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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023089192
(43)【公開日】2023-06-27
(54)【発明の名称】ジペプチド及びこれを含有する医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 5/072 20060101AFI20230620BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20230620BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230620BHJP
C07K 5/075 20060101ALI20230620BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20230620BHJP
【ＦＩ】
C07K5/072
A61K38/05 ZNA
A61P3/00
C07K5/075
A23L33/18
【審査請求】有
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023067139
(22)【出願日】2023-04-17
(62)【分割の表示】P 2020515565の分割
【原出願日】2019-04-25
(31)【優先権主張番号】P 2018084925
(32)【優先日】2018-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000108339
【氏名又は名称】ゼリア新薬工業株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山田 耕太郎
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 英知
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 健司
(72)【発明者】
【氏名】江島 晃佳
(72)【発明者】
【氏名】中川西 修
(72)【発明者】
【氏名】丹野 孝一
(57)【要約】 （修正有）
【課題】新たな疲労予防改善作用を有する成分、該成分を含有する医薬組成物または食品組成物を提供する。
【解決手段】（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅから選ばれるジペプチド、および前記ジペプチドを含有する医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅから選ばれるジペプチド、および前記ジペプチドを含有する医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅから選ばれるジペプチド。
【請求項2】
請求項１記載のジペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項3】
疲労予防改善剤である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項4】
請求項１記載のジペプチドを含有する食品組成物。
【請求項5】
疲労予防改善用食品組成物である請求項４記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジペプチド及びこれを含有する医薬又は食品組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
疲労は、一般に疲労感、倦怠感を主症状とするが、結果として運動能力の低下、睡眠障害、意欲低下等を招く。短期的な疲労の場合には、休息、睡眠、栄養補給等により回復するが、慢性疲労の場合には、長期的な全身疲労感、倦怠感、微熱等が回復し難い。
【0003】
これらの疲労に対して、アミノ酸組成物（特許文献１）、Ｌ－カルニチン（特許文献２）、アスコルビン酸等（特許文献３）が有用であることが知られている。また、肝臓水解物は、ＡＭＰＫ活性化作用を有し、抗疲労効果を有することが報告されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平９－１２４４７３号公報
【特許文献2】特開２００１－０４６０２１号公報
【特許文献3】特開平６－３２７４３５号公報
【特許文献4】国際公開第２０１５／０２２９２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、肝臓水解物は、アミノ酸やペプチドを多く含むとされているが、実際の有効成分は判明していない。
従って、本発明の課題は、新たな疲労予防改善作用を有する成分を提供することにある。
従って、本発明の課題は、新たな疲労予防改善作用を有する成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者は、新たな疲労予防改善剤を開発すべく検討し、肝臓水解物を動物に投与して血中に移行する難消化性ペプチドを探索し、また肝臓水解物を種々のカラムを用いてペプチドを分画し薬効評価をしてきたところ、Ｌ体アミノ酸由来でなく、特定のＤ体アミノ酸由来のジペプチドが見出され、当該ジペプチドが疲労予防改善作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔９〕を提供するものである。
【0008】
〔１〕（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｄ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｄ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｄ）－Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｌ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｌ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｌ）－Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅから選ばれるジペプチド。
〔２〕（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅから選ばれるものである〔１〕記載のジペプチド。
〔３〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドを含有する医薬組成物。
〔４〕疲労予防改善剤である〔３〕記載の医薬組成物。
〔５〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドを含有する食品組成物。
〔６〕疲労予防改善用食品組成物である〔５〕記載の食品組成物。
〔７〕疲労予防改善剤又は疲労予防改善用食品製造のための〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドの使用。
〔８〕疲労を予防改善するための、〔１〕又は〔２〕記載のジペプチド。
〔９〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドの有効量を投与することを特徴とする疲労の予防改善方法。
〔２〕（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅから選ばれるものである〔１〕記載のジペプチド。
〔３〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドを含有する医薬組成物。
〔４〕疲労予防改善剤である〔３〕記載の医薬組成物。
〔５〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドを含有する食品組成物。
〔６〕疲労予防改善用食品組成物である〔５〕記載の食品組成物。
〔７〕疲労予防改善剤又は疲労予防改善用食品製造のための〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドの使用。
〔８〕疲労を予防改善するための、〔１〕又は〔２〕記載のジペプチド。
〔９〕〔１〕又は〔２〕記載のジペプチドの有効量を投与することを特徴とする疲労の予防改善方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明のジペプチドは、Ｄ体アミノ酸由来であることから難消化性であり、血中に長時間存在し、疲労予防改善作用を有することから、疲労予防改善用の医薬及び食品組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】疎水性ペプチド画分の抗疲労効果を示す。
【図2】疎水ピログルタミルペプチド画分の抗疲労効果を示す。
【図3】親水性ペプチド画分の抗疲労効果を示す。
【図4】親水性ピログルタミルペプチド画分の抗疲労効果を示す。
【図5】Ａｓｐ－Ｌｅｕ（Ｄα）の抗疲労効果を示す。
【図6】Ａｓｐ－Ｌｅｕ（Ｄβ）の抗疲労効果を示す。
【図7】Ａｓｐ－Ｖａｌ（Ｄα）の抗疲労効果を示す。
【図8】Ａｓｐ－Ｖａｌ（Ｄβ）の抗疲労効果を示す。
【図9】Ａｓｐ－Ｐｈｅ（Ｄα）の抗疲労効果を示す。
【図10】Ａｓｐ－Ｐｈｅ（Ｄβ）の抗疲労効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明のジペプチドは、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｄ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｄ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｄ）－Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｄ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｌ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｌ）Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｌ）－Ｐｒｏ、（Ｄ）Ｐｒｏ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ｌｅｕ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｉｌｅ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ｖａｌ－（Ｌ）Ｈｙｐ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅから選ばれるジペプチドであり、このうち経口投与による血中への移行性、作用持続性及び抗疲労効果の点から、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅから選ばれるジペプチドが好ましく、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕが更に好ましい。
ここで、（Ｄ）という表記は、アミノ酸がＤ体であることを意味する。（Ｌ）という表記は、アミノ酸がＬ体であることを意味する。
また、上記（Ｄ）体または（Ｌ）体ジペプチドのα体及びβ体のうち、β体がより好ましい。
ここで、（Ｄ）という表記は、アミノ酸がＤ体であることを意味する。（Ｌ）という表記は、アミノ酸がＬ体であることを意味する。
また、上記（Ｄ）体または（Ｌ）体ジペプチドのα体及びβ体のうち、β体がより好ましい。
【0012】
本発明のジペプチドは、（Ｄ）アミノ酸を原料として用いて、通常の液相ペプチド合成法又は固相ペプチド合成法により製造することができる。例えばα－アミノ基以外の官能基を保護したアミノ酸と、カルボキシ基以外の官能基を保護したアミノ酸又はカルボキシ基を活性化し、カルボキシ基以外の官能基を保護したアミノ酸とを縮合させた後、保護基を脱離させることにより製造できる。
ここで、アミノ酸のアミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基等が挙げられる。カルボキシ基の保護基としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基等が挙げられる。縮合反応は、Ｎ，Ｎ'－ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジシクロヘキシル尿素その他の縮合剤を用いる方法、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド等の活性エステル法、混合酸無水物法等を用いることができる。
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合は更にペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。
ここで、アミノ酸のアミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基等が挙げられる。カルボキシ基の保護基としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基等が挙げられる。縮合反応は、Ｎ，Ｎ'－ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジシクロヘキシル尿素その他の縮合剤を用いる方法、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド等の活性エステル法、混合酸無水物法等を用いることができる。
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合は更にペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。
【0013】
本発明のジペプチドは、酸付加塩又は塩基塩であることができる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、過塩素酸などの無機酸塩、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【0014】
本発明のペプチドは、溶媒和物であることができる。溶媒和物としては、水(水和物の場合)、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒和物が挙げられる。
【0015】
本発明のジペプチドは、難消化性であり、経口投与後の血中移行性が高く、持続性にも優れており、疲労予防改善作用を有する。ここで、疲労予防改善作用としては、運動機能持続作用、運動機能向上作用、抗疲労作用、抗ストレス作用、疲労感軽減作用、慢性疲労予防作用、疲労回復作用、どうき予防・改善作用、気つけ予防・改善作用、息ぎれ予防・改善作用、筋肉痛予防・改善作用等が挙げられる。従って、本発明のジペプチドを含有する組成物は、医薬組成物、食品組成物として有用である。
【0016】
本発明の医薬組成物は、経口投与、経皮投与、経腸投与、経静脈投与などによって投与できるが、経口投与がより好ましい。経口投与用の製剤としては、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられるが、液剤、錠剤が好ましく、液剤がより好ましい。
【0017】
これらの経口投与製剤とするには、乳糖、マンニトール、トウモロコシデンプン、結晶セルロースなどの賦形剤、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、非イオン界面活性剤等の溶解補助剤、矯味剤、甘味剤、安定化剤、pH調整剤、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等を使用することができる。また、ヒドロキシメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタクリレートコポリマーなどの被覆剤を用いてもよい。
【0018】
また、本発明の医薬組成物には、他の有効成分を配合することもできる。他の有効成分としては、ビタミンＢ1類；チアミン、硝酸チアミン、塩酸チアミン、フルスルチアミン、ビスベンチアミン、ベンホチアミン、チアミンジスルフィド、ジセチアミン、チアミンプロピルジスルフィド及びこれらの誘導体、ビタミンＢ2類；リボフラビン及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ3類；ナイアシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ5類；パンテノール、パントテン酸及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ6類；ピリドキシン及び誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ12類；シアノコバラミン及び誘導体並びにそれらの塩、その他のビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＰ、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン、タウリン、コンドロイチン硫酸、ローヤルゼリー、カフェイン、ウコン、マリアアザミ、タンポポ、西洋タンポポ、ゴボウ、ニンニク、キク、西洋ノコギリソウ、クチナシ、ゴマ、田七ニンジン、アスパラガス、タマネギ、チコリ、薬用サルビア、朝鮮アザミ（アーティチョーク）、クコ、マメ科・アヤメ科の植物、ミヤマウズラ、エルバ・デ・パサリーニョ、セテサングリア、アガメガシワ、紅茶、レスベラトロール、カテキン類、ベルベリン、ローズマリー、豆エキス、メトホルミン等が挙げられる。
【0019】
また、本発明の組成物は、医薬品の外、医薬部外品、特定保健用食品、スポーツ飲料、リハビリ用飲料、ペットフード等の機能性食品としても使用可能である。
【0020】
本発明の医薬組成物又は食品組成物における前記ジペプチドの含有量は、投与形態によっても異なるが、通常、０．００１～１０質量％が好ましく、０．００１～５質量％がより好ましい。また、本発明の医薬組成物又は食品組成物における前記ジペプチドの１日投与量は、１０ｍｇ～１０００ｍｇが好ましく、２０ｍｇ～８００ｍｇがより好ましく、５０ｍｇ～８００ｍｇが更に好ましい。
【実施例0021】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【0022】
実施例１（肝臓水解物の分画）
（１）ペプチドとピログルタミルペプチドの分画
強カチオン交換樹脂（ＡＧ５０）をＥｃｏｎｏ Ｃｏｌｕｍｎ（２．５×２０ｃｍ）に充填し、樹脂を１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化した。１ｇの肝臓水解物（Ｓａｍｐｌｅ Ａ）を２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＣｌに溶解した。この溶液を樹脂上に添加し、素通り画分を２０ｍＬ回収した（素通り画分１）。続いて、２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＣｌを樹脂上に添加し、素通り画分２０ｍＬを回収する。この操作を１９回繰り返した（素通り画分２～２０）。素通り画分１～２０の吸光度（２３０ｎｍ）を測定し、ペプチドの溶出を確認した。
続いて、２０ｍＬの５０％アンモニア溶液を樹脂上に添加し、吸着画分２０ｍＬを回収した。この操作を２０回繰り返した（吸着画分１～２０）。吸着画分１～２０の吸光度（２３０ｎｍ）を測定し、ペプチドの溶出を確認した。
素通り画分（ピログルタミルペプチド画分）および吸着画分（ペプチド画分）をエバポレーターで減圧濃縮した。
（１）ペプチドとピログルタミルペプチドの分画
強カチオン交換樹脂（ＡＧ５０）をＥｃｏｎｏ Ｃｏｌｕｍｎ（２．５×２０ｃｍ）に充填し、樹脂を１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化した。１ｇの肝臓水解物（Ｓａｍｐｌｅ Ａ）を２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＣｌに溶解した。この溶液を樹脂上に添加し、素通り画分を２０ｍＬ回収した（素通り画分１）。続いて、２０ｍＬの１０ｍＭ ＨＣｌを樹脂上に添加し、素通り画分２０ｍＬを回収する。この操作を１９回繰り返した（素通り画分２～２０）。素通り画分１～２０の吸光度（２３０ｎｍ）を測定し、ペプチドの溶出を確認した。
続いて、２０ｍＬの５０％アンモニア溶液を樹脂上に添加し、吸着画分２０ｍＬを回収した。この操作を２０回繰り返した（吸着画分１～２０）。吸着画分１～２０の吸光度（２３０ｎｍ）を測定し、ペプチドの溶出を確認した。
素通り画分（ピログルタミルペプチド画分）および吸着画分（ペプチド画分）をエバポレーターで減圧濃縮した。
【0023】
（２）親水性と疎水性の分画
固相抽出カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ）を１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化した。ピログルタミルペプチド画分をカラムにパスさせ、素通り画分を溶出・回収した（親水性ピログルタミルペプチド画分）。続いて、１０ｍＭ ＨＣｌを含む６０％アセトニトリル溶液をカラムにパスさせて、吸着画分を溶出・回収した（疎水性ピログルタミルペプチド画分）。
ペプチド画分についてもこれらの操作を行った。
得られた４画分を凍結乾燥した。
固相抽出カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ）を１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化した。ピログルタミルペプチド画分をカラムにパスさせ、素通り画分を溶出・回収した（親水性ピログルタミルペプチド画分）。続いて、１０ｍＭ ＨＣｌを含む６０％アセトニトリル溶液をカラムにパスさせて、吸着画分を溶出・回収した（疎水性ピログルタミルペプチド画分）。
ペプチド画分についてもこれらの操作を行った。
得られた４画分を凍結乾燥した。
【0024】
実施例２
（１）肝臓水解物中の難消化性ペプチドの定量実験
１）２．５ｍｇの肝臓水解物を１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解した。
２）１）にパンクレアチン（０．１ｍｇ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（２．４５ｕｎｉｔ）、カルボキシペプチダーゼ（７．７ｕｎｉｔ）を添加し、酵素反応させた（３７℃、２４ｈ）。
３）限外ろ過（１０Ｋ）により酵素を除した。
４）３）をスピンカラムに充填した強カチオン交換樹脂（ＡＧ５０）にパスさせ、素通り画分を回収した（ピログルタミルペプチド画分）。
５）２００μＬの３）（ペプチド画分）および４）（ピログルタミルペプチド画分）をサイズ排除ＨＰＬＣで分画・分取した（ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４）。
６）ペプチド画分については、ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４を乾固してＡｃｃＱ化した。ピログルタミルペプチド画分については、ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４をそのまま用いた。
７）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、難消化性ペプチドの構造を決定した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３
溶離液：０．１％ギ酸および０．１％ギ酸を含む８０％アセトニトリル
分析方法：ペプチド画分については、ＡｃｃＱのフラグメント（ｍ／ｚ＝１７１．１）を特異的に検出（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ｓｃａｎ分析）した後、ＭＳ／ＭＳ分析で構造を推定し、標準を合成してＭＲＭ分析で同定・定量を行う。
ピログルタミルペプチド画分については、Ｔｏｔａｌ ｓｃａｎ ｉｏｎ分析によりピークを検出した後、ＭＳ／ＭＳ分析で構造を推定し、標準を合成してＭＲＭで同定・定量を行う。
（１）肝臓水解物中の難消化性ペプチドの定量実験
１）２．５ｍｇの肝臓水解物を１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに溶解した。
２）１）にパンクレアチン（０．１ｍｇ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（２．４５ｕｎｉｔ）、カルボキシペプチダーゼ（７．７ｕｎｉｔ）を添加し、酵素反応させた（３７℃、２４ｈ）。
３）限外ろ過（１０Ｋ）により酵素を除した。
４）３）をスピンカラムに充填した強カチオン交換樹脂（ＡＧ５０）にパスさせ、素通り画分を回収した（ピログルタミルペプチド画分）。
５）２００μＬの３）（ペプチド画分）および４）（ピログルタミルペプチド画分）をサイズ排除ＨＰＬＣで分画・分取した（ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４）。
６）ペプチド画分については、ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４を乾固してＡｃｃＱ化した。ピログルタミルペプチド画分については、ＳＥＣ Ｆｒ．３５－４４をそのまま用いた。
７）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、難消化性ペプチドの構造を決定した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３
溶離液：０．１％ギ酸および０．１％ギ酸を含む８０％アセトニトリル
分析方法：ペプチド画分については、ＡｃｃＱのフラグメント（ｍ／ｚ＝１７１．１）を特異的に検出（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ｓｃａｎ分析）した後、ＭＳ／ＭＳ分析で構造を推定し、標準を合成してＭＲＭ分析で同定・定量を行う。
ピログルタミルペプチド画分については、Ｔｏｔａｌ ｓｃａｎ ｉｏｎ分析によりピークを検出した後、ＭＳ／ＭＳ分析で構造を推定し、標準を合成してＭＲＭで同定・定量を行う。
【0025】
（２）肝臓水解物をラットに投与した時のペプチドの血中移行の実験
１）Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（６週齢、雄）に肝臓水解物水溶液を単回投与した（１０ｇ／６０ｋｇ）。
２）投与３０分および６０分後、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈より採血し、血漿を得た。更に、消化管（十二指腸～回腸）を摘出し、生理食塩水１０ｍＬで管腔内容物を溶出する。血漿および消化管内容物に３倍量のエタノールを加えた。（分析まで－２０℃で保存）。
３）血漿および消化管内容物のエタノール上を乾固し、ＡｃｃＱ化を行った。
４）ＭＲＭ分析により、（１）で同定された難消化性ペプチドの同定・定量を行った。
血中のジペプチド濃度を表１に示す。
１）Ｗｉｓｔｅｒ ｒａｔ（６週齢、雄）に肝臓水解物水溶液を単回投与した（１０ｇ／６０ｋｇ）。
２）投与３０分および６０分後、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈より採血し、血漿を得た。更に、消化管（十二指腸～回腸）を摘出し、生理食塩水１０ｍＬで管腔内容物を溶出する。血漿および消化管内容物に３倍量のエタノールを加えた。（分析まで－２０℃で保存）。
３）血漿および消化管内容物のエタノール上を乾固し、ＡｃｃＱ化を行った。
４）ＭＲＭ分析により、（１）で同定された難消化性ペプチドの同定・定量を行った。
血中のジペプチド濃度を表１に示す。
【0026】
【表1】
【0027】
その結果、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｐｈｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｄ）Ｌｅｕ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｖａｌ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｉｌｅ、（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｌｅｕ、及び（Ｄ）Ａｓｐ－（Ｌ）Ｐｈｅは、経口投与による血中移行性が良好で、血中で長時間持続することが判明した。
【0028】
実施例３（ジペプチドの合成）
１）以下の順でナス型フラスコに試薬を加え、撹拌しながら反応させる（４℃，ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ）。
（ｉ）Ｈ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ
（ii）ＤＭＦ
（iii）ＴＥＡ
（iv）Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（Ｌα体）
（ｖ）ＨＯＢｔ
（vi）ＥＤＬ・ＨＣｌ
その他の異性体の場合には、次の保護アミノ酸を使用する。
Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（Ｄα体）
Ｂｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（Ｌβ体）
Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（Ｄβ体）
２）エバポレーターでＤＭＦを除去する。
３）酢酸エチルに溶解し、分液漏斗に移す。
４）５％炭酸水素ナトリウムを加えて撹拌し、水層を除く。（×２）
５）１０％クエン酸を加えて撹拌し、水層を除く。（×２）
６）飽和食塩水を加えて撹拌し、水層を除く。
７）酢酸エチル層を回収し、硫酸水素ナトリウムを加えて脱水する。
８）酢酸エチル層をろ過回収し、エバポレーターで濃縮する。
９）石油エーテルを加え、生じた沈殿を乾燥させる。（生じない場合は10）に進む）
10）乾燥物に４Ｍ ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅを加え、撹拌しながら反応させる。（４℃，２４～４８ｈ）
11）エバポレーターで４Ｍ ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅを除く。
12）ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿を超音波で破砕・洗浄し、エーテル上清をデカンで除く。（×３）
13）ジエチルエーテルを加えて放置（４℃，ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ）。
14）ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿を超音波で破砕・洗浄し、エーテル上清をデカンで除く。（×３）
15）沈殿物を乾燥する。
１）以下の順でナス型フラスコに試薬を加え、撹拌しながら反応させる（４℃，ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ）。
（ｉ）Ｈ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ
（ii）ＤＭＦ
（iii）ＴＥＡ
（iv）Ｂｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（Ｌα体）
（ｖ）ＨＯＢｔ
（vi）ＥＤＬ・ＨＣｌ
その他の異性体の場合には、次の保護アミノ酸を使用する。
Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（Ｄα体）
Ｂｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（Ｌβ体）
Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ（Ｄβ体）
２）エバポレーターでＤＭＦを除去する。
３）酢酸エチルに溶解し、分液漏斗に移す。
４）５％炭酸水素ナトリウムを加えて撹拌し、水層を除く。（×２）
５）１０％クエン酸を加えて撹拌し、水層を除く。（×２）
６）飽和食塩水を加えて撹拌し、水層を除く。
７）酢酸エチル層を回収し、硫酸水素ナトリウムを加えて脱水する。
８）酢酸エチル層をろ過回収し、エバポレーターで濃縮する。
９）石油エーテルを加え、生じた沈殿を乾燥させる。（生じない場合は10）に進む）
10）乾燥物に４Ｍ ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅを加え、撹拌しながら反応させる。（４℃，２４～４８ｈ）
11）エバポレーターで４Ｍ ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅを除く。
12）ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿を超音波で破砕・洗浄し、エーテル上清をデカンで除く。（×３）
13）ジエチルエーテルを加えて放置（４℃，ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ）。
14）ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿を超音波で破砕・洗浄し、エーテル上清をデカンで除く。（×３）
15）沈殿物を乾燥する。
【0029】
実施例４
〔試験方法〕
（１）使用動物
実験には、体重２８～３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用し、実験に供ずるまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００～１９：００、暗期１９：００～７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０ｃｍ×横２０ｃｍ×高さ１３ｃｍ）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。
（２）使用薬物及び調整法
・疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分は、生理食塩液にて溶解し、体重１０ｇあたり０．１ｍＬを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。投与スケジュールとしては、強制歩行前に生理食塩液又は疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分をｉ．ｐ．投与し、３時間の強制歩行負荷後、１５分間観察用ケージに環境順応後生理食塩液又は疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分をｉ．ｐ．投与した。
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５ｃｍの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４ｃｍ×横１７ｃｍ×高さ１２ｃｍ）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
〔試験方法〕
（１）使用動物
実験には、体重２８～３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用し、実験に供ずるまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００～１９：００、暗期１９：００～７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０ｃｍ×横２０ｃｍ×高さ１３ｃｍ）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。
（２）使用薬物及び調整法
・疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分は、生理食塩液にて溶解し、体重１０ｇあたり０．１ｍＬを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。投与スケジュールとしては、強制歩行前に生理食塩液又は疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分をｉ．ｐ．投与し、３時間の強制歩行負荷後、１５分間観察用ケージに環境順応後生理食塩液又は疎水性ペプチド画分、疎水性ピログルタミルペプチド画分、親水性ペプチド画分、親水性ピログルタミルペプチド画分をｉ．ｐ．投与した。
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５ｃｍの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４ｃｍ×横１７ｃｍ×高さ１２ｃｍ）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
【0030】
【0031】
実施例５
（１）使用動物
実験には、体重２８～３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用し、実験に供するまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００～１９：００、暗期１９：００～７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０ｃｍ×横２０ｃｍ×高さ１３ｃｍ）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。
（２）使用薬物及び調整法
・ジペプチドは、生理食塩液にて溶解し、体重１０ｇあたり０．１ｍＬを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。投与スケジュールとしては、強制歩行前に生理食塩液又はジペプチドをｉ．ｐ．投与し、３時間の強制歩行負荷後、１５分間観察用ケージに環境順応後生理食塩液又はジペプチドをｉ．ｐ．投与した。
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５ｃｍの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４ｃｍ×横１７ｃｍ×高さ１２ｃｍ）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
（５）統計処理
実験結果は、平均値（ｍｅａｎ）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示した。有意差検定は分散分析処理後、Ｆｉｓｈｅｒ'のＰＬＳＤ法を行った。Ｐ値５％以下を有意差ありとして判定した。なお、この検定には、Ｓｔａｔ ｖｉｅｗ－Ｊ ５．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を用いた。
（１）使用動物
実験には、体重２８～３２ｇ（搬入時２６ｇ）のｄｄＹ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を使用し、実験に供するまで室温２２±２℃、湿度５５±５％、明暗１２時間サイクル（明期；７：００～１９：００、暗期１９：００～７：００）の一定環境下で飼育した。飼育の際にはプラスチックケージ（縦３０ｃｍ×横２０ｃｍ×高さ１３ｃｍ）を用い、実験以外は、固型飼料および水道水を自由に摂取させた。
（２）使用薬物及び調整法
・ジペプチドは、生理食塩液にて溶解し、体重１０ｇあたり０．１ｍＬを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。投与スケジュールとしては、強制歩行前に生理食塩液又はジペプチドをｉ．ｐ．投与し、３時間の強制歩行負荷後、１５分間観察用ケージに環境順応後生理食塩液又はジペプチドをｉ．ｐ．投与した。
（３）強制歩行負荷
強制歩行負荷は、直径３７×奥行き３５．５ｃｍの電動式回転カゴにマウスを入れ、１回転／２５秒の速度で、３時間強制歩行を試行した。
（４）自発運動量の測定
自発運動量は、マウスをプラスチックケージ（縦２４ｃｍ×横１７ｃｍ×高さ１２ｃｍ）に１匹ずつ入れ、１５分間環境に適応させた後、スーパーメックスを用いて９０分間の平面運動量を自動的に数値化して評価した。
（５）統計処理
実験結果は、平均値（ｍｅａｎ）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示した。有意差検定は分散分析処理後、Ｆｉｓｈｅｒ'のＰＬＳＤ法を行った。Ｐ値５％以下を有意差ありとして判定した。なお、この検定には、Ｓｔａｔ ｖｉｅｗ－Ｊ ５．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を用いた。
【0032】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
