特開 2023-87494 抗感染処置に用いるための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023087494

(43)【公開日】2023-06-23

(54)【発明の名称】抗感染処置に用いるための組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/47 20060101AFI20230616BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230616BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230616BHJP

【ＦＩ】

A61K31/47 ZNA

A61P31/00

A61P31/04

A61P29/00

A61P43/00 111

A61P31/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021201903

(22)【出願日】2021-12-13

(71)【出願人】

【識別番号】501048930

【氏名又は名称】株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】漆畑 直樹

(72)【発明者】

【氏名】隠岐 勝幸

(72)【発明者】

【氏名】吉原 誠一

(72)【発明者】

【氏名】大西 啓介

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC28

4C086GA13

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB32

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZC02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】新たな抗感染性の作用を有する組成物を提供すること。
【解決手段】上記目的を達成するため、一側面において、本発明は以下を提供する。抗感染処置に用いるための組成物であって、前記組成物は、以下の式で表される化合物又はその塩を含む、組成物。

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗感染処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、以下の式で表される化合物又はその塩を含む、組成物。

【化1】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨ又はＣＨ₂であり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸又はＣＨ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｈ、又はＣ１～Ｃ４までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
Ｒ⁵は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂、又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
ｎは、１－１１である。｝

【請求項2】

請求項１の組成物であって、前記化合物が、以下の式で表される、組成物。

【化2】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨであり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ₃であり、
Ｒ⁵は、Ｏであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂であり、
ｎは、１－１１である。｝

【請求項3】

請求項１又は２の組成物であって、前記抗感染処置が、細菌に感染したときの抗炎症性作用を引き起こすための処置である、組成物。

【請求項4】

請求項３の組成物であって、前記細菌がグラム陽性細菌である、組成物。

【請求項5】

請求項３の組成物であって、前記細菌がグラム陰性細菌である、組成物。

【請求項6】

請求項１～５いずれか１項に記載の組成物であって、前記抗感染処置が、炎症性サイトカイン遺伝子の発現を抑制するための処置である、組成物。

【請求項7】

請求項６の組成物であって、前記炎症性サイトカイン遺伝子がＩＬ－１β及び／又はＴＮＦαである、組成物。

【請求項8】

請求項１～５いずれか１項に記載の組成物であって、前記抗感染処置が、抗炎症性サイトカイン遺伝子の発現を増強するための処置である、組成物。

【請求項9】

請求項８の組成物であって、前記抗炎症性サイトカイン遺伝子がＩＬ－１０である、組成物。

【請求項10】

請求項１又は２の組成物であって、前記抗感染処置が、ウイルスに感染したときのインターフェロンの発現を増強させるための処置である、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗感染処置に用いるための組成物に関する。より具体的には、本開示は、特定の有効成分を含む、抗感染処置に用いるための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

哺乳類等は免疫システムを獲得しており、細菌、及び、ウイルスに感染すると、様々な免疫応答を示す。最も典型的な免疫応答の１つとして炎症反応がある。炎症反応には、生体内で分泌される炎症性サイトカインが関与する。一方で、生体には、炎症を鎮める作用として、抗炎症性サイトカインを分泌する機能がある。両者のバランスが崩れると、過剰な炎症反応が起こり、生体に様々な悪影響を及ぼす。

【0003】

特許文献１では、抗炎症活性を有するペプチドが開示されている。具体的には、特許文献１では、炎症性サイトカインの発現を抑制するペプチドが開示されており、その抑制対象として、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＩＬ－２及びＩＮＦ－γが例示されている。

【0004】

また、感染後に放出される炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６によって、血管内皮細胞から血栓を溶かす因子を阻害する因子（線溶阻害因子という）であるＰＡＩ－１（plasminogen activator inhibitor-1）が放出され、血管に血栓が出来やすくなってしまうことが明らかになっている（非特許文献１）。あるいは敗血症においても、播種性血管内凝固症候群という血栓が全身で多発する症状が見受けられる。これらの例からも解るように、感染症と血栓形成には密接な関係があり、実際にＣＯＶＩＤ－１９に伴う肺障害・呼吸不全に対して、ＰＡＩ－１阻害剤が第２相臨床試験が終了次第、早期承認を目指す、という段階まで進んでいる（非特許文献２）。しかし、この薬はＰＡＩ－１を阻害するための薬剤であり、薬剤投与以前に引き起こされた肺障害・呼吸不全に対しては、患者本人の自然治癒力に任されてしまうという問題も抱えている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２０１９－５１００７７号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】https://www.pnas.org/content/117/36/22351

【非特許文献2】https://bio.nikkeibp.co.jp/atcl/news/p1/21/09/13/08625/

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

感染が起こった際に、望まれるのは、生体内において抗感染性の反応を誘導することである。こうした目的で、これまで、様々な組成物が開発されてきたが、いまだに改良の余地が残されている。そこで、本開示は、新たな抗感染性の作用を有する組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者が検討したところ、特定の化合物が、ある特定の抗感染性を誘発するのに有効であることを見出した。本発明はこうした知見に基づいて完成され、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
抗感染処置に用いるための組成物であって、
前記組成物は、以下の式で表される化合物又はその塩を含む、組成物。

【化1】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨ又はＣＨ₂であり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸又はＣＨ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｈ、又はＣ１～Ｃ４までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
Ｒ⁵は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂、又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
ｎは、１－１１である。｝
（発明２）
発明１の組成物であって、前記化合物が、以下の式で表される、組成物。

【化2】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨであり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ₃であり、
Ｒ⁵は、Ｏであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂であり、
ｎは、１－１１である。｝
（発明３）
発明１又は２の組成物であって、前記抗感染処置が、細菌に感染したときの抗炎症性作用を引き起こすための処置である、組成物。
（発明４）
発明３の組成物であって、前記細菌がグラム陽性細菌である、組成物。
（発明５）
発明３の組成物であって、前記細菌がグラム陰性細菌である、組成物。
（発明６）
発明１～５いずれか１つに記載の組成物であって、前記抗感染処置が、炎症性サイトカイン遺伝子の発現を抑制するための処置である、組成物。
（発明７）
発明６の組成物であって、前記炎症性サイトカイン遺伝子がＩＬ－１β及び／又はＴＮＦαである、組成物。
（発明８）
発明１～５いずれか１つに記載の組成物であって、前記抗感染処置が、抗炎症性サイトカイン遺伝子の発現を増強するための処置である、組成物。
（発明９）
発明８の組成物であって、前記抗炎症性サイトカイン遺伝子がＩＬ－１０である、組成物。
（発明１０）
発明１又は２の組成物であって、前記抗感染処置が、ウイルスに感染したときのインターフェロンの発現を増強させるための処置である、組成物。
（発明１１）
発明１又は２の組成物であって、前記抗感染処置が、血管内皮細胞が炎症性サイトカインに曝露された際に発現上昇されるＰＡＩ－１遺伝子の発現を抑制するための、組成物。

【発明の効果】

【0009】

一実施形態において、本開示の組成物は、上記式で表される化合物を含む。これにより、抗感染性の作用を誘発することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】一実施形態において、本開示の組成物が、グラム陰性細菌に感染したときの炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。

【図2】一実施形態において、本開示の組成物が、網羅的遺伝子発現解析から特定の遺伝子発現を制御することを示す。

【図3】一実施形態において、本開示の組成物が、インスリンシグナル経路とは異なる経路にて遺伝子発現を抑制することを示す。

【図4】一実施形態において、本開示の組成物が、ＨＧＦシグナル経路とは異なる経路にて遺伝子発現を抑制することを示す。

【図5】一実施形態において、本開示の組成物が、グラム陽性細菌に感染したときの炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。

【図6】一実施形態において、本開示の組成物が、ウイルスに感染したときのインターフェロンの遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示す。

【図7】一実施形態において、本開示の組成物が、インスリンシグナル経路とは異なる経路にて遺伝子発現を抑制することを示す。

【図8】一実施形態において、本開示の組成物が、炎症性サイトカインＴＮＦα刺激による血管内皮細胞でのＰＡＩ－１の発現亢進を抑制することを示す結果である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。以下の説明は、発明の理解を促進するためのものである。即ち、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0012】

１．有効成分
一実施形態において、本開示は、ある有効成分を含む組成物に関する。前記有効成分は、以下の構造式で表される化合物又はその塩である。

【0013】

【化3】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨ又はＣＨ₂であり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸又はＣＨ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｈ、又はＣ１～Ｃ４までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
Ｒ⁵は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂、又はＣ１～Ｃ２までのアルキル基であり、
ｎは、１－１１である。｝

【0014】

塩の形態は特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等であってもよい。

【0015】

好ましい実施形態において、上記化合物は、以下の式で表される化合物又はその塩であってもよい。

【0016】

【化4】

｛ただし、
Ｒ¹は、ＮＨであり、
Ｒ²は、Ｎ－Ｒ⁸（Ｒ⁸：Ｃ１～Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ³は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ⁴は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ₃であり、
Ｒ⁵は、Ｏであり、
Ｒ⁶は、カルボキシル基であり、
Ｒ⁷は、ＮＨ₂であり、
ｎは、１－１１である。｝

【0017】

最も好ましい実施形態において、上記化合物は、以下の式で表される化合物（ＣＡＳ番号 ８３６６２０－４８－５）又はその塩であってもよい。

【0018】

【化5】

２．組成物としての他の成分
上述した一実施形態において、組成物は、上述した化合物のほかに、適宜他の成分を含んでもよい。応用形態にもよるが、例えば、組成物は、以下の成分のうち１種以上を含んでもよい。
ｐＨ調整剤（例えば、リン酸バッファ、トリスバッファ等）
無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）
糖類（例えば、ラクトース、スクロース等）
賦形剤（例えば、水、精製水、アルコール、グリセリン、乳糖、デンプン、デキストリン、白糖、沈降シリカ等）

【0019】

また、組成物は、固体の形態でもよく、或いは、液体の形態であってもよい。液体の場合には、溶媒は特に限定されず、水であってもよく、有機溶媒であってもよい。

【0020】

３．抗感染性作用
一実施形態において、本開示の組成物は、抗感染処置に用いる。抗感染処置は、特に限定されないが、例えば、抗炎症処置、抗ウイルス感染処置などが挙げられる。抗炎症処置の具体的な例としては、炎症性サイトカイン遺伝子（例えば、ＩＬ－１β及び／又はＴＮＦα）の発現を抑制するための処置、及び／又は、抗炎症性サイトカイン遺伝子（例えば、ＩＬ－１０）の発現を増強するための処置などが挙げられる。また、抗ウイルス感染処置の具体的な例としては、ウイルスに感染したときのインターフェロンの発現を増強させるための処置が挙げられる。

【0021】

また、感染を引き起こす感染源については、特に限定されないが、典型的には、細菌、及び／又は、ウイルスが挙げられる。

【0022】

細菌についても、特に限定されず、グラム陽性菌であってもよく、グラム陰性菌であってもよい。グラム陰性菌についても、特に限定されず、例えば、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を有する細菌が挙げられる。一方、グラム陽性菌についても、特に限定されず、例えば、ＬＴＡ（Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）を有する細菌が挙げられる。

【0023】

ウイルスについても、特に限定されず、ＤＮＡウイルスでもよく、或いは、ＲＮＡウイルスであってもよい。また、１本鎖ウイルスであってもよく、或いは、２本鎖ウイルスであってもよい。さらには、逆転写型のウイルスであってもよい。また、１本鎖ＲＮＡウイルスの場合には、（＋）型であってもよく、（－）型であってもよい。

【0024】

４．対象となる遺伝子
一実施形態において、本開示の組成物は、その有効成分の作用により、特定の遺伝子の発現を増強することができる。例えば、本開示の組成物は、以下から選択される１種以上の遺伝子の発現を増強することができる。
・抗ウイルス活性を有する遺伝子（例えば、インターフェロン、好ましくは、Ｉ型インターフェロン、更に好ましくは、インターフェロンβ）

【0025】

別の一実施形態において、本開示の組成物は、以下から選択される１種以上の遺伝子の発現を抑制することができる。
・炎症性サイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ－１β等）

【0026】

更に別の一実施形態において、本開示の組成物は、以下から選択される１種以上の遺伝子の発現を促進することができる。
・抗炎症性サイトカイン遺伝子（例えば、ＩＬ－１０等）

【0027】

また、上述した遺伝子は、ヒト型でも他の動物種であってもよいが、好ましくは、ヒト型である。

【0028】

４－１．抗ウイルス活性を有する遺伝子
細胞がウイルスに感染したとき、細胞は、他の細胞等においてウイルスの感染を抑制する因子を分泌する機能を有する。こうしたウイルスの感染を抑制する因子として、インターフェロンが挙げられる。インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型に分類される。

【0029】

一実施形態において、本開示の組成物は、インターフェロンの遺伝子の発現を促進する。好ましくは、本開示の組成物は、Ｉ型インターフェロンの遺伝子の発現を促進し、更に好ましくは、インターフェロンβの遺伝子の発現を促進する。これにより、抗ウイルス活性が誘発される。

【0030】

４－２．炎症性サイトカイン
炎症性サイトカインは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与する。一実施形態において、本開示の組成物は、炎症性サイトカインの遺伝子の発現を抑制する。炎症性サイトカインの遺伝子の例としては、ＴＮＦα、ＩＬ－１β等が挙げられる。

【0031】

４－３．抗炎症性サイトカイン
上記の炎症性サイトカインとは逆となるが、抗炎症性サイトカインは、炎症症状を抑制する働きをもつサイトカインである。一実施形態において、本開示の組成物は、抗炎症性サイトカインの遺伝子の発現を促進する。抗炎症性サイトカインの遺伝子の例としては、ＩＬ－１０等が挙げられる。

【0032】

従って、一実施形態において、本開示の組成物は、炎症を抑制する方向に作用することができる。

【0033】

５．対象となる組織又は細胞
一実施形態において、本開示の組成物は、特定の細胞に作用させることを目的として使用されてもよい。例えば、本開示の組成物は、免疫細胞に作用させることができる。免疫細胞の例として、白血球細胞（例えば、マクロファージやＴ細胞）などが挙げられる。

【実施例0034】

以下では、上記実施形態に関連する更なる具体的な例を示す。上記の実施形態と同様、以下の例は、本発明の理解を促進する目的で記載されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例0035】

ＴＨＰ－１（ヒト単球系白血病細胞株）を用いた。ＴＨＰ－１を、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１ｍＬ／ウェルの分量で播種し、当該細胞はＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，１１８７５－０９３）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地で２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ₂）。その際、マクロファージ分化を促すため、ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート）（１００ｎＭ）を添加した。２４時間後、ＰＭＡを除くためにＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ培地に培地交換し、さらに、ＤＭＳＯに溶解したＡＳ１８４２８５６を最終濃度１μＭになるように投与した。また、同時にＬＰＳを最終濃度１．０μｇ／ｍＬになるように投与した。ＬＰＳは、グラム陰性菌の感染状態を模するため投与した。また、よりヒトでの感染を模すため、１．０μｇ／ｍＬのＬＰＳを先に投与し、感染状態にした後に、ＡＳ１８４２８５６を添加した。具体的にはＬＰＳを投与してから８時間後にＡＳ１８４２８５６を投与した。

【0036】

ＡＳ１８４２８５６の投与に対するコントロールとして、同じ量のＤＭＳＯ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。また、ＬＰＳの投与に対するコントロールとして、同じ量のＰＢＳ（－）を投与した。

【0037】

同時投与の場合、投与後、２４時間培養を継続後、細胞からＲＮＡを回収した。ＬＰＳの先投与の場合、ＬＰＳ添加時より２４時間培養を継続後、細胞からＲＮＡを回収した。より具合的には、培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｚ６０１２）を用いて細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｔａｋａｒａ，ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ Ｓｙｂｒ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ；ＴＯＹＯＢＯ，ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を行った。

【0038】

ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２μｌ（最終濃度 １ ｘ）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５００ｎｇ
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ₂Ｏ 合計１０μｌに調整

【0039】

上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｅｒｉｔｉ ９６ ｗｅｌｌ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃ １５分
↓
８５℃ ５秒
↓
４℃ ∞

【0040】

合成したｃＤＮＡ（１０μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。

【0041】

定量ＰＣＲの具体的手順として、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １０μｌ
５ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
５ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４μｌ
Ｈ₂Ｏ ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈） １μｌ

【0042】

上記混合物を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のＣＦＸ－Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃ １分 （初期変性）
２．９５℃ １５秒 （変性）
３．６０℃ ３０秒 （伸長）
（２－３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５℃～９５℃まで０．５℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出

【0043】

上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。

【0044】

内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
ＧＡＰＤＨ Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
ＧＡＰＤＨ Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ＴＮＦα Forward primer: 5’ - cagcctcttctccttcctgat - 3’
ＴＮＦα Reverse primer: 5’ - gccagagggctgattagaga - 3’
ＩＬ－１β Forward primer: 5’ - tacctgtcctgcgtgttgaa - 3’
ＩＬ－１β Reverse primer: 5’ - tctttgggtaatttttgggatct - 3’
ＩＬ－１０ Forward primer: 5’ - gatgccttcagcagagtgaa - 3’
ＩＬ－１０ Reverse primer: 5’ - gcaacccaggtaacccttaaa - 3’

【0045】

全てのプライマーは株式会社ファスマックから購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、ＡＳ１８４２８５６で処理をしておらず、且つＬＰＳで処理していないコントロール条件（ＤＭＳＯ処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅによって確認した。

【0046】

結果を図１に示す。まず、ＴＨＰ－１細胞において、ＬＰＳを投与すると、炎症性サイトカイン遺伝子（ＴＮＦα、ＩＬ－１β）の発現が上昇することが示された（黒色のバーにおけるＣｔｒｌとＬＰＳを比較しながら図１を参照）。また、ＬＰＳを投与すると、抗炎症性サイトカイン遺伝子（ＩＬ－１０）の発現も上昇することが示された。ただし、上昇の度合いは、炎症性サイトカインほど顕著ではなかった。一方で、ＡＳ１８４２８５６の投与により、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ－１β）の発現が抑制されることが示された（灰色のバーにおけるＶｅｈｉｃｌｅとＡＳ１８４２８５６の値を比較しながら図１を参照）。同時に、ＡＳ１８４２８５６の投与により、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）の発現が増強されることが示された。さらに、８時間後にＡＳ１８４２８５６を添加した場合でも、同時添加とほとんど同様に炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ－１β）の発現が抑制され、さらに興味深いことに抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）はむしろ発現がさらに亢進することが示された。