６．２～１９．５ｎＭ
対照マウスＩｇＧでは結合は検出されなかった。
【0300】
３０１－１７ ＩｇＧ２ａの環状ペプチドエピトープとのＰｒｏｔｅＯｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＢｉｏＲａｄ社）結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ２ａをＰｒｏｔｅｏｎ ＧＬＨバイオセンサーチップにアミンカップリングさせ、ＢＳＡとカップリングした配列番号２のシクロペプチドとの結合を試験した。シクロ－ＢＳＡの９ｎＭ～１１１ｐＭの３倍希釈物を使用した。アッセイ緩衝液をＰＢＳ－Ｅ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとした。抗体３０１－１７ ＩｇＧ２ａはＢＳＡとコンジュゲートした環状ペプチド（配列番号１２）と結合し、ＫＤは約１７ｐＭ（３回の試験の平均値）であることがわかった。試験した他の市販のＡベータ抗体（汎Ａベータ６Ｅ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）およびウサギ抗Ａベータ抗体（Ｄ５４Ｄ２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社；ａｂ２０１０６０、（ａｂｃａｍ社；ＮＢＰ１－７８００７、Ｎｏｖｕｓ社）では結合が全くまたはほとんど検出されなかった。
【0301】
３０１－１７ ＩｇＧ１のＡｂＯとのＭＡＡＳ－２結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ１およびハイブリドーマ精製３０１－１７ ＩｇＧ３をＭＡＡＳ－２センサーチップ上に固定化し、１ｕＭのＡｂＯ（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）との結合を試験した。試験条件下では、２回の試験で組換えＩｇＧ１ ３０１－１７抗体の方がハイブリドーマ精製抗体より大きいシグナルが発生した（それぞれ４０～５５ＢＲＵ対１５～２５ＢＲＵ）。対照マウスＩｇＧでは結合がほとんどまたは全く検出されなかった。
【0302】
３０１－１７ ＩｇＧ１の環状ペプチドエピトープとのＭＡＡＳ－２結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ１をＭＡＡＳ－２センサーチップ上に固定化し、ＢＳＡとカップリングした配列番号１２のシクロペプチドとの結合をｐＨ６．５、７．５または８．０で試験した。３０１－１７ ＩｇＧ１では、３種類のいずれのｐＨ条件下でも等しく高いレベルの結合がみられた（約４００ＢＲＵ）。対照マウスＩｇＧ、汎Ａベータ６Ｅ１０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）ともに、いずれのｐＨ条件下でも結合がほとんどまたは全く検出されなかった。
【0303】
実施例６
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には、同時に増大するベータシート形成が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１～４２（Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１～４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光の測定値（４４０ｎｍで励起、４８６ｎｍで発光）を記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には、同時に増大するベータシート形成が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１～４２（Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１～４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光の測定値（４４０ｎｍで励起、４８６ｎｍで発光）を記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
【0304】
ＴｈＴ蛍光によりモニターしたＡβ４２凝集は、蛍光が最小である最初の遅滞期、蛍光が急激に増大する対数期および最後にＡβ分子種が平衡状態にあり蛍光の増大がみられないプラトー期を特徴とするＳ字形を示した。Ａβ４２と無関係のマウス抗体との共インキュベーションでは、凝集過程に対する有意な効果が全くみられなかった。これとは対照的に、Ａβ４２と被験抗体との共インキュベーションでは、凝集過程のいずれの期も完全に阻害された。抗体３０１－１１で得られた結果を図１に示す。
【0305】
３０１－１７および３０１－３でもほぼ同じ結果が得られた。
【0306】
ＴｈＴ凝集アッセイは、ＡＤの病理発生に極めて重要なＡβ伝播ならびにモノマー、オリゴマー、前原線維および線維からのＡβ凝集のｉｎ ｖｉｖｏの生物物理学的／生化学的段階を模倣するものであることから、これらの抗体はこの過程を完全に打ち消す可能性を秘めている。マウスＩｇＧ対照抗体を用いて実施したアイソタイプ対照では阻害がみられなかった。
【0307】
実施例７
毒性阻害アッセイ
抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
毒性阻害アッセイ
抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
【0308】
抗体および対照ＩｇＧをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬなどの濃度に調節する。様々なモル比のＡベータオリゴマーと抗体を溶媒対照、Ａベータオリゴマー単独および神経保護ペプチドのヒューマニンＨＮＧなどの陽性対照とともに試験する。
【0309】
例示的設定を表９に示す。
【0310】
室温で１０分間プレインキュベートした後、培地で体積を８４０マイクロリットルに調節する。この溶液を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、溶液を一次皮質ニューロンに直接添加し、細胞を２４時間インキュベートする。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を求めることができる。
【0311】
【表12】
【0312】
Ａベータオリゴマーの不在下では、３０１－１７抗体は単独で神経細胞の生存率に何ら影響を及ぼすことはなかった。Ａベータオリゴマーの存在下でインキュベートしたところ、抗体は、試験したいずれのモル濃度比でもＡベータオリゴマー誘導性神経細胞死を阻害した。
【0313】
実施例８
ｉｎ ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性阻害をマウス行動試験でｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性阻害をマウス行動試験でｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
【0314】
新奇物体認識（ＮＯＲ）
新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルでは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用する。この試験は、諸項目について認識記憶を評価するものであり、そのヒトに相当するものが視覚的対比較（ＶＰＣ）である。げっ歯類、霊長類およびヒトでは、物体の認識は嗅周皮質を介するものである。ＡＤ病態は最初、海馬より先に嗅周皮質および嗅内皮質に発現する。ＶＰＣの作業課題は軽度認知障害（ＭＣＩ）の記憶欠損を検出するものであり、この作業課題によってＭＣＩからＡＤへの転換が予測される（１６）。
新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルでは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用する。この試験は、諸項目について認識記憶を評価するものであり、そのヒトに相当するものが視覚的対比較（ＶＰＣ）である。げっ歯類、霊長類およびヒトでは、物体の認識は嗅周皮質を介するものである。ＡＤ病態は最初、海馬より先に嗅周皮質および嗅内皮質に発現する。ＶＰＣの作業課題は軽度認知障害（ＭＣＩ）の記憶欠損を検出するものであり、この作業課題によってＭＣＩからＡＤへの転換が予測される（１６）。
【0315】
結果：
試験はＳｙｎＡｇｉｎｇ社（ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）で実施した。第０日、１グループ当たり１２匹のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（１１～１２週齢）に溶媒（Ａβオリゴマー化に使用した緩衝液）またはＡβＯ（５０ピコモル）を溶媒（ＰＢＳ）または抗体３０１－１７の存在下でＩＣＶ注射した。第＋７日および第＋８日に実施した新奇物体認識（ＮＯＲ）試験により全マウスの認知能力を求めた。
試験はＳｙｎＡｇｉｎｇ社（ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）で実施した。第０日、１グループ当たり１２匹のＣ５７ＢＬ６Ｊマウス（１１～１２週齢）に溶媒（Ａβオリゴマー化に使用した緩衝液）またはＡβＯ（５０ピコモル）を溶媒（ＰＢＳ）または抗体３０１－１７の存在下でＩＣＶ注射した。第＋７日および第＋８日に実施した新奇物体認識（ＮＯＲ）試験により全マウスの認知能力を求めた。
【0316】
操作者に対して盲検で実施したこの試験には、１実験グループ当たりマウス１２匹の４つの実験グループに分けたマウス計４８匹を含めた。全個体に抗体の不在下または存在下で総体積５μＬの溶媒またはＡβＯを単回（かつ片側に）ＩＣＶ注射した。実験グループは以下のように定めた：
・グループＡ（溶媒対照）：溶媒のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＢ（ＡβＯ対照）：ＡβＯのＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＣ（抗体対照）：ＡβＯ＋抗体のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＤ（治療）：ＡβＯ＋抗体のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＡ（溶媒対照）：溶媒のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＢ（ＡβＯ対照）：ＡβＯのＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＣ（抗体対照）：ＡβＯ＋抗体のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
・グループＤ（治療）：ＡβＯ＋抗体のＩＣＶ注射（ｎ＝１２）
【0317】
ＩＣＶ注射の前、４μＬ（すなわち、１１２ピコモル）の抗体１を１μＬの溶媒（すなわち、Ａβオリゴマー化のための緩衝液）または抗体／ＡβＯモル比２．２４に相当する１μＬのＡβＯ（５０ピコモル）と室温で３０分間インキュベートした。
【0318】
第０日、マウスに溶媒または抗体の存在下で溶媒またはＡβＯの５μＬ単回ＩＣＶ注射を実施した。
【0319】
第＋７日および第＋８日、マウス計４８匹を用いてＮＯＲ試験を１回の試行で実施した。認知試験の１日前（すなわち、第＋７日）、マウスを何もないオープンフィールドに置いて１０分間の試行に慣れさせる。認知試験当日（すなわち、第＋８日）、同じオープンフィールドに置き、５分間の試行（獲得試行）で２つの同じ物体を自由に探索させる。次いで、マウスを５分間の試行間時間の間、ホームケージに戻す。保持試行では、マウスに異なる２つの物体、すなわち、なじみのある同じ物体と１つの新奇物体を探索させる。この間、治療に対して盲検の実験者が、マウスが能動的に各物体を探索する時間を記録する。いずれの試行もビデオで記録する（Ｓｍａｒｔ ｖ３．０ソフトウェア、Ｂｉｏｓｅｂ社）。次いで、弁別指数（ＤＩ）を：（ＤＩ）＝（新奇物体の探索時間－なじみのある物体の探索時間）／総探索時間で求める。総探索時間が５秒以下であれば、マウスを弁別指数の算出および統計解析から除外する。
【0320】
溶媒対照群（グループＡ）のマウスは正常な行動を示し、平均弁別指数が０．４４３±０．０５３であった。この結果は、これまでのＳｙｎＡｇｉｎｇ社の同様の対照群の観察結果と一致している。予想された通り、ＡβＯの単回ＩＣＶ注射（グループＢ）では、溶媒対照マウスに比して認知能力の有意な低下が認められ（ｐ＜０．０００１）、平均弁別指数は－０．０６２±０．０４８であった。ＡβＯを注射したマウスは新奇物体となじみのある物体を弁別することができなかった。
【0321】
溶媒の存在下で抗体を投与したマウス（グループＣ）は正常な認知能力を示し、平均弁別指数が０．４３９±０．０４９であることがわかった。これらのマウスには、溶媒対照マウスとは有意差が認められず（ｐ＝０．９１６３）、ＡβＯを注射したマウスとは有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【0322】
抗体をＡβＯとともに注射した場合、ＮＯＲ試験でＡβＯ誘導性認知障害が完全に予防された。実際、グループＤのマウスは平均弁別指数が０．４８１±０．０５５であり、対照マウスとの差はみられなかった（ｐ＝０．６１２６）が、ＡβＯを注射したマウスとの差がみられた（ｐ＝０．０００２）。以上のデータを考え合わせると、抗体３０１－１７がＡβＯ誘導性認知障害からの保護作用を示したことが示唆される。
【0323】
シナプスマーカー
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ－１ベータおよびＴＮＦアルファ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで－８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスではシナプスマーカーが２５～３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０～１００％に回復する。Ａベータオリゴマーを注射したマウスではＩＬ－１ベータ炎症性マーカーの濃度が約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ－１ベータおよびＴＮＦアルファ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで－８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスではシナプスマーカーが２５～３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０～１００％に回復する。Ａベータオリゴマーを注射したマウスではＩＬ－１ベータ炎症性マーカーの濃度が約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。
【0324】
行動試験を実施したマウスから脳を収集する。
【0325】
海馬（記憶形成に重要な構造）を切り出し、抗プロテアーゼカクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズする。液体窒素および３７℃の水浴中で凍結融解を３サイクル実施することにより組織を溶解させ、遠心分離後に上清を回収する。
【0326】
ライセートのＴＮＦアルファのレベル（炎症があると上昇する）およびシナプスマーカーＰＳＤ－９５およびＳＮＡＰ－２５のレベル（シナプス損傷があると低下する）を解析することができる。
【0327】
抗体は行動試験で完全な保護作用を示した。脳でもＳＮＡＰ２５およびＰＳＤ－９５両方のレベルの改善ならびに脳内のＴＮＦアルファレベルの低下がみられることが予想される。
【0328】
実施例９
ｉｎ ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる（１３、１４）。これらのモデルは、脳内または全身に投与した被験抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
ｉｎ ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる（１３、１４）。これらのモデルは、脳内または全身に投与した被験抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
【0329】
表１０．Ａベータの配列および化合物
１）
ＨＨＱＫ（配列番号７）
ＣＧＨＨＱＫＧ、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）
１）
ＨＨＱＫ（配列番号７）
ＣＧＨＨＱＫＧ、シクロ（ＣＧＨＨＱＫＧ）（配列番号１２）
【0330】
表１１
ヒトＡベータ１～４２
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号７３）
ヒトＡベータ１～４２
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号７３）
【0331】
実施例１２
組換え抗体（ＨＨＱＫ）
ハイブリドーマ由来３０１－１７の可変領域をマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの主鎖に移植することにより組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ３０１－１７構築物を作製した（ＷｕＸｉ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）。
組換え抗体（ＨＨＱＫ）
ハイブリドーマ由来３０１－１７の可変領域をマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの主鎖に移植することにより組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ３０１－１７構築物を作製した（ＷｕＸｉ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）。
【0332】
以下に記載するように、３０１－１７ ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体の結合特性を試験し、親ハイブリドーマ精製ＩｇＧ３抗体と比較した。
【0333】
３０１－１７ ＩｇＧ２ａのＡｂＯとのＰｒｏｔｅＯｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＢｉｏＲａｄ社）結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ２ａおよびハイブリドーマ精製３０１－１７ ＩｇＧ３を抗マウスＩｇＧまたはアミンカップリングによりＰｒｏｔｅｏｎ ＧＬＭ Ｓｅｎｓｏｒチップ上で捕捉し、ＡｂＯ結合（ＳｙｎＡｇｉｎｇ ＡｂＯ）を試験した。ＡｂＯ ３倍希釈物：１ｕＭ、０．３３ｕＭ、０．１１ｕＭ、３７ｎＭ、１２．３ｎＭを使用した。アッセイ緩衝液はＰＢＳ－Ｅ＋Ｔｗｅｅｎ２０＋２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとした。
【0334】
結果：
およその動態値は次の通りであった：
ハイブリドーマ：ＫＤ＝２６．９ｎＭ
ＩｇＧ２ａ－３０１－１７抗体：ＫＤ＝１６．２～１９．５ｎＭ
対照マウスＩｇＧでは結合は検出されなかった。
組換え３０１－１７ ＩｇＧ１はＩｇＧ２ａ組換えと同程度のＫＤであった。
およその動態値は次の通りであった：
ハイブリドーマ：ＫＤ＝２６．９ｎＭ
ＩｇＧ２ａ－３０１－１７抗体：ＫＤ＝１６．２～１９．５ｎＭ
対照マウスＩｇＧでは結合は検出されなかった。
組換え３０１－１７ ＩｇＧ１はＩｇＧ２ａ組換えと同程度のＫＤであった。
【0335】
３０１－１７ ＩｇＧ２ａの環状ペプチドエピトープとのＰｒｏｔｅＯｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＢｉｏＲａｄ社）結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ２ａをＰｒｏｔｅｏｎ ＧＬＨバイオセンサーチップにアミンカップリングさせ、ＢＳＡとカップリングした配列番号２のシクロペプチドとの結合を試験した。シクロ－ＢＳＡの９ｎＭ～１１１ｐＭの３倍希釈物を使用した。アッセイ緩衝液をＰＢＳ－Ｅ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとした。抗体３０１－１７ ＩｇＧ２ａはＢＳＡとコンジュゲートした環状ペプチド（配列番号２）と結合し、およそのＫＤは１７ｐＭ（３回の試験の平均値）であることがわかった。試験した他の市販のＡベータ抗体（汎Ａベータ６Ｅ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）およびウサギ抗Ａベータ抗体（Ｄ５４Ｄ２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社；ａｂ２０１０６０、（ａｂｃａｍ社；ＮＢＰ１－７８００７、Ｎｏｖｕｓ社）では結合が全くまたはほとんど検出されなかった。
【0336】
３０１－１７ ＩｇＧ１ ＭＡＡＳ－２のＡｂＯとの結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ１およびハイブリドーマ精製３０１－１７ ＩｇＧ３をＭＡＡＳ－２センサーチップ上に固定化し、１ｕＭのＡｂＯ（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）との結合を試験した。試験条件下では、２回の試験で組換えＩｇＧ１ ３０１－１７抗体の方がハイブリドーマ精製抗体より大きいシグナルが発生した（それぞれ４０～５５ＢＲＵ対１５～２５ＢＲＵ）。対照マウスＩｇＧでは結合がほとんどまたは全く検出されなかった。
【0337】
３０１－１７ ＩｇＧ１ ＭＡＡＳ－２の環状ペプチドエピトープとの結合：組換え３０１－１７ ＩｇＧ１をＭＡＡＳ－２センサーチップ上に固定化し、ＢＳＡとカップリングした配列番号２のシクロペプチドとの結合をｐＨ６．５、７．５または８．０で試験した。３０１－１７ ＩｇＧ１では、３種類のいずれのｐＨ条件下でも等しく高いレベルの結合がみられた（約４００ＢＲＵ）。対照マウスＩｇＧ、汎Ａベータ６Ｅ１０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）ともに、いずれのｐＨ条件下でも結合がほとんどまたは全く検出されなかった。
【0338】
実施例１３
可溶性脳抽出物中でのヒト化抗体の結合
方法
可溶性脳抽出物のプールをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（１０／３００）ＨＰＬＣカラムの中に０．５ｍｌ／分で５０分間注入し、０．２５ｍｌの画分を収集した。
可溶性脳抽出物中でのヒト化抗体の結合
方法
可溶性脳抽出物のプールをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（１０／３００）ＨＰＬＣカラムの中に０．５ｍｌ／分で５０分間注入し、０．２５ｍｌの画分を収集した。
【0339】
可溶性ヒトＡＤ脳抽出物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＬＭＷ（＜７０ｋＤａ）画分と高分子（ＨＭＷ；＞７０ｋＤａ）画分とに分けた。抗体のＳＥＣ画分との結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。
【0340】
具体的には、プールした画分を濃縮し、ＢＣＡアッセイにより総タンパク質濃度を求めた。プールした画分を１００ｕｇ／ｍｌに希釈し、ＭＡＳＳ２のセンサーチップ上に固定化された抗体の上に注入した。
【0341】
結果
可溶性ヒトＡＤ脳抽出物のＳＥＣ分画により、毒性のあることが報告されている二量体、四量体および十二量体の存在と一致するＬＭＷピークがあり、再現性のあるパターンが得られた。３０１－１７のヒト化抗体（ＶＨ２Ｖｋ５）（配列番号４５、４６および配列番号６５、６６）をマウスモノクローナル型（３０１－１７；表３）およびその他のＡベータ抗体と比較した。
可溶性ヒトＡＤ脳抽出物のＳＥＣ分画により、毒性のあることが報告されている二量体、四量体および十二量体の存在と一致するＬＭＷピークがあり、再現性のあるパターンが得られた。３０１－１７のヒト化抗体（ＶＨ２Ｖｋ５）（配列番号４５、４６および配列番号６５、６６）をマウスモノクローナル型（３０１－１７；表３）およびその他のＡベータ抗体と比較した。
【0342】
図２に示されるように、マウスモノクローナル３０１－１７とアデュカヌマブでは、可溶性ヒトＡＤ脳抽出物の毒性オリゴマー高含有ＬＭＷ画分に対して同程度の結合がみられる。
【0343】
ＳＰＲ解析では、ヒト化３０１－１７がアデュカヌマブおよびバピネオズマブよりも優先的に毒性オリゴマー高含有ＬＭＷ画分と結合することがわかった。ヒト３０１－１７のＬＭＷ画分に対する結合応答は、アデュカヌマブで得られた応答の約１．５～２倍であった。
【0344】
実施例１４
方法：凍結ヒトＡＤ脳切片をヒト化３０１－１７およびその他のＡベータに対する抗体で染色して、実質のＡベータ斑および血管のＡベータ沈着物との結合の程度を評価した。
方法：凍結ヒトＡＤ脳切片をヒト化３０１－１７およびその他のＡベータに対する抗体で染色して、実質のＡベータ斑および血管のＡベータ沈着物との結合の程度を評価した。
【0345】
結果：アデュカヌマブおよびバピネオズマブでは、ＡＤ脳の実質および血管のＡベータとの明白な結合が観察され、臨床でのこれらの抗体によるＡＲＩＡの出現と一致していた。これと比較して、ヒト化３０１－１７（ＶＨ２Ｖｋ５）ではＡベータ沈着物の免疫反応性は観察されなかった。
【0346】
結論：ＡＤ患者材料で得られた結果（実施例１３および１４）から、ヒト化３０１－１７は、１）可溶性毒性ＬＭＷオリゴマーに対する選択的標的化、および２）より高用量の抗体の安全な投与を可能にするＡＲＩＡリスクの低下により、他のＡに対する抗体よりも高い治療効力をもたらす可能性が示唆される。このデータを図３に示す。
【0347】
実施例１５
Ａβのモノマーおよびオリゴマー
組換えＡβ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーを調製するため、ペプチド膜をＤＭＳＯで戻し５ｍＭとし、さらに蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で最終濃度１００μＭに希釈することによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間インキュベートした後、直ちに使用するか、－８０℃で保管した。
Ａβのモノマーおよびオリゴマー
組換えＡβ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーを調製するため、ペプチド膜をＤＭＳＯで戻し５ｍＭとし、さらに蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で最終濃度１００μＭに希釈することによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間インキュベートした後、直ちに使用するか、－８０℃で保管した。
【0348】
脳抽出物
メリーランド大学のＢｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋおよびケース・ウェスタン・リザーブ大学（クリーブランド、オハイオ州、米国）のＪｉｒｉ Ｓａｆａｒ博士から１１例の異なるヒトＡＤ患者の脳組織を入手した。ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準に基づくものであった。前頭皮質の試料の重量を量り、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になる体積の新鮮な氷冷ＴＢＳ緩衝液およびロシュ・ダイアグノスティックス社（ラバル、ケベック州、カナダ）のＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルに浸漬した。機械的プローブホモジナイザーを用いて、組織をこの緩衝液中でホモジナイズした（間に３０秒の休止を挟んだ３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）。次いで、ＴＢＳホモジナイズ試料を超遠心分離に９０分間供した。上清（可溶性抽出物）を収集し、一定分量ずつに分け、－８０℃で保管した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を求めた。各解析に３～８例の患者の脳抽出物のプールを使用した。
メリーランド大学のＢｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋおよびケース・ウェスタン・リザーブ大学（クリーブランド、オハイオ州、米国）のＪｉｒｉ Ｓａｆａｒ博士から１１例の異なるヒトＡＤ患者の脳組織を入手した。ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準に基づくものであった。前頭皮質の試料の重量を量り、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になる体積の新鮮な氷冷ＴＢＳ緩衝液およびロシュ・ダイアグノスティックス社（ラバル、ケベック州、カナダ）のＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルに浸漬した。機械的プローブホモジナイザーを用いて、組織をこの緩衝液中でホモジナイズした（間に３０秒の休止を挟んだ３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）。次いで、ＴＢＳホモジナイズ試料を超遠心分離に９０分間供した。上清（可溶性抽出物）を収集し、一定分量ずつに分け、－８０℃で保管した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を求めた。各解析に３～８例の患者の脳抽出物のプールを使用した。
【0349】
サイズ排除クロマトグラフィー
プールした可溶性脳抽出物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（１０／３００）ＨＰＬＣカラムの中に０．５ｍｌ／分で５０分間注入し、０．２５ｍｌの画分を収集した。分子量（ＭＷ）マーカーを別個に流した。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍでの吸光度によりタンパク質ピークをモニターした。約８ｋＤａ～約７０ｋＤａのＭＷに対応する画分を低分子量（ＬＭＷ）画分にプールした。Ａβモノマー（ＭＷ約４．５ｋＤａ）をＬＭＷ画分から排除した。７０ｋＤａ超～約７００ｋＤａのＭＷに対応する画分を高分子量（ＨＭＷ）画分にプールした。ＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分を濃縮し、ＢＣＡアッセイで総タンパク質濃度を求めた。次いで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析用に画分をＰＢＳ－ＥＰ、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液で１００μｇ／ｍｌに希釈した。
プールした可溶性脳抽出物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（１０／３００）ＨＰＬＣカラムの中に０．５ｍｌ／分で５０分間注入し、０．２５ｍｌの画分を収集した。分子量（ＭＷ）マーカーを別個に流した。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍでの吸光度によりタンパク質ピークをモニターした。約８ｋＤａ～約７０ｋＤａのＭＷに対応する画分を低分子量（ＬＭＷ）画分にプールした。Ａβモノマー（ＭＷ約４．５ｋＤａ）をＬＭＷ画分から排除した。７０ｋＤａ超～約７００ｋＤａのＭＷに対応する画分を高分子量（ＨＭＷ）画分にプールした。ＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分を濃縮し、ＢＣＡアッセイで総タンパク質濃度を求めた。次いで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析用に画分をＰＢＳ－ＥＰ、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液で１００μｇ／ｍｌに希釈した。
【0350】
脳抽出物中の総Ａβおよび凝集Ａβの測定
プールしたヒトＡＤ可溶性脳抽出物（３例の脳からのプール）のＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分中の凝集Ａβおよび総Ａβ（モノマーおよび凝集体）の量をＱＰＳ（グランバッハ、オーストラリア）で測定した。市販の免疫吸着アッセイ（ＭＳＤ社、ロックビル、メリーランド州、米国）にペプチド標準品を用いてＡβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の総量を求めた。Ａｍｏｒｆｉｘ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ Ａβ Ａｓｓａｙ（Ａ４）を用いて凝集Ａβのレベルを測定した。簡潔に述べれば、Ａｍｏｒｆｉｘ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅのマトリックスで凝集ＡβをモノマーＡβから分離した。マトリックスにはオリゴマーが付着し、フロースルー中にはモノマーがみられる。２回の洗浄段階の後、付着したＡβ凝集体をモノマー化し、ＨＦＩＰで溶出させた。ＨＦＩＰが完全に蒸発するまでＨＦＩＰ溶出液中のモノマー化Ａβをドラフト下で乾燥させ、アッセイ緩衝液に再懸濁させた。分解されたモノマー化Ａβ凝集体について、ＭＳＤアッセイでＡβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の測定を実施した。ＬＭＷ脳画分およびＨＭＷ脳画分中の総タンパク質濃度をＢＣＡにより測定し、その結果を総タンパク質１ｍｇ当たりのＡβ種のｐｇとして表す。
プールしたヒトＡＤ可溶性脳抽出物（３例の脳からのプール）のＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分中の凝集Ａβおよび総Ａβ（モノマーおよび凝集体）の量をＱＰＳ（グランバッハ、オーストラリア）で測定した。市販の免疫吸着アッセイ（ＭＳＤ社、ロックビル、メリーランド州、米国）にペプチド標準品を用いてＡβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の総量を求めた。Ａｍｏｒｆｉｘ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ Ａβ Ａｓｓａｙ（Ａ４）を用いて凝集Ａβのレベルを測定した。簡潔に述べれば、Ａｍｏｒｆｉｘ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅのマトリックスで凝集ＡβをモノマーＡβから分離した。マトリックスにはオリゴマーが付着し、フロースルー中にはモノマーがみられる。２回の洗浄段階の後、付着したＡβ凝集体をモノマー化し、ＨＦＩＰで溶出させた。ＨＦＩＰが完全に蒸発するまでＨＦＩＰ溶出液中のモノマー化Ａβをドラフト下で乾燥させ、アッセイ緩衝液に再懸濁させた。分解されたモノマー化Ａβ凝集体について、ＭＳＤアッセイでＡβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の測定を実施した。ＬＭＷ脳画分およびＨＭＷ脳画分中の総タンパク質濃度をＢＣＡにより測定し、その結果を総タンパク質１ｍｇ当たりのＡβ種のｐｇとして表す。
【0351】
表面プラズモン共鳴解析
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて表面プラズモン共鳴を実施した。精製抗体をセンサーチップ上に固定化した。Ａβペプチドモノマー、合成Ａβオリゴマーまたはプールした可溶性ヒトＡＤ脳抽出物の調製物（１００μｇ／ｍｌ）を表面に注入した後、解離相に移った。センサグラムを二重参照で減算した。示されるＳＰＲの結果は、２～８回の独立した試験で反復したものである。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて表面プラズモン共鳴を実施した。精製抗体をセンサーチップ上に固定化した。Ａβペプチドモノマー、合成Ａβオリゴマーまたはプールした可溶性ヒトＡＤ脳抽出物の調製物（１００μｇ／ｍｌ）を表面に注入した後、解離相に移った。センサグラムを二重参照で減算した。示されるＳＰＲの結果は、２～８回の独立した試験で反復したものである。
【0352】
免疫組織化学
新鮮な凍結ＡＤ脳切片を抗原回復クエン酸緩衝液（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｄａｋｏ社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）に２０分間曝露し、加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ社）と１時間インキュベートして非特異的染色をブロックした。切片を１μｇ／ｍｌの一次抗体（ｍｕ３０１－１７、ｈｕ３０１－１７、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、アイソタイプ対照）と４℃で一晩インキュベートし、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＴＢＳ－Ｔ）緩衝液を含有するトリス－緩衝生理食塩水で５分間、３回洗浄した。切片に二次ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ（０．４μｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）またはヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：１０００希釈；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、シカゴ、イリノイ州、米国）抗体を加え、１時間インキュベートした後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で３回洗浄した。陰性対照として、一次抗体に曝露していない切片にも二次抗体を加えた。次いで、切片にＨＲＰ酵素基質、ビアミノベジジン（ｂｉａｍｉｎｏｂｅｚｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）発色原試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を加えた後、蒸留水ですすいだ。切片をヘマトキシリンＱＳ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｔｏｒｏｎｔｏ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で観察し、Ｌｅｉｃａ ＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、ヴォーン、オンタリオ州、カナダ）を用いて代表的な画像を取得した。示される画像は、３例の異なるＡＤ脳で得られた結果の代表的なものである。
新鮮な凍結ＡＤ脳切片を抗原回復クエン酸緩衝液（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｄａｋｏ社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）に２０分間曝露し、加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ社）と１時間インキュベートして非特異的染色をブロックした。切片を１μｇ／ｍｌの一次抗体（ｍｕ３０１－１７、ｈｕ３０１－１７、アデュカヌマブ、バピネオズマブ、アイソタイプ対照）と４℃で一晩インキュベートし、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＴＢＳ－Ｔ）緩衝液を含有するトリス－緩衝生理食塩水で５分間、３回洗浄した。切片に二次ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ（０．４μｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）またはヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：１０００希釈；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、シカゴ、イリノイ州、米国）抗体を加え、１時間インキュベートした後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で３回洗浄した。陰性対照として、一次抗体に曝露していない切片にも二次抗体を加えた。次いで、切片にＨＲＰ酵素基質、ビアミノベジジン（ｂｉａｍｉｎｏｂｅｚｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）発色原試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を加えた後、蒸留水ですすいだ。切片をヘマトキシリンＱＳ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）で対比染色した。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｔｏｒｏｎｔｏ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で観察し、Ｌｅｉｃａ ＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、ヴォーン、オンタリオ州、カナダ）を用いて代表的な画像を取得した。示される画像は、３例の異なるＡＤ脳で得られた結果の代表的なものである。
【0353】
中枢神経系の曝露
老齢ＡＰＰ／ＰＳ１（ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９）マウスおよび野生型（ＷＴ）の同腹子（５４～７１週齢）に３０ｍｇ／ｋｇのｈｕ３０１－１７、アデュカヌマブまたは陰性対照の溶媒（ＰＢＳ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。治療前ならびに第１日、第７日、第１４日および第２１日、ヒトＩｇＧの循環血中レベルを評価するため血漿を採取した。血漿採取およびＰＢＳ灌流直後にマウスを屠殺した。次いで、脳を採取し、急速冷凍した。脳および血漿を使用まで－８０℃で保管した。Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザー（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ケネソー、ジョージア州、米国）を半分の電力で３０秒間、３回用いて、脳ホモジネート（１０％ｗ／ｖ）をＲＩＰＡ緩衝液で作製した。次いで、ホモジネートを半分の電力で１５秒間超音波処理した後、遠心分離（２，０００×ｇ）により残屑を除去した。Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｋ ＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍａｔｒｉｘ社、バッファロー、ニューヨーク州、米国）を製造業者の指示通りに用いて、個々のマウスの血漿（１：１０，０００希釈）および脳ホモジネート（１：５希釈）中のヒトＩｇＧレベルを測定した。結果を平均μｇ／ｍｌ（血漿）またはｎｇ／ｇ（脳）±ＳＥＭで表す。
老齢ＡＰＰ／ＰＳ１（ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９）マウスおよび野生型（ＷＴ）の同腹子（５４～７１週齢）に３０ｍｇ／ｋｇのｈｕ３０１－１７、アデュカヌマブまたは陰性対照の溶媒（ＰＢＳ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。治療前ならびに第１日、第７日、第１４日および第２１日、ヒトＩｇＧの循環血中レベルを評価するため血漿を採取した。血漿採取およびＰＢＳ灌流直後にマウスを屠殺した。次いで、脳を採取し、急速冷凍した。脳および血漿を使用まで－８０℃で保管した。Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザー（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ケネソー、ジョージア州、米国）を半分の電力で３０秒間、３回用いて、脳ホモジネート（１０％ｗ／ｖ）をＲＩＰＡ緩衝液で作製した。次いで、ホモジネートを半分の電力で１５秒間超音波処理した後、遠心分離（２，０００×ｇ）により残屑を除去した。Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｋ ＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍａｔｒｉｘ社、バッファロー、ニューヨーク州、米国）を製造業者の指示通りに用いて、個々のマウスの血漿（１：１０，０００希釈）および脳ホモジネート（１：５希釈）中のヒトＩｇＧレベルを測定した。結果を平均μｇ／ｍｌ（血漿）またはｎｇ／ｇ（脳）±ＳＥＭで表す。
【0354】
結果
ヒト化３０１－１７と他のＡβに対する抗体の結合プロファイルの比較
ＩｇＧ４アイソタイプ（Ｓ２４１Ｐヒンジ変異）ヒト化抗体ＶＨ２Ｖκ５と他の抗体とを比較した。ヒト化抗体には、ＳＰＲによる評価で合成ＡβＯ対Ａβモノマーの選択的結合が保持されていたほか、凍結ＡＤ脳切片での免疫組織化学により斑との結合もみられなかった。図３に示されるように、Ａβに対する抗体であり、線維に結合することがわかっているバピネオズマブおよびアデュカヌマブでは、実質のＡβ斑および血管沈着物に対して強い染色が見られたが、親モノクローナル（ｍｕ３０１－１７）およびヒト化３０１－１７ではバックグラウンドを上回る染色は一切見られなかった。老齢トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの脳切片でも同じような結果が得られた。ＡＤに関する臨床試験では、斑および血管沈着物との結合により、浮腫（ＡＲＩＡ－Ｅ）および微小出血（ＡＲＩＡ－Ｈ）によるアミロイド関連画像異常が誘発されることがわかっている。
ヒト化３０１－１７と他のＡβに対する抗体の結合プロファイルの比較
ＩｇＧ４アイソタイプ（Ｓ２４１Ｐヒンジ変異）ヒト化抗体ＶＨ２Ｖκ５と他の抗体とを比較した。ヒト化抗体には、ＳＰＲによる評価で合成ＡβＯ対Ａβモノマーの選択的結合が保持されていたほか、凍結ＡＤ脳切片での免疫組織化学により斑との結合もみられなかった。図３に示されるように、Ａβに対する抗体であり、線維に結合することがわかっているバピネオズマブおよびアデュカヌマブでは、実質のＡβ斑および血管沈着物に対して強い染色が見られたが、親モノクローナル（ｍｕ３０１－１７）およびヒト化３０１－１７ではバックグラウンドを上回る染色は一切見られなかった。老齢トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの脳切片でも同じような結果が得られた。ＡＤに関する臨床試験では、斑および血管沈着物との結合により、浮腫（ＡＲＩＡ－Ｅ）および微小出血（ＡＲＩＡ－Ｈ）によるアミロイド関連画像異常が誘発されることがわかっている。
【0355】
ｈｕ３０１－１７の低分子量毒性Ａβオリゴマー高含有可溶性ＡＤ脳抽出物との結合
ＡＤ脳抽出物中の可溶性Ａβ種が複数の研究者によって検討されたことにより、神経毒性活性は主としてＡβＯ（二量体、三量体、四量体、十二量体）の低分子量（ＬＭＷ）画分中に存在し、高分子量（ＨＭＷ）凝集体はＬＭＷ種に解離し得ることが報告されているものの、ほとんどが不活性であることがわかっている。このため、ＡＤ脳からプールした可溶性抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。可溶性ＡＤ脳抽出物のＳＥＣ分画により、ＬＭＷ ＡβＯを含有することが予想されるＭＷ領域にタンパク質ピークのある再現性の高いパターンが得られた（図４ａ）。約８～７０ｋＤａに対応する画分を、二量体～十二量体の範囲内にあり、モノマーを含まないＡβＯを含有すると予想されるＬＭＷ画分にプールした。７０－７００ｋＤａ超に対応する画分をＨＭＷ画分にプールした。総Ａβ３８、Ａβ４０、Ａβ４２の測定（ＭＳＤアッセイ）により、３種ともＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分の両方に存在し、Ａβ４２が主要な凝集Ａβ種である（Ａ４アッセイ）ことがわかった。
ＡＤ脳抽出物中の可溶性Ａβ種が複数の研究者によって検討されたことにより、神経毒性活性は主としてＡβＯ（二量体、三量体、四量体、十二量体）の低分子量（ＬＭＷ）画分中に存在し、高分子量（ＨＭＷ）凝集体はＬＭＷ種に解離し得ることが報告されているものの、ほとんどが不活性であることがわかっている。このため、ＡＤ脳からプールした可溶性抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。可溶性ＡＤ脳抽出物のＳＥＣ分画により、ＬＭＷ ＡβＯを含有することが予想されるＭＷ領域にタンパク質ピークのある再現性の高いパターンが得られた（図４ａ）。約８～７０ｋＤａに対応する画分を、二量体～十二量体の範囲内にあり、モノマーを含まないＡβＯを含有すると予想されるＬＭＷ画分にプールした。７０－７００ｋＤａ超に対応する画分をＨＭＷ画分にプールした。総Ａβ３８、Ａβ４０、Ａβ４２の測定（ＭＳＤアッセイ）により、３種ともＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分の両方に存在し、Ａβ４２が主要な凝集Ａβ種である（Ａ４アッセイ）ことがわかった。
【0356】
固定化したｈｕ３０１－１７および他のＡβに対する抗体と可溶性ＡＤ脳抽出物のＬＭＷ画分およびＨＭＷ画分との結合をＳＰＲにより評価した。複数のＡＤ脳に由来する異なるプール抽出物を用いた複数の別個のアッセイから得た代表的な結果を図４ｂに示す。ｈｕ３０１－１７抗体は一貫して、ＬＭＷ画分に対し高く優先的な結合を示した。これと比較して、アデュカヌマブおよびバピネオズマブはＬＭＷ画分対ＨＭＷ画分の結合が低く無差別なものであった。
【0357】
ＬＭＷ画分中にはＡβタンパク質およびＡβ凝集体が存在することが明らかになったが、ｈｕ３０１－１７がこの画分に同じく存在する他のタンパク質（１つまたは複数）と結合したのではないかという可能性を排除するため、サンドイッチＳＰＲアッセイを実施し、このアッセイでは、固定化したｈｕ３０１－１７によって捕捉された物質を次いで検出抗体に曝露した。アデュカヌマブは、Ａβに特異的であることがわかっており、固定化したアデュカヌマブによって捕捉される物質に結合し／これを検出し、それにより陽性対照としての役割を果たすことが予想されたため、アデュカヌマブを検出抗体として選択した。図４ｃに示されるように、サンドイッチアッセイを用いたアデュカヌマブ検出では、ｈｕ３０１－１７またはアデュカヌマブによって捕捉された物質に対するシグナルが得られ、それにより、ｈｕ３０１－１７がＬＭＷ画分中のＡβＯと結合することが確認された。このアッセイで対照ヒトＩｇＧによる捕捉後に観察される弱いシグナルが発生した物質は、アデュカヌマブによって検出されず、非特異的バックグラウンド結合の程度が低いことと一致していた。
【0358】
ｈｕ３０１－１７結合の具体的な性質がＳＰＲアッセイでさらに明らかになり、このアッセイでは、固定化したｈｕ３０１－１７をそのコグネイト環状ペプチドエピトープに事前に曝露することにより、のちにＬＭＷ画分と全く結合させないようにできることがわかった（図４ｄ）。これと比較して、アデュカヌマブは異なるＡβエピトープを認識するため、固定化したアデュカヌマブを環状ペプチドエピトープに事前に曝露しても、それがのちにＬＭＷ画分と結合する能力に対して何ら感知できる影響を及ぼすことはなかった。以上の結果を考え合わせると、ｈｕ３０１－１７は、ＡβＯ対モノマーおよび斑に選択的であることに加えて、ＡＤ脳抽出物のＬＭＷ毒性オリゴマー高含有画分に対する標的化が他のＡβに対する抗体より優れていることも示唆される。
【0359】
全身送達したｈｕ３０１－１７に対するＣＮＳ曝露
老齢野生型マウス（１５～１７か月齢）を用いて、ｈｕ３０１－１７が末梢から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）に入る能力を評価し、アデュカヌマブのものと比較した。マウスに３０ｍｇ／ｋｇ抗体の単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を実施し、２４時間後、血漿および灌流脳中に存在するヒトＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。図５に示されるように、血漿と脳で等しい量のｈｕ３０１－１７およびアデュカヌマブが検出され（図５ａ）、これまでにアデュカヌマブで報告されている［１８］ように、ＣＮＳへの浸透度が約０．３％の範囲で同程度である（図５ｂ）ことが明らかになった。予想された通り、陰性対照としてＰＢＳ単独を注射したマウスではヒトＩｇＧが検出されなかった（図５ａ）。
老齢野生型マウス（１５～１７か月齢）を用いて、ｈｕ３０１－１７が末梢から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）に入る能力を評価し、アデュカヌマブのものと比較した。マウスに３０ｍｇ／ｋｇ抗体の単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を実施し、２４時間後、血漿および灌流脳中に存在するヒトＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。図５に示されるように、血漿と脳で等しい量のｈｕ３０１－１７およびアデュカヌマブが検出され（図５ａ）、これまでにアデュカヌマブで報告されている［１８］ように、ＣＮＳへの浸透度が約０．３％の範囲で同程度である（図５ｂ）ことが明らかになった。予想された通り、陰性対照としてＰＢＳ単独を注射したマウスではヒトＩｇＧが検出されなかった（図５ａ）。
【0360】
老齢（１３～１７か月齢）トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび野生型の同腹子を用いて、ｈｕ３０１－１７に関して動態評価をさらに実施した。３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与後第１日、第７日、第１４日および第２１日、ヒトＩｇＧの血漿および脳中のレベルを測定した。第２１日に向かって、血漿中レベルが経時的に低下しているにもかかわらず、脳では検出可能なレベルのｈｕ３０１－１７が依然として測定可能であった（図６ａ、６ｂ）。興味深いことに、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスには、経時的にｈｕ３０１－１７のＣＮＳでの相対保持量が血漿よりも高くなる傾向がみられ、このことは、トランスジェニックマウスでは野生型の同腹子とは異なり、脳中に存在する標的ＡβＯとの連動がみられることと一致していた（図６ｃ）。以上の結果は、ｈｕ３０１－１７のＣＮＳへの浸透度および薬物動態特性がＡβ標的に対する他のモノクローナル抗体のものに匹敵するものであることを示している。
【0361】
ここまで、現時点で好ましい例であると考えるものに関して本願を記載してきたが、本願は本開示の例に限定されないことを理解するべきである。これとは逆に、本願は、添付の請求項の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および同等の構成を包含するものとする。
【0362】
刊行物、特許および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが明記された場合と同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば表またはその他の箇所に記載されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含めた本明細書に記載される各アクセッション番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。
【0363】
請求項の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈がなされるべきである。
【0364】
（本明細書で参照される参考文献の列記）
【表13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】