▶ チルドレンズ ホスピタル メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023088954
(43)【公開日】2023-06-27
(54)【発明の名称】複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20230620BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230620BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230620BHJP
C12N 1/04 20060101ALN20230620BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 B
C12N5/071
C12Q1/02
C12N1/04
【審査請求】有
【請求項の数】23
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023041664
(22)【出願日】2023-03-16
(62)【分割の表示】P 2019554752の分割
【原出願日】2018-04-13
(31)【優先権主張番号】62/485,562
(32)【優先日】2017-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/517,414
(32)【優先日】2017-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】500469235
【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】武部 貴則
(72)【発明者】
【氏名】木村 昌樹
(72)【発明者】
【氏名】ザン、ラン－ラン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法を提供する。
【解決手段】プール前駆細胞集団を同期する方法であって、ａ）プール前駆細胞集団を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって同期条件に曝露するステップと、ｂ）前記同期したプール前駆細胞集団を、同期分化細胞集団に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップと、ｃ）前記同期分化細胞集団を凍結同期分化細胞集団に凍結するステップと、およびｄ）前記凍結同期分化細胞集団を融解同期分化細胞集団に融解するステップを含み、前記プール前駆細胞集団は、２以上のドナーに由来する多能性幹細胞を含み、前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤を含む化合物カクテル、および低酸素培養条件を含む、方法とする。
【選択図】図１
【解決手段】プール前駆細胞集団を同期する方法であって、ａ）プール前駆細胞集団を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって同期条件に曝露するステップと、ｂ）前記同期したプール前駆細胞集団を、同期分化細胞集団に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップと、ｃ）前記同期分化細胞集団を凍結同期分化細胞集団に凍結するステップと、およびｄ）前記凍結同期分化細胞集団を融解同期分化細胞集団に融解するステップを含み、前記プール前駆細胞集団は、２以上のドナーに由来する多能性幹細胞を含み、前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤を含む化合物カクテル、および低酸素培養条件を含む、方法とする。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分化細胞集団を含む組成物であって、前記分化細胞集団が、２体以上の個体由来の細胞を含む、組成物。
【請求項2】
前記分化細胞集団が、胚体内胚葉、中胚葉、外胚葉、後方前腸、内皮、肝細胞、またはオルガノイドから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記２体以上の個体が、対象とする疾患を有する個体集団を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記分化細胞集団が、肝臓オルガノイド、胃オルガノイド、腸オルガノイド、脳オルガノイド、肺オルガノイド、骨オルガノイド、軟骨オルガノイド、膀胱オルガノイド、血管オルガノイド、内分泌オルガノイド、感覚オルガノイドから選択されるオルガノイドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
分化細胞集団を含む組成物を作製する方法であって、前記分化細胞集団が、２体以上の個体、例えば、約１０体の個体～約１，０００体のドナーに由来する細胞集団を含み、プール前駆細胞集団、好ましくは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性癌腫細胞（ＥＣ）、胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）、分化後方前腸細胞、またはそれらの組み合わせから選択される細胞型を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって、同期条件に曝露するステップを含み、
前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、好ましくはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤、より好ましくはＰＤ０３２５９０１、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含む化合物カクテルを含む、方法。
前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、好ましくはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤、より好ましくはＰＤ０３２５９０１、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含む化合物カクテルを含む、方法。
【請求項6】
前記カクテルが、
エストロゲン関連受容体ガンマ（ＥＲＲγ）アゴニスト、好ましくはＧＳＫ５１８２、ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤、好ましくはＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤、好ましくはＹ－２７６３２、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ（ＴＧＦＢ）受容体経路阻害剤、好ましくはＡ－８３－０１をさらに含む、請求項５に記載の方法。
エストロゲン関連受容体ガンマ（ＥＲＲγ）アゴニスト、好ましくはＧＳＫ５１８２、ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤、好ましくはＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤、好ましくはＹ－２７６３２、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ（ＴＧＦＢ）受容体経路阻害剤、好ましくはＡ－８３－０１をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記同期条件が、低酸素培養条件を含み、好ましくは、前記低酸素培養条件が、約２％Ｏ２～約５％Ｏ２である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記同期したプール前駆細胞集団を、前記前駆細胞を胚体内胚葉に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップをさらに含む、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記胚体内胚葉が、オルガノイド組成物にさらに分化し、前記オルガノイド組成物が２体以上のドナー由来の細胞を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
２体以上のドナー、好ましくは約１０体のドナー～約１，０００体のドナー由来の分化細胞集団を含む組成物を作製する方法であって、
ａ．前駆細胞集団を、同期したプール内胚葉集団を産生するのに十分な期間にわたって、クローン条件に曝露するステップと、
ｂ．前記プール内胚葉細胞集団を化合物カクテルと接触させるステップであって、前記化合物カクテルが、例えば、ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤、好ましくはＡ－８３－０１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ経路刺激剤、好ましくはＦＧＦ２、ＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＥＧＦ、およびＶＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＶＥＧＦを含む、接触させるステップと、を含み、
好ましくは、前記ステップａおよび／または前記ステップｂが、約２％Ｏ２～約５％Ｏ２の低酸素培養条件下で実行される、方法。
ａ．前駆細胞集団を、同期したプール内胚葉集団を産生するのに十分な期間にわたって、クローン条件に曝露するステップと、
ｂ．前記プール内胚葉細胞集団を化合物カクテルと接触させるステップであって、前記化合物カクテルが、例えば、ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤、好ましくはＡ－８３－０１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ経路刺激剤、好ましくはＦＧＦ２、ＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＥＧＦ、およびＶＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＶＥＧＦを含む、接触させるステップと、を含み、
好ましくは、前記ステップａおよび／または前記ステップｂが、約２％Ｏ２～約５％Ｏ２の低酸素培養条件下で実行される、方法。
【請求項11】
前記内胚葉が、後方前腸細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
化合物を対象とする特徴について試験する方法であって、対象とする試験組成物を請求項１～４のいずれかに記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項13】
前記対象とする特徴が、細胞死、細胞成長、細胞生存、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、ミトコンドリア機能不全を示すＲＯＳ産生、線維症、細胞硬化、線維症、病状に対する有効性、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記試験組成物が、薬物様分子、治療剤、栄養補給剤、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、肝臓オルガノイドであり、前記対象とする特徴が、ＮＡＦＬＤ／胆汁うっ滞／黄疸に対する有効性であり、病状が、前記肝臓オルガノイドで誘発される、請求項１２～１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
集団におけるドナー個体を特定する方法であって、代表的なプール細胞組成物を作製することと、前記ドナー個体由来の細胞を必要とするレシピエントと免疫学的に適合する細胞を特定することと、を含む、方法。
【請求項17】
表現型の遺伝的基盤を特定する方法であって、
ａ．２体以上のドナーに由来するプール細胞集団に由来する細胞を含むオルガノイドまたは分化細胞プールを接触させるステップと、
ｂ．前記オルガノイドまたは分化細胞プールを、対象とする物質、好ましくは薬物または薬物様物質と接触させるステップと、
ｃ．前記オルガノイドまたは分化細胞プールにおける対象とする表現型をアッセイするステップと、
ｄ．前記表現型を前記プール細胞集団由来の遺伝子型と相関させるステップと、を含む、方法。
ａ．２体以上のドナーに由来するプール細胞集団に由来する細胞を含むオルガノイドまたは分化細胞プールを接触させるステップと、
ｂ．前記オルガノイドまたは分化細胞プールを、対象とする物質、好ましくは薬物または薬物様物質と接触させるステップと、
ｃ．前記オルガノイドまたは分化細胞プールにおける対象とする表現型をアッセイするステップと、
ｄ．前記表現型を前記プール細胞集団由来の遺伝子型と相関させるステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月１４日出願の米国仮出願第６２／４８５，５６２号、および２０１７年６月９日出願の米国仮出願第６２／５１７，４１４号に対する優先権およびそれらの利益を主張する。各々の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が組み込まれる。
本出願は、２０１７年４月１４日出願の米国仮出願第６２／４８５，５６２号、および２０１７年６月９日出願の米国仮出願第６２／５１７，４１４号に対する優先権およびそれらの利益を主張する。各々の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
大集団の研究に効率的な方法は、当該技術分野における満たされていない要求である。例えば、ある集団における潜在的な新たな薬物または治療の安全性および有効性の研究は、薬物承認のための臨床試験の必要条件である。薬物誘発性肝臓損傷（ＤＩＬＩ）用のリスク化合物の前臨床検出は、依然として薬物開発における重要な課題であり、人間が作り出す予測システムの必要性を浮き彫りにしている。すなわち、臨床試験には費用も時間もかかり、多くの薬物は、多くの場合、臨床試験に多大な投資がなされた後に、毒性および／または有効性の欠如の点で不合格になる。ある集団を代表するインビトロ研究ツールを使用した毒性（具体的には、薬物誘発性肝毒性）または有効性の初期決定により、開発までの時間が短縮され、かつ／または臨床試験参加者が避けられるはずの損傷が回避され、かつ／または薬物の発売に関連する費用が削減され得る。したがって、薬物安全性および有効性研究の集団コホートをスクリーニングするための実行可能なインビトロプラットフォームが非常に望ましいであろう。肝機能障害を有する個体等の脆弱集団における初期検出に有用なスクリーニングがさらに望ましい。
【0003】
加えて、遺伝的原因が不明の多くの病状が存在し、それ故に、ある集団に現れる病状の遺伝的基盤を特定するための改善された方法が必要とされている。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）および他の前駆細胞は、薬物開発のために様々な疾患のヒト特異的モデルを確立する有望な機会を提供する。集団規模のｉＰＳＣ再プログラミングイニシアチブにより、疾患表現型、薬物安全性、および有効性についての任意の考えられる集団コホートの研究が可能になり得る。しかしながら、各個体の幹細胞の一対一比較は、時間および費用の両方を考慮すると、非効率的であり、全く非現実的である。したがって、様々なドナー由来の前駆細胞のプール試料中の集団表現型をスクリーニングするための実行可能なプラットフォームが非常に望ましいであろう。前駆細胞由来の分化細胞集団およびオルガノイド組成物を作製する方法が当該技術分野で説明されているが、２体以上のドナーに由来する細胞集団および／またはオルガノイドの定方向分化は、異なるドナー由来の細胞の成長および分化を同期させる必要があるため、達成されていない。本開示は、当該技術分野における前述の要求のうちの１つ以上の対処に努める。
【発明の概要】
【0004】
２つ以上のドナー細胞に由来する組成物、具体的には、オルガノイド組成物が開示され、それ故に、１体以上のドナー、またはいくつかの例ではドナー集団の細胞表現が可能になる。所望のドナー集団を代表し得る２つ以上のドナー細胞に由来する分化細胞集団を含む組成物、例えば、オルガノイド組成物を作製する方法がさらに開示される。開示されるオルガノイド組成物を得るのに有用なドナー細胞には、例えば、胚性幹細胞または他の前駆細胞等の前駆細胞が含まれる。開示される方法は、同期したプール前駆細胞集団を産生し、その後、それを定方向分化によりオルガノイド組成物に分化させることができる同期条件を使用する。これらの組成物を使用する方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を有する本特許または特許出願刊行物のコピーは、要請に応じて、かつ必要手数料の支払い時に、特許局から提供される。
【0006】
当業者であれば、以下に記載される図面が例証のみを目的とすることを理解する。図面は、決して本教示の範囲を限定するようには意図されていない。
【0007】
【図1】ドナー依存的変動を試験するための細胞増殖および代謝の分析を示す。上：ｉＰＳＣの増殖特性の差を示す細胞増殖アッセイ。ｉＰＳＣを５×１０ ４細胞でプレーティングし、細胞数を計数した。下：ｉＰＳＣの代謝の差を示すメタボロミクス分析。ＰＣＡスコアを、３０個の代謝物を割り当てたバケツを使用してプロットした。
【図2】低酸素培養条件による同期成長動態変動を示す。細胞成長動態を調節することによって、低酸素培養が細胞同期を促進した。上：低酸素培養条件下での細胞の形態。左下：各酸素条件下での細胞増殖。ドナー依存的変動の細胞増殖を２％低酸素条件下で中止した。右下：細胞増殖同期分析。各細胞の成長率の差をプロットした。同期指数（ＳＹＮＤＥＸ）は、ドナー差標準偏差の逆数である。
【図3】化合物カクテル処理による同期成長動態変動を示す。低酸素培養と組み合わせることによって、化合物カクテル処理が細胞同期を支援した。上：阻害剤処理時の細胞増殖。下：細胞増殖同期分析。
【図4】複数のドナーに由来するｉＰＳＣのプール培養実験を示す。蛍光標識を有する複数のｉＰＳＣを混合し、低酸素状態で培養した。蛍光顕微鏡観察およびＦＡＣＳ集団分析の結果として、低酸素条件により、同じディッシュ上の各細胞集団の同期および維持が可能になった。
【図5】ｉＰＳＣプール由来の様々な細胞型の並行分化誘導を示す。プールｉＰＳＣの多能性を確認するために、本出願人は、胚体内胚葉、中胚葉、後方前腸、内皮細胞、肝細胞、および肝臓オルガノイドを含む複数の系列の誘導を試みた。遺伝子発現、ＦＡＣＳ分析、および特異的機能分析の結果として、プールｉＰＳＣが多系列分化の可能性を有することを実証した。
【図6】ｉＰＳＣプールが内皮細胞への分化傾向を打開することを示す。ｉＰＳＣプールの効果を確認するために、本出願人は、低内皮誘導効率でのｉＰＳＣ系統を使用した内皮細胞誘導の誘導を試みた。上：各細胞系統およびプール細胞系統における内皮細胞誘導の形態。下：各細胞系統およびプール細胞系統における内皮特異的マーカー発現のＦＡＣＳ分析。内皮分化効率は、プールｉＰＳＣ培養で著しく改善した。
【図7】複数のドナー由来の線維芽細胞から確立されたｉＰＳＣの神経分化誘導効率の確認を示す。複数のドナー由来のｉＰＳＣのニューロン分化の誘導の２３日目に神経突起伸長が観察された。
【図8】複数のドナー由来の線維芽細胞から確立されたｉＰＳＣの神経分化誘導効率の確認を示す。分化誘導の２３日目にニューロン特異的遺伝子の発現量が著しく増加した。
【図9】複数のドナー由来の線維芽細胞から確立されたｉＰＳＣの神経分化誘導効率の確認を示す。分化の２３日目にニューロン特異的マーカーＴＵＪ１、ＰＡＸ６、およびＴＨが発現した。
【図10】複数のドナー由来の線維芽細胞から確立されたｉＰＳＣの神経分化誘導効率の確認を示す。分化の２３日目にニューロン特異的マーカーＴＵＪ１、ＰＡＸ６、およびＴＨが発現した。
【図11】ｉＰＳＣ由来の前腸細胞の凍結方法の確立を示す。ｉＰＳＣ由来の前腸細胞の凍結方法を確立するために、我々は、いくつかの凍結保存条件を試した。凍結および融解の結果として、単一細胞単離細胞の生存率は、クラスター状態の細胞よりも著しく高かった。
【図12】ｉＰＳＣ由来の前腸細胞の凍結方法の確立を示す。ｉＰＳＣ由来の前腸細胞の凍結方法を確立するために、本出願人は、凍結細胞を使用した肝臓オルガノイドの生成を試みた。オルガノイド形成の結果として、単一細胞単離細胞のオルガノイド形成効率は、クラスター状態の細胞よりも著しく高かった。
【図13】凍結前腸プールからのクローン肝臓オルガノイド形成を示す。本出願人は、凍結前腸プールから肝臓オルガノイドを形成する方法を開発した。それぞれ、１０μＬのマトリゲル液滴中に５０００個の細胞～４００００個の細胞をプレーティングすることによって、オルガノイド形成を行った。プール細胞は、蛍光標識前腸細胞（緑色、赤色、青色）および非標識前腸細胞を使用した。
【図14】ｉＰＳＣプールからのクローン肝臓オルガノイド形成を示す。２００００個の細胞および４００００個の細胞の条件下でオルガノイドの形成に成功した。加えて、形成されたオルガノイドが単色性であり、単一ドナーに由来することを確認した。
【図15】プール由来の肝細胞およびオルガノイドにおける鉄蓄積のライブ撮像に基づく検出を示す。プール細胞は、蛍光標識前腸細胞（緑色、青色）および非標識前腸細胞を使用した。鉄蓄積の検出のために、鉄イオンと特異的に反応する赤色蛍光試薬ＦｅＲｈｏＮｏｘ－１を使用した。
【図16】プール由来の肝細胞およびオルガノイドにおける鉄蓄積のライブ撮像に基づく検出を示す。２種類の蛍光標識細胞およびヘモクロマトーシス由来の罹患細胞を、鉄蓄積についての陽性対照として使用して、プール肝細胞を調製した。鉄蓄積の定量的結果は、鉄蓄積がヘモクロマトーシス由来の細胞において著しく高かったことを示す。
【図17】プール由来の肝細胞およびオルガノイドにおける鉄蓄積のライブ撮像に基づく検出を示す。二次元肝細胞実験と同様に、２種類の蛍光標識細胞およびヘモクロマトーシス由来の細胞を使用して、プール肝臓オルガノイドを調製した。鉄蓄積の定量的結果は、ヘモクロマトーシス由来の細胞において著しく高かった。
【図18】環境ＤＮＡおよびドナー特異的ＳＮＰ ＰＣＲを使用したドナー特定の概念的画像によるプール幹細胞培養における非侵襲的ドナー解読方法の開発を示す。
【図19】環境ＤＮＡおよびドナー特異的ＳＮＰ ＰＣＲを使用したドナー特定の概念的画像によるプール幹細胞培養における非侵襲的ドナー解読方法の開発を示す。
【図20】ｉＰＳＣプールにおける培養培地からのドナー比推定を示す。本出願人は、培養上清中に含まれる環境ＤＮＡ（「ｅＤＮＡ」）を使用したｉＰＳＣプールのドナー比の推定を試みた。結果として、培養培地中のｅＤＮＡのＰＣＲにより、細胞比の特定に成功した。培養培地中のｅＤＮＡ比は、付着細胞とも相関した。
【図21】ｉＰＳＣプールにおける培養培地からのドナー比推定を示す。本出願人は、ｅＤＮＡによるプール肝細胞および肝臓オルガノイドのドナー比の推定も試みた。結果として、培地中のｅＤＮＡのＰＣＲにより、細胞比の特定に成功した。
【図22】培養培地中のｇＤＮＡによって監視されたドナー比変化。ｅＤＮＡドナー特定を確認するために、本出願人は、薬物選択によって細胞比変化を監視した。２種類の蛍光標識細胞およびピューロマイシン耐性細胞を陽性対照として使用した。薬物選択の結果として、非耐性ｉＰＳＣは、処理の２日目に消失した。ｅＤＮＡドナー特定ＰＣＲの結果は、非耐性細胞の比率が２日目から低下し、耐性細胞のみが４日目に検出されたことを示した。
【図23】オレイン酸およびトログリタゾンで処理した誘導肝細胞を使用したドロップアウトアッセイ。ｉＰＳＣプールから調製された肝細胞を使用して、脂肪蓄積および薬物処理についての薬物スクリーニングアッセイを行った。異なるドナーの１１個のｉＰＳＣをｉＰＳＣ由来の肝細胞プールに使用した。ｅＤＮＡに基づくドロップアウトアッセイにより、脂肪蓄積の危険性の高いドナーの細胞が健常ドナー由来の細胞よりも薬物誘発性肝毒性に著しく高い感受性を示したことが確認された。
【発明を実施するための形態】
【0008】
定義
別途述べられない限り、用語は、慣例的用法に従って当業者に理解されるものとする。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書を優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。
別途述べられない限り、用語は、慣例的用法に従って当業者に理解されるものとする。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書を優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。
【0009】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のかかる方法を含み、「用量」への言及は、当業者に既知の１つ以上の用量およびその等価物への言及を含むといった具合である。
【0010】
「約」または「およそ」という用語は、測定システムの限界等の、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野での実施毎に、１または２以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲であることを意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１０倍以内、例えば、５倍以内、または２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別途明記されない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。
【0011】
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、同義に使用され、治療、観察、および／または実験の対象である動物を指す。概して、この用語は、ヒト患者を指すが、方法および組成物は、他の哺乳動物等の非ヒト対象に同等に適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、これらの用語は、ヒトを指す。さらなる実施形態では、これらの用語は、小児を指す。
【0012】
本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができるいずれの細胞も包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内細胞塊細胞の子孫であり得るか、またはある特定の遺伝子の発現の強制による成体の体細胞等の非多能性細胞の誘導によって得られ得る。多能性幹細胞は、任意の好適な源に由来し得る。多能性幹細胞源の例としては、ヒト、齧歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳類源が挙げられる。
【0013】
本明細書で使用されるとき、一般にｉＰＳ細胞とも略される「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、ある特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、成体の体細胞等の正常な非多能性細胞から人工的に得られた多能性幹細胞型を指す。ｈｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣを指す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ある特定の幹細胞関連遺伝子の成体の線維芽細胞等の非多能性細胞へのトランスフェクションによって得られ得る。トランスフェクションは、レトロウイルス等のウイルスベクターによって達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含み得るが、他の遺伝子も誘導の効率を向上させる。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に同様のものとなり始め、典型的には、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択によって単離される。本明細書で使用されるとき、ｉＰＳＣは、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト誘導多能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、レトロウイルス系が、４つの重要な遺伝子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを使用してヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換するために使用される。代替実施形態では、レンチウイルス系が、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換するために使用される。発現がｉＰＳＣにおいて誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ－３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
本明細書で使用されるとき、一般にＥＳ細胞とも略される「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、多能性であり、かつ初期の胚である胚盤胞の内細胞塊に由来する細胞を指す。本発明の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞も包含するために広範に使用されることもある。
【0015】
本明細書で使用されるとき、「前駆細胞」という用語は、１つ以上の前駆細胞が自己再生するか、または１つ以上の特殊化細胞型に分化する能力を獲得する本明細書に記載の方法で使用され得るいずれの細胞も包含する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、全能性（または全能）幹細胞、多能性幹細胞（誘導または非誘導）、複能性幹細胞、少能性幹細胞、および単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、胚、幼児、小児、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理によって付与されるように処理に供された体細胞であり得る。前駆細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性癌腫細胞（ＥＣ）、および胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）が含まれる。
【0016】
本出願人は、複数のｉＰＳＣ間の成長動態変動の同期、ならびに幹細胞プールの特定の細胞型への増殖および分化のためのシステムを開発しており、この特定の細胞型は、所望のタイプのオルガノイドにさらに発達し得るが、２体以上のドナー由来の細胞を含み得る。発生生物学において、細胞分化は、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用されるとき、外部因子が分化を誘導または制御するために適用される状況下での「定方向分化」、またはより一般的に「分化」という用語は、あまり特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを説明し得る。特殊化された標的細胞型の特殊性は、始原細胞の宿命を定義または変更するために使用され得る任意の適用可能な方法によって決定され得る。例示的な方法には、遺伝子操作、化学的処理、タンパク質処理、および核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
一態様では、２つ以上の前駆細胞に由来する分化細胞集団を含む組成物が開示され、前記分化細胞集団は、発達中に同期し、すなわち、これらの細胞は、例えば、細胞周期が遅い幹細胞を有糸分裂的に促進し、かつ／または細胞周期が速い幹細胞を阻害することによって、実質的に同じ時点で所望の細胞段階に分化する。同期した分化細胞集団は、２体以上の個体由来の細胞を含み得る。一態様では、同期した分化細胞集団は、胚体内胚葉、中胚葉、外胚葉、後方前腸、内皮、肝細胞、またはオルガノイドから選択され得る。２体以上の個体は、ある特定の態様では、対象とする疾患を有する個体集団または有しない個体集団を含み得る。
【0018】
いくつかの実施形態では、多能性であるか、または誘導されて多能性になり得る幹細胞。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞に由来し、これは、次いで、初期哺乳類胚の全能性細胞に由来し、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期の胚である胚盤胞の内細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚芽細胞から胚性幹細胞を得るための方法は、当該技術分野で周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）が本明細書に記載の例示的な実施形態で使用されるが、当業者であれば、本明細書に記載の方法およびシステムがいずれの幹細胞にも適用可能であることを理解するであろう。
【0019】
本発明に従って実施形態で使用され得るさらなる幹細胞には、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）、ＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ａｔ ｔｈｅ Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）によってホストされたデータベース、ならびにＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによってホストされた幹細胞データベースによって提供されるか、またはそれに記載のものが含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って実施形態で使用され得る例示的な胚性幹細胞には、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が含まれるが、これらに限定されない。胚性幹細胞のさらなる詳細は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９１）：１１４５－１１４７、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３３：１５２６－１５３０、Ｍａｒｔｉｎ １９８０，"Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９（４４５８）：７６８－７７６、Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ２９２（５８１９）：１５４－１５６、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ，"Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６３６－１６４１で見つけることができ、これらは各々、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0020】
一態様では、分化細胞集団は、オルガノイドを含み得、このオルガノイドは、２体以上のドナー、または２体以上～約１０００体のドナー、または約１００体のドナー～約５００体のドナー由来の前駆細胞に由来する。オルガノイドは、当業者に既知の任意のオルガノイドであり得、例えば、肝臓オルガノイド、胃オルガノイド、腸オルガノイド、脳オルガノイド、肺オルガノイド、骨オルガノイド、軟骨オルガノイド、膀胱オルガノイド、血管オルガノイド、内分泌オルガノイド（例えば、甲状腺、下垂体、副腎等）、感覚オルガノイド（耳、眼、味、舌等）を含み得る。
【0021】
オルガノイド組織を開発する方法が当該技術分野で開示されている。開示される方法は、２体以上の個体由来のｉＰＳＣ等の前駆細胞、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に由来するオルガノイドの開発を可能にする。結果として得られる「プールオルガノイド」は、２体以上のドナー由来の細胞を組み合わせ、結果として得られるオルガノイドに特有の特性を提供し、その新規の用法を可能にする。様々なオルガノイドを作製する方法が当該技術分野で既知であり、例えば、以下の参考文献：Ｄｅｋｋｅｒｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｗｉｅｇｅｒｉｎｃｋ，Ｃ．Ｌ．，ｄｅ Ｊｏｎｇｅ，Ｈ．Ｒ．，Ｂｒｏｎｓｖｅｌｄ，Ｉ．，Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ｈ．Ｍ．，ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ－ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ａ．Ｍ．，ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｎ．Ｗ．，Ｂｉｊｖｅｌｄｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｏｌｔｅ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＦＴＲ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９，９３９－９４５、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｊ．Ａ．（２０１４）．Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｄｉｓｈ：ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１２４７１２５、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｔ．（２０１８）．Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｗａｒｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ５，５１－６０、Ｓａｃｈｓ，Ｎ．，ｄｅ Ｌｉｇｔ，Ｊ．，Ｋｏｐｐｅｒ，Ｏ．，Ｇｏｇｏｌａ，Ｅ．，Ｂｏｕｎｏｖａ，Ｇ．，Ｗｅｅｂｅｒ，Ｆ．，Ｂａｌｇｏｂｉｎｄ，Ａ．Ｖ．，Ｗｉｎｄ，Ｋ．，Ｇｒａｃａｎｉｎ，Ａ．，Ｂｅｇｔｈｅｌ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ａ Ｌｉｖｉｎｇ Ｂｉｏｂａｎｋ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｃａｐｔｕｒｅｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １７２，３７３－３８６ｅ３１０、Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２０１３）．Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｓｅｌｆ－ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４９３，３１８－３２６、Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，Ｅｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｇａｅｒｉ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｕｅｎｏ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４９９，４８１－４８４、Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｎｅ，Ｋ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｅ．，Ａｙａｎｏ，Ｓ．，Ｋｏｉｄｏ，Ｍ．，Ｆｕｎａｙａｍａ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｎ．，Ｈｉｓａｉ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｍａｓｓｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｂｕｄｓ Ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２１，２６６１－２６７０、Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｔｒｉｓｎｏ，Ｓ．，Ｐｏｌｉｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｆ．，Ｓｃｈｉｅｓｓｅｒ，Ｊ．，Ａｕｂｅｒｔ，Ｐ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３，４９－５９に記載されている。
【0022】
一態様では、複数のドナーに由来する分化細胞集団を含む組成物を作製する方法が開示される。分化細胞集団は、２体以上のドナー、例えば、約１０体のドナー～約１，０００体以上のドナー、または約１００～約５００体のドナーに由来する細胞集団を含み得る。この方法は、プールｉＰＳＣ集団を、同期したプールｉＰＳＣ集団を産生するのに十分な期間にわたって、同期条件に曝露するステップと、同期したプールｉＰＳＣ集団を、同期したプールｉＰＳＣ集団を分化細胞集団に分化させるのに十分な「化合物カクテル」と接触させるステップとを含み得る。一態様では、化合物カクテルは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤（ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤）、例えば、ＰＤ０３２５９０１、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。他の態様では、化合物カクテルは、エストロゲン関連受容体ガンマアゴニスト、例えば、ＧＳＫ５１８２、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路阻害剤）、例えば、Ｙ－２７６３２、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ受容体阻害剤、例えば、Ａ－８３－０１をさらに含み得る。例示的な濃度には、ＧＳＫ５１８２の場合は５ｎＭ～５０μＭ、ＰＤ０３２５９０１の場合は１ｎＭ～１０μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１の場合は３ｎＭ～３０μＭ、Ａ８３－０１の場合は０．５ｎＭ～５μＭ、Ｙ２７６３２の場合は１０ｎＭ～１００μＭが含まれる。
【0023】
他の態様では、以下の薬剤が、前述の薬剤の代わりに、またはそれらに加えて使用され得る。
【0024】
ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤：Ｙ－２７６３２二塩酸塩（Ｒ&Ｄ番号１２５４）
ＧＳＫ３経路阻害剤：ＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ&Ｄ番号４４２３）、ベリリウム、銅、リチウム、水銀、タングステン、６－ＢＩＯ、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルジシン（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、インジルビン、メリジアニン、ＣＴ９８０１４（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）、ＣＴ９８０２３（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＴ９９０２１、ＴＷＳ１１９、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－４１５２８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＡＺＤ－１０８０、アルステルパウロン（Ｓｉｇｍａ）、カズパウロン（ＭｅｄＫｏｏ）、ケンパウロン（Ｓｉｇｍａ）、マンザミンＡ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パリヌリン、トリカンチン、ＴＤＺＤ－８、ＮＰ００１１１、ＮＰ０３１１１５、タイドグルーシブ、ＨＭＫ－３２、Ｌ８０３－ｍｔｓ（Ｓｉｇｍａ）、ケタミン（Ｓｉｇｍａ）、またはそれらの組み合わせ。かかる薬剤は、約１０ｎＭ～約１００μＭ、または約１００ｎＭ～約５０μＭの量で存在し得る。
ＧＳＫ３経路阻害剤：ＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ&Ｄ番号４４２３）、ベリリウム、銅、リチウム、水銀、タングステン、６－ＢＩＯ、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルジシン（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、インジルビン、メリジアニン、ＣＴ９８０１４（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）、ＣＴ９８０２３（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＴ９９０２１、ＴＷＳ１１９、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－４１５２８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＡＺＤ－１０８０、アルステルパウロン（Ｓｉｇｍａ）、カズパウロン（ＭｅｄＫｏｏ）、ケンパウロン（Ｓｉｇｍａ）、マンザミンＡ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パリヌリン、トリカンチン、ＴＤＺＤ－８、ＮＰ００１１１、ＮＰ０３１１１５、タイドグルーシブ、ＨＭＫ－３２、Ｌ８０３－ｍｔｓ（Ｓｉｇｍａ）、ケタミン（Ｓｉｇｍａ）、またはそれらの組み合わせ。かかる薬剤は、約１０ｎＭ～約１００μＭ、または約１００ｎＭ～約５０μＭの量で存在し得る。
【0025】
ＴＧＦＢ経路阻害剤：Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ８３－０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ番号４７１３２）、ＳＤ２０８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ピルフェニドン、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＤＮ１９３１８９塩酸塩、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、Ａ７７－０１、ＧＷ７８８３８８、ドルソモルフィン二塩酸塩、Ｋ０２２８８、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ２１２８５４三塩酸塩、ＳＢ５２５３３４、ＩＴＤ１、ＳＩＳ３、またはそれらの組み合わせ。かかる薬剤は、約０．５ｎＭ～約５μＭ、または約１ｎＭ～約２．５μＭの量で存在し得る。
【0026】
ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、ＰＤ０３２５９０１（Ｒ&Ｄ番号４１９２／１０）（Ｒ&Ｄ番号４１９２／１０）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＢＩＸ０２１８８、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＰＤ３１８０８８、ホノキオール、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ８６－９７６６）、ミリセチン、ＢＩ－８４７３２５、コビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）、ＡＰＳ－２－７９ＨＣｌ、ＧＤＣ－０６２３、またはそれらの組み合わせ。かかる薬剤は、約１ｎＭ～約１０μＭ、または約１０ｎＭ～約５μＭの量で存在し得る。
【0027】
エストロゲン関連受容体γ（ＥＲＲγ）アゴニスト：ＧＳＫ５１８２（Ａｏｂｉｏｕｓ番号ＡＯＢ１６２９）、ＡＣ１８６、ダイゼイン、ＤＰＮ、（Ｒ）－ＤＰＮ、ＤＹ１３１、（Ｓ）－エクオール、ＥＲＢ０４１、α－エストラジオール、β－エストラジオール、エストロピペート、ＦＥＲｂ０３３、ＧＳＫ４７１６、２７－ヒドロキシコレステロール、リキリチゲニン、ＰＰＴ、ＷＡＹ２０００７０、ＸＣＴ７９０、またはそれらの組み合わせ。かかる薬剤は、約５ｎＭ～約５０μＭ、または約１０ｎＭ～約２５μＭの量で存在し得る。
【0028】
供給源情報：以下のものは、例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙから入手することができる：インジルビン、６－ＢＩＯ、ＣＴ９９０２１、ＴＷＳ１１９、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－４１５２８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＡＺＤ－１０８０、ＴＤＺＤ－８、タイドグルーシブ、ＳＤ２０８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ピルフェニドン、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＤＮ１９３１８９塩酸塩、ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、Ａ７７－０１、ＧＷ７８８３８８、ドルソモルフィン二塩酸塩、Ｋ０２２８８、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ２１２８５４三塩酸塩、ＳＢ５２５３３４、ＩＴＤ１、ＳＩＳ３、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＢＩＸ０２１８８、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＰＤ３１８０８８、Ｈｏｎｏｋｉｏｌ、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ８６－９７６６）、ミリセチン、ＢＩ－８４７３２５、コビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）、ＡＰＳ－２－７９ＨＣｌ ＧＤＣ－０６２３、ＡＣ１８６、ダイゼイン、ＤＰＮ、（Ｒ）－ＤＰＮ、ＤＹ１３１、（Ｓ）－エクオール、ＥＲＢ０４１、α－エストラジオール、β－エストラジオール、エストロピペート、ＦＥＲｂ０３３、ＧＳＫ４７１６、２７－ヒドロキシコレステロール、リキリチゲニン、ＰＰＴ、ＷＡＹ２０００７０、ＸＣＴ７９０。
【0029】
一態様では、細胞は、少なくとも４日間にわたって培養されて、混合されたドナー細胞集団の同期を可能にする。他の態様では、同期に要する時間は、約１～約６日間、または約２～約５日間、または約４日間であり得る。増殖動態について、非標識幹細胞プールのｅＤＮＡに基づく監視または異なって標識された幹細胞プールの画像に基づく分析が使用され得る。一態様では、方法は、多能性の以下のマーカー：ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、およびＴＲＡ１６０が発現するのに十分な期間にわたって実行され得る。一態様では、同期条件は、低酸素培養条件を含み得、例えば、前記低酸素培養条件は、約２％Ｏ２～約１０％Ｏ２、または約２％～約５％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または最大６％、または最大７％、または最大約８％Ｏ２である。
【0030】
一態様では、２体以上のドナー由来の分化細胞集団を含む組成物を作製する方法が開示される。分化細胞集団は、２体以上の個体、例えば、約１０体の個体～約１，０００体のドナー、または約１００～約５００体のドナーに由来し得る。この方法は、プール内胚葉集団を、同期したプール内胚葉集団を産生するのに十分な期間にわたって、クローン条件に曝露するステップと、前記同期したプール内胚葉集団を、前記同期したプール内胚葉集団を分化細胞集団に分化させるのに十分な化合物カクテルと接触させるステップとを含み得、前記化合物カクテルは、例えば、ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤、例えばＡ－８３－０１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ経路刺激剤、例えばＦＧＦ２、ＥＧＦ経路刺激剤、例えばＥＧＦ、およびＶＥＧＦ経路刺激剤、例えばＶＥＧＦを含む。一態様では、内胚葉は、後方前腸細胞を含み得る。
【0031】
内胚葉集団は、１つ以上の内胚葉細胞を包含するよう意図されている。同様に、後方前腸細胞およびその集団は、１つ以上の後方前腸細胞を包含するよう意図されている。内胚葉細胞および後方前腸細胞はいずれも、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ．"Ｓｅｌｆ－Ｒｅｎｅｗｉｎｇ Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｌｉｎｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．"Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｉｓｓｕｅ ４，３７１－３８４、Ｈａｎｎａｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｆｏｒｅｇｕｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ"Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｉｓｓｕｅ ４，２９３－３０６、およびＺｈａｎｇ，Ｒａｎ－Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．"Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｇｕｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ａｒｅ Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ａｎｄ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｕｔ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ"Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｉｓｓｕｅ ３，７８０－７９３に記載の方法を使用して得られ得る。
【0032】
クローン条件とは、個々のクローンが選択され得る方法で細胞の培養物が産生され得る条件を意味する。例えば、多系列分化能および自己再生能力を有する幹細胞は、Ｓｕｚｕｋｉ Ａ，Ｚｈｅｎｇ Ｙ，Ｋａｎｅｋｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｌｉｖｅｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００２；１５６（１）：１７３－１８４．ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２００１０８０６６に記載されるように、クローン培養（クローン条件）でクローン的に増殖して、原始幹細胞を維持しながら、子孫として肝細胞および胆管細胞を継続的に産生することができる。他の態様では、クローン培養（クローン条件）は、当該技術分野で典型的な密度と比較して培養物中に低下した密度で播種された細胞の特徴を含み得る。例えば、１０μＬのマトリゲル中に包埋された１０００～４００００個の細胞は、１００～４０００個を超えるクローン由来のオルガノイドを生成するであろう。この密度を使用して、単一ドナー由来の細胞が単離され、単一ドナー由来のオルガノイドを可能にし得る。クローン細胞培養条件は、当業者に容易に理解され、プロトコルの変化も容易に理解されるであろう。
【0033】
一態様では、様々なドナー由来のｉＰＳＣのプール試料中の集団表現型のスクリーニングするための実行可能なプラットフォームが開示される。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）および他の前駆細胞は、薬物開発のために様々な疾患のヒト特異的モデルを確立する有望な機会を提供する。集団規模のｉＰＳＣ再プログラミングイニシアチブにより、疾患表現型、薬物安全性、および有効性についての任意の考えられる集団コホートの研究が可能になり得る。しかしながら、各個体の幹細胞の一対一比較は、時間および費用の両方を考慮すると、非効率的であり、全く非現実的である。開示される組成物および方法は、単一細胞レベルでの希少個体表現型の前向き特定をさらに可能にする。開示される組成物および方法を使用して、表現型は、単一ディッシュ内で、集団規模でスクリーニングされ、プール試料から個体表現型を捕捉する新たな戦略（「前向きセロミクスアプローチ」と称されるアプローチ）を可能にし得る。かかる集団規模のｈｉＰＳＣは、薬物安全性および有効性研究のインビトロ集団コホートを提供し、それ故に、当該技術分野における前述の課題に対処することができる。
【0034】
薬物誘発性肝臓損傷（ＤＩＬＩ）用のリスク化合物の前臨床検出は、依然として薬物開発における重要な課題であり、人間が作り出す予測システムの必要性を浮き彫りにしている。本出願人は、オルガノイド解像度で人間学的ＤＩＬＩ病理を分析するためにプールｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドを開発した。ヒトｉＰＳＣ由来の分化肝臓オルガノイドは、分極肝細胞および分化細胞で覆われた内腔を含み、インビボ胆汁小管様構造を再現する。本出願人は、「ＬｏＴ」（肝臓オルガノイドに基づく毒性スクリーニング）と称される多重化ライブ撮像を用いたＤＩＬＩのモデル化のためにこの構造的特徴を活用した。ＬｏＴを１０個の市販されている薬物で機能的に検証し、胆汁うっ滞およびミトコンドリア毒性に基づくそれぞれの作用機構を区別した（データ示さず）。オルガノイドを脆弱（脂肪症）条件下で導入して、臨床で示された毒性誇張を実証し、続いて、大規模なオルガノイド死から化学的に救助した。このようにして、本出願人は、費用効率の高いプラットフォームで薬物安全性の第１のヒトオルガノイドに基づくモデルを示し、抗ＤＩＬＩ療法スクリーニング適用として化合物最適化、機構研究、および精密医療を促進した。さらに、現在の第１相試験または他の試験段階は、脆弱条件のリスク評価プロセスを完全に欠いており、開示されるＬｏＴ方法は、毒性誇張を実証し、かつ現在の試験における予測不可能な肝毒性による休薬に起因する多額の財務損失に対処するために、脆弱（例えば、脂肪症）条件の使用を可能にする。
【0035】
一態様では、開示される方法および組成物は、集団規模のｈｉＰＳＣ再プログラミングを可能にし、これは、次いで、薬物安全性および有効性試験のインビトロ集団コホートを可能にする。例えば、「健常」または「疾患」ｉＰＳＣバンクは、本明細書に開示される方法を使用して開発され得る。例えば、単一の「ｉＰＳＣバンク」は、複数のドナーに由来する個々のｉＰＳＣを含み得る。いくつかの例では、ｉＰＳＣドナー系統の数は、約１００個のｉＰＳＣドナー系統～最大１０００個を超えるｉＰＳＣドナー系統、または２個以上～約５００個のドナー系統であり得る。本開示は、ｉＰＳＣドナー細胞の同期に成功し、ｉＰＳＣドナー細胞がプールされて２体以上の個体に由来するｉＰＳＣ細胞の「プールｉＰＳＣ」組成物または「バンク」を作製する方法を提供する。その後、プールｉＰＳＣは、オルガノイドの産生のための分化方法に供され得る。オルガノイドは、例えば、ｉＰＳＣ細胞を同期させる能力により所望の集団を代表する細胞を含むｉＰＳＣバンク由来の肝臓オルガノイド（「ミニ肝臓」）であり得る。
【0036】
一態様では、ｉＰＳＣバンクに由来する肝臓オルガノイドは、薬物スクリーニングおよび移植適用、第Ｉ相試験、例えば、正常細胞および易感染性細胞の両方（例えば、脂肪肝細胞／オルガノイド）の肝毒性スクリーニング、ＮＡＦＬＤ／胆汁うっ滞創薬スクリーニング、栄養スクリーニング（例えば、ＴＰＮ、栄養補助剤等）、または第ＩＩ相試験、栄養およびＤＩＬＩ精密スクリーニング、ミニ臓器移植、弾性血漿産物生成、またはＦＸＲアゴニストとして（胆汁酸を有する口腔内オルガノイドの送達）を含む様々な目的のために使用され得る。具体的には、胆汁酸またはその類似体は、ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）アゴニストとして知られており、ＮＡＳＨおよび他の肝疾患の治療に現在使用されている。開示されるオルガノイドは、胆汁酸の産生に使用され得、これは、ＮＡＳＨおよび他のかかる肝疾患の治療に使用され得る。他の態様では、同様の化合物が経口投与されるときに、オルガノイド自体がＦＸＲアゴニストとしてインビボで使用され得る。
【0037】
一態様では、化合物を対象とする特徴について試験する方法が開示される。この方法は、対象とする試験組成物を、上述の組成物であるプールオルガノイド組成物と接触させるステップを含み得る。対象とする特徴は、細胞死、細胞成長、細胞生存、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、ミトコンドリア機能不全を示すＲＯＳ産生、線維症、細胞硬化、線維症、病状に対する有効性、およびそれらの組み合わせから選択され得る。試験化合物は、薬物様分子、治療剤、栄養補給剤、またはそれらの組み合わせから選択され得る。一態様では、組成物は、ＮＡＦＬＤ、胆汁うっ滞、および／または黄疸と同様または同一の誘発性病状または固有の病状を有する肝臓オルガノイドであり、前記対象とする特徴は、１つまたは複数のかかる病状に対する有効性である。
【0038】
一態様では、集団におけるドナー個体を特定する方法が開示される。この方法は、代表的なプール細胞組成物を作製するステップと、前記ドナー個体由来の細胞を必要とするレシピエントと免疫学的に適合する細胞を特定するステップとを含み得る。
【0039】
一態様では、表現型の遺伝的基盤を特定する方法が開示される。この方法は、２体以上のドナーに由来するプール細胞集団に由来する細胞を含むオルガノイドまたは分化細胞プールを接触させるステップと、前記オルガノイドまたは分化細胞プールを、対象とする物質、例えば、薬物または薬物様物質（または細胞応答の決定が所望される任意の物質）と接触させるステップと、前記オルガノイドまたは分化細胞プールにおける対象とする表現型をアッセイするステップと、前記表現型を前記プール細胞集団由来の遺伝子型と相関させるステップとを含み得る。
【0040】
一態様では、「ドロップアウトアッセイ」が開示される。この態様では、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一形態である環境におけるゲノムＤＮＡ（環境ＤＮＡ、または「ｅＤＮＡ」）は、海および土壌等の生物多様性を決定するための環境に存在する。循環腫瘍由来のｃｆＤＮＡの検出は、癌精密医療の進化しつつある要素である。本出願人は、細胞が細胞培養上清中でｅＤＮＡを測定可能な量で産生することを見出した。注目すべきことに、プール幹細胞培養に適用された場合、それぞれのドナーの定量的検出は、培養物中の細胞比と相関する。したがって、本出願人は、ｅＤＮＡに基づく非侵襲的ドナー特定方法が培養上清中のｅＤＮＡによるプール幹細胞培養に有効な解読戦略であると結論付けた。培養上清中のｅＤＮＡのＰＣＲは、ドナー特異的ＳＮＰプライマーを使用して実行され得る。各ＳＮＰプライマーが標準化され得、ｉＰＳＣプールのドナー比は、培養上清中に含まれるｅＤＮＡを使用して推定され得る（図１９を参照のこと）。結果として、培地中のｅＤＮＡのＰＣＲにより、細胞比の決定に成功し得る（図２０を参照のこと）。加えて、これらの方法論は、ｉＰＳＣプールに由来する肝細胞および肝臓オルガノイド等の分化子孫に適用され得る（図２１を参照のこと）。ｅＤＮＡドナー特定の感度を確認するために、本出願人は、薬物選択による細胞比変化を監視した。３体のドナー（２体の蛍光標識ドナーおよび１体のピューロマイシン耐性ドナー）を混合し、ピューロマイシン含有培地で培養した。ｅＤＮＡに基づくドナー検出の結果として、ピューロマイシン耐性細胞が経時的に優勢になった一方で、２体の他のドナーは、ピューロマイシン毒性により死滅した。これらの結果を並列蛍光撮像によってさらに確認し、特定のドナードロップアウトが、以下で「ドロップアウトアッセイ」と称されるeＤＮＡ方法によって測定され得ることを示唆した（図２２を参照のこと）。最後に、薬物スクリーニングアッセイの原理証明として、１１個のｉＰＳＣプールから調製された脂肪処理肝細胞を使用して、肝毒性薬物処理を行った（図２３を参照のこと）。ｅＤＮＡに基づくドロップアウトアッセイにより、脂肪蓄積の危険性の高いドナー由来の細胞が健常ドナー由来の細胞よりも薬物誘発性肝毒性に著しく高い感受性を示したことが確認された（図2３）。
【0041】
一態様では、「適応的免疫適合」が開示される。この態様では、「パネル」を作成するためのｉＰＳＣの代表的な集団プールが作製され得る。これらのプールのうちの少なくともいくつかは、潜在的な患者（レシピエント）と免疫学的に適合し得る。このアプローチを使用して、幹細胞のレシピエントとの事前適合を免除することができ、それ故に、幹細胞ライブラリの収集に要する多大な労働力を削減し、バンキングに関連する費用も削減することができる。
【0042】
一態様では、表現型の遺伝的基盤を特定する方法が開示される。この方法は、プール患者からオルガノイドを開発するステップと、薬物等の対象とする物質を曝露するステップと、プールにおける個体応答（表現型）を分析するステップと、元のゲノムデータを再分析して、表現型を適合させてゲノム寄与を理解するステップとを含み得る。
【実施例0043】
以下の非限定的な実施例は、本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに例証するために提供される。当業者であれば、以下の実施例に開示される技法が、本発明の実施において良好に機能することが見出されたアプローチを代表するものであり、それ故に、その実施のための様式の例を構成すると見なされ得ることを理解するはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮して、多くの変更が開示される特定の実施形態に加えられ得ることを理解すべきであり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、依然として同様または類似の結果を得るはずである。
【0044】
複数のｉＰＳＣ間の成長動態変動の同期
本出願人は、低酸素条件を使用して成長動態変動を同期させることができることを示した。低酸素培養方法により、成長同期に成功した。本出願人は、酸素および阻害剤処理を含む同期要因の特定に成功した。例えば、エストロゲン関連受容体ガンマアゴニスト（ＧＳＫ５１８２）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２）、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ受容体阻害剤（Ａ－８３－０１）の存在および不在下での、周囲および低酸素条件下での細胞成長を使用して、複数のドナー由来の細胞を同期させることができる。一態様では、２％Ｏ２条件の低酸素培養方法を使用して、各細胞集団における成長同期および維持を成功させることができる。
本出願人は、低酸素条件を使用して成長動態変動を同期させることができることを示した。低酸素培養方法により、成長同期に成功した。本出願人は、酸素および阻害剤処理を含む同期要因の特定に成功した。例えば、エストロゲン関連受容体ガンマアゴニスト（ＧＳＫ５１８２）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２）、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ受容体阻害剤（Ａ－８３－０１）の存在および不在下での、周囲および低酸素条件下での細胞成長を使用して、複数のドナー由来の細胞を同期させることができる。一態様では、２％Ｏ２条件の低酸素培養方法を使用して、各細胞集団における成長同期および維持を成功させることができる。
【0045】
幹細胞プールの特定の細胞型への増殖および分化
本出願人は、ｉＰＳＣプールからの様々な細胞型の共分化誘導をさらに実証した。プール細胞が多系列分化に適格であり、ｉＰＳＣプールが内皮細胞への分化傾向を打開することを示す、ＤＥ、中胚葉、後方前腸、内皮誘導（および管形成）、肝細胞誘導、肝臓オルガノイド誘導。
本出願人は、ｉＰＳＣプールからの様々な細胞型の共分化誘導をさらに実証した。プール細胞が多系列分化に適格であり、ｉＰＳＣプールが内皮細胞への分化傾向を打開することを示す、ＤＥ、中胚葉、後方前腸、内皮誘導（および管形成）、肝細胞誘導、肝臓オルガノイド誘導。
【0046】
後に単一細胞レベルで個体を解読するために使用することができる大集団を有するｉＰＳＣプール。例えば、１０～１５個の細胞系統プールを肝臓オルガノイドに分化させることができ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方を配列決定することができる。単一細胞をＤｒｏｐ－ｓｅｑ（大規模単一細胞配列決定法）で分析して、ドナー差効果および希少集団効果を検出することができる。かかる幹細胞同期アプローチにより、ディッシュ内で集団表現型を評価するための前例のない有力なアプローチが提供され、ディッシュ内での臨床試験の実施、ならびに薬物開発プロセスおよび精密医療の促進を可能にし得る。
【0047】
ディッシュ内での「ヒトオルガノイド試験」（ＨｏＴ）
ｉＰＳＣパネルにプールした集団、例えば、アジア集団、米国集団、およびアフリカ集団を、ｉＰＳＣ－オルガノイドパネルにプールすることができる。多重化ハイコンテント撮像を使用して、様々な細胞パラメータを測定することができる。かかるパラメータには、例えば、細胞死、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、およびＲＯＳ産生が含まれる。かかるパラメータを、対象とする１つ以上の化合物に応じて評価することができる。このシステムを、有効性、安全性、移植療法、および適応的免疫適合を含む薬物開発のために使用することができる。
ｉＰＳＣパネルにプールした集団、例えば、アジア集団、米国集団、およびアフリカ集団を、ｉＰＳＣ－オルガノイドパネルにプールすることができる。多重化ハイコンテント撮像を使用して、様々な細胞パラメータを測定することができる。かかるパラメータには、例えば、細胞死、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、およびＲＯＳ産生が含まれる。かかるパラメータを、対象とする１つ以上の化合物に応じて評価することができる。このシステムを、有効性、安全性、移植療法、および適応的免疫適合を含む薬物開発のために使用することができる。
【0048】
ドナー依存的変動の分析。
各細胞のドナー依存性を試験するための細胞増殖および代謝を分析することができる。ＮＭＲに基づくメタボロミクスデータおよび細胞増殖データによって決定される各ｉＰＳＣの細胞増殖および代謝は、非常に異なる場合がある。
各細胞のドナー依存性を試験するための細胞増殖および代謝を分析することができる。ＮＭＲに基づくメタボロミクスデータおよび細胞増殖データによって決定される各ｉＰＳＣの細胞増殖および代謝は、非常に異なる場合がある。
【0049】
細胞同期条件のスクリーニング。１）第一に、細胞成長動態を調節することによって、成長動態変動物を低酸素培養条件（約２％～約５％Ｏ２）下で同期させることができる。２）化合物カクテルを使用して、ｉＰＳＣ同期を促進することができる。低酸素培養と組み合わせることによって、化合物カクテル処理が細胞同期を支援することができる。ＳＹＮＤＥＸ（同期指数）を使用して、ドナー差標準偏差の逆数を示すことができる。
【0050】
複数ドナーｉＰＳＣのプール。低酸素条件により、同じディッシュ上での各細胞集団の同期および維持が可能になり得る。
【0051】
ｉＰＳＣプールにおける希少表現型の検出。一態様では、希少表現型を、ｉＰＳＣプール組成物において検出することができる。例えば、ヘモクロマトーシスの検出のために、当該技術分野で既知の方法に従って、個体１および個体２および個体３由来のｉＰＳＣをプールし、共分化に供して、肝臓オルガノイドを形成することができる。結果として得られる肝臓オルガノイド中の鉄蓄積をライブ撮像によって検出することができる。その後、ヘモクロマトーシス表現型を、鉄累積状態のプールオルガノイドから区別することができる。ヘモクロマトーシス集団を、プールオルガノイドから区別することができる。したがって、この方法は、プール試料における希少疾患効果の影響の検出に有用であり得る。
【0052】
ＰＳＣの維持
本研究で使用したＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉから好意的に提供されたものであった。本研究で使用したＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉから好意的に提供されたものであった。１２３１Ａ３、３１７Ｄ６、１３８３Ｄ６、およびＦＦ０１は、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｊａｐａｎ）から寄贈されたものであった。ＣＷ０２７、ＣＷ０７７、ＣＷ１５０、およびＷＤ９０、９１、９２をＣｏｒｉｅｌｌ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。ヒトｉＰＳＣ系統を以前に説明されているように維持した（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。未分化ｈｉＰＳＣを、１／３０希釈、３７℃、５％ＣＯ２でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）をコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中の無フィーダー条件下で維持した。マルチガスインキュベーターＭＣＯ－１９ＭＵＶ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，Ｊａｐａｎ）を使用して、培養酸素条件を、２％、５％、および周囲（２０％）で行った。
本研究で使用したＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉから好意的に提供されたものであった。本研究で使用したＴｋＤＡ３ヒトｉＰＳＣクローンは、Ｋ．ＥｔｏおよびＨ．Ｎａｋａｕｃｈｉから好意的に提供されたものであった。１２３１Ａ３、３１７Ｄ６、１３８３Ｄ６、およびＦＦ０１は、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｊａｐａｎ）から寄贈されたものであった。ＣＷ０２７、ＣＷ０７７、ＣＷ１５０、およびＷＤ９０、９１、９２をＣｏｒｉｅｌｌ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。ヒトｉＰＳＣ系統を以前に説明されているように維持した（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。未分化ｈｉＰＳＣを、１／３０希釈、３７℃、５％ＣＯ２でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）をコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中の無フィーダー条件下で維持した。マルチガスインキュベーターＭＣＯ－１９ＭＵＶ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，Ｊａｐａｎ）を使用して、培養酸素条件を、２％、５％、および周囲（２０％）で行った。
【0053】
ＰＳＣの同期のための阻害剤処理
６マルチウェルプレートで培養した後、成長同期のために細胞を阻害剤で処理した。以下の抗体：ＧＳＫ５１８２（エストロゲン関連受容体γアゴニスト）、ＰＤ０３２５９０１（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３阻害剤）、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）、およびＡ－８３－０１（１型トランスフォーミング成長因子－ｂ受容体阻害剤）を使用した。
６マルチウェルプレートで培養した後、成長同期のために細胞を阻害剤で処理した。以下の抗体：ＧＳＫ５１８２（エストロゲン関連受容体γアゴニスト）、ＰＤ０３２５９０１（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３阻害剤）、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）、およびＡ－８３－０１（１型トランスフォーミング成長因子－ｂ受容体阻害剤）を使用した。
【0054】
ＰＳＣの胚体内胚葉への分化
以前に説明されている方法にわずかに変更を加えて（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ｈｉＰＳＣの胚体内胚葉への分化を誘導した。簡潔には、ｈｉＰＳＣのコロニーＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で単離した。１５００００細胞／ｍＬをマトリゲルコーティング培養プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）上にプレーティングした。培地を、１日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および５０ｎｇ／ｍＬ骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび０．２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に、３日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に変えた。４～６日目に、細胞を、５００ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ４、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含有する、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で培養した。細胞分化のための培養物を、５％ＣＯ２／９５％大気の雰囲気下で、３７℃で維持し、培地を毎日交換した。分化胚体内胚葉は、７日目にプレート上で出芽を示した。
以前に説明されている方法にわずかに変更を加えて（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ｈｉＰＳＣの胚体内胚葉への分化を誘導した。簡潔には、ｈｉＰＳＣのコロニーＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で単離した。１５００００細胞／ｍＬをマトリゲルコーティング培養プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）上にプレーティングした。培地を、１日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および５０ｎｇ／ｍＬ骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび０．２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に、３日目に１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に変えた。４～６日目に、細胞を、５００ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ４、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含有する、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で培養した。細胞分化のための培養物を、５％ＣＯ２／９５％大気の雰囲気下で、３７℃で維持し、培地を毎日交換した。分化胚体内胚葉は、７日目にプレート上で出芽を示した。
【0055】
後方前腸（ｐＦＧ）細胞の凍結
培地を細胞培養フラスコから慎重に吸引する（ＰＢＳでのすすぎは不要である）。細胞を覆うのに十分な量（典型的には、６ウェルプレートの場合、１ｍＬ／ウェル）でＡｃｃｕｔａｓｅをフラスコに即座に添加する。フラスコを３７℃のインキュベーター内に５～６分間配置する。フラスコを調べて、細胞が丸みを帯びているかを確認する。フラスコを手のひらで叩いて、いかなる「固着物」も取り除く。細胞を穏やかに分散させる。洗浄培地を添加し、試料を取り出して、細胞を計数する。２００～３００×ｇで３分間遠心分離する。上清を吸引する。ｍＴＥＳＲ１＋Ｒｏｃｋ阻害剤（１０ｕＭ）を添加する。細胞をプレーティングする（維持のために２～５×１０４）。ｐＦＧ細胞を継代する。凍結バイアルを、細胞系統、細胞数、データ、凍結培地、成長培地、およびプレートコーティング（ラミニンまたはマトリゲル）でラベル付けする。上清を吸引する。５００ｕＬのＣｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒ１を０．５～２×１０６細胞に添加する。バイアルをＮａｌｇｅｎｅ凍結容器に２４時間にわたって添加する。－８０℃で保管するか、または長期保管のために液体窒素に移す。
培地を細胞培養フラスコから慎重に吸引する（ＰＢＳでのすすぎは不要である）。細胞を覆うのに十分な量（典型的には、６ウェルプレートの場合、１ｍＬ／ウェル）でＡｃｃｕｔａｓｅをフラスコに即座に添加する。フラスコを３７℃のインキュベーター内に５～６分間配置する。フラスコを調べて、細胞が丸みを帯びているかを確認する。フラスコを手のひらで叩いて、いかなる「固着物」も取り除く。細胞を穏やかに分散させる。洗浄培地を添加し、試料を取り出して、細胞を計数する。２００～３００×ｇで３分間遠心分離する。上清を吸引する。ｍＴＥＳＲ１＋Ｒｏｃｋ阻害剤（１０ｕＭ）を添加する。細胞をプレーティングする（維持のために２～５×１０４）。ｐＦＧ細胞を継代する。凍結バイアルを、細胞系統、細胞数、データ、凍結培地、成長培地、およびプレートコーティング（ラミニンまたはマトリゲル）でラベル付けする。上清を吸引する。５００ｕＬのＣｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒ１を０．５～２×１０６細胞に添加する。バイアルをＮａｌｇｅｎｅ凍結容器に２４時間にわたって添加する。－８０℃で保管するか、または長期保管のために液体窒素に移す。
【0056】
脂質および鉄の生細胞撮像
超低接着６マルチウェルプレートで培養した後、５～１０個のＨＬＯを採取し、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ ８ Ｗｅｌｌ Ｇｌａｓｓ Ｂｏｔｔｏｍプレート（Ｉｂｉｄｉ，ＷＩ，ＵＳＡ）中に播種し、生細胞染色に供した。以下の抗体：脂質の場合はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）および鉄蓄積の場合はＦｅＲｈｏＮｏｘ－１ ５４６（Ｇｏｒｙｏｋａｇａｋｕ Ｉｎｃ．）を使用した。核染色をＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で標識した。ＨＬＯを可視化し、ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７１０ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｊａｐａｎ）上で走査した。最終脂質滴体積をＩＭＡＲＩＳ８で計算し、各オルガノイドサイズで正規化した。
超低接着６マルチウェルプレートで培養した後、５～１０個のＨＬＯを採取し、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ ８ Ｗｅｌｌ Ｇｌａｓｓ Ｂｏｔｔｏｍプレート（Ｉｂｉｄｉ，ＷＩ，ＵＳＡ）中に播種し、生細胞染色に供した。以下の抗体：脂質の場合はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）および鉄蓄積の場合はＦｅＲｈｏＮｏｘ－１ ５４６（Ｇｏｒｙｏｋａｇａｋｕ Ｉｎｃ．）を使用した。核染色をＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で標識した。ＨＬＯを可視化し、ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７１０ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｊａｐａｎ）上で走査した。最終脂質滴体積をＩＭＡＲＩＳ８で計算し、各オルガノイドサイズで正規化した。
【0057】
全てのパーセンテージおよび比率は、別途示されない限り、重量で計算される。
【0058】
全てのパーセンテージおよび比率は、別途示されない限り、全組成物に基づいて計算される。
【0059】
本明細書全体を通して記載されるあらゆる最大数値限定には、より小さいあらゆる数値限定が、かかるより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含まれることを理解すべきである。本明細書全体を通して記載されるあらゆる最小数値限定には、より大きいあらゆる数値限定が、かかるより大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含まれる。本明細書全体を通して記載されるあらゆる数値範囲には、かかるより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲が、かかるより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのように含まれる。
【0060】
本明細書に開示される寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、別途指定されない限り、かかる各寸法は、列挙される値およびその値の周囲の機能的に同等の範囲の両方を意味するよう意図されている。例えば、「２０ｍｍ」と開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味するよう意図されている。
【0061】
いずれの相互参照される特許もしくは出願または関連特許もしくは出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明確に除外されるか、または別様に限定されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文献の引用も、それが本明細書に開示または特許請求されるいずれの発明に対する先行技術であると認めるものではなく、あるいは、それが、単独で、または任意の他の参考文献（複数可）と組み合わせて、かかる発明すべてを教示、示唆、または開示すると認めるものではない。さらに、本明細書における用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれた文書における同じ用語の意味または定義と矛盾する場合、本明細書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が優先されるものとする。
【0062】
本発明の特定の実施形態が例証および説明されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な他の変更および修正が加えられ得ることは当業者には明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内の全てのかかる変更および修正を網羅するよう意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プール前駆細胞集団を同期する方法であって
ａ）プール前駆細胞集団を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって、同期条件に曝露するステップと、
ｂ）前記同期したプール前駆細胞集団を、前記同期したプール前駆細胞集団を同期分化細胞集団に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップと、
ｃ）前記同期分化細胞集団を凍結同期分化細胞集団に凍結するステップと、および、
ｄ）前記凍結同期分化細胞集団を融解同期分化細胞集団に融解するステップを含み、
前記プール前駆細胞集団は、２以上のドナーに由来する多能性幹細胞を含み、
前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤を含む化合物カクテル、および、低酸素培養条件を含む、方法。
ａ）プール前駆細胞集団を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって、同期条件に曝露するステップと、
ｂ）前記同期したプール前駆細胞集団を、前記同期したプール前駆細胞集団を同期分化細胞集団に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップと、
ｃ）前記同期分化細胞集団を凍結同期分化細胞集団に凍結するステップと、および、
ｄ）前記凍結同期分化細胞集団を融解同期分化細胞集団に融解するステップを含み、
前記プール前駆細胞集団は、２以上のドナーに由来する多能性幹細胞を含み、
前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ３）経路阻害剤を含む化合物カクテル、および、低酸素培養条件を含む、方法。
【請求項2】
前記プール前駆細胞集団は、１０ドナー～１０００ドナーに由来する多能性幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、または、胚盤葉上層幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤である、請求項１～３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項5】
前記ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である、請求項１～４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項6】
前記ＧＳＫ３経路阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項7】
前記同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間は、１～６日間である、請求項１～６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項8】
前記カクテルが、
エストロゲン関連受容体ガンマ（ＥＲＲγ）アゴニスト、ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ（ＴＧＦＢ）受容体経路阻害剤、をさらに含む、請求項１～７のいずれか１つに記載の方法。
エストロゲン関連受容体ガンマ（ＥＲＲγ）アゴニスト、ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤、および１型トランスフォーミング成長因子－ｂ（ＴＧＦＢ）受容体経路阻害剤、をさらに含む、請求項１～７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項9】
前記ＥＲＲγアゴニストはＧＳＫ５１８２である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤はＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤はＹ－２７６３２である、請求項８～１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項12】
前記ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤はＡ－８３－０１である、請求項８～１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項13】
、前記低酸素培養条件が、２％Ｏ２
～１０％Ｏ２である、請求項１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項14】
前記同期分化細胞集団は、胚体内胚葉、中胚葉、後方前腸、内皮細胞、肝細胞、およびオルガノイドを含む、請求項１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項15】
前記融解同期分化細胞集団は、後方前腸細胞を含む、請求項１～１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項16】
前記融解同期分化細胞集団をオルガノイド組成物にさらに分化させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
凍結同期分化細胞集団を含む組成物。
【請求項18】
融解同期分化細胞集団を含む組成物。
【請求項19】
複数のオルガノイドを含むオルガノイド組成物であって、前記複数のオルガノイドは、融解同期分化細胞集団から形成されたものである、オルガノイド組成物。
【請求項20】
化合物を対象とする特徴について試験する方法であって、対象とする試験組成物を請求項１８に記載の組成物または請求項１９に記載のオルガノイド組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項21】
前記対象とする特徴が、細胞死、細胞成長、細胞生存、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、ミトコンドリア機能不全を示すＲＯＳ産生、線維症、細胞硬化、線維症、病状に対する有効性、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記試験組成物が、薬物様分子、治療剤、栄養補給剤、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項23】
前記オルガノイド組成物が、肝臓オルガノイドであり、前記対象とする特徴が、ＮＡＦＬＤ／胆汁うっ滞／黄疸に対する有効性であり、病状が、前記肝臓オルガノイドで誘発される、請求項２０～２２のいずれか１つに記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0002】
大集団の研究に効率的な方法は、当該技術分野における満たされていない要求である。例えば、ある集団における潜在的な新たな薬物または治療の安全性および有効性の研究は、薬物承認のための臨床試験の必要条件である。薬物誘発性肝臓損傷（ＤＩＬＩ）用のリスク化合物の前臨床検出は、依然として薬物開発における重要な課題であり、人間が作り出す予測システムの必要性を浮き彫りにしている。すなわち、臨床試験には費用も時間もかかり、多くの薬物は、多くの場合、臨床試験に多大な投資がなされた後に、毒性および／または有効性の欠如の点で不合格になる。ある集団を代表するインビトロ研究ツールを使用した毒性（具体的には、薬物誘発性肝毒性）または有効性の初期決定により、開発までの時間が短縮され、かつ／または臨床試験参加者が避けられるはずの損傷が回避され、かつ／または薬物の発売に関連する費用が削減され得る。したがって、薬物安全性および有効性研究の集団コホートをスクリーニングするための実行可能なインビトロプラットフォームが非常に望ましいであろう。肝機能障害を有する個体等の脆弱集団における初期検出に有用なスクリーニングがさらに望ましい。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２０１０／００７５２９５号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１５／０７５１７５号
（特許文献３） 米国特許出願公開第２０１３／００９５５６７号明細書
（特許文献４） 米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２７号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１） ＲＩＥＤＩＮＧＥＲ ｅｔ ａｌ．"Ｒｅｖｅｒｓｉｂ｜ｅ ｓｈｕｔｄｏｗｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｃｅｌｌｓ： Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｈｏｒｔ－ｌｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，" Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，０１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９２ （０１．１２．１９９２）．Ｖｏｌ．２１０，Ｎｏ．２，Ｐｇｓ．３８９－３９８
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２０１０／００７５２９５号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１５／０７５１７５号
（特許文献３） 米国特許出願公開第２０１３／００９５５６７号明細書
（特許文献４） 米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２７号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１） ＲＩＥＤＩＮＧＥＲ ｅｔ ａｌ．"Ｒｅｖｅｒｓｉｂ｜ｅ ｓｈｕｔｄｏｗｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｃｅｌｌｓ： Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｈｏｒｔ－ｌｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，" Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，０１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９２ （０１．１２．１９９２）．Ｖｏｌ．２１０，Ｎｏ．２，Ｐｇｓ．３８９－３９８
【外国語明細書】