特開 2023-88961 アネキシンＶの製造プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023088961

(43)【公開日】2023-06-27

(54)【発明の名称】アネキシンＶの製造プロセス

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20230620BHJP

   C07K 1/36 20060101ALI20230620BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230620BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20230620BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230620BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230620BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47

C07K1/36 ZNA

C12P21/02 C

A61P7/02

A61P9/00

A61K38/17

【審査請求】有

【請求項の数】68

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023042508

(22)【出願日】2023-03-17

(62)【分割の表示】P 2021112221の分割

【原出願日】2016-09-16

(31)【優先権主張番号】1516516.0

(32)【優先日】2015-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518088967

【氏名又は名称】アネキシン ファーマシューティカルズ アーベー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】モクス， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ライヒ， ヤン クリストフ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び／または精製のためのプロセスを提供する。
【解決手段】プロセスは、細胞内タンパク質を宿主細胞から放出させることを含み、該細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とし、好ましくは、該プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質の該宿主細胞からの放出後に、その回収及び／または精製のためにいかなる遠心分離工程も含まず、かつ／またはＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて該プロセス全体を通して溶液中にとどまる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、前記プロセスは、前記細胞内タンパク質を前記宿主細胞から放出させることを含み、
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とし、
好ましくは、前記プロセスは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質の前記宿主細胞からの放出後に、その前記回収及び／または精製のためにいかなる遠心分離工程も含まず、かつ／または前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて前記プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセス。

【請求項2】

前記非イオン性洗剤は、ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０から選択されるポリソルベート、最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程は、アネキシンＡ５と内毒素との間の前記結合を低減するまたは防止するのに有効な量の非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施される、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程は、０．０１～１０％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤、例えば、０．０２～５％（ｗ／ｗ）、０．０５～２％（ｗ／ｗ）、または約１％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施される、請求項１～３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項5】

前記プロセスは、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させることを含み、
前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させる時点での、または前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させた後であるが、いずれのさらなるクロマトグラフ精製が行われる前の、前記ホモジナイゼーション緩衝液中の遊離カルシウムイオン濃度は、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ、１ｍＭ未満、より好ましくは５００μＭ未満、または実質的にゼロであり、かつ／あるいは
前記ホモジナイゼーション緩衝液は、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させた後にカルシウム金属イオンキレート剤を含むか、またはそれを含むように改変される、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を有する宿主細胞からの回収及び／または精製のための請求項１～４のいずれかに記載のプロセス。

【請求項6】

前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはその塩、ＥＧＴＡまたはその塩から選択され、最も好ましくはＥＤＴＡである、請求項５に記載のプロセス。

【請求項7】

遊離カルシウムイオンのレベル、及び／またはカルシウム金属イオンキレート剤の量は、アネキシンＡ５と前記宿主細胞の前記細胞壁の構成成分との間の前記結合を低減するまたは防止するのに有効である、請求項５または６に記載のプロセス。

【請求項8】

前記ホモジナイゼーション緩衝液は、（前記ＡｎｘＡ５タンパク質の前記放出の前または後に）０．０１～５００ｍＭ、例えば、０．０５～１００ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、２～１０ｍＭ、または約４ｍＭカルシウム金属イオンキレート剤を含むか、またはそれを含むように調整され、好ましくは、前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡである、請求項５～７のいずれかに記載のプロセス。

【請求項9】

前記ホモジナイゼーション緩衝液は、請求項２、３または４のいずれかに記載のプロセスに従った非イオン性洗剤を含む、請求項５、６、７または８に記載のプロセス。

【請求項10】

前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡである、請求項９に記載のプロセス。

【請求項11】

前記非イオン性洗剤は、Ｔｗｅｅｎ８０である、請求項９または１０に記載のプロセス。

【請求項12】

前記プロセスは、組換え的に発現された細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質の、前記宿主細胞の培養物からの回収及び／または精製を含み、前記培養物は、少なくとも１００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、５，０００Ｌ、または１０，０００Ｌの体積を有する、請求項１～１１のいずれかに記載のプロセス。

【請求項13】

宿主細胞の前記培養物からのバイオマスを前記ホモジナイゼーション緩衝液中で、ホモジナイゼーション緩衝液１ｍＬあたり約１０ｇのバイオマスの濃度で混合する工程を含む、請求項１～１２のいずれかに記載のプロセス。

【請求項14】

前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記ホモジナイゼーション緩衝液中で前記宿主細胞から放出させる前記工程は、前記宿主細胞の前記細胞壁及び細胞膜障壁が破壊され、それによって、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出するように、前記宿主細胞を溶解させる、分解させる、ホモジナイズする、超音波処理する、または圧力処理することを含み、任意選択で、この工程は、浸透圧ショック及び／または凍結－融解工程の使用を含まない、請求項１～１３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項15】

前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を前記宿主細胞から放出させる前記工程は、高圧ホモジナイゼーション、例えば、約４００バール～約２，５００バールで１サイクル以上の高圧ホモジナイゼーション、好ましくは約６００バールのホモジナイゼーション３サイクル、または約８００バールのホモジナイゼーション２サイクルを含む、請求項１４に記載のプロセス。

【請求項16】

前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる前記工程は、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含むバイオマスホモジネートを作り出す、請求項１～１５のいずれかに記載のプロセス。

【請求項17】

前記バイオマスホモジネートは、宿主細胞タンパク質、宿主細胞壁構成成分、宿主細胞膜、宿主細胞核酸、及び内毒素からなる群から選択される前記不純物のうちの１つ以上（典型的にはすべて）をさらに含む、請求項１６に記載のプロセス。

【請求項18】

前記バイオマスホモジネートを清澄化し、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物を生産する工程をさらに含む、請求項１６または１７に記載のプロセス。

【請求項19】

前記バイオマスホモジネートを清澄化する前記工程は、前記ホモジネートのヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼＡ、好ましくはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｅｓｃｅｎｓ由来のヌクレアーゼＡでの処理を含み、任意選択で、前記ヌクレアーゼは、前記細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質の放出の前に前記ホモジナイゼーション緩衝液に含められる、請求項１８に記載のプロセス。

【請求項20】

前記バイオマスホモジネートを清澄化する前記工程は（好ましくは、請求項１８または１９に記載のヌクレアーゼ処理に後続して）、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む前記バイオマスホモジネートをフィルター（セルロースまたはポリプロピレンフィルターなど、好ましくは、前記フィルターは、デプスフィルターであり、かつ／または好ましくは、前記フィルターは、４μｍ未満のカットオフを有する）に通す工程を含み、前記フィルター流出液は、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む、前記清澄化された生成物である、請求項１８または１９に記載のプロセス。

【請求項21】

第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を陰イオン交換樹脂に供する工程をさらに含む、請求項１～２０のいずれかに記載のプロセス。

【請求項22】

請求項２０に記載の方法によって生産された前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む、前記清澄化された生成物は、前記第１の陰イオン交換工程に供され、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産する、請求項２１に記載のプロセス。

【請求項23】

前記第１の陰イオン交換工程の前に、ｐＨ、伝導率、カルシウムイオンキレート剤のレベル及び非イオン性洗剤のレベルからなる群から選択される、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の環境の１つ以上のパラメータが調整される、請求項２１または２２に記載のプロセス。

【請求項24】

前記陰イオン交換工程に供される前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質は、約６．９のｐＨ、約２．８ｍＳ／ｃｍの伝導率、約１ｍＭのカルシウムイオンキレート剤濃度で製剤化され、非イオン性洗剤を使用して、例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）の最終非イオン性洗剤濃度を得るように希釈される、請求項２１～２３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項25】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、前記陰イオン交換工程中に結合し、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む前記第１の陰イオン交換生成物は、洗浄液及び／または溶出緩衝液を前記陰イオン交換樹脂に適用して、前記結合したＡｎｘＡ５タンパク質を放出させることによって生産され、任意選択で、前記溶出緩衝液は、ＮａＣｌ、例えば約３００ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項２１～２４のいずれかに記載のプロセス。

【請求項26】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、この方法は、
第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む前記溶液を陰イオン交換樹脂に供することと、
前記第１の陰イオン交換生成物を直接または間接的に親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することと、を含み、
好ましくは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて、いずれの先行または後続の工程も含む前記プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセス。

【請求項27】

前記親和性クロマトグラフィー工程は、前記ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み、前記結合は、カルシウムイオンの存在によって促進される、請求項２６に記載のプロセス。

【請求項28】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、前記固定化ヘパリンから溶出される、請求項２７に記載のプロセス。

【請求項29】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、この方法は、
前記ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む前記溶液を、Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で（好ましくは、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で）ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することを含み、
好ましくは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて、いずれの先行または後続の工程も含む前記プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセス。

【請求項30】

前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産する工程をさらに含む、請求項１～２５のいずれかに記載のプロセス。

【請求項31】

請求項２１～２５のいずれかに記載の方法によって生産される、前記第１の陰イオン交換生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質が、前記親和性クロマトグラフィー工程に供される、請求項３０に記載のプロセス。

【請求項32】

（ａ）請求項１６または１７に記載の放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む、バイオマスホモジネートが、請求項１８、１９または２０のいずれかに記載のプロセスによって清澄化され、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物を生産する工程と、
（ｂ）請求項２１～２５のいずれかに従って第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、前記ＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、前記清澄化された生成物中の前記ＡｎｘＡ５タンパク質が、陰イオン交換樹脂に供される工程と、
（ｃ）前記第１の陰イオン交換生成物中の前記ＡｎｘＡ５タンパク質が、請求項３０または３１に従って親和性クロマトグラフィー工程に供される工程と、を含む、請求項３１に記載のプロセス。

【請求項33】

前記親和性クロマトグラフィー工程は、前記ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み、任意選択で、前記結合は、カルシウムイオンの存在によって促進される、請求項３０～３２のいずれかに記載のプロセス。

【請求項34】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、前記固定化ヘパリンから溶出される、請求項３３に記載のプロセス。

【請求項35】

前記第１の親和性クロマトグラフィー生成物は、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質及び、任意選択で、０．１～５００ｍＭの範囲の、より好ましくは約１０ｍＭのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含む、請求項３０～３４のいずれかに記載のプロセス。

【請求項36】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、
前記プロセスが、陰イオン交換工程を行い、それによって、前記ＡｎｘＡ５タンパク質を前記組成物から回収及び／または精製するために、前記組成物を陰イオン交換樹脂に供することを含むことを特徴とし、
前記陰イオン交換工程が、追加の選択された金属イオンの存在下で実施されることをさらに特徴とし、
前記追加の選択された金属イオンは、前記カルシウム金属イオンキレート剤が前記選択された金属イオンに対して、前記陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択され、
好ましくは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて、いずれの先行または後続の工程も含む前記プロセス全体を通して溶液中にとどまる、プロセス。

【請求項37】

前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはその塩、ＥＧＴＡまたはその塩から選択され、最も好ましくはＥＤＴＡである、請求項３６に記載のプロセス。

【請求項38】

前記カルシウム金属イオンキレート剤は、約０．１ｍＭ、０，５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ以上もしくは少なくとも０．１ｍＭ、０，５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ以上を超過して、及び／またはその濃度で、前記組成物中に存在する、請求項３６または３７に記載のプロセス。

【請求項39】

前記選択された金属イオンは、Ｍｇ^２＋イオンなどの二価陽イオンである、請求項３６～３８のいずれかのいずれかに記載のプロセス。

【請求項40】

前記選択された金属イオンは、前記陰イオン交換工程中、前記組成物を前記陰イオン交換樹脂に供する前記プロセス中に前記カルシウムイオンキレート剤と前記陰イオン交換樹脂との間の相互作用を低減するまたは防止するのに有効な量で存在する、請求項３６～３９のいずれかに記載のプロセス。

【請求項41】

前記選択された金属イオンは、前記陰イオン交換工程中、前記カルシウムイオンキレート剤の存在下での前記ＡｎｘＡ５タンパク質の前記陰イオン交換樹脂への結合を増加させるのに有効な量で存在して、それによって、前記陰イオン交換工程の素通り画分におけるＡｎｘＡ５タンパク質の損失を、選択された金属イオンが前記陰イオン交換工程中に存在しない場合に観察される損失のレベルと比較して低減する、請求項３６～４０のいずれかに記載のプロセス。

【請求項42】

前記選択された金属イオンは、前記陰イオン交換工程中、（例えば、前記組成物を前記陰イオン交換樹脂に供する前に、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む前記組成物に添加することによって）約１～約１００ｍＭ、例えば、約２～約５０ｍＭ、約５～約２５ｍＭ、約１０～約１５ｍＭまたは約１２．５ｍＭの濃度で存在する、請求項３６～４１のいずれかに記載のプロセス。

【請求項43】

前記カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡであり、前記選択された金属イオンは、Ｍｇ^２＋イオンであり、好ましくは、Ｍｇ^２＋イオン対ＥＤＴＡのモル比は、０．５：１～２：１の範囲、最も好ましくは少なくとも１：１以上である、請求項３６～４２のいずれかに記載のプロセス。

【請求項44】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含み、前記陰イオン交換樹脂に供される、前記組成物は、
前記ＡｎｘＡ５タンパク質を親和性クロマトグラフィー工程に供し、前記ＡｎｘＡ５タンパク質をカルシウムイオンキレート剤で溶出し、それによって、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物である親和性クロマトグラフィー生成物を生産する前記工程を含む、先行するプロセスの直接または間接的生成物である、請求項３６～４３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項45】

前記先行する親和性クロマトグラフィー工程は、前記ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み、任意選択で、前記結合は、カルシウムイオンの存在によって促進される、請求項４４に記載のプロセス。

【請求項46】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、前記固定化ヘパリンから溶出される、請求項４５に記載のプロセス。

【請求項47】

前記直接または間接的生成物の前記陰イオン交換工程への前記適用の前に、前記先行する親和性クロマトグラフィー工程と前記陰イオン交換工程との間に透析工程は存在せず、かつ／または先行する親和性クロマトグラフィー工程の前記生成物からのカルシウムイオンキレート剤の除去は行われない、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項48】

前記選択された金属イオンは、前記陰イオン交換工程の前に、またはその最中に前記組成物に添加される、請求項３６～４７のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項49】

前記プロセスは、請求項３６～４８のいずれか１項に記載の陰イオン交換工程を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項50】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ宿主細胞、または請求項１２に記載のその培養物からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、
（ａ）前記プロセスは、請求項１～４のいずれか１項により、前記細胞内タンパク質を、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で前記宿主細胞から放出させることを含み、
（ｂ）任意選択で、前記放出工程は、請求項１３～１７のいずれか１項に従い、
（ｃ）さらに任意選択で、前記プロセスは、請求項１８～２０のいずれかにより前記バイオマスホモジネートを清澄化する工程を含み、
（ｄ）前記プロセスは、請求項２１～２５のいずれかに従って第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に、任意選択でカルシウムイオンキレート剤の存在下で、陰イオン交換樹脂に供する前記工程をさらに含み、
（ｅ）前記プロセスは、請求項２６～３５のいずれかに従って、前記放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に親和性クロマトグラフィー工程に供する前記工程をさらに含み、
（ｆ）前記親和性クロマトグラフィー工程の前記生成物は、前記ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物であり、
（ｇ）前記ＡｎｘＡ５タンパク質及び前記カルシウム金属イオンキレート剤を含む、前記親和性クロマトグラフィー工程の前記直接または間接的生成物は、請求項３６～４９のいずれかに従って陰イオン交換工程に供され、
好ましくは、工程（ａ）～（ｇ）のうちで、遠心分離及び／または透析から選択される１つ以上の工程を含むもの、またはそれが介在するものは何もなく、より好ましくは、前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、前記プロセス全体を通して、陰イオン交換及び親和性クロマトグラフィー固相に一時的に結合した場合を除いて可溶性のままである、プロセス。

【請求項51】

前記プロセスは、好ましくは請求項１～５０のいずれかに記載のプロセスの終わりに、濃縮、緩衝液変更、コンディショニング及び濾過（滅菌濾過など）からなる群から選択される１つ以上のさらなる工程、ならびに任意選択で、前記ＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器中に貯蔵する最終工程を含む、請求項１～５０のいずれかに記載のプロセス。

【請求項52】

前記さらなる工程のうちの１つは、透析濾過であり、任意選択で、前記透析濾過工程の前記生成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ １００ｍｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度で前記ＡｎｘＡ５タンパク質を含有する、請求項５１に記載のプロセス。

【請求項53】

前記濾過は、０．４５～０．２μｍフィルターまたは０．２２μｍフィルターを使用し、好ましくは、滅菌濾過工程である、請求項５１または５２に記載のプロセス。

【請求項54】

滅菌濾過は、前記ＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器中に貯蔵する前の最終精製工程である、請求項５１～５３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項55】

前記プロセスは、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約１ｍＭ ＣａＣｌ_２、約０．０５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ８０など）または他の非イオン性洗剤を含む、約ｐＨ７．４の無リン酸緩衝液（ビス－トリスまたはトリス緩衝液など）中に最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供するのに必要とされる工程を含み、任意選択で、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物中の前記ＡｎｘＡ５タンパク質の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１～５４のいずれかに記載のプロセス。

【請求項56】

前記プロセスは、存在する前記ＮａＣｌ濃度がＡｎｘＡ５タンパク質を主として単量体である形態で維持する、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供する、請求項１～５５のいずれかに記載のプロセス。

【請求項57】

前記プロセスは、宿主細胞培養物１Ｌあたり１ｇ超のＡｎｘＡ５タンパク質、より好ましくは少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは約２～約４ｇ／Ｌの範囲の全収率を提供する、請求項１～５６のいずれかに記載のプロセス。

【請求項58】

前記プロセスは、前記宿主細胞培養物中からに存在する約２４重量％の前記ＡｎｘＡ５タンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質の全回収率を提供する、請求項１～５７のいずれかに記載のプロセス。

【請求項59】

前記プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０ｎｇ以下よりも低いレベルの宿主細胞タンパク質（前記組換え的に発現されたＡｎｘＡ５タンパク質以外の）を含む生成物を提供する、請求項１～５８のいずれかに記載のプロセス。

【請求項60】

前記プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００、９０、８０、７０、６０、５０ ４５、４０、３５、３０、３５、２０、１５未満、好ましくは１０、５または１ＥＵ未満の内毒素含量を含む生成物を提供し、かつ／あるいは好ましくは、前記プロセスは、単位剤形にある生成物を提供し、前記生成物は、単位用量あたり１００、９０、８０、７０、６０、５０ ４５、４０、３５、３０、３５、２０、１５未満、好ましくは１０、５または１ＥＵ未満を含有する、請求項１～５９のいずれかに記載のプロセス。

【請求項61】

前記プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ未満、好ましくはＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ｐｇ未満、より好ましくはＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１０ｐｇ未満の宿主細胞核酸レベルを含む生成物を提供する、請求項１～６０のいずれかに記載のプロセス。

【請求項62】

ＡｎｘＡ５タンパク質を含む組成物であって、請求項１～６１のいずれかに記載のプロセスの前記直接または間接的生成物である（またはそれによって直接もしくは間接的に入手可能である）、組成物。

【請求項63】

前記組成物は、請求項５０に記載の、または請求項５０に従属する場合の請求項５１に記載のプロセスの前記直接または間接的生成物である（またはそれによって直接もしくは間接的に入手可能である）、請求項６２に記載の組成物。

【請求項64】

少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ １００ｍｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度で前記ＡｎｘＡ５タンパク質を含有する、請求項６２または６３に記載の組成物。

【請求項65】

前記組成物は、滅菌濾過工程に供された、かつ／または滅菌組成物である、請求項６２～６４のいずれかに記載の組成物。

【請求項66】

滅菌容器中に貯蔵される、請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

前記組成物は、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約１ｍＭ ＣａＣｌ_２、約０．０５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ８０など）または他の非イオン性洗剤を含む、約ｐＨ７．４の無リン酸緩衝液（ビス－トリスまたはトリス緩衝液など）中に滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を含み、任意選択で、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物中の前記ＡｎｘＡ５タンパク質の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項６２～６６のいずれかに記載の組成物。

【請求項68】

存在する前記前記ＮａＣｌ濃度は、ＡｎｘＡ５タンパク質を主として単量体である形態で維持する、請求項６２～６７のいずれかに記載の組成物。

【請求項69】

ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり２０ｎｇ未満のレベルで宿主細胞タンパク質などの非ＡｎｘＡ５タンパク質を含み、任意選択で、前記宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性細胞などの原核細胞であり、特に、内毒素産生グラム陰性細菌細胞であり得、さらに任意選択で、前記宿主細胞タンパク質は、前記組成物中で（ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり２０ｎｇ未満にもかかわらず）検出可能レベルである、請求項６２～６８のいずれかに記載の組成物。

【請求項70】

ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００、５０、２０、１０、５または１ＥＵ未満の内毒素含量を含み、任意選択で、内毒素は、前記組成物中で（ＡｎｘＡ５タンパク質あたり１００、５０、２０、１０、５または１ＥＵ未満にもかかわらず）検出可能レベルである、請求項６２～６９のいずれかに記載の組成物。

【請求項71】

単位剤形にある生成物であり、単位用量あたり１００、５０、２０、１０、５または１ＥＵ未満を含有し、任意選択で、内毒素は、前記組成物中で（単位用量あたり１００、５０、２０、１０、５または１ＥＵ未満にもかかわらず）検出可能レベルである、請求項６２～７０のいずれかに記載の組成物。

【請求項72】

ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ、１００ｐｇ、または１０ｐｇ未満の、宿主細胞核酸レベルなどの核酸レベルを含み、任意選択で、前記宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性細胞などの原核細胞であり、特に、内毒素産生グラム陰性細菌細胞であり得、さらに任意選択で、宿主細胞核酸は、前記組成物中で（ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ、１００ｐｇ、または１０ｐｇ未満にもかかわらず）検出可能レベルである、請求項６２～７１のいずれかに記載の組成物。

【請求項73】

前記組成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルは、前記生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の全含量の０．５～３０％、または０．５～２０％、または０．５～１５％、または０．５～１０％の範囲内である、請求項６２～７２のいずれかに記載の組成物。

【請求項74】

前記組成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルは、生成物は、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であり、好ましくは、実質的に０％である、請求項６２～７３のいずれかに記載の組成物。

【請求項75】

前記ＡｎｘＡ５タンパク質は、Ｈｉｓタグを含有せず、かつ／または１つ以上のＲＧＤモチーフを含有しない、請求項６２～７４のいずれかに記載の組成物。

【請求項76】

前記組成物は、薬学的に許容される及び／または獣医学的に許容される組成物である、請求項６２～７５のいずれかに記載の組成物。

【請求項77】

薬品において使用するための請求項６２～７６のいずれかに記載の組成物。

【請求項78】

治療を必要とするヒトまたは動物対象に請求項６２または７６のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、前記治療を必要とするヒトまたは動物対象を治療する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の製造のためのプロセスに関する。より特定すると、本プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質の、とりわけ細菌宿主細胞などの組換え宿主細胞からの回収及び／または精製のためのものである。本明細書に記載されるプロセスは、非常に効率的かつ費用効果あり、薬品グレードのＡｎｘＡ５タンパク質生成物を迅速かつ好都合に生産するために商業規模で（例えば、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物で）使用することができる。

【背景技術】

【0002】

先行公開されたと思われる文献の本明細書での列挙または考察は、必ずしも、その文献が最新技術の一部であること、または共通一般知識であることを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0003】

根底にある動脈硬化巣から形成される、アテローム性血栓症は、急性冠動脈疾患、脳血管及び末梢動脈閉塞症を含む、臨床的に明らかな虚血性心血管疾患の大多数の裏に潜む主要な病原性機構である。Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｆｒｏｓｔｅｇａｒｄ，２００７，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，２０（５）：３２１－６で考察されるように、アネキシンスーバーファミリーのメンバーである、アネキシンＡ５（以前はアネキシンＶとして知られた）は、強力かつ独特の抗血栓性特性を備えたタンパク質である。アネキシンＡ５が発揮する抗血栓効果は、リン脂質、特にホスファチジルセリンの機械的遮蔽により、凝固反応へのそれらの可用性を低減することによって、主に媒介されると考えられている。しかしながら、その抗血栓機能に潜在的に寄与するアネキシンＡ５の他の興味深い特性、とりわけ、表面で発現される組織因子の下方制御、またはスルファチド及びヘパリンなどのホメオスタシスに関与する追加のリガンドとの相互作用、ならびにウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の上方制御が報告された。大きな脈管構造及び胎盤微小循環に対する体内での内因性抗血栓性系のメンバーとしてのアネキシンＡ５の生物学的重要性もまた示唆されてきた。

【0004】

実際、アネキシンＡ５は、薬品において、直接的な治療効果を提供する上での広範な有用性を有することが知られている。例としては、アネキシンＡ５の下記の使用が挙げられる。
ＷＯ２００５／０９９７４４に記載されるようなアテローム性血栓症及び／またはプラーク破裂の予防のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２００９／０７７７６４に記載されるような血管機能不全の治療、虚血性疼痛の低減及び／または血管疾患の治療のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２００９／１０３９７７に記載されるような再狭窄の予防または治療のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、
ＷＯ２０１０／０６９６０５に記載されるような、酸化カルジオリピン（ｏｘＣＬ）の活性の阻害において使用するため、及び心血管疾患、自己免疫疾患または炎症性病態を治療する、予防する及び／またはその発症のリスクを低減するため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに
ＷＯ２０１２／１３６８１９に記載されるような、血管手術、とりわけ末梢血管手術後の合併症などの、外科的介入後の周術期または術後合併症の予防及び／または低減のため（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0005】

かくして、アネキシンＡ５は、治療上の関心及び可能性が高いタンパク質を代表する。したがって、（例えば、アネキシンＡ５タンパク質を、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物から収集するために）商業規模の生産に合わせて規模拡大し、それに好都合に適用することができる効率的かつ費用効果のあるプロセスによって、治療グレードのアネキシンＡ５タンパク質を生産するための有効な方法が、差し迫って必要とされている。

【0006】

Ｅ．ｃｏｌｉなどの標準的な細菌宿主細胞においてアネキシンＡ５を組換え的に発現させる際の特定の課題は、宿主細胞由来の構成成分による、特に内毒素による汚染である。内毒素は、共有結合によって連結された脂質ならびにＯ抗原、外部コア及び内部コアで構成される多糖で形成されているリポ多糖（ＬＰＳ）である。ＬＰＳは、グラム陰性菌の外膜において見出され、動物において強力な免疫応答を引き出す。アネキシンＡ５は、負荷電を持つリン脂質を含有する生体膜への強力な結合を特徴とし、このため、内毒素に対して特に高い親和性を有する。このことは、内毒素産生宿主からのアネキシンＡ５の商業規模での大規模生産をより困難にしている。

【0007】

現在のところ、（例えば、アネキシンＡ５タンパク質を、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物から収集するために）商業規模の生産に合わせて規模拡大し、それに好都合に適用することができる効率的かつ費用効果のあるプロセスによって、治療グレードのアネキシンＡ５タンパク質を生産するようなプロセスは全く提供されておらず、内毒素汚染に対処するやり方でのプロセスはなおさらである。

【0008】

１９９１年、Ｋｕｍａｒは、Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５の生産及び精製のためのプロセスの開発について報告した（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｋａｎｓａｓ（Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ，ＡＲ）に提出された 「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題されるＵｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅ Ｈｏｎｏｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｔｈｅｓｉｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｕａｒｋｉｖｅ．ｕａｒｋ．ｅｄｕ／ｘｍｌｕｉ／ｈａｎｄｌｅ／１０８２６／９８１にてオンラインで入手可能）。Ｋｕｍａｒのプロセスは、アネキシンＡ５を１００ｍＬ培養物フラスコ中で組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞において発現させ、細胞をペレット化し、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２からなるホモジナイゼーション／溶解緩衝液の存在下で細胞を再懸濁させ、次いで超音波処理を介して細胞を分解して、アネキシンＡ５タンパク質を放出させることを伴った。ＣａＣｌ_２の添加により、カルシウム依存性様態で、細胞破片における細胞膜へのアネキシンＡ５の結合を引き起こし、次いで混合物は、２０分間の第１の精製遠心分離工程に供され、その後、上清が破棄され、細胞破片を含有するペレット及び結合したアネキシンＡ５が回収された。アネキシンＡ５は、ＥＤＴＡを使用してペレットから放出され、これに続いて、２０分間の第２の精製遠心分離工程及び上清中のアネキシンＡ５の収集が行われた。次いで、この後に一晩の透析を行って、アネキシンＡ５用の緩衝液をｐＨ８．０のトリスＨＣｌに変更してから、ＤＥＡＥ－セファロースカラムでの陰イオン交換、及び塩勾配を用いたアネキシンＡ５の溶出のさらなる工程が行われた。

【0009】

本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法に多数の制限及び欠点があることに気づいた。第１に、それは、１００ｍＬ培養物を使用して小規模で実証されるにすぎず、精製プロセス中に２つの別個の遠心分離工程を必要とする。これは、高体積培養物（例えば、１０００Ｌ以上）を使用する商業プロセスには効率的なやり方で規模拡大できない。下記でさらに考察されるように、かかる高体積の流体の遠心分離は、極めて時間を浪費し、費用がかかる。それでも、遠心分離は、細胞破片における膜へのアネキシンＡ５のカルシウム誘導性結合を用いることに依存するＫｕｍａｒの手法において、予備的捕捉工程として必要とされる。第２に、本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法が、例えば、第１の精製遠心分離工程の生成物の上清中の結合していない可溶性アネキシンを処分することによって、アネキシンＡ５タンパク質の高損失につながることに気づいた。第３に、Ｋｕｍａｒの方法は、治療的使用に好適なレベルまで内毒素を除去することが全くできず、最終生成物中の内毒素レベルに関して検査が何ら行われないことは注目に値する。かくして、Ｋｕｍａｒの方法は、効率的かつ時間効果のある様態で商業的生産に規模拡大することは不可能であり、アネキシンＡ５タンパク質の高損失（すなわち低収率）につながり、治療的使用に好適でない低グレードのタンパク質精製をもたらす。

【0010】

２００８年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｔａｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ１２ａ－ＰＡＰＩ」と題される文献を公開した。それは、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅｐｔｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｌａｂｗｅｂ／Ｆａｃｕｌｔｙ／Ｔａｉｔ／１０８．ｐｄｆにてオンラインで入手可能である。記載された方法は、Ｋｕｍａｒによって提案された手法と非常に類似している。この方法は、１Ｌ培養物中で組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてアネキシンＡ５を発現させ、細胞をペレット化し、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２からなるホモジナイゼーション／溶解緩衝液の存在下で細胞を再懸濁させ、次いで超音波処理を介して細胞を分解して、アネキシンＡ５タンパク質を放出させる。ＣａＣｌ_２の添加により、カルシウム依存性様態で、細胞破片における細胞膜へのアネキシンＡ５の結合を引き起こし、次いで混合物は、２０分間の第１の精製遠心分離工程に供され、その後、上清が破棄され、細胞破片を含有するペレット及び結合したアネキシンＡ５が回収された。アネキシンＡ５は、ＥＤＴＡを使用してペレットから放出され、続いて、２０分間の第２の精製遠心分離工程及び上清中のアネキシンＡ５の収集が行われた。次いで、この後に透析工程を行って、アネキシンＡ５用の緩衝液をｐＨ８．０のトリスＨＣｌに変更してから、Ｍｏｎｏ Ｑカラムでの陰イオン交換、及び塩勾配を用いたアネキシンＡ５の溶出のさらなる工程が行われた。本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法における多数の制限及び欠点がこの方法にも当てはまることに気づいた。

【0011】

２０１４年、アネキシンＡ５の精製のためのさらなる方法が、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｂｙ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ」と題されるＭａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３３において提案された。Ｍａｒｄｅｒらは、その方法が、組換えヒトアネキシンＶを大規模に生産する流加法であることを報告し、この方法は、組換えヒトアネキシンＡ５の商業的有用性を、例えば体内画像化研究における用途に拡大し得ることが提案される。

【0012】

それでも再び、Ｍａｒｄｅｒらの方法は、Ｋｕｍａｒによる１９９１年の方法及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる２００８年の方法と非常に類似している。Ｍａｒｄｅｒらは、２Ｌ槽に保持された１Ｌ培養物中で、組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてアネキシンＡ５を発現させる。考察されるように（Ｍａｒｄｅｒらの「ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ」の「ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」節で）、収集された細胞は、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２からなるホモジナイゼーション／溶解緩衝液（緩衝液Ａ）の存在下で再懸濁させられ、次いで細胞は、超音波処理を介して分解されて、アネキシンＡ５タンパク質を放出させた。ＣａＣｌ_２の添加により、カルシウム依存性様態で、細胞破片における細胞膜へのアネキシンＡ５の結合を引き起こし、次いで混合物は、３０分間の第１の精製遠心分離工程に供され、その後、上清が破棄され、細胞破片を含有するペレット及び結合したアネキシンＡ５が回収された。アネキシンＡ５は、ＥＤＴＡを使用してペレットから放出され、続いて、３０分間の第２の精製遠心分離工程及び上清中のアネキシンＡ５の収集が行われた。次いで、この後に透析工程を行って、アネキシンＡ５用の緩衝液をｐＨ８．０のトリスＨＣｌに変更してから、２０分間の第３の精製遠心分離工程を行って残留沈殿物を除去し、次いでＭｏｎｏ Ｑカラムでの陰イオン交換、及び塩勾配を用いたアネキシンＡ５の溶出のさらなる工程が行われた。再び、本出願者は、Ｋｕｍａｒの方法における多数の制限及び欠点がこの方法にも当てはまることに気づいた。

【0013】

Ｋｕｍａｒによる１９９７年の方法及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる２００８年の方法、及びＭａｒｄｅｒによる２０１４年の方法は、当該技術分野がアネキシンＡ５生成物の商業目的での生産及び精製への手法を開発及び確立したことを明確に示すが、これらの方法における欠点は、容易に利用可能な代替手段がないまま当該技術分野で理解されなかった。

【0014】

アネキシンＡ５回収のためのこれらの先行技術の方法のすべては、研究室規模のプロセスでのみ実証されたものであり、規模拡大に向けて採用すること、またはより大きな規模で利用可能な業界標準もしくは機器を考慮に入れることができない。本プロセスは、それらを大規模な製造に不適当にする固有の不利益を有する。特に、これらの先行技術のプロセスの非常に制限的な特長は、アネキシンＡ５が代替的に溶液中にあるかまたは沈殿物としてのものである場合に本プロセスが必要とする２回または（Ｍａｒｄｅｒらによる２０１４年の方法の場合）３回の高Ｇ力遠心分離である。２回のみの遠心分離工程を１つの１０００Ｌバッチのプロセシングに適用することは、いかなる装備の整ったバイオ製造施設においても１日１２時間のシフトで約１２週間を要するであろうプロセスをもたらすことが合理的に推定され得、これは許容されない高い生産費用をもたらす。比較例１を参照されたい。

【0015】

したがって、商業規模で運転される製造プロセスのために（例えば、約１０００Ｌ以上の培養体積を有する組換え宿主細胞培養物）、効率的かつ費用効果のあるアネキシンＡ５の精製及び回収のための方法論的工程を提供すること、またさらに、先行技術のプロセスが被る収率損失及び低純度（内毒素汚染を含む）を克服することが、本発明の目的である。

【0016】

本発明の方法によって生産される薬品グレードのアネキシンＡ５生成物を提供することもまた本発明の目的である。

【発明の概要】

【0017】

本出願者は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の生産のためのプロセスに対して多数の開発及び改善を行ってきて、既存のプロセスを改善するために独立して使用及び／または組み合わせて使用され得るいくつかの非常に効率的な精製工程を考案した。最も好ましくは、アネキシンＡ５の生産のための本プロセスは、開発されたプロセス工程のすべてを含む。

【0018】

特に、本出願者の開発は、ＡｎｘＡ５タンパク質が好ましくは、（クロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて）プロセス全体を通して溶液中にとどまる方法を介して、ＡｎｘＡ５タンパク質の回収のための非常に効率的なプロセスの可能性を提供する。つまり、本出願者の開発は、好ましくは、ＡｎｘＡ５タンパク質の宿主細胞からの放出の後にいかなる精製遠心分離工程をＡｎｘＡ５タンパク質に適用することも要せずに行われ得る、ＡｎｘＡ５タンパク質の回収のためのプロセスを提供する。沈殿物を収集するための高Ｇ力遠心分離は、大規模なバイオ薬品製造プラントにおいて適用することが困難で、時間がかかり、かつ高価であるため、これは莫大な工業上の有益性を有する。さらに、これは、アネキシンＡ５が内毒素などの望ましくない汚染物質とともに共精製されることをしばしば引き起こし得る、膜（例えば宿主細胞膜及び／またはリポソーム）に結合するアネキシンＡ５の能力に依存することなく、本発明のプロセスがすべて行われ得ることを意味する。

【0019】

したがって、本プロセスは、１つ以上の精製遠心分離工程によって引き起こされる隘路を伴わずに、非常に時間効率的なやり方で宿主細胞の高体積（例えば、約１００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、１００，０００Ｌまたはそれを超える）培養物のプロセシングに適用することができる。例えば、処理される宿主細胞培養物１，０００Ｌあたり精製プロセスが５、４、３、２週間で、またはそれ未満、最も典型的には１週間未満で実施されることが好ましくあり得る。なおもさらに、本プロセスを用いて、驚くべきことに、より時間のかかる効率性の低い先行技術のプロセスと比較して、改善された収率及び／または改善された純度（例えば、改善された内毒素除去を含む）を提供することができる。

【0020】

したがって、本発明の第１の態様は、宿主細胞からのタンパク質放出の改善された工程を提供する。より具体的には、それは、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、該プロセスは、細胞内タンパク質を宿主細胞から放出させることを含み、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とする、プロセスを提供する。好ましくは、非イオン性洗剤は、ポリソルベート、より好ましくはＴｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０から選択されるポリソルベート、最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０である。

【0021】

本出願者はまた、精製工程の順次の追加に伴い収率の損失が増加し続ける（生成物が各工程で失われるため）従来の方法とは対照的に、陰イオン交換工程及びヘパリン親和性クロマトグラフィー工程の組み合わせが、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程単独でも得られる高純度を、ただし実質的に増加した収率を伴って（すなわち回収率は、約３０～４０％から約７０～９０％に増加する）、達成するという驚くべき有益性を有することを発見した（下記の実施例２でさらに考察される）。これは、精製工程の組み合わせから通常予想されるであろうものとは正反対である。

【0022】

したがって、本発明第２の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスを提供し、本方法は、
第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液を陰イオン交換樹脂に供することと、
第１の陰イオン交換生成物を直接または間接的に親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することと、を含む。

【0023】

好ましくは、本発明の第２の態様のプロセスに従って、親和性クロマトグラフィー工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み得、任意選択で、この結合は、カルシウムイオンの存在によって促進され、さらに任意選択で、ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、固定化ヘパリンから溶出される。

【0024】

それに加えて、実施例３で考察されるように、本出願者は、Ｔｗｅｅｎ８０がヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に対して特に有利な効果を有する（Ｔｗｅｅｎ２０などの他のＴｗｅｅｎｓを含めた、他の非イオン性洗剤と比較して）ことを発見した。Ｔｗｅｅｎ ８０を、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に使用される緩衝液中に例えば０．１％（ｗ／ｖ）前後で組み込むことは、ＡｎｘＡ５タンパク質の単一ピークでの溶出を補助し、圧力を低減し、沈殿を防止し得る。

【0025】

したがって、本発明第３の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスを提供し、本方法は、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物（本明細書で考察される、第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程の直接または間接的生成物である場合もそうでない場合もある）を含む溶液を、Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で（好ましくは約０．１ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で）ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することを含む。

【0026】

本発明の第４の態様は、カルシウム金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が陰イオン交換工程の有効性に悪影響を及ぼし得るという本出願者の気づきに基づく。遊離ＥＤＴＡ（または他のキレート剤）は、陰イオン交換官能基に直接結合し得、それによって、陰イオン交換工程によって達成される容量、及びさらには分離も低減する。他方で、陰イオン交換工程前にカルシウム金属イオンキレート剤を除去しようとする試みは、時間を浪費し、しがたって費用もまた増加させる。したがって、緩衝液交換のために緩徐な透析工程を伴う先行技術の方法は、非効率的である。さらに、陰イオン交換工程中にカルシウム金属イオンキレート剤をＡｎｘＡ５生成物に組み込む際に、ＡｎｘＡ５タンパク質の、内毒素を含む不純物へのカルシウム媒介性結合を防止するために重要な構成要素であり得る。したがって、カルシウムイオンキレート剤の陰イオン交換樹脂への結合を遮断または低減し、陰イオン交換工程が、透析に関連する不都合及び費用を伴わずに、また陰イオン交換工程中のカルシウム金属イオンキレート剤の有益な効果を阻止することなく行われることを可能にする、添加剤を導入することは、好都合かつ効果的であろう。

【0027】

本出願者は、陰イオン交換の前にＡｎｘＡ５タンパク質生成物へのまたは１種類以上の追加の選択された金属イオンの組み込みによってこれが達成され得ることに気づき、この追加の選択された金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される。適切な追加の金属イオンの選択は、カルシウムイオンキレート剤の性質及び陰イオン交換樹脂の性質に左右されるであろう。例えば、ＥＤＴＡをカルシウムイオンキレート剤として使用する場合、Ｍｇ^２＋イオンが一般に本発明の目的を達成するのに好適であり、陰イオン交換工程の前にＡｎｘＡ５タンパク質生成物に添加され得る。

【0028】

したがって、本発明の第４の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、
該プロセスが、陰イオン交換工程を行い、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質を組成物から回収及び／または精製するために、組成物を陰イオン交換樹脂に供することを含むことを特徴とし、
該陰イオン交換工程が、追加の選択された金属イオンの存在下で実施されることをさらに特徴とし、
この追加の選択された金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される、プロセスを提供する。

【0029】

本発明の第５の態様は、ＡｎｘＡ５タンパク質を含む組成物を提供し、この組成物は、本発明の第１、第２、第３または第４の態様のいずれかによるプロセスの直接または間接的（またはそれによって直接または間接的に得ることができる）生成物である。任意選択で、組成物は、薬学的に許容される及び／または獣医学的に許容される組成物である。

【0030】

本発明の第６の態様もまた、薬品において使用するための本発明の第５の態様の組成物を提供する。別の言い方をすれば、本発明の第６の態様は、治療を必要とするヒトまたは動物に、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0031】

本明細書に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書に記載されるいずれの他の方法または組成物に関して実施され得ることが企図される。

【0032】

特許請求の範囲及び／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併用される場合の「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つよりも多く」の意味とも一貫している。

【0033】

本発明のこれらの及びさらなる態様は、次の説明及び添付の図面と併せて考慮するときによりよく認識及び理解されるであろう。しかしながら、次の説明は、本発明の種々の態様及び実施形態ならびにそれらの多数の具体的な詳細を示しながらも、限定ではなく例示として与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内で、その趣旨から逸脱することなく多くの置換、改変、追加及び／または再配置が行われてよく、本発明は、すべてのかかる置換、改変、追加及び／または再配置を含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1-1】ヒトアネキシンＡ５の配列である、配列番号１の配列を示す。

【図1-2】ヒトアネキシンＡ５の配列である、配列番号１の配列を示す。

【図2】アネキシンＡ５の例となる完全な製造プロセスの概略的流れ図を示す。

【図3】例となるＡＸ捕捉クロマトグラフィーについてのプロセス流れ図を提供する。

【図4】例となる中間親和性クロマトグラフィーについてのプロセス流れ図を示す。

【図5】例となるＡＸ精錬クロマトグラフィー工程についてのプロセス流れ図を示す。

【図6】アネキシンＡ５の例となる限外／透析濾過及び製剤化についてのプロセス流れ図を示す。

【図7A】アネキシンＡ５のヘパリン親和性クロマトグラフィー精製に及ぼすＴｗｅｅｎ８０の影響を実証する、実施例３の結果を示し、このうち図７Ａは、試験１（Ｔｗｅｅｎ８０を含まない）についての結果を示し、図７Ｂは、試験２（Ｔｗｅｅｎ８０を含む）についての結果を示す。

【図7B】アネキシンＡ５のヘパリン親和性クロマトグラフィー精製に及ぼすＴｗｅｅｎ８０の影響を実証する、実施例３の結果を示し、このうち図７Ａは、試験１（Ｔｗｅｅｎ８０を含まない）についての結果を示し、図７Ｂは、試験２（Ｔｗｅｅｎ８０を含む）についての結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

Ａ．アネキシンＡ５タンパク質
本発明は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の精製及び／または回収のための方法、ならびにこのようにして生産された、ＡｎｘＡ５タンパク質を含む生成物及び製剤に関する。

【0036】

本発明の一実施形態において、精製及び／または回収されたＡｎｘＡ５タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列を有するタンパク質を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0037】

別の実施形態において、精製及び／または回収されたＡｎｘＡ５タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列を有するタンパク質のバリアントまたは変異体を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。例えば、バリアントまたは変異体は、任意の１つ以上の位置において、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０個またはそれよりも多くの位置において、または最大その個数の位置において、配列番号１とは異なり得る（Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても）。

【0038】

それゆえ、アネキシンＡ５のバリアントまたは変異体は、保存的であれ非保存的であれ１つ以上の位置においてアミノ酸挿入、欠失、または置換が行われた、タンパク質であり得る。好ましくは、この変化は、アネキシンＡ５に対して同等の様態で機能する基本的特性が著しく変化させられていないタンパク質をもたらす。この関連における「著しく」とは、バリアントの特性が元のタンパク質の特性と比べて依然として異なり得るが、自明でないこともない、と当業者がいうところの意味である。

【0039】

好ましくは、バリアントまたは変異体の等電位点（ｐＩ）は、未修飾タンパク質と比較して変化させられないか、または１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２もしくは０．１ｐＨ単位を超えては変更されない。

【0040】

好ましい実施形態において、ＡｎｘＡ５タンパク質は、好ましくは、同じ条件下でヒトアネキシンＡ５（配列番号１）によって示されるレベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または約１００％であるレベルで、生体膜上のホスファチジルセリンに結合可能である。生体膜上のホスファチジルセリンへのアネキシンＡ５結合を測定するのに好適な方法は、当該技術分野で知られている（Ｖｅｒｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４（１）：ｐ．３９－５１）。

【0041】

「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの意図される組み合わせである。

【0042】

バリアント及び変異体は、当該技術分野で周知のタンパク質工学法及び部位特異的突然変異誘発法を用いて作製され得る。

【0043】

さらなる実施形態において、精製及び／または回収されたＡｎｘＡ５タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列を有するタンパク質、または上述されるようなそのバリアントもしくは変異体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質の二量体であり得る。

【0044】

さらなる実施形態において、精製及び／または回収されたＡｎｘＡ５タンパク質は、融合タンパク質であり得、その融合タンパク質は、次のものを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。（ａ）Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列を有するタンパク質、または上述されるようなそのバリアントもしくは変異体、または二量体に融合された、融合パートナーの配列を含む１つ以上のタンパク質配列、（ｂ）Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列を有するタンパク質、または上述されるようなそのバリアントもしくは変異体、または二量体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つ以上のタンパク質配列。例えば、限定することなく、融合タンパク質は、次のものから選択される一般構造を有してもよい。
－２つのアミノ酸配列の融合の場合、例えば、Ｈ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、または
－３つのアミノ酸配列の融合の場合、例えば、Ｈ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、または
－４つのアミノ酸配列の融合の場合、例えば、Ｈ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、または
－５つのアミノ酸配列の融合の場合、例えば、またはＨ２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－（ｂ）－ＣＯＯＨ、もしくはＨ_２Ｎ－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ｂ）－（ａ）－ＣＯＯＨ、
ここで（ａ）及び（ｂ）は、この段落の上記に定義される通りである。（ａ）によって定義される複数の融合パートナータンパク質の場合、複数の融合パートナーは、同じであっても、異なってもよい。目的とするいずれの融合パートナーも使用されてよい。例えば、融合パートナーポリペプチド配列（複数可）は、患者の循環系内での分子の半減期を延長させる及び／またはさらなる機能性を分子に付与する、例えば、追加の治療的特性（例えば、抗凝固、細胞阻害及び／または殺傷など）を付与するのに好適であり得る。Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくても、ヒトアネキシンＡ５（図１に示される配列番号１）の配列、または上述されるようなそのバリアントもしくは変異体、または二量体を有する複数のタンパク質配列を含む、（ｂ）によって定義される融合タンパク質の場合、それらのタンパク質は、同じであっても、異なってもよい。

【0045】

本発明のさらなる実施形態において、精製及び／または回収されたＡｎｘＡ５タンパク質は、下記から選択されるアネキシンＡ５の配列またはその機能的バリアントもしくは変異体を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質であり得る。
ａ）Ｎ末端メチオニンを含むまたは含まないヒトアネキシンＡ５（配列番号１）、
ｂ）ヒトアネキシンＡ５の哺乳類オルソログ、
ｃ）ａ）またはｂ）の対立遺伝子または遺伝子バリアント、
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のうちのいずれかと５０％、６０％、７０％、７５％超、例えば８０％、８５％超、９０％超、またはさらにより好ましくは９５％もしくは９９％超同一であるタンパク質、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の二量体、あるいは
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のうちのいずれかに融合された、１つ以上の融合パートナーを含む融合タンパク質。

【0046】

特定の実施形態において、ＡｎｘＡ５タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを含むまたは含まないヒトアネキシンＡ５、配列番号１と５０％、６０％、７０％、７５％超、例えば８０％、８５％超、９０％超、またはさらにより好ましくは９５％もしくは９９％超同一である、アネキシンＡ５の機能的バリアントまたは変異体である。

【0047】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、次のように決定される。まず、アミノ酸配列が、ＢＬＡＳＴＮ第２．０．１４版及びＢＬＡＳＴＰ第２．０．１４版を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロン版からのＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、例えば、配列番号１と比較される。このＢＬＡＳＴＺのスタンドアロン版は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトから入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法を説明する説明書は、ＢＬＡＳＴＺに付随するｒｅａｄｍｅファイルに見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列間の比較を行う。２つのアミノ酸配列を比較するには、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションが次のように設定される。－ｉは、比較対象の第１のアミノ酸配列を含むファイルに対して設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）、－ｊは、比較対象の第２のアミノ酸配列を含むファイルに対して設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）、－ｐは、ｂｌａｓｔｐに対して設定され、－ｏは、任意の所望のファイル名に対して設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）、すべての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、次のコマンドを使用して、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる。Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ －ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ －ｐ ｂｌａｓｔｐ －ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、指定の出力ファイルは、整列された配列としてそれらの相同性領域を提示する。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、指定の出力ファイルは、整列された配列を提示しない。いったん整列されると、両配列において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が提示されている位置の数を数えることによって、一致の数が決定される。

【0048】

同一性パーセントは、一致の数を、特定された配列において示される配列の長さで除し、続いて結果として得られた値に１００を乗ずることによって決定される。例えば、配列が配列番号１に示される配列と比較され（配列番号１に示される配列の長さは３２０である）、一致の数が２８８である場合、その配列は、配列番号１に示される配列に対して９０の同一性パーセントを有する（すなわち、２８８÷３２０×１００＝９０）。

【0049】

ＡｎｘＡ５タンパク質は、アネキシンＡ５の二量体（ダイアネキシンなど）またはその機能的バリアントもしくは変異体であり得る。ダイアネキシンＡ５は、ＷＯ０２／０６７８５７に開示される。

【0050】

好ましくは、ＡｎｘＡ５タンパク質はＨｉｓタグを含まず、その回収及び精製は、Ｈｉｓタグ配列への親和性結合工程を使用しては達成されない。

【0051】

Ｈｉｓタグは、少なくとも６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基から典型的になり、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にあることが多い（必ずしもそうではないが）、タンパク質におけるポリヒスチジンアミノ酸モチーフである。ポリヒスチジンタグは、様々な種類で市販されている、結合した二価ニッケルまたはコバルトイオンを含有する親和性樹脂とのインキュベーションによる、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及び他の原核性発現系において発現されるポリヒスチジンタグ付き組換えタンパク質の親和性精製に使用されることが多い。これらの樹脂は、一般に、ポリヒスチジンタグがマイクロモル親和性で結合する、ニッケル用のイミノ二酢酸（Ｎｉ－ＩＤＡ）及びニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）、ならびにコバルト用のカルボキシメチルアスパラギン酸（Ｃｏ－ＣＭＡ）などのキレート剤で官能化された、セファロース／アガロースである。樹脂は次いで典型的に、コバルトまたはニッケルイオンと特異的に相互作用しないタンパク質を除去するために、リン酸緩衝液で洗浄される。Ｎｉ系の方法の場合、２０ｍＭイミダゾールの添加によって洗浄効率を改善することができる（タンパク質は通常、１５０～３００ｍＭイミダゾールで溶出される）。

【0052】

Ｈｉｓタグ手法は精製に好都合であるが、ＡｎｘＡ５タンパク質を含めた治療的タンパク質における非天然ポリヒスチジンモチーフの存在は、それが免疫学的反応などの患者の有害反応につながり得るため、望ましくない。代替的に、タンパク質生産後にＨｉｓタグモチーフを除去しようと試みることは、煩雑で時間や費用がかかり、実際、Ｈｉｓタグが除去されたタンパク質調製物は典型的に、１つ以上の異質ヒスチジン残基を保持するであろう。

【0053】

結果として、好ましくは、ＡｎｘＡ５タンパク質はＨｉｓタグを含まず、その回収及び精製は、Ｈｉｓタグ配列への親和性結合工程を使用しては達成されない。

【0054】

本発明のＡｎｘＡ５タンパク質は、ＷＯ２０１０／１４０８８６に開示されるように（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、１つ以上の、例えば最大２０個のＲＧＤ（アルギニン－グリシン－アスパラギン酸）モチーフを含むように修飾されている、ヒトアネキシンＡ５の配列を有するタンパク質のバリアントまたは変異体のバリアントである場合も、そうでない場合もある（好ましくは、そうでない）。ＷＯ２０１０／１４０８８６に記載されるように、１つ以上のＲＧＤモチーフの付加を用いて、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するＡｎｘＡ５バリアントを使用することによる食作用を強化し、食作用を阻害する代わりにアポトーシス細胞を飲み込むように食細胞を活性化することができる。

【0055】

Ｂ．宿主細胞培養物
ＡｎｘＡ５タンパク質は、宿主細胞培養物中で組換え的に発現され得る。本発明による、ＡｎｘＡ５タンパク質を発現する好ましい宿主細胞培養物は、ＡｎｘＡ５タンパク質生産のために商業規模にある培養物、例えば、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、約１，０００Ｌ、約２，０００Ｌ、約３，０００Ｌ、約４，０００Ｌ、約５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約７，００００Ｌ、約８，００００Ｌ、約９，００００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約２０，０００Ｌ、約３０，０００Ｌ、約４０，０００Ｌ、約５０，０００Ｌ、約６０，０００Ｌ、約７０，００００Ｌ、約８０，００００Ｌ、約９０，００００Ｌ、約１００，０００Ｌまたはそれよりも高い培養体積を有する培養物である。この関連における「約」という用語は、定められた体積の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％の意味を含み得る。

【0056】

目的となる遺伝子の組換え発現のための方法は、当該技術分野でよく知られている。

【0057】

典型的には、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、宿主細胞培養物中で組換え的に発現される。例えば、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列は、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列を含むプラスミドまたは他のベクターでの宿主細胞の形質転換によって、宿主細胞に導入されてもよく、任意選択で、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列は、宿主細胞染色体（またはプラストーム）に組み込まれるか、または複製可能な染色体外ベクター上で維持される。

【0058】

したがって、宿主細胞は、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換され得る。

【0059】

宿主細胞は、原核性または真核性のいずれでもあり得る。

【0060】

細菌細胞が、本発明の関連において好ましい原核性宿主細胞である。細菌宿主細胞は、例えば、グラム陽性であっても、グラム陰性宿主細胞であってもよい（だがグラム中性（ｇｒａｍ－ｎｅｕｔｒａｌ）及びグラム不定菌もまた使用されてよい）。グラム陰性菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

少なくとも本発明の第１の態様の関連において、任意選択で、本発明のすべての態様の関連において、宿主細胞は、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞であり、それゆえ、典型的に、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５、及びＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なＲＲ１（番号ＡＴＣＣ ３１３４３）などのグラム陰性菌である。

【0062】

錯誤回避のために、「細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞」という用語は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、及び他の真核細胞を除外するように解釈され得る。

【0063】

Ｅ．ｃｏｌｉのさらなる特に好ましい内毒素産生株には、（例えば、広く市販されており、Ｍａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：３３に記載されるような）株ＢＬ２１（ＤＥ３）が含まれる。しかしながら、本出願者は、ＢＬ２１（ＤＥ３）から発現されたアネキシンＡ５が驚くべきことに、アネキシンＡ５タンパク質の約４０％がグルコノイル化されたといった、予想外に高レベルの望ましくない翻訳後グルコノイル化を呈することを見出した。これは、典型的にほんの約５～１０％のグルコノイル化のレベルを示す、ＢＬ２１（ＤＥ３）において組換え的に発現されたほとんどの他のタンパク質のグルコノイル化のレベルよりもはるかに高い。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉの内毒素産生株が、例えば、Ａｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８，７４（４）：９５０－９５８に記載されるように（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を過剰発現させ、それによって、組換え的に発現されたタンパク質の翻訳後グルコノイル化を抑制し、ゆえに、ＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化バリアントの形成を、４０％を下回る、例えば３０％、２０％、１０％、９％８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を下回る、好ましくは実質的に０％のレベルまで抑制することによって、ＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化のレベルを低減するように操作されているＢＬ２１（ＤＥ３）の株であることが、さらにより好ましい。

【0064】

典型的に、本発明において使用するための細菌宿主細胞は、壁を持つ細菌宿主細胞であり、したがって好ましくは、スフェロプラストなどの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９：８１－８５に記載されるものなど（その内容は参照により本明細書に組み込まれる））、細胞壁及び（グラム陰性菌の場合）外膜を欠く細胞を除外する。スフェロプラストは、本出願の関連において、内毒素産生宿主細胞ではなく、細胞壁を有しない。スフェロプラストは、特に、大体積培養物中で生産的に成長させられるそれらの能力を重大に制限する細胞壁の不在によるそれらの感受性及び虚弱性に起因して、商業規模生産に全く適しない。

【0065】

任意選択で、宿主細胞は、浸透圧ショック及び／または凍結／融解処理によって溶解されることのできない細胞壁を持つ、内毒素産生宿主細胞である。

【0066】

さらなる選択肢では、宿主細胞培養物は、宿主細胞が耐性を有しない抗生物質の存在下で、及び任意選択でいかなる抗生物質の存在下でも、宿主細胞が培養されない、または培養されたことのない培養物である。回避すべき具体的な抗生物質は、一実施形態において、アンピシリンなどの、スフェロブラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）の形成をもたらす抗生物質である。

【0067】

真核性宿主細胞には、酵母、及び哺乳類細胞、好ましくは、マウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞株由来のものなどの脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ）から一般に入手可能であるＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１が含まれる。好ましい哺乳類宿主細胞には、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、及びＣＲＬ１６５０としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎臓由来ＣＯＳ－１細胞が含まれる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされ得るＳｆ９細胞である。

【0068】

典型的な原核性ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５、ｐＢＳベクター、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ）から入手可能なＰｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａである。

【0069】

典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、ＳＶ４０後期プロモータを使用して、クローニングされた遺伝子の発現を誘導し、このうち最も高い発現レベルは、ＣＯＳ－１細胞などのＴ抗原産生細胞において見出される。誘導性哺乳類発現ベクターの例は、同じくＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手可能なｐＭＳＧである。このベクターは、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復のグルココルチコイド誘導性プロモータを使用して、クローニングされた遺伝子の発現を誘導する。

【0070】

有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３－４０６及びｐＲＳ４１３－４１６であり、これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ）から一般に入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択性マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３－４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。

【0071】

当業者に周知の方法を用いて、ＡｎｘＡ５タンパク質コード配列、及び例えば、適切な転写または翻訳制御配列を含有する、発現ベクターを構築することができる。１つのかかる方法は、ホモポリマーテールを介したライゲーションを伴う。ホモポリマーであるポリｄＡ（またはポリｄＣ）テールが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって、クローニング対象のＤＮＡ断片上の露出した３’ＯＨ基に付加される。すると断片は、直鎖状にされたプラスミドベクターの末端に付加されたポリｄＴ（またはポリｄＧ）テールにアニーリング可能である。アニーリングの後に残されたギャップは、ＤＮＡポリメラーゼによって埋められ得、遊離末端（ｆｒｅｅ ｅｎｄ）がＤＮＡリガーゼによって連結され得る。

【0072】

別の方法は、付着末端を介したライゲーションを伴う。適合性の付着末端は、好適な制限酵素の作用によってＤＮＡ断片及びベクター上で生成され得る。これらの末端は、相補的塩基対合により迅速にアニーリングし、残ったニックが、ＤＮＡリガーゼの作用によってつなげられ得る。

【0073】

さらなる方法は、リンカー及びアダプターと呼ばれる合成分子を使用する。平滑末端を有するＤＮＡ断片が、突出した３’末端を除去し、陥凹した３’末端を埋めるバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩによって生成される。規定の制限酵素のための認識配列を含有する平滑末端２本鎖ＤＮＡの片である、合成リンカーが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって平滑末端ＤＮＡ断片にライゲーションされ得る。それらはその後、適切な制限酵素で消化されて付着末端を作り出し、適合性末端を有する発現ベクターにライゲーションされる。アダプターもまた、ライゲーションに使用される１つの平滑末端を含有するが、１つの実施された付着末端も保有する、化学合成されたＤＮＡ断片である。

【0074】

多様な制限エンドヌクレアーゼを含有する合成リンカーが、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡ）を含むいくつかの供給源から市販されている。

【0075】

ＡｎｘＡ５タンパク質をコードするＤＮＡを修飾する望ましいやり方は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７－４９１によって開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法において、酵素的に増幅される対象となるＤＮＡには、２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーが隣接し、これらのオリゴヌクレオチドプライマー自体が増幅されたＤＮＡに組み込まれるようになる。該特定のプライマーは、当該技術分野で既知の方法を用いた発現ベクターへのクローニングに使用され得る、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有してもよい。

【0076】

適切な細胞宿主の、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ構築物での形質転換は、典型的には使用されるベクターの種類に応じた周知の方法によって遂行される。

【0077】

原核性宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９、２１１０及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．に記載される。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５、１０４－１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、かかる細胞をトランスフェクトする際に有用な試薬、例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ－デキストランまたはリポソーム製剤は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡ）から入手可能である。

【0078】

エレクトロポレーションもまた細胞の形質転換に有用であり、酵母細胞、細菌細胞及び脊椎動物細胞の形質転換に関して当該技術分野でよく知られている。

【0079】

例えば、多くの細菌種は、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７－６４６に記載される方法（参照により本明細書に組み込まれる）によって形質転換されてもよい。２５μＦＤで１ｃｍあたり６２５０Ｖを使用した２．５倍ＰＥＢに懸濁させたＤＮＡ－細胞混合物のエレクトロポレーションの後に、最大数の形質転換体が一貫して回収される。

【0080】

エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示される。

【0081】

ＤＮＡを動物及び植物細胞に導入するために物理的方法が使用されてもよい。例えば、マイクロインジェクションは、非常に微細なピペットを使用して、ＤＮＡ分子を直接、形質転換対象の細胞の核に注入する。別の例は、高速ミクロ射出粒子、通常は、ＤＮＡでコーティングされた金またはタングステンの粒子での細胞の砲撃を伴う。

【0082】

成功裏に形質転換された細胞、すなわち、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技法によって特定することができる。例えば、１つの選択技法は、発現ベクターに、形質転換された細胞の選択可能な形質をコードするＤＮＡ配列（マーカー）を組み込むことを伴う。これらのマーカーは、真核細胞培養物のためにはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、及びＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌中での培養のためにはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。代替的に、かかる選択可能な形質に対する遺伝子は、所望の宿主細胞の共形質転換に使用される、別のベクター上にあり得る。

【0083】

マーカー遺伝子を使用して形質転換体を特定することができるが、細胞のうちのどれが組換えＤＮＡ分子を含有し、どれがセルフライゲーションされたベクター分子を含有するかを決定するのが望ましい。これは、クローニングベクターを使用して達成することができ、ここでＤＮＡ断片の挿入が、その分子上に存在する遺伝子のうちの１つの完全性を破壊する、したがって、組換え体が、その遺伝子の機能喪失のゆえに特定され得る。

【0084】

成功裏に形質転換された細胞を特定する別の方法は、ＡｎｘＡ５タンパク質をコードする配列を含む発現構築物の導入からもたらされる細胞を成長させて、本発明のポリペプチドを産生させることを伴う。細胞は採取及び溶解され得、それらのＤＮＡ含量が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８によって記載される方法などの方法を用いて、そのＤＮＡの存在について検査され得る。代替的に、上清中のタンパク質の存在は、下記に記載されるように抗体を使用して検出することができる。

【0085】

組換えＤＮＡの存在について直接アッセイすることに加えて、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指示可能である場合、成功裏の形質転換は、周知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで成功裏に形質転換された細胞は、適切な抗原性を呈するタンパク質を産生する。形質転換されていることが疑われる細胞の試料が、採取され、好適な抗体を使用してタンパク質についてアッセイされる。

【0086】

それゆえ、形質転換宿主細胞自体を培養して、ＡｎｘＡ５タンパク質を発現する培養物形質転換宿主細胞を提供することができる。培養物は、栄養培地中の、モノクローナル（クローン的に同種）培養物、またはモノクローナル培養物に由来する培養物であり得る。

【0087】

ＡｎｘＡ５タンパク質を発現する形質転換宿主細胞の培養物は、所望の細胞密度が得られるまで、典型的に生産性と、培養相に関連する時間及び費用との平衡を保つように選択される好適な成長条件下で成長させられ、次いで細胞は、典型的に採取される。細胞採取のための最適な時間は、任意の所与の培養について経験的に決定され得る。

【0088】

採取は、例えば、宿主細胞（典型的に無傷であり、典型的に、細胞内にＡｎｘＡ５タンパク質の実質的にすべて（例えば、８０％、９０％、９５％もしくは９９％超または１００％）を保持する）の培地からの収集を伴う。これは一般的に、培養された宿主細胞をバイオマスの形態で収集する、遠心分離または濾過によって達成することができる。遠心分離の場合、上清は破棄され得、細胞ペレットが、細胞培養物ホモジナイゼーション段階に直接または間接的に（例えば、凍結などによる貯蔵の後に）移され得る。

【0089】

Ｃ．細胞培養物ホモジナイゼーション
上記で考察されるように、本発明の第１の態様は、宿主細胞からのタンパク質放出の改善された工程を提供する。より具体的には、それは、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、該プロセスは、細胞内タンパク質を宿主細胞から放出させることを含み、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる工程が、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施されることを特徴とする、プロセスを提供する。

【0090】

好ましくは、非イオン性洗剤は、ポリソルベート、より好ましくはＴｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０から選択されるポリソルベート、最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０である。代替的に、それよりは好ましくないものの、他の非イオン性洗剤が使用されてもよいが、タンパク質の吸収極大、すなわち２７５～２８０ｎｍと同様の紫外線吸収率λ_ｍａｘを有する非イオン性洗剤の使用は回避するのが好ましく（細胞培養物ホモジナイゼーション工程、及びまた、本プロセスの任意の他の工程の両方において）、これは、それが回収プロセス中に紫外線吸収率によりタンパク質の存在を監視する能力を妨害し得るためである。この関連において、「同様」とは、λ_ｍａｘが、精製されているＡｎｘＡ５タンパク質の吸収極大の１０ｍｎ、９ｎｍ、８ｍｎ、７ｎｍ、６ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、または１ｎｍ以内であるという意味を含み得る。それゆえ、例えば、非イオン性洗剤は、λ_ｍａｘ＝２７５ｎｍを有するＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でないことが好ましい場合があり、このため、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、細胞培養物ホモジナイゼーション工程及び／または本発明のプロセスの任意の他の工程に使用されないことが好ましくあり得る。

【0091】

細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる細胞ホモジナイゼーションの前に、非イオン性洗剤が、細胞に添加されるホモジナイゼーション緩衝液に含められてもよく（例えば、ホモジナイゼーション緩衝液は存在する非イオン性洗剤で「あらかじめ形成」されてもよい）、または細胞が、非イオン性洗剤を含まないホモジナイゼーション緩衝液に懸濁させられてもよく、次いで非イオン性洗剤が、ホモジナイゼーション緩衝液に懸濁させられた細胞に添加され、それと混合され得ることに留意されたい。

【0092】

好ましくは、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる工程は、アネキシンＡ５と内毒素との間の結合を低減する（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれを超えてなど）または防止するのに有効な量の非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で実施される。内毒素レベルは、当該技術分野で周知かつ確立された方法によって、例えば、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験によって、測定されてよい。

【0093】

例えば、ホモジナイゼーション緩衝液は、０．０１～１０％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤、例えば、０．０２～５％（ｗ／ｗ）、０．０５～２％（ｗ／ｗ）、または約１％（ｗ／ｗ）非イオン性洗剤を含み得る。この関連における「約」という用語は、±０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％（ｗ／ｗ）の意味を含み得る。

【0094】

カルシウムイオンまたはイオン化できるカルシウム化合物（などのＣａＣｌ_２）は、ホモジナイゼーション緩衝液に何ら添加されないまたは含められないことが好ましい。したがって、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質の宿主細胞からの放出時点でのホモジナイゼーション緩衝液中の遊離カルシウムイオン濃度は、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭまたは１ｍＭ未満、より好ましくは５００μＭ、４００μＭ、３００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μｍ未満または実質的にゼロであることが好ましい。

【0095】

一実施形態において、ホモジナイゼーション緩衝液は、カルシウム金属イオンキレート剤を含み得る。酵素処理を伴い、かかる酵素が補因子としてＭｇ^２＋を用いる、任意選択による後続の工程に照らして、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などの、Ｍｇ^２＋に強力に結合しないカルシウムイオンキレート剤を選択することが好ましくあり得る。代替的に、酵素処理を伴い、かかる酵素が補因子としてＭｇ^２＋を用いる、任意選択による後続の工程は、Ｍｇ^２＋を必要としない他の工程と置換されてもよい。その場合、ＥＧＴＡまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの任意のカルシウムイオンキレート剤がホモジナイゼーション緩衝液に含められてもよい。

【0096】

任意選択で、ホモジナイゼーション緩衝液中の遊離カルシウムイオンの濃度及び／またはカルシウム金属イオンキレート剤の量は、アネキシンＡ５と宿主細胞の細胞膜及び／または壁の構成成分との間の結合を、例えば、ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２からなるホモジナイゼーション緩衝液の存在下で観察されるであろう結合のレベルと比較して、低減する（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれを超えてなど）または防止するのに有効な量にある。

【0097】

例えば、本発明の第１の態様におけるホモジナイゼーション緩衝液は、０．０１～５００ｍＭ、例えば、０．０５～１００ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、２～１０ｍＭ、または約４ｍＭカルシウム金属イオンキレート剤を含み得、好ましくは、カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである。

【0098】

上記で考察されるように、本発明の第１の態様における細胞培養物ホモジナイゼーションの工程は、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の宿主細胞破片からの精製及び分離のために遠心分離工程を含まない。それでも、ホモジナイゼーション緩衝液中の遊離カルシウムイオン及び／または有効量のカルシウム金属イオンキレート剤に対する耐性を確立するために、溶解細胞のアリコートに対して遠心分離工程を用いた単純な試験を実施することができる。細胞ホモジナイゼーションの後に、溶解細胞のアリコート（例えば、１００ｍＬ）は、遠心分離（例えば、３８，９００ｇで３０分間）に供され、次いで上清及びペレットが分離される。上清中のＡｎｘＡ５タンパク質の量が決定されて、「遊離」ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルを求める。ペレットは、５０ｍＭトリスＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）に撹拌しながら４℃で３０分間再懸濁させられて、いずれの結合したＡｎｘＡ５タンパク質も放出させられ、次いで３８，９００ｇで４℃で３０分間遠心分離され、上清中に放出された結合したＡｎｘＡ５タンパク質の量が決定されて、「結合した」ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルを求める。この関連において、宿主細胞の細胞膜及び／または壁の構成成分へのＡｎｘＡ５の結合のパーセンテージ＝（「結合した」ＡｎｘＡ５タンパク質のレベル／（「結合した」ＡｎｘＡ５タンパク質のレベル＋「遊離」ＡｎｘＡ５タンパク質のレベル））×１００である。

【0099】

好ましくは、上述の方法によって決定するとき、結果として生じるバイオマスホモジネート中の結合したＡｎｘＡ５のパーセンテージは、５０％、４０％、３０％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％未満または実質的に０％である。

【0100】

本明細書において「ホモジナイゼーション緩衝液」と称されるが、この溶液がｐＨ緩衝液であることは必ずしも必須ではない。しかしながら、任意選択で、ホモジナイゼーション緩衝液は、緩衝液（例えば、トリス）を含む追加の構成成分をさらに含んでもよく、任意選択で、例えばｐＨ６～８前後、より好ましくはｐＨ７～８．５の範囲、例えば、約ｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、または８．５に、必要に応じてｐＨ調整されてもよい。一実施形態において、ｐＨ７．４が使用に選択され得る。

【0101】

上記で考察されるように、後続の工程がＭｇ^２＋などの補因子を必要とする酵素での酵素処理を含む、いくつかの選択肢において、補因子をホモジナイゼーション緩衝液中に含めることもまた望ましくあり得る。

【0102】

例となる一実施形態において、本発明の第１の態様において使用するためのホモジナイゼーション緩衝液は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０の水溶液を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0103】

本発明の第１の態様のプロセスは、宿主細胞の培養物からのバイオマスをホモジナイゼーション緩衝液中で、ホモジナイゼーション緩衝液１リットルあたり約１ｇ～３００ｇのバイオマス（湿重量）の濃度で、例えば、ホモジナイゼーション緩衝液１リットルあたり約１０ｇ～２００ｇのバイオマスの濃度で、混合する工程を含み得る。例となる濃度は、約１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、または２００ｇ／Ｌであり得る。ホモジナイゼーション緩衝液１リットルあたり約１００ｇのバイオマスの再懸濁比率が特に好ましい。この関連において、「約」という用語は、定められた値の±５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌを含むことを意図する。

【0104】

混合は典型的に、室温前後、すなわち典型的に１８℃～２８℃前後、例えば、約１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、または２７℃で行う。それを上述の列挙項目から選択される温度でまたはその温度前後（例えば、その±５、４、３、２、または１℃）で維持するように、混合プロセス中に温度を制御することが好ましくあり得るが、この段階での動的な温度制御は通常は必要とされない。

【0105】

任意選択で、ホモジナイゼーション緩衝液はまた、バイオマスとの混合の後であるが、宿主細胞ホモジナイゼーションの前に、酵素処理において有用な１つ以上の酵素を含んでもよいか、またはそれがホモジナイゼーション緩衝液に添加されてもよい。例えば、ホモジナイゼーション後に、宿主細胞由来の核酸（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む）の分解を補助する１つ以上のヌクレアーゼ酵素を含めるまたは添加することが好適であり得る。これは、その後に生産されるホモジネートの粘度を低減し、それによって下流プロセシング工程を補助するであろう。任意の好適な酵素が使用されてよい。酵素は、例えば、ヌクレアーゼＡなどのヌクレアーゼ、好ましくは、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｅｓｃｅｎｓ由来のヌクレアーゼＡであり得る。目的となる１つのそのような例となる酵素は、Ｍｅｒｃｋ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈなどを含む商業的供給源から入手可能な、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼであるＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼであり、これは、タンパク質分解活性を何ら有しない一方で、すべての形態のＤＮＡ及びＲＮＡを分解するために使用することができる。それは、広範な条件に対して有効であり、高い特異的活性を保有する。この酵素は、核酸を２～５塩基長（ハイブリダイゼーション限界未満）の５′－一リン酸末端オリゴヌクレオチドまで完全に消化し、これは、組換えタンパク質からの核酸の除去に理想的であり、核酸汚染に関するＦＤＡガイドラインの遵守を可能にする。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ酵素は、活性化に１～２ｍＭ Ｍｇ^２＋を必要とし、イオン性及び非イオン性洗剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、キレート剤ＥＤＴＡ（１ｍＭ）ならびに尿素の存在下で活性にとどまる（相対的活性は具体的な条件に左右される）。当業者であれば、かかるヌクレアーゼ酵素の有効な濃度を容易に決定可能であろうが、本出願者は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅが、少なくとも、宿主細胞培養物１Ｌあたり約３．３Ｕで、または再懸濁させられたバイオマス１Ｌあたり約１．８５Ｕで予備希釈されて使用されたときに有効であることを特定した。この関連における「約」という用語は、定められた単位数の±９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％を含んでもよい。

【0106】

細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質をホモジナイゼーション緩衝液中で宿主細胞から放出させる工程は、細胞ホモジナイゼーションまたは溶解のための任意の好適な手法を伴い得る。例えば、それは、宿主細胞の細胞壁及び細胞膜障壁が破壊され、それによって、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出するように、宿主細胞を溶解させる、分解させるあるいはホモジナイズする、超音波処理する、または圧力処理することを含み得る。本発明の第１の態様のある特定の選択肢において、この工程は、浸透圧ショック及び／または凍結－融解工程の使用を含まない。

【0107】

本発明の第１の態様の好ましい一実施形態において、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を宿主細胞から放出させる工程は、高圧ホモジナイゼーション、例えば、約４００バール～約２，５００バールで１サイクル以上の高圧ホモジナイゼーション、好ましくは約６００バールのホモジナイゼーション３サイクル、または約８００バールのホモジナイゼーション２サイクルを含む。この関連において、「約」という用語は、定められた値の±５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、または１０バールを含み得る。

【0108】

任意選択で、例えば、核酸を分解するのにヌクレアーゼ酵素が何ら添加されなかった状況において（例えば、Ｍｇ^２＋キレート剤の組み込みなどにより、ホモジナイゼーション緩衝液中のＭｇ^２＋の濃度が低すぎる場合）、核酸を分解し、ホモジネートの粘度を低減するために、複数のさらなる回数の高圧ホモジナイゼーション（例えば、約６００～２５００バールの範囲内の圧力で２～４回）を含めることが有益であり得る。

【0109】

したがって、細胞ホモジナイゼーションの後に、細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質を放出させる工程は、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含むバイオマスホモジネートを作り出し得る。好ましくは、バイオマスホモジネートは均一であり、均一とは、バイオマスの細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または実質的に１００％が分解されるという意味を含む。

【0110】

適用される細胞ホモジナイゼーション手法に応じて、この技法は、ホモジネートの温度の増加を引き起こし得る。温度の望ましくない増加を防止するやり方で細胞ホモジナイゼーション技法を操作する、かつ／または温度の望ましくない増加を防止するように温度制御を適用することが好ましくあり得る。しかしながら、例えば、ホモジネートがＢｅｎｚｏｎａｓｅなどの酵素処理剤を含有する場合、酵素の最適温度範囲に近づけるように、及び好ましくはその範囲内に入るように温度増加を用いることが有利であり得る。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅの場合、約３６～４０℃の範囲の温度が特に好適であり得る。

【0111】

細胞ホモジナイゼーション手順が、金属イオン補因子（例えばＭｇ^２＋）を必要とする酵素での酵素処理を含む場合、及びさらに、ホモジナイゼーション緩衝液がカルシウム金属イオンキレート剤を除外した場合、１つの選択肢において、カルシウムイオンキレート剤が酵素処理の完了後に添加されてもよい。これは、下記で考察されるように清澄化工程の前または後に行われてもよい。

【0112】

細胞ホモジナイゼーションの後に、バイオマスホモジネートは、典型的に、宿主細胞タンパク質、宿主細胞壁構成成分、宿主細胞膜構成成分、宿主細胞核酸、及び内毒素からなる群から選択される不純物のうちの１つ以上（典型的にすべて）をさらに含む。

【0113】

ホモジネートの粘度は、下流プロセシング工程を補助するのに十分に低いことが好ましい。

【0114】

Ｄ．ホモジネートの清澄化
任意選択で、及び好ましい実施形態において、次いでバイオマスホモジネートの生産の後に、それは清澄化工程で処理される。

【0115】

したがって、本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、本プロセスは、バイオマスホモジネートを清澄化し、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物を生産する工程をさらに含む。この工程は、核酸の含量を低減するため、及びさらに、粒子が低減された溶液を得るために実施され、これは下記でさらに考察される捕捉クロマトグラフィーなどの後続の精製工程に適用され得る。

【0116】

任意の好適な清澄化工程または工程の組み合わせを行うことができる。例えば、清澄化プロセスは（好ましくは、ヌクレアーゼ処理に後続して）、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含むバイオマスホモジネートを、セルロースまたはポリプロピレンフィルターなどのフィルターに通す工程を含み得、フィルター流出液は、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物である。

【0117】

好ましくは、フィルターは、デプスフィルターであり、かつ／または好ましくは、フィルターは、４μｍ未満のカットオフ、例えば、３μｍ、２μｍまたは１μｍ未満のカットオフ、最も好ましくは０．２～０．６μｍの範囲内のカットオフを有する。例えば、ホモジネートは、０．６～０．２μｍカットオフデプスフィルターを使用した濾過によって清澄化されてもよく、このようなオフデプスフィルターの例は、市販の、例えば、セルロース系Ｃｕｎｏ ６０ ＳＰデプスフィルターとして入手可能なものなどである。０．６～０．２μｍカットオフを有する好ましいセルロースＣｕｎｏ ６０ ＳＰデプスフィルターほどではないものの、良好な性能（すなわち、生成物損失を伴わない良好な濾過）を提供することが見出された他のデプスフィルターには、０．５μｍカットオフを有するセルロース＋ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒフィルター（例えば、Ｂｅｇｅｒｏｗから入手可能なＰＲ１２ ＵＰ）、１．２μｍカットオフを有するポリプロピレンフィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能なＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２）、０．１μｍカットオフを有するセルロースフィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能なＳａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｓ９）、０．６５μｍカットオフを有するポリプロピレンフィルター（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能なＳａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２）、及び０．２～０．５μｍオフを有するセルロースフィルター（例えば、両方ともＰａｌｌから入手可能なＥＫ １ＰまたはＥＫＭ－Ｐ、これらは良好だが緩徐である）が含まれる。さらなる試験により、より大きなカットオフ（例えば、４μｍ超）を有するフィルターは、中程度の粒子除去しか達成しないことが示されたため、それらはあまり好ましくない。

【0118】

正荷電を持つセルロース系フィルターが清澄化されたホモジネート中のＤＮＡ含量をさらに低減し、したがって、清澄化工程において使用するのに特に好ましいフィルターの部類を代表し得ることもまた、本出願者によって見出された。

【0119】

その上、セルロース系フィルターは、有効な清澄化を提供するために必要とするフィルター面積が、対応するポリプロピレンフィルターが必要とするものよりもより小さいことが見出された。これは、清澄化工程において使用するためにセルロース系部類のフィルターが特に好ましいさらなる理由であり得る。

【0120】

フィルター面積の選択はまた、使用されるホモジナイゼーションの程度及び性質に左右され得る。例えば、本出願者は、細胞ホモジナイゼーションが約６００バールのホモジナイゼーション３サイクルによって行われる場合、ホモジネート１Ｌあたり約６０ｃｍ^２のフィルター面積が好適であるが、一方で、細胞ホモジナイゼーションが約８００バールのホモジナイゼーション２サイクルによって行われる場合、ホモジネート１Ｌあたり約１８０ｃｍ^２フィルター面積が好適であることを見出した。したがって、デプスフィルターは、任意選択で、清澄化されるホモジネート１Ｌあたり１０～５００ｃｍ^２、例えば、３０～４００ｃｍ^２／Ｌ、４０～２５０ｃｍ^２／Ｌ、５０～２００ｃｍ^２／Ｌもしくは６０～１８０ｃｍ^２／Ｌ、例えば、５０～１００ｃｍ^２／Ｌ、もしくは６０～８０ｃｍ^２／Ｌ；または１２０～２４０ｃｍ^２／Ｌ、もしくは１５０～２１０ｃｍ^２／Ｌの面積を有するように選択されてもよい。

【0121】

清澄化後、清澄化された生成物は、後続の工程のための準備として１つ以上のさらなる添加剤の添加によってさらに調整されてもよい。例えば、清澄化された生成物を、（ａ）ポリソルベート及び最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０などの非イオン性洗剤、ならびに（ｂ）ＥＤＴＡなどのカルシウム金属イオンキレート剤（清澄化された生成物が、ホモジナイゼーション緩衝液中へのキレート剤の組み込みに基づいてかつ／または酵素処理工程後のキレート剤の添加によって、十分なレベルのキレート剤をすでに含有するのでない限り）の一方または両方の添加によって、コンディショニングすることが好適であり得る。

【0122】

例となる一実施形態において、清澄化された生成物は、１％非イオン性洗剤（最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０）で約２倍希釈され、カルシウムイオンキレート剤（最も好ましくは、ＥＤＴＡ）が、約２ｍＭの最終濃度になるように添加される。

【0123】

本発明のプロセスのさらなる有利な特長は、下記で考察される陰イオン交換捕捉などのさらなるクロマトグラフ捕捉工程の前に、清澄化された生成物において時間を浪費するいかなる透析工程の必要性もないことである。したがって、本発明の実施形態において、清澄化された生成物は、ＡｎｘＡ５タンパク質のクロマトグラフ捕捉の前に透析に供されない。

【0124】

Ｅ．陰イオン交換捕捉
プロセスは、本発明の第１の態様において、第１の陰イオン交換捕捉工程を行い、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を陰イオン交換樹脂に供する工程をさらに含んでもよい。

【0125】

一般に、陰イオン交換クロマトグラフィーによる細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）ホモジネート／ライセートからのタンパク質捕捉は、大量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡが捕捉樹脂に結合することにより、目標生成物の結合容量に悪影響を及ぼし、さらには樹脂性能に負担をかけるため、第１希望の戦略ではない。しかしながら、本出願者は、本発明の第１の態様による上述の細胞ホモジナイゼーション及び清澄化手順が、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて有効にさらに精製され得るＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供するのに有効であると決定した。

【0126】

したがって、一実施形態において、上記で考察される、ホモジネート／ライセートの清澄化及び／または核酸の分解の工程によって生産される、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物は、第１の陰イオン交換捕捉工程に供されて、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産する。

【0127】

任意選択で、第１の陰イオン交換工程の前に、ｐＨ、伝導率、カルシウムイオンキレート剤のレベル及び非イオン性洗剤のレベルからなる群から選択される、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の環境の１つ以上のパラメータが調整される。例えば、陰イオン交換工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物は、約６．９、任意選択で±１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｐＨ単位のｐＨで製剤化されてもよい（１つの選択肢において、好ましい範囲は、ｐＨ６～８．５、より好ましくはｐＨ６．５～７．５、最も好ましくはｐＨ６．９である）。本出願者は、この範囲前後の低ｐＨ値（例えば、ｐＨ６で）が、溶出された生成物中で検出可能な宿主細胞タンパク質の存在を引き起こす傾向がある一方で、ｐＨ８以上では溶解度がいくらか低減されることを見出した。陰イオン交換工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物は、任意選択で、約２．８ｍＳ／ｃｍ、±１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するように調整されてもよい。清澄化後、清澄化された生成物は、後続の工程のための準備として１つ以上のさらなる添加剤の添加によってさらに調整されてもよい。上記ですでに考察されたように、第１の陰イオン交換工程の前に、陰イオン交換工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物を、（ａ）ポリソルベート及び最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０などの非イオン性洗剤、ならびに（ｂ）ＥＤＴＡなどのカルシウム金属イオンキレート剤（清澄化された生成物が、ホモジナイゼーション緩衝液中へのキレート剤の組み込みに基づいてかつ／または酵素処理工程後のキレート剤の添加によって、十分なレベルのキレート剤をすでに含有するのでない限り）の一方または両方の添加によって、コンディショニングすることが好適であり得る。例となる一実施形態において、陰イオン交換工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物は、１％非イオン性洗剤（最も好ましくはＴｗｅｅｎ８０）で約２倍希釈され、カルシウムイオンキレート剤（最も好ましくは、ＥＤＴＡ）が、約２ｍＭの最終濃度になるように添加される。

【0128】

この関連において、第１の陰イオン交換捕捉工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物をコンディショニングするために非イオン性洗剤及び／またはカルシウム金属イオンキレート剤を使用することは、第１の陰イオン交換捕捉工程によるＡｎｘＡ５タンパク質の宿主細胞由来不純物（細胞壁構成成分、細胞膜構成成分、内毒素、核酸などを含む）からの分離を強化する際に非常に有益であり得る。例えば、本出願者は、非イオン性洗剤及びカルシウム金属イオンキレート剤の存在下で実施されたときの第１の捕捉陰イオン交換工程による内毒素の非常に効率的な除去（９９％前後の低減）を実証した。

【0129】

第２の陰イオン交換精錬工程の関連において下記で主に考察されるが、第１の陰イオン交換捕捉工程に供されるＡｎｘＡ５タンパク質組成物中にカルシウム金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が存在する選択肢において、第１の陰イオン交換捕捉工程の操作が、１種類以上の追加の選択された金属イオン（カルシウムでない）を含むこともまた有益であり得、この追加の選択された金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される。１つの例となる金属イオンは、Ｍｇ^２＋である。

【0130】

典型的に、陰イオン交換樹脂及びＡｎｘＡ５生成物の接触の前に、陰イオン交換樹脂は、平衡化される。任意の好適な平衡化が用いられてよい。例えば、陰イオン交換樹脂は、緩衝液（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４）、非イオン性洗剤（例えば、０．１％ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）及び塩（例えば、２５ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化され得る。任意の好適な平衡化体積が用いられてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において３カラム体積（ＣＶ）が好適な体積であることを見出した。

【0131】

好ましくは、第１の陰イオン交換捕捉工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質に関してポジティブモードで実行され、このため、ＡｎｘＡ５タンパク質は、陰イオン交換工程中に陰イオン交換体に一時的に結合し、典型的に洗浄液がカラムに通されて、結合したＡｎｘＡ５タンパク質から不純物を除去し、次いで、溶出緩衝液を陰イオン交換樹脂に適用して、結合したＡｎｘＡ５タンパク質を放出させることによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物が生産される。

【0132】

本出願者は、強陰イオン交換樹脂がＡｎｘＡ５タンパク質捕捉に関して許容される容量を提供した一方で、弱陰イオン交換樹脂での性能があまり許容されるものでなかったことを見出したため、強陰イオン交換樹脂が好ましい。強陰イオン交換樹脂は、当該技術分野でよく知られており、例としては、トリアルキル塩化アンモニウムもしくは水酸化アンモニウムを有するＩ型樹脂、またはジアルキル２－ヒドロキシエチル塩化アンモニウムもしくは水酸化アンモニウムを有するＩＩ型樹脂などの、第四級アンモニウム官能基を含む樹脂が挙げられる（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅによるＣａｐｔｏ Ｑ、ＢｉｏｒａｄによるＵｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ、またはＭｅｒｃｋによるＥｓｈｍｕｎｏ Ｑ）。弱陰イオン交換樹脂は好ましくなく、例としては、ジエチルアミノエチル官能基を含むＤＥＡＥ樹脂が挙げられる。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ樹脂（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供される）が最も好ましくあり得る。

【0133】

陰イオン交換樹脂の上に負荷した後、ポジティブモード下で、ＡｎｘＡ５タンパク質は、樹脂に一時的に結合し、それを洗浄して不純物を低減／除去することができる。任意の好適な洗浄条件が用いられ得る。例えば、洗浄液は、緩衝液（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４）、非イオン性洗剤（例えば、０．１％ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）及び塩（例えば、２５ｍＭ ＮａＣｌ）の水溶液を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。任意の好適な洗浄体積が使用されてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において１０カラム体積（ＣＶ）が好適な体積であることを見出した。

【0134】

結合したＡｎｘＡ５タンパク質は次いで、溶出緩衝液を使用して陰イオン交換樹脂から放出される。任意の好適な溶出緩衝液が用いられ得る。例えば、溶出緩衝液は、緩衝液（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４）、非イオン性洗剤（例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）及び洗浄液よりも高い濃度の塩（例えば、３００ｍＭ ＮａＣｌ、任意選択で±１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｍＭ）の水溶液を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。任意の好適な溶出体積が使用されてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において９カラム体積（ＣＶ）が溶出に好適な体積であることを見出した。

【0135】

したがって、ＡｎｘＡ５タンパク質は、溶出緩衝液中で捕捉され、これは、第１の陰イオン交換生成物を提供する。

【0136】

陰イオン交換樹脂は次いで、再生され、清浄化され得る。再生及び清浄化に好適な方法は、当該技術分野で知られており、１つのかかる好適なプロトコルが実施例で考察される。

【0137】

典型的には、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物は、宿主細胞から放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の５０％を実質的に超える分を含有する。好ましくは、第１の陰イオン交換生成物は、宿主細胞から放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の６０％、７０％または８０％超を含む。Ｍａｒｄｅｒら（上記参照）のプロセスとの比較の点から、先行技術のプロセスが、およそ５０％以上の大きな生成物損失を示したことは明らかである。例えば、Ｍａｒｄｅｒら（上記参照）のプロセスは、上清を破棄し、ペレットに結合したアネキシンＡ５を収集する、最初の精製遠心分離工程を伴う。Ｍａｒｄｅｒら（上記参照）の、破棄された上清中のアネキシンＡ５とペレットから回収されたアネキシンＡ５との相対的量が、それぞれ図３、２列目及び３列目に示される。その図から、放出されたアネキシンＡ５の約半分がＭａｒｄｅｒら（上記参照）のプロセスにおいて破棄されることにより、低収率の方法につながっていることは明らかである。

【0138】

さらなる比較点として、本出願者は、例となるプロセスの収率が、第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程の終わりに培養物１リットルあたり約５ｇのＡｎｘＡ５タンパク質の収率を提供することを見出しており、これは、培養物１リットルあたり０．９８３ｇの精製アネキシンＡ５タンパク質というＭａｒｄｅｒら（上記参照）において報告される収率よりもはるかに高い（第２段落「結論」を参照されたい）。

【0139】

したがって、本発明の第１の態様において、第１の陰イオン交換生成物が培養物１リットルあたり１ｇ超、２ｇ超、３ｇ超、４ｇ超、または約５ｇのＡｎｘＡ５タンパク質を含むことが好ましい。

【0140】

任意選択で、第１の陰イオン交換生成物は、濾過工程（滅菌濾過工程など）に直接または間接的に供される。例えば、限定することなく、０．４５～０．２μＭ濾過工程が好適であることが見出された。

【0141】

Ｆ．親和性クロマトグラフィー
本出願者はまた、精製工程の順次の追加に伴い収率の損失が増加し続ける傾向がある（生成物が各工程で失われるため）従来の方法とは対照的に、陰イオン交換工程及びヘパリン親和性クロマトグラフィー工程の組み合わせが、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程単独でも得られる高純度を、ただし実質的に増加した収率を伴って（すなわち回収率は、約３０～４０％から約７０～９０％に増加する）、達成するという驚くべき有益性を有することを発見した（例えば、下記の実施例２を参照されたい）。精製工程の追加に関連するこの収率の大きな増加は、精製工程の組み合わせから通常予想されるであろうものとは正反対である。

【0142】

したがって、本発明第２の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物（これは上述の清澄化工程の生成物である場合も、そうでない場合もある）を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスを提供し、本方法は、
第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液（この溶液は、上記で考察される細胞ホモジナイゼーション、清澄化及び／または第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程の直接または間接的生成物である場合も、そうでない場合もある）を陰イオン交換樹脂に供することと、
第１の陰イオン交換生成物を直接または間接的に親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することと、を含む。

【0143】

好ましくは、本発明の第２の態様のプロセスに従って、親和性クロマトグラフィー工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み得、任意選択で、この結合は、カルシウムイオンの存在によって促進され、さらに任意選択で、ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、固定化ヘパリンから溶出される。

【0144】

それに加えて、実施例３で考察されるように、本出願者は、Ｔｗｅｅｎ８０がヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に対して特に有利な効果を有する（Ｔｗｅｅｎ２０などの他のＴｗｅｅｎｓを含めた、他の非イオン性洗剤と比較して）ことを発見した。Ｔｗｅｅｎ ８０を、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に使用される緩衝液中に例えば０．１％（ｗ／ｖ）前後で組み込むことは、ＡｎｘＡ５タンパク質の単一ピークでの溶出を補助し、圧力を低減し、沈殿を防止し得る。

【0145】

したがって、本発明第３の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスを提供し、本方法は、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液（この溶液は、上記で考察される細胞ホモジナイゼーション、清澄化及び／または第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程の直接または間接的生成物である場合も、そうでない場合もある）を、Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で（好ましくは０．１％Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で）ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することを含む。

【0146】

それゆえ、互いから独立してまたは組み合わせてのいずれでも操作され得る、本発明第２及び第３の態様の両方とも（すなわち、本発明の第２の態様におけるヘパリン親和性クロマトグラフィー工程は、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程において使用される緩衝液中にＴｗｅｅｎ ８０（例えば、０．１％（ｗ／ｖ）前後で）を含み得る。

【0147】

より一般には、しかしながら、本発明の第１の態様は、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産する工程を含み得る。例えば上述の方法によって生産される、第１の陰イオン交換生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質は、親和性クロマトグラフィー工程に直接または間接的に（例えば、滅菌濾過及び／またはさらなる構成成分の添加後に）供され得ることが特に好ましくあり得る。

【0148】

したがって、本発明の第１の態様の一実施形態において（それは本発明の第２及び第３の態様の特長のいずれかまたは両方と組み合わされ得る）、本プロセスは、
（ａ）上述の放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含むバイオマスホモジネートが、上述の清澄化プロセスによって清澄化され、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む清澄化された生成物を生産する工程と、
（ｂ）上述の第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、清澄化された生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質が、陰イオン交換樹脂に供される工程と、
（ｃ）第１の陰イオン交換生成物中の該ＡｎｘＡ５タンパク質が、親和性クロマトグラフィー工程に（直接または間接的に）供される工程と、を含む。

【0149】

好ましくは、親和性クロマトグラフィー工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み、任意選択で、結合は、カルシウムイオンの存在によって促進される。

【0150】

したがって、ヘパリン親和性工程の前に、ＡｎｘＡ５生成物は、カルシウムイオン（例えば、ＣａＣｌ_２）、非イオン性洗剤（好ましくはＴｗｅｅｎ８０）のうちのいずれか１つ以上の添加によってコンディショニングされ得、任意選択で、緩衝され得る（例えば、ｐＨ７．４のトリス緩衝液）。限定することなく、本出願者は、濾過された陰イオン交換生成物が、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及び２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する希釈緩衝液で約８倍希釈される場合の有益な効果を実証した。

【0151】

したがって、ＡｎｘＡ５生成物がポリソルベート８０でコンディショニングされることが好ましくあり得、より好ましくは、ポリソルベート８０は、約０．０１％超～最大約１０％（ｗ／ｖ）、例えば、約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％の最終濃度にある。この関連における「約」という用語は、定められた値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％を指す。

【0152】

カルシウムでの希釈は、アネキシンＡ５が固定化ヘパリンクロマトグラフィーに結合することを可能にする。この相互作用は、イオン性相互作用と比較して、緩徐である。接触時間は重要であり、したがってこのクロマトグラフィーは、好ましくは、１００ｃｍ／ｈ以下で行われる。

【0153】

親和性クロマトグラフィーカラム（例えば、ヘパリン親和性クロマトグラフィーカラム）の負荷において使用される条件は、ＡｎｘＡ５タンパク質のヘパリンへの結合を許容する。つまり、親和性クロマトグラフィーは、典型的に、ＡｎｘＡ５タンパク質に関してポジティブモードで実行される。

【0154】

親和性クロマトグラフィーカラム（例えば、ヘパリン親和性クロマトグラフィーカラム）には、所望のレベルのＡｎｘＡ５生成物を負荷することができる。例えば、負荷は、カラム樹脂体積１リットルあたり約５ｇで、またはそれを超えて、例えば、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ以上で実施されてもよい。この関連における「約」という用語は、定められた値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％を指す。実際、本出願者は、カラム樹脂体積１リットルあたり約２０～３０ｇのＡｎｘＡ５生成物の負荷が、プロセス効率ならびに生成物精製及び回収の点で、非常に満足のいく結果を提供することを見出した。かかる高負荷量の関連において、本出願者は、負荷される混合物中のポリソルベート８０の存在が、ＡｎｘＡ５タンパク質沈殿または不溶性を回避する上で特に有益であることを見出した。ポリソルベート８０の使用の不在下では、沈殿及び背圧の増加が観察され、親和性クロマトグラフィー工程は、効率性が低下する。実施例３及び４を参照されたい。

【0155】

ＡｎｘＡ５タンパク質の負荷後、カラムは、典型的に１回以上洗浄されて、不純物が除去される。任意の好適な洗浄プロトコルが使用されてよい。本出願者は、限定することなく、好適な洗浄プロトコルが２段階洗浄を含むことを見出した。例えば、第１の洗浄段階において、洗浄は、カルシウムを含有する第１の洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、２ｍＭ ＣａＣｌ_２）を使用して行われ得る。第１段階の洗浄の体積は、所望の結果及び使用される洗浄液の厳密な性質に応じて変えられてもよい。限定することなく、本出願者は、例えば、上述の例となる洗浄緩衝液が、１５ＣＶの洗浄の場合に成功裏に使用され得ることを見出した。第２段階の洗浄において、洗浄緩衝液は、カルシウムを、第１の洗浄よりも低い量で含有し得るか、または好ましくは、カルシウムを含有しない（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）。第２段階の洗浄の体積は、所望の結果及び使用される第２段階の洗浄液の厳密な性質に応じて変えられてもよい。限定することなく、本出願者は、例えば、上述の例となる洗浄緩衝液が、２ＣＶの洗浄の場合に成功裏に使用され得ることを見出した。

【0156】

それ以降、ＡｎｘＡ５タンパク質は、溶出緩衝液を使用して親和性クロマトグラフィーカラムから溶出され、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を提供する。ヘパリン親和性クロマトグラフィーカラムを使用する場合、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのカルシウム金属イオンキレート剤を含む溶出緩衝液を使用することが好ましくあり得る。

【0157】

例えば、限定することなく、本出願者は、好適な溶出緩衝液が２０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌであることを見出しており、これはカルシウムイオンをキレートする。キレート反応は、カルシウムの存在下でのみヘパリンに結合し得るアネキシンＡ５を特異的に溶出する。

【0158】

生成物の濃度を増加させるために、溶出中に流速を１００ｃｍ／ｈ未満にまで低減することが好ましくあり得る。例えば、限定することなく、実施例において、本出願者は、溶出において流速を６０ｃｍ／ｈ以下にまで低減することによって濃縮溶出を可能にした。完全な溶出ピークは、例えば、０．０５ＡＵでＵＶシグナルの上昇から開始して、下行ピークにおける０．０５ＡＵまでで収集され得、これはおよそ７ＣＶに相当する。好ましくは、溶出プロファイルは、単一ピークを示し、これは最も理想的には鋭いピークである。

【0159】

したがって、第１の親和性クロマトグラフィー生成物は、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質及びＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含み、任意選択で、このカルシウムイオンキレート剤は、約０．１ｍＭ～５００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲で、より典型的には約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲で、より好ましくは約５ｍＭ～約１５ｍＭの範囲で存在し、最も好ましくは約１０ｍＭである。この関連において「約」という用語は、定められた濃度（複数可）の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％の意味を含み得る。

【0160】

親和性クロマトグラフィー工程は、本プロセススキームにおいて最も有力な精製工程であり得る。ＡｎｘＡ５タンパク質は、カルシウムイオンに結合し、このカルシウムに結合した状態において、生成物は、ヘパリンとの高度に特異的な結合を形成できる。典型的には、カルシウムと錯化する能力を有する正しく折り畳まれたＡｎｘＡ５タンパク質形態のみがヘパリンに結合できる。それによって、親和性クロマトグラフ工程は、正しく折り畳まれた生成物と誤って折り畳まれた生成物との間の識別を補助するのに有用であり得る。それに加えて、中間工程は、高度に特異的な相互作用が、カルシウムのＥＤＴＡでのキレート反応による特異的な溶出モードと組み合わされるとき、高い除去係数に達する。したがって、ＤＮＡ含量の中程度の低減と組み合わせて、内毒素及びＨＣＰの強力な低減が観察される。内毒素は、先行する陰イオン交換捕捉工程中に典型的にすでに低減されているが（好ましくは約９７％）、さらに低減され（好ましくは約９９％）、これは、好ましくは、内毒素レベルを、第１の陰イオン交換捕捉工程の前の清澄化された生成物中のレベルの約０．０３％まで推移させる。

【0161】

Ｇ．陰イオン交換精錬
本発明の第１、第２及び／または第３の態様のさらなる実施形態において、ＡｎｘＡ５生成物（例えば、親和性クロマトグラフィー工程によって生産された）は、陰イオン交換精錬工程によって直接または間接的にさらに精製されてもよい。

【0162】

親和性クロマトグラフィー工程によって生産されたＡｎｘＡ５生成物が陰イオン交換精錬工程によって間接的にさらに精製される場合、親和性クロマトグラフィーの工程及び陰イオン交換精錬工程は、１つ以上のコンディショニング添加剤の、親和性クロマトグラフィー工程の生成物への添加によって分離されてもよい。

【0163】

好適な添加剤には、例えば、親和性クロマトグラフィー生成物の生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質をさらに希釈するための希釈剤（例えば、水）、緩衝液（例えば、トリス、例えば、３５ｍＭ及びｐＨ８で）、非イオン性洗剤（例えば、ポリソルベート、より好ましくはＴｗｅｅｎ８０、約０．１ｗ／ｖ％の濃度などで）、及び／または下記で考察される本発明の第４の態様に基づく１つ以上のさらなる添加剤が含まれ得る。

【0164】

換言すれば、本発明の第４の態様は、カルシウム金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が陰イオン交換工程の有効性に悪影響を及ぼし得るという本出願者の気づきに基づく。遊離ＥＤＴＡ（または他のキレート剤）は、陰イオン交換官能基に直接結合し得、それによって、陰イオン交換工程によって達成される容量、及びさらには分離も低減する。これは、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程の生成物に対して陰イオン交換を行う場合に特に問題であり、この場合、ＡｎｘＡ５タンパク質がカルシウムイオンの存在下でヘパリンに結合しており、するとカルシウム金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）は、結合したＡｎｘＡ５タンパク質を溶出するのに使用される。結果として、溶出されたヘパリン親和性クロマトグラフィー工程のＡｎｘＡ５生成物は高レベルのカルシウムイオンキレート剤を含有する。ＡｎｘＡ５生成物をさらなる陰イオン交換工程でさらに精製できることが一般に望ましいが、カルシウムイオンキレート剤は、そのさらなる陰イオン交換工程中に問題となる構成成分である。他方で、陰イオン交換工程前にカルシウム金属イオンキレート剤を除去しようとする試みは、時間を浪費し、しがたって費用もまた増加させる。したがって、例えば、緩衝液交換のために透析工程を伴う先行技術の方法は、緩徐で非効率的であり、このため生産費用を増加させる。さらに、陰イオン交換工程中にカルシウム金属イオンキレート剤をＡｎｘＡ５生成物に組み込むことは、ＡｎｘＡ５タンパク質の、内毒素を含む不純物へのカルシウム媒介性結合を防止するために重要な構成要素であり得る。したがって、カルシウムイオンキレート剤の陰イオン交換樹脂への結合を遮断または低減するが、それでも陰イオン交換工程が、透析に関連する不都合及び費用を伴わずに、また陰イオン交換工程中のカルシウム金属イオンキレート剤の有益な効果を阻止することなく行われることを可能にする、添加剤を導入することは、好都合かつ効果的であろう。

【0165】

本出願者は、陰イオン交換の前にＡｎｘＡ５タンパク質生成物へのまたは１種類以上の追加の選択された金属イオンの組み込みによってこれが達成され得ることに気づき、この追加の選択された金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される。適切な追加の金属イオンの選択は、カルシウムイオンキレート剤の性質及び陰イオン交換樹脂の性質に左右されるであろう。例えば、ＥＤＴＡをカルシウムイオンキレート剤として使用する場合、Ｍｇ^２＋イオンが一般に本発明の目的を達成するのに好適であり、陰イオン交換工程の前にＡｎｘＡ５タンパク質生成物に添加され得る。

【0166】

したがって、本発明の第４の態様は、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、
該プロセスが、陰イオン交換工程を行い、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質を組成物から回収及び／または精製するために、組成物を陰イオン交換樹脂に供することを含むことを特徴とし、
該陰イオン交換工程が、追加の選択された金属イオンの存在下で実施されることをさらに特徴とし、
この追加の選択された金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される、プロセスを提供する。

【0167】

好ましくは、追加の選択された金属イオンは、組成物に陰イオン交換樹脂に供される前に、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物と混合される。後続の陰イオン交換工程において使用される溶液（例えば、洗浄液及び／または溶出緩衝液）は、追加の選択された金属イオンもまた含む場合も、含まない場合もある。したがって、本発明のこの態様の一実施形態において、追加の選択された金属イオンの存在下で陰イオン交換工程を実施する工程は、組成物に陰イオン交換樹脂に供される前に、追加の選択された金属イオンを、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物に添加すること指す。

【0168】

本発明の第４の態様の一実施形態において、カルシウム金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはその塩、ＥＧＴＡまたはその塩から選択され、最も好ましくはＥＤＴＡである。

【0169】

カルシウム金属イオンキレート剤は、約０．１ｍＭ～５００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲、より典型的には約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲を超過して、及び／またはその濃度で、例えば、約０．１ｍＭ、０，５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ以上または少なくともその濃度で、組成物中に存在し得る。この関連において、「約」という用語は、定められた値の±０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍＭの意味を含み得る。上述の関連において、「超過」という用語は、先行する親和性クロマトグラフィー工程におけるカラム上の固定化ヘパリンへのＡｎｘＡ５タンパク質の結合に寄与し得るいずれの二価イオンも除去するのに十分な量のカルシウム金属イオンキレート剤が存在し、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質がカラムから溶液に放出され、次いで陰イオン交換精錬工程において直接または間接的に使用されることを可能にする、という意味を含み得る。

【0170】

本発明の第４の態様の例となる一実施形態において、選択された金属イオンは、Ｍｇ^２＋イオンなどの二価陽イオンである。

【0171】

選択された金属イオンが、陰イオン交換工程中、組成物を陰イオン交換樹脂に供するプロセス中にカルシウムイオンキレート剤と陰イオン交換樹脂との間の相互作用を低減する（約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上など）または防止するのに有効な量で存在することが好ましくあり得る。例えば、選択された金属イオンは、陰イオン交換工程中、組成物の陰イオン交換樹脂への負荷中及び／またはＡｎｘＡ５タンパク質が陰イオン交換樹脂に結合し、不純物が洗浄によって除去される１つ以上の洗浄工程中に、カルシウムイオンキレート剤と陰イオン交換樹脂との間の相互作用を低減するまたは防止するのに有効な量で存在し得る。

【0172】

選択された金属イオンが、陰イオン交換工程中、カルシウムイオンキレート剤の存在下でのＡｎｘＡ５タンパク質の陰イオン交換樹脂への結合を増加させるのに有効な量で存在して、それによって、陰イオン交換工程の素通り画分におけるＡｎｘＡ５タンパク質の損失を、選択された金属イオンが陰イオン交換工程中に存在しない場合に観察される損失のレベルと比較して低減する（約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上など）ことが好ましくあり得る。

【0173】

選択された金属イオンが、陰イオン交換工程中、約１～約１００ｍＭ、例えば、約２～約５０ｍＭ、約５～約２５ｍＭ、約１０～約１５ｍＭまたは約１２．５ｍＭの濃度で存在することが好ましくあり得る。

【0174】

さらに、カルシウム金属イオンキレート剤が、ＥＤＴＡであり、該選択された金属イオンは、Ｍｇ^２＋イオンであり、より好ましくは、Ｍｇ^２＋イオン対ＥＤＴＡのモル比は、０．５：１～２：１の範囲、最も好ましくは少なくとも１：１または１：１超であることが好ましくあり得る。

【0175】

本発明の第４の態様の関連において、さらなる実施形態では、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含み、陰イオン交換樹脂に供される組成物は、ＡｎｘＡ５タンパク質を親和性クロマトグラフィー工程に供し、ＡｎｘＡ５タンパク質をカルシウムイオンキレート剤で溶出し、それによって、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物である親和性クロマトグラフィー生成物を生産する工程を含む、先行するプロセスの直接または間接的生成物であり得る。例えば、先行する親和性クロマトグラフィー工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み得、任意選択で、この結合は、カルシウムイオンの存在によって促進され、さらに任意選択で、ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＥＤＴＡなどのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して、固定化ヘパリンから溶出される。

【0176】

直接または間接的生成物の陰イオン交換工程への適用の前に、先行する親和性クロマトグラフィー工程と陰イオン交換工程との間に透析工程は存在せず、かつ／または先行する親和性クロマトグラフィー工程の生成物からのカルシウムイオンキレート剤の除去は行われないことがさらに好ましくあり得る。

【0177】

本発明の第４の態様の関連において、さらなる実施形態では、選択された金属イオンは、陰イオン交換工程の前に、またはその最中に組成物に添加される。

【0178】

好ましい実施形態において、本発明の第１、第２または第３の態様のいずれかによる親和性クロマトグラフィー工程の生成物は、本発明の第４の態様における陰イオン交換工程などの、さらなる陰イオン交換工程で処理される。

【0179】

任意選択で、（第２の）精錬陰イオン交換工程の前に、ＡｎｘＡ５タンパク質の濃度、ｐＨ、伝導率、カルシウムイオンキレート剤のレベル及び非イオン性洗剤のレベル、または選択された追加の金属イオンのレベル（本発明の第４の態様において）からなる群から選択される、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質の環境の１つ以上のパラメータが調整される。

【0180】

典型的に、精錬工程の（第２の）陰イオン交換樹脂及びＡｎｘＡ５生成物の接触の前に、陰イオン交換樹脂は、平衡化される。任意の好適な平衡化が用いられてよい。例えば、陰イオン交換樹脂は、緩衝液（例えば、２０ｍＭトリスｐＨ７．４）、非イオン性洗剤（例えば、０．１％ポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）及び塩（例えば、２５ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化され得る。任意の好適な平衡化体積が用いられてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において３カラム体積（ＣＶ）が好適な体積であることを見出した。

【0181】

好ましくは、（第２の）陰イオン交換精錬工程は、ＡｎｘＡ５タンパク質に関してポジティブモードで実行され、このため、ＡｎｘＡ５タンパク質は、陰イオン交換工程中に陰イオン交換体に一時的に結合し、典型的に洗浄液がカラムに通されて、結合したＡｎｘＡ５タンパク質から不純物を除去し、次いで、溶出緩衝液を陰イオン交換樹脂に適用して、結合したＡｎｘＡ５タンパク質を放出させることによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第２の陰イオン交換生成物が生産される。

【0182】

強陰イオン交換樹脂が好ましい。強陰イオン交換樹脂は、当該技術分野でよく知られており、例としては、トリアルキル塩化アンモニウムもしくは水酸化アンモニウムを有するＩ型樹脂、またはジアルキル２－ヒドロキシエチル塩化アンモニウムもしくは水酸化アンモニウムを有するＩＩ型樹脂などの、第四級アンモニウム官能基を含む樹脂が挙げられる。限定することなく、第２の精錬工程に好適な陰イオン交換樹脂の一例としては、Ｓｏｕｒｃｅ１５ Ｑが挙げられる。Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ陰イオン交換樹脂は、ポリマー強陰イオン交換体として定義され得、第四級アンモニウムリガンド、約１５μｍの累積体積分布による粒度中央値（ｄ_５０ｖ）、ポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリックス、及び／またはベッド高さ１０ｃｍでのＦｉｎｅＬｉｎｅ １００カラムとして評価したときに約４００ｃｍ／ｈ、１０００ｋＰａの圧力／流動規格を有するものとして、さらに特徴付けられ得る。

【0183】

限定することなく、第２の精錬工程に好適な陰イオン交換樹脂のさらなる例としては、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓが挙げられる。Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓは、強陰イオン交換体として定義され得、第四級アミンリガンド、高流速アガロースマトリックス、約３６～４４μｍの粒度中央値（ｄ_５０ｖ）、約０．１５～０．１８ｍｍｏｌ Ｃｌ^－／溶媒ｍｌのイオン容量、５５ｍｇ超のＢＳＡ及び４８ｍｇ超のβ－ラクトグロブリンの結合容量／クロマトグラフィー溶媒ｍｌ、及び／またはベッド高さ２０ｃｍでの１ｍ直径カラムとして評価したときに少なくとも２２０ｃｍ／ｈで約３００ｋＰａの圧力／流動規格を有するものとして、さらに特徴付けられ得る。

【0184】

理論に拘束されることなく、本出願者は、精製対象のＡｎｘＡ５タンパク質が、組換え源（例えば、細菌が発現するＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化をなくす、またはグルコノイル化を低くする、Ａｏｎら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８，７４（４）：９５０－９５８（その内容は参照により本明細書に組み込まれる））に記載されるような、ＰＧＬを過剰発現するようにさらに操作されているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に由来する場合、（第２の）陰イオン交換精錬工程にＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂を使用することが特に有利であり得ることを見出した。この関連において「低い」とは、次いで、グルコノイル化のレベルが、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（例えば、広く市販されており、Ｍａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３３に記載されるようなもの）において発現されるＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化のレベル未満（そのレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満など）である、という意味を含み得る。例えば、（第２の）陰イオン交換精錬工程のためにＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂に適用される生成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルは、適用される生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の全含量の０．５～３０％、または０．５～２０％、または０．５～１５％、または０．５～１０％の範囲内であることが可能である。Ａｎｘ５のグルコニル化（ｇｕｌｕｃｏｎｙｌａｔｅｄ）バリアントは、例えば、適切な陰イオン交換または逆相カラムを使用した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィー器具を使用することによって、測定及び定量することができる。様々なピークを、質量分析法（ＭＳ）を用いてさらに特定及び特徴付けすることができる。

【0185】

本出願者は、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂が高結合容量を有し、背圧を伴わずに高流速に耐え、より高いベッド高さで充填され得、より低い価格を有することから、精製対象のＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化がないか、またはそのレベルが低い場合、（第２の）陰イオン交換精錬工程のためのＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂の使用が、さらにより効率的なプロセスをもたらす（例えば、（第２の）陰イオン交換精錬工程のためのＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ陰イオン交換樹脂の使用と比較して）ことを見出した。最終生成物の品質及び純度は、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑが使用されるかＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂が使用されるかとは無関係に維持される。しかしながら、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ陰イオン交換樹脂（１５μｍ粒度を有する）からＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂（４０μｍ粒径を有する）への切り替えが、全プロセスの操作に必要とされる時間を削減することによって（特に、精錬に使用される第２の陰イオン交換工程は、最も時間を浪費する工程のうちの１つであるため）、約５倍（５×）を超え得る生産性増加を提供し、また全体的な製造費用を約５０％を超えて削減可能であり得ることが推定される。非常に小さなビーズ径（３０μｍ未満）を有する樹脂の回避は、高流速を可能にし、クロマトグラフィーカラムが、許容できない背圧を引き起こすことなくより高い樹脂ベッド高さで充填されることを可能にする。これは、所与の床面積（カラム直径）に対して、より多くの樹脂がカラムに充填され得、したがってより多くのタンパク質が結合され得るため、生産性を増加させ、それと同時に、より高い流速に起因してより高速の操作を可能にする。

【0186】

精錬のために（第２の）陰イオン交換樹脂の上に負荷した後、ポジティブモード下で、ＡｎｘＡ５タンパク質は、樹脂に一時的に結合し、それを洗浄して不純物を低減／除去することができる。任意の好適な洗浄条件が用いられ得る。例えば、洗浄液は、緩衝液（例えば、２０ｍＭビス－トリス、ｐＨ７）、及び塩（例えば、２５ｍＭ ＮａＣｌ）、及び任意選択で、非イオン性緩衝液（例えば、約０．１ｗ／ｖのレベルなどでのポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）の水溶液を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。任意の好適な洗浄体積が使用されてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において３カラム体積（ＣＶ）が好適な体積であることを見出した。

【0187】

結合したＡｎｘＡ５タンパク質は次いで、溶出緩衝液を使用して陰イオン交換樹脂から放出される。任意の好適な溶出緩衝液が用いられ得る。例えば、溶出緩衝液は、緩衝液（例えば、２０ｍＭビス－トリス、ｐＨ７）、洗浄液よりも高い濃度での塩（例えば、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、任意選択で±１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｍＭ）及び任意選択で、非イオン性緩衝液（例えば、約０．１ｗ／ｖのレベルなどでのポリソルベート、好ましくはＴｗｅｅｎ８０）の水溶液を含み得る、それから本質的になる、またはそれからなる。任意の好適な溶出体積が使用されてよく、限定することなく、本出願者は、例となる実施形態において、溶出緩衝液の濃度を直線勾配で０から１００％にまで増加させながらの３３カラム体積（ＣＶ）が、溶出に好適であることを見出した。

【0188】

このようにして、ＡｎｘＡ５タンパク質は溶出緩衝液中に放出され、これは、（第２の）精錬された陰イオン交換生成物を提供する。実施例１で考察されるように、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を用いて実施されたプロセスは、中間プロセス後の生成物収率をおよそ３０％増加させた。

【0189】

（第２の）陰イオン交換樹脂は次いで、再生され、清浄化され得る。再生及び清浄化に好適な方法は、当該技術分野で知られており、１つのかかる好適なプロトコルが実施例で考察される。

【0190】

精錬工程は、生成物に関連する不純物の低減、例えば、様々なアネキシンＡ５アイソフォームの分離のために、主に実施される。それに加えて精錬工程は、残留ＤＮＡに対するプロセスにおいて最も高い除去係数に達し、ＨＣＰを強力に低減する。内毒素は、中間工程後にすでに低レベルにあるが、約９９％さらに低減され、これは（先行する細胞ホモジナイゼーション、ヌクレアーゼ処理、清澄化、捕捉陰イオン交換、濾過（滅菌濾過工程など）、及びヘパリン親和性工程と組み合わせて用いられるとき）、内毒素レベルを、第１のＡＸ工程の前の清澄化された生成物中のレベルの約０．０００３％まで推移させる。

【0191】

したがって、本発明の第１、第２、第３の及び／または第４の態様のさらなる実施形態において、組換え的に発現され細胞内アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、細胞壁を持つ宿主細胞、または本発明の第１の態様における培養物からの回収及び／または精製のためのプロセスが提供され、好ましくは、本プロセスは、組換え的に発現された細胞内ＡｎｘＡ５タンパク質の、宿主細胞の培養物からの回収及び／または精製を含み、この培養物は、少なくとも約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、約１，０００Ｌ、約２，０００Ｌ、約３，０００Ｌ、約４，０００Ｌ、約５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約７，００００Ｌ、約８，００００Ｌ、約９，００００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約２０，０００Ｌ、約３０，０００Ｌ、約４０，０００Ｌ、約５０，０００Ｌ、約６０，０００Ｌ、約７０，００００Ｌ、約８０，００００Ｌ、約９０，００００Ｌ、約１００，０００Ｌまたはそれよりも高い体積を有し、
（ａ）本プロセスは、本発明の第１の態様に従って、細胞内タンパク質を、非イオン性洗剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で宿主細胞から放出させることを含み、
（ｂ）任意選択で、放出工程は、小節Ｃに上述される本発明の第１の態様の実施形態のうちのいずれか１つ以上に従い、
（ｃ）さらに任意選択で、本プロセスは、小節Ｄに上述される実施形態のうちのいずれか１つ以上によりバイオマスホモジネートを清澄化する工程を含み、
（ｄ）本プロセスは、小節Ｅに上述される実施形態のうちのいずれか１つ以上に従って第１の陰イオン交換工程を行い、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に陰イオン交換樹脂に供する工程をさらに含み、
（ｅ）本プロセスは、小節Ｆに上述される本発明の第１、第２及び／または第３の態様のうちのいずれかに従って、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に親和性クロマトグラフィー工程に供する工程をさらに含み、
（ｆ）親和性クロマトグラフィー工程の生成物は、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物であり、
（ｇ）ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む、親和性クロマトグラフィー工程の直接または間接的生成物は、この節（すなわち節Ｇ）に上述される実施形態のいずれかに従って陰イオン交換工程に供される。

【0192】

Ｈ．生成物製剤化
本発明の第１、第２、第３または第４の態様のいずれかのプロセスは、好ましくは本プロセスの終わりに、濃縮、緩衝液変更、コンディショニング及び濾過（滅菌濾過工程など）からなる群から選択される１つ以上のさらなる工程、ならびに任意選択で、ＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器中に貯蔵する最終工程をさらに含んでもよい。

【0193】

例えば、生成物製剤化に使用されるさらなる工程のうちの１つは、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）であり得、任意選択で、ＵＦ／ＤＦ工程の生成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度でＡｎｘＡ５タンパク質を含有する。

【0194】

別の例において、生成物製剤化に使用されるさらなる工程のうちの１つは、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート、及びより好ましくはＴｗｅｅｎ８０の添加であり得る。非イオン性界面活性剤は、最終生成物のために所望される量で、例えば、約０．０５％（ｗ／ｗ）（例えば、±０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１ｗ／ｖ％）の最終濃度になるように、添加され得る。

【0195】

別の例において、生成物製剤化に使用されるさらなる工程のうちの１つは、例えば、０．４５～０．２μｍフィルターまたは０．２２μｍフィルターを使用した、濾過工程（滅菌濾過工程など）であり得る。

【0196】

上記に示されるように、本発明の第１、第２、第３または第４の態様に記載のプロセスは、滅菌濾過工程、及び滅菌濾過されたＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器に入れる工程で完結してもよい。

【0197】

充填された容器中のＡｎｘＡ５タンパク質の最終濃度は、必要に応じて調整されてもよい。限定することなく、本出願者は、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を例として示した。好適な濃度は、例えば、１～１２５ｍｇ／ｍＬ、２～１００ｍｇ／ｍＬ、５～５０ｍｇ／ｍＬ、７～３０ｍｇ／ｍＬまたは約１０～２０ｍｇ／ｍＬであり得る。

【0198】

任意選択で、本発明のプロセスは、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ（例えば、±５０、４０、３０、２０または１０ｍＭ）、約１ｍＭ ＣａＣｌ_２（例えば、±５００、４００、３００、２００、１００、または５０μＭ）、約０．０５％（ｗ／ｗ）（例えば、±０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１ｗ／ｖ％）のＴｗｅｅｎ８０などのポリソルベート、または他の非イオン性洗剤を含む、約ｐＨ７．４（例えば、±０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｐＨ単位）の無リン酸緩衝液（ビス－トリスまたはトリス緩衝液など）中に、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供し得る。約７．４のｐＨは、それがヒトの血液中のｐＨに一致し、良好な溶解度とともに安定なＡｎｘＡ５タンパク質を提供するため、ヒトにおける使用に（とりわけ静脈内送達に）意図される製剤に関する典型的な目標ｐＨである。ｐＨ７を下回ると、特にｐＨ６前後まで低下すると、ＡｎｘＡ５タンパク質は溶解度を失い、沈殿し始める可能性がある。

【0199】

ＮａＣｌは、貯蔵中にＡｎｘＡ５生成物を単量体形態で維持するのに有用であり得る。したがって、本発明のプロセスは、存在するＮａＣｌ濃度がＡｎｘＡ５タンパク質を主として（つまり、約５０％超、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または実質的に１００％）単量体である形態で維持する、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供し得る。単量体レベルパーセンテージは、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの、当該技術分野で周知の技法を用いて容易に決定することができる。

【0200】

一実施形態において、本発明のプロセスは、宿主細胞培養物１Ｌあたり１ｇ超、より好ましくは少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは約２～約４ｇ／Ｌの範囲のＡｎｘＡ５タンパク質の全収率で、治療上許容される最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供する。この関連において、「約」という用語は、定められた値の±０．４、０．３、０．２または０．１ｇ／Ｌを含み得る。

【0201】

別の実施形態において、本発明のプロセスは、宿主細胞培養物中からに存在するＡｎｘＡ５タンパク質の少なくとも約２４重量％（例えば、±１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％）、またはそれよりも多くのＡｎｘＡ５タンパク質の全回収率で、治療上許容される最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供する。これは、例えば、最初のホモジネート中（これは、ホモジネートのアリコートを遠心分離し、上清中のＡｎｘＡ５のレベルを試験することによって捕捉及び測定することができる）及び最終精製生成物中の可溶性ＡｎｘＡ５タンパク質を測定することによって、決定することができる。

【0202】

それに加えて、本プロセスの任意の時点で（関連性があれば、滅菌容器を充填する前に）、及び典型的に上述の最終精製工程の後に、ＡｎｘＡ５タンパク質は、化学修飾され得る。例えば、ＡｎｘＡ５タンパク質は、ＰＥＧ化され得る。ＰＥＧ化アネキシンＡ５は、ＷＯ０２／０６７８５７に開示される。ＰＥＧ化は、当業者に周知の方法であり、ここにおいてポリペプチドまたはペプチド模倣化合物（本発明においては、ＡｎｘＡ５タンパク質）は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が、１つ以上のアミノ酸またはその誘導体の側鎖に共有結合するように修飾されている。それは、最も重要な分子変化構造化学技法（ＭＡＳＣ）のうちの１つである。他のＭＡＳＣ技法が使用されてもよく、かかる技法は、例えば、分子の体内半減期を延長するなど、分子の薬カ学的特性を改善し得る。ＰＥＧ－タンパク質複合体は、まずＰＥＧ部分を、それが本発明のタンパク質またはペプチド模倣化合物と反応して、それにカップリングするように活性化することによって形成される。ＰＥＧ部分は、分子量及び立体配座において相当に異なり、このうち初期の部分（一官能性ＰＥＧ、すなわちｍＰＥＧ）は分子量が１２ｋＤａ以下の線状であり、より後期の部分は増加した分子量のものである。ＰＥＧ技術における最近の革新であるＰＥＧ２は、３０ｋＤａ（またはそれ未満）のｍＰＥＧのリジンアミノ酸へのカップリングを伴い（とはいえＰＥＧ化は、ＰＥＧの他のアミノ酸への付加に拡張され得る）、それがさらに反応させられて、はるかにより大きな分子量の線状ｍＰＥＧのような挙動を示す分岐状構造を形成する（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＥＧ分子をポリペプチドに共有結合させるために使用され得る方法が、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，５４，４５９ － ４７６、Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ５７，５ － ２９、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７２，２１７ － ２２４、及びＶｅｒｏｎｅｓｅ（２００１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２，４０５ － ４１７ならびに同文献中で言及される参考文献にさらに記載される。ＰＥＧ化の利点には、低減された腎クリアランスが含まれ、これは一部の生成物に関して、投与後のより持続される吸着ならびに制限された分布をもたらすことにより、一定で持続される血漿中濃度、及びそれゆえに臨床効果の増加につながる可能性がある（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０，５３９ － ５５１）。更なる利点には、治療化合物の低減された免疫原性（Ｒｅｄｄｙ（２００１）Ａｎｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，３４，９１５ － ９２３）、及びより低い毒性（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｄｒｕｇｓ １５，４１９ － ４２９）が含まれ得る。ＡｎｘＡ５タンパク質が化学修飾される場合、例えば、未反応の構成成分を低減するもしくは除去するため、及び／または最終生成物への組み込み用に化学修飾ＡｎｘＡ５タンパク質の均一集団を選択するために、１つ以上の追加の精製工程を行うことが好適であり得る。化学修飾タンパク質の、反応プロセスからの精製に好適な技法は、当業者に知られている。

【0203】

最終生成物は、薬学的もしくは獣医学的組成物であり得るか、またはそれを形成するようにその後製剤化され得る。

【0204】

最終生成物は、単位剤形で提示されてもよい。例えば、単位剤形は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇのＡｎｘＡ５タンパク質（「約」という用語は、±０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｍｇを指す）、または例えば、０．１～１０００ｍｇ、または１～１００ｍｇの範囲内でそれよりも多くを含有し得る。

【0205】

薬学的または獣医学的組成物は、ＡｎｘＡ５タンパク質を、薬学的にまたは獣医学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混和して含み得、これらは典型的に、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択される。組成物は、即時放出、遅延放出または制御放出用途の形態にあってもよい。好ましくは、製剤化は、活性成分の１日用量もしくは単位、１日部分用量もしくはその適切な割合を含有する単位用量である。

【0206】

「薬学的または獣医学的許容される」という語句は、適宜、動物またはヒトに投与されたときに、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない組成物への言及を含む。かかる薬学的または獣医学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者に知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例として示される通りである。その上、動物またはヒト投与に関して、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される滅菌状態、発熱性、全般的安全性及び純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。

【0207】

本明細書で使用されるとき、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、当業者には知られていようが、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌薬剤）、等張剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、賦形剤、崩壊剤、そのような同様の材料及びそれらの組み合わせを含む。任意の従来の担体が活性成分と不適合性である限りを除いて、治療的または薬学的組成物におけるその使用が企図される。

【0208】

本発明による薬学的または獣医学的組成物は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、眼内投与、頭蓋内投与、脳内投与、骨内投与、脳室内投与、髄腔内投与または皮下投与に、薬物溶出ステントからの投与に、輸注技法による投与に、または局所投与に（表皮に好適な形態、例えば、クリームもしくは軟膏、吸入、点眼薬／目薬、点耳薬／耳薬、または体内の粘膜を通してなど）意図され、それゆえ、それに好適な様態で製剤化される場合も、そうでない場合もある。滅菌注射液は、所要量の活性化合物を、上記に列挙された種々の他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌することによって調製され得る。薬学的組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張性にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る、滅菌水溶液の形態で使用されるのが最善であり得る。必要な場合、水溶液は、好適に（好ましくは、３～９のｐＨに）緩衝され得る。滅菌条件下での好適な薬学的製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技法によって容易に遂行される。

【0209】

本発明による薬学的または獣医学的組成物は、代替的に、凍結乾燥粉末であり得る滅菌粉末などの、粉末の形態で製剤化されてもよい。

【0210】

ヒト患者などの患者への投与用のＡｎｘＡ５タンパク質の治療上有効量は、１日投薬量レベルに基づいて、単回または分割用量で投与して、成人につき０．０１～１０００ｍｇのＡｎｘＡ５タンパク質（例えば、患者の体重１ｋｇあたり約０．００１～２０ｍｇ、例えば、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ、例としては０．１ｍｇ／ｋｇ超かつ２０、１０、５、４、３または２ｍｇ／ｋｇ以下、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ）であり得る。

【0211】

いずれにしても、医師は、任意の個々の患者に最も好適であろう実際の投薬量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重及び応答により異なるであろう。上記の投薬量は、平均的な実例を例として示している。当然のことながら、より高いまたはより低い投薬量範囲が有利である個々の事例があり得、そのような事例は本発明の範囲内にある。

【0212】

獣医学的使用の場合、本発明の化合物は、通常の獣医学的実務に従って好適に許容される製剤として投与され、獣医は、特定の動物に最も適切であろう投薬レジメン及び投与経路を決定する。

【0213】

Ｉ．生成物特質
本発明のプロセスは、上記に定義されるＡｎｘＡ５生成物を提供する。したがって、特許請求されるプロセスによって生産される生成物はまた、本発明のさらなる第５の態様である。

【0214】

さらなる実施形態において、本発明の態様のいずれかのプロセスは、ヒトにおいて使用するための注射用医薬品に好適な純度を有するＡｎｘＡ５タンパク質を含む生成物を提供し得る。本明細書に記載されるプロセスは、典型的に、プロセスに関連する不純物を、許容されるレベルを優に下回るまで、例えば、宿主細胞タンパク質をＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり２０ｎｇ未満、ＤＮＡをＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１０ｐｇ未満、及び内毒素をＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１ＥＵ未満まで、除去する。

【0215】

さらなる実施形態において、本発明の態様のいずれかのプロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎｇ未満未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）またはそれ未満のレベルで非ＡｎｘＡ５タンパク質、特に宿主細胞タンパク質（組換え的に発現されたＡｎｘＡ５タンパク質以外）を含む、生成物を提供し得る。ＦＤＡ及びＥＭＡは、宿主細胞タンパク質が１００ｎｇ／ｍｇ未満であるよう要求し、本出願者は、宿主細胞タンパク質が２０ｎｇ／ｍｇ未満であることを実証した。宿主細胞タンパク質含量は、例えば、ＥＬＩＳＡサンドイッチ技法または他のＥＭＡ及びＦＤＡ承認の方法により、抗宿主細胞タンパク質抗体を使用することによって、測定することができる。

【0216】

さらなる実施形態において、本発明の態様のいずれかのプロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００、９０、８０、７０、６０、５０ ４５、４０、３５、３０、３５、２０、１５未満、好ましくは１０、５または１ＥＵ未満の内毒素含量を含む生成物を提供し得、かつ／または好ましくは、本プロセスは、単位剤形にある生成物を提供し、この生成物は、単位用量あたり１００、９０、８０、７０、６０、５０ ４５、４０、３５、３０、３５、２０、１５未満、好ましくは１０、５または１ＥＵ未満を含有する。ＦＤＡ及びＥＭＡは、内毒素が１００ＥＵ／用量未満であるよう要求し（最大許容量は３５０ＥＵ／用量である）、この要求される量は、１０ｍｇ用量で１０ＥＵ／ｍｇ未満に相当する。これらのパラメータ内で、単位剤形は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇのＡｎｘＡ５タンパク質またはそれよりも多く（例えば、０．１～１０００ｍｇ、または１～１００ｍｇの範囲内）を含有し得る。内毒素は、例えば、ＬＡＬに基づく技法または他のＥＭＡ及びＦＤＡ承認の方法を使用することによって、測定することができる。

【0217】

さらなる実施形態において、本発明の態様のいずれかのプロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ未満、好ましくは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり５００ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり４００ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり３００ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり２００ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり５０ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり４０ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり３０ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり２０ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１５ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１０ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり９ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり８ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり７ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり６ｐｇ未満、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり５ｐｇ未満、例えば、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり約４ｐｇの宿主細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）レベルなどの核酸（例えば、ＤＮＡ）レベルを含む、生成物を提供し得る。ＤＮＡは、例えば、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）技法または他のＥＭＡ及びＦＤＡ承認の方法を使用することによって、測定することができる。

【0218】

特に好ましい実施形態において、本発明の態様のいずれかのプロセスは、次のものからなる列挙項目から選択される任意の１つ以上の特質を有する生成物を提供し得る。
－典型的に８～１２ｇ／Ｌ前後のＡｎｘＡ５タンパク質の濃度、
－１００ｎｇ／ｍｇ以下、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｇの宿主細胞タンパク質レベル（ＥＬＩＳＡによって決定）、
－１００ｐｇ／ｍｇ以下、より好ましくは１０ｐｇ／ｍｇの宿主細胞ＤＮＡレベル
－３５ＥＵ／ｍｇ以下、より好ましくは１ＥＵ／ｍｇの内毒素、
－サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して９５％超の純度、
－１ｃｆｕ／ｍＬ未満のバイオバーデン（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．１２によって決定）、
－可視的粒子のない無色透明の外観、及び
－ウェスタンプロット解析によって検出されるメインバンドが、アネキシンＡ５参照に対応する。

【0219】

さらなる特に好ましい実施形態において、生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質は、低レベルのグルコノイル化を有し得る。この関連において「低い」とは、次いで、グルコノイル化のレベルが、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（例えば、広く市販されており、Ｍａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３３に記載されるようなもの）において発現されるＡｎｘＡ５タンパク質のグルコノイル化のレベル未満（そのレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満など）である、という意味を含み得る。 例えば、生成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルは、生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の全含量の０．５～３０％、または０．５～２０％、または０．５～１５％、または０．５～１０％の範囲内であることが可能である。別の言い方をすれば、生成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルは、４０％を下回る、例えば、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を下回る、好ましくは実質的に０％であることが可能である。Ａｎｘ５のグルコノイル化バリアントは、例えば、適切な陰イオン交換または逆相カラムを使用したＵＰＬＣまたはＨＰＬＣクロマトグラフィー器具を使用することによって、測定及び定量することができる。

【0220】

したがって、本発明の第５の態様は、ＡｎｘＡ５タンパク質を含む組成物を提供し、この組成物は、本発明の第１、第２、第３または第４の態様のいずれかによるプロセスの直接または間接的（またはそれによって直接または間接的に得ることができる）生成物である。任意選択で、組成物は、薬学的に許容される及び／または獣医学的に許容される組成物である。

【0221】

Ｊ．医療的及び獣医学的使用
本発明の第６の態様もまた、薬品において使用するための本発明の第５の態様の組成物を提供する。別の言い方をすれば、本発明の第６の態様は、治療を必要とするヒトまたは動物に、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0222】

本発明の第６の態様のある特定の実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、下記のために使用され得る。
（ａ）血栓症（アテローム性血栓症などの）及び／またはプラーク破裂の予防またはそのリスクの低減のため、あるいは全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）患者及び／または抗リン脂質関連抗体の増加したレベルを引き起こす恐れのある上気道感染もしくは他の感染（肺炎球菌感染を含む）を有するもしくは有したことのある（またはそのリスクがある）患者が含まれるが、これらに限定されない、リスク群に属する患者への投与のため、あるいは血栓塞栓症、出血性もしくは血管炎性脳卒中、心筋梗塞、狭心症もしくは間欠性跛行、不安定狭心症、他の形態の重度の狭心症、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、例えば、ＷＯ２００５／０９９７４４にさらに記載されるようなもの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を治療する（能動的にまたは予防的にのいずれでも）またはそのリスクを低減するため、
（ｂ）血管機能不全、狭心症、虚血性心疾患、末梢動脈疾患、収縮期高血圧、偏頭痛、２型糖尿病及び勃起不全の治療、予防またはそのリスクの低減のため、虚血性疼痛を低減する及び／または血管疾患破裂、例えば、ＷＯ２００９／０７７７６４に記載されるようなもの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の治療のため、
（ｃ）再狭窄（特に新生内膜形成または肥厚）、または血管炎症、例えば、ＷＯ２００９／１０３９７７に記載されるようなもの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の予防または治療のため、
（ｄ）酸化カルジオリピン（ｏｘＣＬ）の活性の阻害において使用するため、ならびに哺乳動物における次の疾患、すなわち、心血管疾患（ＣＶＤ）、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病、認知症全般、リウマチ病、アテローム硬化症、高血圧、急性及び／または慢性炎症性病態、心筋梗塞、急性冠症候群、脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、跛行（ｃｌａｕｄｉｃｔｉｏｎ）、狭心症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、全身性紅斑性狼瘡、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨関節炎を含む関節炎、特発性炎症性筋疾患（ＩＩＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、多発性筋炎（ＰＭ）、封入体筋炎、アレルギー障害及び／または骨関節炎を含むが、これらに限定されない、心血管疾患、自己免疫疾患または炎症性病態、例えば、ＷＯ２０１０／０６９６０５に記載されるようなもの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を治療する、予防する及び／またはその発症のリスクを低減するため、ならびに
（ｅ）血管手術、とりわけ末梢血管手術後の合併症などの、外科的介入後の周術期または術後合併症、例えば、ＷＯ２０１２／１３６８１９に記載されるようなもの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の予防及び／または低減のため。

【0223】

本発明の第６の態様のさらなる実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、鎌状赤血球貧血を含むが、これらに限定されない血液学的障害を治療する、予防するまたはそのリスクを低減する予防的または治療的方法において使用され得る。

【0224】

本発明の第６の態様のさらなる実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、自己免疫要素を伴う血管炎、及び／または薬物誘発性血管炎を含むが、これらに限定されない、急性及び慢性血管炎症、原発性または続発性血管炎を治療する、予防するまたはそのリスクを低減する予防的または治療的方法において使用され得る。したがって、本発明はまた、血管炎、ベーチェット病、皮膚血管炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、免疫グロブリンＡ関連血管炎（ＩｇＡＶ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、多発筋痛リウマチ、及び高安動脈炎を治療する、予防するまたはそのリスクを低減する予防的または治療的方法も提供する。多発筋痛リウマチが特に対象となり得る。

【0225】

本発明の第６の態様のさらなる実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、網膜静脈閉塞を治療する、予防するまたはそのリスクを低減する予防的または治療的方法において使用され得る。

【0226】

本発明の第６の態様のさらなる実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、（ｉ）ウイルス感染の伝染を予防する、もしくはその率を低減する、（ｉｉ）ウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する、あるいは（ｉｉｉ）対象におけるウイルス感染を治療する、予防的または治療的方法において使用され得、このウイルス感染は、次のものからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。
（ａ）出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）、ならびに
（ｂ）ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルス。

【0227】

したがって、さらなる一実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減する予防的または治療的方法において使用するための本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0228】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0229】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0230】

別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減する予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0231】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0232】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低減することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0233】

別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0234】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0235】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0236】

別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0237】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0238】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0239】

別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染を治療する予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0240】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染を治療する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0241】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイル感染を治療することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）によって引き起こされる。

【0242】

別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染を治療する予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0243】

換言すれば、本発明は、対象におけるウイルス感染を治療する予防的または治療的方法を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされ、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0244】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、対象におけるウイルス感染を治療することによる予防法または療法用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0245】

本発明のさらなる実施形態により、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる対象を治療する方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物が提供される。

【0246】

別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる対象を治療するための方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0247】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる対象の治療用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。

【0248】

本発明の別の実施形態により、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがある対象を治療する方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物が提供される。

【0249】

別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがある対象を治療するための方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0250】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがある対象の治療用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。

【0251】

本発明のさらなる実施形態により、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがある対象を治療する方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物が提供される。

【0252】

別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがある対象を治療するための方法を提供し、本方法は、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を対象に投与することを含む。

【0253】

なおも別の言い方をすれば、この実施形態は、出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがある対象の治療用の薬の製造において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。

【0254】

本発明のこれらの上述の実施形態において、出血熱を引き起こすことが可能な病原体は、ＶＨＦであり得る。

【0255】

ウイルス出血（ＶＨＦ）は、少なくとも５つの明確に異なるＲＮＡウイルスのファミリー、すなわちＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、及びＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリーによって引き起こされ得る多様な動物及びヒト疾病群である。すべての種類のＶＨＦが、熱及び出血障害を特徴とし得、すべてが、多くの症例において高熱、ショック及び死へと進行し得る。

【0256】

出血熱を引き起こすことが可能なウイルス（ＶＨＦ）または出血熱を引き起こすことが可能な細菌（ＢＨＦ）などの、出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染していることが疑われる対象は、過去にこの疾患に接触した対象であり得（例えば、医療従事者としての雇用に基づいてまたは家族員の感染に起因して）、かつ／または確認的診断の前に感染している１つ以上の徴候または症状を呈する対象であり得る。

【0257】

感受性ＶＨＦの徴候または症状は特徴的に、熱及び易出血性の増加（出血傾向）を含む。ＶＨＦの症状発現はまた、顔面及び胸部の紅潮、小さな赤いまたは紫色の斑点（点状出血）、明らかな出血、浮腫によって引き起こされる膨張、低血圧（ｌｏｗ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（低血圧（ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ））、及びショック含むことが多い。疲労、筋肉痛（ｍｕｓｃｌｅ ｐａｉｎ）（筋肉痛（ｍｙａｌｇｉａ））、頭痛、嘔吐、及び下痢が頻繁に生じる。症状の重症度は、ウイルスの種類によって異なり、このうち「ＶＨＦ症候群」（毛細血管漏出、出血傾向、及び循環不全によりショックにつながる）が、フィロウイルス出血熱（例えば、エボラ及びＭａｒｂｕｒｇ）、ＣＣＨＦ、及び南米出血熱を有する患者の大多数で現れるが、患者デング熱、ＲＶＦ、及びラッサ熱を有する患者の少数においても現れる。

【0258】

本発明の第６の態様において、ＶＨＦはエボラであり得、対象は、過度のもしくは多量の発汗、発熱、筋肉痛、全身疲労、及び／もしくは悪寒などの初期の臨床症状；ならびに／または任意選択で胃腸症状を伴うインフルエンザ様の症状；斑点状丘疹、点状出血、結膜出血、鼻出血、下血、吐血、ショック及び／もしくは脳症；白血球減少症（例えば、増加したリンパ系細胞アポトーシスに関連する）、血小板減少症、増加したアミノトランスフェラーゼのレベル、トロンビン及び／もしくは部分トロンボプラスチン時間、血中で検出可能なフィブリン分解産物、及び／または播種性血管内凝固（ＤＩＣ）から選択される症状などの、エボラの１つ以上の症状を呈し得る。

【0259】

確定診断は、通常、高度な生物学的封じ込め能力を有する基準検査室で行われる。検査室調査の所見は、ウイルス間でいくらか異なるが、一般に、総白血球数（特にリンパ球）の減少、血小板数の減少、血清肝酵素の増加、ならびにプロトロンビン（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）の両方の増加として測定される血液凝固能力の低下がある。ヘマトクリットは亢進し得る。血清尿素及びクレアチンは上昇し得るが、これは患者の水分補給状態に左右される。出血時間は、長期化される傾向がある。

【0260】

例えば、ＢＳＬ－４病原体であるためエボラウイルス感染の急性期中のウイルス血症の確認された臨床検査室診断は、好適な検査室施設で可能である。利用され得るアッセイは、疾患の病期に基づく。

【0261】

急性疾患の間、アッセイは、ａ）ＶｅｒｏまたはＶｅｒｏ Ｅ６細胞株を使用したウイルス単離、ｂ）適切な偽陰性及び偽陽性対照とともにしたＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ、ｃ）抗原捕捉ＥＬＩＳＡ、ならびにｄ）ＩｇＭ ＥＬＩＳＡを含む。

【0262】

疾患経過中のより後では、利用され得る試験は、ａ）真正ウイルス抗原を使用したＩｇＭ及びＩｇＧ ＥＬＩＳＡを含み、死亡症例では、剖検組織が、ａ）免疫染色技法を用いた抗原検出、ｂ）免疫組織化学補助によるエボラ抗原の検出（Ｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９９９；１７９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３６ｅ４７．（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、及びｃ）ウイルスＲＮＡの検出のためのインサイチュハイブリダイゼーション技法、に利用され得る。

【0263】

これらの技法の各々の詳細は、Ｓａｉｊｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１３：４４４ｅ５１に要約されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0264】

ＥＬＩＳＡに基づくアッセイは、エボラウイルス特異的抗体の検出のためにＣＤＣによって標準化されている。このアッセイは、高感度を有し、１０年前にエボラに曝露されたヒトの血清中の抗体を検出可能であることが示された。細胞系プラークアッセイ及びエンドポイント滴定アッセイ（ＴＣＩＤ５０）もまた、前臨床研究において使用するためのフィロウイルスを検出及び定量するために開発された（Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１２；４：３５１１ｅ３０、Ｓｍｉｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３；１９３：５６５ｅ７１（その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0265】

例えば、ＶＨＦは、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、ＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅから選択されるファミリーのウイルスであり得る。

【0266】

Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーは、ラッサ熱、Ｌｕｊｏウイルス、アルゼンチン、ボリビア、ブラジル、及びベネズエラ出血熱の原因となるウイルスを含む。

【0267】

Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅファミリーは、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）を引き起こすＨａｎｔａウイルス属、Ｎａｉｒｏウイルス属由来のクリミア‐コンゴ出血性熱（ＣＣＨＦ）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａウイルス由来のＧａｒｉｓｓａウイルス及びＩｌｅｓｈａウイルス、ならびにＰｈｌｅｂｏウイルス属由来のリフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルスのメンバーを含む。

【0268】

Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅファミリーは、エボラウイルス及びＭａｒｂｕｒｇウイルスを含む。

【0269】

Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーは、デング、黄熱病、及びＶＨＦを引き起こすダニ媒介性脳炎グループにおける２つのウイルス、すなわちＯｍｓｋ出血熱ウイルス及びＫｙａｓａｎｕｒ森林病ウイルスを含む。

【0270】

コンゴ共和国のＢａｓ－Ｃｏｎｇｏ地区における出血熱の２つの致死的症例及び２つの非致死的症例の原因となるＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーの単離もまた報告された。非致死的症例は、他の２人の治療に従事していた医療従事者に生じたことから、人から人への伝染の可能性が示唆される。

【0271】

したがって、例えば、特に目的とする一実施形態において、本発明は、エボラウイルス及びＭａｒｂｕｒｇウイルスなどのＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに適用され得る。特に目的とする別の実施形態においては、本発明は、デングウイルスなどのＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに適用され得る。

【0272】

したがって、本発明は、（ｉ）エボラ感染の伝染を予防する、もしくはその率を低減する、（ｉｉ）エボラ感染を予防する、もしくはそれから保護する、あるいは（ｉｉｉ）エボラウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる、またはエボラウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、またはエボラウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、対象におけるエボラ感染を治療するための、上述の予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を実現する。

【0273】

したがって、本発明は、（ｉ）Ｍａｒｂｕｒｇ感染の伝染を予防する、もしくはその率を低減する、（ｉｉ）Ｍａｒｂｕｒｇ感染を予防する、もしくはそれから保護する、あるいは（ｉｉｉ）対象が、Ｍａｒｂｕｒｇウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる、またはＭａｒｂｕｒｇウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、またはＭａｒｂｕｒｇウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、Ｍａｒｂｕｒｇ感染を治療するための、上述の予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を実現する。

【0274】

したがって、本発明は、（ｉ）デング熱ウイルス感染の伝染を予防する、もしくはその率を低減する、（ｉｉ）デング熱ウイルス感染を予防する、もしくはそれから保護する、あるいは（ｉｉｉ）対象が、デング熱ウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる、またはデング熱ウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、またはデング熱ウイルスに感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがあるもしくは接触することが予想される、デング熱ウイルス感染を治療するための、上述の予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を実現する。

【0275】

本発明はまた、対象のＶＨＦまたはＢＨＦによる感染を治療する、その発症を遅延させる及び／または進行を遅延させるための、上述の方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0276】

本発明はまた、ＢＨＦまたはＶＨＦによって引き起こされる、対象における免疫及び／または血管系に対する直接及び／または間接的細菌ウイルス被害を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させるための、上述の方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0277】

例えば、本発明は、例えば、エボラ感染の関連において、対象における免疫系に対する直接及び／または間接的細菌またはウイルス被害を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させるために使用されてよい。例えば、細菌またはウイルス被害は、先天性免疫応答への被害、獲得体液性応答への被害、樹状細胞への被害、インターフェロン産生（ＩＬ１産生を含む）などの炎症性因子の産生の調節機能への被害、マクロファージへの被害、及び／または単球への被害から選択され得る。

【0278】

本発明は、対象における血液漏出（出血）、低血圧、血圧の低下、ショックまたは死を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させるために使用されてよい。

【0279】

本発明は、ウイルスにより誘発される対象の血管内皮への酸化窒素損傷を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させるために使用されてよい。

【0280】

本発明は、ＶＨＦまたはＢＨＦなどの出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる対象における、血管内皮またはその内皮細胞の損傷、活性化、死、及び／またはその完全性の破壊を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させる方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。血管内皮またはその内皮細胞の完全性は、例えば、細胞もしくは血管上皮漏出の程度によって、及び／あるいは対象の１件以上の出血事象、または浮腫の形成及び／もしくは脱水症状の検出によって、決定されてもよい。

【0281】

本発明は、ＶＨＦまたはＢＨＦなどの出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象と接触したことがあるもしくは接触することが予想される対象における、血管内皮またはその内皮細胞の損傷、活性化、死、及び／またはその完全性の破壊を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させる方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。

【0282】

本発明は、ＶＨＦまたはＢＨＦなどの出血熱を引き起こすことが可能な病原体に感染したもしくは感染していることが疑われる別の対象において存在するもしくはその対象によって産生される生体材料と接触したことがあるもしくは接触することが予想される対象における、血管内皮またはその内皮細胞の損傷、活性化、死、及び／またはその完全性の破壊を予防する、低減する、その発症を遅延させる、またはその進行を遅延させる方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を提供する。

【0283】

本発明のさらなる実施形態は、本発明の種々の実施形態を参照して上述された、予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物を実現し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。代替的に、ウイルス感染は、アネキシンＡ５が結合する１つ以上の他の種類のリン脂質及び／またはアネキシンＡ５が結合する他の部分を提示する、ウイルスよって引き起こされ得る。

【0284】

ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスには、特に、ウイルスのエンベロープ内、とりわけ外層内にホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む封入ウイルスが含まれ得る。ウイルスによるＰＳの提示は、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、アネキシンＡ５のウイルスへの結合を測定するＥＬＩＳＡ研究を用いて、決定することができる。好適な方法には、例えば、Ｍｏｌｌｅｒ－Ｔａｎｋ，ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１５），８３２７－８３４１に記載されるものなどの（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）、抗－ＨＡ抗血清へのヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付きアネキシンＡ５結合のＥＬＩＳＡ測定が含まれ得る。

【0285】

本発明が特に目的とするウイルスの群には、ホスファチジルセリン媒介性ウイルス侵入促進受容体（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＶＥＥＲ））との結合を介して細胞感染及び／または内部移行を媒介するものが含まれる。ＰＶＥＥＲは、Ｍｏｌｌｅｒ Ｔａｎｋ，ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１５），８３２７－８３４１で考察され、その一例は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチン１（ＴＩＭ－１）受容体である。さらなる例としては、ＴＩＭ－４、Ｇａｓ６またはプロテインＳ／Ａｘｌ、Ｍｅｒ、及びＴｙｒｏ３、ならびにＭＦＧ－Ｅ８／インテグリンαｖβ３またはαｖβ５が挙げられ得る。

【0286】

エボラは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＴＩＭ－１とのＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介する、特に目的とする１つのウイルスの例である。Ｍｏｌｌｅｒ Ｔａｎｋ，ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１５），８３２７－８３４１。

【0287】

本発明は、アネキシンＡ５、及び本発明の第５の態様の組成物が、エボラウイルスなどのウイルスの、ＴＩＭ－１などのＰＶＥＥＲを介したＰＳ媒介性細胞感染及び／または内部移行を阻害するまたは遮断するために使用され得、それによって、（ｉ）ウイルス感染の伝染を予防する、またはその率を低する、（ｉｉ）ウイルス感染の伝染を予防する、またはそれから保護する、あるいは（ｉｉｉ）対象におけるウイルス感染治療する、予防的または治療的方法において有用であり得ることを認識し、このウイルス感染は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳ結合を介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによって引き起こされる。

【0288】

ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示するウイルスは、例えば、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルス（エボラ及びＭａｒｂｕｒｇなど）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリー、Ａ型肝炎、アルファウイルス、バキュロウイルス、及びアレナウイルスからなる群から選択され得る。ウイルスは、ヒトにおいて、またはヒトにおいてのみ感染性であり得る。ウイルスは、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、齧歯動物、ラクダ、家畜動物、及び野生動物から選択される動物のうちのいずれか１つ以上などの非ヒト動物において、または非ヒト動物においてのみ感染性であり得る。

【0289】

ＴＩＭ－１などのＰＶＥＥＲは、ウイルスの、種々の細胞型への内部移行に関与し得る。一実施形態において、本発明における保護及び／または治療の特に目的となる細胞型には、上皮細胞（血管上皮細胞を含む）、肥満細胞、Ｂ細胞、ならびにＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞及び特に活性化ＣＤ４＋細胞などのＴ細胞からなる群から選択される、１つ以上の細胞型が含まれ得る。

【0290】

ＴＩＭ－１、別名ＨＡＶＣＲ１及びＫＩＭ－１は、ヒト喘息の感受性遺伝子として同定された（Ｍｃｌｎｔｉｒｅ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ ４２５：５７６）。１つの公開されたヒトＴＩＭ－１タンパク質のアミノ酸配列は、次のように示される。
ＭＨＰＱＶＶＩＬＳＬＩＬＨＬＡＤＳＶＡＧＳＶＫＶＧＧＥＡＧＰＳＶＴＬＰＣＨＹＳＧＡＶＴＳＭＣＷＲＧＳＣ ＳＬＦＴＣＱＮＧＩＶＷＴＮＧＴＨＶＴＹＲＫＤＴＲＹＫＬＬＧＤＬＳＲＲＤＶＳＬＴＩＥＮＴＡＶＳＤＳＧＶＹＣ ＣＲＶＥＨＲＧＷＦＮＤＭＫＩＴＶＳＬＥＩＶＰＰＫＶＴＴＴＰＩＶＴＴＶＰＴＶＴＴＶＲＴＳＴＴＶＰＴＴＴＴＶＰＭＴＴＶＰＴＴＴＶＰＴＴＭＳＩＰＴＴＴＴＶＬＴＴＭＴＶＳＴＴＴＳＶＰＴＴＴＳＩＰＴＴＴＳＶＰＶＴＴＴＶＳＴＦＶＰＰ ＭＰＬＰＲＱＮＨＥＰＶＡＴＳＰＳＳＰＱＰＡＥＴＨＰＴＴＬＱＧＡＩＲＲＥＰＴＳＳＰＬＹＳＹＴＴＤＧＮＤＴＶＴＥ ＳＳＤＧＬＷＮＮＱＴＱＬＦＬＥＨＳＬＬＴＡＮＴＴＫＧＩＹＡＧＶＣＩＳＶＬＶＬＬＡＬＬＧＶＩＩＡＫＫＹＦＦ ＫＫＥＶＱＱＬＳＶＳＦＳＳＬＱＩＫＡＬＱＮＡＶＥＫＥＶＱＡＥＤＮＩＹＩＥＮＳＬＹＡＴＤ（配列番号２）。

【0291】

ＴＩＭ－１は、ＩｇＶドメイン、ムチンリッチドメインを含有する細胞外領域、及びＮ結合グリコシル化部位を含有する膜近位の短い茎（ｓｈｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｔａｌｋ）を持つ、Ｉ型膜タンパク質である（Ｉｃｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｊ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７３（７）：４１３５－４２）。ΤＩΜ－１ ＩｇＶドメインは、ジスルフィド依存性立体配座を有し、ここでＣＣ’ループは、ＧＦＣ β鎖に折り重なって、ＣＣ’及びＦＧループによって形成される特有の間隙をもたらす（Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６（３）：２９９－３１０）。ＣＣ’及びＦＧループによって構築された間隙は、ホスファチジルセリンのための結合部位である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７（６）：９２７－４０）。ＴＩＭ－１ ＩｇＶドメインのＣＣ’／ＦＧ間隙に向けられた抗体は、ホスファチジルセリン及び樹状細胞へのＴＩＭ－１結合を阻害し、アレルギー性喘息のヒト化マウスモデルにおいて体内で治療活性を呈する（Ｓｏｎａｒ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：２７６７－８１）。

【0292】

本発明のさらなる実施形態は、ＴＩＭ－１のＩｇＶドメイン、及び他のＰＶＥＥＲが、それに提示されたＰＳに結合する能力を予防する、阻害するまたは低減するための、本発明の第５の態様の組成物の使用に基づく。本発明の第５の態様の組成物におけるＡｎｘＡ５タンパク質は、好ましくは、ＰＳに結合する能力も有し、本発明のこの実施形態において、ＰＳに結合するためにＰＶＥＥＲと競合可能である。

【0293】

したがって、さらなる一実施形態において、本発明の第５の態様の組成物は、ＴＩＭ－１（または他のＰＶＥＥＲ）へのホスファチジルセリン結合を阻害する方法において使用され得る。

【0294】

例えば、これは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示して、ＰＳを介して細胞感染及び／または細胞内移行を媒介するウイルスによる細胞の感染を阻害する、低減するまたは予防する関連において、予防上または治療上有用であり得る。

【0295】

代替的に、これは、ＰＳのＴＩＭ－１（または他のＰＶＥＥＲ）への結合が関与する他の病状に対処する関連において、予防上または治療上有用であり得る。ＴＩＭ－１関連障害は、下記でさらに考察される。

【0296】

したがって、別の実施形態において、本発明は、ＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲのホスファチジルセリンへの結合を阻害するまたは低減する方法を提供し、本方法は、ＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲを発現する第１の細胞を、細胞表面上にホスファチジルセリンを含有する第２の細胞への、または表面上にホスファチジルセリン（ＰＳ）を提示するウイルスへの第１の細胞の結合を阻害するまたは低減するのに有効な量の本発明の第５の態様の組成物と接触させることを含む。本方法は、体内方法であっても体外方法であってもよい。体内方法の場合、それは、ＰＳのＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲへの結合が関与する病態を治療するまたは予防することであり得る。

【0297】

換言すると、本発明のこの実施形態はまた、治療を必要とする患者における、ＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲのホスファチジルセリンへの結合を阻害するまたは低減するための予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0298】

別の実施形態において、本発明は、ＰＳの、樹状細胞上のＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲへの結合を阻害するまたは低減する方法を提供し、本方法は、ＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲを発現する樹状細胞を、ＰＳの樹状細胞への結合を阻害するまたは低減するのに有効な量の本発明の第５の態様の組成物と接触させることを含む。本方法は、体内方法であっても体外方法であってもよい。体内方法の場合、それは、ＰＳの、樹状細胞上のＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲへの結合が関与する病態を治療するまたは予防することであり得る。

【0299】

換言すると、本発明のこの実施形態はまた、治療を必要とする患者における、ＰＳの、樹状細胞上のＴＩＭ－１または他のＰＶＥＥＲへの結合を阻害するまたは低減するための予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0300】

また、炎症性病態または自己免疫病態を治療するまたは予防する方法も開示され、本方法は、炎症性病態または自己免疫病態を有する哺乳動物に、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む。

【0301】

換言すると、本発明のこの実施形態はまた、炎症性病態または自己免疫病態を予防する、治療するまたは低減するための予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0302】

また、喘息を治療するまたは予防する方法も開示され、本方法は、喘息を有する哺乳動物に、本発明の第５の態様の組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む。

【0303】

換言すると、本発明のこの実施形態はまた、喘息を予防する、治療するまたは低減するための予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0304】

また、アトピー性障害を治療するまたは予防する方法も開示され、本方法は、アトピー性障害を有する哺乳動物に、治療上有効量の本発明の第５の態様の組成物を含む薬学的組成物を投与することを含む。アトピー性障害は、例えば、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、血管浮腫、ラテックスアレルギー、またはアレルギー性肺障害（例えば、喘息、アレルギー性気管支アスペルギルス症、または過敏性肺臓炎）であり得る。

【0305】

換言すると、本発明のこの実施形態はまた、アトピー性障害を予防する、治療するまたは低減するための予防的または治療的方法において使用するための、本発明の第５の態様の組成物も提供する。

【0306】

本明細書に記載されるように、炎症性障害及び自己免疫障害などの免疫学的障害を含む、多様なＴＩＭ－１関連障害、及び他のＰＶＥＥＲ関連障害を治療するまたは予防するために使用される、本発明の第５の態様の組成物。

【0307】

「治療する」という用語は、本明細書に記載される物質または組成物を、統計的に有意な程度まで、または当業者が検出可能な程度までのいずれかで、障害に関連する病態、症状、もしくはパラメータを改善するのに、または障害（障害によって引き起こされる続発性損傷を含む）の進行もしくはその悪化を予防するのに有効な量、様態、及び／または様式で、投与する意味を含む。

【0308】

これらの障害のうちの１つのリスクがある、そうであると診断された、またはそれを有する対象に、本発明の第５の態様の組成物が、全体的な治療効果を提供する量で及びそのような時間にわたって投与され得る。本発明の第５の態様の組成物は、単独で（単剤療法）、あるいは他の薬剤（併用療法）と組み合わせて、混和してまたは別個、同時もしくは順次の投与によってのいずれかで投与され得る。併用療法の場合、投与の量及び時間は、例えば、相加的または相乗的治療効果を提供するようなものであり得る。さらに、本発明の第５の態様の組成物（第２の薬剤を含むまたは含まない）投与は、一次治療、例えば第一選択治療として、または二次治療として、例えば、以前に施与された療法（すなわち、ＡｎｘＡ５タンパク質での療法以外の療法）に対して不十分な応答を有する対象のために、使用され得る。

【0309】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物で治療可能な疾患または病態には、例えば、虚血再灌流損傷（例えば、肝臓または腎虚血再灌流損傷などの臓器虚血再灌流損傷）、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、移植拒絶、膵炎、及び遅延型過敏症（ＤＴＨ）が含まれる。

【0310】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物で治療可能な追加の疾患または病態には、例えば、自己免疫障害が含まれる。

【0311】

全身性（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ）紅斑性狼瘡（ＳＬＥ、狼瘡）は、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、及びヒストンなどの細胞内抗原に対して向けられた高レベルの自己抗体を特徴とするＴＨ－２媒介性自己免疫障害である。

【0312】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物での治療に好適な他の臓器特異的または全身性自己免疫性疾患の例としては、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ウェグナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎及び急速進行性半月体性糸球体腎炎が挙げられる。例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。それに加えて、関節リウマチ（ＲＡ）が、本明細書に記載されるアネキシンＡ５での治療に好適である。

【0313】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物で治療可能な追加のＴＩＭ－１関連疾患または病態には、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれる。ＧＶＨＤは、本明細書に記載されるアネキシンＡ５を使用して治療され得るＴ細胞媒介性病態の例となる。ＧＶＨＤは、ドナーＴ細胞が宿主抗原を異質として認識するときに発動される。ヒト患者における骨髄移植（ＢＭＴ）の致死的結果であることが多いＧＶＨＤは、急性でも慢性でもあり得る。急性及び慢性型のＧＶＨＤは、それぞれ抗原特異的Ｔｈ１及びＴｈ２応答の発達の例となる。急性ＧＶＨＤは、ＢＭＴ後の最初の２カ月以内に生じ、皮膚、腸、肝臓、及び他の臓器へのドナー細胞傷害性Ｔ細胞媒介性損傷を特徴とする。慢性ＧＶＨＤは、より後（ＢＭＴ後１００日を超えて）に現れ、自己抗体を含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）の過剰産生、ならびにＩｇ沈着によって引き起こされる皮膚、腎臓、及び他の臓器への損傷を特徴とする。急性ＧＶＨＤ患者の９０％近くが慢性ＧＶＨＤの発症に進む。慢性ＧＶＨＤは、Ｔｈ２ Ｔ細胞媒介性疾患のように思われる（Ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６１－３６６）。急性ＧＶＨＤは、Ｔｈ１媒介性疾患である（Ｋｒｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１５：５０－７３、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：６８９－６９９）。Ｔ細胞による細胞傷害活性は、急性ＧＶＨＤの特徴である。ドナー抗宿主細胞傷害活性の結果は、種々の様態で見られ得る。第１に、急性ＧＶＨＤを経験するマウスが深刻に免疫抑制されるといったように、宿主リンパ球が急速に破壊される。第２に、ドナーリンパ球が生着するようになり、宿主脾臓内で増殖し、それらの細胞傷害活性は、ドナー細胞によって（異質として）認識され得る宿主抗原を発現する細胞株を活用することによって、体外で直接測定され得る。第３に、疾患は、さらなる組織及び細胞集団が破壊されるにつれて致死的となる。

【0314】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物で治療可能な追加のＴＩＭ－１関連疾患または病態には、例えば、アトピー性障害が含まれる。アトピー性障害は、活性化Ｔ細胞及びＡＰＣを含めた免疫系細胞による、サイトカイン、ケモカイン、ならびに、とりわけＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３サイトカインなどの、Ｔｈ２応答に特徴的である他の分子の発現を特徴とする。かかるアトピー性障害は、したがって、本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物での治療に応じやすい。アトピー障害には、気道過敏症及び窮迫症候群、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、血管浮腫、ラテックスアレルギー、及びアレルギー性肺障害（例えば、喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び過敏性肺臓炎）が含まれる。

【0315】

本明細書に記載される本発明の第５の態様の組成物で治療可能な追加のＴＩＭ－１関連疾患または病態には、例えば、多数の免疫または炎症性障害が含まれる。免疫または炎症性障害には、アレルギー性鼻炎；自己免疫性溶血性貧血；黒色表皮腫、アジソン病；円形脱毛症；全身性脱毛症；アミロイド症；アナフィラキシー様紫斑病；アナフィラキシー様反応；再生不良性貧血；強直性脊椎炎；頭蓋動脈炎；巨細胞動脈炎；高安動脈炎；側頭動脈炎；毛細血管拡張性運動失調；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性睾丸炎；自己免疫性多腺内分泌不全；ベーチェット病；ベルジェ病；バージャー病；気管支炎；水疱性類天疱瘡；慢性皮膚粘膜カンジダ症；カプラン症候群；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；心炎；セリアックスプルー；シャーガス病；チェディアック・東症候群；チャーグ・ストラウス病；コーガン症候群；寒冷凝集素疾患；ＣＲＥＳＴ症候群；クローン病；クリオグロブリン血症；特発線維性肺胞炎；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；真正糖尿病；ダイヤモンドブラックファン症候群；ディジョージ症候群；円板状紅斑性狼瘡；好酸球性筋膜炎；上強膜炎；持久性隆起性紅斑；輪状紅斑；多形紅斑；結節性紅斑；家族性地中海熱；フェルティ症候群；肺線維症；アナフィラキシー様糸球体腎炎；自己免疫性糸球体腎炎；連鎖球菌感染後糸球体腎炎；移植後糸球体腎炎；膜性糸球体症；グッドパスチャー症候群；免疫媒介性顆粒球減少症；環状肉芽腫；アレルギー性肉芽腫症；肉芽腫性筋炎；グレーブス病；橋本甲状腺炎；新生児の溶血性疾患；特発性ヘモクロマトーシス；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病；慢性活動性肝炎及び慢性進行性肝炎；組織球増殖症Ｘ；好酸球増加症候群；特発性血小板減少性紫斑病；ヨブ症候群；若年性皮膚筋炎；若年性関節リウマチ（若年性慢性関節炎）；川崎病；角膜炎；乾性角結膜炎；ランドリー・ギラン・バレー症候群；らい腫性ハンセン病；レフラー症候群；狼瘡；ライエル症候群；ライム病；リンパ腫様肉芽腫症；全身性肥満細胞症；混合性結合組織疾患；多発性単神経炎；マックル・ウェルズ症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；皮膚粘膜リンパ節症候群；多中心性網組織球症；多発性硬化症；重症筋無力症；菌状息肉腫；全身性壊死性血管炎；ネフローゼ症候群；オーバーラップ症候群；脂肪織炎；発作性寒冷血色素尿症；発作性夜間血色素尿症；類天疱瘡；天疱瘡；紅斑性天疱瘡；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；鳩ブリーダー病；結節性多発動脈炎；リウマチ性多発筋痛；多発筋炎；特発性多発神経炎；ポルトガル家族性多発神経炎；子癇前症／子癇；原発性胆汁性肝硬変；全身性進行性硬化症（強皮症）；乾癬；乾癬性関節炎；肺胞蛋白症；肺線維症、レイノー現象／症候群；リーデル甲状腺炎；ライター症候群、再発性多発軟骨炎；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；強膜炎；硬化性胆管炎；血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；スティーブンス・ジョンソン症候群；スティル病；亜急性硬化性全脳炎；交感性眼炎；全身性紅斑性狼瘡；移植拒絶（ｙｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）；潰瘍性大腸炎；未分化結合組織疾患；慢性蕁麻疹；寒冷蕁麻疹；ブドウ膜炎；白斑；ウェーバー・クリスチャン病；ウェゲナー肉芽腫症、またはウィスコット・アルドリッチ症候群が含まれるが、これらに限定されない。

【0316】

本発明はこれより、１つ以上の非限定的な実施例を参照して説明される。

【実施例0317】

次の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明を実施する上で良好に機能すると発明者によって発見された技法を代表するものであり、ゆえに、その実施のために好ましい様式を構成するようにみなされ得ることが、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも同様または類似の結果が得られることを理解するはずである。

【0318】

比較例１
Ｍａｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３３のプロセスは、１Ｌ培養物のプロセシングについて報告しており、これは、３０分間持続期間で２回の３８，９００ｇ遠心分離からなり、このうち第１の遠心分離工程においては、細胞破片に結合したアネキシンＡ５を沈殿させ、第２の遠心分離工程においては、アネキシンＡ５を溶液中で維持しながら細胞破片を沈殿させる。

【0319】

Ｍａｒｄｅｒらのプロセスを１Ｌから、商業的に関連性のある１０００Ｌの培養体積に規模拡大する影響を算出するために、次の分析が提供される。

【0320】

最大スループットのために最良のローターを備えた、現在利用可能な最良の遠心分離機の選択に基づいて、それらは６×２５０ｍｌ＝１．５リットルを収容することができ、３０，２００～３８，４００ｇを達成することができる。例としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＬＹＮＸ超高速遠心分離機において使用するための高価な炭素繊維製軽量ローター（Ｆｉｂｅｒｌｉｔｅ Ｆ１４－６×２５０ｙ 固定角ローター）、またはＢｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒｓ Ａｖａｎｔｉ ＪＸＮ－２６において使用するためのＪＬＡ－１６．２５０ローター、固定角、アルミニウム、バイオセーフティリッド、６×２５０ｍＬ、３８，４００ｘｇがある。かかるハイエンド高性能遠心分離機を使用した場合、遠心分離機に負荷し、始動し、要求される速度まで加速し、最大Ｇ力で３０分間費やし、次いでペレットを撹乱しないように静止するまで注意深く破砕させ（ｂｒｅａｋｉｎｇ）、次いでローターを空にするには、約４５分間かかるであろう。

【0321】

つまり、現在利用可能な最良の遠心分離機は、４５分間あたり１．５リットルのプロセシングを可能にする。

【0322】

Ｍａｒｄｅｒらは（「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題される節で）、３ｇの湿重量の細胞を３０ｍＬの緩衝液に懸濁させてから、超音波処理及び遠心分離を行うと報告している。したがって、遠心分離中にＭａｒｄｅｒらが使用した細胞湿重量（ＷＣＷ）濃度は、（３グラムを３０ｍｌ緩衝液に入れる）＝９．１％ＷＣＷであった。

【0323】

Ｍａｒｄｅｒらはまた（２ページ目の「Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ」の見出しの下で）、バイオマス濃度について２７．４８ｇ（ＤＣＷ）Ｌ^－１の平均値（ＳＤ＝１．９６）を報告している。したがって、Ｍａｒｄｅｒの発酵槽中の細胞乾燥重量（ＤＣＷ）濃度は、２７．４８グラム／Ｌ＝２．７４８％であった。１グラムＤＣＷ＝約４グラム細胞湿重量（ＷＣＷ）であることが知られている。したがって、細胞濃縮発酵槽中、２．７４８×４＝１１．０％のＷＣＷ濃度が存在した。これを最大１０００Ｌ培養物体積に規模拡大し、１０００Ｌから採取する間に５％細胞損失があると保守的に仮定する場合、Ｍａｒｄｅｒの方法を用いた１０００Ｌ槽中のＷＣＷは、１０００×１１％×０．９５＝１０４．５ｋｇ ＷＣＷとなろう。

【0324】

Ｍａｒｄｅｒの遠心分離方法は、遠心分離工程中に９．１％ＷＣＷ濃度を使用した。したがって、１０００Ｌ培養物からの１０４．５ｋｇ ＷＣＷを９．１％ＷＣＷ濃度に希釈する必要があり、これは１１４８Ｌの遠心分離総体積を要する。

【0325】

そのバイオ製造施設が２つのハイエンド高性能遠心分離機を有すると寛容に仮定して、このうちの一方は、細胞破片とともにアネキシンをペレット化するのに使用することができ（第１の遠心分離）、その間、他方は、アネキシンが溶液中にあり、細胞破片がペレット化されているときの第２の遠心分離と並行して作動できるとすると、下記の通りである。

【0326】

１１４８Ｌ溶液を遠心分離するための総時間（遠心分離機は４５分間あたり１．５リットルを処理可能である）は、１１４８／１．５＝各々４５分で７６６回の遠心分離＝３４，４７０分間＝５７４，５時間である。

【0327】

そのバイオ製造施設が１日あたり１２時間稼働したと仮定すると、Ｍａｒｄｅｒらの方法を用いた１０００Ｌ槽からのＷＣＷのプロセシングは、４８日間の作業、または（１週間あたり５日の作業日数を仮定して）遠心分離だけで１０週間かかる。

【0328】

総じて、発酵、下流プロセシング及び他の操作にさらにおよそ２週間が必要とされるであろう。そのバイオ製造施設がその１つのプロセスに完全に占有されており、このため、その間に同じ施設内で他の生産を行うことができないと仮定して、これは、１０００Ｌ培養物からの細胞の調製及びプロセスのために製造プラントにおいて１２週間かかることになる。これは、２つの遠心分離機が利用可能であるという寛容な仮定にもかかわらずである。１つのみの遠心分離機が使用される場合、製造は、１つの１０００Ｌバッチにつき２２週間となろう。

【0329】

対照的に、下記で考察されるように、本発明の方法は、１０００Ｌ培養物をたった２週間で、すなわち約６倍より迅速にプロセスすることができる（そしてまた、Ｍａｒｄｅｒらプロセスの生成物よりもはるかにより高い収率で、はるかにより高品質の生成物を提供する）。

【0330】

製造プラントが占有されており、その間に同じプラント内で他の生産を行うことができないため、製造費用は、製造時間に正比例する。

【0331】

本発明のプロセスにおけるアネキシンＡ５の収率は、Ｍａｒｄｅｒらによって生産される生成物よりも、バッチあたり２～３倍高いと算出される。これは、アネキシンＡ５タンパク質１グラムあたりの製造費用が、Ｍａｒｄｅｒのプロセスにおいて（６×２－３＝）１２～１８倍高いということである。

【0332】

さらに、Ｍａｒｄｅｒのプロセスからのタンパク質の純度は、ヒト使用に好適でないであろう。入念な遠心分離にもかかわらず、１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程のみが使用され、これは、インプロセス関連の不純物（とりわけ内毒素）及び生成物関連のバリアントの両方に関して、十分な純度に達するための要件をはるかに下回る。Ｍａｒｄｅｒは、内毒素レベルまたは他の不純物に関していかなるデータも示しておらず、薬学的使用における好適性の欠如がさらに示唆される。

【0333】

それに加えて、Ｍａｒｄｅｒのプロセスの非常に緩徐な遠心分離操作は、アネキシンＡ５タンパク質を不安定な環境に長期間さらすことを必要とする。これは、生成物分解または生成物変性をもたらす可能性が高く、生成物品質に関してマイナスの影響を伴う長時間の製造操作のさらなる欠点である。

【0334】

実施例１

【0335】

導入：
組換え約３６ｋＤａタンパク質アネキシンＡ５を含有する３２０アミノ酸を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＨＩＰ．ＡＮＸＡ５の細胞質において発現させる。組換えアネキシンＡ５を、主にその可溶性形態で生産する。アネキシンＡ５のコード配列を有する、熱誘導性発現プラスミドｐＨＩＰを使用する。選択的マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子である。それぞれのクローンのＭＣＢは樹立され、広範に特徴付けられている。

【0336】

製造プロセスは、３Ｌ発酵体積に匹敵する実験室規模から、１００Ｌ発酵体積に匹敵する大規模まで規模拡大する。

【0337】

開発されたプロセスは、粗ライセートからの効率的な陰イオン交換捕捉、続いてカルシウムの存在下での固定化ヘパリンによる親和性工程を含む。この中間親和性工程は、アネキシンＡ５に高度に特異的である。最終精錬工程として、高溶解度陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する。精錬工程は、生成物関連不純物の分離を可能にする。１０ｋＤのＮＭＷＣＯカセットを用いた限外－透析濾過によって製剤化を実施する。

【0338】

この実施例は、製造プロセスにおける計画された適合／変更を説明及び評価し、移入の成功を保証するための操作上のパラメータ及び必要な措置を決定し、その成功を決定するための十分な基準を定義する。移入の成功は、同等の収率及び品質のＤＳをもたらす、規模拡大に関して実験室規模の手順への適合を実装する下流プロセス運転の性能によって示される。

【0339】

全体的なプロジェクトの目的は、アネキシンＡ５のためのｃＧＭＰ製造プロセスの開発である。

【0340】

手順－プロセス比較及び評価
この節では、使用したプロセスパラメータ、原材料、消耗品、緩衝液及び機器を評価する。

【0341】

図２は、アネキシンＡ５の製造のための完全なプロセスの概略的全体図を示す。

【0342】

表１は、３Ｌ及び１００Ｌプロセスによって使用された原材料を比較及び評価する。
表１：３Ｌ及び１００Ｌプロセスによって使用された原材料の比較

【0343】

表２は、３Ｌ及び１００Ｌプロセスによって使用された消耗品を比較及び評価する。消耗品（試料採取デバイス、及び管類）は、ＤＳＰプロセスの生成物品質及び収率に影響を及ぼすべきではない。使用したすべての材料は、要求される規格を満たす。
表２：消耗品の一覧

【0344】

総説：
●使用したすべての消耗品は、単回使用または生成物専用の素材である。
●緩衝液貯蔵用に及び中間生成物容器として使用したバッグは、プロセス全体を通してＰＥ／ＥＶＯＨ層（ＣＸ５－１４フィルム）を備えたＳａｒｔｏｒｉｕｓからのものである。例えば、滅菌性、低い内毒素ならびに漏出性物質及び抽出性物質に関して、同製造業者によって検証されたバッグ。
●管類、コネクタ、試料採取システムまたは試料容器などの生成物と接触する素材を含む、使用したすべての他の消耗品は、本プロセスのそれぞれの工程において目的に適合する。これには、通常、ＵＳＰクラスＶＩ認定、滅菌性及び／または該当する場合には低い内毒素が含まれる。バッグと一体化されたＣ－Ｆｌｅｘ管類を除いて、ＤＳＰ全体を通して白金硬化シリコーン管類を使用する。使用したすべての消耗品は、動物由来の構成成分を含まないか、またはＴＳＥ認定が入手可能である。

【0345】

表３は、アネキシンＡ５の製造のための３Ｌ及び１００Ｌプロセスによって使用された機器を比較する。
表３：使用した機器の一覧

【0346】

媒体、緩衝液及び溶液は表４に示される通り。緩衝液の規格は、伝導率に関してのみ適用され、試験緩衝液調製に基づく。緩衝液は、本プロセス前に調製し、それらの規格に従って試験し、精密濾過し（０．２μｍフィルター）、貯蔵する（室温で３カ月以下の保持時間）。使用時点で緩衝液の試料採取（参照として；分解：内毒素、バイオバーデン）を行う。
表４：媒体及び溶液の一覧

【0347】

規模変更可能な供給バッチ発酵プロセスを開発し、生産単位で規模拡大した。下流精製プロセスは、３つのクロマトグラフィー工程を含む。ベンゾナーゼ処理後、濾過及び希釈した供給流を第１の捕捉工程としてＡＸクロマトグラフィー（ＱセファロースＸＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。溶出液を希釈によってコンディショニングして、親和性クロマトグラフィー（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｈｙｐｅｒ Ｄ Ｍ、Ｐａｌｌ）を用いた中間精製を可能にする。ＡＦプールを希釈し、最終ＡＸクロマトグラフィー工程（Ｓｏｕｒｃｅ１５ Ｑ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。最後に、濃縮及び緩衝液交換をＵＦ／ＤＦによって実施する。

【0348】

３Ｌ発酵体積に匹敵するＤＳＰで成功裏の試運転を実行して、すべてのプロセス工程のために十分なプロセス性能を実証した。

【0349】

目標範囲を小規模なプロセスによって定義し、これを用いて規模拡大の結果を評価する。

【0350】

プロセスの比較
次の節では、実験室規模の下流プロセス（ＤＳＰ）を、３Ｌ発酵体積に匹敵するプロセス規模で行った試運転に基づいて詳述する。一般に、第１の捕捉工程への負荷は別として、クロマトグラフ工程は、ＡｅｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒシステムを用いて実験室規模で行う。大規模において、すべてのクロマトグラフ工程は、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓシステムで実施する。ＤＳＰの規模拡大係数は、３３である（３Ｌ_ＵＳＰから１００Ｌ_ＵＳＰまで）。

【0351】

１．１．１ バイオマスの再懸濁、ベンゾナーゼ処理及び細胞破壊
発酵後、バイオマスを遠心分離によって採取し、－２０℃で貯蔵する。下流プロセシングをバイオマスの融解及びホモジナイゼーション緩衝液１中への再懸濁により開始する。ホモジナイゼーションの前に、ホモジナイゼーション緩衝液（３．３００Ｕ／Ｌ_ＵＳＰまたは１．８５０Ｕ／Ｌ_{再懸濁させたバイオマス}）中に予備希釈したベンゾナーゼを、再懸濁させた細胞に添加する。再懸濁比率は、１ｇバイオマス／１０ｍＬに設定する。ホモジナイゼーションを６００バールで３サイクル行って、次の捕捉工程に有益である高度な均一性を達成する。核酸のベンゾナーゼによる最適な消化を可能にするために最大４０℃の昇温が望まれるため、ホモジナイゼーション内で能動的冷却は何ら必要とされない。小規模では、３６～４０℃の温度範囲を得た。

【0352】

バイオマスの再懸濁、ベンゾナーゼ処理及び細胞破壊についてのプロセス流れ図が下記に示される。

【0353】

１．１．２ 清澄化、コンディショニング及び捕捉クロマトグラフィー
ホモジナイゼーションに後続して、ライセートを、Ｃｕｎｏ ６０ ＳＰ（０．６～０．２μｍ）デプスフィルターを使用した濾過によって清澄化する。この工程は、核酸の含量を低減するため、及び、捕捉クロマトグラフィーに適用可能な、粒子が低減された溶液を得るために実施する。製造業者の指示に従ってデプスフィルターを水で予備洗浄する。

【0354】

濾過後、ライセートを１％Ｔｗｅｅｎ８０で２倍希釈する。ＥＤＴＡを、２ｍＭの最終濃度になるように添加する。

【0355】

このコンディショニングしたプールをペリスタルティックポンプにより、オフラインでＡＸ捕捉クロマトグラフィーに適用する。ＡＸ捕捉カラムを２カラム体積（ＣＶ）（２０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、２５ｍＭ ＮａＣｌ）で、２００ｃｍ／ｈの線形ポンプ速度で平衡化する。

【0356】

負荷後、カラムを平衡化緩衝液により５ＣＶでオフラインで洗浄し、その後、クロマトグラフィー系に移して、さらに５ＣＶの洗浄を行う。アネキシンＡ５溶出を、高濃度の塩（２０ｍＭトリスｐＨ７．４；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；３００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して段階溶出により９ＣＶで実施する。分別は、０．１吸収単位（ＡＵ）刻みでＵＶ_{２８０ｎｍ}シグナルの上昇から、下行ピークにおける０．２ＡＵまでで定義する。全溶出ピークをさらにプロセスする。

【0357】

２工程ＣＩＰ手順を実施して、カラムを再生及び清浄化する（工程１：２Ｍ ＮａＣｌで３ＣＶ、１００ｃｍ／ｈ；上向流／工程２：１Ｍ ＮａＯＨ、３ＣＶ；インキュベーションを１５時間超、４０ｃｍ／ｈ上向流）。カラムを２０ｍＭのＮａＯＨにおいて最終的に貯蔵する。

【0358】

図３は、ＡＸ捕捉クロマトグラフィーについてのプロセス流れ図を提供する。

【0359】

一般に捕捉工程は、中間工程の性能を強化するコンディショニング工程とみなすことができる。それは、生成物を濃縮し、負荷物のマトリックスを著しく変化させる。その上、内毒素の強力な低減（約９７％）ならびにＤＮＡ及びＨＣＰの中程度の低減が観察された。

【0360】

１．１．３ 中間親和性クロマトグラフィー
得られたＡＸ溶出プール（２５０ｍＬ／Ｌ_ＵＳＰ）を、中間クロマトグラフィーの前に濾過した（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２ ０．４５～０．２μｍ）。

【0361】

濾過されたＡＸプールをその後、８倍希釈した（希釈緩衝液：２０ｍＭトリスｐＨ７．４；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；２ｍＭ ＣａＣｌ_２）。カルシウムでの希釈は、アネキシンＡ５が固定化ヘパリンクロマトグラフィーに結合することを可能にする。この相互作用は、イオン性相互作用と比較して、緩徐である。接触時間は重大であり、したがってクロマトグラフィーは、１００ｃｍ／ｈ以下で行われる。

【0362】

２つの洗浄工程を実施する。洗浄工程１を１５ＣＶ（２０ｍＭトリスｐＨ７．４；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；２ｍＭ ＣａＣｌ_２）で実施し、続いて第２の洗浄工程を２ＣＶで、カルシウムを含有しない緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７．４；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて行う。

【0363】

溶出を、カルシウムイオンをキレートするＥＤＴＡ（２０ｍＭトリスｐＨ７．４；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；２５ｍＭ ＮａＣｌ）を含有する緩衝液を使用した段階溶出により行う。キレート反応は、カルシウムの存在下でのみヘパリンに結合し得るアネキシンＡ５を特異的に溶出する。濃縮溶出を可能にするために、溶出において流速を６０ｃｍ／ｈ以下にまで低減した。完全な溶出ピークは、例えば、０．０５ＡＵでＵＶシグナルの上昇から開始して、下行ピークにおける０．０５ＡＵまでで収集し、これはおよそ７ＣＶに相当する。溶出プロファイルは、単一の鋭いピークを示す。

【0364】

２工程ＣＩＰ手順を実施して、カラムを再生及び清浄化する（工程１：２Ｍ ＮａＣｌで３ＣＶ、１００ｃｍ／ｈ；上向流／工程２：０．１Ｍ ＮａＯＨ、３ＣＶ；インキュベーションを１５時間超、４０ｃｍ／ｈ上向流）。カラムを２５％ＥｔＯＨ中１Ｍ ＮａＣｌにおいて最終的に貯蔵する。

【0365】

図１は、中間親和性クロマトグラフィーについてのプロセス流れ図を示す。

【0366】

中間工程は、は、本プロセススキームにおいて最も有力な精製工程である。アネキシンＡ５は、カルシウムイオンに結合する。このカルシウムに結合した状態において、生成物は、ヘパリンとの高度に特異的な結合を形成できる。カルシウムと錯化する能力を有する正しく折り畳まれたアネキシンＡ５形態のみがヘパリンに結合できる。それによって、親和性クロマトグラフ工程は、正しく折り畳まれた生成物と誤って折り畳まれた生成物とを識別することができる。それに加えて、中間工程は、高度に特異的な相互作用が、カルシウムのＥＤＴＡでのキレート反応による特異的な溶出モードと組み合わされるとき、高い除去係数に達する。したがって、ＤＮＡ含量の中程度の低減と組み合わせて、内毒素（さらにおよそ９９％の低減）及びＨＣＰの強力な低減が観察される。

【0367】

第１のＡＸ捕捉工程（約９７％）及び中間親和性クロマトグラフィー工程（約９９％）の内毒素低減効果の組み合わせは、内毒素レベが第１のＡＸ工程の前の清澄化された生成物中のレベルの約０．０３％まで低減された、アネキシンＡ５生成物を提供する。

【0368】

１．１．４ 精錬ＡＸクロマトグラフィー
得られたＡＦ溶出プール（３００ｍＬ／Ｌ_ＵＳＰ）を２倍希釈し（３５ｍＭトリスｐＨ８；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、精錬クロマトグラフィーの前に濾過する（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２ ０．４５～０．２μｍ）。希釈は、ＡＸ負荷物の伝導率を低減するが、さらには遊離ＥＤＴＡ分子をＭｇイオンと錯化もさせる。さもなければ、遊離ＥＤＴＡはカラムに結合し、それによって、この工程における容量を主として低減するが、さらには分離も低減する。

【0369】

精錬樹脂は、１５μｍの平均樹脂直径を有するＳｏｕｒｃｅ１５ Ｑである。それは、高背圧の不都合を有する高溶解度精錬樹脂である。したがってクロマトグラフィーは、１００ｃｍ／ｈで行われる。適切な溶解度を可能にするために、負荷量は１６ｇ／Ｌ樹脂未満であるべきである。

【0370】

負荷後の洗浄を緩衝液Ａ（２０ｍＭビス－トリスｐＨ７；２５ｍＭ ＮａＣｌ）により３ＣＶで実施する。溶出を、３３ＣＶ中、１００％Ｂ（２０ｍＭビス－トリスｐＨ７；１８０ｍＭ ＮａＣｌ）までの直線勾配を用いて行う。このクロマトグラフ工程は、生成物関連不純物の除去のために主に設計される。様々な形態のアネキシンＡ５が、主ピークにより開始して４０～１００％Ｂから溶出し、第２の低減されたピーク及びいくつかのより小さなピークがこれに続く。

【0371】

０．０５ＡＵで開始し、ピーク１とピーク２の間の谷まで（およそ７ＣＶに相当する）の第１の主ピークが収集される。

【0372】

２工程ＣＩＰ手順を実施して、カラムを再生及び清浄化する（工程１：２Ｍ ＮａＣｌで３ＣＶ、１００ｃｍ／ｈ；上向流／工程２：１Ｍ ＮａＯＨ、３ＣＶ；インキュベーションを１５時間超、４０ｃｍ／ｈ上向流）。カラムを２５ｍＭ ＮａＣｌにおいて最終的に貯蔵する。

【0373】

小規模実験で得られた最近の結果は、Ｔｗｅｅｎ８０のプラスの効果を示唆した。０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を用いて実施されたプロセスは、中間プロセス後の生成物収率をおよそ３０％増加させた。適切な溶解度を確実にするために、精錬工程への負荷量は１６ｇ／Ｌ樹脂までに制限する。収率の改善もまた、規模拡大シナリオに影響を有する。精錬工程における算出したカラム寸法を２サイクルで設計した。１００Ｌ_ＵＳＰ規模からの総量をプロセスする場合、増加した収率には、４～５サイクルのシナリオが必要となる。

【0374】

図２は、ＡＸ精錬クロマトグラフィー工程についてのプロセス流れ図を示す。

【0375】

精錬工程は、生成物に関連する不純物の低減、例えば、様々なアネキシンＡ５アイソフォームの分離のために、主に実施される。それに加えて精錬工程は、残留ＤＮＡに対するプロセスにおいて最も高い除去係数に達し、ＨＣＰを強力に低減する。内毒素は、中間工程後にすでに低レベルにあるが、約９９％さらに低減され、これは、内毒素レベルを、第１のＡＸ工程の前の清澄化された生成物中のレベルの約０．０００３％まで推移させる。

【0376】

１．１．５ アネキシンＡ５の限外／透析濾過及び製剤化
生成物濃度を上昇させ、緩衝液変更を行うために、ＡＸプールをＵＦ／ＤＦに直接移す。緩衝液変更に続いて、Ｔｗｅｅｎ８０を、０．０５％の最終濃度になるように添加し、原薬を滅菌濾過する。

【0377】

第１のプロセス工程において、ＡＸプールを６～８倍濃縮する。これに続いて、緩衝液変更を、Ｔｗｅｅｎを含有しない製剤緩衝液（２０ｍＭビス－トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２ ｐＨ７またはｐＨ７．４）中、８～１０透析濾過体積で実施する。緩衝液変更後、第２の濃縮を実施して、１２ｇ／Ｌの最終濃度を得る。これは、０．０５％の最終濃度へのカセットの第１の洗浄液の添加及びＴｗｅｅｎ８０の添加により、滅菌濾過後の１０ｇ／Ｌの最終濃度に達することを可能にする。被覆層形成を最小限にするために、ＵＦ／ＤＦ工程を０．９～１．１バールの低ＴＭＰで実施する。

【0378】

図３は、アネキシンＡ５の限外／透析濾過及び製剤化についてのプロセス流れ図を示す。

【0379】

２つの目標値及び許容基準
本プロセスの性能及び規模拡大を小規模ＤＳＰ実行と比較して評価するために、次の目標値及び許容基準を定義する。目標値は、試運転のＩＰＣ／バルク分析に基づいて定義する。重要なプロセス工程を指定し、プロセス性能の信頼性を強化するために、重要なプロセスパラメータを特徴付けた。

【0380】

２．１ 主要なプロセスパラメータ
表５は、主要なプロセスパラメータを示す。本プロセス実施中の目標範囲の達成は、成功裏のプロセス規模拡大を示す。
表５：プロセス工程のプロセスパラメータ及びそれぞれの目標値

【0381】

２．２ 重要なプロセスパラメータ
捕捉クロマトグラフィー前の懸濁液の高度な均一性は重要である。これを達成するために、ホモジナイゼーション３サイクルの使用が好適である。その上、３７℃の範囲のライセートの温度を得るために、ホモジナイゼーション内の温度増加が好適である。これは、濾過工程及び捕捉性能への直接的影響を有するベンゾナーゼの活性に重要である。

【0382】

精錬工程からのプーリングもまた、この工程が生成物関連不純物の分離に使用されるため、重要である。被覆層の形成を最小限にするために、ＵＦ／ＤＦ工程をＴＭＰに関して中程度の条件下で行う。
表６：重要なプロセスパラメータ

【0383】

２．３ インプロセス制御
表７は、インプロセス制御を示す。本プロセス実施中に目標範囲が達成されることは、成功裏のプロセス規模拡大を示す。目標範囲を、実装された変更により行ったにすぎない、先の小規模実行における観察に基づいて設定する。

【0384】

３ 結論
上述の製造プロセスは、必要とされる場合、１０，０００Ｌ以上の規模のために、隘路を伴わずに大規模製造によく適合される。

【0385】

ＧＭＰ試験的プラントにおいて規模拡大した２００Ｌを用いた試運転の後に、本プロセスは、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１．８ｐｇ宿主細胞ＤＮＡ、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１６．６ｎｇ宿主細胞タンパク質、及びＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり０．１ＥＵを有する生成物を送達した。

【0386】

本製造プロセス全体を通して、アネキシンＡ５タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂に一時的に結合していない場合、その活性形態で溶液中に維持される。

【0387】

１，０００Ｌ培養物に適用するとき、製造プラントにおける全体的なプロセス時間は、クロマトグラフィーの前の発酵、採取、細胞破壊及び処理で１週間、ならびに下流プロセシングで連続した１週間であろう。ＧＭＰにおける全プロセスは２週間であろう。これは、規模とは独立しており、工業規格に完璧に適合され、いずれのＣＭＯまたは医薬品製造業者にも順応するであろう。

【0388】

上述のように、比較すると、Ｍａｒｄｅｒらのプロセスは、１，０００Ｌ培養物をプロセスするのに１２週間前後かかるであろう。

【0389】

その上、本発明のプロセスにおける収率は、Ｍａｒｄｅｒらの収率よりも、バッチあたりで２～３倍高い。これは、アネキシンＡ５原薬１グラムあたりの製造費用が、Ｍａｒｄｅｒのプロセスにおいて（６－８×２－３＝）１２～２４倍高いということである。

【0390】

さらに、Ｍａｒｄｅｒらのプロセスよりも高速、かつより高い収率での精製プロセスを提供することに加えて、本発明のプロセスはまた、より高純度の生成物も提供する。比較例１において上記で考察されるように、Ｍａｒｄｅｒのプロセスからのタンパク質の純度は、ヒト使用に好適でないであろう。入念な遠心分離にもかかわらず、Ｍａｒｄｅｒのプロセスにおいては１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程のみが使用され、これは、インプロセス関連の不純物（とりわけ内毒素）及び生成物関連のバリアントの両方に関して、十分な純度に達するための要件をはるかに下回る。Ｍａｒｄｅｒは、内毒素レベルまたは他の不純物に関していかなるデータも示しておらず、薬学的使用における好適性の欠如がさらに示唆される。

【0391】

対照的に、本出願のプロセスは、次のような列挙される特質を有する、純度の高いアネキシンＡ５タンパク質生成物を提供する。
－典型的に８～１２ｇ／Ｌ前後の濃度、
－１００ｎｇ／ｍｇ以下、より典型的には２０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質レベル（ＥＬＩＳＡによって決定）、
－１００ｐｇ／ｍｇ以下、より典型的には１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡレベル、
－３５ＥＵ／ｍｇ以下、より典型的には１ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素、
－サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して９５％超の純度、
－１ｃｆｕ／ｍＬ未満のバイオバーデン（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．１２によって決定）、
－可視的粒子のない無色透明の外観、及び
－ウェスタンプロット解析によって検出されるメインバンドが、アネキシンＡ５参照に対応する。

【0392】

本プロセスを、第２の精錬工程のために、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑの代わりにＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓを用いて反復した。これは、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ陰イオン交換樹脂が高結合容量を有し、背圧を伴わずに高流速に耐え、より高いベッド高さで充填され得、より低い価格を有することから、さらにより効率的なプロセスを提供した。最終生成物の品質及び純度は、維持された。

【0393】

Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑと比較して、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ樹脂は、下記を有する。
●グラム／リットル樹脂の単位で２倍を超える容量
●同じ背圧で２倍を超えてより高い流速に耐える
●典型的に約３５～６０％高い、より高いベッド高さで充填され得、これは、任意の所与のカラム床面積につきより高い容量を提供する、ならびに
●樹脂１リットルあたりの購入価格の半分未満の費用。

【0394】

実施例２
この実施例は、ヘパリンクロマトグラフィーによる陰イオン交換（ＡＸ）捕捉及び親和性捕捉の比較を例示した。

【0395】

ＡＸ捕捉及びヘパリン親和性捕捉クロマトグラフィーを、捕捉溶出液中のアネキシンＡ５工程収率及び純度に関して比較した。両戦略を、最適化した条件下でバッチ実験において比較した。

【0396】

試験パラメータ：
ＡＸクロマトグラフィー：
バッチモード５００μｌ樹脂（７５％スラリー）
緩衝液ＡＸ Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ
緩衝液ＡＸ Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ
ＡＸクロマトグラフィー：負荷：１０ｍＬの事前濾過したライセート
ＣＩＰ：１Ｍ ＮａＯＨ
ヘパリン親和性クロマトグラフィー：
バッチモード５００μｌ樹脂（７５％スラリー）
負荷：１０ｍＬの事前濾過したライセート；＋１０ｍＭ ＣａＣｌ_２
緩衝液ＡＦ Ａ：５０ｍＭトリスｐＨ７．４、５ｍＭ ＣａＣｌ_２
緩衝液ＡＦ Ｂ：５０ｍＭトリスｐＨ７．４、４０ｍＭ ＥＧＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ
ＣＩＰ：３Ｍ ＮａＣｌ
表７：ＡＸ及びヘパリン親和性クロマトグラフィー捕捉の比較

【0397】

これらの結果は、親和性クロマトグラフィーの前にＡＸ捕捉を行うことが、純度を著しくは改善しないが、ヘパリン工程の収率にはかなりの影響を有することを実証する。その上、費用のかかる親和性樹脂は、中間工程として使用される場合、長期の寿命を有する。収率は、非常に重要である。

【0398】

ＡＸによる捕捉は、ヘパリンクロマトグラフィーによる高度に特異的な親和性工程の有効な使用を可能にするコンディショニング工程とみなされ得る。

【0399】

実施例３
部分的に精製したアネキシンＡ５生成物を、第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程まで実施例１と同様の方法を用いて得た。

【0400】

簡潔に述べると、アネキシンＡ５を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉを、３２００Ｕのベゾナーゼ（Ｂｅｚｏｎａｓｅ）とともにホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．５）に再懸濁させ、６００バール圧力で３サイクルにより均一化した。ホモジナイゼーション後の温度は、３６℃と測定された。Ｃｕｎｏ ６０ ＳＰ０．６～０．２μｍを使用した清澄化工程を行い、清澄化された溶液を１％Ｔｗｅｅｎ２０中でＥＤＴＡの添加により１：２希釈した。捕捉のためのコンディショニング後、溶液は、ｐＨ６．９及び２．７ｍＳ／ｃｍの伝導率を有した。陰イオン交換を、ＱセファロースＸＬ（ＧＥ）を使用して行い、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０，１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０，１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）溶出した。結果として得られた生成物を次いで０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。

【0401】

結果として得られた滅菌濾過された陰イオン交換生成物を、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いて精製し、様々な条件を試験した。

【0402】

使用したヘパリン親和性クロマトグラフィー条件は次の通りであった。

【0403】

捕捉溶出プールの滅菌濾過をＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ０．４５～０．２μｍで行った。このプールをヘパリンクロマトグラフィーからの（１０５０ｍＬ）緩衝液Ａで８倍希釈した。結果として生じたプールは、７．４のｐＨ及び６．８ｍＳの伝導率を有した。６０ｃｍ／ｈの低減した流速を用いて溶出を実施した。

【0404】

Ｔｗｅｅｎ８０の影響を決定するために、洗浄には緩衝液Ａを及び溶出には緩衝液Ｂを使用して、試験１及び２を行った。
試験１：
緩衝液Ａ ２０ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４
緩衝液Ｂ ２０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４
試験２：
緩衝液Ａ ２０ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０ ｐＨ７．４
緩衝液Ｂ ２０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０ ｐＨ７．４
試験１についての結果は図７Ａに示され、試験２についての結果は図７Ｂに示される。

【0405】

結果は、標準条件下で分離させた溶出液とは対照的に（試験１）、Ｔｗｅｅｎ８０の添加が溶出液を単一ピークへと推移させたことを示す。Ｔｗｅｅｎ８０は、アネキシンＡ５を安定化させるように思われる。この溶出挙動の変化についての考えられる説明は、カラム上への理論上の沈殿が防止されるということである。ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程におけるＴｗｅｅｎ８０の使用に関して、次の２つの主要なプラスの効果が記載され得る。
－低減された圧力：負荷において０．５から２～３バールまで増加した、カラムにかかる圧力は、０．５バールまで明らかに低減された。これは大規模に対してとりわけ有益である。長期のインキュベーション後に見られる若干の沈殿が、この圧力増加の理由であり得る。
－沈殿の防止：第２のプラスの効果は、溶出において見られる。溶出液の分別のうち、高度に濃縮された主ピーク溶出画分は、沈殿する傾向を有する。この効果が主ピークにおける非常に高濃度のアネキシンＡ５と関係すると仮定すると、溶出画分のプーリング後、沈殿はもはや何も観察されず、その上、沈殿は、可逆的なようである。主ピークにおける沈殿は、溶出液中の塩濃度の上昇によっても防止することができなかった。これとは対照的に、Ｔｗｅｅｎ８０の添加はまた、主ピーク溶出画分における沈殿物の形成も防止した。
これらの結果に基づいて、すべての中間クロマトグラフィー緩衝液中にＴｗｅｅｎ８０を追加的に添加することは、それがアネキシンＡ５に対して安定化効果を有するため、有利であると思われる。

【0406】

実施例４
部分的に精製したアネキシンＡ５生成物を、第１の陰イオン交換クロマトグラフィー捕捉工程まで実施例１と同様の方法を用いて得た。

【0407】

陰イオン交換工程の１．２５ｍＬの生成物を次いで、８．７５ｍＬの様々な形態の試験希釈緩衝液と混合した。混合物を次いで周囲温度でインキュベートし、３０分後、１８時間後、及び４日後に目視評価した。

【0408】

結果が下記の表に示される。

【0409】

これらの結果は、試料中の生成物沈殿を回避する上でＴｗｅｅｎ ８０（すなわちポリソルベート８０）を添加することの有益性を示した。これは、沈殿を低減し、カラムに送液するときの背圧の増加を予防するために、親和性クロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフカラムへの適用の前にＡｎｘＡ５生成物をコンディショニングする関連において重要である。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-04-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液からの回収及び／または精製のためのプロセスであって、
方法は、ＡｎｘＡ５タンパク質及び１種以上の不純物を含む溶液を、Ｔｗｅｅｎ８０の存在下で、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に供して、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の親和性クロマトグラフィー生成物を生産することを含む、
プロセス。

【請求項2】

Ｔｗｅｅｎ８０の存在が、０．１％のＴｗｅｅｎ８０の存在である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて、いずれの先行または後続の工程も含むプロセス全体を通して溶液中にとどまる、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程が、ＡｎｘＡ５タンパク質の固定化ヘパリンへの結合を含み、結合がカルシウムイオンの存在によって促進される、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

ＡｎｘＡ５タンパク質が、カルシウム金属イオンキレート剤を含有する溶出緩衝液を使用して固定化ヘパリンから溶出される、請求項４に記載のプロセス。

【請求項6】

カルシウム金属イオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項５に記載のプロセス。

【請求項7】

第１の親和性クロマトグラフィー生成物が、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質、及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項8】

カルシウム金属イオンキレート剤がＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである、請求項７に記載のプロセス。

【請求項9】

カルシウム金属イオンキレート剤が０．１～５００ｍＭの範囲である、請求項７または８に記載のプロセス。

【請求項10】

カルシウム金属イオンキレート剤が１０ｍＭである、請求項９に記載のプロセス。

【請求項11】

アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含むタンパク質の、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物からの回収及び／または精製のための陰イオン交換工程を含み、
ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物が、請求項５～９のいずれか１項に記載のプロセスの、直接または間接的生成物であり、
陰イオン交換工程を行い、それによって、組成物からＡｎｘＡ５タンパク質を回収及び／または精製するために、陰イオン交換工程が組成物を陰イオン交換樹脂に供することを含むことを特徴とし、
陰イオン交換工程が、追加の金属イオンの存在下で実施されることをさらに特徴とし、
追加の金属イオンは、カルシウム金属イオンキレート剤が、選択された金属イオンに対して、陰イオン交換樹脂に対するその結合親和性よりも大きいが、カルシウムイオンに対するその結合親和性よりは小さい結合親和性を有するように選択される、
請求項５～９のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項12】

ＡｎｘＡ５タンパク質は、任意のクロマトグラフ樹脂に一時的に結合した場合を除いて、いずれの先行または後続の工程も含むプロセス全体を通して溶液中にとどまる、請求項１１に記載のプロセス。

【請求項13】

（ａ）カルシウム金属イオンキレート剤が、ＥＤＴＡまたはその塩、またはＥＧＴＡまたはその塩から選択され、
（ｂ）カルシウム金属イオンキレート剤が、０．１ｍＭを上回る、及び／または０．１ｍＭ以上の濃度で、組成物中に存在する、
（ｃ）追加の金属イオンが、二価陽イオンである、
（ｄ）追加の金属イオンが、陰イオン交換工程中、１～１００ｍＭの濃度で存在する、かつ／または
（ｅ）カルシウム金属イオンキレート剤が、ＥＤＴＡであり、追加の金属イオンがＭｇ ^２＋ イオンである、
請求項１１または１２に記載のプロセス。

【請求項14】

（ａ）のカルシウム金属イオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項１３に記載のプロセス。

【請求項15】

（ｃ）の二価陽イオンがＭｇ ^２＋ イオンである、請求項１３に記載のプロセス。

【請求項16】

（ｅ）のＥＤＴＡ、及びＭｇ ^２＋ イオンは、Ｍｇ ^２＋ イオン対ＥＤＴＡのモル比が０．５：１から２：１である、請求項１３に記載のプロセス。

【請求項17】

Ｍｇ ^２＋ イオン対ＥＤＴＡのモル比が、１：１または１：１超である、請求項１６に記載のプロセス。

【請求項18】

先行する親和性クロマトグラフィー工程と陰イオン交換工程との間に透析工程が存在せず、かつ／または直接または間接的生成物の陰イオン交換工程への適用の前に先行する親和性クロマトグラフィー工程の生成物からのカルシウム金属イオンキレート剤の除去が行われない、
請求項１１～１７のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項19】

追加の金属イオンが、陰イオン交換工程の前または陰イオン交換工程中に、組成物に追加される、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項20】

細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞、または少なくとも１００Ｌの体積を有するその培養物からの、アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）の配列を含む組換え的に発現された細胞内タンパク質の回収及び／または精製のためのプロセスであって、
（ａ）プロセスが、非イオン性界面活性剤を含むホモジナイゼーション緩衝液の存在下で、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞から細胞内タンパク質を放出させる工程を実施することを含み、
（ｂ）プロセスが、第１の陰イオン交換工程を実施し、それによって、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を含む第１の陰イオン交換生成物を生産するために、放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に陰イオン交換樹脂に供する工程をさらに含み、
（ｃ）プロセスが、請求項１～１０のいずれか１項に記載のプロセスに従って、第１の陰イオン交換生成物の放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的にヘパリン親和性クロマトグラフィー工程に供する工程をさらに含み、
（ｄ）ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程の生成物が、ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む組成物であり、かつ
（ｅ）ＡｎｘＡ５タンパク質及びカルシウム金属イオンキレート剤を含む、ヘパリン親和性クロマトグラフィー工程の直接または間接的な生成物が、請求項１１～１９のいずれか１項に記載のプロセスに従って、陰イオン交換工程に供される、
プロセス。

【請求項21】

（ａ）の非イオン性界面活性剤がポリソルベートである、請求項２０に記載のプロセス。

【請求項22】

ポリソルベートがＴｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０から選択される、請求項２１に記載のプロセス。

【請求項23】

ポリソルベートがＴｗｅｅｎ８０である、請求項２２に記載のプロセス。

【請求項24】

（ｂ）における放出されたＡｎｘＡ５タンパク質を直接または間接的に陰イオン交換樹脂に供する工程が、カルシウム金属イオンキレート剤の存在下である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項25】

工程（ａ）から（ｅ）のいずれにおいても、遠心分離及び／または透析から選択される１つ以上の工程は含まれない、または該工程が介在しない、請求項２０～２４のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項26】

ＡｎｘＡ５タンパク質が、プロセス全体を通して、陰イオン交換及び親和性クロマトグラフィー固相に一時的に結合した場合を除いて可溶性のままである、請求項２５に記載のプロセス。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のプロセスであって、
（ａ）濃縮、
（ｂ）緩衝液変更、
（ｃ）コンディショニング、
（ｄ）濾過、滅菌濾過及び／または透析濾過、
（ｅ）ＡｎｘＡ５タンパク質を化学修飾すること、及び
（ｆ）ＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器中に貯蔵する最終工程、
からなる群から選択される１以上のさらなる工程を含む、プロセス。

【請求項28】

（ｅ）の化学的に修飾することがＡｎｘＡ５タンパク質のＰＥＧ化である、請求項２７に記載のプロセス。

【請求項29】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のプロセスの終わりに、前記１以上のさらなる工程を含む、請求項２７に記載のプロセス。

【請求項30】

（ｄ）の濾過が０．４５～０．２μｍフィルター、または０．２２μｍフィルターを使用する、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項31】

（ｄ）の透析濾過工程をさらに含み、透析濾過工程の生成物が１ｍｇ／ｍＬまたはより高い濃度でＡｎｘＡ５タンパク質を含む、請求項２７または２８に記載のプロセス。

【請求項32】

（ｅ）のＡｎｘＡ５タンパク質を化学修飾する工程が追加の精製を含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項33】

追加の精製が、未反応の構成成分を低減するもしくは除去すること、及び／または化学修飾ＡｎｘＡ５タンパク質の均一集団を選択することを含む、請求項３２に記載のプロセス。

【請求項34】

最終工程が、（ｆ）の滅菌容器中にＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を貯蔵することであり、滅菌濾過がＡｎｘＡ５タンパク質含有生成物を滅菌容器中に貯蔵する前の最終精製工程である、請求項２７～３３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項35】

（ａ）プロセスが、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ _２ 、０．０５％（ｗ／ｖ） ポリソルベート、または他の非イオン性界面活性剤を含むｐＨ７．４の無リン酸緩衝液中に、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を提供するのに必要な工程を含み、かつ／または
（ｂ）プロセスが、最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質を提供し、存在するＮａＣｌ濃度がＡｎｘＡ５タンパク質を主として単量体である形態で維持する、
請求項１～３４のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項36】

（ａ）の無リン酸緩衝液がビス－トリスまたはトリス緩衝液である、請求項３５に記載のプロセス。

【請求項37】

（ａ）のポリソルベートがＴｗｅｅｎ８０である、請求項３５または３６に記載のプロセス。

【請求項38】

（ａ）の最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の濃度が１０ｍｇ／ｍＬである、請求項３５～３７のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項39】

（ａ）プロセスが、宿主細胞培養物１Ｌあたり１ｇ超のＡｎｘＡ５タンパク質の全収率を提供する、
（ｂ）プロセスが、宿主細胞培養物中に存在するＡｎｘＡ５タンパク質の２４重量％のＡｎｘＡ５タンパク質の全回収率を提供する、
（ｃ）プロセスが、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ｎｇ、またはそれ未満のレベルで宿主細胞タンパク質（組換え的に発現されたＡｎｘＡ５タンパク質以外）を含む生成物を提供する、
（ｄ）プロセスが、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ＥＵ未満の内毒素含量を含む生成物を提供し、かつ／またはプロセスが、単位剤形にある生成物を提供し、生成物が、単位用量あたり１００ＥＵ未満を含有する、かつ／または
（ｅ）プロセスが、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ未満の宿主細胞核酸レベルを含む生成物を提供する、
請求項１～３８のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項40】

（ａ）の全収率が少なくとも１．５ｇ／Ｌである、請求項３９に記載のプロセス。

【請求項41】

（ａ）の全収率が２～４ｇ／Ｌの範囲である、請求項３９に記載のプロセス。

【請求項42】

（ｄ）の内毒素含量が、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１０ＥＵ未満である、請求項３９～４１のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項43】

（ｅ）の宿主細胞核酸レベルがＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ｐｇ未満である、請求項３９～４２のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項44】

（ｅ）の宿主細胞核酸レベルがＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１０ｐｇ未満である、請求項３９～４２のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項45】

組換えＡｎｘＡ５タンパク質を発現する、細胞壁を持つ内毒素産生宿主細胞から直接または間接的に得ることができる前記組換えＡｎｘＡ５タンパク質を含む組成物であって、
（ａ）組成物が滅菌濾過工程に供される、かつ／または組成物が滅菌組成物である、
（ｂ）組成物が滅菌容器中に貯蔵される、
（ｃ）組成物が、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１００ＥＵ未満の内毒素含量を含む組成物である、
（ｄ）組成物が、ＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ未満の核酸レベルを含む、かつ
（ｅ）ＡｎｘＡ５タンパク質がＨｉｓタグを含まない、
組成物。

【請求項46】

（ｄ）の核酸レベルが宿主細胞核酸レベルである、請求項４５に記載の組成物。

【請求項47】

ＡｎｘＡ５タンパク質が配列番号１と９５％超同一である、請求項４５または４６に記載の組成物。

【請求項48】

（ａ）組成物が、１ｍｇ／ｍＬ、またはより高い濃度でＡｎｘＡ５タンパク質を含む、
（ｂ）組成物が、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ _２ 、０．０５％（ｗ／ｖ） ポリソルベート、または他の非イオン性界面活性剤を含むｐＨ７．４の無リン酸緩衝液中に、滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物を含む、
（ｃ）存在するＮａＣｌ濃度がＡｎｘＡ５タンパク質を主として単量体である形態で維持する、
（ｄ）内毒素が、組成物中で、検出可能なレベルである、
（ｅ）組成物が、単位剤形にある生成物であり、単位用量あたり、１００、または５０ＥＵ未満を含み、
（ｆ）組成物中に、検出可能なレベルで、核酸レベルを含む、
（ｇ）組成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルが、生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の全含量の０．５～３０％、または０．５～２０％、または０．５～１５％、または０．５～１０％の範囲内である、
（ｈ）組成物中のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルが４０％未満である、
（ｉ）ＡｎｘＡ５タンパク質が１つ以上のＲＧＤモチーフを含まない、
（ｊ）ＡｎｘＡ５タンパク質が化学修飾されている、
（ｋ）ＡｎｘＡ５タンパク質が、ＡｎｘＡ５タンパク質及び融合パートナーを含む融合タンパク質である、かつ／または
（ｌ）組成物が薬学的及び／または獣医学的に許容される組成物である、
請求項４５～４７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項49】

（ｊ）の化学修飾されたＡｎｘＡ５タンパク質がＰＥＧ化されたＡｎｘＡ５タンパク質である、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

（ｂ）の無リン酸緩衝液がビス－トリスまたはトリス緩衝液である、請求項４８または４９に記載の組成物。

【請求項51】

ポリソルベートがＴｗｅｅｎ８０である、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項52】

（ｂ）の最終滅菌ＡｎｘＡ５タンパク質生成物中のＡｎｘＡ５タンパク質の濃度が１０ｍｇ／ｍＬである、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項53】

（ｄ）の検出可能なレベルがＡｎｘＡ５タンパク質あたり１００ＥＵ未満である、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項54】

（ｅ）において内毒素が組成物中で、検出可能なレベルである、請求項４８～５３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項55】

（ｆ）の核酸レベルがＡｎｘＡ５タンパク質１ｍｇあたり１，０００ｐｇ未満である、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項56】

（ｈ）のグルコノイル化ＡｎｘＡ５タンパク質のレベルが実質的に０％である、請求項４８～５５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項57】

非経口、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、眼内、頭蓋内、脳内、骨内、脳室内、髄腔内、皮下、または局所投与に適する薬学的または獣医学的組成物の形態である、請求項４８～５６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項58】

組成物が、局所投与に適し、かつクリーム、軟膏、または点眼薬の形態である、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項59】

組成物中のＡｎｘＡ５タンパク質が、薬学的または獣医学的に許容される担体との混和物中にＡｎｘＡ５タンパク質を含む薬学的または獣医学的組成物の形態で存在し、担体がコーティングである、請求項４５～５８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項60】

組成物が、即時放出、遅延放出または制御放出用途の形態である、請求項４５～５９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項61】

薬物溶出ステントである、薬学的または獣医学的組成物の形態である、請求項４５～５６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項62】

医薬における使用のための、請求項４５～６１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項63】

－心血管疾患、自己免疫疾患、または炎症性病態を治療、予防、及び／またはその発症のリスクを低減するため、
－血栓症の予防またはそのリスクを低減するため、
－網膜静脈閉塞を治療、予防またはそのリスクを低減するため、
－血液学的障害を治療、予防、またはそのリスクを低減するため、
－肺線維症を治療、予防、またはそのリスクを低減するため、
－アテローム性血栓症、急性冠症候群、脳卒中、跛行、狭心症、虚血性心疾患、末梢動脈疾患、収縮期高血圧、血栓塞栓症、出血性または血管炎性脳卒中、心筋梗塞、狭心症または間欠性跛行、不安定狭心症、他の形態の重度の狭心症、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、
を治療、予防、及び／またはその発症のリスクを低減するため、
－血管機能不全を治療、予防、またはそのリスクを低減するため、
－虚血性疼痛を低減するため、
－再狭窄を予防または治療するため、
－虚血再灌流損傷、臓器虚血再灌流損傷、移植拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（急性および／または慢性ＧＶＨＤを含む）を治療、予防、またはそのリスクを低減するため、または移植後の対象を治療するため、
－外科的介入後の周術期または術後合併症を予防及び／または低減するため、
－血管炎症を予防または治療するため、または急性及び慢性血管炎症または心炎を治療、予防、またはそのリスクを低減するため、
－急性及び／または慢性の炎症性病態、及び／または炎症性腸疾患を治療、予防、及び／またはその発症のリスクを低減するため、
－リウマチ病、骨関節炎を含む関節炎、関節リウマチ、または乾癬性関節炎を治療、予防、及び／またはその発症のリスクを低減するため、または
－アルツハイマー病、認知症全般、多発性硬化症、または重症筋無力症を治療、予防、及び／またはその発症のリスクを低減するための、
請求項４５～６２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項64】

血液学的障害が鎌状赤血球貧血である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

再狭窄が新生内膜形成または肥厚である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項66】

臓器虚血再灌流損傷が肝臓または腎虚血再灌流損傷である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項67】

周術期または術後合併症が血管手術後の合併症である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項68】

血管手術が末梢血管手術である、請求項６７に記載の組成物。

【外国語明細書】