特開 2023-92453 非分裂細胞のゲノム編集のための方法と組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023092453

(43)【公開日】2023-07-03

(54)【発明の名称】非分裂細胞のゲノム編集のための方法と組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20230626BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 5/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230626BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230626BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20230626BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20230626BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20230626BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/09 110

A61P27/02

A61P21/04

A61P25/00

A61P25/28

A61P13/12

A61P35/00

A61P1/00

A61P3/00

A61P5/00

A61P7/00

A61P9/00

A61P11/00

A61P17/00

A61P25/16

A61P25/14

A61P37/00

A61K31/7088

A61K35/76

A61K35/761

C12N15/86 Z

C12N15/85 Z

C12N9/10

【審査請求】有

【請求項の数】22

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022159696

(22)【出願日】2022-10-03

(62)【分割の表示】P 2019501985の分割

【原出願日】2017-07-14

(31)【優先権主張番号】62/363,164

(32)【優先日】2016-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513037649

【氏名又は名称】ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】恒川 雄二

(72)【発明者】

【氏名】イズピスア ベルモンテ，ファン カルロス

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 啓一郎

(72)【発明者】

【氏名】ヘルナンデス－ベニテス，レイナ

(72)【発明者】

【氏名】ウー，ジュン

【テーマコード（参考）】

4B050

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC10

4B050DD20

4B050LL01

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA15

4C084ZA16

4C084ZA33

4C084ZA36

4C084ZA51

4C084ZA59

4C084ZA66

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZC02

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA51

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA94

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB26

4C086ZC02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZC02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】遺伝性疾患の治療のための組成物の使用を提供する。
【解決手段】外来性ＤＮＡ配列に対して逆配向である標的配列を含む標的構築物、前記標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含み、ここで、前記外来性ＤＮＡ配列はゲノムと比較して少なくとも１つのヌクレオチドとの差異を含み、標的配列とゲノム中の標的核酸配列はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼにより認識され、前記ゲノム中の前記標的核酸配列は、一旦、前記外来性ＤＮＡ配列が正確な配向で前記非分裂細胞の前記ゲノムに組み込まれると、ゲノム中に存在しなくなる、組成物の使用を提供する。
【選択図】図１Ｆ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非分裂細胞のゲノムに外来性ＤＮＡ配列を組み込む方法であって、該方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列を含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼに非分裂細胞を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ゲノムと比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、方法。

【請求項2】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を修正する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を引き起こす、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される、ことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。

【請求項6】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１つに記載の方法。

【請求項7】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１乃至６の何れか１つに記載の方法。

【請求項8】

標的配列は、一旦、外来性ＤＮＡが正確な配向でゲノムに組み込まれると存在しなくなる、ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の方法。

【請求項9】

非分裂細胞は最終分化細胞を含む、ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか１つに記載の方法。

【請求項10】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項１乃至９の何れか１つに記載の方法。

【請求項11】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

標的配列は、ヌクレアーゼによって特異的に切断される配列である、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。

【請求項13】

標的構築物は、外来性ＤＮＡ配列に隣接する２つの標的配列を含む、ことを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１つに記載の方法。

【請求項14】

標的構築物はミニサークルを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１つに記載の方法。

【請求項15】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１つに記載の方法。

【請求項16】

非分裂細胞のゲノムにおけるＤＮＡ配列を改変する方法であって、該方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列を含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼに非分裂細胞を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、方法。

【請求項17】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を修正する、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を引き起こす、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される、ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項１６乃至１９の何れか１つに記載の方法。

【請求項21】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項１６乃至２０の何れか１つに記載の方法。

【請求項22】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項１６乃至２１の何れか１つに記載の方法。

【請求項23】

標的配列は、一旦、ゲノムＤＮＡ配列が改変されると存在しなくなる、ことを特徴とする請求項１６乃至２２の何れか１つに記載の方法。

【請求項24】

非分裂細胞は最終分化細胞を含む、ことを特徴とする請求項１６乃至２３の何れか１つに記載の方法。

【請求項25】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項１６乃至２４の何れか１つに記載の方法。

【請求項26】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

標的配列は、ヌクレアーゼによって特異的に切断される、ことを特徴とする請求項１６乃至２６の何れか１つに記載の方法。

【請求項28】

標的構築物は、外来性ＤＮＡ配列に隣接する２つの標的配列を含む、ことを特徴とする請求項１６乃至２７の何れか１つに記載の方法。

【請求項29】

標的構築物はミニサークルを含む、ことを特徴とする請求項１６乃至２８の何れか１つに記載の方法。

【請求項30】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、ことを特徴とする請求項１６乃至２９の何れか１つに記載の方法。

【請求項31】

ＤＮＡ配列を改変する方法であって、該方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列の２つのコピーとを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼに、ＤＮＡ配列を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、方法。

【請求項32】

外来性ＤＮＡ配列は突然変異を修正する、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

外来性ＤＮＡ配列は突然変異を引き起こす、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される、ことを特徴とする請求項３２又は３３に記載の方法。

【請求項35】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項３１乃至３４の何れか１つに記載の方法。

【請求項36】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項３１乃至３５の何れか１つに記載の方法。

【請求項37】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項３１乃至３６の何れか１つに記載の方法。

【請求項38】

ＤＮＡ配列は細胞のゲノムの少なくとも一部である、ことを特徴とする請求項３１乃至３７の何れか１つに記載の方法。

【請求項39】

細胞は分裂細胞である、ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

細胞は非分裂細胞である、ことを特徴とする請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

非分裂細胞は最終分化細胞である、ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

標的配列は、一旦、ＤＮＡ配列が正確な配向で標的配列により改変されると存在しなくなる、ことを特徴とする請求項３１乃至４２の何れか１つに記載の方法。

【請求項44】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項３１乃至４３の何れか１つに記載の方法。

【請求項45】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

標的配列は、ヌクレアーゼによって特異的に切断される、ことを特徴とする請求項３１乃至４５の何れか１つに記載の方法。

【請求項47】

必要とする被験体の遺伝性疾患を処置する方法であって、ここで、遺伝性疾患は、野生型遺伝子と比較して少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを持つ突然変異遺伝子から結果として生じ、前記方法は、野生型遺伝子又はその断片に相同するＤＮＡ配列と標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む組成物に、被験体の少なくとも１つの細胞を接触させる工程を含み、標的配列は、突然変異遺伝子又はその突然変異断片が野生型遺伝子又はその断片と置き換えられるようにヌクレアーゼによって認識される、方法。

【請求項48】

突然変異遺伝子は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される突然変異を含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項４７又は４８に記載の方法。

【請求項50】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項４７乃至４９の何れか１つに記載の方法。

【請求項51】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏである、ことを特徴とする請求項４７乃至４９の何れか１つに記載の方法。

【請求項52】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項４７乃至５１の何れか１つに記載の方法。

【請求項53】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項４７乃至５２の何れか１つに記載の方法。

【請求項54】

標的配列は、ヌクレアーゼによって特異的に切断される、ことを特徴とする請求項４７乃至５３の何れか１つに記載の方法。

【請求項55】

標的配列は、一旦、突然変異遺伝子又はその断片が正確な配向で野生型遺伝子又はその断片と置き換えられると存在しなくなる、ことを特徴と請求項４７乃至５４の何れか１つに記載の方法。

【請求項56】

遺伝性疾患は、軟骨無形成症、α１－アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、乳癌、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸癌、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性繊維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内障、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、色素性網膜炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・ザックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病から選択される、ことを特徴とする請求項４７乃至５５の何れか１つに記載の方法。

【請求項57】

細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される非分裂細胞である、ことを特徴とする請求項４７乃至５６の何れか１つに記載の方法。

【請求項58】

遺伝性疾患の処置に使用するための、野生型遺伝子又はその断片に相同するＤＮＡ配列と標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む、組成物であって、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、組成物。

【請求項59】

遺伝性疾患は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される突然変異により引き起こされる、ことを特徴とする請求項５８に記載の組成物。

【請求項60】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項５８又は５９に記載の組成物。

【請求項61】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項５８乃至６０の何れか１つに記載の組成物。

【請求項62】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項５８乃至６０の何れか１つに記載の組成物。

【請求項63】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項５８乃至６２の何れか１つに記載の組成物。

【請求項64】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項５８乃至６３の何れか１つに記載の組成物。

【請求項65】

標的配列は、ヌクレアーゼによって特異的に切断される、ことを特徴とする請求項５８乃至６４の何れか１つに記載の組成物。

【請求項66】

標的配列は、一旦、突然変異遺伝子又はその断片が正確な配向で野生型遺伝子又はその断片と置き換えられると存在しなくなる、ことを特徴と請求項５８乃至６５の何れか１つに記載の組成物。

【請求項67】

遺伝性疾患は、軟骨無形成症、α１－アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、乳癌、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸癌、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性繊維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内障、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、色素性網膜炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・ザックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病から選択される、ことを特徴とする請求項５８乃至６６の何れか１つに記載の方法。

【請求項68】

遺伝性疾患は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される非分裂細胞における突然変異によって引き起こされる、ことを特徴とする請求項５８乃至６７の何れか１つに記載の組成物。

【請求項69】

外来性ＤＮＡ配列と少なくとも２つの標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む、組成物であって、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、組成物。

【請求項70】

組成物は非分裂細胞を含む、ことを特徴とする請求項６９に記載の組成物。

【請求項71】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項６９又は７０に記載の組成物。

【請求項72】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項７１に記載の組成物。

【請求項73】

薬学的に許容可能なバッファー又は賦形剤を含む、請求項６９乃至７２の何れかに記載の組成物。

【請求項74】

外来性ＤＮＡ配列と、非分裂細胞のゲノムに挿入される標的配列の第１の半分及び第２の半分とを含む組成物であって、標的配列の第１の半分及び第２の半分はヌクレアーゼによって切断され、標的配列の第１の半分及び第２の半分は、外来性ＤＮＡ配列のゲノム上流及び下流に挿入される、組成物。

【請求項75】

外来性ＤＮＡ配列は、ウイルス及びヌクレアーゼによって非分裂細胞のゲノムに組み込まれる、ことを特徴とする請求項７４に記載の組成物。

【請求項76】

ウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項７５に記載の組成物。

【請求項77】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項７４乃至７６の何れか１つに記載の組成物。

【請求項78】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項７４乃至７７の何れか１つに記載の組成物。

【請求項79】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項７４乃至７８の何れか１つに記載の組成物。

【請求項80】

薬学的に許容可能なバッファー又は賦形剤を含む、請求項７４乃至７９の何れかに記載の組成物。

【請求項81】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、ことを特徴とする請求項７４乃至８０の何れか１つに記載の組成物。

【請求項82】

外来性ＤＮＡ配列と少なくとも１つの標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレアーゼ、及び非分裂細胞への遺伝子改変を行なうための指示書を含む、キットであって、標的配列はヌクレアーゼにより認識される、キット。

【請求項83】

標的構築物は少なくとも２つの標的配列を含む、ことを特徴とする請求項８２に記載のキット。

【請求項84】

標的構築物はミニサークルを含む、ことを特徴とする請求項８２又は８３に記載のキット。

【請求項85】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている、ことを特徴とする請求項８２乃至８４の何れか１つに記載のキット。

【請求項86】

ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される、ことを特徴とする請求項８２乃至８５の何れか１つに記載のキット。

【請求項87】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される、ことを特徴とする請求項８２乃至８６の何れか１つに記載のキット。

【請求項88】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである、ことを特徴とする請求項８２乃至８７の何れか１つに記載のキット。

【請求項89】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される、ことを特徴とする請求項８２乃至８８の何れか１つに記載のキット。

【請求項90】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、ことを特徴とする請求項８２乃至８９の何れか１つに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１６年７月１５日出願の米国仮特許出願第６２／３６３，１６４号の利益を主張するものであり、その内容は全体の引用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所により与えられたＮＩＨグラントＲ０１ＨＬ１２３７５５の下、政府支援により行なわれた。政府は本発明に一定の権利を有している。

【背景技術】

【0003】

機能突然変異の損失により引き起こされた有害な細胞表現型と戦うための主な治療方法のうち１つは、野生型遺伝子のコピーの細胞内輸送に依存する。この点に関して、急速に発展しつつある分野として、ウイルス媒介性の遺伝子置換療法は、導入遺伝子のコピー数及び発現レベルに対する不完全な制御の他、癌原遺伝子の挿入突然変異及び活性化などの有害な表現効果のリスクによって制限される、幾つかの解決策を提供している。相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用する部位特異的な導入遺伝子の組み込みは、このような問題に１つの解決策を提供する。しかし、ＨＤＲの有用性は、その効率の低さによって、大半の初代細胞において制限されている。更に、ＨＤＲは細胞周期のＳ／Ｇ２期にのみ生じ、これにより出生後の動物組織において普及している非分裂細胞へのアクセスを不能にする。

【発明の概要】

【0004】

幾つかの態様において、非分裂細胞のゲノムに外来性ＤＮＡ配列を組み込む方法が提供される。幾つかの実施形態において、前記方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列を含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼに非分裂細胞を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ゲノムと比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を修正する。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を引き起こす。幾つかの実施形態において、突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、一旦、外来性ＤＮＡが正確な配向でゲノムに組み込まれると存在しなくなる。幾つかの実施形態において、非分裂細胞は最終分化細胞を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより特異的に切断された配列である。幾つかの実施形態において、標的構築物は、外来性ＤＮＡ配列に隣接する２つの標的配列を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物はミニサークルを含む。

【0005】

付加的な態様において、非分裂細胞のゲノムにおけるＤＮＡ配列を改変させる方法が提供される。幾つかの実施形態において、前記方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列を含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼに非分裂細胞を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を修正する。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を引き起こす。幾つかの実施形態において、突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、一旦、ゲノムＤＮＡ配列が改変されると存在しなくなる。幾つかの実施形態において、非分裂細胞は最終分化細胞を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより特異的に切断される。幾つかの実施形態において、標的構築物は、外来性ＤＮＡ配列に隣接する２つの標的配列を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物はミニサークルを含む。

【0006】

付加的な態様において、ＤＮＡ配列を改変させる方法が提供される。幾つかの実施形態において、前記方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列の２つのコピーとを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼにＤＮＡ配列を接触させる工程を含み、ここで、外来性ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は突然変異を修正する。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は突然変異を引き起こす。幾つかの実施形態において、突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ配列は細胞のゲノムの少なくとも一部である。幾つかの実施形態において、細胞は分裂細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は非分裂細胞である。幾つかの実施形態において、非分裂細胞は最終分化細胞である。幾つかの実施形態において、標的配列は、一旦、ＤＮＡ配列が正確な配向で標的配列により改変されると存在しなくなる。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより特異的に切断される。

【0007】

更なる態様において、必要とする被験体の遺伝性疾患を処置する方法が提供される。幾つかの実施形態において、遺伝性疾患は、野生型遺伝子と比較して少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを持つ突然変異遺伝子から結果として生じる。幾つかの実施形態において、前記方法は、野生型遺伝子又はその断片に相同するＤＮＡ配列と標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む組成物に、被験体の少なくとも１つの細胞を接触させる工程を含む。幾つかの実施形態において、突然変異遺伝子又はその突然変異した断片が野生型遺伝子又はその断片と置き換えられるように、標的配列はヌクレアーゼによって認識される。幾つかの実施形態において、突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される突然変異を含む。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより特異的に切断される。幾つかの実施形態において、標的配列は、一旦、突然変異遺伝子又はその断片が正確な配向で野生型遺伝子その断片と置き換えられると存在しなくなる。幾つかの実施形態において、遺伝性疾患は、軟骨無形成症、αアンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、乳癌、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸癌、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性繊維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内障、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、色素性網膜炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・ザックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病から選択される。

【0008】

付加的な態様において、野生型遺伝子又はその断片に相同するＤＮＡ配列と標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む、組成物が提供される。幾つかの実施形態において、標的配列は、遺伝性疾患を処置する際の使用のために、ヌクレアーゼによって認識される。幾つかの実施形態において、遺伝性疾患は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、及び欠失から選択される突然変異によって引き起こされる。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより特異的に切断される。幾つかの実施形態において、標的配列は、一旦、突然変異遺伝子又はその断片が正確な配向で野生型遺伝子その断片と置き換えられると存在しなくなる。幾つかの実施形態において、遺伝性疾患は、軟骨無形成症、αアンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、乳癌、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸癌、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性繊維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内障、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、色素性網膜炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・ザックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病から選択される。

【0009】

付加的な態様において、外来性ＤＮＡ配列と少なくとも２つの標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む、組成物が提供される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、組成物は非分裂細胞を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能なバッファー又は賦形剤を含む。

【0010】

付加的な態様において、外来性ＤＮＡ配列と、非分裂細胞のゲノムに挿入される標的配列の第１の半分及び第２の半分とを含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、標的配列の第１の半分及び第２の半分はヌクレアーゼによって切断され、標的配列の第１の半分及び第２の半分は、外来性ＤＮＡ配列のゲノム上流及び下流に挿入される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は、ウイルス及びヌクレアーゼによって非分裂細胞のゲノムに組み込まれる。幾つかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能なバッファー又は賦形剤を含む。

【0011】

付加的な態様において、外来性ＤＮＡ配列と少なくとも１つの標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレアーゼ、及び非分裂細胞への遺伝子改変を行なうための指示書を含む、キットが提供される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、標的構築物は少なくとも２つの標的配列を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物はミニサークルを含む。幾つかの実施形態において、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター又はウイルスベクターに含まれている。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃ２ｃ６）、及びＣ２ｃ３から選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼ及びＮｇＡｇｏヌクレアーゼから選択される。幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。

【図1A】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ａは、ＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）における相同組換え修復（ＨＤＲ）又はＨＩＴＩによる標的遺伝子修飾の概略図を示す。五角形はＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列である。五角形内の黒線はＣａｓ９切断部位である。０、１、又は２つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的部位を備えた、プロモーターを持たないＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（それぞれＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－０ｃ、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－１ｃ、及びＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－２ｃ）が、ＨＩＴＩ効率を測定するために使用された。ＨＤＲドナー（ｔＧＦＰ）が、ＨＤＲ効率を測定するために使用された。

【図1B】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｂは、ＨＤＲ及びＨＩＴＩによるＨＥＫ２９３細胞における標的遺伝子修飾の、代表的な画像を示す。スケールバーは１００μｍである。

【図1C】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｃは、ＨＤＲ及びＨＩＴＩによる標的遺伝子修飾の効率を示す。Ｎ＝３である。

【図1D】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｄは、異なるＨＩＴＩ標的化ベクターを用いたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の割合に関する経時的研究を示す。

【図1E】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｅは、異なるＨＩＴＩ標的化ベクターを用いた、初期継代（１０日目）及び後期継代（７９日目）でのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のＣｐＧメチル化状況を示す。２つの半分の矢印はバイサルファイトシーケンシングのためのプライマーを示す。

【図1F】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｆは、初代神経細胞におけるインビトロでのＨＩＴＩによる標的ＧＦＰノックインのための実験計画の概略図を示す。ＧＦＰを含むドナーＤＮＡ、Ｃａｓ９発現プラスミド、及びｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドは、Ｅ１４．５胚に由来するマウス初代神経細胞へと同時形質移入された。ＥｄＵは、形質移入後３日目から８日目まで処置された。

【図1G】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｇは、ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＴｕｂｂ３－ＭＣプラスミドで形質移入されたＧＦＰ＋ニューロンの代表的な画像を示す。スケールバーは１００μｍである。

【図1H】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｈは、ＥｄＵ＋又はＥｄＵ－何れかのニューロンにおける形質移入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞１つあたりのノックインＧＦＰ＋細胞の割合を示す。Ｎ＝３である。

【図1I】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｉは、ＨＤＲドナー（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ）、１カットのドナー（Ｔｕｂｂ３－１ｃ）、２カットのドナー（Ｔｕｂｂ３－２ｃ）、及びミニサークルドナー（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ）で形質移入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞１つあたりのノックインＧＦＰ＋細胞の割合を示す。^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ＝３、スチューデントｔ検定。

【図1J】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｊの左のパネルは、ＨＩＴＩドナーを用いた異なる挿入ＤＮＡ配列の概略図を示す。五角形はＣａｓ９標的配列である。五角形内の黒線はＣａｓ９切断部位である。下線を付けた配列はＰＡＭ配列である。ｐＡはポリＡである。右のパネルはＴｕｂｂ３－ＧＦＰの細胞内分布を示す。

【図1K】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｋの左のパネルは、Ｔｕｂｂ３コード領域の３’末端でのＴｕｂｂ３－２ｃ及びＴｕｂｂ３－ＭＣのドナー組込みの概略図を示す。半分の矢印は、組み込まれた配列を検出するためのＰＣＲプライマー対を示す。右のパネルはＰＣＲの結果である。

【図1L】インビトロでの分裂細胞及び非分裂細胞のための相同性に基づかない標的化組み込み（ＨＩＴＩ）方法の進行を示す。図１Ｌは、空ベクター、Ｃａｓ９（＋ＮＬＳ）、及びＣａｓ９（＋ＢＰＮＬＳ）で形質移入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞１つあたりのノックインＧＦＰ＋細胞の割合を示す。

【図2A】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ａは、子宮内電気穿孔法（ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を介した胎児脳におけるＨＩＴＩによる標的ＧＦＰノックインに関する実験計画の概略図を示す。ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９発現プラスミド（ＣＡＧ－Ｃａｓ９）、ｇＲＮＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド（ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ）、及びミニサークルドナー（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ）は、Ｅ１５．５マウス胚の脳に電気穿孔され、生後のＰ２１にて分析された。

【図2B】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｂは、子宮内電気穿孔法による胎児脳におけるＴｕｂｂ３遺伝子座でのＧＦＰノックインの代表的な画像を示す。スケールバーは１００μｍである。ｍＣｈｅｒｒｙは成功裡に形質移入された細胞を標識する。

【図2C】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｃは、全てのｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合によって測定されるノックイン効率を示す。Ｎ＝３である。

【図2D】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｄは、新生のマウス脳におけるＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰノックインのための実験計画の概略図を示す。誘導可能なＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９発現プラスミド（ＣＡＧ－ｆｌｏｘＳＴＯＰ－Ｃａｓ９）、タモキシフェン（ＴＡＭ）誘導可能なＣｒｅＥＲＴ２発現プラスミド（ＥＲＴ２－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２）、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＴｕｂｂ３－ＭＣは最初に、Ｅ１５．５マウス胚の脳へと電気穿孔された。出生後にＣａｓ９発現を誘導するために、タモキシフェンはＰ１０及びＰ１１にて注入され、その後Ｐ２１にて分析された。

【図2E】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｅは、ＨＤＲドナー（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ）又はミニサークルドナー（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ）を用いた誘導可能なＣａｓ９発現による新生児脳におけるＴｕｂｂ３遺伝子座でのＧＦＰノックインの代表的な画像を示す。スケールバーは１００μｍである。

【図2F】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｆは、全てのｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合によって測定されるようなタモキシフェン処置を用いた、又は用いない、ＨＤＲ及びＨＩＴＩドナーのノックイン効率を示す。Ｎ＝３である。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。

【図2G】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｇは、ＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰ－ＮＬＳ又はルシフェラーゼ遺伝子のノックインのための実験計画の概略図を示す。ＣＡＧ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びミニサークルのドナー（Ａｉ１４－ＧＦＰＮＬＳ－ＭＣ又はＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ）は、８週目に圧力媒介型形質移入及び／又は電気穿孔を介してマウスの腎臓又は筋肉に局所送達され、２週間後に分析された。

【図2H】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｈは、ルシフェラーゼ遺伝子ノックインの筋肉内注入後の２日目、８日目、及び１４日目でのルシフェラーゼシグナルのインビボの画像を示す。右脚（－Ｃａｓ９）は、空プラスミド、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣで送達された。左脚（＋Ｃａｓ９）は、ＣＡＧ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣで送達された。矢印は、筋肉中のルシフェラーゼシグナルを示す。

【図2I】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｉは、大腿四頭筋（上のパネル）及び皮筋層（下のパネル）へのＧＦＰ－ＮＬＳノックイン構築物の筋肉内電気穿孔後のＧＦＰ発現の免疫蛍光分析を示す。左のパネル（－Ｃａｓ９）は、空プラスミド、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ＧＦＰＮＬＳ－ＭＣで送達された。右のパネル（＋Ｃａｓ９）は、ＣＡＧ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ＧＦＰＮＬＳ－ＭＣで送達された。スケールバーは１００μｍである。矢印はＧＦＰシグナルを示す。

【図2J】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｊは、ルシフェラーゼ遺伝子ノックイン構築物の圧力媒介型の腎臓形質移入後の７日目及び１４日目での、ルシフェラーゼシグナルのインビボの画像を示す。左のマウス（－Ｃａｓ９）は、空プラスミド、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣで送達された。右のマウス（＋Ｃａｓ９）は、ＣＡＧ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣで送達された。矢印は、右腎中のルシフェラーゼシグナルを示す。

【図2K】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｋは、胃及び食道（Ｓｔ＋Ｅ）、心臓（Ｈ）、肝臓（Ｌｉ）、脾臓（Ｓｐ）、肺（Ｌｕ）、右（Ｒ）及び左（Ｌ）の腎臓（Ｋ）、膵臓（Ｐａ）、小腸（ＳＩ）、盲腸（Ｃｅ）、及び結腸（Ｃｏ）のエクスビボでのルシフェラーゼ画像化を示す。矢印は、右腎中のルシフェラーゼシグナルを示す。

【図2L】非ウイルスベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図２Ｌは、腎臓へのＧＦＰ－ＮＬＳノックイン構築物の電気穿孔後のＧＦＰ発現の免疫蛍光分析を示す。上のパネル（－Ｃａｓ９）は、空プラスミド、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ＧＦＰＮＬＳ－ＭＣで送達された。下のパネル（＋Ｃａｓ９）は、ＣＡＧ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡｉ１４－ＧＦＰＮＬＳ－ＭＣで送達された。スケールバーは１００μｍである。

【図3A】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ａは、Ｔｕｂｂ３遺伝子に３’でのノックインＧＦＰのためのＡＡＶベクターの概略図を示す。半分の矢印は、正確な遺伝子ノックインを検証するためのＰＣＲプライマー対を示す。

【図3B】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｂは、ＡＡＶ感染後のｐａｎ－ニューロンにおけるＴｕｂｂ３遺伝子座でのＧＦＰノックインの代表的な画像を示す。上のパネルはＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３のみを示す。下のパネルはＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３である。スケールバーは１００μｍである。

【図3C】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｃは、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３の感染後のＧＦＰシグナルの細胞内分布を示す。

【図3D】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｄは、ＰＣＲによる正確な遺伝子ノックインの検証を示す。

【図3E】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｅは、成人の脳における局所ＡＡＶ感染を介したＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰノックインのための実験計画の概略図を示す。

【図3F】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｆは、ＡＡＶを注入した脳部分におけるＧＦＰ＋ニューロンの代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバーは１００μｍである。

【図3G】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｇは、Ａｉ１４マウスのＲｏｓａ２６遺伝子座におけるＣＡＧプロモーターの下流でのノックインＧＦＰ－ＮＬＳのためのＡＡＶベクターの概略図を示す。矢印は、正確な遺伝子ノックインを検証するためのＰＣＲプライマー対を示す。

【図3H】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｈは、筋肉内（ＩＭ）注入を介したＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰ－ＮＬＳ遺伝子ノックインのための実験計画の概略図を示す。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰは、８週目に大腿四頭筋へと局所送達され、１２週目に分析された。

【図3I】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｉは、ＡＡＶのＩＭ送達後のＧＦＰ発現の免疫蛍光分析を示す。上のパネル（Ｃａｓ９）はＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰで送達された。下のパネル（＋Ｃａｓ９）は、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰで送達された。ジストロフィンは、筋肉細胞骨格タンパク質のためのマーカーとして使用された。スケールバーは１００μｍである。

【図3J】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｊは、ＰＣＲによる筋肉中の正確な遺伝子ノックインの検証を示す。

【図3K】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｋは、筋肉内（ＩＶ）ＡＡＶ注入を介したＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰ－ＮＬＳノックインのための実験計画の概略図を示す。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰは、Ｐ１にて静脈内を介して全身送達され、２週間後に分析された。

【図3L】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｌは、ＡＡＶのＩＶ注入後のＧＦＰ発現の免疫蛍光分析を示す。上のパネル（Ｃａｓ９）はＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰで送達された。下のパネル（＋Ｃａｓ９）は、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰで送達された。α－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びアルブミンは、それぞれ心臓及び肝臓のためのマーカーとして使用された。スケールバーは２００μｍである。

【図3M】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したインビボのＨＩＴＩを示す。図３Ｍは、ＰＣＲによる心臓及び肝臓の中の正確な遺伝子ノックインの検証を示す。

【図4A】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ａは、野生型及びＲＣＳのラット両方におけるＭｅｒｔｋ遺伝子の概略図を示す。五角形はＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列である。五角形内の黒線はＣａｓ９切断部位である。

【図4B】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｂは、Ｍｅｒｔｋ遺伝子修正ＡＡＶベクターの概略図を示す。周囲のイントロンを含むエクソン２は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列により挟まれ、且つＨＩＴＩによってＭｅｒｔｋのイントロン１内に組み込まれる。半分の矢印は、正確なノックインを検証するためのＰＣＲプライマー対を示す。

【図4C】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｃは、ＲＣＳラットにおけるＭｅｒｔｋ遺伝子修正のための実験計画の概略図を示す。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋは、３週目に網膜下注入によりＲＣＳラットへ局所送達され、７－８週目に分析された。

【図4D】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｄは、ＰＣＲによるＡＡＶを注入した目における正確な遺伝子ノックインの検証を示す。

【図4E】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｅは、ＡＡＶを注入した目における光受容体救出（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｓｃｕｅ）を示す網膜の形態を示す。光受容体外核層（ＯＮＬ）の保存の増大が、非常に薄いＯＮＬ（赤色の丸括弧）しかない未処置のＲＣＳの目に比べて観察された。スケールバーは１００μｍである。

【図4F】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｆの上のパネルは、ＡＡＶ注入後の陽性ＧＦＰシグナルを示す。下のパネルは、処置されたＲＣＳの目のＲＰＥにおけるトランスジェニックｒＭｅｒｔｋの陽性効果を実証する、光受容体におけるロドプシンの発現増加を示す。スケールバーは５０μｍである。矢印はＧＦＰ又はロドプシンのシグナルを示す。

【図4G】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｇは、桿体と錐体の組み合わせの反応の改善を示し（左、波形；右、定量化バー）、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋを注入した目におけるｂ波値の改善を実証する。

【図4H】ＨＩＴＩを介したＲＰのラットモデルの標的インビボ遺伝子修正を示す。図４Ｈは、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋを注入した目における、１０Ｈｚのフリッカー錐体反応の改善を示す。全ての棒グラフに関する動物の数は次の通りである：ＲＣＳラットはｎ＝８、通常のラットはｎ＝８、及びＲＣＳ＋ＡＡＶの群はｎ＝３である。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。

【図5A】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ａは、異なるドナーベクターを用いたＨＩＴＩの概略図を示す。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流にてＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、２つの平滑末端をもたらした。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的染色体配列は、異なるドナープラスミド（１カット、２カット、及びミニサークルのドナー）へと逆方向で加えられる。標的ゲノム遺伝子座の他、ドナープラスミドも、細胞中のＣａｓ９／ｇＲＮＡにより切断され、及び、線形化されたドナーＤＮＡは、古典的ＮＨＥＪ ＤＳＢ修復経路を介して標的部位にて組み込まれた。ドナーＤＮＡが正確な配向で組み込まれる場合、結合配列はＣａｓ９／ｇＲＮＡによる更なる切断から保護される。ドナーＤＮＡが逆配向で組み込まれる場合、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは、無傷のＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的部位により、組み込みドナーＤＮＡを組み込み部位から切断し続ける。五角形はＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列である。五角形内の黒線はＣａｓ９切断部位である。ＧＯＩは対象の遺伝子である。

【図5B】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ｂは、ＨＤＲ及びＨＩＴＩによる標的遺伝子修飾効率に対するＮＨＥＪ阻害剤（ＮＵ７０２６；３０μＭ）の効果を示す。Ｎ＝３である。Ｎ．Ｓは、有意でないことを意味する。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。

【図5C】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ｃは、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－１ｃドナーを用いたＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株のＨＩＴＩによるＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙノックインの後の、５’及び３’の結合部位の配列を示す。五角形はＣａｓ９標的配列である。五角形内の黒線はＣａｓ９切断部位である。下線を付けた配列はＰＡＭ配列である。

【図5D】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ｄは、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－２ｃドナーを用いたＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株のＨＩＴＩによるＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙノックインの後の、５’及び３’の結合部位の配列を示す。

【図5E】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ｅは、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＣドナーを用いたＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株のＨＩＴＩによるＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙノックインの後の、５’及び３’の結合部位の配列を示す。

【図5F】ＨＩＴＩのためのドナーベクターの最適化を示す。図５Ｆは、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＣドナーを用いたＨＩＴＩのための挿入方向の分析を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ－細胞からの単一コロニーからの逆に組み込まれたＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＣのＰＣＲ検出。４８のクローンのうちの１だけ（＃３０）が逆方向で組み込まれ、結合部位における１０ｂｐの欠失がＰＣＲ及び配列決定分析により明らかにされた。

【図6A】ＨＩＴＩのためのＣａｓ９の核輸送の最適化を示す。図６Ａは、異なる核移行シグナルを備えた一連のｄＣａｓ９構築物の概略図を示す。

【図6B】ＨＩＴＩのためのＣａｓ９の核輸送の最適化を示す。図６Ｂは、ｄＣａｓ９局在化のための指標としてＦｌａｇ抗体で染色される、形質移入されたＨＥＫ２９３細胞の代表的な免疫蛍光画像を示す。核はＤＡＰＩで示される。スケールバーは５０μｍである。

【図6C】ＨＩＴＩのためのＣａｓ９の核輸送の最適化を示す。図６Ｃは、異なるＮＬＳシグナルを備えたｄＣａｓ９の核／細胞質の比率を示す。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。

【図6D】ＨＩＴＩのためのＣａｓ９の核輸送の最適化を示す。図６Ｄは、ヒトＥＳＣにおけるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性のアガロースゲル画像特徴化を示す。

【図6E】ＨＩＴＩのためのＣａｓ９の核輸送の最適化を示す。図６Ｅは、ヒトＥＳＣにおけるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の定量特徴化を示す。図６Ｄと図６Ｅにおける結果は、ＫＣＮＱ１遺伝子、及び異なるＮＬＳを備えたＣａｓ９、即ち、Ｃａｓ９－ＮＬＳ（Ｃａｓ９／ＮＬＳなし）、Ｃａｓ９＋ＮＬＳ（１ＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＮＬＳ）、及びＣａｓ９＋ＢＰＮＬＳ（１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ）を標的とするｇＲＮＡを用いて行なわれる、ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイからのものである。２つの下側結合（ｌｏｗｅｒ ｂａｎｄｓ）は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼにより切断されたＤＮＡ産物である。ＮＨＥＪ（％）は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ媒介型の遺伝子修飾の割合を示す。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。

【図7】異なるドナーＤＮＡを備えたＴｕｂｂ３－ＧＦＰの細胞内局在を示す。ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、及び異なるドナーＤＮＡ（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ、Ｔｕｂｂ３－１ｃ、Ｔｕｂｂ３－２ｃ、又はＴｕｂｂ３－ＭＣ）で形質移入された初代神経細胞の代表的な蛍光画像。Ｔｕｂｂ３－ＧＦＰの異なる細胞内局在のパターンが、ドナーについて観察された。スケールバーは１００μｍである。

【図8A】マウス初代神経細胞におけるＧＦＰノックインのＤＮＡ配列決定を示す。Ｔｕｂｂ３－２ｃを備えたマウス初代神経細胞における、ＨＩＴＩによるＧＦＰノックインの後の５’及び３’の結合部位の配列。

【図8B】マウス初代神経細胞におけるＧＦＰノックインのＤＮＡ配列決定を示す。Ｔｕｂｂ３－ＭＣを備えたマウス初代神経細胞における、ＨＩＴＩによるＧＦＰノックインの後の５’及び３’の結合部位の配列。

【図9A】インビトロでのｈＥＳＣ由来のニューロン全体（ｐａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ）を示す。図９Ａは、ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、及び異なるドナーＤＮＡ（ｈＴＵＢＢ３－１ｃ又はｈＴＵＢＢ３－２ｃ）で形質移入された、ｈＥＳＣ由来のヒトニューロン全体の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバーは１００μｍである。

【図9B】インビトロでのｈＥＳＣ由来のニューロン全体を示す。図９Ｂは、ヒトニューロン全体におけるＴＵＢＢ３遺伝子座にて組み込まれたＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ分析を示す。

【図9C】インビトロでのｈＥＳＣ由来のニューロン全体を示す。図９Ｃは、ＴＵＢＢ３－１ｃドナーでの、ヒトニューロン全体におけるＨＩＴＩによるＧＦＰノックインの後の５’結合部位の配列を示す。

【図9D】インビトロでのｈＥＳＣ由来のニューロン全体を示す。図９Ｄは、ＴＵＢＢ３－２ｃドナー（図９Ｄ）での、ヒトニューロン全体におけるＨＩＴＩによるＧＦＰノックインの後の５’結合部位の配列を示す。

【図10A】マウス初代神経細胞におけるＡＡＶ媒介性のＨＩＴＩを示す。図１０Ａは、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３に感染したニューロンの代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバーは５０μｍである。

【図10B】マウス初代神経細胞におけるＡＡＶ媒介性のＨＩＴＩを示す。図１０Ｂは、ＨＩＴＩによるＧＦＰノックインの後の５’及び３’の結合部位の配列を示す。

【図11A】成体マウスにおけるＡＡＶの尾静脈注射を介したインビボでのＨＩＴＩを示す。図１１Ａは、Ａｉ１４マウスのＲｏｓａ２６遺伝子座におけるＣＡＧプロモーターの下流でのノックインルシフェラーゼのためのＡＡＶの概略図を示す。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ｌｕｃは、８週齢のＡｉ１４マウスに尾静脈注射を介して全身送達され、１２週目に分析された。

【図11B】成体マウスにおけるＡＡＶの尾静脈注射を介したインビボでのＨＩＴＩを示す。図１１Ｂは、ルシフェラーゼ遺伝子ノックイン構築物の尾静脈注射後１４日目及び２８日目での、ルシフェラーゼシグナルのインビボの画像を示す。矢印はルシフェラーゼシグナルを示す。

【図11C】成体マウスにおけるＡＡＶの尾静脈注射を介したインビボでのＨＩＴＩを示す。図１１Ｃは、睾丸（Ｔｅ）、胃及び食道（Ｓｔ＋Ｅ）、心臓（Ｈ）、肝臓（Ｌｉ）、脾臓（Ｓｐ）、肺（Ｌｕ）、右（Ｒ）及び左（Ｌ）の腎臓（Ｋ）、膵臓（Ｐａ）、脳（Ｂｒ）、下垂体（Ｐｉ）、右（Ｒ）及び左（Ｌ）の目（Ｅｙ）、舌（Ｔｏ）、小腸（ＳＩ）、盲腸（Ｃｅ）、及び結腸（Ｃｏ）のエクスビボでのルシフェラーゼ画像解析を示す。矢印は、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ｌｕｃを注入したマウスの肝臓におけるルシフェラーゼシグナルを示す。

【図11D】成体マウスにおけるＡＡＶの尾静脈注射を介したインビボでのＨＩＴＩを示す。図１１Ｄは、ＨＩＴＩ ＧＦＰ－ＮＬＳ遺伝子ノックインＡＡＶの尾静脈注射後の肝臓におけるＧＦＰ発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバーは２００μｍである。

【図12A】新生のマウスにおけるＩＶ注射を介したＧＦＰ－ＮＬＳ遺伝子ノックインを示す。図１２Ａは、ＧＦＰ－ＮＬＳノックインＡＡＶのＩＶ注射後の脳、筋肉、腎臓、副腎、脾臓、肺、及び目の脈絡叢におけるＧＦＰ発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。上のパネル（Ｃａｓ９）はＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰのみで送達された。下のパネル（＋Ｃａｓ９）は、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰで送達された。スケールバーは１００μｍである。

【図12B】新生のマウスにおけるＩＶ注射を介したＧＦＰ－ＮＬＳ遺伝子ノックインを示す。図１２Ｂは、ＩＶ ＡＡＶ注射を介したＨＩＴＩによるＧＦＰ－ＮＬＳノックイン後の心臓及び肝細胞の５’及び３’の結合部位の配列を示す。

【図13】ＡＡＶを注入した肝臓組織におけるオンターゲット部位及びオフターゲット部位での、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で媒介されたインデル頻度の次世代配列決定分析を示す。ＨＩＴＩ媒介性ゲノム修飾のインデル頻度を判定するために使用されたオンターゲット部位及びオフターゲット部位のリスト。「配列」のカラムにて灰色のヌクレオチドは、予測されたオフターゲット部位内の個々のミスマッチである。

【図14A】ＨＩＴＩを介して遺伝子を修正したＲＣＳラットの分析を示す。図１４Ａは、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋを注入したＲＣＳラットの目における、ＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋ由来のエクソン２と組み込み部位との間の、３’接続部位の配列を示す。

【図14B】ＨＩＴＩを介して遺伝子を修正したＲＣＳラットの分析を示す。図１４Ｂは、未処置のＲＣＳの目における大規模なＲＰＥ萎縮症（左）、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋ注射後のＲＰＥ萎縮症の減少（中央）、及び野生型対照（右）を示す、眼底写真を示す。矢印は、ＲＰＥ萎縮症による視認可能な大きな脈絡膜血管を実証した。

【図15A】ＧＦＰ ＨＩＴＩ ＡＡＶ９構築物を使用するノックインの効能を示す。図１５Ａは、Ａｉ１４マウスへの静脈内（ＩＶ）ＡＡＶ注射を介したＨＩＴＩによるインビボの標的ＧＦＰ－ＮＬＳノックインの概略図を示す。

【図15B】ＧＦＰ ＨＩＴＩ ＡＡＶ９構築物を使用するノックインの効能を示す。図１５Ｂは、９の血清型を持つＨＩＴＩ－ＡＡＶのＩＶ注射後の肝臓、心臓、及び大腿四頭筋における細胞１つ当たりの量的ＧＦＰノックインの効率を示す。^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図15C】ＧＦＰ ＨＩＴＩ ＡＡＶ９構築物を使用するノックインの効能を示す。図１５Ｃは、９の血清型を持つＨＩＴＩ－ＡＡＶのＩＶ注射後の肝臓、心臓、及び大腿四頭筋におけるＧＦＰ発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。

【図16A】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ａは、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）の処置のための概略図を示す。

【図16B】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｂは、血清型９を持つＬＭＮＡ遺伝子修正ＡＡＶベクターの概略図を示す。

【図16C】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｃは、１１８日目でのＰＣＲによる正確な遺伝子ノックインの検証を示す。

【図16D】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｄは、３５日目及び１１８日目でのｑＰＣＲによる遺伝子ノックインの効率を示す。

【図16E】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｅは、処置したマウス及び未処置のマウスに関する年齢に対する体重の累積プロットを示す。

【図16F】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｆは、処置したマウス対未処置のマウスに関する生存プロットを示す。

【図16G】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｇは、４か月齢のＬｍｎａ＋／＋（ＷＴ）、Ｌｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（－ＨＩＴＩ）、及びＨＩＴＩで処置したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}マウス（＋ＨＩＴＩ）の代表的な写真を示す。

【図16H】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｈは、ＨＩＴＩ処置後のＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}マウス及び未処置のマウス対野生型マウスからの脾臓の写真を示す。

【図16I】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｉは、ＬＡＫＩ ＨＩＴＩで処置したマウスの大動脈弓の組織学的検査（Ｈ＆Ｅ）、及び核密度の定量化を示す。スケールバーは５００μｍである。Ｒｙａｎ方法を用いた事後一元配置分散分析に従い、^＊ｐ＜０．０５であり、^＊＊＊ｐ＜０．００１であり、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【図16J】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｊは、ＬＡＫＩ ＨＩＴＩで処置したマウスの腎臓の組織学的検査（ＰＡＳ）、及び腎臓における糸球体の面積と網膜細管の直径の定量化を示す。スケールバーは２００μｍである。Ｒｙａｎ方法を用いた事後一元配置分散分析に従い、^＊＊ｐ＜０．０１であり、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【図16K】ＨＩＴＩを使用したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（ＬＩＫＩ）マウスの処置の結果を示す。図１６Ｋは、ＬＡＫＩ ＨＩＴＩで処置したマウスの脾臓の組織学的検査（Ｈ＆Ｅ）、及び脾臓における白色髄の面積の定量化を示す。スケールバーは５ｍｍである。Ｒｙａｎ方法を用いた事後一元配置分散分析に従い、^＊＊ｐ＜０．０１であり、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

ヌクレアーゼが設計された標的ゲノムは、基本的な生物医学研究を革命的に変化させ、遺伝子治療の大きな潜在性を有する。しかし、且つ急速な進歩にもかかわらず、インビボで標的とされた導入遺伝子の組込みの、需要の高い目標は、効果的な手法の欠如のせいで今なお定着していない。細胞を分割する際のゲノム編集は以前に記載されているが（例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４４（９）， ２０１６， Ｍａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：５３９－５４６， ２０１３， Ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４： １４２－１５３， ２０１４， Ｂａｃｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１２（１０） ２１５４－２１６２， ２０１５を参照）、このような技術は、成熟細胞及び組織のゲノム編集方法には有用でなかった。非分裂細胞の場合、成体組織の主要構成分である導入遺伝子の組込みは現在、現行の技術での標的とされたノックインにはアクセス不能である。これは、根本的な生物学的原理を解明すること、及び、広範囲の壊滅的な遺伝障害のための治療戦略を進展させることに障害を課す。本明細書には、強健な相同性に基づかない標的組込み（ＨＩＴＩ）方法、及び、インビトロで分裂細胞及び非分裂細胞の両方での十分な標的ノックイン、及びより重要なことに、新生及び成体のマウスの分裂終了細胞におけるインビボでのオンターゲット導入遺伝子挿入を可能にする組成物を開示する。更に、盲目の網膜色素変性症のラットモデル、及び早老性疾患であるハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群のマウスモデルを使用して、インビボでのＨＩＴＩの治療効力及び機能的救出（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｃｕｅ）を実証する前臨床データが、本明細書で提供される。本明細書で提示されるＨＩＴＩ方法は、基礎研究調査及び標的遺伝子治療の両方の研究のための新たな手段を開く。

【0014】

要するに、強健且つ効果的な相同性に基づかない標的組込み方法（ＨＩＴＩ）が本明細書で実証される。ＨＩＴＩは、培養細胞中の標的ノックインを容易にするだけでなく、非分裂細胞中のインビボでのレポーター遺伝子の効果的な標的組込みを可能にする。より重要なことに、ＨＩＴＩは、Ｍｅｒｔｋ遺伝子の機能的エクソンの標的挿入による盲目や網膜色素変性症の共通の原因のラットモデルにおける、機能欠失型突然変異を救出するために成功裡に適用されている。更に、ＨＩＴＩは、偶発的な点突然変異を抱く欠損コピーを交換するための、下流のエクソン及び３’ＵＴＲ配列の機能的コピーを含んでいる部分遺伝子の、ＬＭＮＡのイントロンへの標的挿入により、早老性、即ちハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群のマウスモデルにおける機能獲得型突然変異を救出するために成功裡に適用されている。成体の中枢神経系のインビボでの標的導入遺伝子ノックインをＨＩＴＩが可能にするという観察は以前に実証されておらず、基本的且つ翻訳上の神経科学研究を進歩させる助けとなる場合がある。幾つかの実施形態において、研究ツールは、神経細胞の活性に対する正確な細胞型に特異的な制御を可能にするために予め定められた遺伝子座の下流側への、チャネルロドプシンなどの光遺伝学的活性化因子の標的挿入を含む。幾つかの実施形態において、ＨＩＴＩはまた、生きている動物における細胞トレーシングのためのノックインレポーターの生成を可能にする。幾つかの実施形態において、これは、トランスジェニックツールが制限される動物モデル、例えば非ヒト霊長類における動物モデルの作成を可能にする。加えて、ＨＩＴＩは、幾つかの実施形態において、例えば白血病のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法における疾患の処置又は予防のための新たな機能を備えた標的細胞を与える、標的ノックイン合成ＤＮＡ配列を介して遺伝的強化を可能にする。幾つかの実施形態において、ＨＩＴＩ方法は、インビボでの標的遺伝子組換え治療のための、効果的且つ最適化された組織に特異的なインビボの送達戦略（ウイルス又は非ウイルス性のいずれか）と共に使用される。

【0015】

組成物
本明細書には、標的細胞又は宿主細胞におけるゲノムＤＮＡに変化を与えるための組成物が提供される。幾つかの実施形態において、このような組成物は、遺伝性疾患などの疾患を処置するのに有用である。幾つかの実施形態において、本明細書には、外来性ＤＮＡ配列と少なくとも２つの標的配列とを組成物含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む、組成物が提供され、標的配列はヌクレアーゼにより認識される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列と、非分裂細胞のゲノムに挿入される標的配列の第１の半分及び第２の半分とを含む組成物も提供され、標的配列の第１の半分及び第２の半分はヌクレアーゼによって切断され、標的配列の第１の半分及び第２の半分は、外来性ＤＮＡ配列のゲノム上流及び下流に挿入される。

【0016】

外来性ＤＮＡ配列
本明細書で提供される組成物は、外来性ＤＮＡ配列を含む標的構築物を含む。外来性ＤＮＡ配列は、標的ゲノムのゲノムＤＮＡへと組み込まれるＤＮＡの断片を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは遺伝子の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは遺伝子のエクソンを含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは遺伝子のイントロンを含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは、遺伝子のエンハンサー要素又はプロモーター要素を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは、遺伝子の３’部分に縮合される遺伝子の５’部分を含む遺伝子の、不連続の配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは野生型遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは突然変異遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡは野生型遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びβ－グルクロニダーゼのうち少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は遺伝子転写調節要素を含む。幾つかの実施形態において、遺伝子転写調節要素は、プロモーター配列又はエンハンサー配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は１つ以上のエクソン又はその断片を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は１つ以上のイントロン又はその断片を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は、３’非翻訳領域又は５’非翻訳領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は人工ＤＮＡ配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は核局在配列を含む。幾つかの実施形態において、外来性ＤＮＡ配列は核輸出配列を含む。

【0017】

ヌクレアーゼ切断により生成される切断末端は主に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）により修復される。非分裂細胞において、ヌクレアーゼ切断により生成される切断末端はＮＨＥＪにより修復される。ＮＨＥＪは、２つの切断末端上で行なわれ、これらは幾つかの実施形態において、欠失又は挿入されている塩基対などの非完全な修復をもたらす。ＮＨＥＪは、幾つかの実施形態において、切断部位内の相同性又は非相同性の外来性ＤＮＡ配列を組み込むために行なわれる。非相同性の外来性ＤＮＡ配列を備えたＮＨＥＪは、幾つかの実施形態において、挿入部位の１つ又は両方の末端での塩基対の欠失或いは挿入をもたらす。ＨＤＲは、外来性ＤＮＡ配列が、挿入部位の各側に対応する５’及び３’の両末端に相同性の領域を含む時、切断部位へと外来性ＤＮＡ配列をシームレスに挿入するために使用される。

【0018】

外来性ＤＮＡ配列は、幾つかの実施形態において、標的ゲノム遺伝子座にて組み込まれる核酸の部分を含む。外来性ＤＮＡ配列は、幾つかの実施形態において、１つ以上の対象のポリヌクレオチドを含む。外来性ＤＮＡ配列は、幾つかの実施形態において、１つ以上の発現カセットを含む。そのような発現カセットは、幾つかの実施形態において、対象の外来性ＤＮＡ配列、選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド、及び、発現に影響を及ぼす調節成分を含む。

【0019】

外来性ＤＮＡ配列は、幾つかの実施形態において、ゲノム核酸を含む。ゲノム核酸は、動物、マウス、ヒト、非ヒト、げっ歯類、非ヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物又は農業哺乳動物、鳥類、細菌、古細菌、ウイルス、又は対象のその他生物体、或いはそれらの組み合わせに由来する。

【0020】

あらゆる適切な大きさの外来性ＤＮＡ配列が標的ゲノムに組み込まれる。幾つかの実施形態において、ゲノムに組み込まれる外来性ＤＮＡ配列は、３キロベース（ｋｂ）未満、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００キロベース、或いは５００キロベースを超える長さである。幾つかの実施形態において、ゲノムに組み込まれる外来性ＤＮＡ配列は、少なくとも約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５００を超える長さ（ｋｂ）である。幾つかの実施形態において、ゲノムに組み込まれる外来性ＤＮＡ配列は、最大約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、或いは５００を超える長さ（ｋｂ）である。

【0021】

標的配列
本明細書で提供される組成物は、少なくとも１つの標的配列を含む標的構築物を含む。幾つかの実施形態において、標的構築物は少なくとも２つの標的配列を含む。本明細書中の標的配列は、配列に特異的な様式で本明細書に開示されるヌクレアーゼによって認識且つ切断される核酸配列である。幾つかの実施形態において、標的配列は、長さ約９から約１２のヌクレオチド、長さ約１２から約１８のヌクレオチド、長斜約１８から約２１のヌクレオチド、長さ約２１から約４０のヌクレオチド、長さ約４０から約８０のヌクレオチド、或いは部分範囲の組み合わせ（例えば９－１８、９－２１、９－４０、及び９－８０のヌクレオチド）である。幾つかの実施形態において、標的構築物はヌクレアーゼ結合部位を含む。幾つかの実施形態において、標的配列は、ニック／切断部位を含む。幾つかの実施形態において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。

【0022】

幾つかの実施形態において、標的核酸配列（例えばプロトスペーサー）は２０のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、標的核酸は２０未満のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又はそれ以上のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、又はそれ以上のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’に隣接する（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ）１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３の塩基である。幾つかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの最後のヌクレオチドの３’に隣接する１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３の塩基である。幾つかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’に隣接する２０の塩基である。幾つかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭの最後のヌクレオチドの３’に隣接する２０の塩基である。幾つかの実施形態において、標的核酸配列はＰＡＭの５’又は３’である。

【0023】

幾つかの実施形態において、標的配列は、相補鎖核酸の核酸標的部分が結合する標的核酸に存在する核酸配列を含んでいる。例えば、幾つかの実施形態において、標的配列は、相補鎖核酸が塩基対合を持つように設計される配列を含んでいる。幾つかの実施形態において標的配列は、例えば、細胞の核又は細胞質中に、或いは糸粒体又は葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置するポリヌクレオチドを含む。標的配列はヌクレアーゼのための切断部位を含む。標的配列は、幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼのための切断部位に隣接している。

【0024】

ヌクレアーゼは、幾つかの実施形態において、相補鎖の核酸標的配列が結合する標的核酸に存在する核酸配列の内部又は外部の部位にて核酸を切断する。切断部位は、幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼが一本鎖切断又は二本鎖切断を生成する核酸の場所を含む。例えば、プロテアーゼ認識配列にハイブリダイズされ且つプロテアーゼと複合される相補鎖核酸を含むヌクレアーゼ複合体の形成は、相補鎖核酸のスペーサー領域が結合する標的核酸に存在する核酸配列において、又はその付近で（例えば、核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１９、２０、２３、５０、又はそれ以上の塩基対内で）、１つ又は両方の鎖の切断をもたらす。切断部位は、幾つかの実施形態において、核酸のわずか一本の鎖、又は両方の鎖の上にある。幾つかの実施形態において、切断部位は、（平滑末端を生成する）核酸の両方の鎖の上の同じ場所、或いは、（付着末端を生成する）各鎖の上の異なる場所にある。付着末端は、幾つかの実施形態において、５’又は３’オーバーハング粘着末端である。付着末端は、幾つかの実施形態において、粘着末端を生成するヌクレアーゼ（例えばＣｐｆ１）により生成される。幾つかの実施形態において、付着末端は、例えば２つのヌクレアーゼを使用して生成され、その各々は、各鎖の上の異なる切断部位にて一本鎖切断を生成し、それにより二本鎖切断を生成する。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖の上に一本鎖切断を作成し、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖の上に一本鎖切断を作成する。場合によっては、第１の鎖の上のニッカーゼのヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１０００の塩基対により、第２の鎖の上のニッカーゼのヌクレアーゼ認識配列から分離される。

【0025】

ヌクレアーゼによる標的核酸の部位特異的な切断は、幾つかの実施形態において、相補鎖核酸と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位置に生じる。ヌクレアーゼタンパク質による標的核酸の部位特異的な切断は、幾つかの実施形態において、標的核酸中の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフによって決定される位置に生じる。例えば、ＰＡＭは、認識配列の３’末端にてヌクレアーゼ認識配列に隣接する。例えば、ヌクレアーゼの切断部位は、幾つかの実施形態において、ＰＡＭ配列の約１から約２５、約２から約５、又は約１９から約２３の塩基対（例えば３の塩基対）の上流又は下流にある。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼの切断部位はＰＡＭ配列の３の塩基対の上流にある。幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼの切断部位は、（＋）鎖上の１９の塩基、及び（－）鎖の上の２３の塩基であり、５’オーバーハングの長さ５のヌクレオチド（ｎｔ）を生成する。場合によっては、切断は平滑末端を生成する。場合によっては、切断は、５’オーバーハングを備えた付着末端又は粘着末端を生成する。場合によっては、切断は、３’オーバーハングを備えた付着末端又は粘着末端を生成する。

【0026】

様々なヌクレアーゼタンパク質のオルソログは、異なるＰＡＭ配列を利用する。例えば、異なるＣａｓタンパク質は、幾つかの実施形態において異なるＰＡＭ配列を認識する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスにおいて、ＰＡＭは配列５’－ＸＲＲ－３’を含む標的核酸中の配列であり、ここで、ＲはＡ又はＧの何れかであり、Ｘは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列の３’に隣接する。ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）のＰＡＭ配列は５’－ＸＧＧ－３’であり、ここで、Ｘは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のヌクレアーゼ認識配列の３’に隣接する。Ｃｐｆ１のＰＡＭは５’－ＴＴＸ－３’であり、ここで、Ｘは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ヌクレアーゼ認識配列の５’に隣接する。

【0027】

相補鎖核酸
相補鎖核酸、例えば相補鎖オリゴヌクレオチド、又は相補鎖ＲＮＡは、別の核酸、例えば細胞のゲノム中の標的核酸にハイブリダイズする核酸を指す。相補鎖核酸は、幾つかの実施形態においてＲＮＡである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸はＤＮＡである。相補鎖核酸は、幾つかの実施形態においてヌクレオチドアナログを含む。相補鎖核酸は、幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオチドを含む。相補鎖核酸は、幾つかの実施形態において、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラム又は設計される。

【0028】

相補鎖核酸は、幾つかの実施形態において、核酸に新たな又は強化した特徴を提供するために１つ以上の修飾を含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸が核酸アフィニティータグを含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む。

【0029】

相補鎖核酸は、幾つかの実施形態において、標的核酸中の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列（例えばスペーサー）を、例えば５’末端又は３’末端にて、又はその付近で含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーションを介した配列に特異的な様式（即ち塩基対合）で標的核酸と相互に作用する。幾つかの実施形態において、スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’又は３’に位置する標的核酸（例えばプロトスペーサー配列）にハイブリダイズする。

【0030】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、二本相補鎖核酸と称される２つの別個の核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、一本相補鎖核酸と称される単一の核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、ＣｒＲＮＡを含む一本相補鎖核酸を含む。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、縮合した構築物を含む一本相補鎖核酸を含む。

【0031】

相補鎖核酸の核酸標的領域は、幾つかの実施形態において、標的核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。核酸標的領域は、幾つかの実施形態においてスペーサー領域を含む。幾つかの実施形態において、スペーサー領域は、ハイブリダイゼーションを介した配列に特異的な様式（即ち塩基対合）で標的核酸と相互に作用する。スペーサー領域のヌクレオチド配列は変化し、相補鎖核酸が相互に作用する標的核酸の位置を決定する。相補鎖核酸のスペーサー領域は、幾つかの実施形態において、標的核酸内の望ましい配列にハイブリダイズするように修飾される。

【0032】

相補性は代替的に、完全、或いは実質的／十分である。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が、中にある塩基全てがワトソン－クリック対合により相補的塩基に結合される二重鎖を形成することを意味する。実質的又は十分な相補性は、一本鎖の配列が対向する鎖の配列に対して完全に及び／又は完璧に相補性ではないが、ハイブリダイゼーション条件（例えば塩の濃度及び温度）の設定において安定した雑種複合体を形成するために２つの鎖の上の塩基間で十分な結合が生じることを意味する。このような条件は、ハイブリダイズされた鎖のＴｍを予測するために配列及び標準の数学的計算を使用することによって、或いは、慣例的な方法の使用によるＴｍの経験的決定によって予測することができる。

【0033】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ１８から７２のヌクレオチドである。相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、約１２のヌクレオチドから約１００のヌクレオチドの長さを有している。例えば、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔ、約１２ｎｔから約５０ｎｔ、約１２ｎｔから約４０ｎｔ、約１２ｎｔから約３０ｎｔ、約１２ｎｔから約２５ｎｔ、約１２ｎｔから約２０ｎｔ、約１２ｎｔから約１９ｎｔ、約１２ｎｔから約１８ｎｔ、約１２ｎｔから約１７ｎｔ、約１２ｎｔから約１６ｎｔ、約１２ｎｔから約１５ｎｔの長さを有している。代替的に、ＤＮＡ標的部分は、約１８ｎｔから約２０ｎｔ、約１８ｎｔから約２５ｎｔ、約１８ｎｔから約３０ｎｔ、約１８ｎｔから約３５ｎｔ、約１８ｎｔから約４０ｎｔ、約１８ｎｔから約４５ｎｔ、約１８ｎｔから約５０ｎｔ、約１８ｎｔから約６０ｎｔ、約１８ｎｔから約７０ｎｔ、約１８ｎｔから約８０ｎｔ、約１８ｎｔから約９０ｎｔ、約１８ｎｔから約１００ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約７０ｎｔ、約２０ｎｔから約８０ｎｔ、約２０ｎｔから約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔから約１００ｎｔの長さを有している。

【0034】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ２０のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ１９のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ１８のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ１７のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ１６のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ２１のヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸の核酸標的領域（例えばスペーサー領域）は、長さ２２のヌクレオチドである。

【0035】

プロトスペーサー配列は、幾つかの実施形態において、関心領域内のＰＡＭを同定することによって、及び、プロトスペーサーとしてＰＡＭの上流又は下流の望ましい大きさの領域を選択することによって同定される。対応するスペーサー配列は、プロトスペーサー領域の相補的配列を決定することにより設計される。

【0036】

スペーサー配列は、幾つかの実施形態において、コンピュータープログラム（例えば、機械可読コード）を使用して同定される。コンピュータープログラムは、幾つかの実施形態において、予測された融解温度、二次構造形成、及び予測されたアニール温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノムの発生の頻度、メチル化状況、ＳＮＰの存在などの変数を使用する。

【0037】

標的核酸（例えばプロトスペーサー）内の核酸標的配列（例えばスペーサー配列）とヌクレアーゼ認識配列との間の相補性の割合は、幾つかの実施形態において、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％である。標的核酸内の核酸標的配列とヌクレアーゼ認識配列との間の相補性の割合は、幾つかの実施形態において、約２０の近接ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。

【0038】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾又は調節された安定性；細胞内標的；蛍光標識での追跡；タンパク質又はタンパク質複合体のための結合部位など）を提供する修飾又は配列を含む。そのような修飾の例は、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレート（ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｙｌａｔｅ）キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（即ち３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体によって安定性の調節及び／又はアクセシビリティの調節を可能にするためのもの）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二本鎖（即ちヘアピン）を形成する配列；細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的とする修飾又は配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接抱合、蛍光検出を容易にする部分への抱合、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する修飾又は配列；又はタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、及びそれらの組み合わせを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する修飾又は配列を含む。

【0039】

相補鎖核酸は任意の形態で提供される。例えば、幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、２つの分子（例えば別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）、或いは１つの分子（例えばｓｇＲＮＡ）として、ＲＮＡの形態で提供される。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、ヌクレアーゼタンパク質との複合体の形態で提供される。代替的に、相補鎖核酸は、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でも提供される。相補鎖核酸をコードするＤＮＡは代替的に、単一の相補鎖核酸（例えばｓｇＲＮＡ）又は別個のＲＮＡ分子（例えば別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする。後者の場合、相補鎖核酸をコードするＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供される。

【0040】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸をコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、そして随意に、細胞中のプロモーター活性に作用可能に連結される。相補鎖核酸をコードするＤＮＡは、幾つかの実施形態において、発現構築物中のプロモーターに作用可能に連結される。

【0041】

相補鎖核酸は、任意の適切な方法により調製される。例えば、相補鎖核酸は、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロでの転写によって調製される。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸は、化学合成により調製される、合成的に生成された分子である。

【0042】

ヌクレアーゼ
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物はヌクレアーゼを含む。標的配列を認識するヌクレアーゼが当業者に知られており、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、及びメガヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。組成物に見出され且つ本明細書に開示される方法に有用なヌクレアーゼは、以下により詳細に記載される。

【0043】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」は、ＦｏｋＩの切断ドメインと、３つ以上のジンクフィンガーモチーフを含むＤＮＡ認識ドメインとの間の融合である。正確な配向及び間隔における、２つの個々のＺＦＮのＤＮＡ中の特定の場所でのヘテロ二量体化は、ＤＮＡ中の二本鎖切断を引き起こす。場合によっては、ＺＦＮは、各ジンクフィンガードメインのＣ末端に切断ドメインを融合させる。２つの切断ドメインがＤＮＡを二量化させ且つ切断することを可能にするために、２つの個々のＺＦＮは、特定の距離をおいて、対向するＤＮＡ鎖にそれらのＣ末端を結合させる。場合によっては、ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間のリンカー配列は、各結合部位の５’末端（ｅｄｇｅ）が約５－７ｂｐ分離されることを要求する。本発明に有用である典型的なＺＦＮは、限定されないが、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１０， １１：６３６－６４６；Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１２， ９（８）：８０５－７；米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，７４６，８３８号；第６，７９４，１３６号；第６，８２４，９７８号；第６，８６６，９９７号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；第７，０３０，２１５号；第７，２２０，７１９号；第７，２４１，５７３号；第７，２４１，５７４号；第７，５８５，８４９号；第７，５９５，３７６号；第６，９０３，１８５号；第６，４７９，６２６号；及び米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号及び２００９／０２０３１４０号に記載されるものを含む。

【0044】

ＺＦＮは、幾つかの実施形態において、標的ＤＮＡに二本鎖切断を生成し、遺伝子修飾の導入を可能にするＤＮＡ切断修復をもたらす。ＤＮＡ切断修復は、幾つかの実施形態において、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して生じる。幾つかの実施形態において、ＺＦＮは、幾つかの実施形態において部位特異的な一本鎖ＤＮＡ切断又はニックを誘導する操作されたＺＦＮである、ジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの記載は、例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０１２， ４０（１２）：５５６０－８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ２０１２， ２２（７）：１３２７－３３に見出される

【0045】

ＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ結合縦列反復の中央ドメイン、核移行シグナル、及びＣ末端転写活性化ドメインを含む、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。幾つかの例において、ＤＮＡ結合縦列反復は、長さが３３－３５のアミノ酸を含み、且つ、１つ以上の特異的なＤＮＡ塩基対を認識する場所１２及び１３にて２つの超可変アミノ酸残基を含む。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメインにＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを融合させることによって生成される。例えば、ＴＡＬＥタンパク質は、野生型又は突然変異したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、或いはＦｏｋＩの触媒ドメインに融合されることもある。ＦｏｋＩに対する様々な突然変異が、例えば切断特異性又は切断活性を改善する、ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために生じさせられている。そのようなＴＡＬＥＮは、望ましいＤＮＡ配列を結合するように操作される。

【0046】

ＴＡＬＥＮは頻繁に、後にＮＨＥＪ又はＨＤＲを受ける、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断を作成することによって遺伝子修飾を生成するために使用される。場合によっては、一本鎖ドナーＤＮＡ修複鋳型がＨＤＲを促進するために提供される。

【0047】

ＴＡＬＥＮ、及び遺伝子編集のためのその使用についての詳細な説明は、例えば、米国特許第８，４４０，４３１号；第８，４４０，４３２号；第８，４５０，４７１号；第８，５８６，３６３号；及び第８，６９７，８５３号；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２０１３， １３（４）：２９１－３０３；Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１２， ９（８）：８０５－７；Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ， ２０１３， ４：１７６２；及びＪｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２０１３， １４（１）：４９－５５に見出される。

【0048】

ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ
「ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」は、別の核酸、例えば細胞のゲノム中の標的核酸にハイブリダイズすることによってゲノム中の正確な場所にヌクレアーゼを導くために一本鎖ＤＮＡ相補的ヌクレオチドを使用するヌクレアーゼである。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、アルゴノートヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＴｔＡｇｏ、ＰｆＡｇｏ、及びＮｇＡｇｏから選択される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏである。

【0049】

メガヌクレアーゼ
「メガヌクレアーゼ」は、レアカットエンドヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼである。特定の実施形態において長さが少なくとも１２の塩基対、例えば長さが１２～４０の塩基対、又は１２～６０の塩基対に及ぶ、高度に特異的な認識ＤＮＡ標的部位である。幾つかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの少なくとも１つの触媒ドメイン及び少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、或いは核酸標的配列を明示するタンパク質などの、モジュラーＤＮＡ結合ヌクレアーゼである。ＤＮＡ結合ドメインは、幾つかの実施形態において、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含む。メガヌクレアーゼは代替的に単量体又は二量体である。

【0050】

幾つかの例において、メガヌクレアーゼは、自然発生型（自然に見い出される）又は野生型であり、他の例においてメガヌクレアーゼは、非天然、人工、操作された、合成、合理的に設計された、或いは人造のものである。特定の実施形態において、本発明のメガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、その変異体、その突然変異体、及びその誘導体を含む。

【0051】

任意のメガヌクレアーゼは、本明細書で使用されるものと考慮され、限定されないが、Ｉ－Ｓｃｅｌ、Ｉ－Ｓｃｅｌｌ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｃｅｕｌ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－Ｃｒｅｌ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂｌｌＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－Ｔｌｉｌ、Ｉ－Ｐｐｏｌ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－Ｓｃｅｌ、Ｆ－Ｓｃｅｌｌ、Ｆ－Ｓｕｖｌ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－Ａｍａｌ、Ｉ－Ａｎｉｌ、Ｉ－Ｃｈｕｌ、Ｉ－Ｃｍｏｅｌ、Ｉ－Ｃｐａｌ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－Ｃｓｍｌ、Ｉ－Ｃｖｕｌ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－Ｄｄｉｌ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－Ｄｉｒｌ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、Ｉ－Ｈｍｕｌ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－Ｌｌａｌ、Ｉ－Ｍｓｏｌ、Ｉ－Ｎａａｌ、Ｉ－Ｎａｎｌ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－Ｎｉｔｌ、Ｉ－Ｎｊａｌ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－Ｐａｋｌ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒｌＰ、１－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－Ｐｏｒｌ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－Ｓｃａｌ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、１－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－Ｓｐｏｍｌ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－Ｔｅｖｌ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、１－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、Ｐｌ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－Ｔｈｙｌ、ＰＩ－Ｔｌｉｌ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、又はそれらの任意の活性変異体或いは断片を含む。

【0052】

ＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム工学のために使用される細菌システムに基づく、操作されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌及び古細菌の適応的免疫反応に部分的に基づく。ウイルス又はプラスミドが細菌に侵入すると、侵入物のＤＮＡの部分は「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。その後、ｃｒＲＮＡは、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡに相同する領域へとＣａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼを誘導するために、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別のタイプのＲＮＡと、部分的な相補性の領域を通じて会合する。Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ転写内に含まれる２０のヌクレオチド相補鎖配列により明示される部位での二本鎖切断にて平滑末端を生成するために、ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼは、幾つかの実施形態において、部位特異的なＤＮＡ認識及び切断にｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは現在、特定の実施形態においてｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子（「単一誘導ＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」）に組み合わせられ、且つ単一誘導ＲＮＡのｃｒＲＮＡ等価部分が望ましい配列を標的とするためにＣａｓ（例えばＣａｓ９）ヌクレアーゼを誘導するように設計されるように、設計されている（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１； Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ． （２０１３） ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１； Ｓｅｇａｌ （２０１３） ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３を参照）。故に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞のゲノム中の望ましい標的にて二本鎖切断を作成し、且つ相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により誘導された切断を修復するための細胞の内因的な機構を利用するように、操作することができる。

【0053】

幾つかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼにはＤＮＡ切断活性がある。Ｃａｓヌクレアーゼは、幾つかの実施形態において、標的ＤＮＡ配列の１つの位置にて１つ又は両方の鎖の切断を導く。例えば、幾つかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を切断する１つ以上の不活性化触媒ドメインを持つニッカーゼである。

【0054】

Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ１Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、それらの変異体、それらの突然変異体、及びそれらの誘導体を含む。Ｃａｓヌクレアーゼの３つの主な型（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）、並びに、５つのＩ型、３つのＩＩ型、及び２つのＩＩＩ型を含む１０の亜型が存在する（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ， ２０１５：４０（１）：５８－６６を参照）。ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、及びＣａｓ９を含むが、これらに限定されない。これらＣａｓヌクレアーゼは当業者に既知である。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスの野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ Ｒｅｆ． Ｓｅｑ． Ｎｏ． ＮＰ＿２６９２１５に記載されており、ストレプトコッカス・サーモフィルスの野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ Ｒｅｆ． Ｓｅｑ． Ｎｏ． ＷＰ＿０１１６８１４７０に記載されている。

【0055】

Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ポリペプチドは、幾つかの実施形態において様々な細菌種に由来し、限定されないが、ベイロネラ・アティピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム、フィリファクター・アロキス、ソロバクテリウム・ムーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス・カツス、トレポネーマ・デンティコラ、ペプトニフィルス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ、ストレプトコッカス・ミュータンス、リステリア・イノキュア、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス、アシドアミノコックス・インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、オルセネラ・ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）、オエノコッカス・キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ガセリ、フィネゴルディア・マグナ、滑走性マイコプラズマ、マイコプラズマ・ガリセプティクム、マイコプラズマ・オビニューモニエ、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・シノヴィエ、ユーバクテリウム・レクタレ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ユーバクテリウム・ドリクム、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス、イリオバクター・ポリトロパス、ルミノコッカス・アルブス、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アシドサーマス・セルロリティカス、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・デンティウム、コリネバクテリア・ジフテリア、エルシミクロビウム・ミヌトゥム、ニトラティフラクター・サルスガイニス、スピロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター・サクシノゲネス亜種サクシノゲネス、バクテロイデス・フラジリス、カプノサイトファガ・オクラセア、ロドシュードモナス・パルストリス、プレボテラ・ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）、プレボテラ・ルミニコラ、フラボバクテリウム・コルムナーレ、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドスピリラム・ラブラム、カンジダタス ・プニセイスピリルム・マリナム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア・シジジイ、ディノロセオバクター・シバエ、アゾスピリルム、ニトロバクター・ハンブルゲンシス、ブラジリゾビウム、ウォリネラ・サクシノゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ、ヘリコバクター・ムステラエ、バチルス・セレウス、アシドボラックス・エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス、パルビバクラム・ラバメンティボランス、ロゼブリア・インテスティナーリス、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ、ステレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリウム、レジュネラ・ニューモフィラ、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、ウォリネラ・サクシノゲネス、及びフランシセラ・ノビシダを含む。

【0056】

「Ｃａｓ９」は、ＲＮＡ誘導型二本鎖ＤＮＡ結合ヌクレアーゼタンパク質又はニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼには２つの機能ドメイン、例えば、異なるＤＮＡ鎖を切断するＲｕｖＣ及びＨＮＨがある。両方の機能ドメインが活性であると、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）において二本鎖切断を誘導することができる。Ｃａｓ９酵素は、幾つかの実施形態において、コリネバクター、サテレラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユーバクテリウム、レンサ球菌、ラクトバチラス、マイコプラズマ、バクテロイド、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラティフラクター、及びカンピロバクターから成る群に属する細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の１つ以上の触媒ドメインを含む。幾つかの実施形態において、Ｃａｓ９は融合タンパク質であり、例えば、２つの触媒ドメインは異なる細菌種に由来する。

【0057】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼの有用な変異体は、ＲｕｖＣ－或いはＨＮＨ－酵素又はニッカーゼなどの、単一の不活性触媒ドメインを含む。Ｃａｓ９ニッカーゼは、ほんの１つの活性機能ドメインを有しており、幾つかの実施形態において、標的ＤＮＡのほんの１つの鎖を切断し、それにより単鎖の切断又はニックを作り出す。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのＤ１０Ａ突然変異を持つ突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態において、少なくとも１つのＨ８４０Ａ突然変異を持つ突然変異体Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼに存在する突然変異の他の例は、限定されないがＮ８５４Ａ及びＮ８６３Ａを含む。相対するＤＮＡ鎖を標的とする少なくとも２つのＤＮＡ標的ＲＮＡが使用される場合、二本鎖切断は、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して導入される。二重にニックをつけて誘導された（ｄｏｕｂｌｅ－ｎｉｃｋｅｄ ｉｎｄｕｃｅｄ）二本鎖切断は、ＮＨＥＪ又はＨＤＲにより修復される。この遺伝子編集の戦略はＨＤＲを好み、オフターゲットＤＮＡ部位でのインデル突然変異の頻度を減少させる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、幾つかの実施形態において、標的細胞又は標的生物のためにコドン最適化される。

【0058】

幾つか実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９と称される、ＲｕｖＣ１及びＨＮＨヌクレアーゼドメイン（Ｄ１０ＡとＨ８４０Ａ）の２つのサイレンシング突然変異を含むＣａｓ９ポリペプチドである。１つの実施形態において、化膿レンサ球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７、又はそれらの任意の組み合わせにて少なくとも１つの突然変異を含む。そのようなｄＣａｓ９ポリペプチド及びその変異体の記載は、例えば、国際特許公報ＷＯ２０１３／１７６７７２で提供される。ｄＣａｓ９酵素は、幾つか実施形態において、Ｈ８４０又はＮ８６３での突然変異と同様、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、又はＤ９８６での突然変異を含む。幾つかの例において、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０Ａ又はＤ１０Ｎの突然変異を含む。また、ｄＣａｓ９酵素は代替的に、突然変異Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、又はＨ８４０Ｎを含む。幾つかの実施形態において、本発明のｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡとＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡとＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡとＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮとＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮとＨ８４０Ｙ；又はＤ１０ＮとＨ８４０Ｎの置換を含む。置換は代替的に、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的に不活性にするために保存的置換又は非保存的置換であり、標的ＤＮＡに結合することができる。

【0059】

ゲノム編集の方法のために、Ｃａｓヌクレアーゼは、幾つか実施形態において、ｄＣａｓ９に結合されるＩＩＳ型の制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインを含むポリペプチドなどの、Ｃａｓ９融合タンパク質を含む。ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合タンパク質（ｆＣａｓ９）は、標的ＤＮＡの一本鎖に結合して二本鎖切断を生成するために、２つのガイドＲＮＡを使用することができる。

【0060】

送達のための組成物
任意の適切な送達方法が、本開示の組成物を送達するために使用されることを考慮される。ＨＩＴＩシステムの個々の成分（例えば、ヌクレアーゼ及び／又は外来性ＤＮＡ配列）は、幾つかの実施形態において、同時に又は一時的に分離されて送達される。遺伝子修飾の方法の選択は、形質転換される細胞のタイプ、及び／又は形質転換が生じる状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）に依存する。これら方法の一般的な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９５の中で見出される。

【0061】

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、標的ＤＮＡを接触させる工程、或いは、細胞（又は細胞の集団）に、相補鎖核酸（例えばｇＲＮＡ）、部位特異的修飾ポリペプチド（例えばＣａｓタンパク質）、及び／又は外来性ＤＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を導入する工程を含む。相補鎖核酸及び／又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は発現ベクターを含み、ここで、相補鎖核酸及び／又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは組換え発現ベクターである。

【0062】

送達方法又は形質転換の非限定的な例は、例えば、ウイルス感染又はバクテリオファージ感染、形質移入、抱合、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介の形質移入、ＤＥＡＥデキストラン媒介の形質移入、リポソーム媒介の形質移入、パーティクル・ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注射、及びナノ粒子媒介の核酸送達を含む（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ． ， ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２０１２ Ｓｅｐ． １３． ｐｉｉ： ５０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）。

【0063】

幾つかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるような１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそこから転写された１つ以上のタンパク質などの、１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達する工程を含む方法を提供する。幾つかの態様において、本開示は、前記方法によって産生される細胞、及び、前記細胞を含むか又はそこから産生される生物体（動物、植物、又は真菌類など）を更に提供する。幾つかの実施形態において、相補鎖配列と組み合わせた、及び随意にそれと複合させたヌクレアーゼタンパク質は、細胞に送達される。従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子移入方法が、哺乳動物細胞又は標的組織に核酸を導入するために使用されることを考慮される。前記方法は、培養物、又は宿主生物中の細胞に、ＨＩＴＩシステムの成分をコードする核酸を投与するために使用される。非ウイルス性のベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写）、ネイキッド核酸、及びリポソームなどの送達ビヒクルと複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを含むことができ、こららは、細胞への送達後にエピソームゲノム又は組み込まれたゲノムの何れか有することができる。遺伝子治療手順のレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３ （１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７ （１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６ （１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ． ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５ （１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０ （１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）： １１４９－１１５４ （１９８８）；Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６ （１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４ （１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ） （１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６ （１９９４）を参照。

【0064】

核酸の非ウイルス性送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸の抱合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤により増強された取り込みを含み得る。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号；及び第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている例えばＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効果的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン及び中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４のものを含んでいる。送達は、細胞（例えばインビトロ又はエクスビボの投与）或いは標的組織（例えばインビボの投与）を対象とすると考慮される。

【0065】

免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体などの標的とされたリポソームを含む、脂質：核酸の複合体の調製は周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０ （１９９５）； Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１－２９７ （１９９５）： Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２－３８９ （１９９４）； Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７－６５４ （１９９４）； Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２ （１９９５）； Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７－４８２０ （１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、及び第４，９４６，７８７号を参照）。

【0066】

ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースのシステムは、身体中の特異的細胞を標的とするために使用され、細胞の核にウイルスペイロード（ｖｉｒａｌ ｐａｙｌｏａｄ）を輸送する（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）。ウイルスベクターは代替的に、直接（インビボ）投与され、或いは、インビトロで細胞を処置するために使用され、且つ、修飾された細胞は随意に投与される（エクスビボ）。ウイルスベースのシステムは、限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスの遺伝子導入ベクターを含む。宿主ゲノムにおける組込みは、幾つかの実施形態において、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法により生じ、その結果、幾つかの実施形態において、挿入された導入遺伝子の長期的な発現がもたらされる。高い形質導入の効率が、多くの異種細胞型及び標的組織において観察される。

【0067】

レトロウイルスの指向性は、特定の実施形態において、外来性のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入する又は感染させることが可能であり、且つ高いウイルスの力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、幾つかの実施形態において、最大６－１０ｋｂの外来性の配列のためのパッケージング容量を持つ、シス作用性長末端反復を含む。最小限のシス作用性ＬＴＲは、幾つかの実施形態において、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、これらは、恒久的な導入遺伝子発現をもたらすために標的細胞へと治療遺伝子を組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものに限定されない（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９ （１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０ （１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９ （１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８ （１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４ （１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。

【0068】

幾つかの実施形態において、アデノウイルスベースのシステムが使用される。アデノウイルスベースのシステムは、幾つかの実施形態において、導入遺伝子の一時的発現を引き起こす。アデノウイルスベースのベクターは、細胞中の高い形質導入効率を可能にし、幾つかの実施形態において細胞分裂を必要としない。発現の高い力価及びレベルは、アデノウイルスベースのベクターにより可能である。幾つかの実施形態において、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、標的核酸を備えた（例えば核酸とペプチドのインビトロの産生において、及び、インビボとエクスビボの遺伝子治療処置のために、標的核酸を持つ細胞を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７ （１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１ （１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）。組換え型ＡＡＶベクターの構造は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１－３２６０ （１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２－２０８１ （１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ（ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４））；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２－３８２８ （１９８９）を含む、多くの刊行物に記載されている。

【0069】

パッケージング細胞は、幾つかの実施形態において、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、限定されないが、２９３細胞（例えば、アデノウイルスをパッケージングするためのもの）、．ｐｓｉ．２細胞、或いはＰＡ３１７細胞（例えばレトロウイルスをパッケージングするためのもの）を含む。ウイルスベクターは、ウイルス粒子へと核酸ベクターをパッケージングする細胞株の生成によって生成される。場合によっては、ベクターは、宿主へのパッケージング及びその後の組込みに必要な最小限のウイルス配列を含む。場合によっては、ベクターは、発現されるポリヌクレオチドのための発現カセットと置き換えられる他のウイルス配列を含む。幾つかの実施形態において、欠損ウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスにおいて供給される。例えば、幾つかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、宿主ゲノムへのパッケージング及び組込みに必要な、ＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列を含む。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちレプとキャップをコードするヘルパープラスミドを含むがＩＴＲ配列を欠く、細胞株においてパッケージングされる。代替的に、細胞株はヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。アデノウイルスによる汚染は、例えば熱処理によって減らされ、この処理に対して、アデノウイルスはＡＡＶよりも敏感である。

【0070】

宿主細胞は代替的に、本明細書に記載される１つ以上のベクターにより一時的又は非一時的に形質移入される。幾つかの実施形態において、細胞は、被験体中で自然に生じるように形質移入される。幾つかの実施形態において、細胞は、被験体から得られ又は被験体に由来し、且つ形質移入される。幾つかの実施形態において、細胞は、細胞株など、被験体から得られる細胞に由来する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターで形質移入された細胞は、１つ以上のベクター由来の配列を含む新たな細胞株を確立するために使用される。幾つかの実施形態において、（１つ以上のベクターの一時的な形質移入、或いはＲＮＡでの形質移入などによる）本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲシステムの成分で一時的に形質移入され、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して修飾された細胞は、修飾を含むが他の外因性配列を欠いている細胞を含む新たな細胞株を確立するために使用される。

【0071】

宿主細胞に適合する任意の適切なベクターは、本発明の方法と共に使用されると考慮される。真核生物の宿主細胞のためのベクターの非限定的な例は、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０を含む。

【0072】

幾つかの実施形態において、相補鎖核酸及び／又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節要素、例えば、プロモーターなどの転写調節要素に作用可能に結合される。転写調節要素は、幾つかの実施形態において、真核細胞（例えば哺乳動物細胞）又は原核細胞（例えば細菌又は古細菌の細胞）の何れかにおいて機能的である。幾つかの実施形態において、相補鎖核酸及び／又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核生物及び／又は真核細胞における相補鎖核酸及び／又は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の調節要素に作用可能に結合される。

【0073】

利用された宿主／ベクターの系に依存して、構成的プロモーター及び誘導プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む多くの適切な転写制御要素と翻訳制御要素のいずれかが、発現ベクターに使用され得る（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等；上記を参照）（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照）。

【0074】

いくつかの実施形態では、相補鎖核酸及び／又は部位特異的な修飾ポリペプチドは、ＲＮＡとして提供される。そのような場合、部位特異的な修飾ポリペプチドをコードする相補鎖核酸及び／又はＲＮＡは、直接の化学合成によって生成され、あるいは相補鎖核酸をコードするＤＮＡからインビトロで転写される場合もある。相補鎖核酸及び／又は部位特異的な修飾ポリペプチドをコードするＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えばＴ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等）を使用して、インビトロで合成される。一旦合成されたならば、ＲＮＡは標的ＤＮＡに直接接触し、又は細胞に核酸を導入するための任意の適切な技術を使用して細胞に導入される（例えばマイクロインジェクション、電気穿孔、形質移入など）。

【0075】

相補鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかとして導入される）及び／又は部位特異的な修飾ポリペプチド（ＤＮＡ又はＲＮＡとして導入される）、及び／又は外来性ＤＮＡ配列をコードするヌクレオチドは、適切な形質移入技術を使用して細胞に提供される；例えば、Ａｎｇｅｌ ａｎｄ Ｙａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ１１７５６を参照されたい；及び市販で入手可能な、ＱｉａｇｅｎのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ．ＲＴＭ．試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｆｅｃｔ．ＴＭ．ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣのＴｒａｎｓＩＴ．ＲＴＭ．－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ。相補鎖核酸及び／又は部位特異的な修飾ポリペプチド、及び／又はキメラ型の部位特異的な修飾ポリペプチド、及び／又は外来性ＤＮＡ配列をコードする核酸は、ＤＮＡベクターに提供されてもよい。標的細胞に核酸を転写するのに有用な多くのベクター、例えばプラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルス等が有効である。いくつかの実施形態における核酸を含むベクターは、例えばプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルスやアデノウイルス等のウイルスとして、エピソームで保全され、又は、相同組換え又はランダムインテグレーションを通じて、標的細胞ゲノム、例えばＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１及びＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターに組み込まれる。

【0076】

＜ゲノムＤＮＡに変更を加える方法＞
本明細書に提供されるのは、相同性に基づかない標的化組み込み方法（ＨＩＴＩ）及び組成物であって、分裂しない非分裂細胞又は最終分化細胞のゲノムＤＮＡを含む、ゲノムＤＮＡなどの核酸に変更を加えるためのものである。少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、相同性に依存せず、非分裂細胞又は最終分化細胞などの細胞の、ゲノムＤＮＡなどの標的ＤＮＡに外来性ＤＮＡを挿入するために、非相同末端結合を使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、非分裂細胞のゲノムに外来性ＤＮＡ配列を組み込む方法を含み、該方法は、外来性ＤＮＡ配列と標的配列を含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む組成物に非分裂細胞を接触させる工程を含み、ここで外来性ＤＮＡ配列は、ゲノムと比較して少なくとも１つのヌクレオチドの差異を含み、標的配列はヌクレアーゼにより認識される。

【0077】

本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法のいくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、標的細胞又は宿主細胞のゲノムに挿入される所望の配列を含んだＤＮＡの断片である。外来性ＤＮＡ配列の少なくとも一部には、標的細胞又は宿主細胞のゲノムの一部に相同する配列があり、又は外来性ＤＮＡ配列の少なくとも一部には、標的細胞又は宿主細胞のゲノムの一部に相同しない配列がある。例えば、いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、突然変異を伴った宿主細胞ゲノムＤＮＡ配列の一部を含む場合もある。したがって、外来性ＤＮＡ配列が宿主細胞又は標的細胞のゲノムに組み込まれる場合、外来性ＤＮＡ配列に見られる突然変異は、宿主細胞又は標的細胞のゲノムに運ばれる。

【0078】

本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法のいくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、少なくとも１つの標的配列に隣接する。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、２つの標的配列に隣接する。標的配列は、少なくとも１つのヌクレアーゼにより認識される特異的なＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、標的配列に相同する配列を有する相補鎖オリゴヌクレオチドの存在下で、ヌクレアーゼによって認識される。

【0079】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法において、標的配列は、ヌクレアーゼによって認識されて切断されるヌクレオチド配列を含む。標的配列を認識するヌクレアーゼは当業者には既知であり、限定されないがＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）ヌクレアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、共に融合して配列特異的なヌクレアーゼを生成する、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、共に融合して配列特異的なヌクレアーゼを生成する、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、通常は原核生物のＤＮＡに見られる、ＣＲＩＳＰＲに相同するＤＮＡ配列を認識する、自然発生のヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとして、限定されないがＣａｓ９Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ１があげられる。

【0080】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムの突然変異を修復すると共に、宿主ゲノム又は標的ゲノムに突然変異を導入することもできる。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、突然変異又は野生型配列は、宿主ゲノム又は標的ゲノムに挿入される外来性ＤＮＡ配列に見られる。突然変異は当業者にとって既知であり、一塩基対の改変又は点突然変異、挿入及び欠失を含む。いくつかの実施形態では、一塩基対の改変は、野生型配列とは異なる転写されたｍＲＮＡのアミノ酸をコードするコドンを作り出すミスセンス突然変異をもたらす。いくつかの実施形態では、一塩基対の改変は、転写されたｍＲＮＡの終止コドンをコードするナンセンス突然変異をもたらす。いくつかの実施形態では、転写されたＲＮＡの終止コドンは、ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の早期のトランケーションをもたらす。いくつかの実施形態では、一塩基対の改変は、宿主ゲノム又は標的ゲノムから転写されたｍＲＮＡによりコードされたアミノ酸に何の変化ももたらさないサイレント突然変異に帰結する。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異はイントロンにある。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異はエクソンにあり、野生型配列と同じアミノ酸をコードするためのコドンを作り出す。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、プロモーター、エンハンサー、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又は宿主ゲノム又は標的ゲノムの他の非コード領域にある。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、結果としてｍＲＮＡ転写の異常なスプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、ＲＮＡのスプライス供与部位又はスプライス受容部位を破壊する。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、結果として異常なＲＮＡの排出をもたらす。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、結果としてｍＲＮＡの翻訳の異常又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、サイレント突然変異は、結果としてＲＮＡの転写の異常又は減少をもたらす。いくつかの実施形態では、突然変異は、宿主ゲノム又は標的ゲノムへの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入は、１－１，０００，０００の塩基対、例えば１－１０、５－２０、１５－３０、２０－５０、４０－８０、５０－１００、１００－１０００、５００－２０００、１０００－５０００、２０００－８０００、５０００－１００００、１００００－５００００、５００００－１０００００、１０００００－１２００００、１２００００－１５００００、１５００００－３０００００、２５００００－５０００００、４０００００－８０００００、又は５０００００－１００００００の塩基対の、特定の数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、欠失は、１－１０，０００の塩基対の範囲の、特定の数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムから、少なくとも１つの遺伝子又はその断片を除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムに、外来性遺伝子又はその断片を導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムにおいて、変異した遺伝子又はその断片を、野生型の遺伝子又はその断片に取り換える工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムの少なくとも１つのヌクレオチドを改変し、結果として遺伝子の発現を高める。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムの少なくとも１つのヌクレオチドを改変し、結果として遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、該方法は、宿主ゲノム又は標的ゲノムに外来性プロモーターを導入し、結果として遺伝子の発現を変化させる。いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導プロモーターである。

【0081】

本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法は、ゲノムＤＮＡに変更を加える既存の方法ではアクセスできない非分裂細胞のゲノムＤＮＡに変更を加える能力を高める。非分裂細胞は、円熟した有機体、及び最終分化細胞又は静止期にある幹細胞に、大きな数で存在する。非分裂細胞として、限定されないが：ニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリア及び上衣細胞を含む中枢神経系の細胞；感覚変換器細胞；自律神経細胞；感覚器官と末梢ニューロンの支持細胞；光受容体、桿体及び錐体を含む網膜の細胞；壁細胞、糸球体有足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレの細い部分のループの細胞、遠位尿細管細胞、集合管細胞を含む腎臓の細胞；リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、血小板を含む造血系の細胞；肝細胞、星細胞、クッパー細胞及び肝臓内皮細胞を含む肝臓の細胞；アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ及びイプシロン細胞を含む膵臓の内分泌細胞；線毛細胞、基底細胞、さかずき細胞及び肺胞細胞を含む気道上皮の細胞、卵原細胞／卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞及び精子を含む生殖細胞；骨細胞、破骨細胞及び骨芽細胞を含む骨の細胞；心筋細胞及び心臓ペースメーカー細胞を含む心臓の細胞；甲状腺の濾胞上皮細胞；漿液細胞、粘液細胞及び味蕾を含む上部消化管の細胞；壁細胞、主細胞、腸内分泌細胞を含む胃の細胞；内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨髄細胞、内耳細胞、真皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞があげられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＨＩＴＩ方法は、分裂細胞においてゲノムＤＮＡに変更を加える方法を提供し、該方法は、本技術分野で既に開示されている方法よりも有効性が高い。分裂細胞として、限定されないが、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋サテライト細胞、上皮細胞、膠細胞、及びアストロサイトがあげられる。

【0082】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＩＴＩ方法のための、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び／又はヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスによって標的細胞又は宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスは標的細胞を感染させ、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを発現し、その結果、標的構築物の外来性ＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むことを可能にする。いくつかの実施形態では、ウイルスは、センダイウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは偽型ウイルスである。いくつかの実施形態では、標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載のＨＩＴＩ方法用にヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス遺伝子導入法によって標的細胞又は宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、非ウイルス遺伝子導入法は、標的細胞に遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を含む）を送達し、及び標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを発現し、その結果、標的構築物の外来性ＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むことを可能にする。いくつかの実施形態では、非ウイルス法は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質のための形質移入試薬（ナノ粒子を含む）、又は電気穿孔を含む。

【0083】

＜疾患を処置する方法＞
さらに本明細で提供されるのは、遺伝性疾患などの疾患を処置するための方法と組成物である。遺伝性疾患は、受け継いだＤＮＡにおける突然変異によって引き起こされるものである。いくつかの実施形態において、遺伝性疾患は、ゲノムＤＮＡにおける突然変異によって引き起こされる。遺伝子突然変異は当業者にとって既知であり、一塩基対の改変又は点突然変異、挿入及び欠失を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、必要とする被験体の遺伝性疾患を処置する方法を含み、ここで遺伝性疾患は、野生型遺伝子と比較して少なくとも１つの変更されたヌクレオチドを持つ突然変異遺伝子から生じ、前記方法は、野生型遺伝子に相同するＤＮＡ配列と標的配列とを含む標的構築物、標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びヌクレアーゼを含む組成物に、被験体の少なくとも１つの細胞を接触させる工程を含み、標的配列は、突然変異遺伝子又はその断片が野生型遺伝子又はその断片と置き換えられるようにヌクレアーゼによって認識される。

【0084】

本明細書に開示される方法によって処置される遺伝性疾患として、限定されないが以下があげられる：無セルロプラスミン血症、軟骨無発生症ＩＩ型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、ＡＬＡデヒドラターゼ欠損症、アラジール症候群、白皮症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、α－１－アンチトリプシン欠乏症、アルストレーム症候群、アルツハイマー病、エナメル質形成不全症、筋萎縮性側索硬化症、アンドロゲン不感性症候群、貧血、アンゲルマン症候群、アペール症候群、毛細血管拡張性運動失調、ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群、ベンジャミン症候群、β地中海貧血、ビオチニダーゼ欠損、膀胱癌、ブルーム症候群、骨疾患、乳癌、バート・ホッグ・デュベ症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＧＤ慢性肉芽腫性障害、屈曲肢異形成症、カナバン病、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、コケーン症候群、コフィン・ローリー症候群、ＩＩ型及びＸＩ型コラーゲン異常症、結腸直腸癌、結合織病、カウデン症候群、ネコ鳴き症候群、クローン病（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｎｇ）、クルーゾン症候群、Ｃｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ症候群、変性神経疾患、発達障害、ディジョージ症候群、遠位遺伝性運動ニューロパシー、低身長症、エーラス・ダンロス症候群、骨髄性プロトポルフィリア、ファブリー病、顔面損傷及び障害、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性腺腫性ポリポーシス、家族性自律神経失調症、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調、Ｇ６ＰＤ欠損症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、遺伝子脳障害、ハーレクイン型魚鱗癬、頭部及び脳の奇形、聴覚障害及び難聴、小児の聴覚問題、ヘモクロマトーシス、血友病、肝性骨髄性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝的性非ポリポーシス結腸直腸癌、ホモシスチン尿、ハンチントン病、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、軟骨低発生症、軟骨低形成症、色素失調症、乳児期発症上向性遺伝性痙性麻痺、不妊症、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内症、Ｋｎｉｅｓｔ異形成、クラッベ病、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、リ・フローメニ症候群、家族性リポ蛋白リパーゼ欠損症、男性生殖器疾患、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ、家族性地中海熱、メンケス病、代謝異常、メトヘモグロビン血症ベータ・グロビン・タイプ、メチルマロン酸血症、マイクロ症候群、小頭症、運動障害、モワット・ウィルソン症候群、ムコ多糖沈着（ＭＰＳ Ｉ）、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、筋ジストロフィー、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型及びＢｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症型ＩＩ型、神経疾患、神経筋疾患、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１ＳＭＰＤ１、非症候性難聴、ヌーナン症候群、オグデン症候群、骨形成不全症、ＯＳＭＥＤ（ｏｔｏｓｐｏｎｄｙｌｏｍｅｇａｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、ペンドレッド症候群、ポイツ・ジェガーズ症候群、ファイフェル症候群、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、ポルフィリン症、プラーダー・ヴィリ症候群、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、早老、プロピオン酸血症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、擬似ゴーシェ病、弾力線維性仮性黄色腫、網膜障害、網膜胚種細胞腫、レット症候群、ルービンスタイン・テービ症候群、Ｓｃシュワルツ・ヤンペル症候群、サダン症候群（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ ｗｉｔｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｌａｙ ａｎｄ ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ，ＳＡＤＤＡＮ）、鎌状赤血球貧血、Ｓｉｄｅｒｉｕｓ Ｘ連鎖精神遅滞症候群、皮膚色素沈着障害、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マゲニス症候群、発話障害及びコミュニケーション障害、球脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、脊髄小脳失調症、脊椎骨端骨幹端異形成症Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ型、スティックラー症候群、テイ・ザックス病、テトラヒドロビオプテリン欠損症、致死性骨異形成症、甲状腺疾患、トレチャー・コリンズ症候群、アッシャー症候群、異型ポルフィリン症、フォンヒッペル・リンダウ病、ワールデンブルヒ症候群、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ－Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルフ・ヒルショルン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症又はＸ連鎖鉄芽球性貧血。

【0085】

本明細書に開示される遺伝性疾患を処置する方法は、突然変異した遺伝子のＤＮＡ配列に対応する野性型ＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む外来性ＤＮＡ配列を使用し、その結果、該方法において、突然変異したＤＮＡ配列は野性型ＤＮＡ配列に置き換えられる。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、野性型ＤＮＡ配列の１００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、外来性ＤＮＡ配列は、野性型ＤＮＡ配列の２００塩基対を含む。

【0086】

特に別記されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書に記載される方法又は物質に類似の、又は同等の任意の方法又は物質を、本発明の実施に使用することができる。本発明の目的ために、以下の用語が定義される。

【0087】

本明細書で使用される用語「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」は、１つの構成員を有する態様だけでなく、複数の構成員を有する態様を含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指定していない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤」への言及は、当業者に既知の１つ以上の薬剤への言及を含む等々である。

【0088】

用語「ゲノム編集」は、１つ以上のヌクレアーゼ及び／又はニッカーゼを使用して、ＤＮＡを挿入する、置き換える、又は標的ＤＮＡから、例えば細胞のゲノムから除去する、一種の遺伝子工学を指す。ヌクレアーゼは、ゲノムの望ましい位置に特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、誘導された破壊を修復するために、細胞内因性メカニズムを利用する。ニッカーゼは、ゲノムの望ましい位置に特定の一本鎖切断を作り出す。１つの非限定的な例では、２つのニッカーゼを使用して、標的ＤＮＡの相対する鎖に２つの一本鎖切断を作り出すことができ、その結果として平滑末端又は粘着末端が生成される。標的ＤＮＡ配列のゲノムの編集を誘導するために、任意の適切なヌクレアーゼを細胞に導入することができ、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ、それらの変異体、それらの断片、及びそれらの組み合わせがあげられる。

【0089】

用語「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」は、修復を誘導するために相同の鋳型を使用して、正確かつ精密に二本鎖ＤＮＡ切断を修復する細胞内のメカニズムを指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換え（ＨＲ）、ヌクレオチド配列が２つの類似する、又は同一のＤＮＡ分子間で交換される一種の遺伝的組換えである。

【0090】

用語「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、相同の鋳型を必要とすることなく切断末端を直接繋ぎ合わせる、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する経路を指す。

【0091】

用語「核酸」、「ヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖又は多重鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びそれらのポリマーを指す。該用語は、限定されないが、一本鎖、二本鎖、三本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基及び／又はピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された、非天然の、合成された、又は誘導体化された、ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの類似体の混合物を含み得る。具体的に限定されない限り、この用語は、参照される核酸と同様の結合特性を有し、自然発生のヌクレオチドと同様の方式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別記されない限り、特定の核酸配列はまた、その保守的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び明示される配列と共に相補的配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合基及び／又はデオキシイノシン残基と置換されている配列の生成により達成され得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされたｍＲＮＡと同義で使用される。

【0092】

用語「遺伝子」又は「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、個々の翻訳セグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）と共に、遺伝子産物の転写／翻訳、及び転写／翻訳の調節に関与する翻訳領域（リーダーとトレーラー）に先立つ領域と後続する領域を含み得る。

【0093】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、本明細書で区別なく使用される。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、自然発生のアミノ酸ポリマー及び非自然発生のアミノ酸ポリマーに加えて、対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用されるように、該用語は、完全長のタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、ここでアミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合により結合される。

【0094】

「組換え発現ベクター」は核酸構築物であり、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定の核酸要素で、組換えにより、又は合成されて生成される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルススゲノム又は核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、転写され、プロモーターに作用可能に結合される、ポリヌクレオチドを含む。この文脈での「作用可能に結合した」は、コード配列の転写を命令するプロモーターなどのエレメントの適切な生体機能を可能にする相対的な位置に配された、ポリヌクレオチドコード配列及びプロモーターなどの２つ以上の遺伝要素を意味する。用語「プロモーター」は、核酸の転写を命令する一連の核酸制御配列を指し、本明細書で使用される。本明細書において使用されるように、プロモーターは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列を含み、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡエレメント等である。プロモーターはまた、随意に、転写の開始位置から数千塩基対に位置し得る、遠位エンハンサー又は抑制因子エレメントを含む。発現ベクターに存在し得る他の要素には、転写を増強し（例えばエンハンサー）、及び転写を終了させる（例えばターミネーター）ものが含まれ、及び発現ベクターから生成される組換えタンパク質に対して結合親和性又は抗原性を与えるものが含まれる。

【0095】

「組換え体」は遺伝子組み換えのポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織又は有機体を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（あるいは組換えポリヌクレオチドのコピー又は補体）は、周知の方法を使用して操作されたものである。第２のポリヌクレオチド（例えばコード配列）に作用可能に結合したプロモーターを含む組換え発現カセットは、人間の操作の結果として第２のポリヌクレオチドに非相同なポロモーターを含み得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅｓ１－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４－１９９８）に記載の方法による）。組換え発現カセット（又は発現ベクター）は典型的に、本来は見られない組み合わせのポリヌクレオチドを含む。例えば、人間により操作された制限部位又はプラスミドベクター配列は、プロモーターに隣接し、又は他の配列からプロモーターを分離することができる。組換えタンパク質は組換えポリヌクレオチドから発現するものであり、及び組換え細胞、組織及び有機体は、組換え配列（ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド）を含むものである。

【0096】

用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、対立遺伝子内を含む、ポリヌクレオチドを伴う単一のヌクレオチドの変異を指す。これは、１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置き換えられること、及び単一のヌクレオチドの欠失又は挿入を含み得る。最も典型的には、ＳＮＰは２対立遺伝子のマーカーであるが、３対立遺伝子及び４対立遺伝子のマーカーもまた存在し得る。非限定的な例として、ＳＮＰ Ａ／Ｃを含む核酸分子は、多形性の位置にＣ又はＡを含む場合もある。

【0097】

用語「被験体」、「患者」及び「個体」は、ヒト又は動物を含み、本明細書で区別なく使用される。例えば、動物被験体は、哺乳動物、霊長類（例えばサル）、家畜動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギ）、伴侶動物（例えばイヌ、ネコ）、臨床試験用動物（例えばマウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に重要な動物、又は経済的に重要な動物であり得る。

【0098】

本明細書で使用されるように、用語「投与」は、被験体への経口投与、局所的接触、坐薬としての投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、損傷内投与、クモ膜下腔内投与、鼻腔内投与、又は皮下投与を含む。投与は、非経口及び口腔粘膜を含む任意の経路による（例えば、バッカル、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、又は経皮）。非経口投与は、例えば静脈内、筋肉内、小動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内を含む。他の送達方法として、限定されないが、リポソーム製剤、静脈注射、経皮パッチなどの使用があげられる。

【0099】

用語「処置（する）」は、限定されないが治療効果及び／又は予防効果を含む、有益又は望ましい結果を得るための手法を指す。治療効果は、処置下の１つ以上の疾患、疾病又は症状に対する、治療に関連する改善又は効果を意味する。予防効果については、組成物は、疾患、疾病又は症状がまだ現れていないとしても、特定の疾患、疾病又は症状が進行するリスクのある被験体に、又は疾患の１つ以上の生理学的症状が報告されている被験体に投与され得る。

【0100】

用語「有効な量」又は「十分な量」は、有益又は望ましい結果を達成するのに十分な薬剤（例えばＤＮＡヌクレアーゼ等）の量を指す。治療上有効な量は、以下の１つ以上に依存して変化し得る：処置される被験体と疾患の状態、被験体の体重と年齢、疾患の状態の重症度、投与方法等、これらは当業者によって容易に判定され得る。特定量は、以下の１つ以上に依存して変化し得る：選択される特定の薬剤、標的細胞の種類、被験体の標的細胞の位置、続く投与レジメン、他の化合物と併用されるか否か、投与のタイミング、及びそれが運ばれる物理的送達システム。

【0101】

用語「薬学的に許容可能な担体」は、細胞、有機体又は被験体への薬剤（例えばＤＮＡヌクレアーゼ等）の投与を助ける物質を指す。「薬学的に許容可能な担体」は、組成物又は製剤に含むことができる、患者に重大で有害な中毒作用をもたらさない担体又は賦形剤を指す。薬学的に許容可能な担体の非限定的な例として、水、ＮａＣｌ、正常食塩溶液、乳酸加リンゲル液、正常なスクロース、正常なグルコース、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、着香料、及び着色料などがあげられる。当業者は、他の医薬担体が本発明に有用であることを認識するだろう。

【0102】

参照数値に関する用語「約」は、その値の±１０％の値の範囲を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９～１１の量を含み、９、１０、１１の参照数を含む。参照数値に関する用語「約」はまた、その値の±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の値の範囲を含み得る。

【実施例0103】

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を現時点で代表するものであり、例示的なものであり、及び本発明の範囲を限定するものとしては意図されていない。その中での変更、及び特許請求の範囲により定義される本発明の精神内に包含される他の使用が、当業者に想到されるであろう。

【0104】

実施例１：方法

【0105】

プラスミド。ｇＲＮＡとｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＣＡＧｍＣｈｅｒｒｙ－ｇＲＮＡ）の両方を発現するベクターを生成した。ｇＲＮＡ発現ベクターを構築するために、２０ｂｐ標的配列の各々を、ｐＣＡＧｍＣｈｅｒｒｙ－ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ＿Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ４１８２４）へとサブクローニングした。ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ１２２５１、１２２５３及び１２２５９）を、レンチウイルスのパッケージングに使用した。ｐＥＧＩＰ＊３５及びｔＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ２６７７６及び２６８６４）を、ＨＤＲとＨＩＴＩの有効性を検討するために使用した。ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－０ｃ、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－１ｃ及びＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－２ｃを構築するために、ＩＲＥＳ及びｍＣｈｅｒｒｙ配列を、それぞれｐＥＧＩＰ＊３５及びｐＣＡＧｍＣｈｅｒｒｙ－ｇＲＮＡからＰＣＲによってＣａｓ９標的配列で増幅させ、ｐＣＲ－ｂｌｕｎｔＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと共組換えした。異なるＮＬＳ－ｄＣａｓ９構築物を生成するために、ｐＭＳＣＶ－ＬＴＲ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ＢＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ４６９１２）を使用してｄＣａｓ９を増幅させ、異なるＮＬＳ及び３ｘＦｌａｇタグを用いてｐＣＡＧ含有プラスミドへとサブクローニングした。ｐＣＡＧ－Ｃａｓ９（ＮＬＳ無し）、ｐＣＡＧ－１ＮＬＳ－Ｃａｓ９１ＮＬＳ、及びｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９１－ＢＰＮＬＳを構築するために、ｄＣａｓ９プラスミドのＤ１０ＡとＨ８４０Ａの突然変異を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって野生型配列に取り替えた。その後、ｐＣＡＧ－Ｃａｓ９－２ＡＧＦＰ（ＮＬＳ無し）、ｐＣＡＧ－１ＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＮＬＳ－２ＡＧＦＰ、及びｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ－２ＡＧＦＰを、Ｃａｓ９の下流に２ＡＧＦＰを加えることによって構築した。ｐＣＡＧ－ｆｌｏｘＳＴＯＰ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳを構築するために、１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳをＰＣＲによって増幅させ、ｐＣＡＧ－ｆｌｏｘＳＴＯＰ－ＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターのＧＦＰに取り替えた。マウス及びヒトＴｕｂｂ３遺伝子（Ｔｕｂｂ３－１ｃ、Ｔｕｂｂ３－２ｃ、ｈＴＵＢＢ３－１ｃ及びｈＴＵＢＢ３－２ｃ）のためのＨＩＴＩドナープラスミドを構築するために、１つ又は２つのＣＡＳ９／ｇＲＮＡ標的配列を備えたｐＣＡＧ－ｆｌｏｘＳＴＯＰプラスミドへと、ＧＦＰをサブクローニングした。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（Ｔｕｂｂ３ＨＲ）、ＧＦＰのためのＨＤＲドナーを構築するために、５’及び３’のホモロジーアームをｐＣＡＧ－ＧＦＰ－Ｎ１又はマウスゲノムから増幅させ、次にｐＣＡＧ－ｆｌｏｘＳＴＯＰプラスミドにサブクローニングした。ｐＣＡＧ－ＥＲＴ２－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２を、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した（１３７７７）。ＰＸ５５１とＰＸ５５２を、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した（６０９５７と６０９５８）。ＡＡＶ－Ｃａｓ９を構築するために、ｎＥＦ（ハイブリッドＥＦ１α／ＨＴＬＶ）プロモーター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＰＸ５５１のＭｅｃｐ２プロモーターに取り替えた。ドナー／ｇＲＮＡ ＡＡＶを構築するために、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列、ｇＲＮＡ発現カセット及びＧＦＰＫＡＳＨ（あるいはｍＣｈｅｒｒｙＫＡＳＨ）発現カセットによって挟まれたドナーＤＮＡを、ＰＸ５５２のＩＴＲの間でサブクローニングした。

【0106】

ゲノムＤＮＡ抽出及びゲノムＰＣＲ。すべてのゲノムＤＮＡは、Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）又はＰｉｃｏＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出された。全てのゲノムＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ）で行われた。

【0107】

重亜硫酸塩配列。形質移入されたＨＥＫ２９３株からのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して重亜硫酸塩を変換した。ｍＣｈｅｒｒｙの前述の領域のＤＮＡメチル化プロフィールを、前述のようにＴＯＰＯクローニングによって分析した（Ｌｉｕ，Ｇ．－Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＬＭＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉＰＳＣｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８，６８８－６９４（２０１１））。

【0108】

細胞株。Ｈ１ ｈＥＳＣを、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入し、ｈＥＳＣ培地で保全した（Ｌｉｕ，Ｇ．－Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ａｇｅｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉＰＳＣｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ－Ｇｉｌｆｏｒｄ ｐｒｏｇｅｒｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４７２，２２１－２２５（２０１１））。ＨＥＫ２９３細胞はＡＴＣＣから購入した。

【0109】

ＡＡＶ生成。すべてのＡＡＶを、血清型８又は血清型９でパッケージングした。

【0110】

動物。ＩＣＲ、Ｃ５７ＢＬ／６及びＲＯＳＡ^{ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏ}／ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（Ａｉ１４マウスとしても知られる、Ｍａｄｉｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｒｅ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３，１３３－１４０（２００９））を、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。妊娠しているＩＣＲマウスのいくつかは、ＳＬＣ Ｊａｐａｎ（静岡、日本）から購入した。ＲＣＳ及びＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットを、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。この研究に使用されたすべてのマウスは、雌雄混合、種混合の、Ｐ１から１２週齢のものからであった。すべてのマウス実験は、ＩＡＣＵＣ委員会又は理化学研究所発生・再生科学総合研究センターにより承認され、規制基準に準拠した。全てのラットの処置は、カリフォルニア大学サンディエゴ校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの認可を受けて、その監督下で行なわれ、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈを厳守した。膣栓の正午は胎生０．５日目（Ｅ０．５）として指定された。

【0111】

ミニサークルＤＮＡベクター。ミニサークルＤＮＡベクターの構築と生成は、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．－Ｙ．＆Ｃｈｅｎ，Ｚ．－Ｙ．Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１２８７－１２８９（２０１０）に以前に記載されているように行われた。手短に言えば、Ｐｒｅ－ミニサークルプラスミド（ｐＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＣ、ｐＴｕｂｂ３－ＭＣ、ｐｈＴＵＢＢ３－ＭＣ、ｐＡｉ１４－ＧＦＰ－ＭＣ、及びｐＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ）を構築するために、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的配列を備えたＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ又はルシフェラーゼ遺伝子を、ミニサークル産生プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸのＡｐａＩとＳｍａＩ部位へとクローニングした。最終的なミニサークル構築物を、大腸菌株３Ｓ２Ｔに導入し、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ｐＨ７．０）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一晩増幅した。一晩のＴＢ培養を、新鮮なＬＢ及び２０％のＬ－アラビノース（ＳＢＩ）を含むミニサークル誘導ミックスの等容積と混合し、続いて２５０ｒｐｍで振動させながら３２℃で５時間インキュベートすることで、ミニサークルの産生を誘導した。ミニサークルＤＮＡを、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３バッファーの量を２倍にしたことを除けば、メーカーのプロトコルに従って、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。

【0112】

Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。生成された核局在型のＣａｓ９の有効性を検討するために、ＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイをヒトＨ１ ＥＳＣで行なった。手短に言えば、各１．５×１０^７のフィーダーなしの培養されたＨ１ ＥＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離させ、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｃ．）を含む１ｍｌのＭＥＦ調整培地で再懸濁した。２５μｇのｐＣＡＧｍＣｈｅｒｒｙ－ＫＣＮＱ１と、２５μｇの異なるＣａｓ９（ｐＣＡＧ－Ｃａｓ９－２ＡＧＦＰ、ｐＣＡＧ－１ＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＮＬＳ－２ＡＧＦＰ、又はｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ－２ＡＧＦＰ）で細胞を電気穿孔し、マトリゲルでコーティングされた１００ｍｍの皿の上に平板培養した。電気穿孔の２日後に、細胞をＴｒｙｐＬＥにより分離し、及びＣａｓ９とｇＲＮＡを発現する細胞を、ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘセルソーター（ＢＤ）でＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙダブルポジティブ細胞として選別し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でゲノムＤＮＡを抽出して、Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，１７１－１９２（２０１２）に以前に記載されているように、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイのために使用する。

【0113】

ＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株の生成。分裂細胞においてＨＤＲとＨＩＴＩによる標的遺伝子修飾の有効性を評価するために、変異したＧＦＰ遺伝子ベースのレポーター系を、ＨＥＫ２９３において設定した。手短に言えば、公開されたプロトコル、Ｋｕｔｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．－Ｙ．＆Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ＨＩＶ－１－ｂａｓｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４，４９５－５０５（２００９）に従って、ｐＥＧＩＰ＊３５をｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ及びｐＭＤ２．Ｇと共に同時導入し、レンチウイルスベクターとしてパッケージングと精製を行った。ＨＥＫ２９３細胞を、レンチウイルスＥＧＩＰ＊３５ベクターと４μｇ／ｍｌのポリブレンで１時間、懸濁液中でトランスダクションした。残存するレンチウイルスベクターを除去するための短時間の遠心分離の後、細胞を１００ｍｍの皿に播種した。トランスダクションの３日後に、ピューロマイシン（１－２μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に加えた。１０日後に、単一コロニーを個別に採集し、ＨＥＫ２９３ ＧＦＰ修正株として拡張した。

【0114】

マウスニューロンの初代培養。ニューロンの初代培養を、Ｅ１５．５日齢のマウスの大脳皮質から得た。胚を回収した後、２％のグルコース（Ｇｉｂｃｏ）を有する１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の冷たい溶液中ですべての切開術を行った。皮質組織をトリプシン処理によって分離させ、１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２を、２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）及び０．２５％のＧｌｕｔａｍａｘ ＴＭ－Ｉ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、コーティングされたポリＤ－リジンカバーガラス（Ｎｅｕｖｉｔｒｏ）上に平板培養した。培養を標準的な条件でインキュベートした（３７℃、５％のＣＯ_２／９５％の大気の加湿雰囲気）。培地の体積の半分を３日ごとに取り替えた。

【0115】

ヒトＥＳＣ由来ニューロン全体の分化と培養。ヒトＥＳＣからニューロン全体への分化プロトコルは、当業者によって慣例的に使用されている方法を使用して行われた。

【0116】

インビトロ培養細胞の形質移入。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣｏｍｂｉＭａｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＤＮＡ－Ｉｎ Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔ（Ａｍｓｂｉｏ）を、ＨＥＫ２９３細胞、マウス初代細胞、及びヒトＥＳＣ由来ニューロン全体の、それぞれの形質移入に使用した。形質移入複合体を、メーカーの説明書に従って調製した。

【0117】

一次ニューロンの免疫細胞染色。細胞を室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定した。次に細胞をブロックし、５０分間、室温で震動させながら、ＰＢＳ中の５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理した。一次抗体を、抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ）及び抗βＩＩＩチューブリン（Ｓｉｇｍａ）抗体と共に、湿ったチャンバー内で、４°Ｃで一晩、２．５％のＢＳＡ／ＰＢＳ中でインキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳ中の０．２％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中の０．２％のＴｗｅｅｎ２０での２回目の洗浄後、ＤＡＰＩ－Ｉ－Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して細胞を封入し、４℃で保存した。無分裂の状態を検査するために、形質移入されたニューロンに２μＭ ＥｄＵを加え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＥｄＵ陽性細胞を検出した。

【0118】

一次組織の免疫細胞染色。ＰＢＳ、続いて４％のＰＦＡを使用し、経心腔的灌流後に、動物を回収した。臓器をそれぞれ切開し、４℃で１６－２０時間、ＰＢＳ中の２％のＰＦＡと１５％のスクロースでその後に固定し（ｐｏｓｔ－ｆｉｘｅｄ）、切断前に４°ＣでＰＢＳ中の３０％のスクロースに浸した。マウスの脳を、４℃で２４時間、０．１Ｍのリン酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中の１％のＰＦＡに固定し、その後、４℃で一晩、２５％のスクロース中で凍結保護した。新生児の脳については、脳をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に埋め込み、クリオスタット（１４μｍ）で切断した。よく乾燥させた切片を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の１％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、室温で１時間、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％のロバ血清と０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ７．４）で処理し、次に４°Ｃで一晩、同じバッファーで希釈した一次抗体と共にインキュベートした。使用された一次抗体は、Ａｎｔｉ－ＧＦＰ（Ａｖｅｓ）とＡｎｔｉ－ＲＦＰ（Ａｂｃａｍ）であった。切片をＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１時間、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５４６（Ｊａｃｋｓｏｎ）に結合させた二次抗体で処理した。洗浄後、切片を封入剤（ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で封入した。成体の脳については、５０μｍの冠状の脳切片を、凍結ミクロトームを使用して調製し、４°Ｃで０．０１％のアジ化ナトリウムでＰＢＳ中に保存した。浮動性の切片を、ＰＢＳ中のヤギの抗ＧＦＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）一次抗体／０．５％の正常なロバ血清／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で、４℃で１６－４８時間インキュベートし、続いて室温で２－３時間、Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と結合した適切な第２の抗体でインキュベートした。細胞核を視覚化するために、切片を３０分間、ＰＢＳ中の１０μＭのＤＡＰＩで対比染色した。免疫染色された組織切片を、ＤＡＢＣＯを含むポリビニルアルコール封入剤でスライドに封入し、一晩、空気乾燥させた。他の組織については、採取した組織をＯＣＴ化合物に埋め込んで凍結した。凍結した連続切片又は軸性の凍結切片（厚さ１０－２０μｍ）を、クリオスタットを使用して調製し、次にシラン処理したスライドに配置して風乾させた。切片をＰＢＳで洗浄し、次に室温で１時間、ＰＢＳ中の３％の正常なヤギ血清、０．３％及びトリトンＸ－１００を含むブロッキングバッファーによってインキュベートし、その後、一次抗体の溶液で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は、抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｂｃａｍ）、抗ジストロフィン（Ｓｉｇｍａ）、抗アクチン、α－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ）及び抗ヒト血清アルブミン抗体（Ｒ＆Ｄ）であった。洗浄後、切片を室温で１時間、二次抗体の溶液で免疫染色した。使用された二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８、５６８又は６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）であった。０．２％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、及びＰＢＳでの連続した洗浄後、切片をＤＡＰＩ Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で封入した。ラットについては、網膜の凍結切片をＰＢＳですすぎ、室温で１時間、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００でブロックした。Ａｎｔｉ－Ｍｅｒｔｋ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ａｎｔｉ－Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡに希釈して、４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中で、Ａｌｅｘａ－４８８又はＡｌｅｘａ－５５５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でタグ付けしたＩｇＧ二次抗体でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した。切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で封入し、カバーグラスをかけた。ＫｅｙｅｎｃｅＢＺ－９０００顕微鏡を使用して画像をキャプチャした。

【0119】

画像キャプチャ及び分析。免疫細胞染色分析のために、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ又はＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００ 共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、共焦点顕微鏡検査によって細胞と組織を視覚化した。顕微鏡を反転させ、少なくとも５つの画像を各カバーガラスから得た。ＺＥＮ ２（ｂｌｕｅ ｅｄｉｔｉｏｎ）及びＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）ソフトウェアで画像を分析した。マウスの一次ニューロン及びヒトのニューロン全体の分析のために、各マーカーごとの陽性細胞の総数を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアのＭｕｌｔｉ－ｐｏｉｎｔ ｔｏｏｌで直接数えた。ＧＦＰ＋細胞の割合を、トランスフェクト細胞の量を考慮して計算した。細胞内のＧＦＰ分布を各条件ごとに約１００の独立事象で観察し、ここで、核空間でのＧＦＰの存在又は欠如を判定するために、異なるスタックで焦点を合わせた細胞を観察した。

【0120】

核／細胞質の比率。ｄＣａｓ９の細胞内での局在性を評価するために、既になされた報告に倣った（Ｗｕ，Ｊ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ａ．Ｈ．＆Ｂｅｒｌａｎｄ，Ｋ．Ｍ．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ＮＬＳ ｃａｒｇｏｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９６，３８４０－３８４９（２００９））。要するに、ｄＣａｓ９トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を４％のＰＦＡで固定し、抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）及びＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）で染色した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアのＰｌｏｔＰｒｏｆｉｌｅツールを使用して、蛍光の強度を測定した。単一のトランスフェクト細胞の細胞質と核区画において個別に値を得た。核／細胞質の比率を得るために、核強度の相対的な蛍光値を、細胞質で見出した数値で割った。

【0121】

子宮内電気穿孔によるマウス胚への遺伝子導入。電気穿孔のための実験手順は、以前に記載されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，＆Ｏｓｕｍｉ Ｎ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ５０，４８５－４９７（２００８））。１０％のネンブタール（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ ｓｕｍｉｔｏｍｏ ｋａｇａｋｕ）の５００μｌの腹腔内注射によって、Ｅ１５．５の妊娠しているＩＣＲに麻酔をかけた。ｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳマウスＴｕｂｂ３遺伝子標的ｐＣＡＧｍＣｈｅｒｒｙ－ｇＲＮＡ（０．５μｇ／μｌ）、及びミニサークルドナー（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ）又はＨＤＲドナー（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ）のいずれかのベクター（０．８μｇ／μｌ）を含む１μｌのＤＮＡ混合物を用いて、胚を半球に注入した。視覚的に注入を確認するために、０．００５％のファーストグリーン溶液（Ｗａｋｏ）をＤＮＡと混合した。ピンセット電極（ＣＵＹ２１ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ、ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ）のパドルで胚を取り除いた。Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９発現系を誘導可能なタモキシフェン（ＴＡＭ）に関しては、ｐＣＡＧ－ｆｌｏｘ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ（０．５μｇ／μｌ）、ｐＣＡＧ－ＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２（０．５μｇ／μｌ）、ｐＣＡＧ－ｍｃｈｅｒｒｙ－Ｕ６－ｇＲＮＡ（０．５μｇ／μｌ）、及びミニサークルドナー（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ）又はＨＤＲドナー（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ）のいずれかのベクター（０．８μｇ／μｌ）を含む、１μｌのＤＮＡ混合物を用いて、胚を半球に注入した。コーン油に溶かした１０ｍｇ／ｍｌのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）を５０μｌ、Ｃａｓ９発現の誘導のために、Ｐ１０とＰ１１で電気穿孔したコイヌに注入した。

【0122】

インビボ筋肉電気穿孔。－Ｃａｓ９（２５μｇの空ベクター、２５μｇのｇＲＮＡ発現ベクター、１０μｇのＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ又はＡｉ１４－ＧＦＰ－ＭＣ）、及び＋Ｃａｓ９（２５μｇのｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ、２５μｇのｇＲＮＡ発現ベクター、及び１０μｇのＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ又はＡｉ１４－ＧＦＰ－ＭＣ）用のＤＮＡ混合物を、５０μｌのＴＥに調製した。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いてＡｉ１４マウスに麻酔をかけた。大腿四頭筋電気穿孔のために、大腿四頭筋のごく一部を、後ろ足において外科的に露出させた。プラスミドＤＮＡ混合物を、２９ゲージのインスリン用シリンジを使用して筋肉に注入した。プラスミドＤＮＡ注射の１分後に、１組の電極を、ＤＮＡ注射部位を包含するように５ｍｍの深さまで筋肉に挿入し、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して筋肉を電気穿孔した。電気刺激を、２０ミリ秒間、２０パルス、１００Ｖで送達した。電気穿孔の後、皮膚を閉じ、マウスを３７°Ｃの暖かいパッドの上で回復させた。皮筋の電気穿孔のために、背中の皮膚の毛を脱毛クリームで除毛した。上記のＤＮＡ溶液の混合物を共役させ、右側と左側にそれぞれ皮下注射した。皮膚と皮下組織の注入面積は、プレート・フォーク型電極により垂直にはさまれ、これは１対のステンレス鋼ピンセットから成り．その１つは長さ１０ｍｍ及び幅５ｍｍの長方形のプレートを備え、もう１つは長さ１０ｍｍ及び直径０．５ｍｍの、２．５ｍｍ間隔の３本の直針から成るフォークを備える。皮膚と長方形の電極の接触面を、導電ゲル（ＳｐｅｃｔｒａＧｅｌ ３６０，Ｐａｒｋｅｒ Ｌａｂｓ）で被覆した。Ｔｗｅｎｔｌｙ１８Ｖ／５０ｍｓ／１Ｈｚ－方形波を、続いて反極性の２０パルスをさらに、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０を使用して送達した。電気穿孔の２週間後にマウスを安楽死させ、そして組織を得た。

【0123】

組織圧を媒介とした形質移入。－Ｃａｓ９（１００μｇの空ベクター、１００μｇのｇＲＮＡ発現ベクター、及び５０μｇのＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ）、及び＋Ｃａｓ９（１００μｇのｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９－１ＢＰＮＬＳ、１００μｇのｇＲＮＡ発現ベクター、及び５０μｇのＡｉ１４－ｌｕｃ－ＭＣ）のためのＤＮＡ混合物を、２００ｕｌの生理食塩水中で調製した。正中線での開腹術を行い、Ａｉ１４マウスの右腎を露出させた。腎臓の露出後、マウスにプラスミドＤＮＡ混合物を静脈注射し、その直後に、（Ｍｕｋａｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．＆Ｈａｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｒｅｎａｌ ｐｒｅｓｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ ｔｏ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３７２，３８３－３８７（２００８））に記載されるように、親指と人差し指でつかんだ右腎を１秒間に２０回、押した。

【0124】

腎臓のためのインビボ電気穿孔。－Ｃａｓ９（１００ｕｇの空ベクター、１００ｕｇのｇＲＮＡ発現ベクター、及び５０ｕｇのＡｉ１４－ＧＦＰ－ＭＣ）、及び＋Ｃａｓ９（１００ｕｇのｐＣＡＧ－１ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９１ＢＰＮＬＳ、１００ｕｇのｇＲＮＡ発現ベクター、及び５０ｕｇのＡｉ１４－ＧＦＰ－ＭＣ）のためのＤＮＡ混合物を、２００ｕｌの生理食塩水中で調製した。正中線での開腹を行なった。Ａｉ１４マウスの右腎を露出させ、その後カプセルを除去し（ｄｅｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、副腎には手をつけなかった。その後、露出させた腎臓を、尾静脈からのプラスミドＤＮＡ混合物の注入後に電極針でつつき、続いてＥｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０を使用し１００Ｖ、５０ｍｓパルスで６回、電気穿孔をした。

【0125】

ルシフェラーゼ検出。ＤＮＡ形質移入又は電気穿孔の２週間後に、ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ ２２００（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＬＩを行うことで、マウスを検査した。１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（ＢＩＯＳＹＮＴＨ）をマウスに腹腔内注射し、イソフルランで麻酔をかけ、そしてルシフェリン注入の１０分後に背側の画像をキャプチャした。

【0126】

マウスの一次ニューロンにおけるＡＶＶ感染。３日後にニューロンの初代培養を培養に使用し、ＡＡＶ溶液（－Ｃａｓ９、ＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３（１．５ｘ１０^１０ＧＣ）；＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ｃａｓ９（１．５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３（１．５ｘ１０^１０ＧＣ））を加え、免疫細胞染色又はＤＮＡ抽出後に、培養を５日間、標準状態で維持した。

【0127】

成人の脳へのＳｔｅｒｅｏｔａｘ ＡＡＶ注入。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＰ７５にＡＡＶ注入を受けた。ＡＡＶ－Ｃａｓ９（１．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｍｌ）とＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３（２．３ｘ１０^１３ＧＣ／ｍｌ）の１：１混合物を使用した。対照として、ＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３とＨＢＳＳバッファーの１：１混合物を使用した。腹腔内注射を介して、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンと１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンのカクテルでマウスに麻酔をかけ、外科手術と定位固定の注入のためにｓｔｅｒｅｏｔａｘ（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ９４０シリーズ）に固定した。以下の座標を使用して、ウイルスをＶ１の中央に注入した：吻側３．４ｍｍ、ブレグマに対して外側２．６ｍｍ、及び軟膜から０．５－０．７ｍｍ腹側。２００ｎｌのＡＡＶを、ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖａｌｖｅ Ｃｏｒｐ）により気圧を使用して注入した。ウイルスの逆流を防ぐために、注入の完了後に５～１０分間、ピペットを脳の中に残した。遺伝子ノックインを可能にするためにマウスを２週間、収容した。

【0128】

筋肉内ＡＡＶ注入。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いてＡｉ１４マウスに麻酔をかけた。大腿四頭筋のごく一部を、後ろ足において外科的に露出させた。ＡＡＶ混合物（－Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（１．５ｘ１０^１０ＧＣ）；＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ｃａｓ９（１．５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（１．５ｘ１０^１０ＧＣ））を、２９ゲージのインスリン用シリンジを使用して大腿四頭筋に注入した。電気穿孔の後、皮膚を閉じ、マウスを３７°Ｃの暖かいパッドの上で回復させた。

【0129】

静脈内（ＩＶ）ＡＡＶ注入。Ａｉ１４マウスの新生児（Ｐ１）を、以下の既出の報告に従ってＩＶ ＡＡＶ注入のために使用した（Ｌａｍｐｅ，Ｓ．Ｅ．Ｇ．，Ｋａｓｐａｒ，Ｂ．Ｋ．＆Ｆｏｕｓｔ，Ｋ．Ｄ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｉｃｅ．ＪｏＶＥ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ｅ５２０３７－ｅ５２０３７（２０１４）．ｄｏｉ：１０．３７９１／５２０３７）。ＡＡＶ混合物（－Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（５ｘ１０^１０ＧＣ）；＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ｃａｓ９（５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（５ｘ１０^１０ＧＣ））を、Ｐ１のマウスの側頭部を流れるいくつかの静脈を介して注入した。

【0130】

尾静脈ＡＡＶ注入。ＡＡＶ混合物（－Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ａｉ１４－ｌｕｃ（５ｘ１０^１０ＧＣ）；＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ｃａｓ９（５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ｌｕｃ（５ｘ１０^１０ＧＣ））を、ルシフェラーゼノックイン用に尾静脈を介して注入した。ＡＡＶ混合物（－Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（５ｘ１０^１０ＧＣ）；＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ－Ｃａｓ９（５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰ（５ｘ１０^１０ＧＣ））を、ＧＦＰノックイン用に尾静脈を介して注入した。

【0131】

標的ディープシーケンス。トップ１２の予測されるオフターゲット部位を、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを使用して探索した（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２７－８３２（２０１３））。オンターゲット領域及び潜在的オフターゲット領域を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ＩＶ注入を介して肝臓ＤＮＡから増幅し、ライブラリ構築に使用した。ゲノムＤＮＡの等量を、ライブラリ構築のための、オンターゲット及びトップ１２の予測されるオフターゲットのヌクレアーゼ結合部位に隣接するゲノム領域を増幅するために使用した。次に、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＰＣＲアンプリコンを精製し、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプター及びサンプル特異的なバーコードを取り付けるために２回目のＰＣＲにさらした。精製されたＰＣＲ生成物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して、シングルエンドシーケンシングのために等比でプールした。生の読み取り値を、ＢＷＡを使用してマウス参照ゲノムｍｍ９にマッピングした（Ｌｉ，Ｈ．＆Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１７５４－１７６０（２００９））。Ｆｒｅｅｂａｙｅｓを使用して、ヌクレアーゼ結合部位の５ヌクレオチド上流から、５ヌクレオチド下流（合計３２ｂｐ）までの挿入と欠失（インデル）事象に関して、高品質の読み取り値（スコア＞３０）を分析した。

【0132】

ラットへの網膜下注入。２１日齢の類遺伝子性のＲＣＳラットを試験に使用し、２つのグループに分けた。グループＡ（ｎ＝３）は、２ｕｌのＡＡＶ混合物（ＡＡＶ－Ｃａｓ９（１．５ｘ１０^１０ＧＣ）及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋ（１．５ｘ１０^１０ＧＣ））の網膜下注射を目に受けた。グループＢ（ｎ＝３）には、ベシクルの注入を受ける負の対照として、偽薬を注入した。注入を受けない野性型ラット（ｎ＝３）を、正常な対照として使用した。ケタミンとキシラジンの混合物の腹腔内注射により実験用ラットに麻酔をかけた。１％の局所用トロピカミドで瞳孔を拡大させた。ポンプマイクロインジェクション装置（Ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ ＩＩＩ；Ｐａｒｋｅｒ Ｈａｎｎｉｆｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と、ガラスマイクロピペット（内部直径５０～７５ｍ）と共に解剖顕微鏡を使用して、網膜下注入を直接の可視化の下で行なった。２ｕｌのＡＡＶ混合物を、強膜の小さな切開を通じて網膜下腔に注入した。小さな網膜下液のブレブの生成により、注入の成功を判断した。注入後直ちに眼底検査を行ない、出血などの網膜損傷の徴候を見せたラットを廃棄して、最終的な動物数から除外した。

【0133】

ＥＲＧ記録。視覚を救う際の遺伝子ノックインの有効性をモニタリングするために、組織学のために動物を屠殺する前に、ＥＲＧ試験を処置の４週間後に行なった。暗順応のＥＲＧ応答を、以前に記載されたように記録した（Ｓａｕｖｅ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｂ．＆Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｕｌｌ ｆｉｅｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ ａｎｄ ｐｅｒｉｍｅｔｒｙ－ｌｉｋｅ ｖｉｓｕａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ ｉｎ ＲＣＳ ｒａｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｂｙ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４，９－１８（２００４））．要するに、各ＥＲＧ記録セッションの開始に先立って、ラットを１４時間、暗順応させた。上記の外科的処置に関して記載されたように、それらに深く麻酔をかけた。瞳孔の拡張を促進するために、１％の局所用トロピカミドで目を処置した。各ラットを固定状態で試験し、ガンツフェルトボウル（Ｇａｎｚｆｅｌｄ ｂｏｗｌ）（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ）内の検査のための位置に入れた。１つの活性レンズ電極を各角膜に配置し、皮下に配置された接地針電極を後尾に位置づけ、及び基準電極を２つの目のほぼ中間の頭部領域の皮下に配置した。ガンツフェルトボウル内で、０．０１と０．３ｃｄ／ｍ^２で、光刺激をキセノンランプで送達した。フリッカーＥＲＧ測定のために、ラットを１０ｃｄ／ｍ^２の背景光に適応させて、光刺激を３０ｃｄ／ｍ^２に設定した。その記録を、Ｄｉａｇｎｏｓｙｓにより供給されたソフトウェアを使用して処理した。

【0134】

ラットに関する組織学的分析。ＥＲＧ記録の後に、ラットを犠牲にして、ＯＮＬ保存の組織学的評価のために網膜の断面図を用意した。ラットをＣＯ_２で安楽死させ、目を切開して％のＰＦＡに固定した。角膜、水晶体、及び硝子体を、網膜を害することなくそれぞれの目から取り出した。眼杯を含む残りの網膜を、３０％のスクロースに浸潤させ、ＯＣＴ化合物に埋め込んだ。水平な凍結切片をクリオスタット上で切断した。網膜の横断切片を、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色することにより、組織学的評価のために調整した。

【0135】

ラットの目からのＤＮＡ抽出及び遺伝子型判定。ゲノムＤＮＡを、上記の埋め込まれた眼杯サンプルの凍結切片から単離した。２０の凍結切片を切り取り、この材料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移して、確立されたプロトコルを使用してＤＮＡ抽出の対象にした（Ｔａｌａｕｌｉｋａｒ，Ｄ．，Ｓｈａｄｂｏｌｔ，Ｂ．，ＭｃＮｉｖｅｎ，Ｍ．＆Ｄａｈｌｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｅ．ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｆｏｒｍａｌｉｎ‐ｆｉｘｅｄ ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｐａｒａｆｆｉｎ‐ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒｅｐｈｉｎｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｍａｔｔｅｒ？Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４０，７０２－７０６（２００８））。ＤＮＡの質（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０）及び量（ＯＤ２６０）を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）装置を使用して測定した。ＰＣＲと、遺伝子型決定のための直接ＤＮＡシーケンシングのためにＤＮＡを使用した。

【0136】

統計分析。結果は平均±ｓ．ｄとして示される。スチューデントのｔ検定で比較を行った。

【0137】

実施例２：効果的な標的導入遺伝子組み込みのための相同性に依存しない戦略

【0138】

機能欠失型変異により引き起こされた有害な細胞表現型と戦うための主な治療方法の１つは、野生型遺伝子のコピーの細胞内輸送に依存する。この点に関して、急速に発展しつつある分野であるウイルス媒介性の遺伝子置換療法は、いくつかの解決策を提供するが、導入遺伝子のコピー数と発現レベルに対する不完全な制御、及び挿入突然変異と癌原遺伝子の活性化などの有害な表現効果のリスクゆえの限界がある。相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用する部位特異的な導入遺伝子組み込みは、このような問題に最も適切な解決策を提供する。しかしＨＤＲの有用性は、大半の初代細胞型において、その有効性の低さゆえの限界がある。さらに、ＨＤＲは細胞周期のＳ／Ｇ２期中にのみ生じ、これにより出生後の動物組織に広く認められる非分裂細胞へのアクセスを不可能にする。他の主要なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、増殖細胞と分裂終了細胞の両方を含む、様々な成体の細胞型の細胞周期全体にわたって活性がある。加えてほとんどの場合、ＮＨＥＪ活性は高等生物におけるＨＤＲのそれよりもはるかに高いことがわかっており、筋ジストロフィーのマウスモデルに関して、筋肉機能を改善するためのインビボでの効果的な標的遺伝子破壊のために、直近に利用された。これらの特質は、可能であれば、標的ノックインのためのＮＨＥＪ経路のハイジャックが、ＨＤＲに関連するハードルのいくつかに打ち勝つための有益なアプローチを構成し得ることを示唆する。相同性に依存しないＮＨＥＪベースのＤＮＡライゲーションに頼る方法に関して、正確な導入遺伝子の挿入のためにＨＤＲを回避することが提案されてきたが、分裂終了細胞でのそれらの有効性は捉えがたいままである。さらに、現在までに、成体の動物におけるインビボでの応用のために、そのような戦略を利用することができるかどうかは未知である。この目的のために、相同性に依存しない堅調な戦略が、分裂細胞と分裂終了細胞の両方における、インビボでの効果的な標的導入遺伝子組み込みのために開発された。

【0139】

より堅調なＮＨＥＪベースの標的ノックインのために、既存の方法を改良した。分裂細胞におけるＨＤＲ及びＮＨＥＪベースの遺伝子ターゲティング活性のノックイン効率を測定するために、ＨＥＫ２９３株が生成され、ＥＦ１αプロモーターによって駆り立てられる突然変異ＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ修正ＨＥＫ２９３株として指定）を安定的に発現した。次に、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ及び異なるドナープラスミドを同時導入した。ＨＤＲ及びＨＩＴＩ（相同性に基づかない標的化組み込み方法）を介した標的遺伝子組換えの有効性は、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙのシグナルによりそれぞれ判定された（図１Ａ）。このシステムを使用して、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＨＥＪ対ＨＤＲドナー（ｔＧＦＰ）を介した１カットのドナー（ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－１ｃ）の組み込みの有効性がより高いことを確認した（図１Ｂ、図１Ｃ）。しかしながら、恐らくｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子内のＤＮＡメチル化の増加ゆえに、培養中のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の割合は経時的に減少したことが認められた（図１Ｄ、図１Ｅ）。細菌の骨格の封入により遺伝子抑制が引き起こされたのかもしれないと推論された。これを克服するために、ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の両側にｇＲＮＡ認識配列を宿す２カットのプラスミド（ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－２ｃ）、及び細菌骨格を欠いたミニサークルＤＮＡ（ＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＣ）を設計して試験した。８０日後の培養中で、より明白ではないＤＮＡメチル化、及び有意により高い割合のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞によって証明されるように、高い有効性と最小限のサイレンシングで標的ゲノム遺伝子座に両方のプラスミドを挿入することができた（図１Ａ－１Ｅ）。これらの結果は、これまでに報告された１カットのドナーよりも、２カット及びミニサークルのドナープラスミドによって開始される導入遺伝子の安定性の方が高いことを実証した。ミニサークルドナーでの有効性が、１カット及び２カットのドナーの有効性よりも高いことに留意されたい。ＮＨＥＪ阻害剤ＮＵ７０２６での処置は、ＨＩＴＩの有効性を有意に減少させ、ＮＨＥＪ修復機構によってＨＩＴＩが媒介されることを示唆している（図５Ｂ）。結合前のＤＮＡ末端のプロセシングの必要性次第で、古典的なＮＨＥＪを媒介としたＤＳＢ修復は、誤りのある末端結合又は誤りのない末端結合のいずれかを生み出す。サンガー法の結果は、組み込みに際して大部分の結合部位に挿入又は欠失（インデル）がないことを示し、誤りのない修復がこの文脈において有力であることを示唆している（図５Ｃ－Ｅ）。標的挿入の方向性を調べるために（図５Ａ）、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を選別して、単細胞クローンを生成した。試験した４８のクローンのうち１つのみが（２．１％）、反対方向に組み込まれたＩＲＥＳｍＣｈｅｒｒｙカセットを示し、ＨＩＴＩが主として一方向性のノックインを生成したことを示す（図５Ｆ）。総合すれば、２カット又はミニサークルのドナープラスミドを用いたＨＩＴＩ方法は、ＮＨＥＪベースのＤＳＢ修復を介して、より安定的で効果的な導入遺伝子組み込みを提供することが、この結果により実証される。

【0140】

実施例３：非分裂細胞における遺伝子送達

【0141】

ノックインの有効性に加えて、Ｃａｓ９の核内送達は、特に非分裂細胞に関して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ターゲティング効果を高めるであろうと仮定された。この目的のために、Ｃａｓ９の核輸送を、核移行シグナル（ＮＬＳ）の設計の最適化によって改善した。触媒作用の不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）に付けられた一連のＮＬＳを設計して構築し、及び核／細胞質の比率をＨＥＫ２９３細胞への送達に際して評価した。人工の長いＮＬＳ（二連のＳＶ４０ ＮＬＳ又はＢＰＮＬＳ）は、２つのＳＶ４０ＮＬＳで挟まれた従来のＣａｓ９よりも、核内でのｄＣａｓ９の富化においてより強力であることが、結果により明らかになった（図６Ａ－Ｃ）。結果的に、ＢＰＮＬＳによって付与された核局在の有効性の増加は、触媒的に活性なＣａｓ９を用いたヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）におけるより効果的なゲノム編集をもたらした（図６Ｄ及び６Ｅ）。

【0142】

ＨＩＴＩ方法を、非分裂細胞においてインビトロで試験した。この目的のために、Ｅ１４．５マウスの一次ニューロンを単離し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ構築物での形質移入の前に異なるドナープラスミドと共に、インビトロで３日間培養した。ドナープラスミドを、Ｔｕｂｂ３遺伝子のＧＦＰ下流の標的挿入のために設計し、結果として内因性のＴｕｂｂ３プロモーター下でのＴｕｂｂ３－ＧＦＰ融合タンパク質の発現がもたらされた。正確なＧＦＰノックインは、ＧＦＰシグナルの細胞質内局在によって判定された。培養されたニューロンが本物の分裂終了細胞であったことを確認するために、形質移入されたニューロンを、増殖細胞を追跡するためにＥｄＵで処理した。形質移入の５日後に、ＧＦＰ発現を分析した（図１Ｆ）。細胞質でＧＦＰを発現した多くのニューロンが見つかり、それらはβ－ＩＩＩチューブリン／Ｔｕｊ１との共存下にあり、修正された遺伝子ノックインが確認された（図１Ｇ）。重要なことに、ＧＦＰ＋細胞はＥｄＵであることがわかり、ＨＩＴＩを媒介とした遺伝子ノックイン事象が非分裂細胞で起こったことが実証された（図１Ｈ）。３つのドナープラスミド（１カット（Ｔｕｂｂ３－１ｃ）、２カット（Ｔｕｂｂ３－２ｃ）、及びミニサークル（Ｔｕｂｂ３－ＭＣ））の比較は、２カット及びミニサークルのドナーが１カットのドナー（～３０％）よりも、形質移入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋ニューロンごとに有意に高いＧＦＰノックインの有効性（～６０％）を有していることを明らかにした（図１Ｉ）。ＧＦＰシグナルは、ミニサークルドナーを有する細胞質にもっぱら局在することがわかり、しかし１カット及び２カットのドナーは、より低い細胞質分布を示した（図１Ｊ及び図７）。これらの結果は、細菌骨格及びｐｏｌｙＡなどのＤＮＡ配列の封入が、Ｔｕｂｂ３－ＧＦＰの内因性の局在パターンを混乱させることを示す。最小限のインデルを伴う正確な遺伝子ノックインをさらに、ＰＣＲとシーケンシングによって確認した（図１Ｋ、図８Ａ及び図８Ｂ）。異なるＮＬＳの効果の比較は、分裂細胞に類似する非分裂ニューロンにおける従来のＳＶ４０ＮＬＳよりも、ＢＰＮＬＳでのより優れたノックイン効率を実証した（図１Ｌ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、及び図６Ｅ）。さらに、ＨＩＴＩはまた、ヒトＥＳＣ由来のニューロン全体を使用した、ヒトＴｕｂｂ３遺伝子座下流のノックインＧＦＰに有効であった（図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｄ）。

【0143】

実施例４：インビボでのゲノム編集

【0144】

インビボでのゲノム編集治療は、広範な標的細胞型を、特にインビトロ培養に適用可能でないものを含む、エクスビボ戦略に対するいくつかの有利性を提供し、したがって多数の組織を標的とする潜在力を有する。培養細胞におけるＨＩＴＩの実証の成功後、ＨＩＴＩの有効性を生きている動物で判定した。インビトロでの最適化研究に基づいて、ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９をインビボ実験のためにミニサークルドナーと共に選択した。Ｔｕｂｂ３遺伝子座でのノックインＧＦＰを、子宮内電気穿孔、脳試験のための確立された非ウイルス媒介インビボ遺伝子送達法により、Ｅ１５．５マウス胚で試みた。生誕の３週間後、２０パーセントの成功裡に形質移入された細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）は、脳内で細胞質ＧＦＰ発現を示した（図２Ａ－Ｃ）。ＨＩＴＩ構築物を伴うＥ１５．５における電気穿孔された前駆細胞は、依然として有系分裂的に活性であり、ＨＩＴＩが非分裂細胞に実際に生じたかどうかの確認を妨げた。ＨＩＴＩを媒介とした有系分裂後のノックインを明白に実証するために、タモキシフェン（ＴＡＭ）誘導可能なＣｒｅ依存Ｃａｓ９発現系を、ｇＲＮＡ及びＴｕｂｂ３－ＭＣドナーと共に、Ｅ１５．５の胎児の脳へと、子宮内電気穿孔を介して送達した。Ｃａｓ９発現を、ＴＡＭ処置を介してＰ１０とＰ１１で誘発し、この段階では、電気穿孔された前駆細胞はすでに有系分裂後のニューロンに分解していた（図２Ｄ）。Ｔｕｂｂ３－ＭＣドナーＤＮＡによるＧＦＰノックインのより高い有効性と、ＨＤＲドナー（Ｔｕｂｂ３－ＨＤＲ）でのノックインのほぼ皆無の有効性が、結果により明らかになった（図２Ｅ及び図２Ｆ）。これらの結果は、ＨＩＴＩがさらに、分裂終了細胞における導入遺伝子の標的挿入にインビボで効果的であることを示す。

【0145】

インビボでの応用のためのＨＩＴＩの有用性を広げるために、標的ノックインを、様々な他の体細胞組織でＨＩＴＩプラスミドを使用して試験した。この目的のために、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に恒常的に活性のあるＣＡＧプロモーターを挿入したＡｉ１４マウスを使用した。筋肉と腎臓の組織を編集するためのＨＩＴＩの有効性を検討するために、ミニサークルドナープラスミドをコードするＧＦＰ又はルシフェラーゼ（それぞれＡｉ１４ＧＦＰ－ＭＣ又はＡｉ１４ｌｕｃ－ＭＣ）を、電気穿孔又は圧力を媒介とした形質移入のいずれかによって、ＢＰＮＬＳ－Ｃａｓ９とｇＲＮＡと共に送達した（図２Ｇ）。電気穿孔の８日後に、ルシフェラーゼシグナルを、ルシフェラーゼミニサークルドナーのための大腿四頭筋細胞で検出した（図２Ｈ）。ＧＦＰミニサークルドナーが送達された時、少量の核局在ＧＦＰがさらに、大腿四頭筋と脂肪層の筋肉細胞において見られた（図２Ｉ）。同様の結果は腎臓でも観察された（図２Ｊ－Ｌ）。これらの結果は、様々な体細胞組織に対する標的導入遺伝子ノックインのためのＨＩＴＩの適用可能性を実証する。

【0146】

実施例５：ＨＩＴＩのアデノ随伴ウイルス送達

【0147】

効果的ではあるが、電気穿孔と形質移入を介したプラスミド送達は、インビボでの適用には効果的ではなく、堅調でもない。効果的で正確なインビボ遺伝子送達のために選択された方法はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。したがって、インビボでのＨＩＴＩの有効性と有用性の改善を試みるために、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡを２つのＡＡＶベクターに充填した。ベクターの１つは、最小限の構成的ハイブリッドプロモーター（ｎＥＦ）により駆り立てられるＳＶ４０ＮＬＳによって挟まれたＣａｓ９を宿した（ＡＡＶ（ＡＡＶ－Ｃａｓ９）の限定されたクローニング能力ゆえに、ＢＰＮＬＳの代わりに）。別のベクターは、Ｔｕｂｂ３－ｇＲＮＡ発現カセット、２カットのドナー、及び蛍光性マーカー（ＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３）を収容するように構成された。両ＡＡＶを、血清型８でパッケージングし、それは事前に多くの臓器に対する高い感染能力と治療上の安全性を示した（図３Ａ）。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３に同時感染した培養された初代神経細胞は、細胞質でＧＦＰを発現し、これはβ－ＩＩＩチューブリン染色と共存していた（図３Ｂ、図３Ｃ及び図１０Ａ）。ＧＦＰノックインの性能は、ＰＣＲ及びシーケンシングによってさらに確認された（図３Ｄ及び図１０Ｂ）。

【0148】

次に、局所注入を介して、成体のマウス脳の視覚野にＡＡＶを送達した。２週間後、脳切片を用意し、抗ＧＦＰ抗体で染色した（図３Ｅ）。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を、対照（ＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３のみ）及び実験群（ＡＡＶ－ｍＴｕｂｂ３＋ＡＡＶ－Ｃａｓ９）の両方において観察し、ＡＡＶ感染の成功が示された（図３Ｆ）。対照切片とは対照的に、最小限のＧＦＰシグナルが検出された場合、多くの細胞質の局在ＧＦＰ＋ニューロンが実験群で見つかり、標的遺伝子挿入は有系分裂後のニューロンにおいてＨＩＴＩを用いて達成可能であるという概念が支持された（図３Ｆ）。ＧＦＰ及びルシフェラーゼノックインＡＡＶを、Ａｉ１４マウス用に生成した（図３Ｇ及び図１１Ａ）。脳と同様に、成体マウスの筋肉内（ＩＭ）注射を通じた局所送達はさらに、Ｒｏｓａ２６遺伝子座における正確なＧＦＰノックインを示した（図３Ｈ－Ｊ）。インサイチュ注入に加えて、全身性送達もまた試験した。この目的のために、ＡＡＶ－Ｃａｓ９とＡＡＶ－Ａｉ１４－ＧＦＰを静脈内（ＩＶ）注射を介して新生児のＡｉ１４マウスに同時送達した。感染の２週間後、多くのＧＦＰ＋細胞が、患畜の心臓と肝臓の両方の全体にわたって観察され、同様に、脳、筋肉、腎臓、副腎、脾臓、肺、及び目の脈絡叢を含む広範な他の臓器と組織の種類で観察された（図３Ｋ、図３Ｌ及び図１２Ａ）。ゲノムＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング分析は正確なノックインを確認した（図３Ｍ及び図１２Ｂ）。興味深いことには、ＡＡＶの尾静脈注射後に、成体肝臓での優先的なノックインが観察された（図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ及び図１１Ｄ）。ＨＩＴＩのインビボでのオフターゲット効果を試験するために、ＡＡＶに感染した肝臓組織を使用して、突然変異率を、オンターゲット、及び１２の予測された最も高位のゲノムオフターゲット部位で検査した。次世代シーケンシング分析は、検査されたオフターゲットにおける最小限の挿入と欠失（インデル）の頻度を示唆した（図１３）。

【0149】

実施例６：インビボ遺伝子治療

【0150】

レポーター遺伝子を介した特定の分裂終了細胞型の実際の追跡に加えて、及びその高い標的ノックイン効率ゆえに、ＨＩＴＩは遺伝子治療のための標的導入遺伝子組み込みに利用され得る。第１の概念実証のために、イングランド王立外科医師会（ＲＣＳ）ラットモデルを選択した。ＲＣＳラットは、ヒトにおける失明の一般的要因である、網膜色素変性症と呼ばれる遺伝性の網膜変性の、広く使用される動物モデルである。イントロン１からエクソン２までの１．９ｋｂの欠失を宿すＭｅｒｔｋ遺伝子におけるホモ変異体は、結果として、必然的なＲＰＥと、上にある光受容体の退化及び失明を伴う、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の食作用機能の欠損をもたらす（図４Ａ）。ＲＣＳラットにおける網膜変性は、網膜電図検査（ＥＲＧ）による形態学及び視覚機能の検査によって評価することができる。光受容体の外顆粒層（ＯＮＬ）退化における形態変化は、ＲＣＳラットにおいて、生後１６日目（Ｐ１６）に現われる。目のＭｅｒｔｋ遺伝子の網膜機能を修復するために、イントロン１でＭｅｒｔｋ遺伝子のエクソン２の機能性コピーを組み込むことができるＡＡＶベクターを生成した（図４Ｂ）。ＡＡＶベクターを生後３週間のラットの目に注入し、７－８週で分析した（図４Ｃ）。ＤＮＡ分析から、ＡＡＶ注入された目での正確なＤＮＡノックインが検出された（図４Ｄ及び図１４Ａ）。未処置のＲＣＳラット対照と比較して、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋ注入は、ＯＮＬの著しい保存を示した（図４Ｅ）。Ｈ＆Ｅ染色は、注入を受けた目における光受容体ＯＮＬの増加を確認した。対照的に、未処置の目は、ＯＮＬ中に１～２、又はまばらに分布した光受容細胞体のみを有していた。未処置の目（Ｐ＜０．０５）における５４．６±６．８μｍのＯＮＬ厚さと比較して、平均ＯＮＬ厚さは処置された目では９４±４．４μｍであった。ＧＦＰ導入遺伝子の発現は、処置されたＲＣＳの目のＲＰＥで増加した（図４Ｆ）。同様に、ロドプシンの発現は、処置されたＲＣＳの目のＯＮＬで増加した。網膜の生理作用に対する処置の効果を判定するために、注入（Ｐ５０）の４週間後にＥＲＧ応答を試験して、桿体と錐体の機能の電気活性を測定した（１０Ｈｚフリッカー）。ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋで処置された全ての目は、ＥＲＧ ｂ波応答の有意な改善を示した。平均ｂ波値は、処置された目では８６．４±３３．９μＶであり、これは未処置の目の２倍である（４４．１±１２．８μＶ、Ｐ＜０．０５）（図４Ｇ）。同様に、錐体反応を評価する１０Ｈｚのフリッカー値が有意に改善され、未処置の目よりも４倍以上、高かった（２１．９±１．０μＶ対４．６±２．１μＶ、Ｐ＜０．０５）（図４Ｈ）。眼底写真は、ＲＰＥ萎縮による、目視可能の大きな脈絡膜管が、ＡＡＶを注入された目で改善されたことを示した（図１４Ｂ）。これらの結果は、ＨＩＴＩベースのＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋ処置が、網膜の視覚機能を著しく救済し、かつ保存することができることを実証する。

【0151】

実施例７：インビボ遺伝子破壊

【0152】

いくつかの実施形態では、ＨＩＴＩは、遺伝子破壊を導入する突然変異を導入するための効果的な方法である。遺伝子破壊は、コード配列又は遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素における突然変異を含み、結果として遺伝子の突然変異又は欠失、又は遺伝子発現の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子、例えば腫瘍遺伝子の過剰発現は、ヒト患者に疾患を引き起こす。

【0153】

ＫＲＡＳが過剰発現してマウスに癌をもたらす、癌、ＫＲＡＳのマウスモデルでノックアウトを生成する。標的構築物を、プロモーター／エンハンサー要素に欠失を含む、ＫＲＡＳ遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素に対応する配列を有するように設計し、その結果としてＫＲＡＳ遺伝子の発現は減少する。標的構築物をＡＡＶ－ｄｅｌＫＲＡＳ構築物にパッケージングし、ＡＡＶ－Ｃａｓ９構築物と同時投与する。ＫＲＡＳのプロモーター／エンハンサー由来のｄｅｌＫＲＡＳ断片がマウスに組み込まれる。処置されたマウスは、対照ウイルスで処置されたマウスよりも発現が少ない。さらに、処置されたマウスは、対照ウイルスで処置されたマウスよりも腫瘍の数が少ない。

【0154】

ＨＩＴＩ技術は、ノックアウト又は妨害に、又は疾患を引き起こす遺伝子などの遺伝子の妨害に使用可能であることが、この実施例によって示される。

【0155】

実施例８：ノックイン効率の測定

【0156】

ノックイン効率は、ＨＩＴＩ構築物を発現するＡＡＶ９のＩＶ注入で処置されたマウスで測定された。図１５Ａは、処置の概要を示す。図１５Ｂは、高いウイルス力価と低いウイルス力価でのノックインを示すＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。図１５Ｃは、肝臓、心臓及び筋肉におけるＧＦＰ陽性細胞の顕微鏡写真を示す。このデータは、遺伝子ノックイン効率が、感染したＡＡＶの力価に依存することを示す。高いＡＡＶ力価を使用すると（１．５ｘ１０１２）、２５％までのノックインＧＦＰが可能であった（筋肉）。

【0157】

実施例９：早老症の処置

【0158】

ＨＩＴＩは、網膜色素変性症（ＲＰ）ラットモデルの事前データに示されるように、大きな欠失に加えて点突然変異を伴う疾患の標的遺伝子修正を可能にするために使用された。概念実証のために、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）又は早老症（ＬＡＫＩ）のマウスモデルを使用し、それはＬＭＮＡ遺伝子（ＬＭＮＡ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}）に常染色体優性点突然変異を宿し、及び多数の組織における早老性表現型、多臓器における異常タンパク質（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）蓄積、及び寿命の減少を示した。全身の突然変異を修正するために、ＡＡＶ－ＨＩＴＩを１日目に静脈内の（ＩＶ）注射を通じて全身に注入した（図１６Ａの図表を参照）。

【0159】

大きなＤＮＡ欠失を修正するために、ＨＩＴＩシステムはＤＮＡを挿入することができることが、上記の実施例において示された。この例は、変異したエクソンの前に機能性のエクソン及び３’ＵＴＲを導入する新たなＨＩＴＩ戦略を示し、したがってＨＩＴＩの能力、例えば同じ遺伝子中の点突然変異、多数の突然変異、を拡大する。このマウスモデルは、エクソン１１のＣからＴへの優性点突然変異を有し、したがって機能性のエクソン１１、１２及び３’ＵＴＲはＨＩＴＩによってイントロン１０に挿入された。図１６Ｂは、血清型９を持つＬＭＮＡ遺伝子修正ＡＡＶベクターの概略図を示す。

【0160】

機能障害の内因性のエクソンではなく、挿入されたカセットがその後、転写され、したがって非変異の野性型転写物を修復すると仮定された。突然変異はゲノムに依然として存在するが、修正された転写物の発現には影響しないだろう。注入の１７週間後に、ノックインの修正がＤＮＡレベルに見られた。１１８日目における、ＰＣＲによる正確な遺伝子ノックインの確証（図１６Ｃ）。３５日目及び１１８日目における、ｑＰＣＲによる遺伝子ノックイン効率（図１６Ｄ）。

【0161】

早老症マウスモデルは、体重がより少なく、寿命がより短い。両方の表現型は、ＨＩＴＩ処置によって有意に救済された（図１６Ｅ、体重；図１６Ｆ、寿命）。これらの結果は、ＨＩＴＩを媒介としたインビボでの遺伝子修正が、優性点突然変異に対する治療効力を同様に達成したことを示唆する。

【0162】

処置されたマウスの外観もまた、ＨＩＴＩ処置による影響を受けた。図１６Ｇは、４ヶ月齢のＬｍｎａ^＋／＋（ＷＴ）、Ｌｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}（－ＨＩＴＩ）、及び１７週齢のＨＩＴＩで処置したＬｍｎａ^{Ｇ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ}マウス（＋ＨＩＴＩ）の代表的な写真を示す。処置されたマウスは未処置のマウスよりもわずかに大きく、切開されたマウスでは臓器の外観が改善されていた。処置されたマウスはさらに、図１６Ｈに示される脾臓退行の部分的救済を示す。

【0163】

ＬＡＫＩ ＨＩＴＩ処置されたマウスの大動脈弓の組織像（Ｈ＆Ｅ）における改善がさらに示された。図１６Ｉは、ＨＩＴＩ処置により部分的に救済された核密度の定量化と組み合わせた典型的な組織診断写真を示す。

【0164】

ＬＡＫＩ ＨＩＴＩで処置されたマウスの腎臓の組織構造（ＰＡＳ）もまた改善された。腎臓の糸球体の面積と尿細管の直径は、ＨＩＴＩ処置によって部分的に救済された。図１６Ｊにおいて顕微鏡写真は、腎臓糸球体の面積及び尿細管の直径の定量化と共に示される。

【0165】

ＬＡＫＩ ＨＩＴＩ処置されたマウスの脾臓の組織像（Ｈ＆Ｅ）もまた改善し、脾臓中の白脾髄の面積も含めて、ＨＩＴＩ処置によって部分的に救済された。処置されたマウスの脾臓の典型的な顕微鏡写真、及び白脾髄の面積の定量化は、図１６Ｋに示される。

【0166】

この実施例は、ＨＩＴＩを媒介としたインビボでの遺伝子修正が、「優性」突然変異及び「点」突然変異を有する早老症マウスモデルに対する治療上の有効性を達成したことを示す。

【0167】

実施例１０：ヒトにおける網膜色素変性症の処置

【0168】

ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｒＭｅｒｔｋを含む組成物を、網膜色素変性症を患う個体を処置するために使用する。静脈内投与による被験体への組成物の投与後、組成物は、Ｍｅｒｔｋ遺伝子の突然変異を修正することができ、及び視力減退を含む網膜色素変性症の症状が改善される。１０人の患者が組成物の静脈注射を受ける場合、９人は視力の改善を経験する。

【0169】

実施例１１：ヒトにおける早老症の処置

【0170】

ＬＭＮＡ遺伝子（ＬＭＮＡＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇ）の突然変異を修正するＡＡＶ－ＨＩＴＩを含む組成物を、早老症を患う個体を処置するために使用する。静脈内投与による被験体への組成物の投与後、組成物は、ＬＭＮＡ遺伝子の突然変異を修正することができ、及び腎臓機能、脾臓機能、低成長及び脱毛症を含む早老症の症状が改善される。１０人の患者が組成物の静脈注射を受ける場合、９人は早老症の症状の改善を経験する。

【0171】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されたが、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは、当業者にとって明白だろう。多数の変形、変更、及び置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到されるだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲内の方法と構造、及びそれらの同等物を包含することが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図16I】

【図16J】

【図16K】

【配列表】

2023092453000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2022-10-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

遺伝性疾患の治療のための組成物の使用であって、該組成物は、外来性ＤＮＡ配列に対して逆配向である標的配列を含む標的構築物、前記標的配列に相同する相補鎖オリゴヌクレオチド、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含み、ここで、前記外来性ＤＮＡ配列はゲノムと比較して少なくとも１つのヌクレオチドとの差異を含み、標的配列とゲノム中の標的核酸配列はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼにより認識され、
前記ゲノム中の前記標的核酸配列は、一旦、前記外来性ＤＮＡ配列が正確な配向で前記
非分裂細胞の前記ゲノムに組み込まれると、ゲノム中に存在しなくなる、組成物の使用。

【請求項2】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を修正する、請求項１に記載の組成物の使用。

【請求項3】

外来性ＤＮＡ配列は非分裂細胞のゲノムにおける突然変異を引き起こす、請求項１に記載の組成物の使用。

【請求項4】

突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、サイレント突然変異、挿入、
及び欠失から選択される、請求項２または３に記載の組成物の使用。

【請求項5】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａ
ｓ３Csf1、及びＣ２ｃ３からなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項6】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項7】

非分裂細胞は最終分化細胞または静止期にある幹細胞である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項8】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレ
オチドは、ウイルスベクターに含まれている、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項9】

ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ
随伴ウイルスから選択される、請求項８に記載の組成物の使用。

【請求項10】

標的構築物、相補鎖オリゴヌクレオチド、及び、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレ
オチドは、非ウイルスベクターに含まれている、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項11】

標的配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって特異的に切断される配列である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項12】

標的構築物によってＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードされる、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項13】

非分裂細胞は、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、内皮細胞、上皮細胞、肝
細胞、骨細胞、血小板、脂肪細胞、心筋細胞、ニューロン、網膜細胞、平滑筋細胞、骨格
筋細胞、精母細胞、卵母細胞、及び膵臓β細胞のうち１つ以上から選択される、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項14】

遺伝性疾患は、色素性網膜炎である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項15】

遺伝性疾患は、型筋ジストロフィーである、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項16】

遺伝性疾患は、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項17】

遺伝性疾患は、α－１－アンチトリプシン欠乏症である、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項18】

ゲノム中の標的核酸配列は、Ｍｅｒｔｋである、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項19】

非分裂細胞のゲノム中の標的核酸配列は、ＬＭＮＡである、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項20】

非分裂細胞のゲノム中の標的核酸配列は、ロドプシンである、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項21】

非分裂細胞のゲノム中の標的核酸配列は、α－１－アンチトリプシンである、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【請求項22】

非分裂細胞のゲノム中の標的核酸配列は、軟骨無形成症、α１－アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、抗リン脂質抗体症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、乳癌、癌、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸癌、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性繊維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、レーバー先天黒内障、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド症候群、ポルフィリン症、早老症、前立腺癌、色素性網膜炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、皮膚癌、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・ザックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、及びウィルソン病からなる群から選択される遺伝性疾患の変異遺伝子を含む、請求項１乃至３のいずれか１つに記載の組成物の使用。

【外国語明細書】