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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023089973
(43)【公開日】2023-06-28
(54)【発明の名称】ワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20230621BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230621BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230621BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230621BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20230621BHJP
A61K 47/30 20060101ALI20230621BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230621BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230621BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230621BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230621BHJP
C12N 15/117 20100101ALI20230621BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215 ZNA
A61K39/39
A61K47/36
A61K9/08
A61K9/19
A61K47/30
A61P37/04
A61P31/14
C07K14/165
C12N15/50
C12N15/117 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022201005
(22)【出願日】2022-12-16
(31)【優先権主張番号】P 2021204470
(32)【優先日】2021-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000000033
【氏名又は名称】旭化成株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504155293
【氏名又は名称】国立大学法人島根大学
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(71)【出願人】
【識別番号】304026696
【氏名又は名称】国立大学法人三重大学
(71)【出願人】
【識別番号】504205521
【氏名又は名称】国立大学法人 長崎大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100189337
【弁理士】
【氏名又は名称】宮本 龍
(72)【発明者】
【氏名】勝又 徹
(72)【発明者】
【氏名】浦野 健
(72)【発明者】
【氏名】成相 裕子
(72)【発明者】
【氏名】加美野 宏樹
(72)【発明者】
【氏名】秋吉 一成
(72)【発明者】
【氏名】澤田 晋一
(72)【発明者】
【氏名】三浦 理紗子
(72)【発明者】
【氏名】珠玖 洋
(72)【発明者】
【氏名】森田 公一
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC06
4C076DD26Z
4C076DD67
4C076EE01
4C076EE37
4C076FF70
4C076GG06
4C076GG47
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE05
4C085EE06
4C085FF11
4C085GG03
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA50
4H045DA86
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】ポリエチレングリコール鎖を使用せず、且つ、従来よりも免疫記憶の期間が向上したワクチン組成物を提供する。
【解決手段】ワクチン組成物は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、を含み、前記ヒアルロン酸誘導体が、一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】ワクチン組成物は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、を含み、前記ヒアルロン酸誘導体が、一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含み、
前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、
前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である、ワクチン組成物。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含み、
前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、
前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である、ワクチン組成物。
【化1】
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
【請求項2】
皮下注射又は筋肉内注射によって投与される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項3】
前記抗原タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項4】
アジュバントを更に含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項5】
前記アジュバントがアニオン性化合物である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
前記アジュバントがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記ステリル基がコレステリル基である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項8】
凍結乾燥粉末である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
前記ヒアルロン酸誘導体の分子量が４，０００以上１，０００，０００以下である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（以下、「ＳＡＲＳコロナウイルス－２」と称する）は、２０１９年１１月に中国の武漢市付近で発生が確認されて以来、世界中の国々に拡大し、多くの罹患者及び死亡者が確認されており、治療薬及びワクチンの開発が進められている。
【0003】
近年の研究では、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質が、ヒト等の動物の細胞の受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合する領域として、受容体結合領域（ＲＢＤ）が特定された。ＲＢＤに対する抗体は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２とＡＣＥ２との結合を阻害することにより、ＳＡＲＳコロナウイルス－２の感染を抑える中和抗体として重要な機能を担っている。一方で、ウイルスに対する抗体によって感染が増悪する現象が知られており、その現象は抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）と言われている。スパイクタンパク質に対する抗体を解析した結果、スパイクタンパク質へのＡＣＥ２の結合を阻害する抗体ばかりでなく、ＡＣＥ２の結合性を増加させる抗体が存在することが判明している。
【0004】
そこで、特許文献１では、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質の変異体をコードする核酸分子を含む医薬品組成物により、上記ＡＣＥ２の結合性を増加させる抗体の誘導能を低減し、重症化リスクを低減することが提案されている。
【0005】
また、特許文献２では、ある特定のＳＡＲＳコロナウイルス－２の阻害活性を有する化合物又は当該化合物を含有する医薬組成物により、ＳＡＲＳコロナウイルス－２の複製を阻害し、治療することが提案されている。
【0006】
一方、ＳＡＲＳコロナウイルス－２に対するｍＲＮＡワクチンでは脂質やリン脂質と混合することによってｍＲＮＡ粒子を血中滞留させている。しかしながら、単純な脂質等であるとｍＲＮＡ粒子を血中から排出してしまう虞があり、これを抑制するために脂質等にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が修飾されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特許第６９５４６９６号公報
【特許文献2】特開２０２１－１３８６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２に対するｍＲＮＡワクチンでは、ＰＥＧ鎖がアナフィラキシーショックの原因と考える説もある。また、ｍＲＮＡワクチンでは、長期の免疫記憶ができず、追加接種が必要である。
【0009】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ポリエチレングリコール鎖を使用せず、且つ、従来よりも免疫記憶の期間が向上したワクチン組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含み、
前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、
前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である、ワクチン組成物。
（１） ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含み、
前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有し、
前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率が３０％以上６０％以下である、ワクチン組成物。
【0011】
【化1】
【0012】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
【0013】
（２） 皮下注射又は筋肉内注射によって投与される、（１）に記載のワクチン組成物。
（３） 前記抗原タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、（１）又は（２）に記載のワクチン組成物。
（４） アジュバントを更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（５） 前記アジュバントがアニオン性化合物である、（４）に記載のワクチン組成物。
（６） 前記アジュバントがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである、（４）又は（５）に記載のワクチン組成物。
（７） 前記ステリル基がコレステリル基である、（１）～（６）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（８） 凍結乾燥粉末である、（１）～（７）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（９） 前記ヒアルロン酸誘導体の分子量が４，０００以上１，０００，０００以下である、（１）～（８）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（３） 前記抗原タンパク質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、（１）又は（２）に記載のワクチン組成物。
（４） アジュバントを更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（５） 前記アジュバントがアニオン性化合物である、（４）に記載のワクチン組成物。
（６） 前記アジュバントがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである、（４）又は（５）に記載のワクチン組成物。
（７） 前記ステリル基がコレステリル基である、（１）～（６）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（８） 凍結乾燥粉末である、（１）～（７）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
（９） 前記ヒアルロン酸誘導体の分子量が４，０００以上１，０００，０００以下である、（１）～（８）のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
【発明の効果】
【0014】
上記態様のワクチン組成物によれば、ポリエチレングリコール鎖を使用せず、且つ、従来よりも免疫記憶の期間が向上したワクチン組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】試験例２における鼠径リンパ節での蛍光強度測定の結果である。（Ａ）は、蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫの蛍光強度測定の結果である。（Ｂ）は、蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の蛍光強度測定の結果である。
【図2】試験例２における皮膚での蛍光強度測定の結果である。（Ａ）は、蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫの蛍光強度測定の結果である。（Ｂ）は、蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の蛍光強度測定の結果である。
【図3】試験例２における鼠径リンパ節の共焦点レーザー顕微鏡による三次元観察像である。（Ａ）は、蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫの蛍光の観察像である。（Ｂ）は、蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の蛍光の観察像である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【0017】
以下、本明細書において使用される用語を説明する。
【0018】
本明細書において使用される「Ｃ１－２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、２－エチルブチル等が含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ１－１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ１－６アルキル基も含まれる。
【0019】
本明細書において使用される「Ｃ１－６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル等の「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
【0020】
本明細書において使用される「アミノＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ２－１２アルキルも含まれる。
【0021】
本明細書において使用される「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ２－１２アルキルも含まれる。
【0022】
本明細書において使用される「Ｃ２－３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ２－２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ２－８アルキレン、基「－（ＣＨ２）ｎ－」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。
【0023】
本明細書において使用される「Ｃ１－５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。
【0024】
本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル、オクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。
【0025】
≪ワクチン組成物≫
本実施形態のワクチン組成物は、
ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含む。
本実施形態のワクチン組成物は、
ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む、抗原タンパク質と、
ヒアルロン酸及びステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体を含む、ヒアルロン酸誘導体成分と、
を含む。
【0026】
上記ヒアルロン酸誘導体成分は、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基が水中で自己会合し、単分子又は複数分子が会合することでナノサイズのハイドロゲルを形成するものである。よって、後述する製造方法で得られた、本実施形態のワクチン組成物において、上記抗原タンパク質と、上記ヒアルロン酸誘導体は、複合体（以下、「抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体」と称する場合がある）を形成している。具体的には、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基と、抗原タンパク質とが疎水性相互作用により複合体を形成しており、抗原タンパク質とステリル基等の疎水性部位が中心部に存在し、一方、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体中のヒアルロン酸に由来する部位等の親水性部位が外縁部に存在する、コア－シェル型様の球状構造を呈しているものと推定される。すなわち、抗原タンパク質がヒアルロン酸誘導体に封入又は内包された構造を呈しているものと推定される。
【0027】
抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体からなる球状構造体の平均粒子径は、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以上７０ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以上６０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。平均粒子径が上記数値範囲であることで、生体内で安定した構造で存在することができ、且つ、リンパ節をより容易に通過することができる。平均粒子径は、例えば、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）や、ナノトラッキング粒子測定装置等によって、測定することができる。
【0028】
本実施形態のワクチン組成物において、前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する。
【0029】
【化2】
【0030】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
【0031】
本実施形態のワクチン組成物において、前記ヒアルロン酸及び前記ヒアルロン酸誘導体に由来する二糖の繰り返し単位に対する、前記ステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）が３０％以上６０％以下であり、３０％以上５５％以下が好ましく、３５％以上５０％以下がより好ましく、３５％以上４５％以下がさらに好ましい。
ステリル基導入率が上記下限値以上であることで、生体内で沈殿せずに安定したハイドロゲルを保つことができる。一方で、上記上限値以下であることで、ハイドロゲルの平均粒子径を上記範囲内とすることができる。
ステリル基導入率が上記下限値以上であることで、生体内で沈殿せずに安定したハイドロゲルを保つことができる。一方で、上記上限値以下であることで、ハイドロゲルの平均粒子径を上記範囲内とすることができる。
【0032】
ステリル基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、ヒアルロン酸誘導体成分の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。なお、式中ｎＨはピークに対応する水素原子の数を表す。具体的には、例えば後述する実施例に記載した方法に従って測定することができる。
【0033】
［ステリル基導入率］（％）
＝［（ステリル基に由来するピーク積分値×３／ｎＨ）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値）］×１００
＝［（ステリル基に由来するピーク積分値×３／ｎＨ）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値）］×１００
【0034】
本実施形態のワクチン組成物は、上記構成を有することで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含まず、ＰＥＧ鎖によって引き起こされると推定されているアナフィラキシーショック等の副作用が生じにくいものである。
【0035】
また、本実施形態のワクチン組成物は、後述する実施例に示すように、Ｔ細胞における免疫記憶期間が向上しており、中和抗体の産生能も向上しており、免疫効果に優れるものである。
【0036】
また、後述する実施例に示すように、本実施形態のワクチン組成物を凍結乾燥粉末とすることで、保存安定性を向上させることができる。
【0037】
次いで、本実施形態のワクチン組成物の構成成分について以下に詳細を説明する。
【0038】
＜抗原タンパク質＞
抗原タンパク質は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む。
抗原タンパク質は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含む。
【0039】
抗原タンパク質は、糖鎖修飾されていてもよい。糖鎖修飾されていることによって、より効果的に免疫を誘導することができる。
【0040】
ウイルス表面のタンパク質を抗原タンパク質とする場合、抗原タンパク質がウイルス同様に糖鎖修飾を受けるためには、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドが付加されている必要がある。抗原タンパク質が細胞外に分泌される時に、Ｎ末端の分泌シグナルペプチドは切断される。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質の１番目から１３番目までのアミノ酸残基からなる分泌シグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号２））、ＩＬ－２に由来するシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号３））、ＩＬ－６に由来するシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＮＳＦＳＴＳＡＦＧＰＶＡＦＳＬＧＬＬＬＶＬＰＡＡＦＰＡＰ（配列番号４））等が挙げられる。中でも、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質の１番目から１３番目までのアミノ酸残基からなる分泌シグナルペプチド（配列番号２）が好ましい。
【0041】
糖鎖としては特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド又は糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよく、生体内で複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。生体内で複合糖質として存在する糖鎖としては、Ｎ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等が挙げられる。Ｎ－結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型の糖鎖が挙げられる。
なお、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のサブユニット（Ｓ１及びＳ２）は、２２のＮ－結合型グリコシル化部位を有することが知られている（例えば、参考文献１（Shajahan A et al., “Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2.”, Glycobiology, pp. 1-8, 2020, doi: 10.1093/glycob/cwaa042.）、参考文献２（Walls AC et al., “Structure, Function, and Antigenicity of the SARSCoV-2 Spike Glycoprotein”, Cell, Vol. 180, pp. 281-292, 2020.）、及び参考文献３（Watanabe Y et al., “Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike”, Science, Vol. 369, Issue 6501, pp. 330-333, 2020.）等参照）。
なお、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のサブユニット（Ｓ１及びＳ２）は、２２のＮ－結合型グリコシル化部位を有することが知られている（例えば、参考文献１（Shajahan A et al., “Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2.”, Glycobiology, pp. 1-8, 2020, doi: 10.1093/glycob/cwaa042.）、参考文献２（Walls AC et al., “Structure, Function, and Antigenicity of the SARSCoV-2 Spike Glycoprotein”, Cell, Vol. 180, pp. 281-292, 2020.）、及び参考文献３（Watanabe Y et al., “Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike”, Science, Vol. 369, Issue 6501, pp. 330-333, 2020.）等参照）。
【0042】
抗原タンパク質は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットの少なくとも一部を含めばよく、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質の全長を含んでもよく、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部を含む部分タンパク質であってもよい。中でも、ＳＡＲＳコロナウイルス－２のスパイクタンパク質の３１９番目から５８９番目までのアミノ酸残基（アミノ酸配列：配列番号１）からなる部分タンパク質を含むことが好ましい。
【0043】
これらの中でも、本実施形態のワクチン組成物において、抗原タンパク質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく用いられる。
【0044】
本実施形態のワクチン組成物において、抗原タンパク質の含有量は、抗原タンパクの構造にもよるが、ヒアルロン酸誘導体成分の質量に対して、０．００１質量以上１０，０００質量％以下とすることができ、０．１質量％以上１０００質量％以下が好ましく、１．０質量％以上１００．０質量％以下であることがより好ましく、１．５質量％以上５０．０質量％以下であることがさらに好ましく、３．０質量％以上３０．０質量％以下であることが特に好ましく、５．０質量％以上２０．０質量％以下であることが最も好ましい。
抗原タンパク質の含有量は、ワクチン組成物の１００質量部に対しては、０．０００１質量部以上１．００質量部以下であることが好ましく、０．００１質量部以上０．１００質量部以下であることがより好ましく、０．００２質量部以上０．５００質量部以下であることがさらに好ましい。
抗原タンパク質の含有量が上記下限値以上であることで、より効果的に免疫を誘導することができ、一方で、上記上限値以下であることで、抗原タンパク質をヒアルロン酸誘導体成分に封入し、より安定的な構造とすることができる。
抗原タンパク質の含有量は、ワクチン組成物の１００質量部に対しては、０．０００１質量部以上１．００質量部以下であることが好ましく、０．００１質量部以上０．１００質量部以下であることがより好ましく、０．００２質量部以上０．５００質量部以下であることがさらに好ましい。
抗原タンパク質の含有量が上記下限値以上であることで、より効果的に免疫を誘導することができ、一方で、上記上限値以下であることで、抗原タンパク質をヒアルロン酸誘導体成分に封入し、より安定的な構造とすることができる。
【0045】
＜ヒアルロン酸誘導体成分＞
ヒアルロン酸誘導体成分は、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体を含む。
ヒアルロン酸誘導体成分は、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体を含む。
【0046】
ヒアルロン酸誘導体において、ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを解して結合されていてもよい。
【0047】
ここでいう「リンカー」とは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができるが、ヒアルロン酸誘導体においては、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは２アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。ヒアルロン酸誘導体に含まれるペプチドリンカーは、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよく、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
【0048】
［ステリル基］
本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
【0049】
ヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、ヒアルロン酸誘導体１分子あたりのステリル基導入数を増やし、抗原タンパク質との複合体を形成する観点、また、分子の絡み合いを高め、血中での滞留性を高める観点からは、分子量の比較的大きいヒアルロン酸誘導体が好ましい。このようなヒアルロン酸誘導体の分子量としては、４０００（４ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上５００ｋ以下がより好ましく、７ｋ以上３００ｋ以下がさらに好ましく、７ｋ以上１００ｋ以下が特に好ましい。ヒアルロン酸誘導体の分子量が上記下限値以上であることで、分子の絡み合いをより高め、血中での滞留性をより高めることができる。一方、ヒアルロン酸誘導体の分子量が上記上限値以下であることで、粘度の上昇を抑制でき、より高濃度のヒアルロン酸誘導体をワクチン組成物中に溶解させることができる。ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
【0050】
ここでいう、「ヒアルロン酸誘導体の分子量」は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。具体的には、後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。
【0051】
好ましいヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。
【0052】
【化3】
【0053】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
－ＮＲｂ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－Ｓ－Ｒ、
－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
【0054】
ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉａ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉａ）」と称する場合がある）を、１以上有するヒアルロン酸誘導体を含むことが好ましい。
【0055】
【化4】
【0056】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基であり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択され；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基であり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択され；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、
ｍは、１以上１００以下の整数である。）
【0057】
ここで、ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）がそれぞれ２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【0058】
ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）以外の位置において、修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は－Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｏ（ホルミル）、－Ｏ（Ｃ１－６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド又はエステルに変換されていてもよく、塩を形成していてもよい。
【0059】
［繰り返し単位（Ｉ）］
一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基を含む。
当該基としては、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択される基が好ましい。
一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基を含む。
当該基としては、
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択される基が好ましい。
【0060】
（Ｚ）
一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
【0061】
（Ｙ）
一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
【0062】
Ｙは、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－等であってもよい。
【0063】
（Ｙａ）
Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
【0064】
（Ｙｂ）
Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
【0065】
基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリル等が挙げられる。好ましい基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」としては、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、又はＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレン若しくは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
【0066】
［繰り返し単位（Ｉａ）］
一般式（Ｉａ）において、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより好ましい。
一般式（Ｉａ）において、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより好ましい。
【0067】
ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）に加えて、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を更に含むことができる。
【0068】
【化5】
【0069】
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｘａは、ヒドロキシ及び－Ｏ－Ｑ＋からなる群より選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである。）
Ｘａは、ヒドロキシ及び－Ｏ－Ｑ＋からなる群より選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである。）
【0070】
ここで、ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（ＩＩ）が２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。
別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。
【0071】
［繰り返し単位（ＩＩ）］
一般式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。中でも、Ｑ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、Ｃ１－６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ－ブチル基が好ましい。
一般式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。中でも、Ｑ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、Ｃ１－６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ－ブチル基が好ましい。
【0072】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４、並びにＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、全て水素原子であることが好ましい。また、Ｒａ及びＲｂは、いずれも水素原子であることが好ましい。
【0073】
中でも、ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であることが好ましい。ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）である。ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されていてもよい。
【0074】
本実施形態のワクチン組成物において、ヒアルロン酸誘導体成分の含有量は、特に限定されないが、例えば、ワクチン組成物の１００質量部に対して、０．０１質量部以上５０．００質量部以下であることが好ましく、０．１０質量部以上２５．００質量部以下であることがより好ましく、０．２０質量部以上１０．００質量部以下であることがさらに好ましい。
【0075】
＜アジュバント＞
本実施形態のワクチン組成物は、上記抗原タンパク質及び上記ヒアルロン酸誘導体成分に加えて、アジュバントを更に含むことが好ましい。これにより、後述する実施例に示すように、より効果的に免疫（特に液性免疫）を誘導することができる。
本実施形態のワクチン組成物は、上記抗原タンパク質及び上記ヒアルロン酸誘導体成分に加えて、アジュバントを更に含むことが好ましい。これにより、後述する実施例に示すように、より効果的に免疫（特に液性免疫）を誘導することができる。
【0076】
なお、一般に、液性免疫とは、Ｂ細胞と抗体が中心となる免疫機構のことをいう。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）の産生するサイトカインにより、Ｂ細胞が刺激されることで、Ｂ細胞が形質細胞へと分化し、大量の抗体を産生し、抗体は体液中を循環して全身に広がる。また、刺激されたＢ細胞の一部は、抗原の情報を記憶しているメモリーＢ細胞となって、再度の感染の際には、最初の反応より迅速に、そしてより抗原に親和性が高い抗体を大量に産生することができる。一方、細胞性免疫とは、病原体そのものやウイルス感染細胞、癌細胞等の異物の排除において、細胞を主なエフェクターとして免疫機構のことをいう。マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、キラーＴ細胞)、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）等の免疫担当細胞自体による排除機構である。
【0077】
アジュバントとしては、ワクチンに通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、アルミニウム塩、スクアレン、自然免疫受容体に対するリガンド等が挙げられる。
【0078】
ここでいう「リガンド」とは、受容体に特異的に結合するものを意味し、特に、受容体に特異的に結合して、種々の生理作用を示す物質を用いることができる。このような物質を「アゴニスト」ともいう。
【0079】
自然免疫受容体としては、例えば、トール様受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＯＤ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＬＲ）等が挙げられる。
【0080】
ＴＬＲリガンドとしては、例えば、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ－５、ＴＬＲ－６、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８及びＴＬＲ－９からなる群より選択される少なくとも１種のＴＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
【0081】
ＴＬＲ－２リガンドとしては、例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４等が挙げられる。
【0082】
ＴＬＲ－３リガンドとしては、例えば、ポリＩＣＬＣ、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）等が挙げられる。
【0083】
ＴＬＲ－４リガンドとしては、例えば、Ｒ型リポ多糖、Ｓ型リポ多糖、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ等が挙げられる。
【0084】
ＴＬＲ－５リガンドとしては、例えば、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）等が挙げられる。
【0085】
ＴＬＲ－２及びＴＬＲ－６リガンドとしては、例えば、ＭＡＬＰ－２等が挙げられる。
【0086】
ＴＬＲ－７及びＴＬＲ－８リガンドとしては、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｒ８３７）、ガルジキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）等が挙げられる。
【0087】
ＴＬＲ－９リガンドとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等が挙げられる。
【0088】
中でも、アジュバントとしては、抗原提示機能をより向上できることから、アニオン性化合物が好ましく、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドがより好ましい。
【0089】
ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとしては、例えば、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６、ＣｐＧ－Ｋ３等が挙げられる。
【0090】
＜その他添加剤＞
本実施形態のワクチン組成物は、単独で投与することもでき、或いは、薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って、医薬組成物として、使用することができる。医薬組成物として使用する場合は、例えば、上記ワクチン組成物と、水若しくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、含水エタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））等とを、混合してもよく、生理学的に許容し得る賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤、凍結乾燥補助剤等を含むこともできる。
本実施形態のワクチン組成物は、単独で投与することもでき、或いは、薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って、医薬組成物として、使用することができる。医薬組成物として使用する場合は、例えば、上記ワクチン組成物と、水若しくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、含水エタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））等とを、混合してもよく、生理学的に許容し得る賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤、凍結乾燥補助剤等を含むこともできる。
【0091】
防腐剤としては、例えば、ベンザルコニウム塩化物、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ソルビン酸、アルキルポリアミノエチルグリシン等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム水和物、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ポリソルベート８０等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム水和物、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ポリソルベート８０等が挙げられる。
【0092】
＜ワクチン組成物の製造方法＞
本実施形態のワクチン組成物は、ヒアルロン酸誘導体成分を製造した後に、当該ヒアルロン酸誘導体成分に抗原タンパク質や、必要に応じてアジュバントやその他添加剤を添加することで、製造することができる。
本実施形態のワクチン組成物は、ヒアルロン酸誘導体成分を製造した後に、当該ヒアルロン酸誘導体成分に抗原タンパク質や、必要に応じてアジュバントやその他添加剤を添加することで、製造することができる。
【0093】
まず、ヒアルロン酸誘導体成分の製造方法としては、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、ステリル基を導入することで、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体を含むヒアルロン酸誘導体成分が得られる。また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を３０％以上６０％以下とすることができる。
【0094】
グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基を導入する方法として具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されるヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、式：「ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、ＮＨＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ、又は－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、Ｚ及びＲは本明細書で既に定義したとおりである）」で表されるステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。
【0095】
上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。
【0096】
特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシ基が共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシ基とが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
【0097】
ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。多価アルコールとしては、２価のアルコールであってもよく、３価のアルコールであってもよい。２価のアルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等が挙げられる。３価のアルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等が挙げられる。
【0098】
或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ ＋ ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ ＋ ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ ＋ ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ ＋ ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ ＋ Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ ＋ ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ ＋ ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ ＋ Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
【0099】
反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
【0100】
また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル２－ピリジルジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。
【0101】
さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
【0102】
また、ヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、繰り返し単位（Ｉ）、及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１％以上９９．５％以下、好ましくは４０％以上６５％以下を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で化学的に架橋させてゲル化することもできる。
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び
－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で化学的に架橋させてゲル化することもできる。
【0103】
次いで、ヒアルロン酸誘導体をゲル化させて得られる溶液、又は、ヒアルロン酸誘導体のゲルの乾燥物を水等に溶解又は分散させた溶液と、抗原タンパク質を水等に溶解又は分散させた溶液や、必要に応じて、アジュバント及びその他添加剤を水等に溶解又は分散させた溶液と、を混合する（以下、「混合工程」と称する場合がある）。混合工程において、ヒアルロン酸誘導体のステリル基と、抗原タンパク質との疎水性相互作用により、ステリル基及び抗原タンパク質が内部に存在し、一方で、ヒアルロン酸に由来する親水性部位が外縁部に存在する構造からなる、抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体が形成される。
【0104】
混合工程において、抗原タンパク質の疎水部をやや露出し、ヒアルロン酸誘導体と相互作用しやすくする観点から、温度を２５℃以上６５℃以下とすることが好ましく、３０℃以上５５℃以下とすることがより好ましく、３３℃以上４０℃以下とすることがさらに好ましい。或いは、抗原タンパク質の構造及び特性のよって、最適な温度を適宜設定することができる。
【0105】
混合工程において、時間は特に限定されないが、例えば、３０分間以上２４時間以下とすることができ、１時間以上１０時間以下とすることができる。
【0106】
混合工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。中でも、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥を行う場合に、ワクチン組成物は、凍結乾燥時における抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、凍結保護剤を更に含むことが好ましい。
【0107】
凍結保護剤は、「凍結保護剤」又は「凍結乾燥保護剤」として知られているものであれば特に限定されず、例えば、二糖類、ソルビトール、デキストラン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【0108】
二糖類としては特に限定されず、例えば、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ネオヘスペリドース、ルチノース、ルチヌロース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロース等が挙げられる。中でも、凍結保護剤として広く使用されていることから、スクロース、トレハロース、マルトース、又はラクトースが好ましい。また、医薬品添加物としての使用実績や、凍結乾燥時におけるヒアルロン酸誘導体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、スクロースがより好ましい。
【0109】
凍結保護剤は、上記混合工程の前に、ヒアルロン酸誘導体成分又は抗原タンパク質に予め混合してもよく、或いは、上記混合工程の間に、又は、上記混合工程の後に、ワクチン組成物に混合してもよい。凍結保護剤は、固体の状態で添加してもよく、水等の溶媒に溶解した状態で添加してもよい。
【0110】
凍結保護剤の添加量は特に限定されないが、ヒアルロン酸誘導体成分１００質量部に対して、２０質量部以上が好ましい。凍結保護剤の添加量が上記下限値以上であることで、より十分な粒径増大抑制効果が得られる。一方、凍結保護剤の添加量の上限は特に限定されないが、例えば、１００，０００質量部とすることができる。
【0111】
凍結乾燥において使用する装置も特に限定されず、例えば、市販の凍結乾燥機を用いることができる。中でも、真空度を制御する観点からは、凍結乾燥中に装置内の真空度をモニタリングできる凍結乾燥機が好ましく、また、品温を制御する観点からは、棚式凍結乾燥機が好ましい。
【0112】
本実施形態のワクチン組成物としては、製剤化したものを用いてもよい。製剤の形態としては、固体、半固体又は液体の形態とすることができる。
【0113】
固体の場合、粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセル等の形態が挙げられる。中でも、固体としては、凍結乾燥粉末であることが好ましい。本実施形態のワクチン組成物を凍結乾燥粉末とすることで、後述する実施例に示すように、保存安定性を向上させることができる。
【0114】
半固体の場合、ゲル等の形態が挙げられる。
【0115】
液体の場合、粉末を水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液により希釈又は懸濁した懸濁液等の形態が挙げられる。
【0116】
＜投与方法＞
本実施形態のワクチン組成物を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類に分類される動物（サル、マーモセット、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）が挙げられる。
本実施形態のワクチン組成物を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類に分類される動物（サル、マーモセット、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）が挙げられる。
【0117】
投与経路は、例えば、髄腔内注射、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、経肺的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行なうことができる。中でも、皮下注射又は筋肉内注射が好ましい。
【0118】
本実施形態のワクチン組成物において、非経口的に投与する場合、その投与量は、投与対象の種類（年齢や性別等も含む）等を考慮して適宜選択することができるが、一般的に例えばヒト（体重６０ｋｇとして）においては、１回あたり、抗原タンパク質の量として、５μｇ以上１ｍｇ以下とすることができ、１０μｇ以上５００μｇ以下とすることができる。
【0119】
投与回数は、上述した投与量の単回投与であってもよく、上述した投与量を、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は半年毎に１回等、２回以上の複数回投与であってもよい。
【0120】
≪その他実施形態≫
一実施形態において、本発明は、上記ワクチン組成物の有効量を、患者又は患畜に投与することを含む、新型コロナウイルス感染症の予防方法を提供する。
なお、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２に起因する感染症である。
また、ここでいう「有効量」とは、予防に有効な量、すなわち、新型コロナウイルス感染症の発症予防に適する量が包含される。
一実施形態において、本発明は、上記ワクチン組成物の有効量を、患者又は患畜に投与することを含む、新型コロナウイルス感染症の予防方法を提供する。
なお、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２に起因する感染症である。
また、ここでいう「有効量」とは、予防に有効な量、すなわち、新型コロナウイルス感染症の発症予防に適する量が包含される。
【0121】
一実施形態において、本発明は、新型コロナウイルス感染症の予防のための組成物であって、上記抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
【0122】
一実施形態において、本発明は、ワクチン組成物を製造するための、上記抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体の使用を提供する。
【実施例0123】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。
【0124】
＜ヒアルロン酸誘導体成分の製造＞
［製造例１－１］
（ヒアルロン酸誘導体Ｈ１の製造）
ヒアルロン酸誘導体を次の工程１～工程３に従って調製した。
［製造例１－１］
（ヒアルロン酸誘導体Ｈ１の製造）
ヒアルロン酸誘導体を次の工程１～工程３に従って調製した。
【0125】
１．工程１
（コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１－１、続いて工程１－２に従って合成した。
（コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１－１、続いて工程１－２に従って合成した。
【0126】
（１）工程１－１
コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
【0127】
（２）工程１－２
得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル ６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
【0128】
２．工程２
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１、続いて工程２－２に従って調製した。
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１、続いて工程２－２に従って調製した。
【0129】
（１）工程２－１
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
【0130】
（２）工程２－２
分子量１０，０００（１０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２－１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
分子量１０，０００（１０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２－１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
【0131】
３．工程３
「２．（２）工程２－２」で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、「１．工程１」で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で４４／１００となるように添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で４８／１００となるように加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：２，０００）した。得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ：ＨＡ－１）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４２％であった。また、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、１２，０００であった。なお、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、以下の方法を用いて測定した。
「２．（２）工程２－２」で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、「１．工程１」で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で４４／１００となるように添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で４８／１００となるように加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：２，０００）した。得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ：ＨＡ－１）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４２％であった。また、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、１２，０００であった。なお、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、以下の方法を用いて測定した。
【0132】
（ヒアルロン酸誘導体の分子量）
ヒアルロン酸誘導体の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。ヒアルロン酸誘導体組成物（２０ｍｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解して室温で１２時間以上撹拌し、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。このヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（７５０μＬ）に対して３００ｍＭ ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）水溶液（７５０μＬ）加えて振とう機を用いて１０秒間混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。そして、得られた試料をＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定に供して重量平均分子量を決定した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定の条件を以下に示す。
ヒアルロン酸誘導体の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。ヒアルロン酸誘導体組成物（２０ｍｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解して室温で１２時間以上撹拌し、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。このヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（７５０μＬ）に対して３００ｍＭ ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）水溶液（７５０μＬ）加えて振とう機を用いて１０秒間混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。そして、得られた試料をＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定に供して重量平均分子量を決定した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定の条件を以下に示す。
【0133】
（測定条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本
カラム温度：３０℃
溶離液：１０ｍＭ ＨＰ－β－ＣＤ入りリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／分
注入量：２００μＬ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本
カラム温度：３０℃
溶離液：１０ｍＭ ＨＰ－β－ＣＤ入りリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／分
注入量：２００μＬ
【0134】
＜抗原タンパク質の製造＞
［製造例２－１］
抗原タンパク質は、以下のようにして作製した。
［製造例２－１］
抗原タンパク質は、以下のようにして作製した。
【0135】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００９７２４３９０）のＳ１タンパク質の受容体結合領域を含む領域（ＲＢＤ；３１９番目のアミノ酸から５８９番目のアミノ酸まで；配列番号１）において、Ｎ末端に自身の分泌シグナルペプチド（ＳＰ；１番目のアミノ酸から１３番目のアミノ酸まで；配列番号２）を付加し、且つ、Ｃ末端にＧ１９６タグ（ＤＬＶＰＲ；配列番号５）及びＨｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号６）を融合したタンパク質（アミノ酸配列：配列番号７）をコードし、且つ、ヒト用にコドンを最適化した人工遺伝子（配列番号８）を合成した。次いで、５’末端及び３’末端に付加したＢａｍＨＩ切断配列及びＥｃｏＲＩ切断配列を用いて、発現ベクターｐＭａｂＰｒｏｔｅｉｎ－Ｋａｎ（ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ）のマルチクローニングサイトに挿入して、抗原タンパク質発現ベクターを作製した。
【0136】
作製した抗原タンパク質発現ベクターを、動物細胞に導入した後、分泌タンパク質として発現させ、培養上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ、３０２３０）を用いて精製した。精製したタンパク質はリン酸緩衝液で透析後、フィルター滅菌した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて精製タンパク質を電気泳動したところ、予想される分子サイズより泳動度が遅かったため、予想通り糖鎖修飾を受けていると推測できた。
【0137】
＜ワクチン組成物の製造＞
［実施例１］
（ワクチン組成物の製造）
製造例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１を５ｍｇ／ｍＬ、スクロース１０質量％となるように水へ溶解させた。別の容器にて、抗原タンパク質の濃度が０．３３ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液、９．６質量％スクロースとなるように希釈して、抗原タンパク質の水溶液を得た。室温で、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１水溶液と抗原タンパク質の水溶液を容量比で１：１の割合で混合し、３７℃で４時間インキュベートすることで、抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体を含むワクチン組成物を得た。ワクチン組成物１００質量部に対する、ヒアルロン酸誘導体の含有量は０．２５質量部、抗原タンパクの含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭであった。
［実施例１］
（ワクチン組成物の製造）
製造例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１を５ｍｇ／ｍＬ、スクロース１０質量％となるように水へ溶解させた。別の容器にて、抗原タンパク質の濃度が０．３３ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液、９．６質量％スクロースとなるように希釈して、抗原タンパク質の水溶液を得た。室温で、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１水溶液と抗原タンパク質の水溶液を容量比で１：１の割合で混合し、３７℃で４時間インキュベートすることで、抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体を含むワクチン組成物を得た。ワクチン組成物１００質量部に対する、ヒアルロン酸誘導体の含有量は０．２５質量部、抗原タンパクの含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭであった。
【0138】
［実施例２］
（アジュバント含有ワクチン組成物の製造）
製造例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１を５ｍｇ／ｍＬ、スクロース１２．８質％となるように水へ溶解させた。別の容器にて、抗原タンパク質の濃度が０．６６ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液、１２．８％スクロースとなるように希釈して、抗原タンパク質の水溶液を得た。ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６水溶液は１００μＭとなるように調整した。
（アジュバント含有ワクチン組成物の製造）
製造例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１を５ｍｇ／ｍＬ、スクロース１２．８質％となるように水へ溶解させた。別の容器にて、抗原タンパク質の濃度が０．６６ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭリン酸緩衝液、１２．８％スクロースとなるように希釈して、抗原タンパク質の水溶液を得た。ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６水溶液は１００μＭとなるように調整した。
【0139】
室温で、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１水溶液、抗原タンパク質の水溶液を容量比で２：１の割合で混合し、３７℃で４時間インキュベートすることで、抗原タンパク質－ヒアルロン酸誘導体複合体を含むワクチン組成物を得た。得られたワクチン組成物に各アジュバント水溶液を容量比で３：１の比で混合することで、各アジュバント含有ワクチン組成物を得た。このアジュバント含有ワクチン組成物１００質量部に対する、ヒアルロン酸誘導体の含有量は０．２５質量部、抗原タンパク質の含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭ、アジュバントの濃度は、２５μＭであった。
【0140】
［実施例３］
（アジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液の製造）
実施例２で得られたＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物２ｍＬを６ｍＬの滅菌バイアルに入れ、－８０℃で凍結後、減圧することで凍結乾燥を行い、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末を得た。
（アジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液の製造）
実施例２で得られたＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物２ｍＬを６ｍＬの滅菌バイアルに入れ、－８０℃で凍結後、減圧することで凍結乾燥を行い、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末を得た。
【0141】
また、得られた凍結乾燥粉末を注射用水にて総容量２ｍＬの水溶液に戻すことで、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物の再溶解液を得た。このＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液１００質量部に対する、ヒアルロン酸誘導体の含有量は０．２５質量部、抗原タンパク質の含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭ、アジュバントの濃度は２５μＭであった。
【0142】
［比較例１］
ワクチン組成物１００質量部に対する、抗原タンパクの含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭとなるように調整し、ワクチン組成物を得た。
ワクチン組成物１００質量部に対する、抗原タンパクの含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭとなるように調整し、ワクチン組成物を得た。
【0143】
［複合化の確認］
以下の測定により抗原タンパク質がすべてヒアルロン酸誘導体成分に複合化されていることを確認した。
以下の測定により抗原タンパク質がすべてヒアルロン酸誘導体成分に複合化されていることを確認した。
【0144】
（評価方法）
実施例１のワクチン組成物、実施例２のアジュバント含有ワクチン組成物、実施例３のアジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液、及び比較例１のワクチン組成物、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１の２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の測定条件にて測定した。
実施例１のワクチン組成物、実施例２のアジュバント含有ワクチン組成物、実施例３のアジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液、及び比較例１のワクチン組成物、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１の２．５ｍｇ／ｍＬ溶液を以下の測定条件にて測定した。
【0145】
（測定条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
カラム温度：３０℃
溶離液：１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／分
注入量：１００μＬ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
カラム温度：３０℃
溶離液：１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／分
注入量：１００μＬ
【0146】
（結果）
比較例１では、９．４分に抗原タンパクに由来するピークが確認されるのに対し、実施例１、実施例２、及び実施例３の組成物では、９．４分に抗原タンパクに由来するピークは確認されず、６．０分にヒアルロン酸誘導体成分に由来する成分のピークが、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１のみの溶液と比較して面積値が増大しており、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１に完全に複合化されていることがわかった。
比較例１では、９．４分に抗原タンパクに由来するピークが確認されるのに対し、実施例１、実施例２、及び実施例３の組成物では、９．４分に抗原タンパクに由来するピークは確認されず、６．０分にヒアルロン酸誘導体成分に由来する成分のピークが、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１のみの溶液と比較して面積値が増大しており、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１に完全に複合化されていることがわかった。
【0147】
［試験例１］
（マウス皮下投与による抗体産生能亢進効果の評価）
実施例１及び２で作製した各ワクチン組成物を用いて、抗体産生能の亢進効果を評価した。処方は、下記表１及び表２に示すとおりである。１回目の投与から１０日後に、同量を皮下投与した（すなわち、投与回数は２回とした）。なお、表１及び表２は、別日に独立して行った試験である。そのため、表１及び表２において、試験４の処方は、同一であるが、使用したＥＬＩＳＡのロットが異なることから、結果に多少の差異がみられた。
表１において、試験２～試験５では、実施例１のワクチン組成物と同時にアジュバント溶液も皮下投与した。使用したアジュバント溶液中の各アジュバントの濃度は、以下に示すとおりである。すなわち、アルミニウム塩ではＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、水酸化アルミニウム４０ｍｇ／ｍＬと水酸化マグネシウム４０ｍｇ／ｍＬの混合液）を用いた。また、スクアレンは原液をそのまま用い、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６では１００μＭ、ＣｐＧ－Ｋ３では１００μＭであった。
（マウス皮下投与による抗体産生能亢進効果の評価）
実施例１及び２で作製した各ワクチン組成物を用いて、抗体産生能の亢進効果を評価した。処方は、下記表１及び表２に示すとおりである。１回目の投与から１０日後に、同量を皮下投与した（すなわち、投与回数は２回とした）。なお、表１及び表２は、別日に独立して行った試験である。そのため、表１及び表２において、試験４の処方は、同一であるが、使用したＥＬＩＳＡのロットが異なることから、結果に多少の差異がみられた。
表１において、試験２～試験５では、実施例１のワクチン組成物と同時にアジュバント溶液も皮下投与した。使用したアジュバント溶液中の各アジュバントの濃度は、以下に示すとおりである。すなわち、アルミニウム塩ではＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、水酸化アルミニウム４０ｍｇ／ｍＬと水酸化マグネシウム４０ｍｇ／ｍＬの混合液）を用いた。また、スクアレンは原液をそのまま用い、ＣｐＧ－ＯＤＮ １８２６では１００μＭ、ＣｐＧ－Ｋ３では１００μＭであった。
【0148】
【表1】
【0149】
【表2】
【0150】
（抗体産生能の評価方法）
抗体産生能の評価方法は、以下に示すとおりである。
酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡという。）により、上記試験１～７及び比較試験１の処方の溶液を皮下投与したマウスから採取した産生抗体を含む各血清（２回目の接種から１０日後に採取）を評価した。抗原として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が固定化されている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体測定プレート（ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ、Ｅ－Ｓ－００２）に、産生抗体を含む各血清（５００倍希釈）を添加して抗原抗体反応を行なった。洗浄後に酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加してプレートリーダーで吸光度（波長４５０ｎｍ、バックグランド波長６２０ｎｍ）を測定し、抗体価を吸光度（ＯＤ）として決定した。陰性コントロール血清として、処理前のマウス血清を使用した。発色時間は、遮光して２５℃、１５分とし、その他すべて同一条件下で行った。結果を上記表１及び表２に示す。
抗体産生能の評価方法は、以下に示すとおりである。
酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡという。）により、上記試験１～７及び比較試験１の処方の溶液を皮下投与したマウスから採取した産生抗体を含む各血清（２回目の接種から１０日後に採取）を評価した。抗原として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が固定化されている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体測定プレート（ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ、Ｅ－Ｓ－００２）に、産生抗体を含む各血清（５００倍希釈）を添加して抗原抗体反応を行なった。洗浄後に酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加してプレートリーダーで吸光度（波長４５０ｎｍ、バックグランド波長６２０ｎｍ）を測定し、抗体価を吸光度（ＯＤ）として決定した。陰性コントロール血清として、処理前のマウス血清を使用した。発色時間は、遮光して２５℃、１５分とし、その他すべて同一条件下で行った。結果を上記表１及び表２に示す。
【0151】
表１及び表２に示すように、ヒアルロン酸誘導体成分を含まない比較試験１と比較して、試験１～試験７ではすべて高い抗体価を示すことがわかった。このことから、ヒアルロン酸誘導体成分の液性免疫活性能が示された。
また、アジュバントとして、ＣｐＧを用いた場合には、さらに高い抗体価を示し、より好適な組成であることがわかった。
また、アジュバントとして、ＣｐＧを用いた場合には、さらに高い抗体価を示し、より好適な組成であることがわかった。
【0152】
また、表２に示すように、ＣｐＧを予め加えた単一溶液として投与したほうがより高い抗体産生が確認され、また、凍結乾燥粉末とした後、再懸濁した溶液を接種したほうが、さらに高い抗体産生が確認された。これにより、ＣｐＧを予め加えた単一溶液とし、且つ、凍結乾燥粉末とした後、再懸濁することが、ワクチンとしてより高い抗体産生能を示すことが明らかとなった。
【0153】
（平均粒子径の評価方法）
実施例１のワクチン組成物、実施例２のアジュバント含有ワクチン組成物、及び実施例３のアジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液をヒアルロン酸誘導体成分が２ｍｇ／ｍＬになるように超純水で希釈後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍希釈した後に以下条件でＤＬＳ測定を行った。
実施例１のワクチン組成物、実施例２のアジュバント含有ワクチン組成物、及び実施例３のアジュバント含有ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液をヒアルロン酸誘導体成分が２ｍｇ／ｍＬになるように超純水で希釈後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍希釈した後に以下条件でＤＬＳ測定を行った。
【0154】
（測定条件）
ＤＬＳ装置：大塚電子製、ＥＬＳＺ２０００
セル：微量粒径セル
温度：３７℃
ヒアルロン酸誘導体組成物の濃度：１ｍｇ／ｍＬ
ＤＬＳ装置：大塚電子製、ＥＬＳＺ２０００
セル：微量粒径セル
温度：３７℃
ヒアルロン酸誘導体組成物の濃度：１ｍｇ／ｍＬ
【0155】
【表3】
【0156】
（抗体解析の評価方法）
感染阻害実験によるウイルス中和活性を測定することにより、上記試験４の処方の溶液を皮下投与したマウスから採取した産生抗体を含む血清の抗体価を評価した。具体的には、上記血清を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＪＰＮ／ＴＹ－ＷＫ－５２１株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＣ５２２９７５．１）の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への感染阻害実験を封じ込めレベルＰ３で行なった。上記血清を、２０倍から５，１２０倍までの２倍段階希釈したサンプルを用いて、ウイルスのみの感染時のプラーク数から５０％減少した希釈倍率により阻害活性を評価した。阻害活性は、５０％ Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ＰＲＮＴ５０）で評価を行った。
その結果、ウイルスのみの感染時のプラーク数から５０％減少した希釈倍率は、２０～８０倍であり、良好な阻害活性が確認された。
感染阻害実験によるウイルス中和活性を測定することにより、上記試験４の処方の溶液を皮下投与したマウスから採取した産生抗体を含む血清の抗体価を評価した。具体的には、上記血清を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＪＰＮ／ＴＹ－ＷＫ－５２１株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＣ５２２９７５．１）の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への感染阻害実験を封じ込めレベルＰ３で行なった。上記血清を、２０倍から５，１２０倍までの２倍段階希釈したサンプルを用いて、ウイルスのみの感染時のプラーク数から５０％減少した希釈倍率により阻害活性を評価した。阻害活性は、５０％ Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ＰＲＮＴ５０）で評価を行った。
その結果、ウイルスのみの感染時のプラーク数から５０％減少した希釈倍率は、２０～８０倍であり、良好な阻害活性が確認された。
【0157】
（長期抗体維持能の評価方法）
上記２回目の投与から１年（３６５日経過）後に、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、１年経過後の血清（上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後）の抗体価を評価した。結果を以下の表４に示す。
上記２回目の投与から１年（３６５日経過）後に、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、１年経過後の血清（上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後）の抗体価を評価した。結果を以下の表４に示す。
【0158】
【表4】
【0159】
（免疫記憶能の評価方法１）
上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後に、抗体価が０．１以下になったものを選定し、そのマウスに、同じワクチン組成物の皮下投与試験を行った。投与した処方は、下記表５に示すとおりである。１回目の接種から１０日後に、同量を皮下投与した。上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中の（投与前（上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後）中の抗体価を評価した。そのうち抗体価が０．１以下のものを選定し、同じワクチン組成物を皮下投与した（すなわち、投与回数は３回とした）。１０日後、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記３回目の接種から１０日後）中の抗体価を評価した。結果を以下の表５に示す。
上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後に、抗体価が０．１以下になったものを選定し、そのマウスに、同じワクチン組成物の皮下投与試験を行った。投与した処方は、下記表５に示すとおりである。１回目の接種から１０日後に、同量を皮下投与した。上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中の（投与前（上記２回目の接種から１年（３６５日経過）後）中の抗体価を評価した。そのうち抗体価が０．１以下のものを選定し、同じワクチン組成物を皮下投与した（すなわち、投与回数は３回とした）。１０日後、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記３回目の接種から１０日後）中の抗体価を評価した。結果を以下の表５に示す。
【0160】
【表5】
【0161】
表４及び表５に示すように、ヒアルロン酸誘導体成分を含まない比較試験２と比較して、試験８～試験９では、長期間抗体産生能が維持されていることがわかった。また、上記２回目の接種から１年経過後に投与することで、抗体価の上昇が見られたことから、長期間免疫記憶が維持されていることが明らかとなった。
また、アジュバントとして、ＣｐＧを用いた場合でも、長期間高い抗体価を維持できることがわかった。
また、アジュバントとして、ＣｐＧを用いた場合でも、長期間高い抗体価を維持できることがわかった。
【0162】
（免疫記憶能の評価方法２）
上記２回目の接種から３か月（９０日経過）後に、抗体価が０．１以下になったものを選定し、そのマウスに、同じワクチン組成物の皮下投与試験を行った。投与した処方は、下記表６に示すとおりである。１回目の接種から１０日後に、同量を皮下投与した。上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記２回目の接種から３か月（９０日経過）後）の抗体価を評価した。そのうち抗体価が０．１以下のものを選定し、表６の処方（３回目接種）に示すワクチン組成物を皮下投与した（すなわち、投与回数は３回とした）。１０日後、３か月後、６か月後、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記３回目の接種から１０日後、３か月後、６か月後）の抗体価を評価した。結果を以下の表６に示す。
上記２回目の接種から３か月（９０日経過）後に、抗体価が０．１以下になったものを選定し、そのマウスに、同じワクチン組成物の皮下投与試験を行った。投与した処方は、下記表６に示すとおりである。１回目の接種から１０日後に、同量を皮下投与した。上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記２回目の接種から３か月（９０日経過）後）の抗体価を評価した。そのうち抗体価が０．１以下のものを選定し、表６の処方（３回目接種）に示すワクチン組成物を皮下投与した（すなわち、投与回数は３回とした）。１０日後、３か月後、６か月後、上記「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、血清中（上記３回目の接種から１０日後、３か月後、６か月後）の抗体価を評価した。結果を以下の表６に示す。
【0163】
【表6】
【0164】
これにより、免疫記憶後に抗体価を上昇させた場合でも、長期に抗体価を維持できることがわかった。
【0165】
＜蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分の製造＞
［製造例１－２］
（蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の製造）
Ｃｈｏｌ塩酸塩を添加する前に、ＨＡユニットに対するＣｙ－５ａｍｉｎｅの添加量がモル比で４／１００となるように添加した後、ＨＡユニットに対するＤＭＴ－ＭＭの添加量がモル比で６／１００となるように加え、室温で一晩撹拌し反応すること以外は、製造例１－１に記載のヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１の製造方法と同様の方法で蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１を得た。
［製造例１－２］
（蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の製造）
Ｃｈｏｌ塩酸塩を添加する前に、ＨＡユニットに対するＣｙ－５ａｍｉｎｅの添加量がモル比で４／１００となるように添加した後、ＨＡユニットに対するＤＭＴ－ＭＭの添加量がモル比で６／１００となるように加え、室温で一晩撹拌し反応すること以外は、製造例１－１に記載のヒアルロン酸誘導体成分ＨＡ－１の製造方法と同様の方法で蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１を得た。
【0166】
＜蛍光修飾抗原タンパク質の製造＞
［製造例２－２］
（蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫの製造）
フルオレセイン標識用キット－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて、キットマニュアルに従い蛍光ラベル化を行った。使用した抗原タンパク溶液は０．５ｍｇ／ｍＬであった。最終的には１０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、回収した。得られた溶液を抗原タンパクＳＪＫ水溶液として用いた。
［製造例２－２］
（蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫの製造）
フルオレセイン標識用キット－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて、キットマニュアルに従い蛍光ラベル化を行った。使用した抗原タンパク溶液は０．５ｍｇ／ｍＬであった。最終的には１０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、回収した。得られた溶液を抗原タンパクＳＪＫ水溶液として用いた。
【0167】
＜蛍光修飾ワクチン組成物の製造＞
［実施例４］
（蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１の製造）
蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬ、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫの濃度が０．１６５ｍｇ／ｍＬとなるように、５ｍＭ リン酸緩衝液及び９．８質量％スクロース含有水溶液に溶解し、３７℃４時間インキュベートを行い、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１を作製した。
［実施例４］
（蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１の製造）
蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬ、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫの濃度が０．１６５ｍｇ／ｍＬとなるように、５ｍＭ リン酸緩衝液及び９．８質量％スクロース含有水溶液に溶解し、３７℃４時間インキュベートを行い、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１を作製した。
【0168】
［試験例２］
（リンパ節移行性の評価）
次いで、ワクチン組成物のリンパ節移行性を評価した。
なお、比較試験２に用いる溶液として、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫの濃度が０．１６５ｍｇ／ｍＬとなるように、５ｍＭ リン酸緩衝液及び９．８質量％スクロース含有水溶液に溶解し、蛍光修飾抗原タンパク質溶液ＳＪＫ－１を予め作製した。
（リンパ節移行性の評価）
次いで、ワクチン組成物のリンパ節移行性を評価した。
なお、比較試験２に用いる溶液として、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫの濃度が０．１６５ｍｇ／ｍＬとなるように、５ｍＭ リン酸緩衝液及び９．８質量％スクロース含有水溶液に溶解し、蛍光修飾抗原タンパク質溶液ＳＪＫ－１を予め作製した。
【0169】
ＣＤＦ１マウス背部右下へ蛍光修飾抗原タンパク質溶液ＳＪＫ－１、又は、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１（それぞれ１００μＬ）を皮下投与し、６時間後又は１日後に所属リンパ節である鼠径リンパ節、及び、投与箇所を含む背部皮膚を回収した。ＩＶＩＳ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）により鼠径リンパ節と皮膚の蛍光強度を測定した。また、共焦点レーザー顕微鏡により、投与側の鼠径リンパ節を三次元観察した。鼠径リンパ節における蛍光強度測定の結果を図１（Ａ）（蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫ）及び図１（Ｂ）（蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１）に、皮膚における蛍光強度測定の結果を図２（Ａ）（蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫ）及び図２（Ｂ）（蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１）に、鼠径リンパ節の共焦点レーザー顕微鏡による三次元観察像を図３（Ａ）（蛍光（ＦＩＴＣ）修飾抗原タンパク質ＳＪＫ）及び図３（Ｂ）（蛍光（Ｃｙ５）修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１）に示す。
【0170】
図１に示すように、蛍光修飾抗原タンパク質溶液ＳＪＫ－１は所属リンパ節での蛍光が殆ど観測されず、リンパ節移行性に乏しいことが示された。その一方で、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１は、ＦＩＴＣ及びＣｙ５由来の強い蛍光が観測され、抗原タンパク質のヒアルロン酸誘導体による複合化により、リンパ節への抗原送達性が向上したことが示された。また、投与２４時間後においても蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１は鼠径リンパ節へ滞留していることが示された。
【0171】
図２に示すように、皮下における滞留性に関しても同様であり、ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１による抗原複合化により、皮下での拡散が抑制され、抗原の皮下滞留性が向上したことが示された。
【0172】
図３に示すように、共焦点レーザー顕微鏡による三次元観察により、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫ、及び、蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１のリンパ節内分布を観察したところ、ＩＶＩＳの結果と同様に、蛍光修飾抗原タンパク質溶液ＳＪＫ－１投与群では蛍光が観察されなかった。一方で、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１投与群では、蛍光修飾抗原タンパク質ＳＪＫ、及び、蛍光修飾ヒアルロン酸誘導体成分ＨＫ１が共にリンパ節内部に浸潤していることが示された。また、それらの蛍光は共局在しており、蛍光修飾ワクチン組成物ＨＫ１ＳＪＫ－１は、複合体の状態を保持してリンパ節内部へ浸潤していることが明らかとなった。
【0173】
＜ワクチン組成物の製造２＞
［実施例５］
（ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液の製造）
実施例１で得られたワクチン組成物２ｍＬを６ｍＬの滅菌バイアルに入れ、－８０℃で凍結後、減圧することで凍結乾燥を行い、ワクチン組成物の凍結乾燥粉末を得た。
［実施例５］
（ワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液の製造）
実施例１で得られたワクチン組成物２ｍＬを６ｍＬの滅菌バイアルに入れ、－８０℃で凍結後、減圧することで凍結乾燥を行い、ワクチン組成物の凍結乾燥粉末を得た。
【0174】
得られたワクチン組成物の凍結乾燥粉末を、２５℃２８日間又は４０℃３０日間保存した。
【0175】
得られた保存後の凍結乾燥粉末を注射用水にて総容量２ｍＬの水溶液に戻すことで、ワクチン組成物の再溶解液を得た。このワクチン組成物の凍結乾燥粉末の再溶解液１００質量部に対する、ヒアルロン酸誘導体の含有量は０．２５質量部、抗原タンパク質の含有量は０．０１６５質量部、スクロースの含有量は ９．８質量部、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭであった。
【0176】
［試験例３］
（マウス皮下投与による抗体産生能亢進効果の評価２）
実施例５で得られた再溶解液を用いて、抗体産生能の亢進効果を評価した（試験１２、１３）。比較試験４として、比較試験１と同じ組成の溶液を調整し投与した。１回目の投与から１０日後に、同量を皮下投与した（すなわち、投与回数は２回とした）。２回目の投与から１０日経過後に、後述する１０－２．１抗体を用いた以外は上記試験例１に記載の「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、１０日経過後の血清の抗体価を評価した。結果を以下の表７に示す。
（マウス皮下投与による抗体産生能亢進効果の評価２）
実施例５で得られた再溶解液を用いて、抗体産生能の亢進効果を評価した（試験１２、１３）。比較試験４として、比較試験１と同じ組成の溶液を調整し投与した。１回目の投与から１０日後に、同量を皮下投与した（すなわち、投与回数は２回とした）。２回目の投与から１０日経過後に、後述する１０－２．１抗体を用いた以外は上記試験例１に記載の「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、１０日経過後の血清の抗体価を評価した。結果を以下の表７に示す。
【0177】
【表7】
【0178】
表７に示すように、ヒアルロン酸誘導体成分を含まない比較試験４と比較して、試験１２～１３では、高い抗体価を示すことがわかった。
【0179】
（検量線に用いる抗体の検討）
発明者らは、スパイクタンパク質をマウスに免疫し、モノクローナル抗体を得て、その立体構造を認識し捕捉できる抗体を免疫沈降法により更に選別し、多数の抗体を得た。中でも、スパイクタンパク質を効率よく認識する１０－２．１抗体を標準抗体とした検量線を使用することにより、抗体価を正確に評価することができた。
発明者らは、スパイクタンパク質をマウスに免疫し、モノクローナル抗体を得て、その立体構造を認識し捕捉できる抗体を免疫沈降法により更に選別し、多数の抗体を得た。中でも、スパイクタンパク質を効率よく認識する１０－２．１抗体を標準抗体とした検量線を使用することにより、抗体価を正確に評価することができた。
【0180】
検体と同時に、標準抗体１０－２．１（後述）は１，０００ｎｇ／ｍＬから２．１ｎｇ／ｍＬまで段階希釈し、上記試験例１に記載の「抗体産生能の評価方法」と同様の方法を用いて、測定を行った。標準抗体の段階希釈を検量線として、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）等の解析ソフトを用いて、定量化することができた。
【0181】
１０－２．１を標準抗体として使用するにあたり、遺伝子解析の結果を以下に示す。ハイブリドーマ１０－２．１からＲＮＡを抽出後、ｏｌｉｇｏ－ｄＴプライマーを用いて逆転写しｃＤＮＡを作成した。合成したｃＤＮＡを、Ｈ鎖及びＬ鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。用いたプライマー配列は以下のとおりである。なお、下線部は制限酵素の認識サイトを示す。すなわち、配列番号９及び１１の「ｇｇａｔｃｃ」はＢａｍＨＩサイトであり、配列番号１０及び１２の「ｇａａｔｔｃ」はＥｃｏＲＩサイトである。
【0182】
【表8】
【0183】
ハイブリドーマ１０－２．１抗体のＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）、塩基配列（
配列番号１４）、Ｌ鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）、塩基配列（配列番号１６）を決
定した。また、ＣＤＲのアミノ酸配列を表９に、塩基配列を表１０に示す。
配列番号１４）、Ｌ鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）、塩基配列（配列番号１６）を決
定した。また、ＣＤＲのアミノ酸配列を表９に、塩基配列を表１０に示す。
【0184】
【表9】
【0185】
【表10】
【産業上の利用可能性】
【0186】
本実施形態のワクチン組成物によれば、ポリエチレングリコール鎖を使用せず、且つ、従来よりも免疫記憶の期間が向上したワクチン組成物を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】