特開 2023-88309 対象物の画像のｚスタックの境界を判定するための方法、対応する光学機器およびそのためのコンピュータプログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023088309

(43)【公開日】2023-06-26

(54)【発明の名称】対象物の画像のｚスタックの境界を判定するための方法、対応する光学機器およびそのためのコンピュータプログラム

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20230619BHJP

   G02B 21/26 20060101ALI20230619BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20230619BHJP

   G02B 7/28 20210101ALI20230619BHJP

   G02B 7/36 20210101ALI20230619BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B21/26

G02B21/36

G02B7/28 J

G02B7/36

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022198431

(22)【出願日】2022-12-13

(31)【優先権主張番号】21214515

(32)【優先日】2021-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】511079735

【氏名又は名称】ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｅｒｎｓｔ－Ｌｅｉｔｚ－Ｓｔｒａｓｓｅ １７－３７， Ｄ－３５５７８ Ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ホセ ミゲル セラ ジェティ

(72)【発明者】

【氏名】トビアス ヘスラー

【テーマコード（参考）】

2H052

2H151

【Ｆターム（参考）】

2H052AB01

2H052AC05

2H052AC18

2H052AD03

2H052AD09

2H052AD16

2H052AF14

2H052AF21

2H052AF25

2H151AA12

2H151BA47

2H151BA66

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明は、対象物の画像のｚスタックの境界を自動的に判定する方法に関する。
【解決手段】画像のｚスタックは、光学機器により異なる焦点位置において対象物を撮像することにより取得され、光学機器は、機器光学系を介して、異なる焦点位置において対象物を撮像するための機器光学系および焦点調節ユニットを備える。前記方法は、対象物の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像のセットを生成するステップと、不鮮明度‐Ｗ距離関数を、画像のセットの各画像に適用し、不鮮明度‐Ｗ距離関数により、各画像についての距離値を計算し、それぞれ異なる距離値を対応する画像の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付けるステップと、焦点位置を変数として有する不鮮明度‐Ｗ距離関数が１次極値と１次極値に隣接する２つの２次極値とを示す場合、ｚスタック境界を、２つの２次極値に割り当てられた焦点位置に応じて判定するステップと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象物（１３０）の画像のｚスタックの境界（１１０，１２０）を自動的に判定する方法であって、
前記画像のｚスタックは、光学機器により異なる焦点位置において前記対象物を撮像することにより取得され、前記光学機器は、機器光学系を介して、異なる焦点位置において前記対象物を撮像するための機器光学系および焦点調節ユニットを備え、
前記方法は、
前記対象物（１３０）の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像（２３１）のセット（２３０）を生成するステップ（Ｓ１）と、
不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）を前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用するステップ（Ｓ３）であって、前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）は、前記焦点位置を変数として有し、焦点位置において最大または最小の鮮明度についての大域的極値を示し、加えて前記大域的極値に隣接する２次極値を示す、不鮮明度または鮮明度距離関数であり、前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）により前記各画像（２３１）についての距離値が計算され、それぞれ異なる距離値が対応する画像（２３１）の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付けられるステップと、
前記焦点位置を変数として有する前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）が１次極値（２１４）と前記１次極値（２１４）に隣接する２つの２次極値（２１２，２１６）とを示す場合、前記ｚスタック境界（１１０，１２０）を、前記２つの２次極値（２１２，２１６）に割り当てられた焦点位置に応じて判定するステップ（Ｓ４）と、
を含む方法。

【請求項2】

対象物（１３０）の画像のｚスタックの境界（１１０，１２０）を自動的に判定する方法であって、
前記画像のｚスタックは、光学機器により異なる焦点位置において前記対象物を撮像することにより取得され、前記光学機器は、機器光学系を介して、異なる焦点位置において前記対象物を撮像するための機器光学系および焦点調節ユニットを備え、
前記方法は、
前記対象物（１３０）の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像（２３１）のセット（２３０）を生成するステップ（Ｓ１）と、
不鮮明度距離関数（２２０）を前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用するステップ（Ｓ２）であって、前記不鮮明度距離関数（２２０）により前記各画像についての距離値が計算され、それぞれ異なる距離値が対応する画像（２３１）の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付けられ、前記不鮮明度距離関数は、焦点位置における最大または最小の鮮明度または不鮮明度についての１次極値を示すステップと、
前記焦点位置を変数として有する前記不鮮明度距離関数（２２０）が絶対極値（２２４）を示す場合、前記絶対極値の焦点位置から開始して、その両側で等しく積分されて前記焦点位置のすべてにわたる総積分の所定の部分に達するまで、前記不鮮明度距離関数の積分を適用するステップ（Ｓ３１）と、
前記ｚスタック境界を、前記総積分の所定の部分の２つの限界に割り当てられた焦点位置に応じて判定するステップ（Ｓ４）と、
を含む方法。

【請求項3】

前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）を前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用するステップ（Ｓ３）の前に、不鮮明度距離関数（２２０）が前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用され（Ｓ２）、前記不鮮明度距離関数（２２０）により前記各画像についての距離値が計算され、それぞれ異なる距離値が前記対応する画像（２３１）の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付けられ、
前記焦点位置を変数として有する前記不鮮明度距離関数（２２０）が絶対極値（２２４）を示しかつ前記絶対極値の対応する焦点位置に関して対称である場合には、前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）は、前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用されて（Ｓ３）、前記ｚスタック境界が判定される（Ｓ４）、
請求項１記載の方法。

【請求項4】

前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）が１次極値（２１４）と前記１次極値（２１４）に隣接する２つの２次極値（２１２，２１６）とを示す場合、前記方法は、前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）の前記１次極値（２１４）が前記不鮮明度距離関数（２２０）の前記絶対極値（２２４）に対応するか否かを検証するさらなるステップを含む、
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

前記不鮮明度距離関数の総積分の所定の部分を、６０～８０％の範囲もしくは６０～７０％の範囲または６３％もしくは６６％であるように選択する、
請求項２または３を引用する場合の請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

前記焦点位置を変数として有する前記不鮮明度距離関数（２２０）が絶対極値（２２４）を示しかつ前記絶対極値（２２４）の対応する焦点位置に関して対称でない場合、前記不鮮明度距離関数（２２０）の積分が適用されて（Ｓ３１）、前記ｚスタック境界が判定される（Ｓ４）、
請求項２または３を引用する場合の請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）は、勾配法に基づく距離関数またはウェーブレット分解法に基づく距離関数の群から選択される、
請求項１を引用する場合の請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

前記不鮮明度距離関数（２２０）は、自己相関法に基づく距離関数の群から選択される、
請求項２または３を引用する場合の請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

前記対象物の撮像にとって最適な焦点は、請求項２または３を引用する場合に前記不鮮明度距離関数（２２０）がその絶対極値（２２４）を有する焦点位置として規定される、
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。

【請求項10】

前記ｚスタック境界（１１０，１２０）を判定するために、前記対象物の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像（２３１）のセット（２３０）を生成するステップ（Ｓ１）は、焦点位置の第１の範囲にわたって第１の焦点ステップサイズを使用して画像の第１のセットを生成することと、焦点位置の第２の範囲にわたって第２の焦点ステップサイズを使用して画像の第２のセットを生成することと、を含む、
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

前記第２の焦点ステップサイズは、前記第１の焦点ステップサイズより小さい、
請求項１０記載の方法。

【請求項12】

前記焦点位置の第２の範囲は、前記焦点位置の第１の範囲より小さい、
請求項１０または１１記載の方法。

【請求項13】

前記ｚスタックの境界を、前記画像の第１のセットおよび前記画像の第２のセットの各画像のセットについて判定する、
請求項１０から１２までのいずれか１項記載の方法。

【請求項14】

前記対象物の画像（２３１）のセット（２３０）を生成するステップ（Ｓ１）の後、まず、前記不鮮明度距離関数（２２０）が前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用され（Ｓ２）、前記不鮮明度距離関数（２２０）が絶対極値（２２４）を有しかつ前記絶対極値（２２４）の対応する焦点位置に関して対称である場合、前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）が前記画像のセット（２３０）の各画像（２３１）に適用され（Ｓ３）、
前記不鮮明度距離関数（２２０）が絶対極値（２２４）を有するものの対称でない場合、前記不鮮明度距離関数（２２０）の積分が適用されて（Ｓ３１）、前記ｚスタック境界が判定され、
前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）が適用されて（Ｓ３）前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）が１次極値（２１４）に隣接する２つの２次極値（２１２，２１６）を有する場合、前記ｚスタック境界が前記２つの２次極値（２１２，２１６）に割り当てられた焦点位置に応じて判定され（Ｓ４）、
前記不鮮明度‐Ｗ距離関数（２１０）がこのような２つの２次極値を欠く場合、前記不鮮明度距離関数（２２０）にわたって積分が適用されて（Ｓ３１）、前記ｚスタック境界が判定される（Ｓ４）、
請求項１および２または請求項３を引用する場合の請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項15】

対象物（１３０）を撮像するための光学機器（８００）であって、前記光学機器（８００）は、
前記対象物（１３０）を撮像するための機器光学系（８１０，８２０）と、
前記対象物（１３０）が撮像される焦点位置を調節するための焦点調節ユニット（８３０）と、
前記対象物（１３０）の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像のセットを生成するように、前記機器光学系（８２０）および前記焦点調節ユニット（８３０）に動作可能に接続されており、かつ、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法を実行するように構成されたプロセッサ（８４０）と、
を備える光学機器（８００）。

【請求項16】

前記光学機器（８００）は、顕微鏡であり、
前記機器光学系（８１０，８２０）は、前記対象物の拡大画像を生成するように構成された顕微鏡対物レンズ（８１０）を含む、
請求項１５記載の光学機器（８００）。

【請求項17】

コンピュータプログラムであって、
プロセッサ上、特に請求項１５または１６記載の光学機器（８００）のプロセッサ（８４０）上で実行される際に、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法を実行するためのプログラムコードを含む、
コンピュータプログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象物の画像のｚスタックの境界を自動的に判定する方法であって、画像のｚスタックは、光学機器により異なる焦点位置において対象物を撮像することにより取得される、方法に関する。本発明は、さらに、対応する光学機器および前記方法を実行するためのコンピュータプログラムに関する。とりわけ、本発明は、対象物の画像のｚスタックが特にｚスタック画像の画像処理により対象物の３次元イメージングのために取得される顕微鏡検査法の分野にある。

【背景技術】

【0002】

顕微鏡撮像では、ｚスタックは、サンプル／対象物の同じｘ‐ｙ位置にあるが、異なる焦点深度／ｚ位置で連続的にキャプチャされた複数の画像のセットである。本出願において、焦点方向またはｚ軸の方向は、サンプルまたは対象物のｘ‐ｙ面または「サンプル面」に対して垂直である。ｚスタック内でキャプチャされた画像は、典型的には、ｚスタックの境界内のサンプル／対象物の３次元表現を生成するために画像処理される。

【0003】

顕微鏡のユーザは、典型的には、ｚスタックの限界または境界の画定にいたるまで、サンプルの観察に相当な量の時間を費やす。最初に、例えば最適な焦点の焦点位置、例えばサンプルの中心における中心面のｚ位置を手動でまたは自動的に判定し、ついで、ｚスタックの範囲およびｚスタック内の多数の画像／スライスを画定することにより、中心面から対称的に開始して、ｚスタックの境界を拡大する場合がある。しかしながら、このような方法は、特にｚスタックの境界に関してかつ／または特に手動で行われる場合、非常に時間がかかるサンプル自体に対しては適応化されないことが多い。さらに、このような方法は、自動取得プロセス、例えば大規模なスクリーニングにとって問題となることがある。取得の限界を手動で判定する場合、ユーザは、事前にサンプルを観察して対象物深度のおおよその程度を学習する必要がある。サンプルが焦点面の大きな変動を有する異なる領域を有する場合、対応するｚスタックの限界を設定することは、時間のかかる労力を要する。一方、このような場合に固定されたｚスタック限界を設定すると、サンプル領域に応じて空の画像またはサンプルの境界を含まないｚスタックがもたらされ、画像情報の欠落につながるおそれがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、特に、顕微鏡検査法において、対象物／サンプルの画像のｚスタックの境界（boundary）／境界（border）／限界を自動的に判定するための改善された方法を提供することである。この画像のｚスタックは、光学機器、例えば顕微鏡により、異なる焦点位置において対象物を撮像することにより取得される。本発明の別の目的は、改善された対応する光学機器および前記方法を実施するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラムを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

この目的は、独立請求項に係る方法、光学機器およびコンピュータプログラムにより解決される。本発明の実施形態は、各従属請求項および本明細書における説明の主題である。

【0006】

サンプル／対象物のｘ‐ｙ位置におけるｚスタックの適切な境界を自動的に判定するために、対象物の画像のセットが生成され、各画像が異なる焦点位置でキャプチャされる。この目的で、光学機器は、機器光学系を介して、異なる焦点位置において対象物を撮像するための機器光学系および焦点調節ユニットを備える。すなわち、対象物のｚスタックまたは画像のセットが、判定されたｚスタック境界内の異なる焦点位置において、対象物を撮像することにより取得される画像の別のｚスタックの境界を自動的に判定するために取得される。ｚスタック境界を判定するために取得された画像は、後の時点でｚスタック自体の画像として使用することもできるしまたは使用しなくてもよい。

【0007】

ｚスタック取得の方式は、多くの場合、顕微鏡検査法においてオートフォーカシングに使用される。サンプルの所定のｘ‐ｙ位置において、顕微鏡ステージまたは顕微鏡の対物レンズが焦点方向に異なるｚ位置に走査されている間、画像が取得される。得られたｚスタックについて、各画像に適用される特定の距離関数を、変数としての焦点位置と共に使用することができる。このような距離関数により、ｚスタックの画像の画像コントラスト、エントロピー、空間周波数コンテンツ等についての情報を抽出することが可能となる。種々の距離関数が、特に、異なる顕微鏡撮像モードおよびノイズ耐性の観点から評価されてきた（例えば“Analysis of focus measure operators for shape-from-focus”, Said Pertuz et al., in Pattern Recognition 46 (2013) 1415-1432を参照のこと）。

【0008】

本発明者らは、オートフォーカシングに使用される幾つかの距離関数をｚスタックの境界の自動的な判定に使用できることを見出した。本発明者らは、オートフォーカシングに使用される距離関数の中から、２種類の距離関数、すなわち「不鮮明度距離関数」および「不鮮明度‐Ｗ距離関数」を特定することができることを見出した。

【0009】

いわゆる「不鮮明度距離関数」を使用することにより、その大域的最小値から、ｚスタック内の最小の不鮮明度、すなわち最大の鮮明度の焦点位置、このため典型的には撮像される対象物の焦点面の位置が得られる。最良の結果が、画定された境界の球形または楕円形対象物、例えば細胞または細胞クラスタとして定義することができる基準対象物について達成される。「鮮明度距離関数」は、反対符号の「不鮮明度距離関数」に対応するため、「不鮮明度距離関数」なる用語に包含されるべきである。対象物の焦点が合っているとき、キャプチャされた画像は、大きな画像コントラスト、大きな範囲の強度値および鮮明なエッジを示すはずである。したがって、適切な不鮮明度（または鮮明度）距離関数は焦点に対して特に感度が高く、焦点の隣の両側で単調に低下し、最適には、ピークに関して対称であり、局所的極値を示さない。不鮮明度距離関数として使用することができる距離関数の群を以下に与える。

【0010】

「不鮮明度‐Ｗ距離関数」は、不鮮明度または鮮明度距離関数のサブファミリと見なすことができ、このサブファミリは、大域的極値、例えば焦点位置における最大鮮明度についての大域的最大値を示し、さらに、局所的極値、例えば大域的最大値に隣接する２つの局所的最小値を示す（この例の距離関数は「Ｗ」の形式を有する。これが、不鮮明度‐Ｗ距離関数の名称が選択される理由である。一方、反対符号のこのような距離関数が考慮される場合、得られた「Ｍ」形式のために、「不鮮明度－Ｍ距離関数」と称することができる。このため、不鮮明度－Ｍ距離関数は、「不鮮明度‐Ｗ距離関数」なる用語に包含されるべきである）。再度、最良の結果が、画定された境界の球形または楕円形対象物、例えば、細胞または細胞クラスタとして定義することができる基準対象物について達成される。このような「不鮮明度‐Ｗ距離関数」を使用して、本発明者らは、２つの局所的極値／最小値に割り当てられた焦点位置が、対応する画像をそのバックグラウンドから依然として区別することができる程度に十分に鮮明である対象物の境界を表しまたは示すことを見出した。すなわち、対応する焦点位置をｚスタックの適切な境界の判定に使用することができる。Ｚスタック境界を、２つの局所的極値に割り当てられた焦点位置に応じてまたは大部分が焦点位置にあると判定することができる。本明細書において、「１次極値」は、大域的最大値または大域的最小値のための別の用語であり、一方、「２次極値」なる用語は、局所的最大値または局所的最小値を指定する。

【0011】

まとめると、本発明の実施形態によれば、上記定義された不鮮明度‐Ｗ距離関数を、光学機器により異なる焦点位置において取得された画像のセットの各画像に適用し、不鮮明度‐Ｗ距離関数により、各画像についての距離値を計算し、それぞれ異なる距離値を対応する画像の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付け、焦点位置を変数として有する不鮮明度‐Ｗ距離関数が１次極値と当該１次極値に隣接する２つの２次極値とを示す場合、ｚスタック境界を、２つの２次極値に割り当てられた焦点位置に応じて判定する。１次極値が最大値である場合、２つの２次極値は典型的には最小値であり、逆もまた同様である。

【0012】

本発明により、ユーザがサンプル／対象物を事前に観察し、サンプル／対象物の範囲について推測しまたはサンプルの中心から対称的に始まるｚスタックを画定することを必要とせずに、ｚスタック境界を純粋に自動的に判定することが可能となる。本発明に係る方法を実施するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラムを使用することにより、ユーザは、単に、サンプルの所定の位置でｚスタック撮像を選択することができ、本発明に係る方法により、さらなるユーザ入力なしに、ｚスタックの限界または境界が自動的に判定されるであろう。このため、光学機器、特に顕微鏡を操作するユーザの使い勝手が非常に向上する。ｚスタック撮像を行うとき、ユーザは、ｚステップ間隔および／または所定のｚスタック内の画像／スライスの数を規定するのみでよい。一方、特定のサンプルおよび／または撮像モードの経験に基づいて、デフォルトで、このようなステップ間隔または画像／スライスの数を設定することも好都合でありうる。

【0013】

実際には、本発明の方法に係る画像のセットへの適用に適した１つの不鮮明度‐Ｗ距離関数のみが存在するわけではないことに留意されたい。このため、２つ以上の不鮮明度‐Ｗ距離関数を、上記定義された不鮮明度距離関数の群から選択することができる。ついで、２つ以上のこのような不鮮明度‐Ｗ距離関数を画像のセットに適用し、少なくとも幾つかの、例えば少なくとも２つの不鮮明度‐Ｗ距離関数が一致する２次極値を有する焦点位置を選択することが好都合でありうる。

【0014】

さらに、画像のセットが取得される範囲を、焦点面の周りの領域に限定することが好都合でありうる。焦点面を、上記説明された不鮮明度距離関数を焦点方向においてより大きなステップサイズで取得することができる画像のセットに適用することにより見出すことができる。適用される不鮮明度距離関数は、焦点面における絶対極値を有する必要があり、最適には、この絶対極値に隣接するさらなる極値を有してはならない。このような不鮮明度距離関数を適用することにより、焦点面を容易に特定することができる。代替的には、ユーザは、焦点面を視覚的に特定することができる。本発明によれば、対象物の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像のセットを生成するステップは、焦点面を含む焦点位置の範囲をカバーすべきである。不鮮明度‐Ｗ距離関数の１次極値は、典型的には、不鮮明度距離関数の絶対極値と同じ焦点位置にあることに留意されたい。

【0015】

例えば、選択された不鮮明度‐Ｗ距離関数が２つの２次極値を示さないかまたは明確には示さない、対象物および／または撮像方法に応じた事例が生じうる。この場合、既に上記にて説明したように、適切な不鮮明度‐Ｗ距離関数のセットから別の不鮮明度‐Ｗ距離関数を選択することができる。

【0016】

代替的にはまたは冗長検査のために、上記にて定義された不鮮明度距離関数を画像のセットの各画像に適用し、不鮮明度距離関数により各画像についての距離値を計算し、それぞれ異なる距離値を対応する画像の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付け、焦点位置を変数として有する不鮮明度距離関数が絶対極値を示す場合、不鮮明度距離関数の積分を絶対極値の焦点位置から開始し、その両側で等しく積分されて焦点位置のすべてにわたる総積分の所定の部分に達するまで適用する。ついで、ｚスタック境界を、総積分の所定の部分の２つの限界に割り当てられた焦点位置に応じて判定する。

【0017】

実施形態において、この代替方法を、不鮮明度‐Ｗ距離関数を使用する最初に言及した方法の結果を確認する場合または期待に反して、不鮮明度‐Ｗ距離関数が（各実験設定において）２つの２次極値を示さないかもしくは十分に明確に示さない場合のいずれかに適用することができる。ただし、最初に不鮮明度‐Ｗ距離関数を適用することなく、不鮮明度距離関数に基づく積分法を使用することができることに留意されたい。

【0018】

この実施形態では、典型的には、サンプル／対象物の最適な焦点位置または焦点面における絶対極値を有する不鮮明度距離関数を、この絶対極値の焦点位置から開始し、その両側で等しく積分されて総積分の所定の割合に達するまで積分する。画像のセットのすべての焦点位置にわたる総積分を、事前に、並列にまたは事後に計算する。不鮮明度距離関数が、この絶対極値の焦点位置に関して対称であることは利点であるが、必須ではない。対称な場合、絶対極値の焦点位置に対する総積分の所定の部分の２つの限界の距離は、（本質的に）同じである。特に、この場合、ｚスタック境界を、総積分の所定の部分の２つの限界に割り当てられた焦点位置として判定することができる。一般的には、特に、非対称不鮮明度距離関数の場合、ｚスタック境界を、２つの積分限界に割り当てられた、発見された焦点位置に応じて判定する。以下に、例を、さらに詳細に説明するものとする。

【0019】

実施形態において、不鮮明度‐Ｗ距離関数が１次極値と当該１次極値に隣接する２つの２次極値とを示す場合、不鮮明度‐Ｗ距離関数の１次極値が、不鮮明度距離関数の絶対極値に対応するか否かを検証するために、不鮮明度距離関数を追加で適用することが依然として有意義である場合がある。当該検証は、両距離関数を焦点面または最適焦点値付近で取得された画像のセットに適用し、２次極値の焦点位置付近で取得された画像のセットには適用しないという目的に役立つ。

【0020】

不鮮明度‐Ｗ距離関数を適用する同様の実施形態では、不鮮明度‐Ｗ距離関数を画像のセットの各画像に適用するステップの前に、不鮮明度距離関数を、画像のセットの各画像に（追加で）適用することができ、上記にて定義された不鮮明度距離関数により、各画像についての距離値を計算し、それぞれ異なる距離値を対応する画像の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付け、焦点位置を変数として有する不鮮明度距離関数が絶対極値を示しかつ当該絶対極値の対応する焦点位置に関して対称であり、特に、絶対極値に隣接する２つの２次極値を示さずまたはより一般的には、２次極値を何ら示さない場合には、不鮮明度‐Ｗ距離関数を、ｚスタック境界を判定するために、画像のセットの各画像に適用する。最初に上記の手法で不鮮明度距離関数を適用し、ついで、ｚスタック境界を判定するために不鮮明度‐Ｗ距離関数を適用するこの実施形態は、有益であることが証明されており、ｚスタック境界を判定する際に良好な結果がもたらされる。この実施形態を、以下でより詳細に検討するものとする。

【0021】

不鮮明度距離関数を積分することによりｚスタックの境界を判定する代替的または付加的な方法に関して、不鮮明度距離関数の総積分の所定の部分を、６０～８０％もしくは６０～７０％の範囲でまたは６３％（１／ｅに対応）もしくは６６％（２／３）になるように選択することができる。後者の２つの値が好ましいが、実験設定に応じて別の値に置き換えることができる。

【0022】

実際には、サンプルの種類および撮像モードに応じて、焦点位置を変数として有する不鮮明度距離関数は、絶対極値を示すものの当該絶対極値の対応する焦点位置に関して対称でないことがある。このような場合には、不鮮明度距離関数の積分をｚスタック境界の判定に依然として適用することができる。一方、絶対極値を示す不鮮明度距離関数を見出すことができない場合、通常、ｚスタック境界を判定することができないことが示されている。

【0023】

実施形態において、不鮮明度‐Ｗ距離関数は、勾配法に基づく距離関数またはウェーブレット分解法に基づく距離関数の群から選択される。

【0024】

実施形態において、不鮮明度距離関数は、自己相関法に基づく距離関数の群から選択される。

【0025】

別の実施形態では、対象物を撮像するための最適焦点が、不鮮明度距離関数がその絶対極値を有する焦点として定義される。

【0026】

別の実施形態では、対象物の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像のセットを生成するステップは、焦点位置の第１の範囲にわたって第１の焦点ステップサイズを使用して画像の第１のスタックを生成することと、焦点位置の第２の範囲にわたって第２の焦点ステップサイズを使用して画像の第２のスタックを生成することとを含む。実施形態において、第２のステップサイズは、第１のステップサイズより小さい。実施形態において、焦点の第２の範囲は、焦点の第１の範囲より小さい。これは、焦点面の周りの領域に集中することにより、画像取得の速度を高めるのに役立ち、焦点面を、画像の第１のスタックを生成した後に迅速に見出すことができる。その後、焦点面の周りの領域が、より高い精度で走査される。

【0027】

別の実施形態では、対象物の境界を、画像の第１のスタックおよび第２のスタックの画像の各セットについて判定する。このため、当該プロセスを、以下のように、２またはそれ以上の粒度ステップで最適化することができる。

【0028】

実施形態の第１のステップにおいて、約３０スライス／画像のスタックが、対物レンズの限界の間、すなわち、６００μｍの範囲内のより大きなステップサイズ、例えば２０μｍで取得される。本発明の実施形態によれば、ｚレンジファインダが適用され、第１のｚスタック限界が得られる。ｚレンジファインダにより、例えば２つのｚスタック境界としてスライス３および１８が提供され、ｚスタックは３００μｍ幅である。

【0029】

第２のステップにおいて、より薄いステップサイズが適用される（ここでは、例えば、３００μｍの範囲にわたって３．６μｍであり、合計８４個の画像が得られる）。ｚレンジファインダが２回目として適用され、また、ｚスタック境界が例えばスライス２５および６０として提供される。

【0030】

最終的に、出力は、対象物についてのｚスタックの下側境界および上側境界の両方である。一般的には、スライス番号の代わりに、ｚ方向における顕微鏡ステージ座標で位置を得ることもできることに留意されたい。また、これは、２つのスライス間の距離値の補間およびマイクロメートル単位での最適な等価ｚ値を見出すことも含むことができる。

【0031】

実施形態においては、対象物の画像のセットを生成するステップ後、不鮮明度距離関数が画像のセットの各画像に適用され、不鮮明度距離関数が絶対極値を有しかつ当該絶対極値の対応する焦点位置に関して対称であり、特に２次極値を何ら示さない場合、不鮮明度‐Ｗ距離関数が画像のセットの各画像に適用され、一方、不鮮明度距離関数が絶対極値を有するものの対称でない場合、不鮮明度距離関数の積分がｚスタック境界の判定に適用され、不鮮明度‐Ｗ距離関数が適用される場合、不鮮明度‐Ｗ距離関数が１次極値に隣接する２つの２次極値を有するか否かが検証される。その場合、ｚスタック境界が、２つの２次極値に割り当てられた焦点位置に応じて（またはそうであるとして）判定され、不鮮明度‐Ｗ距離関数がこのような２つの２次極値を有さない場合、不鮮明度距離関数にわたって積分を適用してｚスタック境界が判定される。

【0032】

さらに、本発明は、対象物を撮像するための光学機器に関する。光学機器は、対象物を撮像するための機器光学系と、対象物が撮像される焦点位置を調節するための焦点調節ユニットと、対象物の異なる焦点位置においてキャプチャされた各画像のセットを生成するように、機器光学系および焦点調節ユニットに動作可能に接続されており、かつ上記の本発明に係る方法の実施形態のいずれか１つを実行するように構成された、プロセッサと、を備える。

【0033】

実施形態において、光学機器は顕微鏡であり、機器光学系は、顕微鏡光学系、特に対象物の拡大画像を生成するように構成された顕微鏡対物レンズを含む。

【0034】

さらに、本発明は、コンピュータプログラムがプロセッサ上で、特に本発明に係る光学機器のプロセッサ上で実行された場合、本発明に係る上記の方法の実施形態を実施するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラムに関する。

【0035】

実施形態の上記の特徴は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の概念の範囲に依然として含まれる他の実施形態を達成するために、全体的にまたは部分的に組み合わせることができることに留意されたい。

【0036】

本明細書で使用されるように、用語「および／または（かつ／または）」は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数の項目のあらゆるすべての組み合わせを含んでおり、「／」として略記されることがある。

【0037】

幾つかの態様を方法の文脈で説明してきたが、これらの態様は、このような方法に従って動作するように構成されている装置またはデバイスの説明も表すことが明らかである。

【0038】

さらなる実施形態およびその利点は、以下の図に関連して、以下に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】顕微鏡による画像のｚスタックの取得のためのサンプルを保持するサンプルキャリアの例を模式的に示す図である。

【図2】画像のセット内のｚスタック境界の判定に使用される不鮮明度‐Ｗ距離関数および不鮮明度距離関数を模式的に示す図である。

【図3】ワークフローのフロー図（図３の左側）および距離関数の対応するグラフ（右側）を模式的に示す。

【図4】本発明に係る方法の実施形態の別のワークフローのフロー図を模式的に示す。

【図5】本発明に係る方法の別の実施形態のフロー図（左側）および対応する距離関数のグラフ（右側）を模式的に示す。

【図6】本発明に係る方法の別の実施形態のフローチャート（左側）および対応する距離関数の対応するグラフ（右側）を模式的に示す。

【図7】例示的な不鮮明度距離関数の積分によるｚスタック境界の判定の例を模式的に示す図である。

【図8】本発明の実施形態に係る光学機器の例としての顕微鏡を模式的に示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

以下に、図面は、包括的に説明され、同じ参照符号は、同じまたは少なくとも機能的に同じ要素を指定する。詳細な説明は、顕微鏡による対象物の撮像に関するが、他の光学機器を想定することができる。

【0041】

図１に、サンプルを保持するための傾斜サンプルキャリア１４０が模式的に示されている。また、傾斜焦点面／レベル１５０（「Ｆ」を参照のこと）は、オートフォーカシング法により決定される。この実施形態では、サンプルは、焦点方向に変化する広がりを有し、このため、典型的には、焦点マップを顕微鏡撮像のためにオートフォーカシング法により生成することができる。顕微鏡は、サンプルの撮像に使用され、対物レンズの対物レンズ範囲限界１６０を有する。画像のｚスタックが取得されるサンプルは、１３０（目的の対象物）で指定されている。所望のｚスタック境界は、下側境界としての１２０、上側境界としての１１０であってよい。実際には、目的の対象物１３０の対象物境界は、ｚスタック境界と一致するかまたはこのようなｚスタック境界１１０，１２０の外側もしくは内側のいずれかであることができる。図１の模式図では、対象物境界はｚスタック境界１１０，１２０内にある。

【0042】

以下の説明では、このようなｚスタック境界１１０，１２０を、本発明の実施形態により自動的に判定することのできる方法について検討する。

【0043】

図２では、下方に水平方向で、対象物１３０の例示的な画像が示されている。対象物１３０は、球形であって明確に画定された境界を有する上記にて検討した典型的な基準対象物を表しており、対象物の拡大画像を生成するように構成された顕微鏡光学系を通して、図１に示されたｚ方向に異なる焦点位置において撮影される。目視検査から、画像が最も鮮明である焦点面が、およそ１０番目の画像の焦点位置にあることが明らかになる（ここでは示されていないが、１１番目または１２番目の画像であることもある）。図２には、合計３１個の画像（画像０～画像３０）の８つの画像のみが示されていることが留意される。ユーザが、図２の画像０～３０を視覚的に検査することにより、対象物１３０の撮像にとって最適な焦点面の焦点位置を容易に特定することができるが、対象物境界の徹底的な検査によってのみ、ユーザは、図１に示されたｚスタック境界１１０，１２０を判定することが可能となる。一方、Ｚスタック境界１１０，１２０は、本発明の方法の以下の実施形態を適用することにより見出すことができる。

【0044】

画像２３１のセット２３０が生成された後、各画像２３１がｚ方向（図１を参照のこと）のそれぞれ異なる焦点位置においてキャプチャされ、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０が画像のセット２３０の各画像２３１に適用される。不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０により、各画像２３１についての距離値（ｙ軸）が計算され、それぞれ異なる距離値が、グラフの下の画像２３１のセット２３０から分かるように、対応する画像の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付けられる。図２のグラフに、焦点位置を変数（ｘ軸）として有する不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０が示されている。不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０は、１次極値または最大値２１４と当該１次極値２１４に隣接する２つの２次極値または最小値２１２および２１６とを明確に示しており、典型的な「Ｗ」型がもたらされている。本発明者らは、図１のｚスタック境界１１０，１２０を、２つの２次極値２１２および２１６に割り当てられた焦点位置に応じて判定することができることを見出した。

【0045】

例えば、２つの最小値２１２，２１６に割り当てられた焦点位置を、ｚスタック境界１２０および１１０として直接に使用することができる。実験設定に応じて、別の対象物１３０の形状およびトポロジーは、図１および図２に関連して検討された例から逸脱する場合があることに留意されたい。また、顕微鏡撮像モードも、画像２３１のセット２３０で撮影された画像２３１に影響を及ぼす。このため、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０の挙動は、実際には、異なる対象物１３０に適用するときかつ／または異なる顕微鏡撮像モード下で異なる場合がある。このような異なる実験設定により、もはや２次極値および／または１次極値を明確に示さない、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０がもたらされることがある。同様の考察が、図２に示された不鮮明度距離関数２２０にも適用される。本発明の実施形態により、以下に説明されるように、このような異なる実験設定に対処することさえ可能となる。

【0046】

また、適切な不鮮明度距離関数２２０も、画像のセット２３０の各画像２３１に適用し、不鮮明度距離関数２２０によっても、各画像２３１についての距離値を計算し、それぞれ異なる距離値を、図２から分かるように、対応する画像２３１の異なる画像鮮明度または不鮮明度に関連付ける。焦点位置を変数（ｘ軸）として有する不鮮明度距離関数２２０は、焦点位置における絶対極値２２４を示しかつ当該焦点位置が最適な焦点を表す。オートフォーカシングの目的で、最適な焦点を、不鮮明度（または鮮明度）距離関数２２０を画像２３１のセット２３０に適用することにより、容易に判定することができる。一方、不鮮明度距離関数２２０自体によっては、対象物の画像のｚスタックの境界に関する指示を何ら得られない。それにもかかわらず、本発明者らは、特に、例えば、本実験設定のために、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０を適用可能でない場合、図２に示されているような不鮮明度距離関数２２０のみを適用することにより、ｚスタックの境界１１０，１２０を判定する代替法を見出した。このような場合については、以下でさらに詳細に検討するものとする。

【0047】

図２から最も良く分かるように、不鮮明度距離関数２２０は、その大域的最大値から最大の鮮明度の焦点位置が得られるため、むしろ「鮮明度距離関数」であり、焦点に特に感度が高く、焦点の隣の両側で単調に低下し、ピークに関して全く対称であり、局所的極値を何ら示さない。このため、図２の実施形態における不鮮明度距離関数２２０は、本発明の意味において「不鮮明度距離関数」として使用することができる、ある種の距離関数の良好な代表である。

【0048】

不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０は、不鮮明度距離関数２２０とほぼ同じ焦点位置における最大鮮明度についての大域的最大値を示す。加えて、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０は、大域的最大値２１４に隣接する２つの局所的最小値２１２，２１６を示す。これらの局所的極小値２１２，２１６は、対応する画像２３１が依然として十分に鮮明であり、その結果、対象物の画像をそのバックグラウンドから区別することができる対象物１３０のエッジを示す。したがって、図２の実施形態の不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０は、不鮮明度‐Ｗ距離関数として使用することができる、ある種の距離関数の良好な候補である。

【0049】

実施形態において、不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０は、勾配法に基づく距離関数またはウェーブレット分解法に基づく距離関数の群から選択される。とりわけ、勾配法に基づく距離関数の中でも、ｘ方向およびｙ方向それぞれにおける画像の１次導関数、このため、空間周波数を使用する距離関数が有益であることが証明されている。実施形態において、不鮮明度‐Ｗ距離関数は、“Analysis of focus measure operators for shape-from-focus”, Said Pertuz et al., in Pattern Recognition 46 (2013) 1415-1432の第１４２７頁の式Ａ．１３に記載されている関数である。ウェーブレット分解法に基づく距離関数は、主に、離散ウェーブレット変換（ＤＷＴ）係数の統計的特性に基づいている。第１のレベルのＤＷＴでは、画像は４つの部分画像に分解される。第１のレベルのＤＷＴに基づく距離関数は、不鮮明度‐Ｗ距離関数としての使用に有益であることが証明されている。このような実施形態では、不鮮明度‐Ｗ距離関数は、“Analysis of focus measure operators for shape-from-focus”, Said Pertuz et al., in Pattern Recognition 46 (2013) 1415-1432の第１４３０頁の式Ａ．４０に記載されている関数である。さらに、実施形態において、不鮮明度距離関数は、自己相関法に基づく距離関数の群から選択される。このような自己相関法では、画像自己相関が、例えば、隣接する列または行のピクセル値を自己相関させることにより計算される。実施形態において、不鮮明度距離関数は、“Analysis of focus measure operators for shape-from-focus”, Said Pertuz et al., in Pattern Recognition 46 (2013) 1415-1432の第１４２８頁の式Ａ．１４に記載されている関数である。

【0050】

図３に、本発明に係る方法の実施形態に係るフローチャートが示されている。Ｓ１は、第１のステップを指定する。第１のステップにおいて、対象物１３０の画像２３１のセット２３０が生成される（図１および図２を参照のこと）。各画像が、異なる焦点またはｚ位置においてキャプチャされる。不鮮明度‐Ｗ距離関数を適用するステップＳ３の前に、ステップＳ２において、不鮮明度距離関数２２０（図２を参照のこと）が、画像のセット２３０の各画像２３１に適用される。図３の実施形態におけるステップＳ２に使用される不鮮明度距離関数の別の例が、図３の右側に参照符号３２０で示されている。次のステップにおいて、不鮮明度距離関数が絶対極値を示すか否かが評価される。この場合、絶対極値は、関数３２０の最大値である。次に、不鮮明度距離関数３２０が良好な近似に対して対称であるか否かが評価される。この場合も、この評価で評価肯定的な応答が得られれば、方法はステップＳ３に進む。その前に、不鮮明度距離関数３２０がその絶対極値に隣接する２次極値を何ら示さないか否かを追加で評価することが好都合であることもある。なぜならば、そうでないなら、選択された不鮮明度距離関数は、むしろ、不鮮明度‐Ｗ距離関数のカテゴリに入るためである。

【0051】

ステップＳ３において、不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０を適用することにより、（Ｓ３）において図３の右側に示された対応するグラフを得ることができる。このグラフは、不鮮明度距離関数３２０および重畳された不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０を示している。

【0052】

次に、１次極値に隣接する２つの２次極値を有するか否かに関して、不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０が評価される。不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０は１次最大値と最大値に隣接する２つの局所的最小値とを示すため、方法は、ステップＳ３について図３の右側に示された距離関数３１０の２つの最小値に割り当てられた焦点位置に応じて（ここでは同一であるとして）、ｚスタック境界を判定するステップＳ４に続く。ｚスタック境界１１０，１２０の焦点位置はそれぞれｆ_ｍｉｎおよびｆ_ｍａｘである。

【0053】

不鮮明度距離関数３２０を、不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０を適用する前に、画像のセット２３０に適用する理由は、以下のように考えることができる。まず、不鮮明度距離関数３２０を適用することにより、焦点面の焦点位置を、不鮮明度距離関数３２０の最大値の焦点位置として容易に見出すことができる。ｚスタック境界を判定するために評価される画像のセットは、不鮮明度距離関数３２０の最大値の焦点位置の周りの焦点領域において取得されるはずである。このため、画像のセットを取得するための焦点位置の範囲のシフトは、不鮮明度距離関数３２０を最初に適用した後に可能である。さらに、本発明者らは、図３のステップＳ３に示されているように、不鮮明度‐Ｗ距離関数３１０を適用することにより、ｚスタック境界判定につきより速く、大部分がより信頼できる結果が得られることを見出した。第３に、図３のステップＳ２に示されているように、画像のセットから不鮮明度距離関数３２０がもたらされると、実際には、不鮮明度距離関数のサブ群に属すると見なすことのできる図３の関数３１０のような不鮮明度‐Ｗ距離関数が、１次極値と当該１次極値に隣接する２つの明確な２次極値とを有することに関する要件を満たす可能性が最も高い。

【0054】

図４には、ステップＳ２における不鮮明度距離関数の評価の結果、不鮮明度距離関数がそのピークに関して対称ではない場合についての、本発明に係る方法の別の実施形態のフローチャートが模式的に示されている。ステップＳ１およびＳ２は、図３の実施形態で検討されたステップＳ１およびＳ２に相当する。しかしながら、不鮮明度距離関数が対象物の画像２３１のセット２３０に適用されると、この場合には、この実験設定についての不鮮明度距離関数４２０を示す、（Ｓ２）における図４の右側に示されるグラフが得られる。本発明者らは、特にこのような場合、ｚスタック境界の判定に適した不鮮明度‐Ｗ距離関数を見出すことがほとんど不可能であることを見出した。代わりに、絶対極値、ここでは最大値を示す既存の不鮮明度距離関数４２０がｚスタック境界の判定に使用される。対称性評価が否定的な応答を返したため、方法は、絶対極値／最大値の焦点位置ｆ_０から開始し、その両側で等しく積分されて画像のセットの焦点位置のすべてにわたる総積分の所定の部分／割合に達するまで不鮮明度距離関数４２０を積分することにより、ステップＳ３１に続く。総積分の一部を６３％または６６％と規定することが有益であることが証明されているが、実験設定に応じて、他の値、好ましくは６０％～８０％または６０％～７０％の範囲の他の値をとってもよい。ついで、ｚスタック境界ｆ_ｍｉｎおよびｆ_ｍａｘが、焦点位置に応じてまたは総積分の所定の部分の２つの限界に割り当てられた焦点位置として、ステップＳ４において判定される。積分法は、図７に関連して、以下でより詳細に説明するものとする。

【0055】

図４の実施形態に関連して検討された積分法を、不鮮明度‐Ｗ距離関数（図３を参照のこと）を適用する代わりに、ステップＳ２の直後に適用することができることにも留意されたい。ここから、積分法を適用する別のケースを図５に関連して検討するものとする。

【0056】

図５に、本発明に係る方法の別の実施形態のフローチャートが示されている。ステップＳ１からステップＳ３までのフローチャートは図３のフローチャートと同一である。したがって、図３の実施形態に関連したステップＳ１からＳ３までの検討が明示的に参照される。不鮮明度距離関数を画像２３１のセット２３０に適用すると、（Ｓ３）における図５の右側のグラフに示されているような関数５２０が得られる。不鮮明度距離関数５２０は、絶対極値を有し、その最大値に関して対称であって、ステップＳ３において不鮮明度‐Ｗ距離関数が適用される。しかしながら、この実験設定の場合、得られた不鮮明度‐Ｗ距離関数５１０は、１次極値／最大値に隣接する２つの２次極値を示さない。別の適切な不鮮明度‐Ｗ距離関数の選択を試みることができるが、ステップＳ３１へ進むこと、すなわち実際には図４の実施形態のステップＳ３１に記載された積分法へ進むことがより容易かつ迅速である。このため、図５に示されている不鮮明度距離関数５２０の積分法の説明に関しては、この実施形態が参照される。積分法の結果として、ステップＳ４において、ｚスタック境界ｆ_ｍｉｎおよびｆ_ｍａｘが判定される。

【0057】

図６には、本発明に係る方法のさらに別の実施形態のフローチャートが模式的に示されている。図６のフローチャートは、図３～図５の組み合わせたフローチャートの完全なワークフローである。このため、図６に示されているワークフローの詳細については、上記検討が参照される。以下では、ワークフロー全体を簡単に説明するのみである。対象物１３０の画像２３１のセット２３０を生成するステップ（図６に示さず）の後、まず、不鮮明度距離関数２２０が画像のセットの各画像に適用される。不鮮明度距離関数２２０が絶対極値２２４（図２を参照のこと）を有し、この絶対極値２２４の対応する焦点に関して対称であり、特に絶対極値に隣接する２次極値を示さない場合、ワークフローはステップＳ３に進む。一方、不鮮明度距離関数が絶対極値を示すことができない場合、ワークフローは、ステップＳ５において、ｚスタックの境界を見出すことができないとして終了する。一方、不鮮明度距離関数が、図４に示された不鮮明度距離関数４２０のように、その絶対極値に属する焦点に関して対称でない場合、ワークフローはステップＳ３１に移り、図４の実施形態に関連して詳細に検討したように、積分法が不鮮明度距離関数に適用される。

【0058】

ステップＳ３において、１次極値に隣接する２つの２次極値を有さない不鮮明度‐Ｗ距離関数が再度適用された場合、ワークフローは、図５の実施形態で既に検討したように、ステップＳ３１に移る。一方、ステップＳ３において適用された不鮮明度‐Ｗ距離関数２１０が１次極値に隣接する２つの２次極値を示す場合、ワークフローはステップＳ４に進み、２つの２次極値に割り当てられた焦点位置に応じてまたはこの焦点位置として、ｚスタック境界が判定される。

【0059】

図７に、図４（ステップＳ３１）および図５（これもステップＳ３１）の実施形態に関連して上述した、不鮮明度距離関数に適用される積分法が示されている。図７には、不鮮明度距離関数７２０に適用される積分アルゴリズムのステップが示されており、最大値７２４がその絶対極値として示されている。図７のグラフ（１）は、値０～１（ｙ軸）の範囲で正規化されて、信号が平滑化された後の不鮮明度距離関数７２０を示している。

【0060】

まず、画像のセットの焦点位置の全範囲にわたる関数７２０の総積分が計算される。ついで、大域的最大値７２４から開始して、カバーされた面積が最初に６６％以上になるまで左右に段階的に移動することにより、積分が行われる。この場合も、６６％は、上記にて検討したように例示的な値に過ぎない。６６％積分の対応する限界は、ｚスタックの潜在的な位置である（図７のグラフ（２）を参照のこと）。実際のｚスタック境界が、図７のグラフ（３）に示されているように、これらの２つの潜在的な焦点位置に応じて判定される。

【0061】

冗長検査として、図７のグラフ（２）に示されているように、前ステップで判定された潜在的なｆ_ｍｉｎ位置から開始して、潜在的な限界ｆ_ｍｉｎの前により高い焦点値が存在するか否かを評価し、潜在的な限界ｆ_ｍａｘの後ろにより高い焦点値の点が存在するか否かが検査される。これは、明らかに、ピーク７２４の両側で単調に低下する関数７２０のケースとはなりえない。一方、このようなより高い焦点が存在する場合、対応する焦点位置が新たな限界となる。ついで、図７のグラフ（２）に示された潜在的な限界ｆ_ｍｉｎおよびｆ_ｍａｘが対称でない場合、図７のグラフ（３）に示された最終的な限界ｆ_ｍｉｎおよびｆ_ｍａｘがピーク７２４の周りで対称となるように、この限界のうちの少なくとも一方がより制限的な数値に設定される。図７のグラフ（２）および（３）に示された例では、潜在的な上方限界ｆ_ｍａｘを、最終的な限界ｆ_ｍａｘより低い数値すなわちより制限的な数値に設定した。

【0062】

図８には、本発明に係る光学機器の一実施形態として、顕微鏡８００が模式的に示されている。顕微鏡８００は、対象物１３０を撮像するための機器光学系８１０，８２０を備える。機器光学系は、特に、フロントレンズ８１２を有する対物レンズ８１０と、画像検出器８２０と、を含む。この実施形態では、サンプルまたは対象物１３０を、顕微鏡ステージ８６０上に置き、光源８５２および照明光学系８５０により照明することができる。対物レンズ８１０は、サンプル１３０の透過光撮像のための光軸８０２を画定する。

【0063】

顕微鏡８００は、ここではコントローラの形態にあるプロセッサ８４０と、焦点調節ユニット８３０と、をさらに備える。この実施形態の焦点調節ユニット８３０は、顕微鏡ステージ８６０を矢印８３２の方向に移動させるためのｚドライブを備える。原則として、対物レンズ８１０も、ｚ方向に移動させることができる。ｚドライブの移動により、対象物１３０が撮像される焦点位置を調節することができる。

【0064】

コントローラ／プロセッサ８４０は、画像２３１のセット２３０を生成するように、機器光学系、ここでは画像検出器８２０および焦点調節ユニット８３０に動作可能に接続されている。各画像２３１が、異なる焦点またはｚ位置においてキャプチャされる（図２を参照のこと）。コントローラ／プロセッサ８４０は、図８に例示的に示されているごとく、ｚスタック範囲１１５の下側境界１２０および上側境界１１０を自動的に判定するために、本発明に係る方法の実施形態に係る画像２３１のこのセット２３０を処理するようにさらに構成されている。

【0065】

ｚスタック境界１１０，１２０が判定された後、ｚスタック画像取得が開始され、例えば、ｚスタック範囲１１５内で撮像された対象物１３０の一部の３次元表現が生成される。

【0066】

本発明に係るコンピュータプログラムは、特に、本発明に係る方法の実施形態を実施するために、コントローラ／プロセッサ８４０上、一般的には、コンピュータシステム８４０上で実行される。

【0067】

コンピュータシステム８４０は、本明細書に記載された方法の少なくとも一部を実施するように構成されている。コンピュータシステム８４０は、機械学習アルゴリズムを実行するように構成されていてもよい。コンピュータシステム８４０と顕微鏡８００は別個の存在物であってもよいが、１つの共通のハウジング内に一体化されていてもよい。コンピュータシステム８４０は、顕微鏡８００の中央処理システムの一部であってもよく、かつ／またはコンピュータシステム８４０は、顕微鏡８００のセンサ、アクター、カメラまたは照明ユニット等の、顕微鏡８００の従属部品の一部であってもよい。

【0068】

コンピュータシステム８４０は、１つまたは複数のプロセッサおよび１つまたは複数のストレージデバイスを備える局所的コンピュータデバイス（例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレットコンピュータまたは携帯電話）であってもよく、または分散コンピュータシステム（例えば、局所的クライアントおよび／または１つまたは複数のリモートサーバファームおよび／またはデータセンター等の様々な場所に分散されている１つまたは複数のプロセッサおよび１つまたは複数のストレージデバイスを備えるクラウドコンピューティングシステム）であってもよい。コンピュータシステム８４０は、任意の回路または回路の組み合わせを含んでいてもよい。１つの実施形態では、コンピュータシステム８４０は、任意の種類のものとすることができる、１つまたは複数のプロセッサを含んでいてもよい。本明細書で使用されるように、プロセッサは、例えば、顕微鏡または顕微鏡部品（例えばカメラ）のマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、複合命令セットコンピューティング（ＣＩＳＣ）マイクロプロセッサ、縮小命令セットコンピューティング（ＲＩＳＣ）マイクロプロセッサ、超長命令語（ＶＬＩＷ）マイクロプロセッサ、グラフィックプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、マルチコアプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または任意の他の種類のプロセッサまたは処理回路等のあらゆる種類の計算回路を意図していてもよいが、これらに限定されない。コンピュータシステム８４０に含まれ得る他の種類の回路は、カスタム回路、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）等であってもよく、例えばこれは、携帯電話、タブレットコンピュータ、ラップトップコンピュータ、双方向無線機および類似の電子システム等の無線装置において使用される１つまたは複数の回路（通信回路等）等である。コンピュータシステム８４０は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）の形態のメインメモリ等の特定の用途に適した１つまたは複数の記憶素子を含み得る１つまたは複数のストレージデバイス、１つまたは複数のハードドライブおよび／またはコンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）等のリムーバブルメディアを扱う１つまたは複数のドライブ等を含んでいてもよい。コンピュータシステム８４０はディスプレイ装置、１つまたは複数のスピーカーおよびキーボードおよび／またはマウス、トラックボール、タッチスクリーン、音声認識装置を含み得るコントローラ、またはシステムのユーザがコンピュータシステム８４０に情報を入力すること、およびコンピュータシステム８４０から情報を受け取ることを可能にする任意の他の装置も含んでいてもよい。

【0069】

ステップの一部または全部は、例えば、プロセッサ、マイクロプロセッサ、プログラマブルコンピュータまたは電子回路等のハードウェア装置（またはハードウェア装置を使用すること）によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、極めて重要なステップのいずれか１つまたは複数が、そのような装置によって実行されてもよい。

【0070】

一定の実装要件に応じて、本発明の実施形態は、ハードウェアまたはソフトウェアで実装され得る。この実装は、非一過性の記録媒体によって実行可能であり、非一過性の記録媒体は、各方法を実施するために、プログラマブルコンピュータシステムと協働する（または協働することが可能である）、電子的に読取可能な制御信号が格納されている、デジタル記録媒体等であり、これは例えば、フロッピーディスク、ＤＶＤ、ブルーレイ、ＣＤ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭまたはＦＬＡＳＨメモリである。したがって、デジタル記録媒体は、コンピュータ読取可能であってもよい。

【0071】

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法が実施されるように、プログラマブルコンピュータシステムと協働することができる、電子的に読取可能な制御信号を有するデータ担体を含んでいる。

【0072】

一般的に、本発明の実施形態は、プログラムコードを備えるコンピュータプログラム製品として実装可能であり、このプログラムコードは、コンピュータプログラム製品がコンピュータ上で実行されるときにいずれかの方法を実施するように作動する。このプログラムコードは、例えば、機械可読担体に格納されていてもよい。

【0073】

別の実施形態は、機械可読担体に格納されている、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを含んでいる。

【0074】

したがって、換言すれば、本発明の実施形態は、コンピュータプログラムがコンピュータ上で実行されるときに本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラムである。

【0075】

したがって、本発明の別の実施形態は、プロセッサによって実行されるときに本明細書に記載のいずれかの方法を実施するために、格納されているコンピュータプログラムを含んでいる記録媒体（またはデータ担体またはコンピュータ読取可能な媒体）である。データ担体、デジタル記録媒体または被記録媒体は、典型的に、有形である、かつ／または非一過性である。本発明の別の実施形態は、プロセッサと記録媒体を含んでいる、本明細書に記載されたような装置である。

【0076】

したがって、本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを表すデータストリームまたは信号シーケンスである。データストリームまたは信号シーケンスは例えば、データ通信接続、例えばインターネットを介して転送されるように構成されていてもよい。

【0077】

別の実施形態は、処理手段、例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するように構成または適合されているコンピュータまたはプログラマブルロジックデバイスを含んでいる。

【0078】

別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するために、インストールされたコンピュータプログラムを有しているコンピュータを含んでいる。

【0079】

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを（例えば、電子的にまたは光学的に）受信機に転送するように構成されている装置またはシステムを含んでいる。受信機は、例えば、コンピュータ、モバイル機器、記憶装置等であってもよい。装置またはシステムは、例えば、コンピュータプログラムを受信機に転送するために、ファイルサーバを含んでいてもよい。

【0080】

いくつかの実施形態では、プログラマブルロジックデバイス（例えばフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）が、本明細書に記載された方法の機能の一部または全部を実行するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイは、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためにマイクロプロセッサと協働してもよい。一般的に、有利には、任意のハードウェア装置によって方法が実施される。

【符号の説明】

【0081】

１１０，ｆ_ｍｉｎ ｚスタックの上側境界
１１５ ｚスタック範囲
１２０，ｆ_ｍａｘ ｚスタックの下側境界
１３０ 目的の対象物、サンプル
１４０ サンプルキャリア
１５０ 焦点面
１６０ 対物レンズ範囲限界
２１０ 不鮮明度‐Ｗ距離関数
２１２ ２次極値
２１４ １次極値
２１６ ２次極値
２２０ 不鮮明度距離関数
２２４ 絶対極値
２３０ 画像のセット
２３１ 画像
３１０，５１０ 不鮮明度‐Ｗ距離関数
３２０，５２０ 不鮮明度距離関数
７２０ 不鮮明度距離関数
７２４ 絶対極値
８００ 顕微鏡、光学機器
８０２ 光軸
８１０ 対物レンズ
８１２ フロントレンズ
８２０ 画像検出器
８３０ 焦点調節ユニット
８３２ 移動方向
８４０ プロセッサ、コントローラ、コンピュータシステム
８５０ 照明光学系
８５２ 光源
８６０ 顕微鏡ステージ
Ｓ１～Ｓ５，Ｓ３１ 方法のステップ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【外国語明細書】