(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023090807
(43)【公開日】2023-06-29
(54)【発明の名称】創薬のためのヒトスフェロイドの使用方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20230622BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230622BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230622BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20230622BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20230622BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230622BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
A61P25/00
A61P25/28
A61P9/06
A61P25/20
A61K45/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023071410
(22)【出願日】2023-04-25
(62)【分割の表示】P 2021544925の分割
【原出願日】2020-01-31
(31)【優先権主張番号】62/800,430
(32)【優先日】2019-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】517069228
【氏名又は名称】ステモニックス インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】カシアーノ カロメウ
(72)【発明者】
【氏名】ロバート ティー．フレモー，ジュニア
(57)【要約】
【課題】本発明は、一つの実施形態において、ヒト人工多能性幹細胞を使用して、治療薬の毒性および発見のための三次元ヒト器官組織を生成する方法を開示する。
【解決手段】一つの実施形態では、ハイスループットマイクロタイタープレートに野生型およびレット病の３Ｄスフェロイドの両方を負荷し、薬物ライブラリーに曝露し、野生型細胞の挙動に対する疾患回復についての活性を測定および分析する。
【選択図】なし
【解決手段】一つの実施形態では、ハイスループットマイクロタイタープレートに野生型およびレット病の３Ｄスフェロイドの両方を負荷し、薬物ライブラリーに曝露し、野生型細胞の挙動に対する疾患回復についての活性を測定および分析する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果を検出する方法であって、
直径が均一なヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと、一つまたは複数の試験化合物とを接触させる工程であって、ここで、前記スフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデルに由来する細胞から得られる工程；および
一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の前記効果を検出する工程
を含む、方法。
直径が均一なヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと、一つまたは複数の試験化合物とを接触させる工程であって、ここで、前記スフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデルに由来する細胞から得られる工程；および
一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の前記効果を検出する工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
各ウェルが一つのスフェロイドを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ウェルは、カルシウムを検出するのに有用な蛍光分子とさらに接触され、経時的な蛍光の量または変化は、一つまたは複数のウェルで検出される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記蛍光の量または変化は、蛍光のピークの量、一つまたは複数の前記ピークの振幅、一つまたは複数の前記ピーク間のピーク間隔、一つまたは複数のピークの幅、またはそれらの任意の組み合わせを検出する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記一つまたは複数のスフェロイドはニューロンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記一つまたは複数のスフェロイドはニューロンおよびアストロサイトを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む一つまたは複数のスフェロイドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、レット病（Ｒｅｔｔ ｄｉｓｅａｓｅ）患者由来の細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、ミクログリア細胞またはオリゴデンドロサイトを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
周皮細胞および内皮細胞を含む前記一つまたは複数のスフェロイドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞は前駆細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、約５００～約６００ミクロンの直径を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記一つまたは複数のスフェロイドは、約４５０～約５００ミクロンの直径を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記一つまたは複数のスフェロイドが、前記一つまたは複数の試験化合物と接触する前に少なくとも４～６週間培養される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
蛍光分子がＣａｌｃｉｕｍ ３、Ｃａｌｃｉｕｍ ４、Ｃａｌｃｉｕｍ ５、Ｃａｌｃｉｕｍ ６、Ｆｌｕｏ３、またはＦｌｕｏ４を含む、請求項３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ウェルを細胞膜非透過性クエンチャー（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と接触させることをさらに含む、請求項３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記蛍光の変化量は、スフェロイドおよび前記蛍光分子を含むが、前記試験化合物を含まないウェル内の前記蛍光と比較される、請求項３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ヒトにおけるレット症候群の一つまたは複数の症状を予防、抑制、または治療する方法であって、有効量の一つまたは複数の５－ＨＴ4受容体選択的アゴニスト、ザビシクロアルキルベンズイミダゾロン（ｚａｂｉｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ）、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン受容体での競合的アンタゴニスト、アセタゾラミド、選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、抗ムスカリン薬、選択的セロトニン受容体アゴニスト、ゴナドトロピン放出ホルモンの放出を促進する化合物、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、分岐鎖飽和脂肪酸アニオン、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害薬、グルクロニルトランスフェラーゼの阻害薬、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬、エポキシドヒドロラーゼの阻害薬、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ビインドール、抗コリン作用薬、ドーパミンアンタゴニスト、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、抗ヒスタミン薬、ベンゾチアジアジン、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の修飾薬、制吐薬、セロトニン逆作動薬、モノアミンオキシダーゼの阻害薬、またはアルカロイド、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項22】
前記組成物は、アセタゾラミド、アトモキセチン（トモキセチン）、塩酸ベンズヘキソール、ＢＩＭＵ－８、エレトリプタン臭化水素酸塩（ｅｌｅｔｒｉｐｔａｎ ＨＢｒ Ｓａｌｔ）、イロペリドン、トラゾドン（ベネフィキャット［Ｂｅｎｅｆｉｃａｔ］）、バルプロ酸ＤＰＡ、バクロフェン、塩酸ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ブロモインジルビン－３－オキシム、ビペリデン、シタロプラム、リンゴ酸クレボプリド、ドネペジル（ｂｏｎｅｐｅｚｉｌ）、フルマゼニル、二塩化ヒドロキシジン（ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＩＤＲＡ－２１、オンダンセトロン、パロキセチン、ピマバンセリン、メシル酸ピルリンドール、塩酸セレギリン、またはビンポセチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記組成物は、経口投与される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
前記組成物は、徐放性製剤である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項25】
前記投与は、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、髄腔内、脳室内、実質内、経網膜（ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎａｌ）、筋肉内、経皮、または直腸内である、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
前記組成物は、徐放性製剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記量は、成長遅延、正常な動きの喪失、協調の喪失、コミュニケーション能力の喪失、異常な手の動き、異常な眼球運動、呼吸障害、認知障害、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、脊柱側弯症、不規則な心拍、または睡眠障害を抑制、または治療する、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１９年２月２日に出願された米国出願第６２／８００，４３０号の出願日の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１９年２月２日に出願された米国出願第６２／８００，４３０号の出願日の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
生物医学研究のツールとしてのマウスや他の動物の使用は十分に確立されている。それらの存在は、低コストで、維持が容易で、急速に繁殖する哺乳動物モデルで、疾患の病因および治療プロファイリングを評価する能力を提供する。長年にわたり、自発的および化学的に誘発されたマウスモデルを研究するフォワードジェネティクスアプローチから、遺伝子工学によるノックアウトを介して遺伝子機能を研究するリバースジェネティクスアプローチへの転換が図られてきた。標準的な遺伝子工学技術を通じて、構成的および組織特異的な機能喪失変異の両方を研究することにより、遺伝子機能、経路、および疾患の病態生理学に関して膨大な量の情報が得られている。しかしながら、進歩は、従来の遺伝子工学に関連するコストによって妨げられてきた。その多くは、胚性幹（ＥＳ）細胞を標的とし、生殖細胞系伝達を確立し、選択可能なマーカーから離れて（ｂｒｅｅｄ ａｗａｙ）繁殖させるのに必要な時間に関連している。さらに、異なる近交系由来のＥＳ細胞における効率の欠如は、異なる遺伝的背景での表現型の探索を制限してきた。この制限は、単一の近交系背景の疾患モデルを、疾患浸透度が異なる可能性のある異種の患者集団と比較する際に考慮すべき重要なポイントである。
【0003】
動物実験は、ヒト用の薬の開発および試験において、試験管またはペトリ皿の実験だけでは得られない非常に貴重な情報を提供する。それらは、薬物がどのように吸収され、どのように生きている動物の体内に広がるか、およびそれが標的組織および他の組織にどのように影響するかを提供する。それらはまた、体がどのように薬物を処理して排除するかを伝える。ほとんどの薬物では、これは主に肝臓と腎臓によって行われる。これらの研究は、薬剤をヒトの治験に進めるかどうか、およびもしそうなら、ヒトにとって妥当な開始用量を決定するのに役立つ。しかしながら、種の違いのために、ヒト以外の動物で効果的かつ安全なものは、ヒトではそうではない可能性がある。
【0004】
動物研究に関する科学雑誌の出版物は、通常、「この効果は動物でのみ実証されており、人間では再現されない可能性がある」という免責事項を含む。そして、非常に正当な理由がある。レビューでは、ヒト以外の動物で医学的介入が試験された研究、およびその結果がヒトの試験で再現されたかどうかを調べた。
【0005】
ＮａｔｕｒｅやＣｅｌｌ等の権威ある科学雑誌で最も引用されている非ヒト動物研究では、その後のヒトランダム化試験で再現されたのはわずか３７％であり、ヒト試験では１８％が矛盾していた。より少ないジャーナルであまり引用されていない非ヒト動物の研究は、さらに低い成功率を有すると仮定するのが安全である。別のレビューでは、ヒトおよび非ヒト動物で行われた６つの医学的介入による治療効果（利益または害）は、該介入の半分のみで類似していることが見出された。すなわち、非ヒト動物とヒトの試験の結果は、しばしば一致しなかった。
【0006】
非ヒト動物試験とヒト試験の不一致は大きな問題を引き起こす可能性がある。非ヒト動物の治験段階への薬の開発はすでに信じられないほど高額の費用がかかるが、それをヒトの臨床試験に持ち込むことは莫大な費用、しばしば数千万ドルを追加する。有望な薬がヒトの治験で印象に残っていない場合、それは多くのお金、時間、および労力を浪費したことを意味する可能性がある。
【0007】
しかし、はるかに問題なのは、非ヒト動物の試験では安全であるように見えるが、ヒトでは安全ではないことが判明した薬である。結果は悲劇的なものになる可能性がある。たとえば、サリドマイド（つわりを治療する薬）は、妊娠中のラットおよびマウスに投与しても先天性欠損症を引き起さないが、ヒトでは、１９５０年代と１９６０年代に、重度の四肢奇形を含む先天性欠損症の国際的な流行を引き起こした。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、ヒトｉＰＳＣ細胞株から生成された組織を使用するヒトモデルの使用を提供し、それにより、薬物の安全性および治療試験のための動物モデルの代替を提供する。前臨床創薬および毒性試験のために目的の疾患をモデル化する細胞株が選択される。本開示のヒト組織疾患モデルは、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、目、筋肉、および／または骨等のほとんどの器官について生成することができる。アッセイは、組織モデルのいずれか一つ、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。一つの実施形態では、モデルは自閉症スペクトラム障害のモデルであり、したがって、スクリーニングで特定された治療化合物を使用して、自閉症スペクトラム障害または同様の障害、たとえばレット症候群の一つまたは複数の症状を予防、抑制、または治療することができる。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、小児期の初期に始まり、ヒトの生涯を通じて続く神経学的および発達障害である。それは、ヒトがどのように行動し、他者と交流し、コミュニケーションし、そして学ぶかに影響を与える。したがって、様々な異なる組織を有する薬物スクリーニングアッセイは、ＡＳＤを有する患者の一つまたは複数の器官または組織における一つまたは複数の症状を治療するのに有益な一つまたは複数の化合物を同定することができる。
【0009】
たとえば、レット症候群は、成長遅延、正常な動きおよび協調の喪失、コミュニケーション能力の喪失、異常な手の動きおよび眼球運動、呼吸障害、認知障害、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、脊柱側弯症、不規則な心拍、および睡眠障害を含むが、これらに限定されない神経学的および発達的症状（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ）を特徴とするため、多くの臓器系に影響を及ぼす。したがって、様々な異なる組織を有する薬物スクリーニングアッセイは、レット症候群患者の一つまたは複数の器官または組織における一つまたは複数の症状を治療するのに有益な一つまたは複数の化合物を同定することができる。
【0010】
一つの実施形態では、方法は、治療薬化合物の試験および発見のために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）によって生成されたヒト疾患組織モデルを提供する。
【0011】
一つの実施形態では、方法は、三次元構造（たとえば、スフェロイドまたは三次元スフェロイド形成因子（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｆｏｒｍ ｆａｃｔｏｒ））を有する治療薬化合物の試験および発見のためのｉＰＳＣ生成ヒト組織モデルを提供する。
【0012】
一つの実施形態では、方法は、三次元構造を有する治療薬化合物の試験および発見のためのｉＰＳＣ生成ヒト組織モデルを提供し、ハイスループットアレイ、たとえば、ハイスループットマイクロタイターアレイ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ａｒｒａｙ）にフォーマットされている。
【0013】
一つの実施形態では、方法は、三次元構造を有する治療薬化合物の試験および発見のためのｉＰＳＣ生成ヒト組織モデルを提供し、治療用化合物に曝露した場合に、たとえば、疾患対対照組織における組織応答に関する機能情報を生成することができる。
【0014】
一つの実施形態では、方法は、前臨床試験および臨床試験における非ヒト動物の使用に代わりうる、三次元構造を有する治療薬化合物の試験および発見のためのｉＰＳＣ生成ヒト組織モデルを提供する。
【0015】
一つの実施形態では、本開示は、３Ｄヒト細胞スフェロイド、たとえば、混合集団ヒト細胞ニューロンスフェロイド（ｍｉｘｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）の光学アッセイ、たとえば、機能的ＦＬＩＰＲアッセイまたは高含量高倍率光学顕微鏡法（ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を提供する。一つの実施形態では、試験の前に、スフェロイドを６～１４週間培養して、たとえば、脳機能のような成熟したヒトを模倣するための頑強な同期シナプスネットワークを誘導する。これらのスフェロイドの混合集団は、長期間にわたって予測可能かつ一貫して発火した。一つの実施形態では、本開示は、ＦＬＩＰＲおよびカルシウム取り込み蛍光振動（ｃａｌｃｉｕｍ ｕｐｔａｋｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を利用するヒト細胞３Ｄスフェロイドの混合集団のハイスループット光学アッセイを提供する。振動は化合物で調節することができ、振動発火はアゴニストまたはアンタゴニストで変えることができる。一つの実施形態では、細胞は、レット症候群の患者またはレット症候群のモデルである細胞に由来する。
【0016】
一つの実施形態では、本開示は、たとえば、レット症候群患者の細胞またはレット症候群のモデル由来のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果を検出するための光学的方法を提供する。この方法は、組織培養プレート、たとえば、レット症候群患者の細胞またはレット症候群のモデル由来のヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイド（たとえば、均一な直径のスフェロイド）を含むウェルを有するプレートと、一つまたは複数の試験化合物を接触させる工程；およびスフェロイドの振動の量または変化を光学的に検出する工程を含む。一つの実施形態では、プレートはマルチウェルプレートである。一つの実施形態では、スフェロイドを、カルシウムを検出するのに有用な蛍光分子とさらに接触させ、経時的な蛍光の量または変化を検出する。一つの実施形態では、蛍光の量または変化は、蛍光のピークの量、一つまたは複数のピークの振幅、一つまたは複数のピーク間のピーク間隔、一つまたは複数のピークの幅、またはそれらの任意の組み合わせを介して検出される。一つの実施形態では、スフェロイドはニューロンを含む。一つの実施形態では、スフェロイドはニューロンおよびアストロサイトを含む。一つの実施形態では、スフェロイドは心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。一つの実施形態では、スフェロイドはミクログリア細胞またはオリゴデンドロサイトを含む。一つの実施形態では、スフェロイドは周皮細胞および内皮細胞を含む。一つの実施形態では、スフェロイドは内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一つの実施形態では、細胞は分化した細胞である。一つの実施形態では、前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞である。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約５００～約６００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約４５０～約５００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドを、一つまたは複数の試験化合物と接触させる前に少なくとも４～６週間培養する。一つの実施形態では、蛍光分子は、Ｃａｌｃｉｕｍ ３、Ｃａｌｃｉｕｍ ４、Ｃａｌｃｉｕｍ ５、Ｃａｌｃｉｕｍ ６、Ｆｌｕｏ３、またはＦｌｕｏ４、またはそれらの組み合わせを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドを、細胞膜非透過性クエンチャー（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）とさらに接触させる。一つの実施形態では、蛍光の変化量は、一つまたは複数のスフェロイドおよび蛍光分子を含むが、試験化合物を含まない蛍光と比較される。一つの実施形態では、マルチウェルプレートでは、各ウェルは一つのスフェロイドを有する。
【0017】
ウェルごとに、たとえば、レット症候群患者またはレット症候群のモデルの細胞由来の、一つまたは複数の混合ヒト細胞スフェロイドを含むマルチウェルプレートも提供される。一つの実施形態では、スフェロイドはニューロンおよびアストロサイトを含む。一つの実施形態では、スフェロイドは心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。一つの実施形態では、スフェロイドはミクログリア細胞またはオリゴデンドロサイトを含む。一つの実施形態では、スフェロイドは周皮細胞および内皮細胞を含む。一つの実施形態では、スフェロイドは内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一つの実施形態では、スフェロイドはニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ハイスループット形式の皮質脳スフェロイドの顕微鏡画像、単一のウェル、およびスフェロイドサイズ分布を示す。
【図2】異なるウェルからキャプチャされた野生型（ＷＴ）およびレット（ＲＴＴ）の両方のスフェロイドのカルシウム振動活性を示す。
【図3-1】ＢＩＭＵ－８およびフルマゼニルの薬物曝露前後のＷＴおよびＲＴＴスフェロイドのスフェロイドカルシウム振動活性のマルチパラメトリックプロットを示す。
【図3-2】ＢＩＭＵ－８およびフルマゼニルの薬物曝露前後のＷＴおよびＲＴＴスフェロイドのスフェロイドカルシウム振動活性のマルチパラメトリックプロットを示す。
【図4-1】ボリノスタットおよびエピガロカテキンへの曝露前後のＷＴおよびＲＴＴスフェロイドのスフェロイドカルシウム振動活性のマルチパラメトリックプロットを示す。
【図4-2】ボリノスタットおよびエピガロカテキンへの曝露前後のＷＴおよびＲＴＴスフェロイドのスフェロイドカルシウム振動活性のマルチパラメトリックプロットを示す。
【図5】フルマゼニルおよびＢＩＭＵ－８薬物分子への曝露後のＷＴおよびＲＴＴスフェロイドのカルシウム振動活性を示しており、振動活性をＷＴの正常な動作に戻すことを実証している。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
定義
本発明を説明する際に、以下の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。
定義
本発明を説明する際に、以下の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。
【0020】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、記事の文法的目的語の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。例として、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つまたは複数のエレメントを意味する。
【0021】
本明細書で使用する用語「約」は、「約」という用語は、おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、その辺り（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ）、おおまかに（ｒｏｕｇｈｌｙ）、またはその周辺（ａｒｏｕｎｄ）を意味する。用語「約」を数値範囲と組み合わせて使用する場合、記載されている数値の上下の境界を拡張することにより、その範囲が変更される。たとえば、一つの態様では、用語「約」は、本明細書では、記載された値の上下の数値を２０％の分散で変更するために使用される。用語「約」は、数値または範囲を指す場合、値または範囲のある程度の変動性、たとえば、記載された値または範囲の記載された限界の１０％以内または５％以内を考慮に入れている。
【0022】
用語「疾患」および「障害」および「症候群」は、交換可能に使用される。
【0023】
「有効量」という表現は、障害に苦しむ個体への治療を記載するために使用される場合、疾患または障害の一つまたは複数の症状を予防または抑制または他の方法で治療するのに有効な化合物または組成物の量を指す。
【0024】
本明細書で使用される用語としての「実質的に」は、完全にまたはほぼ完全にを意味し、たとえば、成分を「実質的に含まない」組成物は、成分を含まないか、または組成物の関連する機能特性が微量の存在によって影響を受けないような微量を含むか、または化合物が「実質的に純粋」とは、ごくわずかな不純物しか存在しないことである。
【0025】
組成物の投与は、「予防的」または「治療的」目的のいずれかであってもよい。予防的に提供される場合、組成物は、疾患の症状または臨床的兆候が現れる前に提供される。組成物の予防的投与は、その後の症状または臨床的兆候を予防または軽減するのに役立つ。治療的に提供される場合、組成物は、疾患の症状または臨床的兆候の検出時に提供される。
【0026】
したがって、組成物は、疾患または症状の発症前（症状を予防または軽減するため）、または症状または疾患の臨床的兆候の開始後のいずれかに提供することができる。
【0027】
組成物は、その投与がヒトなどのレシピエント哺乳動物によって耐容性が示される場合、「薬理学的に許容される」と言われる。そのような薬剤は、投与量が生理学的に有意である場合、「治療上有効な量」で投与されると言われる。
【0028】
提供される「保護」は絶対的である必要はない。すなわち、対照集団または哺乳類のセットと比較して統計的に有意な改善がある場合、完全に予防または根絶する必要はない。保護は、症状または疾患の臨床的兆候の発症の重症度または速度を緩和することに限定される場合がある。
【0029】
本明細書の意味における「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、障害または疾患に関連する症状の緩和、またはそれらの症状のさらなる進行または悪化の阻止、または疾患または障害の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、または疾患または障害を治癒することを指す。同様に、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の化合物の「有効量」または「治療有効量」は、障害または状態に関連する症状を全体的または部分的に軽減するか、またはそれらの症状のさらなる進行または悪化を停止または遅延させるか、障害または状態を予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）または予防を提供する（ｐｒｏｖｉｄｅ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）化合物の量を示す。特に、「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間での有効量を指す。治療上有効な量はまた、本発明の化合物の毒性または有害な効果が治療的に有益な効果をしのぐ量である。
【0030】
当技術分野で周知の「塩」は、対イオンと組み合わせた、イオン形態のカルボン酸、スルホン酸、またはアミン等の有機化合物を含む。たとえば、それらのアニオン形態の酸は、金属カチオン、たとえばナトリウム、カリウム等のカチオン；ＮＨ４＋等のアンモニウム塩、またはテトラメチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウム塩を含む様々なアミンのカチオン、またはトリメチルスルホニウム等の他のカチオンと塩を形成することができる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩は、人間の消費が承認されており、塩化物塩またはナトリウム塩等の一般に無毒であるイオンから形成される塩である。「双性イオン」は、少なくとも２つのイオン化可能な基を有する分子内に形成することができるような内部塩であり、一方はアニオンを形成し、他方はカチオンを形成し、これらは互いにバランスをとるのに役立つ。たとえば、グリシン等のアミノ酸は双性イオンの形態で存在することができる。「双性イオン」は、本明細書の意味の範囲内の塩である。本発明の化合物は、塩の形態をとることができる。用語「塩」は、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を包含する。塩は「薬学的に許容される塩」であってもよい。用語「薬学的に許容される塩」は、製薬用途において有用性を与える範囲内の毒性プロファイルを有する塩を指す。それにもかかわらず、薬学的に許容されない塩は、たとえば本発明の化合物の合成、精製または製剤化の過程における有用性等、本発明の実施において有用性を有する高い結晶化度等の特性を有する可能性がある。
【0031】
好適な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製することができる。無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸を含む。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環式、カルボン酸およびスルホン酸のクラスの有機酸から選択することができ、該有機酸の例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４－ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）［ｅｍｂｏｎｉｃ （ｐａｍｏｉｃ)］、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β－ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸を含む。薬学的に許容されない酸付加塩の例は、たとえば過塩素酸塩およびテトラフルオロホウ酸塩を含む。
【0032】
化合物の好適な薬学的に許容される塩基付加塩は、たとえば、アルカリ金属、アルカリ土類金属を含む金属塩、およびたとえば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛塩等の遷移金属塩を含む 薬学的に許容される塩基付加塩はまた、たとえば、Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ－メチルグルカミン）およびプロカイン等の塩基性アミンから作製される有機塩も含む。薬学的に許容されない塩基付加塩の例は、リチウム塩およびシアン酸塩を含む。薬学的に許容されない塩は、一般に医薬品として有用ではないが、そのような塩は、たとえば、化合物の合成における中間体として、たとえば、再結晶によるそれらの精製において有用である可能性がある。これらの塩のすべては、たとえば、適切な酸または塩基を化合物と反応させることにより、対応する化合物から従来の手段によって調製することができる。用語「薬学的に許容される塩」は、無毒の無機または有機酸および／または塩基付加塩を指す。たとえば、本明細書に参照により組み込まれるＬｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｄｒｕｇｓ （１９８６）， Ｉｎｔ Ｊ． Ｐｈａｒｍ．， ３３， ２０１－２１７を参照されたい。
【0033】
「水和物」は、水分子との組成物中に存在する化合物である。組成物は、一水和物または二水和物等の化学量論量の水を含んでもよく、またはランダムな量の水を含んでもよい。本明細書で使用される用語としての「水和物」は固体形態を指す。すなわち、水溶液中の化合物は、水和されていてもよいが、本明細書で使用されている用語としての水和物ではない。
【0034】
「溶媒和物」は、水以外の溶媒が水を置換することを除いて、同様の組成物である。たとえば、メタノールまたはエタノールは「アルコール酸塩」を形成する可能性があり、これも化学量論的または非化学量論的であってもよい。本明細書で使用される用語としての「溶媒和物」は固体形態を指す。すなわち、溶媒溶液中の化合物は、溶媒和されていてもよいが、本明細書で使用されている用語としての溶媒和物ではない。
【0035】
例示的なアッセイ方法
一つの実施形態では、本開示は、ヒト誘導多能性幹細胞ｉＰＳｃを提供し、これは、その後、約５０：５０の比率でニューロンおよびアストロサイトを含むヒト皮質ニューロンに分化する。この比率は、特定の対象疾患に応じて、ニューロンまたはアストロサイトのいずれか１～９９％のケースバイケースで調整することができる。３Ｄスフェロイドは、約５０：５０のニューロンとアストロサイトの比率＋／－１０％で構成されている。３次元スフェロイドを分化および形成する方法、ならびにＦＬＩＰＲ光学技術を用いた機能試験は、係属中の特許出願第６２／５３２６６７号に記載されている。本発明の実施例では、レット症候群の原因となる遺伝子を保有することが知られている疾患モデル細胞株を使用する。
一つの実施形態では、本開示は、ヒト誘導多能性幹細胞ｉＰＳｃを提供し、これは、その後、約５０：５０の比率でニューロンおよびアストロサイトを含むヒト皮質ニューロンに分化する。この比率は、特定の対象疾患に応じて、ニューロンまたはアストロサイトのいずれか１～９９％のケースバイケースで調整することができる。３Ｄスフェロイドは、約５０：５０のニューロンとアストロサイトの比率＋／－１０％で構成されている。３次元スフェロイドを分化および形成する方法、ならびにＦＬＩＰＲ光学技術を用いた機能試験は、係属中の特許出願第６２／５３２６６７号に記載されている。本発明の実施例では、レット症候群の原因となる遺伝子を保有することが知られている疾患モデル細胞株を使用する。
【0036】
レット（ＲＴＴ）症候群は、乳児期に最初に認識され、ほとんどの場合女の子に見られるが、男の子にはめったに見られない、独特の出生後の神経障害である。レット症候群は、自閉症、脳性麻痺、または非特異的な発達遅延と誤診されることが最も多い。レット症候群は、ＭＥＣＰ２と呼ばれる遺伝子のＸ染色体上の変異によって引き起こされる。ＭＥＣＰ２遺伝子には２００以上の異なる変異が見られる。これらの変異のほとんどは、８つの異なる「ホットスポット」に見られる。レット症候群は、すべての人種および民族を襲い、世界中で１０，０００人に１人の女性の出生で発生する。レット症候群は出生後の神経障害である。変性疾患ではない。レット症候群は、認知、感覚、感情、運動、および自律神経機能に関与している脳機能の問題を引き起こす。これらは、学習、発話、感覚知覚（ｓｅｎｓｏｒｙ ｓｅｎｓａｔｉｏｎｓ）、気分、動き、呼吸、心機能、さらには咀嚼、嚥下、および消化を含む。
【0037】
レット症候群の症状は、明らかに正常またはほぼ正常な発達の初期の期間の後、生後６～１８カ月までに現れ、スキルの遅れまたは停滞がある。その後、彼女がコミュニケーションスキルおよび意図的な手の使用を失うと、退行の期間が続く。すぐに、常同的な手の動き、たとえば手洗い、歩行障害、および通常の頭の成長速度の低下が明らかになる。他の問題は、彼女が起きている間の発作および不規則な呼吸パターンを含む場合もある。初期の頃、彼女がイライラしてひどく泣くとき、孤立またはひきこもり（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）の期間がある場合がある。時間の経過とともに、運動の問題が増える可能性があるが、一般的に、過敏性は減少し、アイコンタクトおよびコミュニケーションは改善される。
【0038】
レット症候群は、ＭＥＣＰ２変異を特定するための簡単な血液検査で確認される。しかし、ＭＥＣＰ２変異は他の疾患でも見られるため、ＭＥＣＰ２変異の存在自体は、レット症候群の診断には十分ではない。診断は、変異の存在（分子診断）または診断基準の確認（観察できる兆候および症状に基づく臨床診断）、またはその両方を必要とする。レット症候群は、軽度から重度までの幅広い障害を呈する可能性がある。レット症候群の経過および重症度は、変異およびＸ染色体不活性化の場所、種類、重症度によって決まりる。したがって、同じ変異を有する同じ年齢の２人の女の子はまったく異なって見える可能性がある。
【0039】
本開示では、野生型（ＷＴ）およびレット病［Ｒｅｔｔ Ｄｉｓｅａｓｅ］（ＲＴＴ）の両方の皮質脳ヒト組織スフェロイドは、病状をほぼ通常の働きに戻すか、または回復（ｒｅｓｃｕｅ）するために脳活動を調節することができる治療用化合物を特定するためのハイスループットスクリーニングの目的で調製された。たとえば、使用される細胞株（対照または「ＷＴ」および疾患「ＲＴＴ」）は、レット病の表現型のない家族およびある家族由来であってもよい。
【0040】
本明細書に開示される方法は、一つの実施形態では、３８４ウェル丸底マイクロタイタープレートで３Ｄスフェロイドを作成することを含んでもよい。たとえば、その開示は本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／５３２，６６７号を参照されたい。スフェロイドが生成され、その後６週間以上成熟化されると、その時点で有望な治療用化合物の試験を開始することができる。本開示では、６～１４週間の成熟は、試験のための成熟範囲、たとえば、８～１０週間の成熟である。
【0041】
図１を参照すると、この画像および左は、各ウェルには、直径が約６００ミクロンのヒト組織ミクロスフェアがロードされており、各スフィアは約１０，０００個の細胞がある３８４ウェルのマイクロタイタープレートを示す。マイクロタイターウェル数は、プレートあたり２８～１５３６ウェル、または９６～３８４ウェルまでの幅があってもよい。各スフェロイドを形成する細胞の数は、２５００～５００００細胞または５０００～１５０００細胞までの幅があってもよい。右側の画像は、単一ウェル内のミクロスフェア上の均一性を示している。均一性は、非常に再現性のある結果を得て、ウェル間、およびプレート間の変動を制限するために、本発明において非常に重要である。下の画像は、マイクロタイターウェルの列全体の平均スフェロイドサイズを示すプロットである。スフェロイドの大きさは、１００ミクロン～５ミリメートル、または４００～８００ミクロンまでの幅があってもよい。
【0042】
図２を参照すると、この図は、治療薬への曝露前にランダムに選択されたウェルからのＷＴスフェロイドおよびＲＴＴスフェロイドの両方の例を示している。測定されている振動は、周囲条件で細胞に出入りするカルシウムフラックス由来のものである。振動は自発的であり、外因によって生成されない。測定はリアルタイムで行われ、データは、従来技術で周知であるＦＬＩＰＲと呼ばれる技術を使用して捕捉される。画像に見られるように、ＷＴスフェロイドは選択されたランダムウェルからの非常に規則的な周期的ピーク強度を有する。しかし、右側のＲＴＴ疾患スフェロイドモデルは非常に不安定で、やや予測不可能である。この所見は、レット表現型の患者に見られ、前述の記載で記載されている不安定な行動と一致する。データを分析するときは、複数の要因がＦＬＩＰＲソフトウェアによって記録される信号に寄与することを理解することが重要である。したがって、本開示では、スフェロイドから生成されたデータに意味があるかどうかを決定するために、７つのパラメータを記録する。測定されるパラメータは、たとえば、ピーク計数（ｐｅａｋ ｃｏｕｎｔ）、ピーク幅、平均ピーク間隔、ピーク間隔標準偏差、ピーク減衰時間、ピーク立ち上がり時間、および／またはピーク振幅である。ＷＴスフェロイドマルチパラメータデータを薬物曝露の前後のＲＴＴデータと比較することにより、有望な治療候補が病状をＷＴ正常状態に戻すのに有効であるかどうかを判断することができる。
【0043】
本開示では、２９８の化合物を含むＳＭＡＲＴライブラリをＷＴおよびＲＴＴの両方の成熟スフェロイドで数週間にわたって使用し、ＦＬＩＰＲデータを収集して潜在的な治療効果について分析した。化合物のＳＭＡＲＴ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｔｔ Ｔｈｅｒａｐｙ）ライブラリは、レット症候群およびその生物学的原因に厳密に焦点を当てた、現代のバイオインフォマティクス手法によって十分に精査されている。このライブラリは現在、イリノイ大学シカゴ校にある。Ｒｅｔｔｓｙｎｄｒｏｍｅ．ｏｒｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｂｏａｒｄは、購入または調製され、現在ライブラリに含まれている多くの化合物も推奨している。時間およびリソースの両方を節約し、レット症候群の創薬を加速するという目標を念頭に置いて、ＳＭＡＲＴライブラリの化合物は、レット症候群の研究に取り組んでいる研究者がすぐに利用することができる。
【0044】
図３を参照すると、これは、上の２つの画像のスフェロイドに影響を与えない媒体に曝露されたＷＴおよびＲＥＴＴスフェロイドの結果を示している。図中および下部には、ＳＭＡＲＴライブラリからの１マイクロモル用量のＢＩＭＵ－８およびフルマゼニルに曝露されたＲＴＴスフェロイドがある。図３に見られるように、ＢＩＭＵ－８およびフルマゼニルの両方が、図３の左上に示されているように、ＷＴスフェロイドに対して生成されたＲＴＴの病状をほぼ正常な多変量グラフに逆転または回復するのに有意な効果があった。
【0045】
これは、１マイクロモル濃度のボリノスタットおよびエピガロカテキンへのＷＴおよびＲＴＴ曝露が、スフェロイドの自発的カルシウム振動を回復または反転させる効果を示さなかった図４とはまったく対照的である（下の多変量プロット）。実際、それは薬が状態を悪化させた。
【0046】
図５を参照すると、これは、フルマゼニルおよびＢＩＭＵ－８に２週間の曝露時間にわたって曝露されたＷＴ、ＲＴＴ、およびＲＴＴスフェロイドのランダムマイクロタイターウェルからキャプチャおよびプロットされた自発的なカルシウムピークを示している。下の２つの画像からわかるように、薬剤候補は、細胞スフェロイドのピーク頻度および振幅の動作のＷＴ状態をほぼ回復した。これらの結果および多変量解析に基づいて、アッセイはＳＭＡＲＴライブラリの約１０％を治療候補として、また前臨床または臨床試験の可能性のある薬剤として特定した。ＳＭＡＲＴライブラリの対象となるレット症候群治療薬は、アセタゾラミド、アトモキセチン（トモキセチン）、塩酸ベンズヘキソール、ＢＩＭＵ－８、エレトリプタン臭化水素酸塩（ｅｌｅｔｒｉｐｔａｎ ＨＢｒ Ｓａｌｔ）、イロペリドン、トラゾドン（ベネフィキャット［Ｂｅｎｅｆｉｃａｔ］）、バルプロ酸ＤＰＡ、バクロフェン、塩酸ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ブロモインジルビン－３－オキシム、ビペリデン、シタロプラム、リンゴ酸クレボプリド、ドネペジル、フルマゼニル、二塩化ヒドロキシジン（ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＩＤＲＡ－２１、オンダンセトロン、パロキセチン、ピマバンセリン、メシル酸ピルリンドール、塩酸セレギリン、またはビンポセチンを含むが、これらに限定されない。これらの有望な治療法およびその派生物も、レット症候群の治療のためのよい候補である。レット症候群に効果的な化合物は、他の自閉症の状態にも効果的である可能性がある。
【0047】
２つ以上の異なる細胞型から形成されるもの等のスフェロイドは、任意選択で１つ以上の異なる成長因子を含む任意の好適な培地、および任意の好適な条件を使用して調製することができる。たとえば、ニューロンおよびアストロサイトから形成されるスフェロイドは、一つの実施形態では、以下の培地および／または条件のうちの一つまたは複数を使用して調製することができる： １×ＳＭ１ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標） Ｎｅｕｒｏｎａｌ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ；カタログ番号０５７９２； ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ （カタログ番号７８００５； ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ （カタログ番号； ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号ＳＶ３００１０； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞を、５％ＣＯ2および高湿度のインキュベーター内で３７℃に維持される。
【0048】
本主題は、プレート、たとえば、均一な直径のヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイド、蛍光分子を含むウェルを有するマルチウェルプレートとの接触を含む、カルシウムを検出するのに有用な蛍光分子、および一つまたは複数の試験化合物；および任意選択で各ウェルにおいて、経時的な蛍光の量または変化を光学的に検出する。様々な例において、この方法は、蛍光のピークの量、一つまたは複数のピークの振幅、一つまたは複数のピーク間のピーク間隔、一つまたは複数のピークの幅、またはそれらの任意の組み合わせ。様々な例において、前述の方法は、ニューロンを含むスフェロイド、またはニューロンおよびアストロサイトを含むスフェロイド、または心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞を含む、またはスフェロイドはがん細胞を含む。前述の様々な例において、スフェロイドは、複数の異なる細胞型を含んでもよい。前述の例では、いくつかの例は、細胞がヒトｉＰＳ細胞に由来するものが含まれる。いくつかの例では、細胞は分化した細胞である。一部の例では、細胞は前駆細胞である。前駆細胞を使用する一部の例では、前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞である。
【0049】
前述の様々な方法において、スフェロイドは、約５００～約６００ミクロンの直径または約４５０～約５００ミクロンの直径を有してもよい。前述の様々な方法では、スフェロイドは少なくとも６週間培養されていてもよい。前述の様々な方法では、蛍光分子がＣａｌｃｉｕｍ ３、Ｃａｌｃｉｕｍ ４、Ｃａｌｃｉｕｍ ５、Ｃａｌｃｉｕｍ ６、Ｆｌｕｏ３、またはＦｌｕｏ４を含む。
【0050】
一つの実施形態では、光学アッセイが提供され、たとえば３Ｄヒト細胞スフェロイドの機能的ＦＬＩＰＲアッセイまたは高含量高倍率光学顕微鏡法、たとえばスフェロイドはニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、内皮細胞、または任意のそれらの組み合わせの混合集団で形成される。
【0051】
一つの実施形態では、マルチウェルフォーマットの、たとえば９６、３８４、または１５３６マイクロプレートウェル、たとえばラウンドボトムウェルフォーマットの３Ｄ混合集団ヒト細胞スフェロイドの、機能的ＦＬＩＰＲアッセイ等のマルチウェル光学アッセイが提供される。
【0052】
さらに、各マイクロプレートウェル内のスフェロイドが均一なサイズ、たとえば、直径が＋／－５０または＋／－２５ミクロンである、３Ｄ混合集団スフェロイドの光学的アッセイ、たとえば、機能的ＦＬＩＰＲアッセイが提供される。一つの実施形態では、ＦＬＩＰＲは、マイクロプレート内、たとえば、ウェル間、およびプレート間で非常に一貫性のある３Ｄニューロンベースの細胞スフェロイド上でリアルタイムの機能データを生成する。
【0053】
一つの実施形態では、本開示は、アゴニストまたはアンタゴニスト薬物負荷（ｄｒｕｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）にリアルタイムで応答する３Ｄ混合集団スフェロイドの機能的ＦＬＩＰＲアッセイを含む光学アッセイを提供する。
【0054】
一つの実施形態では、本開示は、ヒト一次細胞、ｉＰＳｃ、分化細胞、または他のヒト細胞株に由来する３Ｄ混合集団スフェロイドの光学アッセイ、たとえば、機能的ＦＬＩＰＲアッセイを提供する。
【0055】
例示的な治療方法および組成物
本開示は、自閉症スペクトラム障害またはレット症候群等の障害に関連する一つまたは複数の症状をヒトにおいて予防または軽減する、たとえば、抑制または治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、疾患の神経学的または発達的症状を抑制または治療するための方法が提供される。
本開示は、自閉症スペクトラム障害またはレット症候群等の障害に関連する一つまたは複数の症状をヒトにおいて予防または軽減する、たとえば、抑制または治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、疾患の神経学的または発達的症状を抑制または治療するための方法が提供される。
【0056】
成長遅延、正常な動きおよび協調の喪失、コミュニケーション能力の喪失、異常な手および眼球運動、呼吸障害、認知障害、発作、脊柱側弯症、不規則な心拍、または睡眠障害を特徴とする疾患のリスク、進行または発症を軽減するための方法も提供される。
【0057】
リスクを軽減する、重症度を軽減する、またはレット病の進行または発症を遅らせるための方法がさらに提供される。
【0058】
一つの実施形態では、投与される組成物は、５－ＨＴ4受容体選択的アゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ザビシクロアルキルベンズイミダゾロンを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ベンゾジアゼピンを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ベンゾジアゼピン受容体での競合的アンタゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、アセタゾラミドを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、抗ムスカリン薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、選択的セロトニン受容体アゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ゴナドトロピン放出ホルモンの放出を促進する化合物を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、選択的セロトニン再取り込み阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、分岐鎖飽和脂肪酸アニオンを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害薬、グルクロニルトランスフェラーゼの阻害薬、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬、またはエポキシドヒドロラーゼの阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、局所的に作用する、たとえば局所麻酔薬および鎮痛薬の特性を有する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ビインドール、たとえばインディルビンを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、抗コリン作用薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、制吐または運動促進特性を有するドーパミンアンタゴニストを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、選択的アセチルコリンエステラーゼ阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、抗ヒスタミン薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ベンゾチアジアジンを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の正のアロステリック調節を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、制吐薬（ａｎｔｉ－ｍｉｍｅｔｉｃ）を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、選択的セロトニン逆作動薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、モノアミンオキシダーゼの阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、モノアミンオキシダーゼの可逆的阻害薬、たとえばモノアミンオキシダーゼＡの選択的で可逆的な阻害薬を含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、アルカロイドを含む。一つの実施形態では、投与される組成物は、ビンカアルカロイドを含む。
【0059】
一つの実施形態では、組成物は、ＢＩＭＵ－８を含む。一つの実施形態では、組成物は、フルマゼニルを含む。一つの実施形態では、組成物は、アセタゾラミドを含む。一つの実施形態では、組成物は、Ｎ－メチルアセタゾラミドを含む。一つの実施形態では、組成物は、アトモキセチン（トモキセチン）を含む。一つの実施形態では、組成物は、塩酸ベンズヘキソールを含む。一つの実施形態では、組成物は、エレトリプタンを含む。一つの実施形態では、組成物は、イロペリドンを含む。一つの実施形態では、組成物は、トラゾドンを含む。一つの実施形態では、組成物は、バルプロ酸塩を含む。一つの実施形態では、組成物は、バクロフェンを含む。一つの実施形態では、組成物は、塩酸ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む。一つの実施形態では、組成物は、ブロモインジルビン－３－オキシムを含む。一つの実施形態では、組成物は、イペリデンを含む。一つの実施形態では、組成物は、シタロプラムを含む。一つの実施形態では、組成物は、リンゴ酸クレボプリドを含む。一つの実施形態では、組成物は、ドネペジルまたはそのアナログを含む。たとえば、本明細書において参照によりその開示の全体が組み込まれるＳａｇｌｉｋ ｅｔ ａｌ． （Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０１６ Ｎｏｖ ２９；１２４：１０２６－１０４０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｅｊｍｅｃｈ．２０１６．１０．０４２）を参照されたい。一つの実施形態では、組成物は、二塩化ヒドロキシジンを含む。一つの実施形態では、組成物はＩＤＲＡ－２１を含む。一つの実施形態では、組成物はオンダンセトロン、ドラステロン、またはパロノセトロンを含む。一つの実施形態では、組成物はパロキセチンを含む。一つの実施形態では、組成物はピマバンセリンを含む。一つの実施形態では、組成物はメシル酸ピルリンドールを含む。一つの実施形態では、組成物は塩酸セレギリンを含む。一つの実施形態では、組成物はビンポセチンを含む。
【0060】
医薬組成物
静脈内、筋肉内、局所または皮下経路等による、または薬物を身体または身体の特定の器官および組織に送達することを可能にする任意の他の投与経路による中枢神経系への髄腔内、脳室内または実質内送達等、任意選択で、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンをさらに含む、投与、たとえば経鼻、非経口または経口投与に好適な、本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を有する医薬組成物。組成物は、当技術分野で知られているように、補助剤または賦形剤をさらに含んでもよい。本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を有する組成物は、一般に、個々の用量（単位用量）の形態で提示される。
静脈内、筋肉内、局所または皮下経路等による、または薬物を身体または身体の特定の器官および組織に送達することを可能にする任意の他の投与経路による中枢神経系への髄腔内、脳室内または実質内送達等、任意選択で、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンをさらに含む、投与、たとえば経鼻、非経口または経口投与に好適な、本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を有する医薬組成物。組成物は、当技術分野で知られているように、補助剤または賦形剤をさらに含んでもよい。本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を有する組成物は、一般に、個々の用量（単位用量）の形態で提示される。
【0061】
非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および／またはエマルジョンを含み、これらは、当技術分野で知られている補助剤または賦形剤を含んでもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸収を高めることができる。経口投与用の液体剤形は、一般に、液体剤形を含むリポソーム溶液を含んでもよい。リポソームを懸濁するための好適な形態は、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、および精製等の当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含むエリキシル剤を含む。不活性希釈剤に加えて、そのような組成物はまた、補助剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、または甘味剤、香味剤、または芳香剤を含んでもよい。
【0062】
本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を有する組成物を個体への投与に使用する場合、組成物の有効性を改善するために望ましい塩、緩衝液、アジュバント、または他の物質をさらに含んでもよい。
【0063】
一つの実施形態では、医薬組成物は、放出制御系（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）の一部であり、たとえば、ポンプを有するもの、またはポリマー材料で形成されたものである（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．（１９７４）； Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ （ｅｄｓ．）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）； Ｒａｎｇｅｒ ＆ Ｐｅｐｐａｓ， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２３：６１（１９８３）； ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２８：１９０（１９８５）； Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２５：３５１（１９８９）； Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．， ７１：１０５（１９８９）を参照のこと）。他の放出制御系はＬａｎｇｅｒによるレビューで考察されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１５２７（１９９０））。
【0064】
本明細書に記載の化合物の一つまたは複数を含む医薬組成物は、治療有効量の化合物、たとえば、スクリーニング方法によって同定されたもの、および薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認された、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を指す。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として使用することができる。好適な医薬品賦形剤は、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。これらの組成物は、坐剤として処方することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含んでもよい。好適な医薬担体の例は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、好適な量の担体とであると共に治療上有効である担体を含む。製剤は投与方法に従う必要がある。
【0065】
組成物は、たとえば、経口的に、不活性希釈剤等の薬学的に許容される媒体と組み合わせて、全身投与することができる。経口投与の場合、化合物は、一つまたは複数の賦形剤と組み合わせて、摂取可能なカプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェファー剤等の形態で使用することができる。そのような組成物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。もちろん、組成物および調製物のパーセンテージは変動してもよく、そして都合よく、所与の単位剤形の重量の約２～約６０％の間であってもよい。そのような有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な投与量レベルが得られるようなものである。
【0066】
組成物はまた、以下を含んでもよい：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；ショ糖、果糖、乳糖またはアスパルテーム等の甘味剤、またはペパーミント、冬緑油、またはチェリー香味料等の香味剤を添加することができる。他の様々な材料が存在していてもよい。たとえば、シロップ剤またはエリキシル剤は、化合物、甘味剤としてのショ糖または果糖、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、着色料、ならびにチェリーまたはオレンジフレーバー等の香味剤を含んでもよい。もちろん、徐放性製剤またはデバイスを含む、任意の単位剤形を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に許容され、使用される量において実質的に無毒でなければならない。
【0067】
組成物はまた、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、実質内または脳室内注入または注射、または液体製剤の送達が薬物送達に好適または適切である他の任意の投与経路によって送達することもできる。化合物の溶液は、水または好適な緩衝液で調製することができ、必要に応じて無毒の界面活性剤と混合することができる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物、ならびに油で調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤は、望ましくない微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【0068】
注射または注入に好適な医薬剤形は、任意選択でリポソームに封入された、無菌の注射可能または注入可能な液剤または分散剤の即時調製に適合される有効成分を含む無菌の水溶液または分散液または無菌の粉末を含んでもよい。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および保管の条件下で、無菌で、流動性があり、安定している必要がある。液体担体または媒体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒のグリセリルエステル、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または液体分散媒であってもよい。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成によって、分散剤の場合に必要な粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。望ましくない微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【0069】
滅菌注射液は、滅菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した他の様々な成分とともに適切な溶媒に必要な量の化合物を組み込むことによって調製され、その後、照射、蒸気（熱）またはフィルター滅菌、または本質的に細菌および／またはウイルス汚染のない製剤化をもたらす他の調製方法が続く。
【0070】
有用な液体担体は、水、アルコールまたはグリコール、または水－アルコール／グリコールブレンドを含み、その中で本化合物を、任意選択で無毒の界面活性剤の助けを借りて、有効レベルで溶解または分散させることができる。芳香剤および追加の抗菌剤等の補助剤を追加して、特定の用途に合わせて特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸収パッドから塗布するか、包帯（ｂａｎｄａｇｅ）および他の包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を含浸させるために使用するか、またはポンプタイプまたはエアロゾル噴霧器を使用して患部に噴霧することができる。
【0071】
組成物の有用な投与量は、動物モデルにおけるそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することによって決定することができる。
【0072】
例示的な実施形態
一つの実施形態では、スフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果を検出する方法が提供される。一つの実施形態では、この方法は、均一な直径のヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと一つまたは複数の試験化合物とを接触させることを含み、ここでスフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデル由来の細胞から得られる。一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果が、任意選択で対応する野生型細胞と比較して、検出され、たとえば、測定される。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、マルチウェルプレートのウェル内にある。一つの実施形態では、各ウェルは一つのスフェロイドを有する。一つの実施形態では、ウェルは、カルシウムを検出するのに有用な蛍光分子とさらに接触され、経時的な蛍光の量または変化が、一つまたは複数のウェルで検出される。一つの実施形態では、蛍光の量または変化は、蛍光のピークの量、一つまたは複数のピークの振幅、一つまたは複数のピーク間のピーク間隔、一つまたは複数のピークの幅、またはそれらの任意の組み合わせを検出することである。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ニューロンを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ニューロンおよびアストロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、細胞またはオリゴデンドロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、周皮細胞および内皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一つの実施形態では、細胞は、前駆細胞である。一つの実施形態では、前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞である。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約５００～約６００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約４５０～約５００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、一つまたは複数の試験化合物と接触する前に少なくとも６週間培養される。一つの実施形態では、蛍光分子はＣａｌｃｉｕｍ ３、Ｃａｌｃｉｕｍ ４、Ｃａｌｃｉｕｍ ５、Ｃａｌｃｉｕｍ ６、Ｆｌｕｏ３、またはＦｌｕｏ４を含む。一つの実施形態では、方法は、ウェルを細胞膜非透過性クエンチャー（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と接触させることをさらに含む。一つの実施形態では、蛍光の変化量は、スフェロイドおよび蛍光分子を含むが、試験化合物を含まないウェル内の蛍光と比較される
一つの実施形態では、スフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果を検出する方法が提供される。一つの実施形態では、この方法は、均一な直径のヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと一つまたは複数の試験化合物とを接触させることを含み、ここでスフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデル由来の細胞から得られる。一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果が、任意選択で対応する野生型細胞と比較して、検出され、たとえば、測定される。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、マルチウェルプレートのウェル内にある。一つの実施形態では、各ウェルは一つのスフェロイドを有する。一つの実施形態では、ウェルは、カルシウムを検出するのに有用な蛍光分子とさらに接触され、経時的な蛍光の量または変化が、一つまたは複数のウェルで検出される。一つの実施形態では、蛍光の量または変化は、蛍光のピークの量、一つまたは複数のピークの振幅、一つまたは複数のピーク間のピーク間隔、一つまたは複数のピークの幅、またはそれらの任意の組み合わせを検出することである。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ニューロンを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ニューロンおよびアストロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、細胞またはオリゴデンドロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、周皮細胞および内皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一つの実施形態では、細胞は、前駆細胞である。一つの実施形態では、前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞である。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約５００～約６００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、約４５０～約５００ミクロンの直径を有する。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、一つまたは複数の試験化合物と接触する前に少なくとも６週間培養される。一つの実施形態では、蛍光分子はＣａｌｃｉｕｍ ３、Ｃａｌｃｉｕｍ ４、Ｃａｌｃｉｕｍ ５、Ｃａｌｃｉｕｍ ６、Ｆｌｕｏ３、またはＦｌｕｏ４を含む。一つの実施形態では、方法は、ウェルを細胞膜非透過性クエンチャー（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と接触させることをさらに含む。一つの実施形態では、蛍光の変化量は、スフェロイドおよび蛍光分子を含むが、試験化合物を含まないウェル内の蛍光と比較される
【0073】
一つの実施形態では、ヒトにおける自閉症スペクトラム障害の一つまたは複数の症状を予防、抑制、または治療するための方法が提供される。一つの実施形態では、ヒトにおけるレット病の一つまたは複数の症状を予防、抑制、または治療するための方法が提供される。方法は、一つの実施形態では、有効量の一つまたは複数の５－ＨＴ4受容体選択的アゴニスト、ザビシクロアルキルベンズイミダゾロン（ｚａｂｉｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅ）、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン受容体での競合的アンタゴニスト、アセタゾラミド、選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、抗ムスカリン薬、選択的セロトニン受容体アゴニスト、ゴナドトロピン放出ホルモンの放出を促進する化合物、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、分岐鎖飽和脂肪酸アニオン、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害薬、グルクロニルトランスフェラーゼの阻害薬、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬、エポキシドヒドロラーゼの阻害薬、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ビインドール、抗コリン作用薬、ドーパミンアンタゴニスト、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、抗ヒスタミン薬、ベンゾチアジアジン、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の修飾薬、制吐薬、セロトニン逆作動薬、モノアミンオキシダーゼの阻害薬、またはアルカロイドを含む組成物をヒトに投与することを含む。一つの実施形態では、組成物は、アセタゾラミド、アトモキセチン（トモキセチン）、塩酸ベンズヘキソール、ＢＩＭＵ－８、エレトリプタン臭化水素酸塩（ｅｌｅｔｒｉｐｔａｎ ＨＢｒ Ｓａｌｔ）、イロペリドン、トラゾドン（ベネフィキャット［Ｂｅｎｅｆｉｃａｔ］）、バルプロ酸ＤＰＡ、バクロフェン、塩酸ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ブロモインジルビン－３－オキシム、ビペリデン、シタロプラム、リンゴ酸クレボプリド、ドネペジル（ｂｏｎｅｐｅｚｉｌ）、フルマゼニル、二塩化ヒドロキシジン（ｈｙｄｒｏｘｙｚｉｎｅ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＩＤＲＡ－２１、オンダンセトロン、パロキセチン、ピマバンセリン、メシル酸ピルリンドール、塩酸セレギリン、またはビンポセチンを含む。一つの実施形態では、組成物は経口投与される。一つの実施形態では、組成物は、徐放性製剤である。一つの実施形態では、投与は、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、髄腔内、脳室内、実質内、経網膜（ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎａｌ）、筋肉内、経皮、または直腸内である。一つの実施形態では、組成物は、徐放性製剤である。一つの実施形態では、量は、成長遅延、正常な動きの喪失、協調の喪失、コミュニケーション能力の喪失、異常な手の動き、異常な眼球運動、呼吸障害、認知障害、発作、脊柱側弯症、不規則な心拍、または睡眠障害を抑制、または治療する。
【0074】
ウェルごとに一つまたは複数の混合ヒト細胞スフェロイドを含むマルチウェルプレートも提供される。一つの実施形態では、スフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデル由来の細胞から取得される。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドはニューロンおよびアストロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞または上皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ミクログリア細胞またはオリゴデンドロサイトを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、周皮細胞および内皮細胞を含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、内皮細胞、ミクログリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一つの実施形態では、一つまたは複数のスフェロイドは、ニューロン、アストロサイト、心臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肺細胞、内皮細胞、または上皮細胞の前駆細胞を含む。一つの実施形態では、ウェルは、様々な細胞から形成されたスフェロイドを含む。
【0075】
上記の議論は、本発明の原理および様々な実施形態を例示することを意図している。上記の開示が完全に理解されると、異なる細胞型、たとえば心臓、肝臓、腎臓、肺、皮膚、膵臓、脾臓、骨を３Ｄスフェロイド形態因子で使用する等、多くの変形および改変が当業者に明らかになるであろう。以下の特許請求の範囲は、そのようなすべての変形および改変を包含すると解釈されることが意図されている。
【0076】
すべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書では、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して記載されており、例示の目的で多くの詳細が示されているが、本発明が追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書の特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更することができることは、当業者にとって明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の効果を検出する方法であって、
直径が均一なヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと、一つまたは複数の試験化合物とを接触させる工程であって、ここで、前記スフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデルに由来する細胞から得られる工程；および
一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の前記効果を検出する工程
を含む、方法。
直径が均一なヒト細胞の一つまたは複数のスフェロイドと、一つまたは複数の試験化合物とを接触させる工程であって、ここで、前記スフェロイドは、自閉症患者の細胞、レット症候群患者の細胞、またはレット症候群のモデルに由来する細胞から得られる工程；および
一つまたは複数のスフェロイドに対する一つまたは複数の化合物の前記効果を検出する工程
を含む、方法。
【外国語明細書】