(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023090618
(43)【公開日】2023-06-29
(54)【発明の名称】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20230622BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20230622BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230622BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230622BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230622BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230622BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230622BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230622BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230622BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55 ZNA
C12N9/14
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/6869 Z
C12M1/34 E
C12M1/34 Z
【審査請求】有
【請求項の数】40
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022131279
(22)【出願日】2022-08-19
(31)【優先権主張番号】202111546554.8
(32)【優先日】2021-12-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522332250
【氏名又は名称】チタン テクノロジー リミテッド， ベイジン
【氏名又は名称原語表記】ＱＩＴＡＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．， ＢＥＩＪＩＮＧ
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０１， Ｆｌｏｏｒ ３， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ５， Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ， Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｎｏ．６６ Ｘｉ Ｘｉａｏｋｏｕ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジャン ジョウガン
(72)【発明者】
【氏名】ワン ムーヤン
(72)【発明者】
【氏名】ズオ ユアン
(72)【発明者】
【氏名】リュウ ウェイリー
(72)【発明者】
【氏名】グオ チァンチァン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB16
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B050CC04
4B050DD01
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4B063QA13
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4B063QQ42
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4B063QR35
4B063QR42
4B063QS05
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4B063QS36
4B063QX05
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA31
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ及びその使用を提供することである。
【解決手段】具体的に、修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを含む構造体、及び標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御におけるその使用を提供する。本発明は、さらに、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法、又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を効果的制御することができる。
【選択図】図１
【解決手段】具体的に、修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを含む構造体、及び標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御におけるその使用を提供する。本発明は、さらに、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法、又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を効果的制御することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼであって、
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、
（Ａ）少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失であって、置換又は欠失された天然アミノ酸が、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９に対応するアミノ酸を含む、少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失、及び／又は、
（Ｂ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換であって、置換されたアミノ酸が、配列番号６のＨ８７及び／又はＶ４２２及び／又はＩ２８２に対応するアミノ酸を含む、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、
をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、
ことを特徴とするＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、
（Ａ）少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失であって、置換又は欠失された天然アミノ酸が、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９に対応するアミノ酸を含む、少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失、及び／又は、
（Ｂ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換であって、置換されたアミノ酸が、配列番号６のＨ８７及び／又はＶ４２２及び／又はＩ２８２に対応するアミノ酸を含む、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、
をさらに含み、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、
ことを特徴とするＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項2】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号１のバリアントであって、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｅ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１のバリアント、
（ｂ）配列番号２のバリアントであって、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｄ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号２のバリアント、
（ｃ）配列番号３のバリアントであって、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号３のバリアント、
（ｄ）配列番号４のバリアントであって、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号４のバリアント、
（ｅ）配列番号５のバリアントであって、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号５のバリアント、
（ｆ）配列番号６のバリアントであって、タワードメインのＥ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６、及び／又はピンドメインのＫ９１－Ｅ１０７、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号６のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、タワードメインのＴ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２、及び／又はピンドメインのＫ１００－Ｄ１１６、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、タワードメインのＤ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４、及び／又はピンドメインのＫ９５－Ｅ１１２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３、及び／又はピンドメインのＫ８８－Ｅ１０４、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９、及び／又はピンドメインのＫ９７－Ａ１１３、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１１のバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号１のバリアントであって、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｅ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１のバリアント、
（ｂ）配列番号２のバリアントであって、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ｄ１０５、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号２のバリアント、
（ｃ）配列番号３のバリアントであって、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号３のバリアント、
（ｄ）配列番号４のバリアントであって、タワードメインのＴ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４、及び／又はピンドメインのＫ８９－Ａ１０９、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号４のバリアント、
（ｅ）配列番号５のバリアントであって、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号５のバリアント、
（ｆ）配列番号６のバリアントであって、タワードメインのＥ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６、及び／又はピンドメインのＫ９１－Ｅ１０７、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号６のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、タワードメインのＴ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２、及び／又はピンドメインのＫ１００－Ｄ１１６、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、タワードメインのＤ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４、及び／又はピンドメインのＫ９５－Ｅ１１２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、タワードメインのＥ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１、及び／又はピンドメインのＫ８６－Ｅ１０２、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、タワードメインのＥ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３、及び／又はピンドメインのＫ８８－Ｅ１０４、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、タワードメインのＥ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９、及び／又はピンドメインのＫ９７－Ａ１１３、及び／又は１ＡドメインのＭ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４に少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入されている、配列番号１１のバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項3】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は、（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つに限定される位置に対応するシステイン残基を含む、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は、（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む、配列番号１１のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントであって、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つに限定される位置に対応するシステイン残基を含む、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項4】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列が、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列であるか、又は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．９％の相同性を有し且つポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項5】
導入されたシステイン同士が互いに連結され、導入された非天然アミノ酸同士が互いに連結され、導入されたシステインと非天然アミノ酸とが互いに連結され、導入されたシステインと天然アミノ酸とが互いに連結され、又は、導入された非天然アミノ酸と天然アミノ酸とが互いに連結される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項6】
前記（Ａ）において、前記天然アミノ酸は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸又は荷電したアミノ酸で置換され、前記非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）又はバリン（Ｖ）を含み、前記極性アミノ酸は、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）を含み、前記荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）を含み、及び／又は、一つの又は複数の前記システイン（Ｃ）は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はバリン（Ｖ）で置換される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項7】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号６のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、（ｉ）Ｃ３０８及び／又はＣ４１９と（ｉｉ）Ｃ１１４、Ｃ１１９、Ｃ１４１のうちの一つ又は複数との組み合わせである、配列番号６のバリアント、
（ｂ）配列番号１のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ３９、Ｃ１１２、Ｃ１１７、Ｃ４１７のうちの一つ又は複数である、配列番号１のバリアント、
（ｃ）配列番号２のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１１２、Ｃ１１７、Ｃ１３９、Ｃ２０２、Ｃ３０７、Ｃ３２７、Ｃ３４４、Ｃ３９５、Ｃ４１５のうちの一つ又は複数である、配列番号２のバリアント、
（ｄ）配列番号３のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１５、Ｃ６２、Ｃ１４２、Ｃ４２０、Ｃ４２２のうちの一つ又は複数である、配列番号３のバリアント、
（ｅ）配列番号４のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１６、Ｃ６３、Ｃ１４３、Ｃ４２２、Ｃ４４４のうちの一つ又は複数である、配列番号４のバリアント、
（ｆ）配列番号５のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１９９、Ｃ３０２、Ｃ４１４、Ｃ３９４のうちの一つ又は複数である、配列番号５のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ２３、Ｃ１２３、Ｃ１２８、Ｃ１５０、Ｃ３１８、Ｃ４０５、Ｃ４２５のうちの一つ又は複数である、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１１９、Ｃ１２４、Ｃ１４６、Ｃ２０９、Ｃ４０７、Ｃ４２４のうちの一つ又は複数である、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１９９、Ｃ３０２、Ｃ４１４、Ｃ３９４のうちの一つ又は複数である、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１４、Ｃ１１１、Ｃ１３８、Ｃ１１６、Ｃ２４３、Ｃ３９６、Ｃ４１０、Ｃ４１６、Ｃ３４７のうちの一つ又は複数である、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１２５、Ｃ１２８、Ｃ４１２、Ｃ３１５のうちの一つ又は複数である、配列番号１１のバリアント、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号６のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、（ｉ）Ｃ３０８及び／又はＣ４１９と（ｉｉ）Ｃ１１４、Ｃ１１９、Ｃ１４１のうちの一つ又は複数との組み合わせである、配列番号６のバリアント、
（ｂ）配列番号１のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ３９、Ｃ１１２、Ｃ１１７、Ｃ４１７のうちの一つ又は複数である、配列番号１のバリアント、
（ｃ）配列番号２のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１１２、Ｃ１１７、Ｃ１３９、Ｃ２０２、Ｃ３０７、Ｃ３２７、Ｃ３４４、Ｃ３９５、Ｃ４１５のうちの一つ又は複数である、配列番号２のバリアント、
（ｄ）配列番号３のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１５、Ｃ６２、Ｃ１４２、Ｃ４２０、Ｃ４２２のうちの一つ又は複数である、配列番号３のバリアント、
（ｅ）配列番号４のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１６、Ｃ６３、Ｃ１４３、Ｃ４２２、Ｃ４４４のうちの一つ又は複数である、配列番号４のバリアント、
（ｆ）配列番号５のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１９９、Ｃ３０２、Ｃ４１４、Ｃ３９４のうちの一つ又は複数である、配列番号５のバリアント、
（ｇ）配列番号７のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ２３、Ｃ１２３、Ｃ１２８、Ｃ１５０、Ｃ３１８、Ｃ４０５、Ｃ４２５のうちの一つ又は複数である、配列番号７のバリアント、
（ｈ）配列番号８のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１１９、Ｃ１２４、Ｃ１４６、Ｃ２０９、Ｃ４０７、Ｃ４２４のうちの一つ又は複数である、配列番号８のバリアント、
（ｉ）配列番号９のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１９９、Ｃ３０２、Ｃ４１４、Ｃ３９４のうちの一つ又は複数である、配列番号９のバリアント、
（ｊ）配列番号１０のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１４、Ｃ１１１、Ｃ１３８、Ｃ１１６、Ｃ２４３、Ｃ３９６、Ｃ４１０、Ｃ４１６、Ｃ３４７のうちの一つ又は複数である、配列番号１０のバリアント、又は、
（ｋ）配列番号１１のバリアントであって、一つ又は複数の置換又は欠失された天然アミノ酸が、Ｃ１２５、Ｃ１２８、Ｃ４１２、Ｃ３１５のうちの一つ又は複数である、配列番号１１のバリアント、
を含むことを特徴とする請求項６に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項8】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、表面が負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性アミノ酸の置換又は修飾をさらに含み、前記置換は、正に帯電したアミノ酸または非荷電アミノ酸による負に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、又は極性又は非極性アミノ酸の置換である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項9】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号６のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、Ｓ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数である、配列番号６のバリアント、
（ｂ）配列番号７のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、Ｄ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数である、配列番号７のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び８～１１のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、配列番号６のＳ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数に対応するか、又は、配列番号７のＤ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１～５及び８～１１のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号６のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、Ｓ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数である、配列番号６のバリアント、
（ｂ）配列番号７のバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、Ｄ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数である、配列番号７のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び８～１１のいずれか一つのバリアントであって、一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸が、配列番号６のＳ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数に対応するか、又は、配列番号７のＤ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数に対応する、配列番号１～５及び８～１１のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項10】
前記非天然アミノ酸は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２′－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンから選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項11】
前記（Ｂ）において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、より大きな側鎖を含むアミノ酸で置換される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項12】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、
（ｂ）配列番号６のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、（ｉ）Ｈ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２と（ｉｉ）Ｐ９４、Ｆ１０３、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｓ２９３、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６のうちの少なくとも一つとの組み合わせである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つに対応するか、又は、配列番号６の（ｉ）Ｈ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２と（ｉｉ）Ｐ９４、Ｆ１０３、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｓ２９３、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６のうちの少なくとも一つとの組み合わせに対応する、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、
（ｂ）配列番号６のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、（ｉ）Ｈ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２と（ｉｉ）Ｐ９４、Ｆ１０３、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｓ２９３、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６のうちの少なくとも一つとの組み合わせである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つに対応するか、又は、配列番号６の（ｉ）Ｈ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２と（ｉｉ）Ｐ９４、Ｆ１０３、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｓ２９３、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６のうちの少なくとも一つとの組み合わせに対応する、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項13】
前記より大きな側鎖が、増加した数の炭素原子を含む、増加した長さを有する、増加した分子体積を有する、及び／又は増加したファンデルワールス体積を有する、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項14】
前記より大きな側鎖が、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合、（ｉｉｉ）カチオン-π相互作用、及び／又は（ｉｖ）π－π相互作用を増加させる、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項15】
より大きな側鎖のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）ではない、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項16】
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）又はグルタミン（Ｑ）、又は、（ｖ）アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）で置換され、
ｂ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換され、
ｃ）プロリン（Ｐ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）、又は、（ｖ）トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、
ｄ）フェニルアラニン（Ｆ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換され、
ｅ）アスパラギン酸（Ｄ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
ｆ）バリン（Ｖ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
ｇ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）で置換され、
ｈ）チロシン（Ｙ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換され、及び／又は、
ｉ）イソロイシン（Ｉ）が、（ｉ）フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｉ）バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）、（ｉｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換される、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ｂ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換され、
ｃ）プロリン（Ｐ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）、又は、（ｖ）トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）で置換され、
ｄ）フェニルアラニン（Ｆ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換され、
ｅ）アスパラギン酸（Ｄ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
ｆ）バリン（Ｖ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換され、
ｇ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）で置換され、
ｈ）チロシン（Ｙ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換され、及び／又は、
ｉ）イソロイシン（Ｉ）が、（ｉ）フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｉ）バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）、（ｉｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換される、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項17】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、且つ、Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙを含む、及び／又は、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、Ｐ９４Ｗ、Ｐ９４Ｆ、Ｆ１０３Ｗ、Ｉ２８２Ｆ、Ｖ１５５Ｌ、Ｖ１５５Ｉ、Ｄ１２６Ｈ、Ｄ１２６Ｎ、Ｄ１２６Ｑ、Ｐ１５７Ｗ、Ｐ１５７Ｆ、Ｐ１５７Ｌ、Ｖ４２２Ｙ、Ｖ４２２Ｒ、Ｖ４２２Ｈ、Ｖ４２２Ｗ、Ｓ２９３Ｒ、Ｓ２９３Ｎ、Ｓ２９３Ｑ、Ｈ８７Ｒ、Ｈ８７Ｙ、Ｈ８７Ｎ、Ｈ８７Ｑ、Ｎ９３Ｑ、Ｎ９３Ｒ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｈ、Ｈ４０３Ｙ、Ｈ４０３Ｒ、Ｈ４０３Ｑ、Ｆ２４６Ｒ、Ｆ２４６Ｙ、又はＦ２４６Ｑを含む、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、Ｐ９４Ｗ、Ｐ９４Ｆ、Ｆ１０３Ｗ、Ｉ２８２Ｆ、Ｖ１５５Ｌ、Ｖ１５５Ｉ、Ｄ１２６Ｈ、Ｄ１２６Ｎ、Ｄ１２６Ｑ、Ｐ１５７Ｗ、Ｐ１５７Ｆ、Ｐ１５７Ｌ、Ｖ４２２Ｙ、Ｖ４２２Ｒ、Ｖ４２２Ｈ、Ｖ４２２Ｗ、Ｓ２９３Ｒ、Ｓ２９３Ｎ、Ｓ２９３Ｑ、Ｈ８７Ｒ、Ｈ８７Ｙ、Ｈ８７Ｎ、Ｈ８７Ｑ、Ｎ９３Ｑ、Ｎ９３Ｒ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｈ、Ｈ４０３Ｙ、Ｈ４０３Ｒ、Ｈ４０３Ｑ、Ｆ２４６Ｒ、Ｆ２４６Ｙ、又はＦ２４６Ｑを含む、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項18】
前記（Ｂ）において、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項19】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、
（ｂ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｋ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８、Ｅ２８０、Ｋ２９０又はＫ２４９のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸であるか、又は、配列番号６のＫ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８、Ｅ２８０、Ｋ２９０又はＫ２４９に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号１１のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、
（ｂ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｋ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８、Ｅ２８０、Ｋ２９０又はＫ２４９のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｃ）配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸であるか、又は、配列番号６のＫ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８、Ｅ２８０、Ｋ２９０又はＫ２４９に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項１８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項20】
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）、又は、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）で置換され、
ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）、又は、（ｖ）アスパラギン（Ｎ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換され、
ｃ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換され、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換され、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され、及び/又は、
ｆ）アルギニン（Ｒ）が、（ｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）又はグルタミン（Ｑ）で置換される、
ことを特徴とする請求項１９に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）、又は、（ｖ）アスパラギン（Ｎ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換され、
ｃ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換され、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換され、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され、及び/又は、
ｆ）アルギニン（Ｒ）が、（ｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）又はグルタミン（Ｑ）で置換される、
ことを特徴とする請求項１９に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項21】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、且つ、（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、又は、（ｋ）Ｋ３９３Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙのうちの一つ又は複数を含み、又は、
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、（ａ）Ｋ９１Ｒ、（ｂ）Ｔ８５Ｎ、Ｔ８５Ｑ又はＴ８５Ｒ、（ｃ）Ｒ８８Ｎ又はＲ８８Ｑ、（ｄ）Ｈ６９Ｎ、Ｈ６９Ｑ又はＨ６９Ｒ、（ｅ）Ｋ４０４Ｒ、（ｆ）Ｔ４０１Ｎ、Ｔ４０１Ｈ、Ｔ４０１Ｋ又はＴ４０１Ｒ、（ｇ）Ｎ２９９Ｑ、Ｎ２９９Ｒ、Ｎ２９９Ｈ又はＮ２９９Ｋ、（ｈ）Ｎ２４８Ｑ、Ｎ２４８Ｒ、Ｎ２４８Ｈ又はＮ２４８Ｋ、又は、（ｉ）Ｋ２４９Ｒ、Ｋ２４９Ｑ又はＫ２４９Ｎのうちの一つ又は複数を含む、
ことを特徴とする請求項１８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、（ａ）Ｋ９１Ｒ、（ｂ）Ｔ８５Ｎ、Ｔ８５Ｑ又はＴ８５Ｒ、（ｃ）Ｒ８８Ｎ又はＲ８８Ｑ、（ｄ）Ｈ６９Ｎ、Ｈ６９Ｑ又はＨ６９Ｒ、（ｅ）Ｋ４０４Ｒ、（ｆ）Ｔ４０１Ｎ、Ｔ４０１Ｈ、Ｔ４０１Ｋ又はＴ４０１Ｒ、（ｇ）Ｎ２９９Ｑ、Ｎ２９９Ｒ、Ｎ２９９Ｈ又はＮ２９９Ｋ、（ｈ）Ｎ２４８Ｑ、Ｎ２４８Ｒ、Ｎ２４８Ｈ又はＮ２４８Ｋ、又は、（ｉ）Ｋ２４９Ｒ、Ｋ２４９Ｑ又はＫ２４９Ｎのうちの一つ又は複数を含む、
ことを特徴とする請求項１８に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項22】
前記（Ｂ）において、二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換される、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項23】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｍ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号６のＭ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項２２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｍ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号６のＭ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアント、
を含むことを特徴とする請求項２２に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項24】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、（ａ）Ｍ８１Ｋ、Ｍ８１Ｒ又はＭ８１Ｈ、（ｂ）Ｖ５９Ｋ、Ｖ５９Ｒ又はＶ５９Ｈ、（ｃ）Ｑ５２Ｋ、Ｑ５２Ｒ又はＱ５２Ｈ、（ｄ）Ｅ２８６Ｋ、Ｅ２８６Ｒ又はＥ２８６Ｈ、又は、（ｅ）Ｋ２９０のうちの一つ又は複数を含む、
ことを特徴とする請求項２３に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項２３に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項25】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、且つ、Ｔ８５Ｎ、Ｈ８７Ｙ、Ｈ８７Ｑ、Ｈ８７Ｎ、Ｒ８８Ｑ、Ｒ８８Ｎ、Ｖ１５５Ｉ、Ｖ１５５Ｌ、Ｋ９１Ｒ、Ｆ１０３Ｗ、Ｓ２３９Ｎ、Ｆ２４６Ｒ、Ｆ２４６Ｙ、Ｋ２４９Ｒ、Ｉ２８２Ｆ、Ｅ２８６Ｋ又はＶ４２２Ｈのアミノ酸の置換の一つ又は複数を含む、
ことを特徴とする請求項１１、１８～２４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
ことを特徴とする請求項１１、１８～２４のいずれか一項に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項26】
前記ヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、
（ａ）配列番号１１のバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１上の一つ又は複数の置換を含み、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１に対応する少なくとも一つの置換を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
（ａ）配列番号１１のバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１上の一つ又は複数の置換を含み、又は、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントにおいて、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが、（ａ）Ｅ１９６（ｂ）Ｗ２０２（ｃ）Ｎ１９９又は（ｄ）Ｇ２０１に対応する少なくとも一つの置換を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項27】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、且つ、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、又は、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、
の位置での置換を含むことを特徴とする請求項２６に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋを含む、Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、
Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆを含む、Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、
Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、
Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、又は、
Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌを含む、Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、
の位置での置換を含むことを特徴とする請求項２６に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ。
【請求項28】
請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼを少なくとも一つ含むことを特徴とする、構造体。
【請求項29】
前記構造体は、ポリヌクレオチド結合部をさらに含む、
ことを特徴とする請求項２８に記載の構造体。
ことを特徴とする請求項２８に記載の構造体。
【請求項30】
請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼをコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項31】
請求項３０に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項32】
請求項３０に記載の核酸を含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項33】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、
請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は請求項２８に記載の構造体を、ポリヌクレオチドに接触させる、
ことを特徴とするポリヌクレオチドの移動を制御する方法。
請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は請求項２８に記載の構造体を、ポリヌクレオチドに接触させる、
ことを特徴とするポリヌクレオチドの移動を制御する方法。
【請求項34】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
Ｉ）請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は請求項２８に記載の構造体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構造体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること、
を含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法。
Ｉ）請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は請求項２８に記載の構造体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構造体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること、
を含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法。
【請求項35】
前記ヘリカーゼ又は構造体にまたがって、標的ポリヌクレオチドと接触するポアに電位差を印加する工程をさらに含み、
前記ポアが、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される、
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
前記ポアが、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される、
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記標的ポリヌクレオチドが、一本鎖、二本鎖、又は少なくとも一部が二本鎖である、
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記一つ又は複数の特徴は、標的ポリヌクレオチドの由来、長さ、同一性、配列、二次構造、又は標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択され、
前記一つ又は複数の特徴が、電気的測定及び／又は光学的測定によって測定される、
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
前記一つ又は複数の特徴が、電気的測定及び／又は光学的測定によって測定される、
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品であって、
前記項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２８に記載の構造体、請求項３０に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、又は請求項３２に記載の宿主細胞、及び
ポア、
を含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品。
前記項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２８に記載の構造体、請求項３０に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、又は請求項３２に記載の宿主細胞、及び
ポア、
を含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品。
【請求項39】
前記製品は、キット、装置、又はセンサから選択される、
ことを特徴とする請求項３８に記載の製品。
ことを特徴とする請求項３８に記載の製品。
【請求項40】
標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における、請求項１に記載のＰｉｆ１様ヘリカーゼ、請求項２８に記載の構造体、請求項３０に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、又は請求項３２に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子シークエンシング、分子検出及び臨床検出の技術分野に関し、具体的に修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｐｉｆ１－ｌｉｋｅ Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ）、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを含む構築体、及び標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ナノポアシークエンシング技術とは、単一核酸分子を測定ユニットとし、ナノポアを利用してその配列情報をリアルタイムに連続的に読み取る遺伝子シークエンシング技術を指す。
【0003】
ナノポアシークエンシング技術は、イオン電流にチャネルを提供できるナノポアを利用する。電気泳動は、ポリヌクレオチドがナノポアを通過するように駆動し、ポリヌクレオチドがナノポアを通過するため、ナノポアを通過する電流を低減することができる。通過する各ヌクレオチド又は一連のヌクレオチドによって特徴電流が取得され、電流レベルの記録はポリヌクレオチド配列に対応する。「ストランドシークエンシング（ｓｔｒａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」方法（例えば、ヘリカーゼを使用してポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御する）において、単一ポリヌクレオチド鎖が前記ポアを通過して、ヌクレオチドの同定を可能にする。このようなシークエンシング技術の利点とは、ライブラリの構築が簡単で、増幅する必要がないこと、読み取り速度が速く、単一分子で一時間当たり数万塩基の読み取り速度に達することができること、読み取り長さが非常に長く、一般的に数千塩基であること、ＲＮＡ及びＤＮＡのメチル化を直接測定することが可能であることである。これらは、従来の第２世代シークエンシング技術の範囲を超えている。
【0004】
しかしながら、ナノポアシークエンシング技術にも解決すべき課題がある。例えば、ポリヌクレオチドは、ナノポアを介した転座が速すぎ、単一ヌクレオチドの電流レベルが短すぎて区別しにくい。特に、ヌクレオチド配列が非常に長い場合、例えば５００個以上であり、ポリヌクレオチドの移動を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離脱する可能性がある。これにより、ポリヌクレオチドを迅速に、制御されていない方法で、印加されたフィールドの方向に前記ポアを通して引っ張ることができる。
【0005】
従来技術において、この問題を解決するために、例えば、国際公開第２０１３／０５７４９５Ａ３号には、標的ポリヌクレオチドを特徴づける新規な方法が開示されており、前記方法は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ又は分子モーターによってポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することを含む。特許 ＵＳ２０１５００６５３５４Ａ１には、ＸＰＤヘリカーゼを用いて標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法が開示され、前記方法は、ＸＰＤヘリカーゼによってポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することを含む。特許 ＣＮ１０７１０９３８０Ａには、修飾された酵素が開示され、当該酵素は、ポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御できる修飾されたＤｄａヘリカーゼである。上記方法は、いずれもある程度でポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御することができる。しかしながら、依然としてポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御する新規なヘリカーゼを開発する必要がある。
【0006】
また、ヘリカーゼが核酸の移動を持続的且つ均一に制御する能力は、核酸の配列情報を正確に識別するのに重要な役割を果たしている。ナノポアを通過する核酸の移動を制御するヘリカーゼにおいて、ナノポアシークエンシング技術が単一分子シークエンシング技術であるため、酵素が核酸に結合し続けるという必須の特徴に加えて、異なる核酸分子上の酵素の移動速度の均一性、及び同一核酸分子の異なる塩基上の酵素の移動速度の均一性は、塩基信号を正確に識別することにも非常に重要である。具体的に、酵素が異なる核酸分子を制御する移動速度は、異なる酵素分子の異質性のために異なる酵素が核酸のナノポアへの通過を制御する速度が異なる場合があるか、又はある酵素の低い活性のために核酸のナノポアへの通過を制御する際に停滞現象が発生され、これにより塩基信号の分析や塩基配列の識別に不利になるか、ポアチャネルの効率的な利用に不利になるため、シークエンシングの正確性又はスループットが低下される。同一核酸分子上の酵素の変位は、例えば、個別又は連続的な複数の塩基が電界力の作用下で酵素の制御から逸脱して「滑り出す」こと、酵素の一貫性のないスタッフサイズのためにステップごとに半分又は複数の塩基が長くなること、又は酵素が核酸に対して一つ又は複数のスタッフサイズで前に変位した後、後に変位することなどのようなシークエンシングの性能に不利な現象を含むが、これらに限定されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、異なる酵素分子間の均一性を向上させ、単一酵素分子が核酸のナノポアの通過のための移動を効果的に制御することは、ナノポアシークエンシング技術の性能の向上に非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、ナノポアを通過するポリヌクレオチドの速すぎる転座の問題を解決するために、新規な修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドとの結合をより長い時間で保持することができ、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することができる。
【0009】
本発明の第１態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、その特徴とは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、（Ａ）少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失であって、置換又は欠失された天然アミノ酸が、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９に対応するアミノ酸を含む、少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失、及び／又は、（Ｂ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換であって、置換されたアミノ酸が、配列番号６のＨ８７及び／又はＶ４２２及び／又はＩ２８２に対応するアミノ酸を含む、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、をさらに含み、ここで、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ストランドシークエンシングプロセスにおいてポリヌクレオチドの移動を制御する有用なツールであり、制御可能且つ段階的な方式で、印加電圧によって引き起こされる電界に沿って又はそれに逆らって、ポリヌクレオチドを移動させ、これによりナノポアを通過するポリヌクレオチドの速度を制御し、識別可能な電流レベルを取得することができる。特に、ポリヌクレオチド鎖の長さが増加する場合、例えば、５００個以上のヌクレオチドである場合、プロセシビティを向上させる分子モーターを有する必要があると、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは依然としてポリヌクレオチドから離脱せず、即ち、５００、１０００、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００又はその以上のポリヌクレオチドの移動の制御に対して特に効果的である。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、ストランドシークエンシング領域においてポリヌクレオチドのポアからの滑らかな移動を制御し、摺動移動又は不規則な移動を減少させ、これにより、ヌクレオチドのより正確な読み取り及びより長い読み取り長さを促進することができる。本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼによれば、酵素が核酸に結合し続けることを維持すると同時に、酵素分子が核酸分子のナノポアへの通過の移動を制御することを効果的に向上させるため、核酸の検出又はシークエンシングの正確度及びスループットなどの性能を向上させる。
【0011】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ活性を試験する蛍光分析概略図である。ここで、蛍光基質鎖は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基をハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。ａ）に示すように、主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（Ｅ）を有し、ハイブリダイズした相補鎖（Ｄ）が５’端にカルボキシフルオレセイン（Ｃ）を有することが含まれる。さらに、蛍光基質の短鎖（Ｄ）と相補的な０．５μＭの捕捉鎖（Ｆ）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、前記基質に添加されたヘリカーゼ（２００ｎＭ）が前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、且つ前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして初期基質と損失蛍光との再アニーリングを防止する。ｃ）に示すように、主鎖と完全に相補的な捕捉鎖（Ａ）を過剰に添加した後、巻き戻されない一部のｄｓＤＮＡは過剰のＡの存在により鎖の巻き戻し効果を有し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
【図2】蛍光分析によるＰｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力の測定を示し、具体的には、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液の時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す。
【図3】異なるＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力のゲル測定結果を示す。レーン１は、予め構築されたｄｓＤＮＡ（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９のハイブリダイゼーション）である。レーン２～６は、それぞれ、ｄｓＤＮＡに予め連結されたＡｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５及びＭｐｈ ＭＰ１を含む。レーン７～１１は、それぞれ、ｄｓＤＮＡに予め連結されたＡｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ及びＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを含む。バンドＡは、配列番号１８とハイブリダイズする配列番号１９に対応する。１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａと標識された領域は、それぞれ、１、２、３、４、５個のヘリカーゼと、配列番号１８とハイブリダイズする配列番号１９との結合に対応する。
【図4】実施例で使用されるＤＮＡ構築体の図であり、ここで、配列番号１３（Ｂと標識される）は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され（Ａと標識される）、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され（Ｃと標識される）、当該スペーサー（Ｃと標識される）は、配列番号１４（Ｄと標識される）の５’末端に連結され、当該配列番号１４（Ｄと標識される）の３’末端が配列番号１７又は配列番号２４（Ｅと標識される）に連結され、当該構築体の配列番号１５（Ｆと標識される）領域が配列番号１６（Ｇと標識され、３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。
【図5】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（変異Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを有する配列番号１１））がナノポア８ＭｓｐＡ（配列番号１２）を通過するＤＮＡ構築体Ａの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ、０～２５０）、ｘ軸座標＝サンプリング周波数（ｈｚ、０～３．５＊１０５））を示す。
【図6】図５の電流軌跡図に示すＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の領域拡大図（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ、３０～１００）、ｘ軸座標＝サンプリング周波数（ｈｚ、２．３４６～２．３６６＊１０５））を示す。
【図7】Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａの突然変異を有する配列番号５）がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図8】ヘリカーゼ（ＥｐＨ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａの突然変異を有する配列番号６））がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図9】ヘリカーゼ（Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａの突然変異を有する配列番号８））がＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ構築体Ｂの転座を制御する場合の例示的な電流の軌跡（ｙ軸座標＝電流（ｐＡ）、ｘ軸座標＝時間（ｓ））を示す。
【図10】精製されたＭｐｈ ＭＰ１（配列番号１１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。ここで、Ｍは、マーカー（Ｋｄ）であり、レーン１は、Ｍｐｈ ＭＰ１ヘリカーゼの電気泳動結果図である。
【図11A】配列番号１～１１のアミノ酸配列の対応関係を示す。
【図11B】配列番号１～１１のアミノ酸配列の対応関係を示す。
【図12】突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ａ図）及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ｂ図）により制御される核酸ライブラリーのナノポアへの通過の速度分布を示す。
【図13】Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄの突然変異を有する配列番号６）とＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗの突然変異を有する配列番号６）により制御される核酸のナノポアへの通過の移動を示す。ここで、Ａ図は、シミュレーションされた配列番号２４の核酸配列が一つずつナノポアを通過する移動により生成された電流信号の特徴である。Ｂ図は、配列番号２４の核酸配列のナノポアへの通過の移動を制御する突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗにより生成された電流の特徴である。Ｃ図は、配列番号２４の核酸配列のナノポアへの通過の移動を制御するＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄにより生成された電流信号の特徴である。
【図14】突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５に対してシークエンシングする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム及びヒトゲノム（ｈｕｍａｎ）がランダムに断片化されたライブラリー配列の検証セットの正確度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の第１態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、その特徴とは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメインへ導入された少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、（Ａ）少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失であって、置換又は欠失された天然アミノ酸が、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９に対応するアミノ酸を含む、少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失、及び／又は、（Ｂ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換であって、置換されたアミノ酸が、配列番号６のＨ８７及び／又はＶ４２２及び／又はＩ２８２に対応するアミノ酸を含む、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、をさらに含み、ここで、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。
【0014】
具体的に、配列番号１～１１のＰｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン及び／又は１Ａドメイン（ＲｅｃＡ型モータ）へ導入されたの少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸を含み、（Ａ）少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失であって、置換又は欠失された天然アミノ酸が、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９、又は、配列番号６のＣ３０８及び／又はＣ４１９に対応する配列番号１～５及び７～１１のアミノ酸を含む、少なくとも一つ又は複数の天然アミノ酸の置換又は欠失、及び／又は、（Ｂ）一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換であって、置換されたアミノ酸が、配列番号６のＨ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２、又は、配列番号６のＨ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２に対応する配列番号１～５及び７～１１のアミノ酸を含む、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換、をさらに含み、ここで、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、リヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。
【0015】
好ましくは、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、下記からなる群から選択される任意のものに導入される。
（ａ）タワードメイン、
（ｂ）ピンドメイン、
（ｃ）１Ａドメイン、
（ｄ）タワードメイン及びピンドメイン、
（ｅ）タワードメイン及び１Ａドメイン、
（ｆ）１Ａドメイン及びピンドメイン、
（ｇ）タワードメイン、ピンドメイン及び１Ａドメイン。
（ａ）タワードメイン、
（ｂ）ピンドメイン、
（ｃ）１Ａドメイン、
（ｄ）タワードメイン及びピンドメイン、
（ｅ）タワードメイン及び１Ａドメイン、
（ｆ）１Ａドメイン及びピンドメイン、
（ｇ）タワードメイン、ピンドメイン及び１Ａドメイン。
【0016】
好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はその以上のシステイン残基、又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はその以上の非天然アミノ酸、又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はその以上のシステイン残基及び非天然アミノ酸が、タワードメイン、ピン構造及び／又は１Ａドメインに導入され得る。
【0017】
好ましくは、システイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が導入された後、当該Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチドの結合がより安定し、その移動を制御する能力が向上される。
【0018】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、Ｐｂａ－ＰＭ２、Ａｐｈ－Ａｃｊ６１、Ａｐｈ－ＰＸ２９、Ａｖｉ－Ａｅｈ１、Ｓｐｈ－ＣＢＨ８、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６、Ａｐｈ－ＡＭ１０１、ＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５、Ｅｐｈ－ＥｃＳ１、Ｅｐｈ－Ｃｒｏｎｕｓ２、又はＭｐｈ－ＭＰ１から選択される。具体的に、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、表１に示す通りである。
【0019】
【表1】
【0020】
前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのタワードメイン、ピンドメイン、フックドメイン、１Ａドメイン及び２Ａドメインのアミノ酸残基の位置は、表２に示す通りである。
【0021】
【表2-1】
【0022】
【表2-2】
【0023】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、Ｍｐｈ－ＭＰ１、Ｓｐｈ－ＣＢＨ８、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６又はＰｐｈＰｓｐＹＺＵ０５から選択される。
【0024】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ｐ３８９）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９７－Ａ１１３）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９６及びＰ１１４－Ｋ１８４）に導入されている。
【0025】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６４－Ｐ２７８及びＮ２９６－Ａ３９４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ｅ１０５）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＭ１０６－Ｖ１８１）に導入されている。
【0026】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号２のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６５－Ｐ２７９及びＮ２９７－Ａ３９２）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ｄ１０５）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＩ１０６－Ｍ１８０）に導入されている。
【0027】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号３のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０３）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ａ１０９）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２）に導入されている。
【0028】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号４のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ｓ４０４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８９－Ａ１０９）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８８及びＫ１１０－Ｖ１８２）に導入されている。
【0029】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号５のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８６－Ｅ１０２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８４及びＭ１０３－Ｋ１７７）に導入されている。
【0030】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６６－Ｐ２８０及びＮ２９８－Ａ３９６）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９１－Ｅ１０７）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９０及びＭ１０８－Ｍ１８３）に導入されている。
【0031】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号７のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｔ２７６－Ｐ２９０及びＮ３０８－Ｐ４０２）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ１００－Ｄ１１６）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９９及びＤ１１７－Ｍ１９１）に導入されている。
【0032】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号８のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｄ２７４－Ｐ２８８及びＮ３０６－Ａ４０４）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ９５－Ｅ１１２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ９５及びＩ１１３－Ｋ１８７）に導入されている。
【0033】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号９のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６０－Ｐ２７４及びＮ２９２－Ａ３９１）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８６－Ｅ１０２）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８５及びＭ１０３－Ｋ１７７）に導入されている。
【0034】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１０のバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのシステイン残基及び／又は少なくとも一つの非天然アミノ酸が、タワードメイン（残基 Ｅ２６５－Ｐ２７９及びＨ２９７－Ａ３９３）及び／又はピンドメイン（残基 Ｋ８８－Ｅ１０４）及び／又は１Ａドメイン（残基 Ｍ１－Ｌ８７及びＩ１０５－Ｋ１８０）に導入されている。
【0035】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは配列番号１１のバリアントを含み、それは、（ｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｉｉｉ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｖ）Ｆ１０８Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｖｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＭ３５６Ｃ、（ｘｖｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６０Ｃ、（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｉｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＱ３６３Ｃ、（ｘｘ）Ｋ１３４Ｃ及び／又はＫ３６６Ｃ、（ｘｘｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＧ３５９Ｃ、（ｘｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ、（ｘｘｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｉｖ）（ｉ）～（ｘｘ）のいずれか一つ及びＱ１１１Ｃ及びＩ１３８Ｃ、（ｘｘｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＦ３７７Ｃ、（ｘｘｖｉ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｙ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｃ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｖｉｉ）Ｅ１０５Ｙ及びＡ３６２Ｃ、（ｘｘｖｉｉｉ）Ａ３６２Ｃ、（ｘｘｉｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ、Ｎ３５２Ｎ、Ａ３６２Ｙ及びＹ３６５Ｎ、（ｘｘｘ）Ｙ１０３Ｌ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｘｘｘｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、及びＩ２８０Ａ、（ｘｘｘｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＬ３５８Ｃ、（ｘｘｘｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＧ３５９Ｃ、（ｘｘｘｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＡ３６２Ｃ、（ｘｘｘｖ）Ｋ１０６Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉ）Ｔ１０２Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｘｘｉｘ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｘｌｉｉｉ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｘｌｉｖ）Ｅ１０４Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｘｌｖ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＹ３５５Ｃ、（ｘｌｖｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＮ３８２Ｃ、（ｘｌｖｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３８１Ｃ、（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＫ３７９Ｃ、（ｘｌｉｘ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＤ３７６Ｃ、（ｌ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７８Ｃ、（ｌｉ）Ｅ１０５Ｃ及び／又はＷ３７４Ｃ、（ｌｉｉ）Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｙ、（ｌｉｉｉ）Ｅ１０５Ｃ、Ｇ３５９及びＡ３６２Ｃ、又は（ｌｉｖ）Ｉ２Ｃ、Ｅ１０５Ｃ及びＡ３６２Ｃを含む。
【0036】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、それは、配列番号１１の（ｉ）～（ｌｉｖ）のいずれか一つで限定される位置に対応する位置にシステイン残基を含む。
【0037】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列であるか、又は、配列番号１～１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．９％の相同性を有し、且つ、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
【0038】
本発明の一つの具体的な実施形態において、システイン残基は、配列番号１１の１０５位及び／又は３６２位に対応するアミノ酸、例えば、配列番号２の９７位及び／又は３６３位、配列番号３の９６位及び／又は３７１位、配列番号５の９４位及び／又は３６１位、配列番号６の９９位及び／又は３６６位、配列番号８の１０４位及び／又は３７５位などに導入されている。
【0039】
本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチドの結合の安定性を向上させ、ポリヌクレオチドからの離脱の能力を低下させるために、導入されたシステイン同士が互いに連結させ、導入された非天然アミノ酸同士が互いに連結させ、導入されたシステインと非天然アミノ酸とが互いに連結させ、導入されたシステインとヘリカーゼ上に天然アミノ酸とを互いに連結させ、又は導入された非天然アミノ酸とヘリカーゼ上に天然アミノ酸とを互いに連結させる。
【0040】
任意の数及び組み合わせの二つ以上の導入されたシステイン及び／又は非天然アミノ酸を互いに連結させることができる。例えば、３、４、５、６、７、８又はその以上のシステイン及び／又は非天然アミノ酸を互いに連結させることができる。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数のシステインに連結されてもよい。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）に連結されてもよい。一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）は、一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）に連結されてもよい。一つ又は複数のシステインは、一つ又は複数のヘリカーゼ上の天然アミノ酸に連結されてもよい。一つ又は複数の非天然アミノ酸（例えば、Ｆａｚ）は、一つ又は複数のヘリカーゼ上の天然アミノ酸に連結されてもよい。
【0041】
ここで、前記連結はいかなる形態であってもよく、直接連結又は間接連結を含む。好ましくは、前記連結は、一時的な接触であってもよく、永久連結であってもよい。さらに好ましくは、前記連結は、非共有連結又は共有連結であってもよい。
【0042】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記共有連結は、化学的架橋剤、線状分子又は触媒を用いて実現することができる。前記化学的架橋剤は、マレイミド、活性エステル、コハク酸イミド、アジド、アルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチンオール（ＤＩＢＯ又はＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルキン及び線状アルキン）などを含むが、これらに限定されない。化学的架橋剤の長さは一つの炭素（ホスゲンタイプのリンカー）から数オングストロームまで変化できる。前記線状分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和及び不飽和の炭化水素、ポリアミドを含むが、これらに限定されない。前記触媒は、任意のシステイン残基間、非天然アミノ酸間、システイン残基と非天然アミノ酸の間、非天然アミノ酸と天然アミノ酸の間、又はシステイン残基と天然アミノ酸との間に共有結合を生成させるＴＭＡＤなどのような触媒を含むが、これらに限定されない。
【0043】
好ましくは、（Ａ）において、前記天然アミノ酸は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸又は荷電したアミノ酸で置換され、好ましくは、前記非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）又はバリン（Ｖ）を含むが、これらに限定されず、前記極性アミノ酸は、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）を含むが、これらに限定されず、前記荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）を含むが、これらに限定されない。
【0044】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼはさらに修飾されて、一つ又は複数のシステイン残基が欠失される。
【0045】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、少なくとも一つ又は複数の天然システインの置換をさらに含む。さらに好ましくは、システインは、アラニン（Ａ）、グリシン、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はバリン（Ｖ）で置換される。
【0046】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含み、前記一つ又は複数の置換された天然システイン残基は、（ｉ）Ｃ３０８及び／又はＣ４１９と（ｉｉ）Ｃ１１４、Ｃ１１９、Ｃ１４１のうちの一つ又は複数との組み合わせである。
【0047】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか一つのバリアントを含み、前記一つ又は複数の置換された天然システイン残基は表３に示す通りである。
【0048】
【表3】
【0049】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼはさらに修飾されて、その表面の負電荷が低減される。
【0050】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、正味の正電荷を増加させる置換をさらに含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、表面が負に帯電したアミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の置換又は修飾を含み、又は、正に帯電したアミノ酸を、表面が負に帯電したアミノ酸、或いは極性又は非極性のアミノ酸の近くの位置に導入することを含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、正に帯電したアミノ酸による負に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の置換を含む。さらに好ましくは、前記正味の正電荷を増加させる置換は、非荷電アミノ酸による負に帯電したアミノ酸、芳香族アミノ酸、極性又は非極性のアミノ酸の置換を含む。適切な正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）を含むが、これらに限定されない。適切な非荷電アミノ酸は、正味電荷を有さない。適切な非荷電アミノ酸は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）を含むが、これらに限定されない。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）を含むが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。適切な芳香族アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【0051】
ここで、前記正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、極性アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸であってもよく、人工的に合成又は修飾された天然アミノ酸であってもよい。
【0052】
好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換と、リジン（Ｋ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換、アスパラギン（Ｎ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換、リジン（Ｋ）によるアスパラギン酸（Ｄ）の置換、及びアルギニン（Ｒ）によるアスパラギン酸（Ｄ）の置換を含むが、これらに限定されない。
【0053】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸は、Ｓ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数である。
【0054】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号７のバリアントを含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸は、Ｄ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数である。任意の数のこれらのアミノ酸を中和することができ、例えばこれらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、７又は８個を中和することができる。
【0055】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～５及び８～１１のいずれか一つのバリアントを含み、前記一つ又は複数の負に帯電したアミノ酸又は非荷電アミノ酸は、配列番号６のＳ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８のうちの一つ又は複数に対応するか、又は、配列番号７のＤ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６のうちの一つ又は複数に対応する。配列番号６のＳ９、Ｓ１７３、Ｄ２０８又はＴ２１８に対応する配列番号１～５及び８～１１のアミノ酸、又は、配列番号７のＤ８、Ｅ１１、Ｔ２６、Ｓ１８６、Ｄ２１６又はＳ２２６に対応する配列番号１～５及び８～１１のアミノ酸は、図１１の比較を用いて決定することができる。
【0056】
好ましくは、前記非天然アミノ酸は、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２′－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ、３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンから選択される。
【0057】
さらに好ましくは、（Ｂ）において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換される。
【0058】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換されることを含む。任意の数のアミノ酸、例えば、１個又はその以上、２個又はその以上、３個又はその以上、４個又はその以上、５個又はその以上、又は６個又はその以上のアミノ酸を置換することができる。各アミノ酸は、塩基、糖環、又は塩基及び糖環と相互作用することができる。タンパク質モデリングを使用して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用するアミノ酸を同定することができる。
【0059】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、（ａ）配列番号１１のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｐ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００のうちの少なくとも一つである、配列番号１１のバリアント、又は、（ｂ）配列番号６のバリアントであって、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、（ｉ）Ｈ８７、Ｖ４２２及び／又はＩ２８２と（ｉｉ）Ｐ９４、Ｆ１０３、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｓ２９３、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６のうちの少なくとも一つとの組み合わせである、配列番号６のバリアント、を含む。これらの番号は、配列番号１１及び６の関連位置に対応し、配列番号１１及び６に比べて、一つ又は複数のアミノ酸がバリアントに挿入又は欠失された状況下で変更する必要がある場合がある。前述のように、当業者は、バリアントの相応位置を確認することができる。さらに好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の中一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｆ１０９及び一つ又は複数のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００である。
【0060】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントであり、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００に対応する少なくとも一つのアミノ酸であるか、又は、配列番号６のＰ９４、Ｆ１０３、Ｉ２８２、Ｖ１５５、Ｐ６７、Ｍ１２４、Ｄ１２６、Ｅ１５６、Ｐ１５７、Ｅ２７９、Ｖ４２２、Ｓ２９３、Ｈ８７、Ｎ９３、Ｈ４０３又はＦ２４６に対応する少なくとも一つのアミノ酸である。さらに好ましくは、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントを含み、ここで、前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドの糖環及び／又は塩基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＦ１０９に対応するアミノ酸及び配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４又はＰ１００に対応する一つ又は複数のアミノ酸である。
【0061】
表４には、配列番号１１のＰ７３、Ｈ９３、Ｎ９９、Ｆ１０９、Ｉ２８０、Ａ１６１、Ｆ１３０、Ｄ１３２、Ｄ１６２、Ｄ１６３、Ｅ２７７、Ｋ４１５、Ｑ２９１、Ｈ３９６、Ｙ２４４、Ｐ１００に対応する配列番号１～１０のアミノ酸が示されている。
【0062】
【表4】
【0063】
より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは、（ａ）増加した数の炭素原子数を含む（ｂ）増加した長さを有する、（ｃ）増加した分子体積を有する、及び／又は、（ｄ）増加したファンデルワールス体積を有する。より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「（ａ）及び（ｂ）」、「（ａ）及び（ｃ）」、「（ａ）及び（ｄ）」、「（ｂ）及び（ｃ）」、「（ｂ）及び（ｄ）」、「（ｃ）及び（ｄ）」、「（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）」、「（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）」、「（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）」、「（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）」、又は、「（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）」である。（ａ）から（ｄ）のそれぞれは、本技術分野の標準的な方法によって測定することができる。
【0064】
さらに好ましくは、前記より大きな側鎖（Ｒ基）は、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ内の一つ又は複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合、（ｉｉｉ）カチオン－π（カチオン－ｐｉ）相互作用、及び／又は、（ｉｖ）π－π相互作用を増加させる。例えば、（ｉ）において、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）及びリジン（Ｋ）などの正に帯電したアミノ酸は、静電相互作用を増加させるＲ基を有する。例えば、（ｉｉ）において、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）及びヒスチジン（Ｈ）などのアミノ酸は、水素結合を増加させるＲ基を有する。例えば、（ｉｉｉ）において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）などの芳香族アミノ酸は、カチオン-π（カチオン－ｐｉ）相互作用を増加させるＲ基を有する。
【0065】
より大きな側鎖（Ｒ）を含むアミノ酸は、非天然アミノ酸であってもよい。
【0066】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記より大きな側鎖（Ｒ基）のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）ではない。
【0067】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、以下の置換の一つ又は複数を含む。
【0068】
ａ）ヒスチジン（Ｈ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）又はグルタミン（Ｑ）、又は、（ｖ）アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）で置換されることが好ましい。ヒスチジン（Ｈ）は、（ｉｖ）Ｙ、Ｒ又はＱ、又は、（ｖ）Ｒ、Ｙ、Ｎ又はＱで置換されることがより好ましい。
【0069】
ｂ）アスパラギン（Ｎ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換されることが好ましい。アスパラギン（Ｎ）は、Ｑ、Ｒ、Ｈ又はＫで置換されることがより好ましい。
【0070】
ｃ）プロリン（Ｐ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）、又は、（ｖ）トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。プロリン（Ｐ）は、Ｗ、Ｆ又はＬで置換されることがより好ましい。
【0071】
ｄ）バリン（Ｖ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることがより好ましい。バリン（Ｖ）は、Ｙ、Ｒ、Ｈ又はＷで置換されることがより好ましい。
【0072】
ｅ）フェニルアラニン（Ｆ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換されることが好ましい。フェニルアラニン（Ｆ）は、Ｒ、Ｙ、Ｑ又はＨで置換されることがより好ましい。
【0073】
ｆ）グルタミン（Ｑ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0074】
ｇ）アラニン（Ａ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、又は、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）で置換されることが好ましい。
【0075】
ｈ）セリン（Ｓ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｖ）アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）で置換されることが好ましい。セリン（Ｓ）は、Ｒ、Ｎ又はＱで置換されることが好ましい。
【0076】
ｉ）リジン（Ｋ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又は（ｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0077】
ｊ）アルギニン（Ｒ）は、（ｉｉ）チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0078】
ｋ）メチオニン（Ｍ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0079】
ｌ）ロイシン（Ｌ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0080】
ｍ）アスパラギン酸（Ｄ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。アスパラギン酸（Ｄ）は、Ｈ、Ｙ又はＫで置換されることがより好ましい。
【0081】
ｎ）グルタミン酸（Ｅ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。
【0082】
ｏ）イソロイシン（Ｉ）は、（ｉ）フェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）、（ｉｉ）バリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）、又は、（ｉｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されることが好ましい。
【0083】
ｐ）チロシン（Ｙ）は、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、又は、（ｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換されることが好ましい。チロシン（Ｙ）は、Ｗ又はＲで置換されることがより好ましい。
【0084】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、より好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、それは、以下を含む。
Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙ。
Ｐ７３Ｌ、Ｐ７３Ｖ、Ｐ７３Ｉ、Ｐ７３Ｅ、Ｐ７３Ｔ、Ｐ７３Ｆ、Ｈ９３Ｎ、Ｈ９３Ｑ、Ｈ９３Ｗ、Ｎ９９Ｒ、Ｎ９９Ｈ、Ｎ９９Ｗ、Ｎ９９Ｙ、Ｐ１００Ｌ、Ｐ１００Ｖ、Ｐ１００Ｉ、Ｐ１００Ｅ、Ｐ１００Ｔ、Ｐ１００Ｆ、Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１３０Ｈ、Ｄ１３２Ｈ、Ｄ１３２Ｙ、Ｄ１３２Ｋ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｗ、Ａ１６１Ｈ、Ｄ１６２Ｈ、Ｄ１６２Ｙ、Ｄ１６２Ｋ、Ｄ１６３Ｗ、Ｄ１６３Ｆ、Ｄ１６３Ｙ、Ｄ１６３Ｈ、Ｄ１６３Ｉ、Ｄ１６３Ｌ、Ｄ１６３Ｖ、Ｙ２４４Ｗ、Ｙ２４４Ｈ、Ｅ２７７Ｇ、Ｉ２８０Ｈ、Ｉ２８０Ｋ、Ｉ２８０Ｗ、Ｑ２９１Ｋ、Ｑ２９１Ｒ、Ｑ２９１Ｗ、Ｑ２９１Ｆ、Ｈ３９６Ｎ、Ｈ３９６Ｑ、Ｈ３９６Ｗ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｒ、Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ７３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ９３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｅ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｆ１３０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６２Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ２７７Ｇ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｉ２８０Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｑ２９１Ｆ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｗ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｈ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ４１５Ｙ。
【0085】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含むことがより好ましく、それは、Ｐ９４Ｗ、Ｐ９４Ｆ、Ｆ１０３Ｗ、Ｉ２８２Ｆ、Ｖ１５５Ｌ、Ｖ１５５Ｉ、Ｄ１２６Ｈ、Ｄ１２６Ｎ、Ｄ１２６Ｑ、Ｐ１５７Ｗ、Ｐ１５７Ｆ、Ｐ１５７Ｌ、Ｖ４２２Ｙ、Ｖ４２２Ｒ、Ｖ４２２Ｈ、Ｖ４２２Ｗ、Ｓ２９３Ｒ、Ｓ２９３Ｎ、Ｓ２９３Ｑ、Ｈ８７Ｒ、Ｈ８７Ｙ、Ｈ８７Ｎ、Ｈ８７Ｑ、Ｎ９３Ｑ、Ｎ９３Ｒ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｈ、Ｈ４０３Ｙ、Ｈ４０３Ｒ、Ｈ４０３Ｑ、Ｆ２４６Ｒ、Ｆ２４６Ｙ、又はＦ２４６Ｑを含む。
【0086】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換されるヘリカーゼである。任意の数のアミノ酸、例えば、１個又はその以上、２個又はその以上、３個又はその以上、４個又はその以上、５個又はその以上又は６個又はその以上のアミノ酸が置換されることができる。ｓｓＤＮＡのヌクレオチドは、それぞれ三つのリン酸基を含む。置換された各アミノ酸は、毎回任意の数のリン酸基、例えば、毎回一つ、二つ又は三つのリン酸基と相互作用することができる。一つ又は複数のリン酸基と相互作用するアミノ酸は、タンパク質モデリングを使用して同定することができる。
【0087】
置換は、好ましくは、前記少なくとも一つのアミノ酸と前記ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のリン酸基との間の（ｉ）静電相互作用、（ｉｉ）水素結合及び／又は（ｉｉｉ）カチオン-π（カチオン－ｐｉ）相互作用を増加させる。以下、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）標識法を用いて、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の好ましい置換を説明する。
【0088】
置換は、好ましくは、サイト（位置）での正味の正電荷を増加させる。本技術分野で既知の方法を使用して、任意の位置の正味電荷を測定することができる。例えば、等電点を用いてアミノ酸の正味電荷を定義することができる。正味電荷は、通常約７．５で測定される。置換は、好ましくは、正に帯電したアミノ酸、非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸による負に帯電したアミノ酸の置換である。負に帯電したアミノ酸は、正味の負に帯電したアミノ酸である。負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）を含むが、これらに限定されない。正に帯電したアミノ酸は、正味の正に帯電したアミノ酸である。正に帯電したアミノ酸は、天然又は非天然に存在する。正に帯電したアミノ酸は、合成又は修飾され得る。例えば、正味の正に帯電した修飾アミノ酸は、本発明で用いられるために専門的に設計することができる。アミノ酸に対する多くの異なるタイプの修飾は、本技術分野で公知である。好ましい天然に存在する正に帯電したアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を含むが、これらに限定されない。
【0089】
非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸は、天然又は非天然に存在するものであってもよい。それは、合成又は修飾されたものであってもよい。非荷電アミノ酸は、正味電荷を有しない。適切な非荷電アミノ酸は、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）を含むが、これらに限定されない。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。適切な非極性アミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）及びバリン（Ｖ）を含むが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【0090】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここで、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｈ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７のうちの少なくとも一つである。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントを含むことが好ましく、ここで、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡのうちの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、Ｋ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８又はＫ２４９のうちの少なくとも一つである。これらの番号は、配列番号１１又は６の関連位置に対応し、配列番号１１又は６に比べて、一つ又は複数のアミノ酸がバリアントに挿入又は欠失された状態下で変更する必要がある場合がある。当業者は、前述のようなバリアントの相応位置を確認することができる。
【0091】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１～５及び７～１０のいずれか一つのバリアントを含み、ここで、前記ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数のリン酸基と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸は、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４又はＫ３９７に対応する少なくとも一つのアミノ酸であるか、又は、配列番号６のＫ９１、Ｔ８５、Ｒ８８、Ｈ６９、Ｋ４０４、Ｔ４０１、Ｎ２９９、Ｎ２４８又はＫ２４９に対応する少なくとも一つのアミノ酸である。
【0092】
表５は、配列番号１１のＨ７５、Ｔ９１、Ｓ９４、Ｋ９７、Ｎ２４６、Ｎ２４７、Ｎ２８４、Ｋ２８８、Ｎ２９７、Ｔ３９４及びＫ３９７に対応する配列番号１～１０のアミノ酸を示す。
【0093】
【表5】
【0094】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、以下のいずれ一つ又は複数を含む。
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）、又は、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されること、
ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）、又は、（ｖ）アスパラギン（Ｎ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されること、
ｃ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換されること、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換されること、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換されること、及び/又は、
ｆ）アルギニン（Ｒ）が、（ｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）又はグルタミン（Ｑ）で置換されること。
ａ）ヒスチジン（Ｈ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はスレオニン（Ｔ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）、又は、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されること、
ｂ）スレオニン（Ｔ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）、又は、（ｖ）アスパラギン（Ｎ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されること、
ｃ）セリン（Ｓ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）で置換されること、
ｄ）アスパラギン（Ｎ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）で置換されること、及び／又は、
ｅ）リジン（Ｋ）が、（ｉ）アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）又はヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）又はヒスチジン（Ｈ）、又は、（ｉｖ）アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換されること、及び/又は、
ｆ）アルギニン（Ｒ）が、（ｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）又はグルタミン（Ｑ）で置換されること。
【0095】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントであり、それは、（ａ）～（ｋ）のうちの一つ又は複数を含み、ここで、（ａ）Ｈ７５Ｎ、Ｈ７５Ｑ、Ｈ７５Ｋ又はＨ７５Ｆ、（ｂ）Ｔ９１Ｋ、Ｔ９１Ｑ又はＴ９１Ｎ、（ｃ）Ｓ９４Ｈ、Ｓ９４Ｎ、Ｓ９４Ｋ、Ｓ９４Ｔ、Ｓ９４Ｒ又はＳ９４Ｑ、（ｄ）Ｋ９７Ｑ、Ｋ９７Ｈ又はＫ９７Ｙ、（ｅ）Ｎ２４６Ｈ又はＮ２４６Ｑ、（ｆ）Ｎ２４７Ｑ又はＮ２４７Ｈ、（ｇ）Ｎ２８４Ｈ又はＮ２８４Ｑ、（ｈ）Ｋ２８８Ｑ又はＫ２８８Ｈ、（ｉ）Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ又はＮ２９７Ｈ、（ｊ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｈ又はＴ３９４Ｎ、又は、（ｋ）Ｋ３９３Ｒ、Ｋ３９７Ｈ又はＫ３９７Ｙである。
【0096】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは配列番号６のバリアントであり、それは（ａ）～（ｉ）のうちの一つ又は複数を含み、ここで、（ａ）Ｋ９１Ｒ、（ｂ）Ｔ８５Ｎ、Ｔ８５Ｑ又はＴ８５Ｒ、（ｃ）Ｒ８８Ｎ又はＲ８８Ｑ、（ｄ）Ｈ６９Ｎ、Ｈ６９Ｑ又はＨ６９Ｒ、（ｅ）Ｋ４０４Ｒ、（ｆ）Ｔ４０１Ｎ、Ｔ４０１Ｈ、Ｔ４０１Ｋ又はＴ４０１Ｒ、（ｇ）Ｎ２９９Ｑ、Ｎ２９９Ｒ、Ｎ２９９Ｈ又はＮ２９９Ｋ、（ｈ）Ｎ２４８Ｑ、Ｎ２４８Ｒ、Ｎ２４８Ｈ又はＮ２４８Ｋ、又は、（ｉ）Ｋ２４９Ｒ、Ｋ２４９Ｑ又はＫ２４９Ｎである。
【0097】
さらに好ましくは、（Ｂ）において、二本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が置換される。
【0098】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、
（ａ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｍ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号６のＭ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアント、を含む。
（ａ）配列番号６のバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、Ｍ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０のうちの少なくとも一つである、配列番号６のバリアント、又は、
（ｂ）配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアントであって、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドの二本鎖と相互作用する少なくとも一つのアミノ酸が、配列番号６のＭ８１、Ｖ５９、Ｑ５２、Ｅ２８６又はＫ２９０に対応する少なくとも一つのアミノ酸である、配列番号１～５及び７～１１のいずれか一つのバリアント、を含む。
【0099】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、それは、（ａ）～（ｅ）のうちの一つ又は複数を含み、ここで、（ａ）Ｍ８１Ｋ、Ｍ８１Ｒ又はＭ８１Ｈ、（ｂ）Ｖ５９Ｋ、Ｖ５９Ｒ又はＶ５９Ｈ、（ｃ）Ｑ５２Ｋ、Ｑ５２Ｒ又はＱ５２Ｈ、（ｄ）Ｅ２８６Ｋ、Ｅ２８６Ｒ又はＥ２８６Ｈ、又は、（ｅ）Ｋ２９０Ｒである。
【0100】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号６のバリアントであり、それは、Ｔ８５Ｎ、Ｈ８７Ｙ、Ｈ８７Ｑ、Ｈ８７Ｎ、Ｒ８８Ｑ、Ｒ８８Ｎ、Ｖ１５５Ｉ、Ｖ１５５Ｌ、Ｋ９１Ｒ、Ｆ１０３Ｗ、Ｓ２３９Ｎ、Ｆ２４６Ｒ、Ｆ２４６Ｙ、Ｋ２４９Ｒ、Ｉ２８２Ｆ、Ｅ２８６Ｋ又はＶ４２２Ｈのようなアミノ酸の置換の一つ又は複数を含む。
【0101】
本発明のヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部が一つ又は複数の修飾を含み、好ましくは一つ又は複数の置換を含み、さらに好ましくは、前記ヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を含む。前記膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部は、通常、ヘリカーゼがポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御するために用いられる場合、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの一部であり、例えば、以下でより詳細に説明する。ヘリカーゼがポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御するために用いられる場合、前記一部は通常ポアと相互作用又は接触するアミノ酸を含む。電位の印加下で、ヘリカーゼとポアを通って移動するポリヌクレオチドとが結合又は連結される場合、前記一部は一般的にポアと相互作用又は接触するアミノ酸を含む。
【0102】
膜貫通ポアと相互作用する一部は、好ましくは、配列番号１１のバリアントを含み、ここでの位置は、Ｅ１９６、Ｗ２０２、Ｎ１９９又はＧ２０１上の一つ又は複数（例えば、２個、３個、４個又は５個）のアミノ酸の置換を含む。
【0103】
膜貫通ポアと相互作用する一部は、好ましくは、配列番号１～１０のいずれか一つのバリアントを含み、それは、（ａ）Ｅ１９６、（ｂ）Ｗ２０２、（ｃ）Ｎ１９９、又は（ｄ）Ｇ２０１位置での配列番号１１に対応する少なくとも一つのアミノ酸又は複数の置換を含む。
【0104】
表６は、配列番号１１のＥ１９６、Ｗ２０２、Ｎ１９９、Ｇ２０１に対応する配列番号１～１０のアミノ酸を示す。
【0105】
【表6】
【0106】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、配列番号１１のバリアントである。それは、以下の位置での置換を含む。
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、
－Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又は、
－Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌ。
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｈ７５、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｎ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｑ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｋ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｈ７５Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｔ９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｑ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｔ９１Ｎ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ９９／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ９９Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｓ９４／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｓ９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、
－Ｆ１０９／Ｐ１００／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｐ１００Ｔ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１３２／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１３２Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ａ１６１／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ａ１６１Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｄ１６３／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｉ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｌ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｄ１６３Ｖ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｙ２４４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ２４４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｎ２４６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２４６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｉ２８０、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｈ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｉ２８０Ｒ、
－Ｆ１０９／Ｅ１９６／Ｑ２９１、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｋ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｒ、Ｆ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｗ、又はＦ１０９Ｗ／Ｅ１９６Ｌ／Ｑ２９１Ｆ、
－Ｆ１０９／Ｎ２９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｎ２９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｔ３９４／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｈ３９６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｅ１９６Ｌ、
－Ｆ１０９／Ｋ３９７／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｅ１９６Ｌ、Ｆ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｅ１９６Ｌ、又は、
－Ｆ１０９／Ｙ４１６／Ｅ１９６、例えば、Ｆ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｗ／Ｅ１９６Ｌ、又はＦ１０９Ｗ／Ｙ４１６Ｒ／Ｅ１９６Ｌ。
【0107】
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、野生型ヘリカーゼのアミノ酸配列から変化され且つポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。特に、配列番号１～１１のいずれか一つのバリアントは、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列から変化され且つポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、本技術分野の既知の方法を用いて確認することができる。適切な方法は、蛍光異方性法、トリプトファン蛍光法及び電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含むが、これらに限定されない。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドと結合するバリアントの能力は、実施例に説明されたように確認することができる。
【0108】
アミノ酸の同一性に基づいて、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列の長さ全体に対して、バリアントは、当該配列と少なくとも２０％の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、アミノ酸の同一性に基づいて、前記バリアントのポリペプチドは、配列番号１～１１のいずれか一つのアミノ酸配列の配列全体に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％及びより好ましく少なくとも９５％、９７％又は９９％の同一性を有することができる。１００以上、例えば１５０、２００、３００、４００又は５００又はより多くの連続アミノ酸の長さに、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性（厳密な相同性）を有することができる。
【0109】
本発明の第２態様は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを少なくとも一つ又は複数含む構築体を提供する。
【0110】
好ましくは、前記構築体は、ポリヌクレオチド結合部をさらに含む。
【0111】
好ましくは、前記構築体は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。
【0112】
好ましくは、前記ポリヌクレオチド結合部は、ポリヌクレオチドの塩基に結合する部分、及び／又はポリヌクレオチドの糖環に結合する部分、及び／又はポリヌクレオチドのリン酸に結合する部分であってもよい。
【0113】
好ましくは、前記構築体を構成するＰｉｆ１様ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合部は、単独で調製された後に直接連結することができる。遺伝子融合方法により構築体を直接調製することがでる。例えば、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼをコードするヌクレオチドとポリヌクレオチド結合部とを連結させ、発現のために宿主細胞に移し、精製する。
【0114】
さらに好ましくは、前記ポリヌクレオチド結合部は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドであり、真核生物の一本鎖結合タンパク質、細菌の一本鎖結合タンパク質、古細菌の一本鎖結合タンパク質、ウイルスの一本鎖結合タンパク質又は二本鎖結合タンパク質のうちの一種又は二種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0115】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチド結合部は、表７に示すいずれか一種を含むが、これらに限定されない。
【0116】
【表7】
【0117】
本発明の第３態様は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は前記構築体をコードする核酸を提供する。
【0118】
本発明の第４態様は、本発明に係る核酸を含む発現ベクターを提供する。
【0119】
好ましくは、前記核酸は、発現ベクターの調節エレメントに作動可能に連結され、ここで、前記調節エレメントは、好ましくは、プロモーターである。
【0120】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記プロモーターは、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａ又はλＬから選択される。
【0121】
好ましくは、前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又はファージを含むが、これらに限定されない。
【0122】
本発明の第５態様は、本発明に係る核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0123】
好ましくは、前記宿主細胞は大腸菌を含むが、これらに限定されない。
【0124】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記宿主細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂなどから選択される。
【0125】
本発明の第６態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製方法を提供し、前記方法は、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを提供し、次に前記野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを修飾して本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを取得することを含む。
【0126】
本発明の第７態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製方法を提供し、前記方法は、本発明に係る宿主細胞を培養し、誘導性の発現と精製を行って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを取得することを含む。
【0127】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記方法は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼのアミノ酸配列に従って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼをコードする核酸配列を取得し、酵素切断して発現ベクターにライゲーションし、次に大腸菌に形質転換し、誘導性の発現と精製を行って、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを得る。
【0128】
本発明の第8態様は、ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。前記方法は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体をポリヌクレオチドに接触させることを含む。
【0129】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの移動を制御することは、ポアを通過するポリヌクレオチドの移動を制御することである。前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。当該ポアは、天然又は人工のポアであってもよく、タンパクポア、ポリヌクレオチドポア又は固体状ポアを含むが、これらに限定されない。
【0130】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記膜貫通ポアは、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0131】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質などから由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0132】
好ましくは、前記方法は、一つ又は複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼと共にポリヌクレオチドの移動を制御することができる。
【0133】
本発明の第９態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法を提供し、前記方法は、以下を含む。
Ｉ）本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること。
Ｉ）本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体を、標的ポリヌクレオチド及びポアと接触させて、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体がポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにすること、及び、
ＩＩ）標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと前記ポアが相互作用する時の一つ又は複数の特徴を取得して、前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけること。
【0134】
好ましくは、前記方法において任意の数の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを使用することができる。好ましくは、一つ又は複数であり、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はより多くてもよい。ここで、二つ以上の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼは、同じでも異なってもよい。野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は他のタイプのヘリカーゼを含み得る。さらに、二つ以上のヘリカーゼが互いに連結されるか又はポリヌクレオチドにそれぞれ結合されて、ポリヌクレオチドの移動を制御する機能を奏することができる。
【0135】
好ましくは、ポアに一つの力（例えば、電圧）を印加すると、ポアを通過する標的ポリヌクレオチドの速度がＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体により制御され、これにより識別可能な安定した電流レベルを取得し、標的ポリヌクレオチドの特徴を確認するために用いられる。
【0136】
好ましくは、工程Ｉ）及びＩＩ）を一回又は複数回繰り返す。
【0137】
好ましくは、前記方法は、前記ヘリカーゼ又は構築体にまたがって、標的ポリヌクレオチドに電位差を印加する工程をさらに含む。
【0138】
好ましくは、前記ポアは、印加された電位の駆動下で水和イオンが膜の一側から膜の他側に流れることを許容する構造である。さらに好ましくは、前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。前記膜貫通ポアは、標的ポリヌクレオチドの移動にチャネルを提供する。
【0139】
前記膜は、従来技術において存在するいかなる膜であってもよく、好ましくは両親媒性分子層、即ち、少なくとも一つの親水性部分と少なくとも一つの親油性又は疎水性部分を有する両親媒性分子（例えば、リン脂質）で形成された層である。両親媒性分子は、合成又は天然に存在することができる。さらに好ましくは、前記膜は脂質二重層膜である。
【0140】
前記標的ポリヌクレオチドは、任意の既知の方法を用いて膜に連結されることができる。膜が両親媒性分子層、例えば脂質二重分子層であれば、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、前記膜に存在するポリペプチド又は前記膜に存在する疎水性アンカーによって当該膜に連結される。ここで、疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ又はアミノ酸であることが好ましい。
【0141】
好ましくは、前記ポアは生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0142】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質等から由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0143】
移動を促進する全ての必要な成分を提供する場合、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼはＤＮＡに沿って５’－３’の方向で移動するが、ＤＮＡのポア内での配向（ＤＮＡのどの末端が捕捉されるかに依存する）とは、酵素を使用して、印加されたフィールドの方向の逆方向でＤＮＡをポアから取り出すために用いられるか、又は印加された電界の方向に沿ってＤＮＡをポアに移動するために用いられることを意味する。
【0144】
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖又は少なくとも一部が二本鎖である。
【0145】
さらに好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドは、タグ、スペーサー、メチル化、酸化又は損傷の方式により修飾されることができる。
【0146】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記標的ポリヌクレオチドは、少なくとも一部が二本鎖である。ここで、前記二本鎖部分は、前記ポアに優先的にねじ込まれるリーダー配列を含むＹアダプター構造を構成する。
【0147】
さらに好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドの長さは１０～１０００００個又はより多くてもよい。
【0148】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記標的ポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１００００個、少なくとも５００００個又は少なくとも１０００００個などであってもよい。
【0149】
好ましくは、前記ヘリカーゼは、一本鎖ポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドに結合される。
【0150】
好ましくは、前記一つ又は複数の特徴は、標的ポリヌクレオチドの由来、長さ、同一性、配列、二次構造、又は標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。
【0151】
好ましくは、前記一つ又は複数の特徴は、電気的測定及び／又は光学的測定によって測定される。
【0152】
さらに好ましくは、電気的測定及び／又は光学的測定によって電気信号及び／又は光信号を生成し、各ヌクレオチドは一つの信号レベルに対応し、続いて電気信号及び／又は光信号をヌクレオチドの特徴に変換する。
【0153】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記電気的測定は、電流測定、インピーダンス測定、トンネリング測定、ウィンドトンネル測定又は電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定などを含むが、これらに限定されない。
【0154】
本発明に係る電気信号は電流、電圧、トンネリング、抵抗、電位、導電率又は横方向の電気的測定の測定値から選択される。
【0155】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記電気信号は、前記ポアを通過する電流である。
【0156】
本発明の第１０態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける製品を提供する。前記製品は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体、核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0157】
好ましくは、前記製品は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ及び／又は複数の構築体を含む。
【0158】
好ましくは、前記製品は、複数のポアを含む。さらに好ましくは、前記ポアはナノポアであり、前記ナノポアは膜貫通ポアである。
【0159】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記膜貫通ポアは、生物学的ポア、固体状ポア、又は生物学的ポアと固体状ポアのハイブリッドポアから選択される。
【0160】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記ポアは、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＡ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＢ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＣ、マイコバクテリウム・スメグマティス・ポリンＤ、ヘモリシン、リシン、インターロイキン、外膜ポリンＦ、外膜ポリンＧ、外膜ホスホリパーゼＡ、ＷＺＡ又はナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質等から由来するものを含むが、これらに限定されない。
【0161】
本発明の一つの具体的な実施形態において、前記製品は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は複数の構築体、及び複数のポアを含む。
【0162】
好ましくは、前記製品は、キット、装置又はセンサから選択される。
【0163】
さらに好ましくは、前記キットは、脂質二重層を含むチップをさらに含む。前記ポアは、脂質二重層に跨る。
【0164】
本発明に係るキットは、一つ又は複数の脂質二重層を含み、各脂質二重層は、一つ又は複数の前記ポアを含む。
【0165】
本発明に係るキットは、標的ポリヌクレオチドを特徴づける試薬又は装置をさらに含む。好ましくは、前記試薬は、緩衝剤、ＰＣＲ増幅に必要なツールを含む。
【0166】
本発明の第１１態様は、標的ポリヌクレオチドの特徴づけ又はポアを通過する標的ポリヌクレオチドの移動に対する制御における、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体、核酸、発現ベクター、宿主細胞又は製品の使用を提供する。
【0167】
本発明の第１２態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるキットを提供する。前記キットは、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体又は核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0168】
本発明の第１３態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける装置を提供する。前記装置は、本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ、構築体又は核酸、発現ベクター又は宿主細胞、及びポアを含む。
【0169】
好ましくは、前記装置は、前記複数のポアを支持し且つポアとポリヌクレオチドとの相互作用信号を伝達できるセンサ、及び少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドを貯蔵するための貯蔵器、及び特徴付けを実施する過程に必要な溶液を含む。
【0170】
好ましくは、前記装置は、複数のＰｉｆ１様ヘリカーゼ及び／又は複数の構築体、及び複数のポアを含む。
【0171】
本発明の第１４態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを提供し、前記センサは、前記ポアと本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体との間に複合体を形成することを含む。
【0172】
好ましくは、前記標的ポリヌクレオチドの存在下で、前記ポアとヘリカーゼ又は構築体とを接触させ、前記ポアに跨って電位を印加する。前記電位は、電圧電位又は化学電位から選択される。
【0173】
本発明の第１５態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを形成する方法を提供し、前記ポアと本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼ又は構築体との間に複合体を形成して標的ポリヌクレオチドを特徴づけるセンサを形成することを含む。
【0174】
本発明の第１６態様は、ポリヌクレオチドに連結される二つ又は複数のヘリカーゼを提供し、ここで、前記二つ又は複数のヘリカーゼの少なくとも一つが本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼである。
【0175】
本発明の第１７態様は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーを提供し、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、一つ又は複数の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを含む。
【0176】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ又は他のタイプのヘリカーゼをさらに含み得る。ここで、前記他のタイプのヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、Ｄｄａヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ又はＴｒｗＣヘリカーゼなどであってもよい。
【0177】
好ましくは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとの間、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとＰｉｆ１様ヘリカーゼとの間、野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼとの間、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと他のタイプのヘリカーゼとの間、又は野生型Ｐｉｆ１様ヘリカーゼと他のタイプのヘリカーゼとの間は、頭対頭、尾対尾、又は頭対尾の方式で連結又は配列されてもよい。
【0178】
好ましくは、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼオリゴマーは、二つ以上の本発明に係るＰｉｆ１様ヘリカーゼを含み、ここで、前記Ｐｉｆ１様ヘリカーゼは、異なっても同じであってもよい。
【0179】
本発明に係る「Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ」は修飾されたものである。前記修飾は、野生型又は天然ヘリカーゼに対して修飾されたものである。
【0180】
本発明に係る「Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ」、「構築体」又は「ポア」は、いずれも修飾されて、同定又は精製に役立つ。例えば、ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ又はＭＢＰタグを添加して、又は信号配列を添加して、ポリペプチドに信号配列が自然に含まれていない細胞からの分泌を促進する。遺伝子タグを導入する代わりに、化学反応によりタグをＰｉｆ１様ヘリカーゼ、ポア又は構築体上の天然又は人工位置に連結することもできる。
【0181】
本発明に係る「ヌクレオチド」は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）及びデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ又はｄＣＭＰから選択される。
【0182】
本発明に係る「保存的アミノ酸置換」は、アラニンとセリン、グリシン、スレオニン、バリン、プロリン又はグルタミン酸との間の置換、及び／又は、アスパラギン酸とグリシン、アスパラギン又はグルタミン酸との間の置換、及び／又は、セリンとグリシン、アスパラギン又はスレオニンとの置換、及び／又は、ロイシンとイソロイシン又はバリンとの間の置換、及び／又は、バリンとロイシン、イソロイシンとの間の置換、及び／又は、チロシンとフェニルアラニンとの間の置換、及び／又は、リジンとアルギニンとの間の置換を含むが、これらに限定されない。上記の前記置換基は、本発明に記載のアミノ酸配列の活性を変化させない。
【0183】
本発明に係る「二つ以上」は、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、又はより多くの個数などを含む。
【0184】
本発明に係る「複数」は、二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つ以上、八つ以上、又はより多くの個数などを含むが、これらに限定されない。
【0185】
本発明に係る「少なくとも一つ」は、一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つ以上、八つ以上又はより多くの個数などを含むが、これらに限定されない。
【0186】
本発明に係る「及び／又は」は、択一の項目及び任意の個数の項目の組み合わせを含む。
【0187】
本発明に係る「含む」は、制限のない用語であり、記載された特定の成分又は工程、及び実質的な効果を有さない他の成分又は工程を含むことを意味する。
【0188】
本発明に係る「非天然アミノ酸」は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼに天然に存在するアミノ酸ではない。好ましくは、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、４－アセトアセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリル－Ｌ－チロシン、３－（フェニルセレニル）－Ｌ－アラニン、Ｏ－２－プロピン－１－イル－Ｌ－チロシン、４－（ジヒドロキシボリル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－［（エチルスルファニル）カルボニル］－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（プロパン－２－イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛４－［（２－アミノ－３－スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロピオン酸、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－（トリフルオロメチル）チロシン、４－ニトロＬ－フェニルアラニン、３－ヒドロキシ－Ｌ－チロシン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、４－イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、３－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン、４－フェニル－Ｌ－フェニルアラニン、（２Ｓ）－２－アミノ－３－（ナフタレン－２－イルアミノ）プロピオン酸、６－（メチルスルファニル）ノルロイシン、６－オキシ－Ｌ－リジン、Ｄ－チロシン、（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノオクタン酸エステル－３－（２，２′－ビピリジル－５－イル）－Ｄ－アラニン、２－アミノ－３－（８－ヒドロキシ－３－キノリル）プロピオン酸、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｓ－（２－ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）スルファニル］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）オキシ］プロピオン酸、Ｏ－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル）－Ｌ－セリン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン、２－ニトロフェニルアラニン、４－［（Ｅ）－フェニルジアゼニル］－Ｌ－フェニルアラニン、４－［３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリジニル－３イル］－Ｄ－フェニルアラニン、２－アミノ－３－［［５－（ジメチルアミノ）－１－ナフチル］スルホニルアミノ］プロピオン酸、（２Ｓ）－２－アミノ４－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）ブタン酸、（２Ｓ）－３－［（６－アセチルナフタレン－２－イル）アミノ］－２－アミノプロピオン酸、４－（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、Ｏ－チオ－Ｌ－チロシン、（２Ｒ）－６－アセチルアミノ－２－アミノカプロン酸エステル、１－メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、Ｌ－ホモシステイン、５－スルファニル－ノルバリン、６－スルファニル－Ｌ－ノルロイシン、５－（メチルスルファニル）－Ｌ－ノルバリン、Ｎ６－｛［（２Ｒ，３Ｒ）－３－メチル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロール－２－イル］カルボニル｝－Ｌ－リジン、Ｎ６－［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６－［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（２Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）－２－アミノ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－エチニルテトラヒドロフラン－２－イル］－８－オキシオクタン酸、Ｎ６－（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－６－（｛［（２－メチル－２－プロパンイル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－（｛［（２－アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６－Ｌ－プロピル－Ｌ－リジン、（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸又はＮ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンを含むが、これらに限定されない。
【実施例0189】
下記の実施例は、本発明の内容をさらに説明するものであるが、本発明を限定するものと理解すべきではない。本発明の主旨及び実質から逸脱することなく、本発明の方法、工程又は条件に対して行われた修正又は差替えは、いずれも本発明の範囲内に属する。
【0190】
特に明記しない限り、実施例で用いられる技術的手段は、当業者に周知の従来の手段である。各実施例で使用される装置及び試薬はいずれも常用の市販品であり得る。シークエンシングに使用されたシーケンサーは、ＱＩＴＡＮ ＴＥＣＨ社製のＱＮｏｍｅ－９６０４遺伝子シーケンサーであり、シークエンシングのアルゴリズムは、ＯＮＴ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、オックスフォードナノポア社）製のオープンソースのシークエンシングモデル ｂｏｎｉｔｏ－ｃｔｃであり、詳細なオープンソースアドレスは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ／ｂｏｎｉｔｏである。これは、ＣＴＣに基づくオープンソースの端末間のｓｅｑ２ｓｅｑモデルであり、アーキテクチャは、エヌビディア（ＮＶＩＤＩＡ）社のオープンソースの音声認識ネットワークＱｕａｒｔｚＮｅｔに基づく。ＱｕａｒｔｚＮｅｔの論文は、『ＱＵＡＲＴＺＮＥＴ：ＤＥＥＰ ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＳＰＥＥＣＨ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＷＩＴＨ １Ｄ ＴＩＭＥ－ＣＨＡＮＮＥＬ ＳＥＰＡＲＡＢＬＥ ＣＯＮＶＯＬＵＴＩＯＮＳ』である。
【0191】
実施例１ Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの調製
１ 材料及び方法
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ配列を含有する組換えプラスミド（アミノ酸配列の配列番号１～１１のバリアントであり、それはヌクレオチド配列の配列番号２５～３５に対応する）を、熱ショックによりＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、蘇生した細菌溶液をアンピシリン耐性の固体ＬＢプレートに塗布した後、３７℃で一晩培養し、単一コロニーを選び、１００ｍｌのアンピシリン耐性液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で培養する。接種量の１％をアンピシリン耐性ＬＢ液体培地に接種して拡大培養し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で培養し、そのＯＤ６００値を連続的に測定する。ＯＤ６００＝０．６～０．８である場合、ＬＢ培地の培養液を１８℃に冷却し、イソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、最終濃度を１ｍＭにする。１２～１６時間後、１８℃で細菌を収集する。細菌を高圧下で粉砕し、ＦＰＬＣ方法で精製し、サンプルを収集する。
２ 結果
１ 材料及び方法
Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ配列を含有する組換えプラスミド（アミノ酸配列の配列番号１～１１のバリアントであり、それはヌクレオチド配列の配列番号２５～３５に対応する）を、熱ショックによりＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、蘇生した細菌溶液をアンピシリン耐性の固体ＬＢプレートに塗布した後、３７℃で一晩培養し、単一コロニーを選び、１００ｍｌのアンピシリン耐性液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で培養する。接種量の１％をアンピシリン耐性ＬＢ液体培地に接種して拡大培養し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で培養し、そのＯＤ６００値を連続的に測定する。ＯＤ６００＝０．６～０．８である場合、ＬＢ培地の培養液を１８℃に冷却し、イソプロピルチオガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加して発現を誘導し、最終濃度を１ｍＭにする。１２～１６時間後、１８℃で細菌を収集する。細菌を高圧下で粉砕し、ＦＰＬＣ方法で精製し、サンプルを収集する。
２ 結果
【0192】
図１０は、精製されたＭｐｈ ＭＰ１（配列番号１１のバリアント）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示す。
【0193】
実施例２
蛍光分析を用いて酵素の活性を検出することによって、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力を説明する。
蛍光分析を用いて酵素の活性を検出することによって、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼのハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ巻き戻し能力を説明する。
【0194】
１ 材料及び方法
図１のａ）に示すように、蛍光基質鎖（最終濃度 １００ｎＭ）は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基のハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（配列番号２０－ＢＨＱ－３’）を有し、前記ハイブリダイズした相補鎖が５’端にカルボキシフルオレセイン（５’ＦＡＭ－配列番号２１）を有することを含む。ハイブリダイズしたフルオレセイン由来蛍光が局所的なＢＨＱ－１によって消光され、基質は本質的に非蛍光性である。さらに、蛍光基質の短鎖に相補的な０．５μＭの捕捉鎖（配列番号２２）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（２００ｎＭ）は、前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして、最初の基質の再アニーリングと蛍光の損失を防止する。同時に、システム内に依然としてＰｉｆ１様ヘリカーゼによって巻き戻されない一定量のハイブリッドしたｄｓＤＮＡが存在する。ｃ）に示すように、主鎖に完全に相補的な捕捉鎖Ａ（配列番号２３）を過剰に添加した後、巻き戻されないｄｓＤＮＡの一部は、過剰なＡの存在により鎖巻き戻し効果を奏し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
図１のａ）に示すように、蛍光基質鎖（最終濃度 １００ｎＭ）は、５’端のｓｓＤＮＡ突出部分、及び５０塩基のハイブリダイズしたｄｓＤＮＡ部分を有する。主鎖の上部（Ｂ）が３’端にブラックホールクェンチャー（ＢＨＱ－１）塩基（配列番号２０－ＢＨＱ－３’）を有し、前記ハイブリダイズした相補鎖が５’端にカルボキシフルオレセイン（５’ＦＡＭ－配列番号２１）を有することを含む。ハイブリダイズしたフルオレセイン由来蛍光が局所的なＢＨＱ－１によって消光され、基質は本質的に非蛍光性である。さらに、蛍光基質の短鎖に相補的な０．５μＭの捕捉鎖（配列番号２２）を含む。ｂ）に示すように、ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたＰｉｆ１様ヘリカーゼ（２００ｎＭ）は、前記蛍光基質の５’端部分に連結され、前記主鎖に沿って移動し、前記相補鎖を巻き戻した後、過剰の捕捉鎖が優先的に相補鎖ＤＮＡにアニーリングして、最初の基質の再アニーリングと蛍光の損失を防止する。同時に、システム内に依然としてＰｉｆ１様ヘリカーゼによって巻き戻されない一定量のハイブリッドしたｄｓＤＮＡが存在する。ｃ）に示すように、主鎖に完全に相補的な捕捉鎖Ａ（配列番号２３）を過剰に添加した後、巻き戻されないｄｓＤＮＡの一部は、過剰なＡの存在により鎖巻き戻し効果を奏し、最終的に全てのｄｓＤＮＡが巻き戻され、蛍光値が最も高くなる。
【0195】
２ 結果
図２は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液の時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、０．５μＭ 捕捉ＤＮＡ）。
図２は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液の時間依存性のｄｓＤＮＡ巻き戻し比の変化図を示す（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、０．５μＭ 捕捉ＤＮＡ）。
【0196】
実施例３
例示的にゲル測定を使用して本発明の修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力を測定する。
例示的にゲル測定を使用して本発明の修飾されたＰｉｆ１様ヘリカーゼのＤＮＡ結合能力を測定する。
【0197】
具体的に、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ（Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃの突然変異を有する配列番号２）、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ（Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃの突然変異を有する配列番号３）、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ及びＣ１３６Ａの突然変異を有する配列番号５）、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａの突然変異を有する配列番号８）及びＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃの突然変異を有する配列番号１１）とＤＮＡとの結合能力を測定する。
【0198】
１ 材料及び方法
１０ｍＭ ＨＥＰＥ、ｐＨ値 ８．０、４００ｍＭ 塩化カリウム中で、アニーリングしたＤＮＡ複合体（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９とのハイブリダイゼーション）を、（１：１、体積／体積）の割合で、それぞれ、Ａｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５、Ｍｐｈ ＭＰ１、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃと混合して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの最終濃度（６００ｎＭ）及びＤＮＡ（３０ｎＭ）を得る。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを室温下で１時間ＤＮＡと結合させる。最終濃度が５μＭになるまで、ＴＭＡＤを各サンプルに添加し、室温で１時間培養する。サンプルを４～２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖで１．５時間泳動する。そして、当該ゲルを青色蛍光下でＤＮＡバンドを観察する。
１０ｍＭ ＨＥＰＥ、ｐＨ値 ８．０、４００ｍＭ 塩化カリウム中で、アニーリングしたＤＮＡ複合体（配列番号１８と５’ＦＡＭで修飾された配列番号１９とのハイブリダイゼーション）を、（１：１、体積／体積）の割合で、それぞれ、Ａｐｈ Ａｃｊ６１、Ａｐｈ ＰＸ２９、Ｓｐｈ ＣＢＨ８、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５、Ｍｐｈ ＭＰ１、Ａｐｈ Ａｃｊ６１－Ｄ９７Ｃ／Ａ３６３Ｃ、Ａｐｈ ＰＸ２９－Ｄ９６Ｃ／Ａ３７１Ｃ、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｐｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃと混合して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの最終濃度（６００ｎＭ）及びＤＮＡ（３０ｎＭ）を得る。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼを室温下で１時間ＤＮＡと結合させる。最終濃度が５μＭになるまで、ＴＭＡＤを各サンプルに添加し、室温で１時間培養する。サンプルを４～２０％ＴＢＥゲルにロードし、１６０Ｖで１．５時間泳動する。そして、当該ゲルを青色蛍光下でＤＮＡバンドを観察する。
【0199】
２ 結果
図３は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの修飾前後のＤＮＡ結合能力への影響を示す。レーン２～６は、大量のＤＮＡが電気泳動過程においてＰｉｆ１様ヘリカーゼと結合せず、明らかな結合バンドが観察されないことを示す。レーン７～１１は、異なる個数の酵素がＤＮＡと結合した結合バンドを示し、ここで、レーン９及び１０は、最大５個のＰｉｆ１様ヘリカーゼが配列番号１８の一本鎖部分と結合できることを示す。これは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが修飾された後にＤＮＡと結合する結合強度を大幅に向上させることを示す。
図３は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの修飾前後のＤＮＡ結合能力への影響を示す。レーン２～６は、大量のＤＮＡが電気泳動過程においてＰｉｆ１様ヘリカーゼと結合せず、明らかな結合バンドが観察されないことを示す。レーン７～１１は、異なる個数の酵素がＤＮＡと結合した結合バンドを示し、ここで、レーン９及び１０は、最大５個のＰｉｆ１様ヘリカーゼが配列番号１８の一本鎖部分と結合できることを示す。これは、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが修飾された後にＤＮＡと結合する結合強度を大幅に向上させることを示す。
【0200】
実施例４
本実施例は、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃの突然変異を有する配列番号１１）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
本実施例は、Ｍｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃ（Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃの突然変異を有する配列番号１１）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するＤＮＡ鎖全体をどのように制御するかを検証する。
【0201】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ａを調製する。配列番号１３（塩基配列が「ｔｔｔｔｔｔｔ」，Ｂ領域）は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結される。当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該配列番号１４の３’末端は、配列番号１７（Ｅ領域）に連結される。当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５の領域（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。調製されたＤＮＡ構造体とＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを、２５℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ グリセリン、２ｍＭ ＤＴＴ）中で一緒に３０分間プレインキュベートする。
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ａを調製する。配列番号１３（塩基配列が「ｔｔｔｔｔｔｔ」，Ｂ領域）は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結される。当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該配列番号１４の３’末端は、配列番号１７（Ｅ領域）に連結される。当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５の領域（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。調製されたＤＮＡ構造体とＭｐｈ ＭＰ１－Ｅ１０５Ｃ／Ａ３６２Ｃを、２５℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ グリセリン、２ｍＭ ＤＴＴ）中で一緒に３０分間プレインキュベートする。
【0202】
電気的測定値は、１，２－ジエタノールアシル－グリセロ－３－コリンリン酸脂質二重分子層に埋め込まれたＭｓｐＡナノポアから取得される。Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、ＰＴＦＥ膜上の直径約２５μｍの孔に二重分子層を形成し、二つの約１００μＬの緩衝溶液を分離する。全ての実験は、前記緩衝液中で行われる。デジタル変換器を備えた増幅器を用いて、単一チャネルの電流を測定する。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が前記緩衝液に連結され、シスコンパートメントは増幅器の接地端子に連結され、トランスコンパートメントは活性電極に連結される。
【0203】
前記二重分子層が単一ポアを実現した後、ＤＮＡポリヌクレオチド及びＰｉｆ１様ヘリカーゼを、電気生理学的チャンバーのシスコンパートメントの７０μＬ緩衝液に添加し、前記ナノポアでの酵素－ＤＮＡ複合体の捕捉を開始する。必要に応じて、前記シスコンパートメントに二価金属（５ｍＭ ＭｇＣｌ２）及びＮＴＰ（２．８６μＭ ＡＴＰ）を添加することにより、ヘリカーゼのＡＴＰ酵素活性を活性化する。実験は、＋１８０ｍＶの定電位で実施される。
【0204】
２ 結果及び検討
結果から、ＤＮＡ構築体におけるＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動が観察され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の結果は、図５に示す通りである。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動は５０秒であり、前記ナノポアを通過する１０ｋＢに近いＤＮＡ構築体の転座に対応する。ここで、図６は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の部分領域の拡大図を示す。
結果から、ＤＮＡ構築体におけるＰｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動が観察され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の結果は、図５に示す通りである。Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動は５０秒であり、前記ナノポアを通過する１０ｋＢに近いＤＮＡ構築体の転座に対応する。ここで、図６は、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼにより制御されるＤＮＡ移動の部分領域の拡大図を示す。
【0205】
実施例５
本実施例は、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａの突然変異を有する配列番号５）及びＥｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａの突然変異を有する配列番号６）及びＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａの突然変異を有する配列番号８）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ鎖全体を如何に制御するかを検証する。
本実施例は、Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ（Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａの突然変異を有する配列番号５）及びＥｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａの突然変異を有する配列番号６）及びＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ及びＣ１４６Ａの突然変異を有する配列番号８）を例として、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼが単一ＭｓｐＡナノポアを通過するＤＮＡ鎖全体を如何に制御するかを検証する。
【0206】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ｂを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当配列番号１４の３’末端は、配列番号２４に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５の領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。当該ＤＮＡ構築体Ｂは、実施例４で用いられる構築体と類似し、相違とは、Ｅと標識される領域が配列番号２４に対応することである。
図４に示すようなＤＮＡ構築体Ｂを調製する。配列番号１３は、その５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに連結され、当該スペーサーは、配列番号１４の５’末端に連結され、当配列番号１４の３’末端は、配列番号２４に連結され、当該ＤＮＡ構築体の配列番号１５の領域は、配列番号１６（３’コレステロールテザーを有する）とハイブリダイズする。当該ＤＮＡ構築体Ｂは、実施例４で用いられる構築体と類似し、相違とは、Ｅと標識される領域が配列番号２４に対応することである。
【0207】
緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて、１０ｍＭ ＴｒｉＳ ｐＨ７．５）中のＤＮＡ構築体Ｂと緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）中のＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａを、室温下で３０分間プレインキュベートする。次に、ＤＮＡ／酵素のプレ混合物にＴＭＡＤを添加し、さらに３０分間インキュベートする。最後に、前記プレ混合物に緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ ＭｇＣｌ２）及びＡＴＰを添加する。
【0208】
電気的測定値は、室温で、緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから取得される。単一ポアをブロック共重合体に挿入した後、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ（Ｓｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａ（１ｎＭ 最終濃度））、ＤＮＡ（０．３ｎＭ 最終濃度）、燃料（ＡＴＰ、３ｍＭ 最終濃度）のプレ混合物を、単一ナノポア実験システムに添加する。各実験は、保持電位１８０ｍＶで２時間実施され、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動が監視される。
【0209】
２ 結果
ＤＮＡ構築体Ｂに対して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動を観察し、そのＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａの制御によるＤＮＡの移動の結果は、それぞれ図７～９に示す通りである。
ＤＮＡ構築体Ｂに対して、Ｐｉｆ１様ヘリカーゼの制御によるＤＮＡの移動を観察し、そのＳｐｈ ＣＢＨ８－Ａ９４Ｃ／Ａ３６１Ｃ／Ｃ１３６Ａ、Ｅｐｈ Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１４１Ａ又はＰｐｈ ＰｓｐＹＺＵ０５－Ｄ１０４Ｃ／Ａ３７５Ｃ／Ｃ１４６Ａの制御によるＤＮＡの移動の結果は、それぞれ図７～９に示す通りである。
【0210】
実施例６
本実施例において、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋの突然変異を有する配列番号６）及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋの突然変異を有する配列番号６）を例として、ヘリカーゼのいくつかのタイプの天然アミノ酸の置換又は欠失によって、ヘリカーゼを化学修飾又は処理する際の一つ又は複数の当該タイプの位置のアミノ酸の非特異的な修飾を回避し、酵素分子間の異質性を減少させ、異なる酵素分子がＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過する異なる核酸分子を制御する速度の均一性を向上させることを説明する。
本実施例において、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋの突然変異を有する配列番号６）及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋの突然変異を有する配列番号６）を例として、ヘリカーゼのいくつかのタイプの天然アミノ酸の置換又は欠失によって、ヘリカーゼを化学修飾又は処理する際の一つ又は複数の当該タイプの位置のアミノ酸の非特異的な修飾を回避し、酵素分子間の異質性を減少させ、異なる酵素分子がＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過する異なる核酸分子を制御する速度の均一性を向上させることを説明する。
【0211】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ｃを製造する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ｃを製造する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
【0212】
濃度 １０ｕＭのＡセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメントが合成されて連結されたセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントを、１：１：１の割合で、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加し、９８℃ １０ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、３００サイクル、６５℃ ５ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、４００サイクルのフローでアニーリング処理を行う（ここで、Ａセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントは、生工生物工学（上海）株式会社により提供される）。
【0213】
調製されたＤＮＡ構造体ＣとＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ又はＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋを、緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）中で、２５℃で３０分間プレインキュベートする。その後に最終濃度 １ｍＭのＴＭＡＤを添加して触媒処理が３０分間行う。最後に、磁気ビーズ精製を経て、精製されたＤＮＡ構造体／酵素混合物と末端が修復された１０ｋｂの定長の核酸ライブラリーの配列番号１７（Ｅ領域）とを、１．５：１のモル濃度比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの迅速連結反応系に添加し（下記表８に示すように、Ｔ４迅速連結（Ｒａｐｉｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）キットはＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ社により提供される）、室温で１０分間迅速ＴＡ連結される。連結生成物が磁気ビーズ精製された後、後続のシークエンシングシステムに投入される。
【0214】
【表8】
【0215】
電気的測定値は、１，２－ジエタノールアシル－グリセロ－３－コリンリン酸脂質二重分子層に埋め込まれたＭｓｐＡナノポアから取得される。Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、ＰＴＦＥ膜上の直径約２５μｍの孔に二重分子層を形成し、二つの約１００μＬの緩衝溶液を分離する。全ての実験は、前記緩衝液中で行われる。デデジタル変換器を備えた増幅器を用いて、単一チャネルの電流を測定する。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が前記緩衝液に連結され、シスコンパートメントは増幅器の接地端子に連結され、トランスコンパートメントは活性電極に連結される。前記二重分子層への単一ポアの埋め込みを実現した後、インキュベーションが完了したＤＮＡ／酵素混合物を電気生理学的チャンバーのシスコンパートメントの７０μＬ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．０）に添加し、３５℃の条件下で１８０ｍＶの定電位を印加し、前記ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）でのＤＮＡ構造体／酵素複合体の捕捉及びヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動を開始し、且つヘリカーゼにより制御されるＤＮＡの移動を監視し記録する。
【0216】
２ 結果
ヘリカーゼ配列上のいくつかのタイプの天然アミノ酸は、ヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動速度の均一性に影響を与え、ここで、当該タイプの天然アミノ酸は、ヘリカーゼの核酸結合ポケットに存在するか又は導入され、化学的又は生物学的修飾を行った後に核酸結合ポケットを縮小する。ヘリカーゼの当該タイプのアミノ酸の置換又は欠失が、ヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動速度の均一性に対する改善効果を検定及び分析するために、本実施例では、シークエンシングによって得られる各原始電流信号の時間を取得することによって、各原始電流信号の速度が、定長ライブラリーの塩基長に基づいて計算される。Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋにより制御される核酸ライブラリーのナノポアへの通過の電流信号を識別及び処理して、異なる核酸ライブラリーがナノポアを完全に通過する速度を計算し統計分析を行う。
ヘリカーゼ配列上のいくつかのタイプの天然アミノ酸は、ヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動速度の均一性に影響を与え、ここで、当該タイプの天然アミノ酸は、ヘリカーゼの核酸結合ポケットに存在するか又は導入され、化学的又は生物学的修飾を行った後に核酸結合ポケットを縮小する。ヘリカーゼの当該タイプのアミノ酸の置換又は欠失が、ヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動速度の均一性に対する改善効果を検定及び分析するために、本実施例では、シークエンシングによって得られる各原始電流信号の時間を取得することによって、各原始電流信号の速度が、定長ライブラリーの塩基長に基づいて計算される。Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋにより制御される核酸ライブラリーのナノポアへの通過の電流信号を識別及び処理して、異なる核酸ライブラリーがナノポアを完全に通過する速度を計算し統計分析を行う。
【0217】
図１２に示すように、図１２のＡにおいて、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋにより制御される核酸のナノポアへの通過の速度はマルチピーク分布を呈するが、図１２のＢにおいて、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋにより制御される核酸の速度は単一ピーク分布を呈する。突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋ及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋにおいて、突然変異の位置 Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃは、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの核酸結合ポケットに関連する１Ｂドメイン及び２Ｂドメインにそれぞれ導入されたシステイン突然変異である。突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ／Ｅ２８６Ｋは、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの１Ｂドメイン及び２Ｂドメインに導入されたシステイン（Ｃ）以外の他の位置のシステインに対してＣ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄの突然変異を行い、Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄの突然変異は、ＴＭＡＤで触媒されるＤ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ間のジスルフィド結合の形成過程において他のシステイン位置（例えば、Ｃ１１４、Ｃ１１９、Ｃ１４１、Ｃ３０８又はＣ４１９）に修飾が導入されて酵素の機能に影響を及ぼし、酵素分子間の異質性を引き起こし、速度がマルチピーク分布を呈することを回避することができる。ヘリカーゼにより制御される核酸分子のナノポアへの通過の移動速度のマルチピーク分布は、アルゴリズムが信号を識別する難しさを増加させるか又は塩基の識別に不利になり、ヘリカーゼ配列上のいくつかのタイプの天然アミノ酸を置換することにより、ヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動速度の均一性を効果的に改善することができるため、効果的なシークエンシングデータのスループット及び正確度を向上させることができる。
【0218】
実施例７
本実施例において、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄの突然変異を有する配列番号６）とＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗの突然変異を有する配列番号６）により制御される核酸のＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）への移動により生成された電流信号を比較分析することにより、ヘリカーゼと核酸のリン酸骨格、糖環又は塩基と相互作用するアミノ酸側鎖の電流信号への影響を説明し、さらにシークエンシングの正確度への影響を説明する。
本実施例において、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄの突然変異を有する配列番号６）とＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗ（Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗの突然変異を有する配列番号６）により制御される核酸のＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）への移動により生成された電流信号を比較分析することにより、ヘリカーゼと核酸のリン酸骨格、糖環又は塩基と相互作用するアミノ酸側鎖の電流信号への影響を説明し、さらにシークエンシングの正確度への影響を説明する。
【0219】
１ 材料及び方法
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ｄを製造する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
図４に示すようなＤＮＡ構造体Ｄを製造する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域であって、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
【0220】
濃度 １０ｕＭのＡセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメントが合成されて連結されたセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントを、１：１：１の割合で、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加し、９８℃ １０ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、３００サイクル、６５℃ ５ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、４００サイクルのフローでアニーリング処理を行う（ここで、Ａセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントは、生工生物工学（上海）株式会社により提供される）。
【0221】
調製されたＤＮＡ構造体ＤとＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ又はＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗを、２５℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）中で３０分間プレインキュベートし、最終濃度 １ｍＭのＴＭＡＤを添加して触媒処理を３０分間行い、磁気ビーズ精製を経て、精製されたＤＮＡ構造体／酵素混合物と配列番号２４及びその相補配列とのアニーリングにより形成された二本鎖ＤＮＡ標的配列（Ｅ領域）とを、１．５：１のモル濃度比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの迅速連結反応系に添加し（下記表９に示すように、Ｔ４迅速連結キットはＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ社により提供される）、室温で１０分間迅速連結する。連結生成物が磁気ビーズ精製された後、後続のシークエンシングシステムに投入される。
【0222】
【表9】
【0223】
電気的測定値は、１，２－ジエタノールアシル－グリセロ－３－コリンリン酸脂質二重分子層に埋め込まれたＭｓｐＡナノポアから取得される。Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、ＰＴＦＥ膜上の直径約２５μｍの孔に二重分子層を形成し、二つの約１００μＬの緩衝溶液を分離する。全ての実験は、前記緩衝液中で行った。デデジタル変換器を備えた増幅器を用いて、単一チャネルの電流を測定する。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が前記緩衝液に連結され、シスコンパートメントは増幅器の接地端子に連結され、トランスコンパートメントは活性電極に連結される。前記二重分子層への単一ポアの埋め込みを実現した後、インキュベーションが完了したＤＮＡ構造体及びヘリカーゼを電気生理学的チャンバーのシスコンパートメントの７０μＬ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６００ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．０）に添加し、３０℃の条件下で１８０ｍＶの定電位を印加し、前記ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）でのＤＮＡ構造体／酵素複合体の捕捉及びヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動を開始し、且つヘリカーゼにより制御されるＤＮＡの移動を監視し記録する。
【0224】
２ 結果
その結果、ＤＮＡ構造体がＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御されるＤＮＡの移動が観察された。図１３は、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御される標的核酸配列配列番号２４のナノポアへの通過の電流信号の特徴である。Ａ図は、シミュレーションの標的核酸 配列番号２４が一つずつナノポアを通過する移動により生成された電流信号の特徴である。Ｂ図は、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｆ／Ｆ１０３Ｗにより制御される標的核酸 配列番号２４のナノポアへの通過の移動により生成された実際の電流信号である。Ｃ図は、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄにより制御される標的核酸 配列番号２４のナノポアへの通過の移動により生成された実際の電流信号である。比較から分かるように、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗにより標的核酸配列番号２４のナノポアへの通過が制御される際にいくつかの電流階段信号（Ｂ図の矢印標識）が現れ、それにより挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）タイプのエラーの増加をもたらす。結果として、核酸塩基配列と相互作用するアミノ酸側鎖又は特定のドメイン位置の核酸塩基と相互作用するアミノ酸側鎖は、シークエンシングの正確度に影響を与える。
その結果、ＤＮＡ構造体がＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御されるＤＮＡの移動が観察された。図１３は、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御される標的核酸配列配列番号２４のナノポアへの通過の電流信号の特徴である。Ａ図は、シミュレーションの標的核酸 配列番号２４が一つずつナノポアを通過する移動により生成された電流信号の特徴である。Ｂ図は、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｆ／Ｆ１０３Ｗにより制御される標的核酸 配列番号２４のナノポアへの通過の移動により生成された実際の電流信号である。Ｃ図は、Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄにより制御される標的核酸 配列番号２４のナノポアへの通過の移動により生成された実際の電流信号である。比較から分かるように、突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－Ｄ９９Ｃ／Ａ３６６Ｃ／Ｃ１１４Ｖ／Ｃ１１９Ｖ／Ｃ１４１Ｓ／Ｃ３０８Ｓ／Ｃ４１９Ｄ／Ｆ１０３Ｗにより標的核酸配列番号２４のナノポアへの通過が制御される際にいくつかの電流階段信号（Ｂ図の矢印標識）が現れ、それにより挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）タイプのエラーの増加をもたらす。結果として、核酸塩基配列と相互作用するアミノ酸側鎖又は特定のドメイン位置の核酸塩基と相互作用するアミノ酸側鎖は、シークエンシングの正確度に影響を与える。
【0225】
実施例８
本実施例において、異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体を用いてＤＮＡ構造体のナノポアへの通過の移動を制御し、測定されたヘリカーゼは、テンプレート一本鎖ＤＮＡ又は相補一本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を有する。異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御される核酸のＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）への通過の移動の異なるパラメータを分析することにより、テンプレート一本鎖ＤＮＡ又は相補一本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用するヘリカーゼのアミノ酸の置換が、核酸のシークエンシングのレート及び正確度に対する影響を説明し、且つシークエンシングの正確度及び／又は速度を改善する複数の突然変異体を提供する。
本実施例において、異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体を用いてＤＮＡ構造体のナノポアへの通過の移動を制御し、測定されたヘリカーゼは、テンプレート一本鎖ＤＮＡ又は相補一本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも一つのアミノ酸の置換を有する。異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体により制御される核酸のＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）への通過の移動の異なるパラメータを分析することにより、テンプレート一本鎖ＤＮＡ又は相補一本鎖ＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用するヘリカーゼのアミノ酸の置換が、核酸のシークエンシングのレート及び正確度に対する影響を説明し、且つシークエンシングの正確度及び／又は速度を改善する複数の突然変異体を提供する。
【0226】
１ 材料及び方法
図４に示すうなＤＮＡ構造体Ｅを調製する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
図４に示すうなＤＮＡ構造体Ｅを調製する。配列番号１３（Ｂ領域）は、５’末端が２０個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ａ領域）に連結され、３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサー（Ｃ領域）に連結され、当該スペーサーは、配列番号１４（Ｄ領域）の５’末端に連結され、当該ＤＮＡ構造体の配列番号１５（Ｆ領域）は、配列番号１６（Ｇ領域、５’端が２０個のｉＳＰＣ３を有し、且つ末端にコレステロールが修飾される）とハイブリダイズする。
【0227】
濃度 １０ｕＭのＡセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメントが合成されて連結されたセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントを、１：１：１の割合でｍアニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加し、９８℃ １０ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、３００サイクル、６５℃ ５ｍｉｎ、－０．１℃／０．６ｓ、４００サイクルのフローでアニーリング処理を行う（ここで、Ａセグメント、Ｂセグメント、Ｃセグメント、Ｄセグメント、Ｆセグメント、Ｇセグメントは生工生物工学（上海）株式会社により提供される）。
【0228】
調製されたＤＮＡ構造体とＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体を、２５℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）中で３０分間プレインキュベートし、異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体は、下記表に示す通りである。最終濃度 １ｍＭのＴＭＡＤを添加して触媒処理を３０分間行い、磁気ビーズ精製を経て、精製されたＤＮＡ構造体／酵素混合物と配列番号１７の標的核酸の二本鎖ＤＮＡ配列（Ｅ領域）とを、１．５：１のモル濃度比で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの迅速連結反応系に添加し（下記表に示すように、Ｔ４迅速連結キットはＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ社により提供される）、室温で１０分間迅速連結する。連結生成物が磁気ビーズ精製された後、後続のシークエンシングシステムに投入される。
【0229】
【表10】
【0230】
【表11】
【0231】
電気的測定値は、１，２－ジエタノールアシル－グリセロ－３－コリンリン酸脂質二重分子層に埋め込まれたＭｓｐＡナノポアから取得される。Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｅｌｌｅｒ技術により、ＰＴＦＥ膜上の直径約２５μｍの孔に二重分子層を形成し、二つの約１００μＬの緩衝溶液を分離する。全ての実験は前記緩衝液中で行われる。デデジタル変換器を備えた増幅器を用いて、単一チャネルの電流を測定する。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が前記緩衝液に連結され、シスコンパートメントは増幅器の接地端子に連結され、トランスコンパートメントは活性電極に連結される。前記二重分子層への単一ポアの埋め込みを実現した後、インキュベーションが完了したＤＮＡ／酵素混合物を電気生理学的チャンバーのシスコンパートメントの７０μＬ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．０）に添加し、３５℃の条件下で１８０ｍＶの定電位を印加し、前記ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）でのヘリカーゼ－ＤＮＡ複合体の捕捉及びヘリカーゼにより制御される核酸のナノポアへの通過の移動を開始し、且つヘリカーゼにより制御されるＤＮＡの移動を監視し記録する。
【0232】
２ 結果
異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体が配列番号１７核酸配列のナノポアへの通過を制御する時に生成された電流信号特徴（中位速度（ｍｅｄｉａｎ ｓｐｅｅｄ）、階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）、大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）などを含む）を分析することにより、テンプレート鎖又は相補鎖と相互作用するヘリカーゼのアミノ酸の置換が、核酸の移動を制御する酵素の能力に対する影響を説明し、さらに核酸のナノポアへの通過の移動を効果的に制御するヘリカーゼの突然変異体をスクリーニングし、シークエンシングの正確度及びスループット指標を改善する。上記パラメータの定義及び計算方法の概要は、以下の通りである。まず、定長のライブラリーシークエンシングの原始電流信号を一般的な配列比較アルゴリズム（例えば、動的時間計画）により対照塩基配列と切り分けて比較し、切り分けた電流信号及び対応する塩基配列情報を取得する。切り分けて比較した結果に基づいて、各パラメータをそれぞれ統計する。（１）中位速度（ｍｅｄｉａｎ ｓｐｅｅｄ）の計算方法は、実施例６で説明される通りである。（２）階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、原始電流信号に欠失した対照配列の対応する塩基を示し、欠失した塩基の数を対照配列の合計塩基数で割ると階段欠失率を得る。（３）階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、電流信号における挿入階段の割合を示し、比較結果に基づいて、二つ又は二つ以上の階段に一つの塩基が対合すれば、一つの挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）と見なされる。（４）不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）は、不均一な階段の割合を示す。理想的に、各塩基はいずれも原始電流信号の一つの均一な連続信号として発現する。実際に、この連続信号は相対的に均一であり、信号ブロックの電流値の標準偏差が一定の閾値より大きい場合に不均一階段と考えられる。不均一階段の数を階段総数で割ると、不均一階段占有率と定義する。（５）大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）は、大きな信号擾乱が発生する信号ブロック割合を示す。信号に対してハイパスフィルタリングを行い、相対的に高周波の成分を取得する。ハイパス以降の信号ブロックの標準偏差が一定の閾値より大きい場合、この信号ブロックにおいて高干渉が存在すると考えられる。高干渉ブロックの数を総数量で割ると、大電流擾乱発生率を得る。ここで、パラメータ（２）～（５）の数値が低いほど、シークエンシングの結果が高いと表明する。
異なるＥｐｈ－Ｐｅｉ２６ヘリカーゼの突然変異体が配列番号１７核酸配列のナノポアへの通過を制御する時に生成された電流信号特徴（中位速度（ｍｅｄｉａｎ ｓｐｅｅｄ）、階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）、大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）などを含む）を分析することにより、テンプレート鎖又は相補鎖と相互作用するヘリカーゼのアミノ酸の置換が、核酸の移動を制御する酵素の能力に対する影響を説明し、さらに核酸のナノポアへの通過の移動を効果的に制御するヘリカーゼの突然変異体をスクリーニングし、シークエンシングの正確度及びスループット指標を改善する。上記パラメータの定義及び計算方法の概要は、以下の通りである。まず、定長のライブラリーシークエンシングの原始電流信号を一般的な配列比較アルゴリズム（例えば、動的時間計画）により対照塩基配列と切り分けて比較し、切り分けた電流信号及び対応する塩基配列情報を取得する。切り分けて比較した結果に基づいて、各パラメータをそれぞれ統計する。（１）中位速度（ｍｅｄｉａｎ ｓｐｅｅｄ）の計算方法は、実施例６で説明される通りである。（２）階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、原始電流信号に欠失した対照配列の対応する塩基を示し、欠失した塩基の数を対照配列の合計塩基数で割ると階段欠失率を得る。（３）階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、電流信号における挿入階段の割合を示し、比較結果に基づいて、二つ又は二つ以上の階段に一つの塩基が対合すれば、一つの挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）と見なされる。（４）不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）は、不均一な階段の割合を示す。理想的に、各塩基はいずれも原始電流信号の一つの均一な連続信号として発現する。実際に、この連続信号は相対的に均一であり、信号ブロックの電流値の標準偏差が一定の閾値より大きい場合に不均一階段と考えられる。不均一階段の数を階段総数で割ると、不均一階段占有率と定義する。（５）大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）は、大きな信号擾乱が発生する信号ブロック割合を示す。信号に対してハイパスフィルタリングを行い、相対的に高周波の成分を取得する。ハイパス以降の信号ブロックの標準偏差が一定の閾値より大きい場合、この信号ブロックにおいて高干渉が存在すると考えられる。高干渉ブロックの数を総数量で割ると、大電流擾乱発生率を得る。ここで、パラメータ（２）～（５）の数値が低いほど、シークエンシングの結果が高いと表明する。
【0233】
異なる突然変異体の各パラメータの分析結果は、表１２に示す通りである。パラメータの分析結果から見ると、異なるアミノ酸の位置は、酵素により制御される核酸の移動に異なる影響を与え（移動速度、特に階段均一性、階段欠失率、階段挿入率のパラメータを含む）、これはアミノ酸側鎖が塩基の変位に対する干渉又は滑りから引き起こされる可能性がある。上記パラメータ値が小さいほど、酵素により制御される核酸の移動によって生成された電流信号の品質が良好であると考えられる。異なる突然変異体を評価する際に、各パラメータの影響を総合して突然変異の影響を考察する。本発明者らは、酵素により制御される核酸の移動のパラメータの差異に対するアミノ酸の位置の改造が、シークエンシングの正確度へ与える影響を検証するために、上記パラメータの間に大きな差異がある突然変異体を選択して後続の塩基識別のモデル訓練を行う。
【0234】
【表12】
【0235】
実施例９
本実施例において、実施例８の表１２における階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）、大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）の四つのパラメータ値を選択することにより、大きい差異を有する突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５を総合的に表現し、ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するを制御する大腸菌及びヒトゲノムのランダムな断片化ライブラリーのシークエンシングデータをそれぞれ収集し、同一アルゴリズムモデルを用いて異なる突然変異体の塩基識別モデルを訓練する。セットチップデータ及び試験チップデータの検証での異なる突然変異体のモデルの表現を評価することにより、実施例８の表１２における各パラメータは核酸の移動への異なる突然変異体の制御能力の差異を評価し、さらに適切な突然変異体を選択してナノポアの核酸シークエンシングに応用する。
本実施例において、実施例８の表１２における階段欠失率（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、階段挿入率（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）、不均一階段占有率（ｕｎｅｖｅｎ ｒａｔｉｏ）、大電流擾乱発生率（ｆｌｉｃｋ ｒａｔｉｏ）の四つのパラメータ値を選択することにより、大きい差異を有する突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５を総合的に表現し、ＭｓｐＡナノポア（配列番号１２）を通過するを制御する大腸菌及びヒトゲノムのランダムな断片化ライブラリーのシークエンシングデータをそれぞれ収集し、同一アルゴリズムモデルを用いて異なる突然変異体の塩基識別モデルを訓練する。セットチップデータ及び試験チップデータの検証での異なる突然変異体のモデルの表現を評価することにより、実施例８の表１２における各パラメータは核酸の移動への異なる突然変異体の制御能力の差異を評価し、さらに適切な突然変異体を選択してナノポアの核酸シークエンシングに応用する。
【0236】
１ 方法
大腸菌及びヒトゲノムの核酸をランダムに断片化した後、図４に示されたＤＮＡ構造体のＥセグメントを置換し、Ａセグメント／Ｂセグメント／Ｃセグメント／Ｄセグメント／Ｆセグメントのアニーリングにより組み立てられた複合体に連結させる。連結生成物は磁気ビーズ精製された後、それぞれＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５ヘリカーゼの突然変異体とインキュベートしてＴＭＡＤ触媒処理を行い、処理生成物を精製した後にシークエンシング装置のチップに添加し、シークエンシングして信号を収集する。
大腸菌及びヒトゲノムの核酸をランダムに断片化した後、図４に示されたＤＮＡ構造体のＥセグメントを置換し、Ａセグメント／Ｂセグメント／Ｃセグメント／Ｄセグメント／Ｆセグメントのアニーリングにより組み立てられた複合体に連結させる。連結生成物は磁気ビーズ精製された後、それぞれＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５ヘリカーゼの突然変異体とインキュベートしてＴＭＡＤ触媒処理を行い、処理生成物を精製した後にシークエンシング装置のチップに添加し、シークエンシングして信号を収集する。
【0237】
２ 結果
突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５に対してシークエンシングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム及びヒトゲノム（ｈｕｍａｎ）のランダムな断片化ライブラリー配列の検証セットデータを複数回訓練した後のモデル正確度の結果が図１４に示され、それぞれ突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５を訓練した塩基識別モデルに対してそれぞれチップデータを試験した試験結果が表１３に示される。検証セットの正確度とは、訓練後に取得されたモデルが検証セットのチップデータを塩基識別した後、一つのライブラリー信号が対照配列と完全に対合する割合である。相応的に、試験チップの正確度とは、訓練されたモデルを用いて試験チップのデータを識別し、一つのライブラリー信号が対照配列と完全に対合する割合であり、実施例における正確度値は、統計後の中位値である。突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４は、それぞれ大腸菌ゲノム及びヒトゲノムの検証セットデータでの正確度がＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５より高く、試験チップにおいてもこの差異を検証し、試験チップ間及び試験チップと検証セットとの間の正確度の差異（特にチップ間の差異）はバッチ実験の再現性に関連する。本実施例の結果から分かるように、実施例８において異なる突然変異体が核酸の移動を制御するパラメータは、核酸の移動への酵素の制御能力の差異を効果的に評価することに対して効果的である。
突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５に対してシークエンシングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム及びヒトゲノム（ｈｕｍａｎ）のランダムな断片化ライブラリー配列の検証セットデータを複数回訓練した後のモデル正確度の結果が図１４に示され、それぞれ突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４及びＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５を訓練した塩基識別モデルに対してそれぞれチップデータを試験した試験結果が表１３に示される。検証セットの正確度とは、訓練後に取得されたモデルが検証セットのチップデータを塩基識別した後、一つのライブラリー信号が対照配列と完全に対合する割合である。相応的に、試験チップの正確度とは、訓練されたモデルを用いて試験チップのデータを識別し、一つのライブラリー信号が対照配列と完全に対合する割合であり、実施例における正確度値は、統計後の中位値である。突然変異体 Ｅｐｈ－Ｐｅｉ２６－２４は、それぞれ大腸菌ゲノム及びヒトゲノムの検証セットデータでの正確度がＥｐｈ－Ｐｅｉ２６－２５より高く、試験チップにおいてもこの差異を検証し、試験チップ間及び試験チップと検証セットとの間の正確度の差異（特にチップ間の差異）はバッチ実験の再現性に関連する。本実施例の結果から分かるように、実施例８において異なる突然変異体が核酸の移動を制御するパラメータは、核酸の移動への酵素の制御能力の差異を効果的に評価することに対して効果的である。
【0238】
【表13】
【0239】
上記で本発明の好ましい実施態様を詳細に説明したが、本発明は上記実施態様における特定の詳細に限定されるものではない。本発明の技術的主旨の範囲内で、本発明の技術的解決手段に対して様々な簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形はいずれも本発明の保護範囲内に属する。
【0240】
また、上記の具体的な実施態様に記述された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない状況で任意の適切な方式で組み合わせることができることに留意されたい。不必要な説明を避けるために、本発明は、様々な可能な組み合わせ方式を説明しない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】