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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023088584
(43)【公開日】2023-06-27
(54)【発明の名称】ヒト肝癌細胞シート及びヒト肝癌細胞の培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20230620BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021203405
(22)【出願日】2021-12-15
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０２１年１月、細胞アッセイ研究会２０２０年シンポジウム細胞アッセイ技術の現状と将来・要旨集 ２０２１年１月２６日、細胞アッセイ研究会２０２０年シンポジウム ２０２１年３月１１日～１３日、第２０回日本再生医療学会総会 ２０２１年６月３日、第２８回ＨＡＢ研究機構学術年会 プログラム・要旨集 ２０２１年６月３日～４日、第２８回ＨＡＢ研究機構学術年会 ２０２１年９月２６日、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ・要旨集 ２０２１年９月２７日～１０月１日、ＥＵＲＯＴＯＸ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ２０２１ ２０２１年１０月２９日、日本動物実験代替法学会第３４回大会プログラム・講演要旨集 ２０２１年１１月１１日～１３日、日本動物実験代替法学会第３４回大会
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594158150
【氏名又は名称】学校法人君が淵学園
(71)【出願人】
【識別番号】000229542
【氏名又は名称】日本バイリーン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】石田 誠一
(72)【発明者】
【氏名】松下 琢
(72)【発明者】
【氏名】古水 雄志
(72)【発明者】
【氏名】親富祖 亮太
(72)【発明者】
【氏名】岩佐 卓哉
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 皓平
(72)【発明者】
【氏名】小島 理恵
(72)【発明者】
【氏名】川部 雅章
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA30
4B065BC42
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】ＢＳＥＰを高発現する一般的な肝がん細胞株を用いたモデル肝細胞を提供する。
【解決手段】本発明のヒト肝癌細胞シートは、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在し、胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している。本発明のヒト肝癌細胞の培養方法は、多孔体を細胞培養担体として用い、前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】本発明のヒト肝癌細胞シートは、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在し、胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している。本発明のヒト肝癌細胞の培養方法は、多孔体を細胞培養担体として用い、前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在している、ヒト肝癌細胞シートであって、
胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、
ヒト肝癌細胞シート。
胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、
ヒト肝癌細胞シート。
【請求項2】
胆汁排泄機能の評価に使用する、請求項１に記載のヒト肝癌細胞シート。
【請求項3】
多孔体を細胞培養担体として用いるヒト肝癌細胞の培養方法であって、
前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする、
ヒト肝癌細胞の培養方法。
前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする、
ヒト肝癌細胞の培養方法。
【請求項4】
工程１：ウェルを有する二種類の培養容器（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する工程、
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程、
を備えており、
培養容器（Ａ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積よりも、培養容器（Ｂ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積の方が広いことを特徴とする、
請求項３に記載のヒト肝癌細胞の培養方法。
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程、
を備えており、
培養容器（Ａ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積よりも、培養容器（Ｂ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積の方が広いことを特徴とする、
請求項３に記載のヒト肝癌細胞の培養方法。
【請求項5】
前記工程８における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培養期間が、５日間より多いことを特徴とする、
請求項４に記載のヒト肝癌細胞の培養方法。
請求項４に記載のヒト肝癌細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト肝癌細胞シート及びヒト肝癌細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
薬物の副作用の一つに薬物性肝障害（ＤＩＬＩ；Drug-Induced Liver Injury）がある。そのＤＩＬＩの最も初期の症状として胆汁うっ滞型肝毒性（胆汁を作る肝細胞から胆汁の排出が阻害され生じる肝毒性、一例として、肝細胞の胆汁酸トランスポーター（ＢＳＥＰ；Bile Salt Export Pump）による胆汁の排出が阻害され生じる）を生ずることが知られている。すなわち、医薬品などの開発の初期段階において胆汁うっ滞型肝毒性を事前に評価・予測できれば、副作用ＤＩＬＩの発生を低減した薬物の開発が促進されると考えられる。
【0003】
一方、胆汁うっ滞型肝毒性のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）評価には、評価標的分子であるＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞が必要である。現在最も主流なモデル細胞としてヒト正常肝細胞があるが、提供ドナーの個体差や製造ロットの影響を受けて再現性のある結果が得られない、長期培養ができない、価格が高いという課題があった。また、ヒト肝細胞を移植したキメラマウス由来の肝細胞や正常肝細胞由来不死化株ＨｅｐａＲＧ（登録商標；非特許文献１）といった新規細胞ソースも登場したが、細胞や専用の特殊培地の価格が高いという課題は解決されていなかった。
【0004】
そのため、安価・簡便で再現性が高く、また長期培養もできる一般的な肝癌細胞株を用いたモデル肝細胞の開発が求められていた。しかしながら、肝癌細胞株は肝機能が減退・消失しているものが多く、従来の培養条件下ではＢＳＥＰが高発現し難いものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Gripon P et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc Natl Acad Sci U S A., 99, 15655-15660 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、一般的な肝がん細胞株を用いてＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の発明に関する：
［１］多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在している、ヒト肝癌細胞シートであって、
胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、
ヒト肝癌細胞シート。
［２］胆汁排泄機能の評価に使用する、［１］のヒト肝癌細胞シート。
［３］多孔体を細胞培養担体として用いるヒト肝癌細胞の培養方法であって、
前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする、
ヒト肝癌細胞の培養方法。
［４］工程１：ウェルを有する二種類の培養容器（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する工程、
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程、
を備えており、
培養容器（Ａ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積よりも、培養容器（Ｂ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積の方が広いことを特徴とする、［４］のヒト肝癌細胞の培養方法。
［５］前記工程８における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培養期間が、５日間より多いことを特徴とする、［４］のヒト肝癌細胞の培養方法。
［１］多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在している、ヒト肝癌細胞シートであって、
胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、
ヒト肝癌細胞シート。
［２］胆汁排泄機能の評価に使用する、［１］のヒト肝癌細胞シート。
［３］多孔体を細胞培養担体として用いるヒト肝癌細胞の培養方法であって、
前記ヒト肝癌細胞がＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞であることを特徴とする、
ヒト肝癌細胞の培養方法。
［４］工程１：ウェルを有する二種類の培養容器（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する工程、
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程、
を備えており、
培養容器（Ａ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積よりも、培養容器（Ｂ）の前記ウェル底面上における前記多孔体の設置可能面積の方が広いことを特徴とする、［４］のヒト肝癌細胞の培養方法。
［５］前記工程８における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培養期間が、５日間より多いことを特徴とする、［４］のヒト肝癌細胞の培養方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明のヒト肝癌細胞シート及びヒト肝癌細胞の培養方法によれば、ＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートの厚さ方向における、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞核の蛍光量と、ＢＳＥＰの蛍光量をプロットし作成したグラフ。
【図2】実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートの厚さ方向における、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞核の蛍光量に対するＢＳＥＰの蛍光量の割合をプロットし作成したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0010】
（本発明のヒト肝癌細胞シート）
本発明のヒト肝癌細胞シートは、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在しており、胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している。
本発明のヒト肝癌細胞シートは、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在しており、胆汁酸トランスポーターＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している。
【0011】
本発明において細胞培養担体として用いる前記多孔体は、細胞を増殖および分化誘導することのできる三次元空間（空隙）を有するシート状の構造体であれば、特に限定されるものではなく、例えば、繊維シート、より具体的には織物、編物、繊維ウェブ、不織布、あるいは、多孔フィルムや発泡体などを挙げることができ、細胞が実在している生体内構造に近いことから、繊維ウェブあるいは不織布を用いるのが好ましい。
【0012】
多孔体として繊維シートを用いる場合、前記繊維シートを構成する繊維は、細胞を増殖および分化誘導するための担体として使用できる繊維シートを形成することができれば限定するものではなく、例えば、有機系繊維または無機系繊維のいずれか、あるいは、有機系繊維および無機系繊維を採用できる。
【0013】
有機系繊維の構成成分としては、例えば、ポリアミドポリマー、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリブリレンサクシネート、あるいはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲン）、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ナフィオン）、汎用ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ））などを単独で、あるいは、混合して使用することができる。
【0014】
無機系繊維の構成成分としては、例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができ、これらの一成分の酸化物から構成されていても、二成分以上の酸化物から構成されていても良い。
【0015】
本発明で挙げる一例の培養方法では、第一の培養容器（培養容器（Ａ））から第二の培養容器（培養容器（Ｂ））に、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと多孔体を移動させる工程を含むため、充分な強度と保形性を示す繊維シートが好ましく、例えば、繊維間が接着や融着された繊維シートが好ましく、更に成分自体に剛性を有する無機系繊維シートが好ましく、具体的には繊維間が接着されたシリカ繊維不織布を挙げることができる。
【0016】
繊維シートが組成の異なる二種類以上の繊維から構成されている場合、各種繊維が混在してなる繊維シートであっても良いし、互いに組成の異なる繊維層を備えた繊維シートであっても良い。また、上述した有機系繊維と無機系繊維が混在してなる繊維シートであっても、有機系繊維層と無機系繊維層を備えた繊維シートであってもよい。
【0017】
本発明では、ヒト肝癌細胞としてＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を使用する。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は、アレキサンダー細胞とも称されるヒト肝癌由来の細胞株であり、胆汁の排出に関与する胆汁酸トランスポーター（ＢＳＥＰ；Bile Salt Export Pump）を発現することが知られている（Tomonari T et al. Oncotarget. 2016; 7:7207-7215.）。各種細胞バンク（例えば、ＡＴＣＣ、ＪＣＲＢ細胞バンク）から入手可能であり、例えば、体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地等を用いて３７℃、５％二酸化炭素濃度の条件で培養することができる。
【0018】
本発明のヒト肝癌細胞シートでは、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している。
本明細書において「一方の主面側に偏在している」とは、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートにおけるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞数の分布態様と比較して、ＢＳＥＰ発現の分布態様が一方の主面側に偏っていることを指す。具体的には、以下の方法で、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートか否かを判断できる。
本明細書において「一方の主面側に偏在している」とは、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートにおけるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞数の分布態様と比較して、ＢＳＥＰ発現の分布態様が一方の主面側に偏っていることを指す。具体的には、以下の方法で、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートか否かを判断できる。
【0019】
（判断方法１）
（１）ヒト肝癌細胞シートを染色し、細胞核およびＢＳＥＰを染色する。このとき、染色された細胞核の発色（例えば、赤色に蛍光）と、染色されたＢＳＥＰの発色（例えば、緑色に蛍光）とが異なるものとなるように染色を行う。
（２）染色された前記ヒト肝癌細胞シートを一方の主面からもう一方の主面に向かう厚さ方向（主面と垂直を成す方向）に切断し、染色された細胞核を蛍光させた状態で前記ヒト肝癌細胞シートの断面写真を撮影する。なお、共焦点レーザー顕微鏡などの標本内部を観察可能な装置を使用することで、当該シートを実際には切断せずに断面写真を取得することもできる。次いで、同断面における、染色されたＢＳＥＰを蛍光させた状態で前記ヒト肝癌細胞シートの断面写真を撮影する。
（３）撮影された両断面写真を重ね合わせて新たな断面写真を作成し、染色された細胞核の蛍光と染色されたＢＳＥＰの蛍光が重なり、異なる蛍光色となっている箇所（例えば、赤色と緑色が重なることで黄色の蛍光色となっている箇所）の態様を目視で確認する。なお、異なる蛍光色となっている箇所が確認できなかった場合、当該ヒト肝癌細胞シートではＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞が存在していないと判断できる。また、異なる蛍光色となっている箇所が多いほど、当該ヒト肝癌細胞シートではＢＳＥＰが多く発現していると判断できる。
前記新たな断面写真において、前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面側よりも、もう一方の主面側に、前記異なる蛍光色となっている箇所が多く存在している場合、当該ヒト肝癌細胞シートでは、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）は、当該もう一方の主面側に偏在していると判断できる。
（１）ヒト肝癌細胞シートを染色し、細胞核およびＢＳＥＰを染色する。このとき、染色された細胞核の発色（例えば、赤色に蛍光）と、染色されたＢＳＥＰの発色（例えば、緑色に蛍光）とが異なるものとなるように染色を行う。
（２）染色された前記ヒト肝癌細胞シートを一方の主面からもう一方の主面に向かう厚さ方向（主面と垂直を成す方向）に切断し、染色された細胞核を蛍光させた状態で前記ヒト肝癌細胞シートの断面写真を撮影する。なお、共焦点レーザー顕微鏡などの標本内部を観察可能な装置を使用することで、当該シートを実際には切断せずに断面写真を取得することもできる。次いで、同断面における、染色されたＢＳＥＰを蛍光させた状態で前記ヒト肝癌細胞シートの断面写真を撮影する。
（３）撮影された両断面写真を重ね合わせて新たな断面写真を作成し、染色された細胞核の蛍光と染色されたＢＳＥＰの蛍光が重なり、異なる蛍光色となっている箇所（例えば、赤色と緑色が重なることで黄色の蛍光色となっている箇所）の態様を目視で確認する。なお、異なる蛍光色となっている箇所が確認できなかった場合、当該ヒト肝癌細胞シートではＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞が存在していないと判断できる。また、異なる蛍光色となっている箇所が多いほど、当該ヒト肝癌細胞シートではＢＳＥＰが多く発現していると判断できる。
前記新たな断面写真において、前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面側よりも、もう一方の主面側に、前記異なる蛍光色となっている箇所が多く存在している場合、当該ヒト肝癌細胞シートでは、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）は、当該もう一方の主面側に偏在していると判断できる。
【0020】
また、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の、ヒト肝癌細胞シートにおける偏在の態様をより正確に判断する必要がある場合には、以下の方法を用いることで、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートか否かを判断できる。
【0021】
（判断方法２）
（１）ヒト肝癌細胞シートを染色し、細胞核およびＢＳＥＰを染色する。このとき、染色された細胞核の発色（例えば、赤色に蛍光）と、染色されたＢＳＥＰの発色（例えば、緑色に蛍光）とが異なるものとなるように染色を行う。
（２）染色された前記ヒト肝癌細胞シートを一方の主面からもう一方の主面に向かう厚さ方向（主面と垂直を成す方向）へ向かい、０．５μｍ間隔ごとに一方の主面と平行を成すように切断してゆき、前記ヒト肝癌細胞シートの薄膜を複数取得する。なお、共焦点レーザー顕微鏡などの標本内部を観察可能な装置を使用することで、当該シートを実際には切断せずに後述する各薄膜の主面写真を取得することもできる。
（３）染色された細胞核を蛍光させた状態で各薄膜の主面写真を、倍率４００倍で撮影する。次いで、染色されたＢＳＥＰを蛍光させた状態で各薄膜の主面写真を撮影する。
（４）撮影された全ての写真について、各写真に写る細胞核の蛍光値ｃならびにＢＳＥＰの蛍光値ｂを各々求める。そして、求めた各細胞核の蛍光値ｃのうち最も小さい蛍光値を基準値（＝１）とし、当該基準値に対し各写真に写る細胞核の蛍光値ｃの相対値を、各写真に写る細胞核の蛍光量として扱う。同様に、求めた各ＢＳＥＰの蛍光値ｂのうち最も小さい蛍光値を基準値（＝１）とし、当該基準値に対し各写真に写るＢＳＥＰの蛍光値ｂの相対値を、各写真に写るＢＳＥＰの蛍光量として扱う。
（５）Ｘ軸を前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面からその厚さ方向に向かう長さ（厚み、単位：μｍ）、Ｙ軸を蛍光量とした座標軸中に、各薄膜において数値化された、細胞核の蛍光量と、ＢＳＥＰの蛍光量とをプロットしてグラフを作成する（例えば、後述の実施例で作成する図１）。
（６）Ｘ軸を前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面からその厚さ方向に向かう長さ（厚み、単位：μｍ）、Ｙ軸を前記項目（５）で求めた、各薄膜における細胞核の蛍光量に対するＢＳＥＰの蛍光量の割合（紙面上の下側の端部が最小値を示し、紙面上の上側に向かい増加すること意味する）をプロットしてグラフを作成する（例えば、後述の実施例で作成する図２）。
このようにして（５）で作成されたグラフでは、細胞核の蛍光量プロットを当該シート厚み方向の細胞数（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の数など）の分布と見なし、ＢＳＥＰの蛍光量プロットを当該シート厚み方向に存在する細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）で発現しているＢＳＥＰの発現量と見なすことができる。
そして、前記項目（６）で作成した座標軸中のグラフにおいて、Ｘ軸のどちらか一端へ向かうにつれＹ軸の値が優位に増加している場合、当該ヒト肝癌細胞シートでは、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が一方の主面側よりももう一方の主面側に偏在していると判断できる。
（１）ヒト肝癌細胞シートを染色し、細胞核およびＢＳＥＰを染色する。このとき、染色された細胞核の発色（例えば、赤色に蛍光）と、染色されたＢＳＥＰの発色（例えば、緑色に蛍光）とが異なるものとなるように染色を行う。
（２）染色された前記ヒト肝癌細胞シートを一方の主面からもう一方の主面に向かう厚さ方向（主面と垂直を成す方向）へ向かい、０．５μｍ間隔ごとに一方の主面と平行を成すように切断してゆき、前記ヒト肝癌細胞シートの薄膜を複数取得する。なお、共焦点レーザー顕微鏡などの標本内部を観察可能な装置を使用することで、当該シートを実際には切断せずに後述する各薄膜の主面写真を取得することもできる。
（３）染色された細胞核を蛍光させた状態で各薄膜の主面写真を、倍率４００倍で撮影する。次いで、染色されたＢＳＥＰを蛍光させた状態で各薄膜の主面写真を撮影する。
（４）撮影された全ての写真について、各写真に写る細胞核の蛍光値ｃならびにＢＳＥＰの蛍光値ｂを各々求める。そして、求めた各細胞核の蛍光値ｃのうち最も小さい蛍光値を基準値（＝１）とし、当該基準値に対し各写真に写る細胞核の蛍光値ｃの相対値を、各写真に写る細胞核の蛍光量として扱う。同様に、求めた各ＢＳＥＰの蛍光値ｂのうち最も小さい蛍光値を基準値（＝１）とし、当該基準値に対し各写真に写るＢＳＥＰの蛍光値ｂの相対値を、各写真に写るＢＳＥＰの蛍光量として扱う。
（５）Ｘ軸を前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面からその厚さ方向に向かう長さ（厚み、単位：μｍ）、Ｙ軸を蛍光量とした座標軸中に、各薄膜において数値化された、細胞核の蛍光量と、ＢＳＥＰの蛍光量とをプロットしてグラフを作成する（例えば、後述の実施例で作成する図１）。
（６）Ｘ軸を前記ヒト肝癌細胞シートの一方の主面からその厚さ方向に向かう長さ（厚み、単位：μｍ）、Ｙ軸を前記項目（５）で求めた、各薄膜における細胞核の蛍光量に対するＢＳＥＰの蛍光量の割合（紙面上の下側の端部が最小値を示し、紙面上の上側に向かい増加すること意味する）をプロットしてグラフを作成する（例えば、後述の実施例で作成する図２）。
このようにして（５）で作成されたグラフでは、細胞核の蛍光量プロットを当該シート厚み方向の細胞数（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の数など）の分布と見なし、ＢＳＥＰの蛍光量プロットを当該シート厚み方向に存在する細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）で発現しているＢＳＥＰの発現量と見なすことができる。
そして、前記項目（６）で作成した座標軸中のグラフにおいて、Ｘ軸のどちらか一端へ向かうにつれＹ軸の値が優位に増加している場合、当該ヒト肝癌細胞シートでは、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が一方の主面側よりももう一方の主面側に偏在していると判断できる。
【0022】
シート中の細胞密度や前記ＢＳＥＰ発現以外の細胞状態は、シート使用時に細胞が健常な状態にあれば特に限定されるものではないが、例えば、シートを境界とした胆汁酸輸送評価が実施できるよう、シート主面方向を細胞が埋め尽くし、隙間がない状態が好ましい。更に、シート全体が膜としての機能を果たす状態が好ましく、具体的には、細胞間にタイトジャンクションの形成に必要なタンパク質（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＺＯ－１など）が発現しており、シートが経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を有することが好ましい。また、ＢＳＥＰが偏在している主面側とは異なる他方の主面側に、胆汁酸の排泄トランスポーターＢＳＥＰと対の機能を果たす取り込みトランスポーターＮＴＣＰ（sodium taurocholate cotransporting polypeptide）などが存在している状態が好ましい。
【0023】
ＢＳＥＰの発現の有無は、例えば、後述の実施例に示すように、抗ＢＳＥＰ抗体（一次抗体）と蛍光色素等で標識化した二次抗体を用いる免疫染色により確認することができる。この際、ＢＳＥＰの発現の有無にかかわらず、全細胞を染色することのできる染色剤（例えば、細胞核染色剤）を併用することにより、ＢＳＥＰを発現している細胞は、免疫染色および細胞染色（例えば、細胞核染色）の両方で陽性を示す一方、ＢＳＥＰを発現していない細胞は、細胞染色でのみ陽性を示す。
【0024】
後述の実施例では、シートをシャーレに載置した状態においてシート上面となる主面側（シャーレ底面と接触しない主面側）に、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が集中して存在し、一方、該状態においてシート下面となる主面側（シャーレ底面と接触する主面側）に、ＢＳＥＰが発現していないＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が集中して存在していた。
つまり、後述の実施例では、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、ヒト肝癌細胞シートを提供できた。
つまり、後述の実施例では、ＢＳＥＰが発現しているＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在している、ヒト肝癌細胞シートを提供できた。
【0025】
この構造（すなわち、ＢＳＥＰの発現に関して偏在を示す構造）は胆汁の取り込み（ＢＳＥＰが発現していない側の働き）と排泄（ＢＳＥＰが発現している側の働き）を再現可能な構造であり、本発明のヒト肝癌細胞シートを用いることで、胆汁の取り込みと排泄を評価することが可能となり、薬物の副作用の一つである薬物性肝障害の発生を低減した薬物の開発が促進されることが期待できる。
【0026】
本発明のヒト肝癌細胞シートの利用形態は特に限定されるものではないが、例えば、培養空間を２つに仕切る境界面を覆うように設置し、２空間の間の物質移動を評価することに使用することができる。培養容器のウェルを内外２つの空間に仕切るツールとしてインサート（例えば、トランズウェル（Corning社）、セルカルチャーインサート（Thermo Fisher Scientific社））が知られているが、これらのインサートのメンブレンが設置されている部分に本ヒト肝癌細胞シートを設置して使用できる。本ヒト肝癌細胞シートのＢＳＥＰが偏在している側をインサートの内側に向くように設置した場合、胆汁酸を含む培地をインサートの外側に、通常の培地をインサートの内側に添加すると、胆汁酸は本シートのＢＳＥＰを介して外から内へ一定の速度で輸送されると考えられる。医薬品評価の一例としては、内外の培地に更に被検物質を添加し、胆汁酸の外から内への輸送速度の変化を測定する方法を挙げることができる。測定の結果、胆汁酸の輸送速度に低下が生じれば、その被検物質はＢＳＥＰの機能を阻害して胆汁酸うっ滞型毒性を引き起こす可能性があると評価できる。
【0027】
（本発明のヒト肝癌細胞の培養方法）
本発明のヒト肝癌細胞の培養方法では、ヒト肝癌細胞としてＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を使用し、細胞培養担体として多孔体を使用する。
また、本発明のヒト肝癌細胞の培養方法の好適態様では、
工程１：ウェルを有する二種類の培養容器（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する工程、
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程
を実施する。
本発明のヒト肝癌細胞の培養方法では、ヒト肝癌細胞としてＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を使用し、細胞培養担体として多孔体を使用する。
また、本発明のヒト肝癌細胞の培養方法の好適態様では、
工程１：ウェルを有する二種類の培養容器（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する工程、
工程２：培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程３：前記ウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する工程、
工程４：前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を前記多孔体上で培養する工程、
工程５：培養容器（Ｂ）が有するウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす工程、
工程６：前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す工程、
工程７：工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル底面上に設置する工程、
工程８：培養容器（Ｂ）が有する前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する工程
を実施する。
【0028】
前記工程１では、ウェルを有する二種類のウェルプレート（培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ））、多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、および、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地を用意する。
【0029】
工程１で用意する培養容器（Ａ）および培養容器（Ｂ）としては、培養容器（Ａ）のウェル底面上における多孔体の設置可能面積（Ｓａ）は多孔体の主面の面積（Ｓｐ）よりも広く、かつ、Ｓａよりも培養容器（Ｂ）のウェル底面上における多孔体の設置可能面積（Ｓｂ）の方が広い限り、特に限定されるものではなく、細胞培養に一般的に使用される培養容器、例えば、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、８ウェルプレート、６ウェルプレート、４ウェルプレート、シャーレ、ガラスボトムディッシュ等から適宜選択することができる。
【0030】
Ｓｐに対するＳａの比（Ｓａ／Ｓｐ）は、１を超えれば特に限定されるものではないが、播種した細胞が多孔体の片側の主面に効率良く配置され、接着できるように１に近い方が好ましいことから、２以下であるとより好ましく、１．５以下であると更に好ましい。
また、Ｓａに対するＳｂの比（Ｓｂ／Ｓａ）は、１を超えれば特に限定されるものではないが、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは２０以上である。本発明の培養方法によりＢＳＥＰが高発現し、且つ、ＢＳＥＰの発現に関して偏在が生じる理由は、現時点では明らかになっていないが、本発明者の推測によれば、ウェル底面上における多孔体の設置可能面積が広がることにより、培地の豊富な環境へ移動したためと考えている。
なお、Ｓｂ／Ｓａの上限は特に限定されるものではないが、例えば、培養容器の載置場所や培地コストの制約などから、現実的には５０以下である。
また、Ｓａに対するＳｂの比（Ｓｂ／Ｓａ）は、１を超えれば特に限定されるものではないが、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは２０以上である。本発明の培養方法によりＢＳＥＰが高発現し、且つ、ＢＳＥＰの発現に関して偏在が生じる理由は、現時点では明らかになっていないが、本発明者の推測によれば、ウェル底面上における多孔体の設置可能面積が広がることにより、培地の豊富な環境へ移動したためと考えている。
なお、Ｓｂ／Ｓａの上限は特に限定されるものではないが、例えば、培養容器の載置場所や培地コストの制約などから、現実的には５０以下である。
【0031】
前記工程１で用意する多孔体、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞については、（本発明のヒト肝癌細胞シート）において先述した説明がそのまま適用できる。
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地としては、例えば、体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地等を用いることができる。
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培地としては、例えば、体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地等を用いることができる。
【0032】
前記工程２では、培養容器（Ａ）が有するウェルのウェル底面上に設置されている前記多孔体すべてが浸るまで、前記ウェル内に前記培地を満たす。
工程２において培養容器（Ａ）のウェル内に満たす培地の量は、ウェル底面上に設置する多孔体すべてが浸る量であれば特に限定されるものではないが、培地深さが深すぎると多孔体と気相の距離が離れて酸素供給性が悪くなる恐れがあるため、典型的には、ウェル底面から１～１０ｍｍの高さであるのが好ましい。
工程２において培養容器（Ａ）のウェル内に満たす培地の量は、ウェル底面上に設置する多孔体すべてが浸る量であれば特に限定されるものではないが、培地深さが深すぎると多孔体と気相の距離が離れて酸素供給性が悪くなる恐れがあるため、典型的には、ウェル底面から１～１０ｍｍの高さであるのが好ましい。
【0033】
前記工程３では、培養容器（Ａ）のウェル底面上に設置されている前記多孔体における、前記ウェル底面側と反対側の主面上へ、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種する。播種するＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のウェル底面の単位面積当たりの細胞数は、例えば、ウェル及び多孔体の大きさや培養日数に応じて適宜決定することができ、例えば、１．０×１０４～３．０×１０５細胞／ｃｍ２である。
【0034】
前記工程４では、培養容器（Ａ）のウェル中で、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を多孔体上で培養する（以下、一次培養と称する）が、このとき、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は多孔体上に接着した状態にあるのが好ましい。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞は、例えば、体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地等を用いて３７℃、５％二酸化炭素濃度の条件で培養することができる。培養日数は、調整できるが、培養容器（Ａ）のまま培養を続けると、播種時に多孔体からこぼれ落ちた不要な細胞も増殖することで培地劣化を早め、多孔体上の細胞に悪影響が生じる恐れがあることから、当該培養日数は、多孔体への細胞接着から培地劣化が開始するまでの時間とするのが好ましい。具体的には、細胞が接着に要する播種後４時間以降から培地に含まれる劣化判定用の指示薬の色が変化し始めるまで（例：フェノールレッド、細胞の酸性老廃物の蓄積により赤紫から黄に変化する）の期間であるのが好ましい。なお、培地交換によって培地劣化が生じない状態を維持できる内は、適宜培地交換を行うことで一次培養期間を延長可能である。
【0035】
前記工程５では、培養容器（Ｂ）のウェル内に、以後の工程において前記多孔体すべてが浸るように、前記ウェル内に前記培地を満たす。
工程５において培養容器（Ｂ）のウェル内に満たす培地の量は、前記工程２と同様に、ウェル底面上に設置する多孔体すべてが浸る量であれば特に限定されるものではないが、典型的には、ウェル底面から１～１０ｍｍの高さであるのが好ましい。
工程５において培養容器（Ｂ）のウェル内に満たす培地の量は、前記工程２と同様に、ウェル底面上に設置する多孔体すべてが浸る量であれば特に限定されるものではないが、典型的には、ウェル底面から１～１０ｍｍの高さであるのが好ましい。
【0036】
前記工程６では、前記培養容器（Ａ）の前記ウェルから、培養中の前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞ごと前記多孔体を取り出す。本発明の培養方法では、多孔体として、充分な強度と保形性を示す繊維間が接着された無機繊維シートを用いることが好ましい。
【0037】
前記工程７では、工程６で取り出した前記多孔体を、前記多孔体における前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を播種した側が前記ウェル底面側と反対側になるようにして、培養容器（Ｂ）の前記ウェル底面上に設置する。
また、前記工程８では、培養容器（Ｂ）の前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する（以下、二次培養と称する）。
また、前記工程８では、培養容器（Ｂ）の前記ウェル中で、前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養する（以下、二次培養と称する）。
【0038】
工程６～工程７における培養容器（Ａ）から培養容器（Ｂ）の多孔体の移動は、培養容器（Ｂ）に移動させた多孔体の状態が、培養容器（Ａ）に設置した多孔体の状態と変わらないように（すなわち、多孔体の上面と下面との関係が変わらないように）実施する。
【0039】
二次培養は、培養容器（Ｂ）のウェル底面上における多孔体の設置可能面積（Ｓｂ）が、培養容器（Ａ）のウェル底面上における多孔体の設置可能面積（Ｓａ）より広くなること（すなわち、培地量が多くなること）以外は、工程４の一次培養と同様にして実施することができる。
【0040】
二次培養の培養日数は特に限定されるものではないが、ＢＳＥＰの発現量が多くなるよう２日以上であるのが好ましく、多孔体中のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞がＢＳＥＰの発現に関して偏在が生じるよう、更に好ましくは５日より多い日数である。上限としては、培養日数に従ってＢＳＥＰの発現量が増加するが、ヒト肝癌細胞シートが得られるまでに要する時間を不必要に長期化することが無いよう、また、細胞が増殖し過ぎて内部壊死などの不具合が起きないようにするため、現実的には２０日以下である。なお、二次培養中は、培地に含まれる劣化判定用の指示薬の色の変化を注視しながら、適宜培地交換を行うのが好ましい。
【0041】
本発明の培養方法によれば、ヒト肝癌細胞としてＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を使用するため、ＢＳＥＰを高発現するヒト肝癌細胞を担持するヒト肝癌細胞シートを提供することができる。例えば、後述の比較例２、比較例３に示すように、ヒト肝癌由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を使用した場合、ＢＳＥＰが発現しない結果となった。
【0042】
また、本発明の培養方法によれば、多孔体を細胞培養担体として使用することによって生体環境を模倣した３次元培養を実現可能であるため、より多くのＢＳＥＰを発現するヒト肝癌細胞を担持するヒト肝癌細胞シートを提供することができる。例えば、後述の比較例１に示すように、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を使用しても、多孔体を使用せずに直接ウェルに播種した場合、ＢＳＥＰの発現は確認できなかった。
【0043】
更に、一次培養と二次培養を実施する本発明の培養方法の好適態様によれば、一次培養のみを実施する本発明の培養方法（例えば、後述の実施例１、実施例２）と比べて、より多くのＢＳＥＰを発現し、且つ、ＢＳＥＰの発現に関して偏在を示すヒト肝癌細胞を担持するヒト肝癌細胞シートをより短期間で提供することができる。
【実施例0044】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0045】
《ヒト肝癌細胞シートの調製》
後述の実施例１～６、比較例１～３では、特に断らない限り、基本的に以下の培養手順に従ってヒト肝癌細胞シートを調製した。
体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（２５０μＬ／ウェル）を満たした２４ウェルプレート（円形のウェルの直径：１５．６ｍｍ）内に、多孔体の細胞培養担体として円形のシリカ繊維不織布（Ｃｅｌｌｂｅｄ（直径：１３ｍｍ、平均繊維径：約１μｍ、厚み：２５０μｍ、登録商標）；日本バイリーン株式会社製）を浸漬させて当該ウェルの底面上に敷き、その上へウェル当たり３．０×１０５細胞／２５０μＬのヒト肝癌由来細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号IFO50069、培養ロット10252013）の懸濁培地を播種した。３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養条件で２日、７日または１４日間の一次培養を行った。培養日数が２日の場合は、途中培地交換は実施しなかった。培養期間が７日の場合は、播種後２、４、６日目に５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換した。培養期間が１４日の場合は、播種後２、４日目に５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換し、更に、６日目以降は毎日５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換した。
後述の実施例１～６、比較例１～３では、特に断らない限り、基本的に以下の培養手順に従ってヒト肝癌細胞シートを調製した。
体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（２５０μＬ／ウェル）を満たした２４ウェルプレート（円形のウェルの直径：１５．６ｍｍ）内に、多孔体の細胞培養担体として円形のシリカ繊維不織布（Ｃｅｌｌｂｅｄ（直径：１３ｍｍ、平均繊維径：約１μｍ、厚み：２５０μｍ、登録商標）；日本バイリーン株式会社製）を浸漬させて当該ウェルの底面上に敷き、その上へウェル当たり３．０×１０５細胞／２５０μＬのヒト肝癌由来細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号IFO50069、培養ロット10252013）の懸濁培地を播種した。３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養条件で２日、７日または１４日間の一次培養を行った。培養日数が２日の場合は、途中培地交換は実施しなかった。培養期間が７日の場合は、播種後２、４、６日目に５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換した。培養期間が１４日の場合は、播種後２、４日目に５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換し、更に、６日目以降は毎日５００μＬ／ウェルの培地を全て新しいものに交換した。
【0046】
所定日数の一次培養を行った後に、シリカ繊維不織布ごと、体積比で１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を満たした１００ｍｍシャーレへ移動し、所定日数の二次培養を行い、ヒト肝癌細胞シートを調製した。なお、１００ｍｍシャーレに移動させた後、培地は３日に１回、全量交換した。
【0047】
《実施例１、２》
本実施例では、シリカ繊維不織布を敷いた２４ウェルプレートにおける一次培養のみを行うことによりヒト肝癌細胞シートを調製した。実施例１では７日間、実施例２では１４日間の一次培養を行った。
本実施例では、シリカ繊維不織布を敷いた２４ウェルプレートにおける一次培養のみを行うことによりヒト肝癌細胞シートを調製した。実施例１では７日間、実施例２では１４日間の一次培養を行った。
【0048】
《実施例３～６》
本実施例では、シリカ繊維不織布を敷いた２４ウェルプレートにおける一次培養を二日間行った後、シリカ繊維不織布ごと、１００ｍｍシャーレへ移動し、二次培養を行うことによりヒト肝癌細胞シートを調製した。実施例３では２日間、実施例４では５日間、実施例５では８日間、実施例６では１２日間の二次培養を行った。
本実施例では、シリカ繊維不織布を敷いた２４ウェルプレートにおける一次培養を二日間行った後、シリカ繊維不織布ごと、１００ｍｍシャーレへ移動し、二次培養を行うことによりヒト肝癌細胞シートを調製した。実施例３では２日間、実施例４では５日間、実施例５では８日間、実施例６では１２日間の二次培養を行った。
【0049】
《比較例１》
本比較例では、シリカ繊維不織布を用いることなく、平面底の培養容器を用いた単層培養条件で培養を行うことで、ヒト肝癌由来細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のみからなる単層ヒト肝癌細胞シートを調製した。なお、後に蛍光観察を行うにあたり、自家蛍光を有さないガラスボトムディッシュを用いた。また、単層培養条件では、細胞が過密になりすぎると剥離が生じることから、培養日数を実施例１と同じ７日間にした場合に丁度隙間のない単層状の細胞シートが形成されるよう、細胞播種密度等の条件調整を行った。具体的には、直径３５ｍｍで円形の平面底を有するガラスボトムディッシュに、２．０×１０４細胞／２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養条件で７日の培養を行った。培地は実施例１と同じものを使用し、２、４、６日目に、全量新しいものに交換した。
本比較例では、シリカ繊維不織布を用いることなく、平面底の培養容器を用いた単層培養条件で培養を行うことで、ヒト肝癌由来細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のみからなる単層ヒト肝癌細胞シートを調製した。なお、後に蛍光観察を行うにあたり、自家蛍光を有さないガラスボトムディッシュを用いた。また、単層培養条件では、細胞が過密になりすぎると剥離が生じることから、培養日数を実施例１と同じ７日間にした場合に丁度隙間のない単層状の細胞シートが形成されるよう、細胞播種密度等の条件調整を行った。具体的には、直径３５ｍｍで円形の平面底を有するガラスボトムディッシュに、２．０×１０４細胞／２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養条件で７日の培養を行った。培地は実施例１と同じものを使用し、２、４、６日目に、全量新しいものに交換した。
【0050】
《比較例２》
本比較例では、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に代えてヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞（理研バイオリソースセンター、細胞番号ＲＣＢ１６４８）を用いたこと、そして、シリカ繊維不織布を用いることなく、比較例１と同様にして、ガラスボトムディッシュ上にヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞のみからなる単層ヒト肝癌細胞シートを調製した。
本比較例では、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に代えてヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞（理研バイオリソースセンター、細胞番号ＲＣＢ１６４８）を用いたこと、そして、シリカ繊維不織布を用いることなく、比較例１と同様にして、ガラスボトムディッシュ上にヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞のみからなる単層ヒト肝癌細胞シートを調製した。
【0051】
《比較例３》
本比較例では、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に代えてヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いること以外は、前記実施例１の操作を繰り返し、ヒト肝癌細胞シートを調製した。
本比較例では、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に代えてヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いること以外は、前記実施例１の操作を繰り返し、ヒト肝癌細胞シートを調製した。
【0052】
《ヒト肝癌細胞シートの免疫染色》
実施例１～６、比較例１～３で調製した各ヒト肝癌細胞シートに関して、抗ＢＳＥＰ抗体を用いる免疫染色と、ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いる核染色を行った。
実施例１～６、比較例１～３で調製した各ヒト肝癌細胞シートに関して、抗ＢＳＥＰ抗体を用いる免疫染色と、ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いる核染色を行った。
【0053】
始めに、シリカ繊維不織布中の培養細胞を固定するために、体積比で４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて各ヒト肝癌細胞シートを２０分間処理した。続いて、抗体および核染色剤が培養細胞の細胞膜を透過して細胞内へ侵入できるように、体積比で１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳを用いて３０分間の膜透過処理を行った。更に、抗体および核染色剤の非特異的な反応を抑制するために、いずれも体積比で１０％のヤギ血清および０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて３０分間のブロッキング処理を行った。
【0054】
これらの前処理を行った後、免疫染色は、一次抗体として抗ＢＳＥＰ抗体（Ｆ－６）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；カタログ＃ｓｃ－７４５００）を、二次抗体として抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；カタログ＃４４０８）を用いて、常法に従って実施した。続いて、添付の説明書に従って、ＴＯ－ＰＲＯ－３染色（核染色）を行った。
そして、このようにして染色したヒト肝癌細胞シートを前述した（判断方法１）へ供した。
また、（判断方法１）へ供した結果、最も、ＢＳＥＰの発現量が多いと確認できた（ＢＳＥＰ発現量が〇〇〇と評価された）ヒト肝癌細胞シートである、実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートを、前述した（判断方法２）へ供した。なお、実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートを前述した（判断方法２）へ供することで作成したグラフを、図１および図２として図示する。これらグラフ中では、紙面上の左側が、ヒト肝癌細胞シートにおける培養時に培養容器と接していた側の主面（０μｍ）であり、紙面上右側が、ヒト肝癌細胞シートにおける培養時に培養容器と接していなかった側の主面（５９．５μｍ）を表している。
そして、このようにして染色したヒト肝癌細胞シートを前述した（判断方法１）へ供した。
また、（判断方法１）へ供した結果、最も、ＢＳＥＰの発現量が多いと確認できた（ＢＳＥＰ発現量が〇〇〇と評価された）ヒト肝癌細胞シートである、実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートを、前述した（判断方法２）へ供した。なお、実施例６で調製したヒト肝癌細胞シートを前述した（判断方法２）へ供することで作成したグラフを、図１および図２として図示する。これらグラフ中では、紙面上の左側が、ヒト肝癌細胞シートにおける培養時に培養容器と接していた側の主面（０μｍ）であり、紙面上右側が、ヒト肝癌細胞シートにおける培養時に培養容器と接していなかった側の主面（５９．５μｍ）を表している。
【0055】
結果を表１、表２に示す。
表１、表２「ＢＳＥＰ発現量」欄について、「×」は（判断方法１）へ供したところ、異なる蛍光色となっている箇所が確認できなかったことから、ＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞が存在していないヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
一方、「△」「〇」「〇〇」「〇〇〇」は、異なる蛍光色となっている箇所が確認できたことから、ＢＳＥＰが発現したヒト肝癌細胞が存在しているヒト肝癌細胞シートであることを意味する。なお、そのＢＳＥＰ発現量は、「△」から「〇〇〇」に向かい増量していることを意味する。
表１、表２「偏在有無」欄について、「－」は、ＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞の存在が確認できなかったため、ＢＳＥＰが発現している細胞の分布態様を確認しなかったことを意味する。
また、「×」は、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が、一方の主面側に偏在していることが確認できなかったヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
一方、「〇」は、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が、一方の主面側に偏在していることが確認できたヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
表１、表２「ＢＳＥＰ発現量」欄について、「×」は（判断方法１）へ供したところ、異なる蛍光色となっている箇所が確認できなかったことから、ＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞が存在していないヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
一方、「△」「〇」「〇〇」「〇〇〇」は、異なる蛍光色となっている箇所が確認できたことから、ＢＳＥＰが発現したヒト肝癌細胞が存在しているヒト肝癌細胞シートであることを意味する。なお、そのＢＳＥＰ発現量は、「△」から「〇〇〇」に向かい増量していることを意味する。
表１、表２「偏在有無」欄について、「－」は、ＢＳＥＰが発現しているヒト肝癌細胞の存在が確認できなかったため、ＢＳＥＰが発現している細胞の分布態様を確認しなかったことを意味する。
また、「×」は、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が、一方の主面側に偏在していることが確認できなかったヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
一方、「〇」は、ＢＳＥＰが発現している細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞など）が、一方の主面側に偏在していることが確認できたヒト肝癌細胞シートであることを意味する。
【0056】
【表1】
【0057】
【表2】
【0058】
比較例と実施例を比較した結果から、多孔体を用いてＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を培養することにより、ＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞を提供できることが判明した。
また、実施例１～２と実施例３～６とを比較した結果から、本発明にかかる二段階の培養方法を採用することによって、短時間の培養日数であっても、ＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞を効率よく培養して提供できることが判明した。そして、二段階目の培養日数（ウェル底面上における多孔体の設置可能面積が広い培養環境下での培養日数）が５日より多い時（具体的には８日以上の時）に、ＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートを効率よく提供できることが判明した。
また、本発明にかかる培養方法を用いることによって、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在しており、ＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートを提供できることが判明した。
そして、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートを構成している一つ一つのヒト肝癌細胞単位でも、細胞極性（頂側膜（apical）側・基底膜（basal）側で発現するタンパク質や生理機能が異なる）も構造的に再現されている可能性があると考えられた。
以上から、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートは、胆汁排泄機能の評価に使用することが可能だと考えられる。
また、実施例１～２と実施例３～６とを比較した結果から、本発明にかかる二段階の培養方法を採用することによって、短時間の培養日数であっても、ＢＳＥＰを高発現するモデル肝細胞を効率よく培養して提供できることが判明した。そして、二段階目の培養日数（ウェル底面上における多孔体の設置可能面積が広い培養環境下での培養日数）が５日より多い時（具体的には８日以上の時）に、ＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートを効率よく提供できることが判明した。
また、本発明にかかる培養方法を用いることによって、多孔体の空隙中にＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が存在しており、ＢＳＥＰが発現している前記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が一方の主面側に偏在しているヒト肝癌細胞シートを提供できることが判明した。
そして、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートを構成している一つ一つのヒト肝癌細胞単位でも、細胞極性（頂側膜（apical）側・基底膜（basal）側で発現するタンパク質や生理機能が異なる）も構造的に再現されている可能性があると考えられた。
以上から、本発明にかかるヒト肝癌細胞シートは、胆汁排泄機能の評価に使用することが可能だと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明のヒト肝癌細胞シートは、胆汁排泄機能の評価に用いることができ、例えば、薬物の副作用の一つである薬物性肝障害、特にはその初期症状である胆汁うっ滞型肝毒性のインビトロ評価に用いることができる。
【図1】
【図2】
