特開 2023-93532 鉄硫黄クラスタの輸送が改善された細胞工場

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023093532

(43)【公開日】2023-07-04

(54)【発明の名称】鉄硫黄クラスタの輸送が改善された細胞工場

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230627BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230627BHJP

   C12P 11/00 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 9/04 20060101ALN20230627BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20230627BHJP

   C12N 9/88 20060101ALN20230627BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N1/21

C12P11/00

C12N15/54

C12N15/60

C12N15/53

C12N9/04

C12N9/04 Z

C12N9/10

C12N9/88

【審査請求】有

【請求項の数】18

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023061066

(22)【出願日】2023-04-05

(62)【分割の表示】P 2020523046の分割

【原出願日】2018-07-12

(31)【優先権主張番号】17181503.8

(32)【優先日】2017-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520009585

【氏名又は名称】バイオシンティア アペィエス

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＳＹＮＴＩＡ ＡＰＳ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｕｅｂｊｅｒｇｖｅｊ ３，２１００ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｏ（ＤＫ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジェニー，ハンス ジャスパー

(72)【発明者】

【氏名】バリ，アン ピール

(72)【発明者】

【氏名】マイリング－ペーターセン，ニルス

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌を提供する。
【解決手段】変異鉄硫黄クラスタレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードする改変遺伝子及び、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれかの生合成を増強するポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を特徴とする、鉄硫黄クラスタ輸送を改善することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供する。本発明は更に、本発明の遺伝子改変された細菌を使用して、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれかを製造する方法及び、ビオチン、リポ酸、又はチアミンの製造のための遺伝子改変された細菌細胞の使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌であっ
て、該細菌が、
ａ．変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子で
あって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０
、１２及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性
を有し、該アミノ酸配列は、
ｉ．Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外の
アミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、遺伝子改変された
内在性ｉｓｃＲ遺伝子と、
ｂ．少なくとも１つの導入遺伝子であって、
ｉｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと
、
ｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの導入遺伝子と
、
を備える、遺伝子改変された細菌。

【請求項2】

前記変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ及びＷのいずれかであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれかであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、請求項１に記載のビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産
を増強するための遺伝子改変された細菌。

【請求項3】

前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）
を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．ＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ
２．１．１．１９７）を有するポリペプチド、
ｂ．７－ケト－８－アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ２．３．１
．４７）を有するポリペプチド、
ｃ．７，８－ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ：２．６．１．
６２又はＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド、及び
ｄ．デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＥＣ６．３．３．３）を有するポリ
ペプチド、
ｅ．ピメロイル－［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ（ＥＣ３
．１．１．８５）を有するポリペプチド、及び
ｆ．６－カルボキシヘキサノエート－ＣｏＡリガーゼ活性（ＥＣ６．２．１．１４）を
有するポリペプチド、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含
み、
前記細菌は、ビオチンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項4】

前記少なくとも１つの導入遺伝子がリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有
するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペ
プチドと、
ｂ．ピルビン酸デヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェ
ラーゼ成分（ＥＣ２．３．１．１２）を含むポリペプチドと、
ｃ．リポエートタンパク質リガーゼＡ活性（ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポリペ
プチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含
み、
前記細菌は、リポ酸の生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項5】

前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．
１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９
）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子をコードし、更に、
ａ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴ
ｈｉＦポリペプチドと、
ｂ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプ
チドと、
ｃ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペ
プチドと、
ｄ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有する
ＴｈｉＤポリペプチドと、
ｅ．グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチ
ドと、
ｆ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｇ．ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭ
ポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．３．－）を有するポリペ
プチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含
み、
前記細菌は、チアミンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項6】

前記細菌が、
ａ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプ
チドと、
ｂ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するＴｈｉＨポリペプチド
又はグリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチド
と、
ｃ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴ
ｈｉＦポリペプチドと、
ｄ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプ
チドと、
ｅ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペ
プチドと、
ｆ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有する
ＴｈｉＤポリペプチド、
ｇ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．－）活性を有するポリペ
プチドと、
をコードする更なる導入遺伝子を含む、請求項５に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項7】

前記少なくとも１つの導入遺伝子及び前記１以上の更なる導入遺伝子が構成的プロモー
タに作用可能に連結されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変された
細菌。

【請求項8】

前記細菌が、エシェリキア属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア
属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、セラチア属、ラク
トバシラス属、ラクトコッカス属及びアシネトバクター属、シュードモナス属、及びアセ
トバクター属からなる群から選択される細菌の一種である、請求項１～７のいずれか１項
に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項9】

ａ．請求項１～３、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培
地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオ
チンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたビオチンを回収し、該回収されたビオチンを任意に
精製する工程と、
を含む、ビオチンの製造方法。

【請求項10】

ａ．請求項１、２、４、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増
殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、
リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と
、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたリポ酸を回収し、該回収されたリポ酸を任意に精製
する工程と、
を含む、リポ酸の製造方法。

【請求項11】

ａ．請求項１、２、５～８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に
導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ－
Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシン
リアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたチアミンを回収し、該回収されたチアミンを任意に
精製する工程と、
を含む、チアミンの製造方法。

【請求項12】

前記増殖培地が、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース
、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトース、又はそれら
の任意の組み合わせから選択される炭素源を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載
のビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの製造方法。

【請求項13】

遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を
増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用で
あって、該細菌が、
ｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド
と、
ｉｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を備
えて発現し、
前記遺伝子改変された細菌は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ
遺伝子であり、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８
、１０、１２、及び１４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配
列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外の
アミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘからなる群
から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、使用。

【請求項14】

請求項１３に記載の遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸及びチアミンのい
ずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変さ
れた遺伝子の使用であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミ
ノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、使用。

【請求項15】

ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１～
８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌の使用。

【請求項16】

前記細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．
２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７
）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と
、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能
な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子
又は導入遺伝子であり得る、
請求項１～８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項17】

ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１６
に記載の遺伝子改変された細菌の使用。

【請求項18】

前記遺伝子改変された細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．
２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７
）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と
、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能
な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子
又は導入遺伝子であり得る、
請求項９～１２のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸、及びチアミンのいずれか１
つの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変異鉄硫黄クラスタレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードする改変された遺伝
子、及びビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれかの生合成を増強するポリペプチドを
コードする１以上の導入遺伝子を特徴とする、鉄硫黄クラスタ輸送を改善することの可能
な遺伝子改変された細菌細胞に関する。本発明は更に、本発明の遺伝子改変された細菌を
使用したビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれかの製造方法、及び遺伝子改変された
細菌細胞のビオチン、リポ酸、又はチアミンの製造への使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

ビオチン（ビタミンＢ７又はビタミンＨとしても知られている）及びチアミン（ビタミ
ンＢ１としても知られている）は、人間が他の後生動物と同様にビオチン又はチアミンを
生成できないため、人間にとって必須の食物ビタミンである。リポ酸（ＬＡ）は、硫黄を
含むビタミン様の抗酸化物質であり、少量が細菌、植物、動物内で合成される。３つは全
て栄養補助食品として広く使用されている。現在、これらのビタミン又はビタミン様化合
物の製造は、化学合成に依存しているが、これには費用がかかる。これらの製造のための
生合成法は、現在及び将来のニーズを満たすための新たなより費用効果の高い手段を提供
する。

【0003】

ビオチンは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）等、特定のカルボキシル化反
応を触媒する酵素の必須補因子である。全ての生命体内に存在するＡＣＣは、脂肪酸生合
成の重要な基本単位であるマロニルＣｏＡを生成する。自然界では、ビオチンは脂肪酸生
合成経路を含む線形経路によって合成される。大腸菌でのビオチン合成の初期基質はマロ
ニルＡＣＰであり、これは脂肪酸合成の開始代謝物でもある。脂肪酸サイクルを開始する
前に、マロニルＡＣＰはＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェ
ラーゼであるＢｉｏＣによってマスクされ、それによりマロニルＡＣＰメチルエステルが
生成される。その後、２サイクル分の脂肪酸鎖伸長により、分子ピメロイルエステルＡＣ
Ｐが生成される。固有のエステラーゼであるＢｉｏＨによるピメロイルエステルＡＣＰの
Ｏメチル基の加水分解により、この分子は脂肪酸伸長サイクルを終了することができる。

【0004】

その後、中間体であるピメロイルエステルＡＣＰは、ビオチン特異的経路を介してビオ
チンに変換される（図１Ａ）。この経路では、ＢｉｏＦはピメロイルＡＣＰとアラニンと
のＰＬＰ依存性脱炭酸アルドール縮合を触媒し、ＫＡＰＡ（８－アミノ－７－オキソノナ
ン酸）を生成する。ＢｉｏＡ（及びＢｉｏＫ）は、ＫＡＰＡのＰＬＰ依存的なアミノ基転
移を触媒して、ＤＡＰＡ（７，８－ジアミノペラルゴン酸）を生成する。ここで供与体は
ＳＡＭであり、副産物はＳ－アデノシル－オキソメチオニンである。ＢｉｏＤは、ＡＴＰ
駆動のＤＡＰＡのカルボキシル化及び閉環を触媒して、デスチオビオチン（ＤＴＢ）内に
チオファン環を形成する。ビオチン合成経路の最終ステップは、ＢｉｏＢ（ビオチンシン
ターゼ）による２つの炭化水素間に硫黄架橋を導入してビオチンを生成することを含むた
め、既知の最も複雑な反応の１つである。ＢｉｏＢはＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（
ＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔ）ラジカル酵素であり、二量体として検出され、活性部位に［２
Ｆｅ－２Ｓ］^２＋及び［４Ｆｅ－４Ｓ］^２＋の２つの鉄硫黄クラスタを含む。ＤＴＢでチ
オファン環を形成するのに必要な硫黄原子は、ＢｉｏＢの［２Ｆｅ－２Ｓ］^２＋クラスタ
から補充されると考えられている。結果として、ＤＴＢ合成で消費されるＢｉｏＢ二量体
の鉄硫黄クラスタは、各触媒サイクル後に再生成されると考えられている。

【0005】

リポ酸（ＬＡ）は、活性酸素種の強力な捕捉剤であるために重要な抗酸化剤であること
に加えて、α－ケト酸デヒドロゲナーゼの補因子でもある。ＬＡは、脂肪酸代謝の中間体
からデノボ合成される（図２）。大腸菌のＬＡ合成に関与する３つの酵素は、ＬｐｌＡ（
リポエート－タンパク質リガーゼ）、ＬｉｐＢ（オクタノイルタンパク質ＡＣＰキャリア
タンパク質：タンパク質トランスフェラーゼ）、及びＬｉｐＡ（リポ酸シンターゼ）であ
る。ｌｐｌＡ遺伝子によってコードされるＬｐｌＡは、標的酵素のＥ２サブユニットの非
リポイル化アポリポイルドメインへの外来性オクタン酸の結合をＡＴＰ依存的に触媒する
ことができる。ｌｉｐＢ遺伝子によってコードされるＬｉｐＢは、ＡＣＰから標的酵素の
Ｅ２サブユニットのアポリポイルドメインへのオクタノイル残基の転移を触媒することが
できる。ＡｃｅＦ遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ２サブユニットのリポイル
ドメインをコードする。ｌｉｐＡ遺伝子によってコードされるＬｉｐＡは、２つのＣ－Ｓ
結合の形成に関与している。ＬｉｐＡが駆動する反応には、その機能を果たすために鉄硫
黄クラスタ（４Ｆｅ－４Ｓ）とＳＡＭ（ｍｅｔＫ遺伝子によって生成される）とが必要で
ある。リポ酸は、主に細胞内において、様々な多酵素複合体のタンパク質結合リポアミド
部分として存在する。

【0006】

チアミン生合成の研究は、細菌、一部の原生動物、植物及び真菌で行われてきた。チア
ミンのチアゾール部分及びピリミジン部分は別々に合成される（図３）。ピリミジン部分
である４－アミノ－５－ヒドロキシメチル－２－メチルピリミジンホスフェート（ＨＭＰ
－Ｐ）は、デノボプリン生合成経路の中間体である５－アミノイミダゾールリボチド（Ａ
ＩＲ）に由来する。グラム陰性菌では、ラジカルＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡ
Ｍ）依存性反応におけるＡＩＲからＨＭＰ－Ｐへの変換が、サブユニットあたり１個の［
４Ｆｅ－４Ｓ］クラスタを結合させるｔｈｉＣ遺伝子産物であるＨＭＰ－Ｐシンターゼに
よって触媒される。

【0007】

次に、ＨＭＰ－Ｐは、チアゾールユニットと結合する前に、ＴｈｉＤキナーゼによって
リン酸化されてＨＭＰ－ＰＰとなる。チアゾール部分である５－（２－ヒドロキシエチル
）－４－メチルチアゾールホスフェート（ＨＥＴ－Ｐ）は、Ｌ－チロシン及び１－デオキ
シ－Ｄ－キシルロースホスフェート（ＤＸＰ）及びシステインに由来する。ここで、硫黄
原子はＬ－システインに由来すると考えられる。ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされるチ
ロシンリアーゼは、サブユニットあたり１個の［４Ｆｅ－４Ｓ］クラスタを結合させ、ラ
ジカル媒介によるチロシンの２－イミノ酢酸及び４－クレゾールへの開裂を触媒する。チ
アゾール部分の合成には、少なくとも５つの遺伝子ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈ
ｉＨ及びｔｈｉＩの発現が必要である。

【0008】

次に、ピリミジン部分及びチアゾール部分は、ｔｈｉＥによってコードされるチアミン
－リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．３）の作用により結合されてＴＭＰを形成する。
従って、ＴＭＰは全ての既知のチアミン生合成経路の最初の産物である。大腸菌及び他の
腸内細菌科では、ＡＴＰの存在下で、ｔｈｉＬによってコードされるチアミンリン酸キナ
ーゼ（ＥＣ２．７．４．１６）により、ＴＭＰが補因子ＴＰＰへとリン酸化され得る。チ
アミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ３．１．３．－）を発現する導入遺伝子を含む細
菌株は、ＴＭＰをチアミンに変換することによりチアミンの生産を増強することが可能で
ある。

【0009】

細菌を利用した細胞工場の使用は、ビオチン、リポ酸、チアミンの生合成製造のための
一方法となり得る。バイオ製品の製造のための細胞工場としての組換え大腸菌の利点は、
（ｉ）グルコース塩培地で最適な環境条件下で培養した場合の倍加時間が約２０分と、増
殖速度が比類なく急速であること及び、（ｉｉ）大腸菌液体培養の理論的密度限界が、乾
燥細胞重量約２００ｇ／ｌ又はおよそ１×１０^１３生菌／ｍＬと推定され、高い細胞密度
を容易に達成可能であるという事実により、広く認識されている。更に、大腸菌の遺伝子
改変のための多くの分子ツール及びプロトコルが入手可能であり、また異種タンパク質の
発現が容易な微生物であるという点はいずれも、所望のバイオ製品を高レベルで製造する
ために不可欠であろう。

【0010】

大腸菌では、ビオチンオペロン構造は、対向する鎖（ｂｉｏＯ遺伝子座）の重複プロモ
ータの制御下でｂｉｏＡとｂｉｏＢＦＣＤとに分割され、ｂｉｏＨは大腸菌染色体の他の
場所にある。ビオチンオペロンの発現は、ビオチンオペロンのオペレータに結合するビオ
チン結合リプレッサ（ＢｉｒＡ）によって下方制御される。ＢｉｒＡはビオチンリガーゼ
としても機能し、ビオチンを細胞のカルボキシラーゼへと移動させる。ＢｉｒＡ機能のビ
オチンリガーゼから転写リプレッサへの切り替えは、それぞれの細胞内ビオチン及びアポ
カルボキシラーゼプールによって調節される。大腸菌でのビオチンオペロン（ｂｉｏＡ及
びｂｉｏＢＦＣＤ）の過剰発現は、増殖を阻害することが報告されている（Ｉｆｕｋｕ，
Ｏら１９９５）。この阻害の原因はこれまで不明であり、これがビオチン合成の促進を妨
げる障害となってきた。

【0011】

一般に、例えば細菌を利用したテーラーメードの細胞工場（例：大腸菌）でのビオチン
、リポ酸及びチアミンの製造を容易にするためには、これらの複雑な生合成経路のボトル
ネックを特定して、これらの経路がそれぞれの経路酵素の増殖及び生産のレベルを高める
能力を制限する可能性のある様々な要因を克服することが必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

【課題を解決するための手段】

【0013】

第１の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つ
の生産を増強するための遺伝子改変された細菌であって、
●変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子であ
って、変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１
２、及び１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列は、
○Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４の対応するアミノ酸残基以外の
任意のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、内在性ｉｓｃＲ遺
伝子と、
○ビオチン生産を増強するためのビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有
するポリペプチドと、
○リポ酸生産を増強するためのリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有する
ポリペプチドと、
○チアミン生産を増強するためのＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７
を有するポリペプチド）と、
○チアミン生産を増強するためのチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を
有するポリペプチドと、
●から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子と、
を備える遺伝子改変された細菌を提供する。

【0014】

好ましくは、変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、
○ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘ、
○ＸがＹ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｆ及びＷのいずれか１つであるＣ９２Ｘ、
○ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｆ及びＷのいずれか１つである９８Ｘ、
○ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｆ及びＷのいずれか１つであるＣ１０４Ｘ並びに、
○ＸがＡ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｉ、Ｇ及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される。

【0015】

ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする１
つの導入遺伝子を含む、ビオチン生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細
菌は、
○ＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（Ｂｉｏ
Ｃ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；
○７－ケト－８－アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ２
．３．１．４７）を有するポリペプチド；
○７，８－ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＡ；ＥＣ：２．
６．１．６２）又はＬ－リジン：８－アミノ－７－オキソノナノエートアミノトランスフ
ェラーゼ活性（ＢｉｏＫ：ＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド；
○デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＢｉｏＤ；ＥＣ６．３．３．３）を有
するポリペプチド；及び
○ピメロイル－［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ活性（Ｂｉ
ｏＨ；ＥＣ３．１．１．８５）を有するポリペプチド又は６－カルボキシヘキサノエート
－ＣｏＡリガーゼ活性（ＢｉｏＷ；ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド；
からなる群から選択される１以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を更に
含んでもよい。

【0016】

好ましくは、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドを
コードする１つの導入遺伝子を含む、ビオチン生産を増強するための本発明による遺伝子
改変された細菌は、ＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラー
ゼ活性（ＢｉｏＣ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；７－ケト－８－ア
ミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ２．３．１．４７）を有
するポリペプチド；及び７，８－ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（Ｂ
ｉｏＡ；ＥＣ：２．６．１．６２）を有するポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子
を更に含む。

【0017】

リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードする１つ
の導入遺伝子を含む、リポ酸の生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌
は、
○オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペプ
チドと、
○ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１２）のジヒドロリポイルリジ
ン残基アセチルトランスフェラーゼ部分を含むポリペプチドと、
○リポエートタンパク質リガーゼＡ（ＬｐｌＡ；ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポ
リペプチドと、
からなる群から選択される１以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を更に
含んでもよい。

【0018】

ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプチド
をコードする１つの導入遺伝子及び／又は、チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．
１９）を有するＴｈｉＨポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む、チアミンの
生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌は、
○ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈ
ｉＦポリペプチドと、
○チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチ
ドと、
○チアゾールシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチド
と、
○ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴ
ｈｉＤポリペプチドと、
○硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
○チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（ＥＣ３．１．３．－）を有するポリペプチド
と、
○グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチド
と、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子並び
に、任意に、
○ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭポ
リペプチド
をコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。

【0019】

好ましくは、遺伝子改変された細菌細胞は、ポリペプチド：ＴｈｉＣ（ｔｈｉＣ遺伝子
によってコードされる）；ＴｈｉＤ（ｔｈｉＤ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＥ
（ｔｈｉＥ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＦ（ｔｈｉＦ遺伝子によってコードさ
れる）；硫黄担体タンパク質（ｔｈｉＳ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＧ（ｔｈ
ｉＧ遺伝子によってコードされる）；ＴＭＰホスファターゼ（ＴＭＰホスファターゼ遺伝
子によってコードされる）；及びＴｈｉＨ（ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされる）又は
ＴｈｉＯ（ｔｈｉＯ遺伝子によってコードされる）をコードする導入遺伝子を含む。この
実施形態によれば、細胞は、（（ｔｈｉＭ遺伝子によってコードされる）酵素ＴｈｉＭを
コードする導入遺伝子を更に含んでもよい。

【0020】

好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌における少なくとも１つの導入遺伝子及び
１つ以上の更なる導入遺伝子のそれぞれは、構成的プロモータに作用可能に連結されてい
る（プロモータが、導入遺伝子を含むオペロンに作用可能に連結されていてもよい）。

【0021】

本発明の遺伝子改変された細菌は、好ましくは、エシェリキア属、バシラス属、ブレビ
バクテリウム属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、セ
ラチア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、アシネトバクター属、アセトバクター
属、及びシュードモナス属からなる群から選択される属の種であり、より好ましくは、例
えば大腸菌又はグルタミン酸生産菌等のエシェリキア属又はコリネバクテリウム属の種で
ある。

【0022】

第２の実施形態によれば、本発明は、
○ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする
導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して、培養物を作製す
る工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたビオチンを回収し、回収されたビオチンを任意に精製する
工程と、
を含むビオチン製造方法を提供する。

【0023】

第３の実施形態によれば、本発明は、
○リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードする１
つの導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して、培養物を作
製する工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたリポ酸を回収し、回収されたリポ酸を任意に精製する工程
と、
を含むリポ酸製造方法を提供する。

【0024】

第４の実施形態によれば、本発明は、
○ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドをコー
ドする導入遺伝子及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有する
ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に
導入して、培養物を作製する工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたチアミンを回収し、回収されたチアミンを任意に精製する
工程と、
を含むチアミン製造方法を提供する。

【0025】

好ましくは、ビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つを製造する方法で使用され
る増殖培地は、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ア
ラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、ラクトース、又はそれらの任意の
組み合わせから選択される炭素源を含む。

【0026】

第４の実施形態によれば、本発明は、ビオチンシンターゼをコードする導入遺伝子を発
現する細菌細胞におけるビオチン生産を増強するための、変異ｉｓｃＲポリペプチドをコ
ードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、変異ｉｓｃＲポリペプチドのアミノ酸
配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４と少なくとも８０％の配列同一性
を有し、アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応する
アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸であるＬ１５Ｘ、Ｃｙｓ９２Ｘ、Ｃｙｓ９８Ｘ、Ｃｙ
ｓ１０４Ｘ及びＨｉｓ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換
を有する使用を提供する。

【0027】

第４の実施形態によれば、本発明は、細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのい
ずれか１つの生産を増強するための変異ｉｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変さ
れた遺伝子の使用であって、細菌が、
・ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
・リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
・ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、チ
ロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含み、かつ発
現し、
遺伝子改変された遺伝子は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ遺
伝子であり、変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１
０、１２及び１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、
アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ
酸残基以外の任意のアミノ酸であるＬ１５Ｘ、Ｃｙｓ９２Ｘ、Ｃｙｓ９８Ｘ、Ｃｙｓ１０
４Ｘ及びＨｉｓ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有す
る、使用を提供する。

【0028】

第５の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸又はチアミンの生産を増強する
ための、本発明による遺伝子改変された細菌の使用を提供する。

【0029】

第６の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの
生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌であって、例えば、フラボドキ
シン／フェレドキシンレダクターゼ及びフラボドキシン還元システムのポリペプチド又は
ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシドレダクターゼシステムのポリペプチ
ド等の、電子供与体ＮＡＤＰＨからＳＡＭラジカル鉄硫黄クラスタ酵素の［４Ｆｅ－４Ｓ
］^２＋クラスタへの増強された電子伝達を媒介することの可能なポリペプチドをコードす
る１以上の遺伝子を更に含む細菌を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】Ａ）細菌のビオチン経路の中間体及びビオチンの合成に至る各酵素段階、ＳＡＭ：Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン、ＳＡＨ：Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン、ＣｏＡ：コエンザイムＡ、ＡＣＰ：アシルキャリアタンパク質、ＫＡＰＡ：７－ケト－８－アミノペラルゴン酸、ＡＭＴＯＤ：Ｓ－アデノシル－２－オキソ－４－チオメチルブチレート、ＤＡＰＡ：７，８－ジアミノペラルゴン酸、ＤＴＢ：デスチオビオチン、５’ＤＯＡ：５’－デオキシアデノシン並びに、Ｂ）ＩｓｃＲのｉｓｃオペロン構造、Ｆｅ－Ｓクラスタ形成における役割及び調節機構を示す図である。ｉｓｃオペロンは、遺伝子：ｉｓｃＳ（システイン脱スルフラーゼ）、ｉｓｃＵ（足場）、ｉｓｃＡ（Ａ型タンパク質）、ＨｓｃＢ（Ｄｎａｊ様コシャペロン）、ＨｓｃＡ（ＤｎａＫ様シャペロン）及びｆｄｘ（フェレドキシン）遺伝子の発現を制御するＩｓｃＲをコードするｉｓｃＲ遺伝子を含む。ＩｓｃＲは、遺伝子ｈｙａＡ、ｙｄｉＵ、ｅｒｐＡ及びｓｕｆＡを含む４０種類超の遺伝子も調節する。

【図2】細菌のリポ酸経路の中間体及び、リポイル化リポイルドメイン（リポ酸合成）に至る各酵素段階を示す図である。経路の主要な酵素には、ＬｉｐＡ（リポ酸シンターゼ）、ＬｉｐＢ（オクタノイルタンパク質ＡＣＰキャリアタンパク質：タンパク質トランスフェラーゼ）及び基質ＳＡＭ：Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンが含まれる。ＬｐｌＡは、リポエートタンパク質リガーゼＡ；ＥＣ：６．３．１．２０である。

【図3】細菌のチアミン経路の中間体並びに、チアミン（ＴＨＩ）；チアミン一リン酸（ＴＭＰ）及びチアミン二リン酸（ＴＰＰ）の合成に至る各酵素段階を示す図である。中間体の略語：５－アミノイミダゾールリボヌクレオチド（ＡＩＲ）、４－アミノ－２－メチル－５－（ホスホオキシメチル）ピリミジン（ＨＭＰ－Ｐ）、４－アミノ－２－メチル－５－（ジホスホメチル）ピリミジン（ＨＭＰ－ＰＰ）、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＸＰ）、デヒドログリシン（ＤＨＧ）、４－メチル－５－（２－ホスホオキシエチル）チアゾール（ＴＨＺ－Ｐ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、還元フェレドキシン（Ｆｄｘ ｒｅｄ）、酸化フェレドキシン（Ｆｄｘ ｏｘ）。

【図4】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドを含む（大腸菌ＢＷ２５１１３）ΔｂｉｏＢ株（右パネル）及び、ＩＰＴＧ誘導性フレームシフトｂｉｏＢ（未熟停止コドン）発現プラスミドを含む参照（大腸菌ＢＷ２５１１３）株（左パネル）の経時的に測定された細胞密度（ＯＤ_６００で測定）のグラフである。０．１ｇ／ＬのＤＴＢ、５０μｇ／ｍＬ、０ｍＭ（円形）のカナマイシン、０．０１ｍＭ（三角形）又は０．１ｍＭ（正方形）のＩＰＴＧを含む２００μＬのｍＭＯＰＳ中で増殖させた４つの生物株の複製について、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎを使用してＯＤ_６２０を測定し、ＯＤ_６００に変換した。それぞれの対数増殖速度の値を、隣接する枠内に示す。

【図5】（ビオチン定量方法で説明するように）２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２０時間インキュベートした後に、４０μｇ／ｍｌのゼオシンとゼロ又は最大０．２４４μｇ／ｍＬまで増加する濃度のビオチンとを加えた１５０μＬのｍＭＯＰＳ培地中で増殖させたプラスミドｐＢＳ４５１を含む大腸菌ＢＳ１０１１の培養物の最終細胞密度（ＯＤ_{６ ００}で測定）を示す散布図のグラフである。点線の灰色の縦線は、ビオチンバイオアッセイの最適なビオチン濃度範囲が０．０２４～０．２４μｇ／Ｌであることを示している。

【図6】それぞれがＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミド（ｐＢＳ４１２）を含む４つの生物学的複製物における、アミノ酸変異を有する変異ＩｓｃＲを発現する３つの異なるｉｓｃＲ変異株（ＢＳ１３７７、Ｌ１５Ｆ）、（ＢＳ１３７５、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）並びに大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｂｉｏＢ株（ＢＳ１０１１、参照）のビオチン生産（株については表１を参照）を示す棒グラフである。株を、０．１ｇ／ｌのＤＴＢと５０μｇ／ｍＬのカナマイシンとを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で、２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２４時間増殖させた。棒は、平均ビオチン生産値（高さ）及びＩＰＴＧ誘導レベル（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのビオチン生産を示し、水平の点線は参照野生型株からの最大ビオチン生産を示す。ＩＰＴＧの不在下で培養した場合、どの株も検出可能なレベルのビオチンを生産しなかったことに留意すべきである。

【図7】変異ＩｓｃＲを発現するｉｓｃＲ変異株（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）及び大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｂｉｏＢ株（ＢＳ１０１１、参照）の細胞密度とビオチン生産のグラフである。各株はＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ遺伝子発現プラスミド（ｐＢＳ４１２）を含む。データは、２５時間にわたって観察されたｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ変異株（濃い実線）及び参照株である大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｂｉｏＢ株（薄い灰色の点線）のそれぞれの３つの生物学的複製の平均測定ＯＤ_６００並びに、ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ変異株（濃い円形）及び参照株である大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｂｉｏＢ株（明るい灰色の円形）のそれぞれによるビオチン生産を表す。株を、２５０ｍＬのバッフル付きの振盪フラスコに入れた０．１ｇ／ｌのＤＴＢ、０．０１ｍＭ（Ａ）又は０．５ｍＭ（Ｂ）のＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬのｍＭＯＰＳ中で、３７℃、２７５ｒｐｍの振盪で増殖させた。増殖速度を黒い枠内に示す。

【図8】同定された変異株のｉｓｃＲ遺伝子におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列変異の位置を示す、注釈が付けられたＩｓｃＲコード配列を示す図である。

【図9】Ｌ１５Ｆ及びＨ１０７Ｙ ｉｓｃＲ変異が棒（野生型アミノ酸は灰色、変異アミノ酸は黒）として示される、ｈｙａ ＤＮＡ結合部位（黒）に結合したＩｓｃＲ二量体（灰色）の結晶構造（ＰＤＢエントリ４ＨＦ１）を示す図及び変異した残基を強調する拡大画像である。

【図10】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドと、強力なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作用可能に連結されたｉｓｃオペロン（ｉｓｃＳＵＡ－ｈｓｃＢＡ－ｆｄｘ、ｉｓｃＲ遺伝子を欠くネイティブ大腸菌ｉｓｃオペロン構造に対応する）又は大腸菌ｓｕｆオペロン（ｓｕｆＡＢＣＤＳＥ）及び中コピー数プラスミド（ｐ１５Ａ ｏｒｉ）からのＴ５ ＬａｃＯ抑制プロモータを含むプラスミド又は対照プラスミドとを含む大腸菌株のビオチン生産を示す棒グラフである。対照プラスミドは、ｓｕｆオペロン又はｉｓｃオペロンの代わりにＧＦＰをコードするＩＰＴＧ誘導性遺伝子を含んだ。各株の生物学的トリプリケートを、低（０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）及び高（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）誘導下で、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含み、基質として０．１ｇ／Ｌ（ＤＴＢ）を加えたｍＭＯＰＳで培養した。各株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は平均ビオチン生産値（高さ）及びＩＰＴＧ誘導レベル（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製からのビオチン生産を示し、十字はＯＤ_６００として測定される各株のエンドポイント（最終）細胞密度を示す。０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合、どの株も検出可能なレベルのビオチンを生成しなかったことに留意されたい。

【図11】トリプリケートで実施された４つの異なるサンプルでのＢｉｏＢタンパク質発現レベルとビオチン生産との相関のグラフである。株はｐＢＳ４３０（ｂｉｏＢフレームシフトＩＰＴＧ誘導性プラスミド）を有するＢＳ１０１３（大腸菌ＢＷ２５１１３、バックグラウンド株）、ｐＢＳ４１２（ｂｉｏＢ ＩＰＴＧ誘導性プラスミド）を含むＢＳ１０１１（ΔｂｉｏＢを含むＢＳ１０１３）、ｐＢＳ４１２を含むＢＳ１３５３（ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ変異を含むＢＳ１０１１）である。０．１ｇ／ｌのＤＴＢ及びＩＰＴＧをグラフに示すように含むｍＭＯＰＳで菌株を増殖させた。

【図12】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミド及び、ｉｓｃＲの以下のゲノム変異：野生型（ｉｓｃＲ ＷＴ）、位置２２で停止コドンに変異したＥ２２^＊グルタミン酸をコードするノックアウト変異（ｉｓｃＲ ＫＯ）、位置９２でのシステインからチロシンへの置換をコードする変異（ｉｓｃＲ Ｃ９２Ｙ）のいずれかを含む大腸菌ΔｂｉｏＢ株のビオチン生産を示す棒グラフである。棒は、所定のＩＰＴＧ誘導（灰色の陰影）レベルでの平均ビオチン生産値（高さ）を示し、点は個々の複製からのビオチン生産を示す。各株の生物学的トリプリケートを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むｍＭＯＰＳで、無誘導（０ｍＭのＩＰＴＧ）、低誘導（０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）及び高誘導（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）で、基質として０．１ｇ／ＬのＤＴＢを加えて培養した。各株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。

【図13】ビオチンオペロンプラスミドと、ｉｓｃＲの以下のゲノム変異：野生型（ｉｓｃＲ ＷＴ）、変異ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）又は位置９２でのシステインからチロシンへの置換をコードする変異（ｉｓｃＲ Ｃ９２Ｙ）のいずれかを含む大腸菌ΔｂｉｏＡ ΔｂｉｏＢＦＣＤ株によるビオチン生産を示す棒グラフである。各株の生物学的なクアドルプリケート（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を、基質として０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）を含むか又は含まない１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むｍＭＯＰＳ中で培養した。株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は平均ビオチン生産値（高さ）及びＤＴＢの有無（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製からのビオチン生産を示す。

【図14】アミノ酸変異（ＢＳ１３７５、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）を有する変異ＩｓｃＲを発現する２つの異なるｉｓｃＲ変異株及び対照株（ＢＳ１０１１、ＩｓｃＲ ＷＴ）（株については表１を参照）の、それぞれがＩＰＴＧ誘導性ｌｉｐＡ（ｐＢＳ９９３、表４を参照）を発現するプラスミドを含む３つの生物学的複製のリポ酸生産（灰色の棒）及び２４時間生産後の最終（最終的な）ＯＤ_６００（×印）を示す棒グラフである。株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのビオチン、０．６ｇ／ｌのオクタン酸及び０．０１ｍＭのＩＰＴＧを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で、３７℃で２７５ｒｐｍの振盪で２４時間増殖させた。棒は平均リポ酸生産値（高さ）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのリポ酸生産を示している。リポ酸の平均生産量が、最終ＯＤ_６００が同じままであっても１．７９倍増加することが分かる。

【図15】双方ともＩＰＴＧ誘導性ｌｉｐＡ発現プラスミド（ｐＢＳ１０３７）を含む、経時的に測定された参照株（大腸菌ＢＷ２５１１３）ΔｌｉｐＡ（ＷＴ、三角形）及び変異ｉｓｃＲ（Ｃ９２Ｙ）（Ｃ９２Ｙ、四角）を有するΔｌｉｐＡ株の細胞密度（ＯＤ_６２０で測定）のグラフである。ＯＤ６２０を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎを使用して、０．６ｇ／Ｌのオクタン酸、１００ｇ／ｍＬのアンピシリン及び、０～０．０４ｍＭ（灰色の濃さが増加）のＩＰＴＧを含む２００μＬのｍＭＯＰＳ中で増殖させた６つの生物学的菌株の複製について測定した。それぞれの増殖速度（ＧＲ）を右側に示す。

【図16】アミノ酸変異（ＢＳ２０１９、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ２０２０、Ｈ１０７Ｙ）を有する変異ＩｓｃＲを発現する２つの異なるｉｓｃＲ変異株及び大腸菌ＢＷ２５１１３ ΔｔｈｉＰ、ｔｈｉＬ^＊株（ＢＳ７５０、参照）（株については表５を参照）の、それぞれがチアミン経路遺伝子全体ｔｈｉＣＥＦＳＧＨＭＤ（ｐＢＳ１４０）を発現するプラスミドを含む４つの生物学的複製のチアミン生産を示す棒グラフである。株を、２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２４時間、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００μＬのｍＭＯＰ中で増殖させた。棒は、最終ＯＤ_６００を修正したチオクロムアッセイ（チアミン、ＴＭＰ、ＴＰＰを含む）で測定した上清の平均チアミン生産値（高さ）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのチアミン生産を示す。参照株（ＢＳ７５０）と比較して、変異株（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０２０）ではＯＤ正規化力価が１．４３倍改善されていることが分かる。

【図17】大腸菌ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）の、ＩＰＴＧ誘導性ＢｉｏＢ過剰発現プラスミドｐＢＳ６７９を単独で含む株（ＢＳ１９３７）、あるいは更にＦｌｄＡ－Ｆｐｒの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１１１２と共に含む株（ＢＳ２１８５）、又はＧＦＰの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１０５４と共に含む株（ＢＳ２７０７）によるビオチン生産を示す棒グラフである。各株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、基質としての０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）、０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５又は０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳ中で培養した。ＢＳ２１８５及びＢＳ２７０７の培地は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むこと以外は同じであった。株を、２７５ｒｐｍ、３７℃で２４時間、ディープウェルプレートで増殖させ、その後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は、各菌株：ＢＳ１９３７（黒色の棒）；ＢＳ２１８５（灰色の棒）；及びＢＳ２７０７（市松模様の灰色の棒）によるビオチン生産値（高さ）を示す。

【図18】ＩＰＴＧ誘導性ＢｉｏＢ過剰発現プラスミドｐＢＳ６７９を含む大腸菌ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）株によるビオチン生産を示す棒グラフである。ＢＳ２１８５は更に、ＦｌｄＡ－Ｆｐｒの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１１１２を含む。ＢＳ１９３７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、基質としての０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）、０．０２５ｍＭのＩＰＴＧ誘導を含むｍＭＯＰＳ中で培養した。ＢＳ２１８５の培地は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを更に含む以外は同じであった。株を、２７５ｒｐｍ、３７℃で２４時間、ディープウェルプレートで増殖させ、その後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。暗い灰色の棒は平均ビオチン生産値（高さ）を示し（ＢＳ１９３７はｎ＝６及びＢＳ２１８５はｎ＝８）、明るい灰色の棒は最終ＯＤ_６００を示す。黒い点は個々の複製からのビオチン生産及び最終ＯＤ_６００を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

定義：
アミノ酸配列同一性：本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、実質的に等
しい長さの２つのアミノ酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較する２つの配
列は、ギャップを挿入するか、タンパク質配列の末端で切断を行うことにより、最適な適
合を実現するためにアライメントを行う必要がある。配列同一性は、（（Ｎｒｅｆ－Ｎｄ
ｉｆ）１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算することが可能であり、ここで、Ｎｄｉｆはア
ライメントされた時の２つの配列の同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは片方の配列
の残基の数である。配列同一性の計算は、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ｐｅａｒｓｏ
ｎ Ｗ．Ｒ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８））（（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ
ｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）等のＢＬＡＳＴプログラムを使用して自動
化することが好ましい。多重配列アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ配列アライメント法
で実行され、デフォルトのパラメータはＴｈｏｍｐｓｏｎ Ｊら１９９４によって説明さ
れており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可
能である。

【0032】

好ましくは、ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、追加又は欠失の
数は、その比較ポリペプチドと比較して制限されており、すなわち１、２、３、４、５、
６、７、８、９、又は１０個以下の置換、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１
０個以下の挿入、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の追加、及び１
、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の欠失となっている。好ましくは、
置換は保存的アミノ酸置換であり、グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン；グループ２：セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、メ
チオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン、トリプト
ファン；グループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンのメン
バー内の交換に限定されている。

【0033】

アミノ酸略語：ロイシン（Ｌ）、システイン（Ｃ）及びヒスチジン（Ｈ）。

【0034】

内在性遺伝子：起源が宿主細菌と相同な細菌細胞ゲノム内の遺伝子（即ち、宿主細菌の
ネイティブ遺伝子）。当技術分野で知られているツールを使用して内在性遺伝子を遺伝子
改変することにより、遺伝子改変された内在性遺伝子が、それが由来する親内在性遺伝子
によってコードされるポリペプチドとはアミノ酸配列が１つ以上の位置で異なる変異ポリ
ペプチドをコードしてもよい。

【0035】

ゲノム：細胞又は生物内に存在する遺伝物質。そのゲノムは、その細胞又は生物を構築
及び維持するために必要な全ての情報を含み、また、細胞又は生物内に存在する染色体及
びプラスミドの両方の遺伝物質を含む。

【0036】

ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。

【0037】

ｇｉ番号：（ｇｅｎｌｎｆｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅ
ｎＢａｎｋからのヌクレオチド配列、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＰＩＲ及び多くのその他か
らのタンパク質配列をはじめ、Ｅｎｔｒｅｚに処理される全ての配列にＮＣＢＩによって
割り当てられる、データベースソースとは無関係の特定の配列を識別する一意の整数であ
る。

【0038】

Ｉｓｃ経路：鉄硫黄クラスタ経路；ｉｓｃＲ遺伝子を含むｉｓｃオペロンによってコー
ドされる。

【0039】

Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ：フィルタベースのマイクロプレート光度計。３４０～８５０ｎｍ
（６００～６２０ｎｍを含む）の波長範囲で９６又は３８４ウェルプレートフォーマット
からの吸光度を測定する。プレートは、５０℃までの選択された温度で、光度計内でイン
キュベートされる。光度計はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製である。

【0040】

ネイティブ遺伝子：宿主細胞と相同な細菌細胞ゲノムの内在性遺伝子。

【0041】

非ネイティブプロモータ：本発明の遺伝子改変された細菌の文脈において、この細胞内
の遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結されたプロモータであり、このプロモータは、
自然界で見つかる細菌細胞内のこの遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結されたもので
はない。

【0042】

ＯＤ：光学密度

【0043】

導入遺伝子：遺伝子操作によって細菌のゲノムに導入された外来性遺伝子。本発明の文
脈において、このゲノムは染色体遺伝子要素及びエピソーム遺伝子要素の双方を含む。

【0044】

発明の詳細な説明
ビオチン、リポ酸、及びチアミンの合成のための生合成経路の共通の特徴は、複雑なラ
ジカル媒介分子再配列を触媒するための１以上のＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔラジカル酵素を
必要とすることである。ビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ
、及びチロシンリアーゼは、これらの経路におけるこれらの必須のステップを触媒するこ
とが知られているそれぞれの酵素である。ビオチンオペロンの過剰発現によって、又はＢ
ｉｒＡリプレッサによるフィードバック調節の影響を受けにくい変異ビオチンオペロンを
使用することによって、大腸菌のビオチン生合成を高めようとする以前の試みの失敗は、
強い増殖阻害によるものであった（Ｉｆｕｋｕ，Ｏら１９９５）。観察された増殖阻害に
関して、証拠に基づいた説明がないために、ビオチンシンターゼの過剰発現の毒性を説明
しうる細胞因子を特定するには、代替的なアプローチが必要であった。

【0045】

本発明により提供されるこの問題に対する解決策は、細菌細胞工場の細胞（例えば大腸
菌）におけるビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ、及びチロ
シンリアーゼの発現の増強に等しく適用可能であることが示されている。この問題を解決
するために追求されたアプローチは、不完全なエラー修正ポリメラーゼによって生成され
たバックグラウンド変異の蓄積により進化したゲノム多様性を持つ大腸菌細胞のライブラ
リを生成することであった。このようなライブラリの細胞を、ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ遺
伝子発現カセットを含むプラスミドで形質転換した。候補変異体は、変異細胞が由来する
親大腸菌株においてＢｉｏＢ発現毒性を誘発するのに十分な濃度のＩＰＴＧの存在下で増
殖することの可能なライブラリの細胞であった。

【0046】

選択されたＢｉｏＢ発現変異株の増殖の遺伝的根拠を、全ゲノムシーケンシングによっ
て確認した。驚くべきことに、３つの株が、多面発現性の転写因子（ＩｓｃＲ）［配列番
号２］をコードするネイティブ鉄硫黄クラスタレギュレータ遺伝子（ｉｓｃＲ）に変異を
有することが判明した。Ｆｅ－Ｓクラスタは多くのタンパク質及び必須酵素の補因子であ
り、ビオチン等のＳ含有化合物の合成に必要であるだけでなく、酸化還元又は鉄に関連す
るストレス状態のセンサとしても必要な多様な生化学的能力を付与する。

【0047】

ＩｓｃＲは、Ｆｅ－Ｓクラスタホロタンパク質として、又はＦｅ－Ｓクラスタのないア
ポタンパク質として、２つの状態で存在する。ＩｓｃＲのＦｅ－Ｓクラスタのアセンブリ
は、ｉｓｃオペロンによってコードされるＩｓｃ経路によって触媒される。ｉｓｃオペロ
ンは、まずレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードし、続いてシステイン脱スルフラーゼ（Ｉ
ｓｃＳ）、足場（ＩｓｃＵ）、Ａ型タンパク質（ＩｓｃＡ）、Ｄｎａｊ様コシャペロン（
ＨｓｃＢ）、ＤｎａＫ様シャペロン（ＨｓｃＡ）及びフェレドキシン（Ｆｄｘ）をコード
する。Ｉｓｃ経路は、ＩｓｃＲホロ酵素のアセンブリに不可欠であることに加えて、大腸
菌におけるＦｅ－Ｓクラスタ生合成の主要な経路である（図１Ｂ）。

【0048】

ＩｓｃＲの２つの形態の比率は、［２Ｆｅ－２Ｓ］クラスタの細胞レベルによって決定
され、鉄及び酸素のレベルを含むいくつかの要因の影響を受ける（Ｐｙ，Ｂ．＆Ｂａｒｒ
ａｓ，２０１０）。鉄が豊富な条件下では、ＩｓｃＲは主にホロ酵素として存在し、その
後、ｉｓｃオペロンの転写リプレッサとして働く。しかし、鉄が少ない条件下（低レベル
の［２Ｆｅ－２Ｓ］クラスタ）では、ＩｓｃＲはそのアポタンパク質状態に戻り、ｉｓｃ
オペロンの転写を可能にする。ＩｓｃＲは、そのアポタンパク質状態ではｓｕｆＡＢＣＤ
ＳＥオペロンの活性化因子として機能し、酸化ストレス下でＦｅ－Ｓクラスタ生合成を触
媒する。

【0049】

ＩｓｃＲは、大腸菌の２つのＦｅ－Ｓクラスタアセンブリシステムの発現を調節するこ
とに加えて、酸化ストレスメカニズム（例えばｓｏｄＡ）、特定の及び全体的なレギュレ
ータ（例えばｙｑｊＩ及びｓｏｘＳ等）、アミノ酸生合成（例：ａｒｇＥ）及び未知の機
能をもつ一連の遺伝子のさまざまな作用機序に関与する４０種類超の遺伝子を調節する。
ＩｓｃＲの役割は、ＩｓｃＲ調節の状況が好気性条件と嫌気性条件との間で変化するとい
う事実によって更に複雑になる（Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ Ｉｍｌａｙ，２０１２；Ｇｉｅ
ｌら２００６）。

【0050】

ＩｓｃＲの恒常性制御上の役割及び全体的な遺伝子調節における役割を考慮すると、そ
の調節特性の変更の結果は予測不可能であり、細胞代謝に重大な影響を及ぼすであろう。
更に、硫黄形成（ｓｕｆ）及びｉｓｃ経路の双方の発現が増強することによりＦｅ－Ｓク
ラスタの生合成が増加する細胞の状態は、蓄積されたＦｅ－Ｓクラスタがフェントン反応
によって過酸化物ラジカルを生成するリスクを生む。

【0051】

この観点から、３つの単離された個々の変異体が示すように、ＩｓｃＲが細胞のＢｉｏ
Ｂの活性と毒性に非常に重要であることは、全く予想外であった。更に、Ｆｅ－Ｓクラス
タを合成し組み立てる能力を高めるｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現は、ｂ
ｉｏＢを過剰発現する細胞でのビオチン生産を増強することが見出されなかったため（例
１、図１０を参照）、変異ＩｓｃＲタンパク質のビオチン生合成への影響は予想外であっ
た。更に、ｉｓｃＲ遺伝子のノックアウトによる細胞のｉｓｃＲ調節の除去も、細胞内の
ビオチン生産を増強しなかった（例１、図１２を参照）。

【0052】

変異細胞におけるＢｉｏＢ発現の毒性を排除したＩｓｃＲタンパク質の３つの異なる変
異は、アミノ酸Ｌ１５［配列番号１６］、Ｃ９２［配列番号１８］及びＨ１０７［配列番
号２０］の単一アミノ酸置換であった（図８）。３つの変異のうち２つはＩｓｃＲの残基
に正確に対応しており、それぞれがＩｓｃＲホロタンパク質の形成に不可欠であることが
知られている。ＩｓｃＲには、大腸菌に見られるように、異常なＦｅ－Ｓクラスタライゲ
ーション機序があり、このため、Ｆｅ－Ｓクラスタライゲーションに不可欠な残基はＣ９
２、Ｃ９８、Ｃ１０４及びＨ１０７である。この異常なライゲーションは、他のＦｅ－Ｓ
タンパク質と比較してＩｓｃＲのホロ酵素状態の安定性を低下させ、低Ｆｅ－Ｓ条件での
アポタンパク質状態への切り替えの原因となる（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒら２０１２
）。

【0053】

理論に束縛されることを望まないが、これは、本発明の変異ｉｓｃＲ遺伝子を発現する
細胞において、酵素（ビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ、
チロシンリアーゼ）を含む鉄－硫黄クラスタのアセンブリを促進しながら、これらを過剰
発現している間であっても、Ｆｅ－Ｓクラスタ生合成の恒常性制御及び細胞増殖に必要な
全体的な遺伝子調節が独自に保たれることを示唆している。

【0054】

要約すると、本発明者らは、発現された変異ＩｓｃＲタンパク質がアポタンパク質の形
でのみ存在するように、Ｆｅ－Ｓクラスタのライゲーションに必要な１以上のアミノ酸残
基の欠如を特徴とする変異ＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子を同定し
た。酵素を含む鉄硫黄クラスタの合成は、細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンの
生産を増強する取り組みの大きなボトルネックであることが示されている。この問題は、
本発明によって提示されるように、アポタンパク質状態で存在する変異ＩｓｃＲタンパク
質をコードする遺伝子を含む細胞工場におけるこれらの酵素の過剰発現によって容易に解
決される。本発明の様々な実施形態を、以下により詳細に説明する。

【0055】

Ｉ ビオチン製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、ビオチン生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提
供する。細菌細胞は、野生型ＩｓｃＲの代わりに変異ＩｓｃＲを発現するように遺伝子改
変され、ビオチンシンターゼ（ＥＣ２．８．１．６を有するビオチンシンターゼ）をコー
ドする導入遺伝子を含む。場合により、遺伝子改変された細菌細胞は、ビオチン経路の更
なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の更なる導入遺伝子を更に含
んでもよい（図１Ａ）。ビオチン経路のステップを触媒するポリペプチドのレベルが増加
すると、細菌細胞のビオチン経路の中間体と経路の最終生成物（ビオチン）との両方の合
成が促進される。

【0056】

遺伝子改変された細菌細胞によって発現される変異ＩｓｃＲポリペプチドは、ポリペプ
チド骨格（アポタンパク質）によって特徴付けられるＩｓｃＲポリペプチドファミリの野
生型メンバーに由来する。ＩｓｃＲポリペプチドファミリの野生型メンバーのアミノ酸配
列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のいずれか１つから選択される配列
と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配
列同一性を有する。本発明による変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくと
も１つのアミノ酸置換により、由来する対応する野生型ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸
配列と異なる。この置換は、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ、及びＨ１０７
Ｘから選択され、置換アミノ酸であるＸは、変異型が由来する野生型ＩｓｃＲの対応する
位置に見られるアミノ酸以外の任意のアミノ酸である。

【0057】

別の一実施形態では、変異ＩｓｃＲのアミノ酸置換は、ＸはＬ以外の任意のアミノ酸で
あり、より好ましくは、Ｘはフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ
）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＬ１５Ｘ；ＸはＣ以外の任意のアミノ酸で
あり、より好ましくは、Ｘはチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、フェ
ニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＣ９２Ｘ；ＸはＣ以外の
任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイ
シン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）から
選択されるＣ９８Ｘ；ＸはＣ以外の任意のアミノ酸、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ
）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及
びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＣｙｓ１０４Ｘ；ＸはＨ以外の任意のアミノ酸で
あり、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、イソロイ
シン（Ｉ）、及びロイシン（Ｌ）から選択されるＨｉｓ１０７Ｘのいずれかから選択され
る。例えば、変異ＩｓｃＲにおけるアミノ酸置換は、Ｌ１５Ｆ、Ｃ９２Ｙ、Ｃ９２Ａ、Ｃ
９８Ａ、Ｃｙｓ１０４Ａ、Ｈ１０７Ｙ、及びＨ１０７Ａの中から選択され得る。

【0058】

（野生型ＩｓｃＲの代わりに）本発明の遺伝子改変された細菌細胞により発現される変
異ＩｓｃＲは、染色体上又は自己複製プラスミド上の細菌細胞のゲノム内に位置する遺伝
子改変された遺伝子によりコードされる。染色体内の遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子は
、ネイティブゲノム内の野生型ｉｓｃＲ遺伝子と同じゲノム内位置に位置していてもよい
。本発明の遺伝子改変された細菌細胞のゲノムは、ネイティブな野生型ｉｓｃＲ遺伝子が
欠失されているか、又は遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子によって直接置換されているた
めに、ネイティブな野生型ｉｓｃＲ遺伝子を欠いている。遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝
子の発現を駆動するプロモータは、遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子が由来するか又は置
き換えられた野生型ｉｓｃＲ遺伝子のネイティブプロモータであってもよい。あるいは、
プロモータは、異種構成的プロモータ又は誘導性プロモータであってもよい。プロモータ
が異種構成的プロモータである場合、適切なプロモータにはａｐＦａｂファミリ［配列番
号２３０－２３２］が含まれ、適切な誘導性プロモータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘
導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号２３４］が含まれる。適切なターミネー
タには、［配列番号２３５－２３７］を含むａｐＦＡＢターミネータファミリのメンバー
が含まれる。

【0059】

本発明によるビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドは
、デスチオビオチン（ＤＴＢ）のビオチンへの変換を触媒するビオチンシンターゼ活性を
有するポリペプチドである。ビオチンシンターゼのこのファミリのメンバーは、幅広い属
に属する細菌に見られる遺伝子によってコードされている。ビオチンシンターゼ活性を有
するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２２（起源：大腸菌）；配列番号２７（起
源：候補名クロラキドバクテリウム・テルモピルムＢ）；配列番号２９（起源：ストレプ
トマイセス・ライディカス）；配列番号３１（起源：パラコッカス・デニトリフィカンス
）；配列番号３３（起源：パラコッカス・デニトリフィカンス ＰＤ１２２２）；配列番
号３５（起源：アグロバクテリウム・ビティス）；配列番号３７（起源：ルエジェリア・
ポメロイ）；配列番号３９（起源：アグロバクテリウム・ファブラム）；配列番号４１（
起源：トコジラミのボルバキア内部共生体）；配列番号４３（起源：スフィンゴモナス・
パウシモビリス）；配列番号４５（起源：アシディチオバシラス・フェリボランス（Ａｃ
ｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｉｖｏｒａｎｓ））；配列番号４７（起源：
ガリオネラ・カスピフェリフォルマンス（Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ ｃａｐｓｉｆｅｒｒ
ｉｆｏｒｍａｎｓ））；配列番号４９（起源：ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔ
ｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））；配列番号５１（起源：パラ百日咳菌）；配列番号５３
（起源：プシリモナス属）；配列番号５５（起源：ケナルカエウム・シュンビオスム属）
；配列番号５７（起源：アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス属）；配列番号５９
（起源：ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス）；配列番号６１（起源：枯草菌）；配
列番号６３（起源：リシニバチルス・スフェリカス）；配列番号６５（起源：メチロコッ
カス・カプスラータス）；配列番号６７（起源：レクレルシア・アデカルボキシラータ）
；配列番号６９（起源：クロモハロバクター・サレキシゲンス）；配列番号７１、７３、
７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７（起源：シュードモナス属）のいずれか１つ
から選択された配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１
００％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0060】

遺伝子改変された細菌細胞内の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性がビオ
チン経路の中間体と生成物との双方の合成を増強する役割を果たすポリペプチドは、次の
通りである：
ａ）ＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（Ｂｉ
ｏＣ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；例えば、配列番号８９と８０、
８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド；
ｂ）７－ケト－８－アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ
２．３．１．４７）を有するポリペプチド；例えば、配列番号９１と８０、８５、９０、
９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｃ）７，８－ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＡ；ＥＣ：２
．６．１．６２）を有するポリペプチド；例えば、配列番号９３と８０、８５、９０、９
５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は、例え
ば、配列番号９７と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ
酸配列を有するポリペプチド等のＬ－リジン：８－アミノ－７－オキソノナノエートアミ
ノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＫ；ＥＣ：２．６．１．１０５）；
ｄ）配列番号９５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド等の、デスチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（Ｂ
ｉｏＤ；Ｅ．Ｃ６．３．３．３）を有するポリペプチド；及び、任意に、
ｆ）配列番号９９と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド等の、ピメロイル－［アシル－キャリアタンパク質］メチ
ルエステルエステラーゼ（ＢｉｏＨ；ＥＣ：３．１．１．８５）を有するポリペプチド；
又は、
ｇ）６－カルボキシヘキサノエート－ＣｏＡリガーゼ活性（ＢｉｏＷ；ＥＣ６．２．１
．１４）を有するポリペプチド；例えば、配列番号１０１と８０、８５、９０、９５、又
は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。

【0061】

ＢｉｏＢをコードする導入遺伝子は、ビオチン経路の更なるステップを触媒するポリペ
プチドをコードする１以上の更なる導入遺伝子と共に、遺伝子改変された細菌細胞のゲノ
ム内に位置し、細菌細胞の染色体内又は自己複製プラスミド上に組み込まれている。ビオ
チン経路酵素（ＢｉｏＡＢＦＣＤ及びＨ又はＷ）内のＢｉｏＢ及び１以上の酵素をコード
する導入遺伝子が、１以上のオペロン内のゲノムに存在してもよい。

【0062】

ＢｉｏＢをコードする導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロ
モータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性
プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロ
モータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０－２３２］が含まれ、適切な誘導性プロ
モータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号
２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５－２３７］を含むａｐ
ＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネ
ータが、ＢｉｏＢのコード配列並びに、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ、ＢｉｏＡ、ＢｉｏＦポリペ
プチドと、ＢｉｏＷ又はＢｉｏＨポリペプチドとのうちの１つ以上のコード配列のコード
配列に作用可能に連結されていてもよいが、選択されたＢｉｏポリペプチドをコードする
１つ以上のオペロンに作用可能に連結されていてもよい。

【0063】

ＩＩ 本発明の遺伝子改変された細菌を使用してビオチンを製造及び検出する方法
ビオチンは、例に示すように、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例えば、遺伝子改
変された大腸菌細胞）を使用して、増殖を介助するのに適し、かつビオチンの生合成に適
した炭素源を含む培地に細胞を導入し、培養物によって生産されたビオチンを最終的に回
収することにより、製造し取り出すことができる。

【0064】

ビオチンシンターゼ（ＢｉｏＢ）をコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変さ
れた細菌細胞は、供給された炭素源がデスチオビオチン（ＤＴＢ）を含む場合、ビオチン
の生産レベルを高める。ＢｉｏＡ、ＢｉｏＦ、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ及びＢｉｏＨ又はＢｉ
ｏＷのそれぞれをコードする導入遺伝子を更に含む本発明の遺伝子改変された細菌細胞は
、供給される炭素源がグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロー
ス、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース及びラクトースから選択され
る場合に、ビオチンを生産する（例１、図１３）。

【0065】

本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産される細胞外ビオチンを定量化する方法
は、例１．５に記載されている。本方法は、本発明の細胞の培養に由来する細胞外増殖培
地を加えたビオチン欠乏増殖培地中におけるプラスミドｐＢＳ４５１を含むＢＳ１０１１
のビオチン欠乏条件下での一晩培養物の増殖の測定に基づくバイオアッセイである。ビオ
チンバイオアッセイの検量線は、図５に示すように、既知の濃度範囲のビオチン標準液を
加えたビオチン欠乏一晩培養物の増殖を測定することによって作成される。

【0066】

ＩＩＩ リポ酸製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、リポ酸生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供
する。細菌細胞は、野生型ＩｓｃＲの代わりに、本発明に従って変異ＩｓｃＲを発現する
ように遺伝子改変されており（セクションＩを参照）、リポ酸シンターゼ（ＥＣ２．８．
１．８）をコードする導入遺伝子を含む。ＬｉｐＡは、２つの硫黄結合の形成を促進する
ことにより、共有結合したオクタノイルドメインからリポイルドメインへの変換を触媒す
る。必要に応じて、遺伝子改変された細菌細胞は、リポ酸合成経路の更なるステップを触
媒するポリペプチド、より具体的にはコードされたポリペプチドＬｉｐＢ；例えばｌｉｐ
Ｂ遺伝子のＥＣ：２．３．１．１８１及び、コードされたポリペプチドＥ２；例えばａｃ
ｅＦ遺伝子のＥＣ：２．３．１．１２等をコードする１以上の更なる導入遺伝子を更に含
んでもよい（図２）。リポ酸経路のステップを触媒するこれらのポリペプチドのレベルの
増加は、細菌細胞の経路の中間体と経路の最終産物との両方の合成を促進する。リポエー
トタンパク質リガーゼＡであるＬｐｌＡ；ＥＣ：６．３．１．２０をコードする更なる導
入遺伝子は、オクタン酸を与えられた細胞におけるリポ酸の合成を、オクタノイル部分の
活性化リポイルドメインへの転移を触媒することにより促進するのに役立つ。

【0067】

リポ酸シンターゼは、幅広い属に属する広範な細菌及び真菌に見られる遺伝子によって
コードされている。リポ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列
番号１０３（起源：大腸菌）；配列番号１０５（起源：枯草菌）；配列番号１０７（起源
：出芽酵母）；配列番号１０９（起源：シュードモナス・プチダ）；配列番号１１１（起
源：バクテロイデス・フラギリス）；及び配列番号１１３（起源：ストレプトマイセス・
コエリカラー）のいずれか１つから選択された配列と少なくとも７０、７５、８０、８５
、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0068】

遺伝子改変された細菌細胞内の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性がリポ
酸経路の中間体と生成物との両方の合成を強化する役割を果たすポリペプチドは以下の通
りである：
ａ）（オクタノイル残基をＡＣＰから標的酵素活性のＥ２サブユニットのアポリポイル
ドメインに転移させるためのオクタノイルトランスフェラーゼ活性；ＬｉｐＢ；ＥＣ：２
．３．１．１８１、配列番号１１５（起源：大腸菌）又は配列番号１１７（起源：フレク
スナー赤痢菌）と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸
配列を有するポリペプチド等）；
ｂ）例えば、配列番号１１９（起源：大腸菌）又は配列番号１２１（起源：クレブシエ
ラ・オキシトカ）又は配列番号２３９（ハイブリッド配列）と８０、８５、９０、９５、
又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ピルビン酸
デヒドロゲナーゼ（Ｅ２；ＥＣ：２．３．１．１２）のジヒドロリポイルリジン残基アセ
チルトランスフェラーゼ成分を含むポリペプチド。
ｃ）例えば、配列番号１２３（起源：大腸菌）又は配列番号１２５（起源：クレブシエ
ラ・オキシトカ）と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ
酸配列を有するポリペプチド等の、リポエートタンパク質リガーゼＡ（ＬｐｌＡ；ＥＣ：
６．３．１．２０）活性を有するポリペプチド。

【0069】

リポ酸シンターゼをコードする導入遺伝子は、リポ酸経路の更なるステップを触媒する
ポリペプチドをコードする１以上の更なる導入遺伝子とともに、遺伝子改変された細菌細
胞のゲノム内に位置し、細菌細胞の染色体中又は自己複製プラスミド上に組み込まれてい
る。ＬｉｐＡをコードする導入遺伝子と、リポ酸経路酵素の酵素をコードする導入遺伝子
（ＩｐＢ、ＩｐｌＡ及びＡｃｅＦ）の１以上とが、１以上のオペロン内のゲノムに存在し
ていてもよい。

【0070】

ＬｉｐＡをコードする導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロ
モータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性
プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロ
モータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０－２３２］が含まれ、適切な誘導性プロ
モータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号
２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５－２３７］を含むａｐ
ＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネ
ータは、個々の遺伝子調節又はオペロンの調節のために、それぞれの遺伝子に作用可能に
連結され得る。

【0071】

ＩＶ 本発明の遺伝子改変された細菌を使用してリポ酸を製造及び検出する方法
リポ酸は、例２及び図１４に示すように）、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例え
ば、遺伝子改変された大腸菌細胞）を使用して、細胞を適切な培地に導入し、細胞によっ
て生産されたリポ酸を最終的に回収することにより、製造することができる。

【0072】

リポ酸シンターゼ（ＬｉｐＡ）をコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変され
た細菌細胞は、供給された炭素源がオクタン酸（ＯＡ）を含む場合にリポ酸を生産する。
細胞は、適切な炭素源、例えばグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、
スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトースの
中から選択される供給源が供給されると、リポ酸を生産する。

【0073】

本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産される細胞リポ酸を定量化する方法は、
例２に記載されている。この方法は、本発明の細胞から抽出されたリポ酸を加えた最小培
地でのリポ酸依存栄養要求性大腸菌株の増殖の測定に基づくバイオアッセイである。

【0074】

Ｖ チアミン製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、チアミン生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提
供する。細菌細胞は、本発明に従って、野生型ＩｓｃＲの代わりに変異ＩｓｃＲを発現す
るように遺伝子改変されており（セクションＩを参照）、ｔｈｉＣによってコードされる
、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１７）とも呼ばれるホスホメチルピリミジ
ンシンターゼ又は、ｔｈｉＨによってコードされる（２－イミノ酢酸シンターゼ（ＥＣ４
．１．９９．１９）とも呼ばれるチロシンリアーゼをコードする導入遺伝子を含む。

【0075】

遺伝子改変された細菌細胞は、チアミン合成経路の更なるステップを触媒するポリペプ
チドをコードする１つ以上の更なる導入遺伝子を更に含んでもよい（図３）。チアミン経
路のステップを触媒するこれらのポリペプチドのレベルが増加すると、細菌細胞の経路の
中間体と経路の最終生成物との両方の合成が促進される。例えば、細菌細胞は、以下をコ
ードする１つ以上の導入遺伝子を更に含んでもよい：ＴｈｉＥチアミンリン酸シンターゼ
（ＥＣ２．５．１．３）；（例えばｔｈｉＦ遺伝子によりコードされる）［ＴｈｉＳ］ア
デニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．７３）；ＴｈｉＧチアゾールシンターゼ
（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）；ＴｈｉＳ硫黄キャリアタンパク質；ＴｈｉＤホスホヒド
ロキシメチルピリミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．４．７）及びチアミン一リン酸ホスファ
ターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．－）；ＴｈｉＯグリシンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．
１９）；及びＴｈｉＭヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（２．７．１．５０）。

【0076】

ＨＭＰ－Ｐシンターゼは、幅広い属に属する広範囲の細菌及び真菌に見られる。ＨＭＰ
－Ｐシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２０１（起源：大
腸菌）；配列番号２０３（起源：シネココッカス・エロンガツス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃ
ｃｕｓ＿ｅｌｏｎｇａｔｕｓ））；配列番号２０５（起源：コリネバクテリウム・グルタ
ミカム）；配列番号２０７（起源 候補名バウマニア・シカデリニコーラ（Ｂａｕｍａｎ
ｎｉａ ｃｉｃａｄｅｌｌｉｎｉｃｏｌａ））のいずれか１つから選択された配列と、少
なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同
一性を有する。

【0077】

チロシンリアーゼは、２－イミノ酢酸シンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１９）とも呼ば
れる。ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１
７の配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のア
ミノ酸配列同一性を有する。

【0078】

遺伝子改変された細菌細胞の１以上の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性
がチアミン経路の中間体と生成物との両方の合成を増強する役割を果たすポリペプチドは
、次の通りである：
ａ）配列番号２１１と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、［ＴｈｉＳ］アデニリルトランスフェラーゼ（Ｅ
Ｃ２．７．７．７３）活性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号２０９と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアミンリン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．３
）活性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２１５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアゾールシンターゼ（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１
０）活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２２５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ（Ｅ
Ｃ２．７．４．７）活性を有するポリペプチド；
ｅ）配列番号２１９、２２１及び２２３の中から選択される配列と８０、８５、９０、
９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、グリ
シンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１９）活性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号２１３と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ＴｈｉＳ硫黄キャリア活性を有するポリペプチド
；
ｇ）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１
４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１
６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１
８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９のいずれか１
つから選択された配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．
１．３．－）活性を有するポリペプチド；及び、
ｈ）配列番号２２７と８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド等の、ＴｈｉＭヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性
（２．７．１．５０）を有するポリペプチド。

【0079】

好ましくは、遺伝子改変された細菌細胞は、（ｔｈｉＣ遺伝子によりコードされる）酵
素ＴｈｉＣ；（ｔｈｉＤ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＤ；（ｔｈｉＥ遺伝子によ
ってコードされる）ＴｈｉＥ；（ｔｈｉＦ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＦ；（こ
の遺伝子によってコードされる）硫黄キャリアタンパク質；（ｔｈｉＧ遺伝子によってコ
ードされる）ＴｈｉＧ；（ＴＭＰホスファターゼ遺伝子によってコードされる）ＴＭＰホ
スファターゼ；及び、（ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＨと（ｔｈｉＯ遺
伝子によってコードされる）ＴｈｉＯとのうちのいずれかをコードする導入遺伝子を含む
。この実施形態によれば、細胞は、（（ｔｈｉＭ遺伝子によってコードされる）酵素Ｔｈ
ｉＭをコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。

【0080】

本発明の遺伝子改変された細菌におけるチアミン合成レベルは、チアミン－リン酸キナ
ーゼをコードする内在性ｔｈｉＬ遺伝子の変異により更に増強され得る。変異ｔｈｉＬ遺
伝子は、配列番号２２８のヌクレオチド配列を有し、親の野生型遺伝子と比較すると、Ｇ
１３３Ｄ置換［配列番号２２９］を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド１３３
～１３５（ＧＧＴからＧＡＣ）に変異を有する。

【0081】

ｔｈｉＣでコードされるＨＭＰ－Ｐシンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１７）又は、ｔｈ
ｉＨによってコードされるチロシンリアーゼ（ＥＣ４．１．９９．１９）をコードする導
入遺伝子は、チアミン経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１つ以
上の更なる導入遺伝子とともに、遺伝子改変された細菌細胞のゲノム内に位置し、細菌細
胞染色体中又は自己複製プラスミド上に組み込まれている。ｔｈｉＣ又はｔｈｉＨ導入遺
伝子及びチアミン経路酵素の酵素をコードする導入遺伝子のうちの１以上が、１以上のオ
ペロン内のゲノムに存在していてもよい。

【0082】

ｔｈｉＣ又はｔｈｉＨ導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロ
モータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性
プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロ
モータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０－２３２］が含まれ、適切な誘導性プロ
モータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号
２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５－２３７］を含むａｐ
ＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネ
ータは、個々の遺伝子調節又はオペロンの調節のために、それぞれの遺伝子に作用可能に
連結され得る。

【0083】

ＶＩ 本発明の遺伝子改変された細菌を使用してチアミンを製造及び検出する方法
チアミン、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）、及びチアミン二リン酸（ＴＰＰ）は、例３及
び図１６に示すように、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例えば遺伝子改変された大
腸菌細胞）を使用して、細胞を適切な培養培地に導入し、細胞によって生成されたチアミ
ン、ＴＰＰ、及びＴＭＰを最終的に回収することにより、製造することができる。

【0084】

ＨＭＰ－Ｐシンターゼをコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌細
胞は、供給される炭素源がグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スク
ロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース及びラクトースから選択
される場合に、チアミン、ＴＰＰ、及びＴＭＰを生産する。

【0085】

本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産されたチアミンを定量する方法は、例３
に記載されており、チアミン標準液と比較して、高圧液体クロマトグラフィーの使用が含
まれ得る。

【0086】

ＶＩＩ ビオチン、リポ酸又はチアミンの製造のための遺伝子改変された細菌細胞の操作
方法
本発明の細菌細胞におけるビオチン、リポ酸又はチアミンの合成に関連する酵素活性を
有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子をクローニング及び導
入するのに適した組込み及び自己複製ベクターは市販されており、当業者に既知である（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ らＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照）。細菌細胞は、細胞
内に異種ＤＮＡを導入することによって遺伝子操作される。本発明の細菌細胞におけるビ
オチン、リポ酸又はチアミン合成に関連する酵素活性を有する１以上のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の異種発現は、例１、２及び３にそれぞれ示されている。

【0087】

本発明によるビオチン、リポ酸又はチアミン合成に関連する酵素活性を有する１以上の
ポリペプチドをコードする核酸分子を、自己複製ベクターによって宿主細胞に導入しても
よいが、当該分野で標準的な方法及び技術を使用して宿主細胞ゲノム内に任意に組み込ん
でもよい。例えば、核酸分子を、化学的形質転換及びエレクトロポレーション、形質導入
、粒子衝撃等を含む形質転換等の標準的なプロトコルによって導入してもよい。本発明の
酵素をコードする核酸分子の発現を、核酸分子をゲノムに組み込むことによって達成して
もよい。

【0088】

本発明の細菌細胞におけるネイティブな内在性ｉｓｃＲ遺伝子の遺伝子改変は、適切な
親細菌細胞に標準的な組み換え方法を適用し、内在性ｉｓｃＲ遺伝子を欠失（ノックアウ
ト）して、セクションＩで定義される変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする導入遺伝子
での挿入／置換を行うことにより実施可能である（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ，ｅｔ ａｌ
．；２０００）。

【0089】

ビオチン、リポ酸又はチアミンの製造のための本発明による遺伝子改変された細菌細胞
は細菌であってもよく、適切な細菌の非網羅的なリストは次のとおりである：エシェリヒ
ア、ブレビバクテリウム、バークホルデリア、カンピロバクター、コリネバクテリウム、
シュードモナス、セラチア、ラクトバチルス、ラクトコッカス、アセトバクター、アシネ
トバクター、シュードモナス等からなる群から選択される属に属する種。

【0090】

本発明の好ましい細菌種は、大腸菌、シュードモナス・プチダ、セラチア・マルセッセ
ンス及びコリネバクテリウム・グルタミカムである。

【0091】

ＶＩＩＩ 本発明の遺伝子改変された細菌細胞のビオチン生産能力は、電子伝達の増加に
より増強される。
酸化された［４Ｆｅ－４Ｓ］^２＋クラスタを含むＳＡＭラジカル鉄硫黄クラスタ酵素、
例えばＢｉｏＢ、ＴｈｉＣ及びＬｉｐＡは、［４Ｆｅ－４Ｓ］^＋クラスタへの還元のため
に電子伝達を必要とする。還元された［４Ｆｅ－４Ｓ］^＋クラスタのみが、触媒作用に必
要なＳＡＭラジカルを生成することができる。電子供与体ＮＡＤＰＨから［４Ｆｅ－４Ｓ
］^２＋クラスタへの電子伝達は、フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ
）及びフラボドキシン（ＦｌｄＡ）還元システムにより、又はピルビン酸フラボドキシン
／フェレドキシンオキシレダクターゼシステムにより媒介される。

【0092】

更なる一実施形態では、ビオチン、リポ酸、又はチアミンを生産することの可能な本発
明による遺伝子改変された細菌細胞は、フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダ
クターゼをコードする遺伝子（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）；ピ
ルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子（ＥＣ
１．２．７）；フラボドキシンをコードする遺伝子；フェレドキシンをコードする遺伝子
；フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子からな
る群から選択される１以上の遺伝子を更に含む。１以上の遺伝子のそれぞれに作用可能に
連結されたプロモータは、細菌におけるこれらの１以上の遺伝子の発現を増強することが
できる。これらの１以上の遺伝子のそれぞれは、ネイティブ遺伝子であっても、導入遺伝
子であってもよい。好ましくは、作用可能に連結されたプロモータは、この細菌における
これらの１以上の遺伝子の発現を、本発明の遺伝子改変された細菌が由来する親細菌にお
けるレベルよりも高いレベルまで増強する。好ましくは、本発明による遺伝子改変された
細菌細胞は、フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８
．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子及びフラボドキシンをコードす
る遺伝子あるいは、フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼの両方の
コード配列を含む単一遺伝子を含む。加えて、この遺伝子改変された細菌細胞が、フェレ
ドキシンをコードする遺伝子を更に含んでもよい。

【0093】

本発明の遺伝子改変された細菌細胞における電子伝達経路の成分を発現する遺伝子の過
剰発現は、（本発明のビオチン生産細胞についての例４に示すように）それらのＳＡＭラ
ジカル鉄硫黄クラスタ酵素の細胞活性を増強する。

【0094】

好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子
によりコードされるポリペプチドは、フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ活性
（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）を有する場合、配列番号２４１（
起源：大腸菌由来のｆｐｒ遺伝子）；配列番号２４３（起源：枯草菌１６８由来のｙｕｍ
Ｃ遺伝子）；配列番号２４５（起源：シュードモナス・プチダＫＴ２４４０由来のｆｐｒ
－Ｉ遺伝子）；配列番号２４７（起源：ストレプトマイセス・ベネズエラエ ＡＴＣＣ
１０７１２由来のＳＶＥＮ＿０１１３遺伝子）；配列番号２４９（起源：コリネバクテリ
ウム・グルタミカム ＡＴＴＣＣ １３０３２由来のＣｇｌ２３８４遺伝子）及び配列番
号２５１（起源：スフィンゴバクテリウム属ＪＢ１７０由来のＳＪＮ １５６１４．１遺
伝子）のいずれか１つから選択された配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配
列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0095】

好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子
によってコードされるポリペプチドは、ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキ
シレダクターゼ活性（ＥＣ１．２．７）を有する場合、配列番号２５３（起源：大腸菌Ｋ
１２ ＭＧ１６５５由来のｙｄｂＫ遺伝子）；配列番号２５５（起源：ゲオバクター・ス
ルフレデュセンス ＡＭ－１由来のｐｏｒ遺伝子）；配列番号２５７（起源：ストレプト
マイセス・プラテンシス ＡＴＣＣ ３３３３１由来のＳｆｌａ＿２５９２遺伝子；配列
番号２５９（起源：プロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ ＤＳＭ ２０２
７１由来のＲＭ２５＿０１８６遺伝子）；配列番号２６１（起源：シネコシスティス属
ＰＣＣ ６８０３由来のｎｉｆＪ遺伝子）のいずれか１つから選択された配列と８０、８
５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0096】

好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子
によりコードされるポリペプチドは、フラボドキシンである場合、配列番号２６３（起源
：大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｆｌｄＡ遺伝子）；配列番号２６５（起源：大腸菌
Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｆｌｄＢ遺伝子）；配列番号２６７（起源：枯草菌１６８由
来のｙｋｕｎ遺伝子）；配列番号２６９（起源：シネコシスティス属 ＰＣＣ ６８０３
由来のｉｓｉＢ遺伝子；配列番号２７１（起源：ストレプトマイセス・ベネズエラエ Ａ
ＴＣＣ １０７１２由来のｗｒｂＡ遺伝子）；配列番号２７３（起源：メタノコッカス・
エオリカス・ナンカイ－３（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓ Ｎａｎｋ
ａｉ－３）由来のＰＲＫ０６２４２遺伝子）のいずれか１つから選択される配列と８０、
８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0097】

好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子
によってコードされるポリペプチドは、フェレドキシンである場合、配列番号２７５（起
源：大腸菌由来のｆｄｘ遺伝子）；配列番号２７７（起源：枯草菌１６８由来のｆｅｒ遺
伝子）；配列番号２７９（起源：コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＴＣＣ １３
０３２由来のｆｄｘＢ遺伝子）；配列番号２８１（起源：シネコシスティス属 ＰＣＣ
６８０３由来のｆｄｘ遺伝子）；配列番号２８３（起源：ストレプトマイセス・ベネズエ
ラエ ＡＴＣＣ １０７１２由来のＳＶＥＮ＿７０３９遺伝子）；配列番号２８５（起源
：メタノコッカス・エオリカス・ナンカイ－３（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌ
ｉｃｕｓ ｎａｎｋａｉ－３）由来のｆｄｘ遺伝子）のいずれか１つから選択される配列
と８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0098】

この細菌の電子伝達経路のポリペプチドをコードするネイティブ遺伝子又は導入遺伝子
に作用可能に連結された場合に遺伝子発現を増強することの可能なプロモータは、好まし
くは非ネイティブプロモータである。このプロモータは、構成的ａｐＦＡＢ３０９プロモ
ータファミリ［配列番号２３０－２３２］のメンバーであってもよい。好ましくは、この
非ネイティブプロモータは、このネイティブ遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結され
た場合、この遺伝子改変された細菌におけるこのコードされたポリペプチドの発現を、そ
れが由来する親細菌よりも高いレベルまで増強する。このネイティブ遺伝子又は導入遺伝
子に作用可能に連結されることの可能な適切なターミネータには、ａｐＦＡＢ３７８ター
ミネータファミリ［配列番号２３５－２３７］が含まれる。

【実施例0099】

実施例１：ビオチン生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の同定及び特
性評価

【0100】

１ 方法
１．１：例で使用した大腸菌の株を以下に示す。

【0101】

表１：株

【表1】

【0102】

１．２：例で使用したプラスミドを以下に示す。

【0103】

表２：プラスミド

【表2】

【0104】

１．３ 培地と添加物：
各例で使用された増殖培地（ｍＭＯＰＳ）は、次の組成を有した：１．３２ｍＭのＫ_２
ＨＰ０_４；２ｇ／ｌのＤ－グルコース；０．０４７６ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシウム
；０．０１３８ｍｇ／ｌのｐ－アミノ安息香酸；０．０１３８ｍｇ／ｌのｐ－ヒドロキシ
安息香酸；０．０１５４ｍｇ／ｌの２，３－ジヒドロキシ安息香酸及び、１×改質ＭＯＰ
Ｓバッファ。

【0105】

１０×改質ＭＯＰＳは、０．４ＭのＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸）；０．０４Ｍのトリシン；０．１ｍＭのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；９５ｍＭのＮＨ_４
Ｃｌ；２．７６ｍＭのＫ_２ＳＯ_４；５μＭのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；５．２５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ_２；０．５ＭのＮａＣｌ；及び５０００倍に希釈した微量栄養素ストック溶液を含む
。

【0106】

微量栄養素ストック溶液：

【数1】

【0107】

以下の抗生物質ストックを使用した：アンピシリン（ａｍｐ、１００ｍｇ／ｍＬ）、カ
ナマイシン（ｋａｎ、５０ｍｇ／ｍＬ）、ゼオシン（ｚｅｏ、４０ｍｇ／ｍＬ）。指示に
従って増殖培地に添加し、１０００倍希釈液を得た。

【0108】

１．４ 大腸菌株ライブラリの作成：
進化したゲノム多様性を有する大腸菌ライブラリを、プラスミドｐＢＳ４１２を含む大
腸菌株ＢＳ１０１１の細胞から、ｋａｎ（ＭＯＰＳ－ｋａｎ）を添加したｍＭＯＰＳ培地
でこれらの細胞を一晩静置培養し、得られたｍＭＯＰＳ－ｋａｎ培養物の１００倍希釈液
を調製し、一晩培養と希釈との連続工程を５回繰り返すことにより作成した。この手順に
より、不完全なエラー修正ポリメラーゼによって生成されたバックグラウンド変異の蓄積
が可能になり、遺伝的多様性が生まれる。培養と希釈の各ラウンドの後、ＩＰＴＧを含む
ｍＭＯＰＳプレートに細胞培養のサンプルを播種し（下記参照）、ＢｉｏＢ発現の増強に
耐える細胞の進化を検出した。次に、各ライブラリの細胞をＢｉｏＢ過剰発現プラスミド
ｐＢＳ４１２で形質転換した。

【0109】

１．５ 変異株の選択
０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１ｍＭのいずれかの濃度のＩＰＴ
Ｇを含むｍＭＯＰＳ（Φ＝９ｃｍ）を含む一連の１．５％寒天プレートに、ｐＢＳ４１２
を含むＢＳ１０１１のｍＭＯＰＳ－ｋａｎのｏ／ｎ培養から得られた１０^４、１０^５、１
０^６、１０^７個の細胞をそれぞれ播種することにより、選択アッセイを行った。次いで、
プレートを３７℃で最大３６時間インキュベートし、間隔を置いて細胞増殖を評価した。
これらの条件下で、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いたｐＢＳ４１２からのＢｉｏＢ発現の誘
導は、１０^５個までの細胞の増殖を防止することが判明したが、１ｍＭのＩＰＴＧを用い
た誘導は、単一のペトリ皿に播種した場合、少なくとも１０Λ７個の細胞の増殖を防止し
た。１０^５個の細胞の細胞集団に対する１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を含む選択圧は、Ｂ
ｉｏＢ発現に対してより高いロバスト性を持つ株を特定するのに最適であることが判明し
た。従って、次のように実施された：

【0110】

１）セクション１．４に記載されているように、各ライブラリの約１０^５個の細胞を各
ｍＭＯＰＳ－ｋａｎ－１ｍＭのＩＰＴＧ寒天プレートに播種し、３７℃で最大２４時間イ
ンキュベートした。
２）単一コロニーをｍＭＯＰＳ－ｋａｎ液体培地で増殖させて前培養物を作成し、その
後、０．００、０．０１、又は０．１ｍＭのＩＰＴＧのいずれかを添加したｍＭＯＰＳ－
ｋａｎで実施したビオチンバイオアッセイ（以下のセクション１．６を参照）により、こ
れらのビオチン生産を評価した。各前培養物の細胞を、２０％グリセロール中でグリセロ
ールストックとして保存した。
３）ビオチン１．５ｍｇ／ｌ以上（細胞外ビオチンとして検出）を生産するコロニーを
ｍＭＯＰＳ－ｋａｎ寒天プレートに再度ストリークし、３７℃で最大２４時間インキュベ
ートし、生物学的複製でのビオチン生産について再度バイオアッセイを行った（以下のセ
クション１．６で詳述）。

【0111】

４）選択したビオチン過剰生産株の細胞を以下のように評価した：
ａ）選択された株の細胞のゲノムにおける親株ＢＳ１０１１のゲノムと比較した遺伝子
変異を特定するための全ゲノムシーケンシングを、選択された株の細胞から単離されたＤ
ＮＡで次のように行った：選択された細胞を５－１０ｍＬのｍＭＯＰＳ－ｋａｎ内で増殖
させ、次いで細胞を回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅｌｉｎｋゲノムＤＮＡ抽
出キット（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／
ｃａｔａｌｏｑ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｋ１８２００１）を使用して、回収した細胞からゲノ
ムＤＮＡを単離した。抽出されたＤＮＡの全ゲノムシーケンシングを行った。
ｂ）選択された株の細胞からこれらのｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングした。次
に、ｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングした株の細胞を再度形質転換した。最後に、
形質転換された株の細胞培養物のビオチン生産についてのバイオアッセイを再度行った。
細胞からこれらのｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングする工程は、１ｍＭのＩＰＴＧ
を含み抗生物質を含まないＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）富栄養培地中で細胞を３７℃
で一晩増殖させ、得られた培養物の細胞をＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で
一晩インキュベートすることにより行った。寒天プレートからの単一コロニーを５０μｌ
のＬＢ培地で希釈し、５μｌを使用してＬＢ及びＬＢ－ａｍｐ寒天プレート上にスポット
し、３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢ－ａｍｐプレート上では増殖しなかったがＬ
Ｂプレート上では増殖したこれらの単一コロニーをＬＢプレート上に再度ストリークして
単一コロニーを得、これらを再形質転換用のキュアリングされた株として使用した。

【0112】

形質転換株の細胞によるビオチン生産を生物学的複製で測定した（以下のセクション１
．６で詳述）。簡単に説明すると、０．００、０．０１又は０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加
したｍＭＯＰＳ－ｋａｎ中の生物学的複製について、ビオチン生産を再評価した。並行し
て、各形質転換株の細胞の増殖速度を、透明な通気性シールを使用して密封したマイクロ
タイタープレートに入れた２００μＬのｍＭＯＰＳ－ｋａｎ培地で、３７℃で２４時間、
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣで好気的増殖のための「高速振盪」を行って測定した。３０分
ごとにＯＤ６２０を測定することにより、細胞増殖を監視した。

【0113】

１．６ ビオチン生産を定量化するためのバイオアッセイ
前培養物を、選択された単一細胞コロニーから９６ディープウェルプレートに入れた４
００μＬのｍＭＯＰＳ－ｋａｎでそれぞれ作成し、２７５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で
１６～１８時間インキュベートした。０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）と、任
意に最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧとを含む、９６ディープウェルプレートに入れた４０
０μＬのｍＭＯＰＳ－ｋａｎに、初期ＯＤ_６００を約０．０３とするのに十分な前培養物
４μＬを接種することにより、生産培養物を作成した。次いで、培養物を２７５ｒｐｍで
振盪しながら３７℃で２４時間増殖させた。培養物のＯＤ_６００を測定した後、４０００
Ｇで８分間遠心分離することにより、９６ディープウェルプレートの細胞をペレット化し
た。各培養上清からの上清を、超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）でビオチン濃度範囲が０．０５
ｎＭ～０．５０ｎＭとなるように希釈した。並行して、０．１ｎＭ（ビオチン０．０２４
μｇ／Ｌ）～１ｎＭ（ビオチン０．２４μｇ／Ｌ）の濃度範囲の５種類超のビオチン標準
液をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した。次に、各希釈上清１５μＬと各ビオチン標準液とをマ
イクロタイタープレートのウェルに加えた。各ウェルは、プラスミドｐＢＳ４５１を含む
ＢＳ１０１１のビオチン欠乏一晩培養物１３５μＬを含んでいた。そして、一晩培養物を
、ゼオシンを加えたｍＭＯＰＳで初期ＯＤ_６２０が０．０１となるように希釈した。プレ
ートを通気性のあるシールで密封し、２７５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２０時間イン
キュベートした後に、ＯＤ_６００を測定した。このバイオアッセイで様々なビオチン標準
液を使用して得られたビオチンバイオアッセイ検量線を、図５に示す。

【0114】

１．７ ゲノム変異の特定
全ての次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データについて、選択された株の細胞のゲノム
における親株のゲノムと比較した変異を、ＣＬＣゲノムワークベンチバージョン９．５．
３（Ｑｉａｇｅｎ提供）を使用して、（単一又は少数の置換、欠失又は挿入はＶａｒｉａ
ｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、より大きな挿入／欠失はＩｎＤｅｌｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒａｌ Ｖａｒｉａｎｔｓにより）特定した。シーケンシング手順によって導入され
た誤ったヌクレオチドに起因するゲノム変異を区別するために、８５％のカットオフを使
用して、特定の細菌株の細胞から単離されたＤＮＡ分子（ゲノム）群の８５％以上に変異
が存在することを意味する「有意な変異」を定義した。

【0115】

シーケンシングによって配列が確認されたＫｅｉｏ ΔｂｉｏＢ ｓｃａｒ変異を考慮
して、ＮＣＢＩからのゲノムアクセッション番号ＣＰ００９２７３を参照配列として使用
した。

【0116】

１．８ ｉｓｃＲ変異のプロテオミクスの全体像の特性評価
０．０２５ｍＭのＩＰＴＧ誘導レベルでのＢＳ１０１３＋ｐＢＳ４３０、ＢＳ１０１１
＋ｐＢＳ４１２及びＢＳ１３５３＋ｐＢＳ４１２並びに１ｍＭのＩＰＴＧ誘導でのＢＳ１
３５３＋ｐＢＳ４１２のタンパク質含有量を、ＬＣ－ＭＳと効率的なタンパク質抽出とを
組み合わせた最近開発されたアプローチによって求めた（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ，
２０１５）。２．０％ＦＤＲのペプチド閾値に加えて、３つのペプチドを分析用に同定さ
れた最小数のペプチドとして選択した。タンパク質発現の著しい変化は、Ｓｃａｆｆｏｌ
ｄ Ｖｉｅｗｅｒ４．７．５を使用した複数のテストのＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂ
ｅｒｇ補正による分散分析（ＡＮＯＶＡ）に基づいて、０．５％の信頼区間で見受けられ
る。

【0117】

株を、ＯＤ_６００が０．５に達するまで（対数期）、ｍＭＯＰＳ中でＩＰＴＧ誘導によ
り約１０世代にわたって増殖させた。４℃で、最大速度で遠心分離することにより、１０
^８個の細胞を回収した。氷冷ＰＢＳバッファで１回洗浄した。ＰＢＳバッファを除去した
後、４℃で、最大速度で遠心分離して再ペレット化し、液体窒素で急速凍結した。

【0118】

２．結果
２．１ ＢｉｏＢの過剰発現は毒性である
ネイティブなビオチンシンターゼ遺伝子（ｂｉｏＢ）を保持しているが、低コピープラ
スミド（複製開始点Ｓｃ１０１）に由来するＩＰＴＧ誘導性のフレームシフトされた大腸
菌ｂｉｏＢ遺伝子（未熟な停止コドンによる非機能性ビオチンシンターゼをコードする）
を発現する大腸菌は、ＩＰＴＧを含むか又は含まないｍＭＯＰＳ－ｋａｎ培地中で好気的
に増殖可能である。このことは、大腸菌ＢＷ２５１１３、ＢｉｏＢフレームシフト変異体
の対数増殖曲線を示す図４（左パネル）に示されている。対照的に、大腸菌ノックアウト
株ΔｂｉｏＢでの機能性ビオチンシンターゼ遺伝子（ｂｉｏＢ）の過剰発現は、増殖に対
して毒性であり、非常に顕著な誘導期の延長を引き起こす。このことは、低コピープラス
ミド（複製開始点Ｓｃ１０１）上のＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモータに由来する大腸菌ｂｉ
ｏＢ遺伝子を発現する大腸菌ノックアウト株ΔｂｉｏＢの増殖を示す図４（右パネル）に
示されている。図４に示すように、ＩＰＴＧレベルの増加（灰色の暗さ）に応じたｂｉｏ
Ｂ発現の増加の誘導は、誘導期には大きく影響するが、増殖速度への影響はわずかである
（黒枠）。

【0119】

２．２ ビオチン生産力価が増強されたｉｓｃＲ変異株の単離
進化したゲノム多様性を持つ大腸菌ライブラリ（セクション１．４及び１．５を参照）
を、ｂｉｏＢ遺伝子発現に対する耐性が改善され、ビオチン生産が増加した株についてス
クリーニングした。選択された株の全ゲノムシーケンシングにより、Ｌ１５Ｆ、Ｃ９２Ｙ
、Ｈ１０７Ｙのいずれかのアミノ酸置換を持つｉｓｃＲポリペプチドをコードする鉄硫黄
クラスタレギュレータ（ｉｓｃＲ）遺伝子を含む３つのユニークな変異体が同定された。
コードされたレギュレータのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１８及び２０であ
る。セクション１．６（及び図５）で説明するように、バイオアッセイを使用してビオチ
ン生産レベルを測定した。図６に、ｉｓｃＲ変異株及び大腸菌ＢＷ２５１１３ Δｂｉｏ
Ｂ参照株のそれぞれのビオチン生産力価を、２つの異なるＩＰＴＧ濃度レベル（より濃い
灰色でＩＰＴＧがより多い）の不在又は存在下で、ＤＴＢ０．１ｇ／ｌを加えたｍＭＯＰ
Ｓ中で増殖させた４つの生物学的複製（黒い点）について示す。参照株でのビオチン生産
は、０．０１ｍＭを超えるＩＰＴＧレベルで阻害された。これは、参照株の増殖に対して
毒性を有するＩＰＴＧレベルに対応する（図４を参照）。これに対し、ｉｓｃＲ変異株は
、ＩＰＴＧレベル０．０１～０．１ｍＭで増殖し、ビオチンを生産した。３つのｉｓｃＲ
変異株は全て、ＩＰＴＧ濃度０．０１ｍＭで、参照株（点線）よりも約１．５倍多くのビ
オチンを生産した。ｉｓｃＲ変異株の生産は、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで、参照株の最高
生産力価（ビオチン約１．５ｍｇ／ｌ）よりも最大２倍（ビオチン約３．２ｍｇ／ｌ）で
あった。

【0120】

２．３ ＩｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ変異株のビオチン生産及び増殖
ｉｓｃＲ（Ｈ１０７Ｙ）変異株の増殖プロファイル及びビオチン生産力価の特徴を、５
０ｍＬのｍＭＯＰＳにＤＴＢ０．１ｇ／ｌを加えた、２つの異なるＩＰＴＧ誘導レベル（
図７Ａで０．０１ｍＭ）及び０．５ｍＭ（図７Ｂ）での２５０ｍＬ振盪フラスコ実験で明
らかにした。ＩＰＴＧレベルが低い場合（図７Ａ）、ＩｓｃＲ変異株（濃い灰色）と参照
株（薄い灰色）とは増殖及びビオチン生産力価が類似しており、最終力価はビオチン約１
．１ｍｇ／ｌであった。しかし、高ＩＰＴＧ誘導レベル（図７Ｂで０．５ｍＭ）では、参
照株（明るい灰色）の増殖は大幅に抑制されたのに対し、ＩｓｃＲ変異株は低ＩＰＴＧ誘
導レベルと同じ増殖プロファイルを保持した。更に、ＩｓｃＲ変異株のビオチン生産力価
は約２倍に増加し、２５時間の増殖後、最大で約２．２ｍｇ／ｌとなった。

【0121】

２．４ ＩｓｃＲ変異の作用機序
図６に示すように、同定された３つのＩｓｃＲ変異株全てについて、ビオチン耐性を増
強する表現型が明らかに示された。Ｃ９２変異（Ｃ９２Ｙ）がビオチン耐性を増強する能
力は、ＩｓｃＲの［Ｆｅ－Ｓ］クラスタ結合特性におけるＣ９２の役割によるものである
ことが示唆されている。Ｃ９２Ｙ変異による［Ｆｅ－Ｓ］クラスタ結合特性の喪失は、Ｉ
ｓｃＲのＩｓｃオペロン抑制挙動を不活性化することが提示されている。同時に、Ｃ９２
Ｙ変異ＩｓｃＲではＩｓｃＲのプロモータ機能は無傷のままであり、複数の細胞プロセス
に不可欠な他の経路を活性化する機能を保持することが提示されている。Ｈ１０７も、Ｉ
ｓｃＲの［Ｆｅ－Ｓ］クラスタ結合特性を付与する同様の重要な役割を果たす。Ｈ１０７
Ｙ変異も同様に、大腸菌のビオチン耐性を高めることが可能である。ＩｓｃＲのＬ１５Ｆ
も、鉄硫黄クラスタ結合を破壊することにより、鉄硫黄クラスタの枯渇を部分的に克服す
ることが提示されている。図９は、ＤＮＡに結合したときのＩｓｃＲのＬ１５及びＨ１０
７の位置（ｈｙａの結合部位、ＰＤＢエントリ４ＨＦ１）を示しており、Ｌ１５は各Ｉｓ
ｃＲサブユニットの内側に位置していることが分かる。フェニルアラニンは、ロイシンよ
りも著しく大きいアミノ酸であり、タンパク質の三次元の折りたたみを妨げる可能性があ
る。

【0122】

２．５ 大腸菌株のみでのｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現は、ビオチン生
産の増強に十分ではない
大腸菌でのビオチン生産にｉｓｃオペロン（ｉｓｃＳＵＡ－ｈｓｃＢＡ－ｆｄｘ、ｉｓ
ｃＲ遺伝子を欠いたネイティブな大腸菌オペロン構造に対応）又はｓｕｆオペロン（ネイ
ティブな大腸菌オペロン構造に対応するｓｕｆＡＢＣＤＳＥ）の過剰発現が及ぼす直接的
な影響を判断するため、各オペロンを、強力なＲＢＳ及びＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモータ
の制御下に置かれた中程度のコピー数のプラスミド（ｐ１５Ａ ｏｒｉ）にクローニング
した。ｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの代わりにスーパーフォルダー緑色蛍光タンパ
ク質（ｓｆＧＦＰ）をコードする遺伝子を含むプラスミドを対照として使用した。ＩＰＴ
Ｇ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドを含む大腸菌株の細胞に、それぞれのプラスミドを形質
転換した：ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドに加えて、１）ＩＰＴＧ誘導性ｉｓｃ
オペロン、２）ＩＰＴＧ誘導性ｓｕｆオペロン、又は３）ＩＰＴＧ－誘導性ＧＦＰ（対照
）のいずれかを含む生物学的トリプリケートコロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ
及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で低（０．０１
ｍＭのＩＰＴＧ）誘導及び高（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）誘導で培養した後、（セクション
１．５に記載のように）ビオチン生産についてアッセイした。

【0123】

グラフ（図１０）から、全ての株でビオチンの生産がＩＰＴＧ誘導性であるが、検出可
能なビオチン生産レベルに到達するのに必要なＩＰＴＧ濃度は、図６に示す参照及び変異
ｉｓｃＲ株と比較すると、０．０１ｍＭのＩＰＴＧから０．１ｍＭのＩＰＴＧに増加して
いることが分かる。更に、図１０の両方のｓｆＧＦＰ株と比較した場合、ビオチン生産力
価は、ｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現によって有意に減少した。更に、ｉ
ｓｃオペロンの過剰発現は、ｓｕｆオペロンの過剰発現よりも更にビオチン生産を抑制し
た。ｉｓｃＲに単一点変異を有する変異株で観察されるビオチン生産の増加（図６）と考
え合わせると、これらの株におけるｉｓｃオペロンの抑制解除が、これらの株におけるビ
オチン生産の改善の唯一の／主な理由である可能性は低い。

【0124】

２．６ ＢｉｏＢタンパク質含有量はビオチン生産と相関する
野生型バックグラウンド株及び変異バックグラウンド株におけるＢｉｏＢの過剰発現の
分子効果を調べるために、野生型バックグラウンド株：ｐＢＳ４３０を保持するＢＳ１０
１３；ｂｉｏＢ生産プラスミド有する野生型ｉｓｃＲ株：ｐＢＳ４１２を保持するＢＳ１
０１１；及び、ｂｉｏＢ生産プラスミドを有する変異ｉｓｃＲ株：ｐＢＳ４１２を保持す
るＢＳ１３５３のプロテオミクス測定を実施した。全ての株を、０．１ｇ／ＬのＤＴＢ及
び０．０２５ｍＭのＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳ中で増殖させた。後者の株は、１ｍＭのＩ
ＰＴＧ誘導で更に増殖させた。プロテオミクス分析のために対数期に細胞を採取し、残り
の細胞培養物を合計２４時間インキュベートした後、他の文献に記載のバイオアッセイを
使用してビオチン生産を測定した。

【0125】

グラフ（図１１）から、測定されたＢｉｏＢタンパク質レベルはビオチン生産と強く相
関している（Ｒ２値０．９６）。この線形的な相関は、ＢｉｏＢ発現の促進がＩｓｃＲ変
異細胞工場におけるビオチン生産の改善の鍵であることを示している。プロテオミクスデ
ータのＡＮＯＶＡ分析により、更なる２９種類のタンパク質での発現の有意な増加（９５
％信頼区間、ｐ値０．００１６６）が明らかとなった。これらの中には、ｉｓｃオペロン
（ＩｓｃＡ及びＩｓｃＳ）並びにｓｕｆオペロン（ＳｕｆＢ及びＳｕｆＳ）のメンバーが
含まれる。

【0126】

２．７ ｉｓｃＲノックアウト変異体ではビオチン生産は増強されない
ＭＡＧＥを使用して、ｉｓｃＲの位置２２のグルタミン酸をコードするコドン（Ｅ、Ｇ
ＡＡ）を停止コドン（＊、ＴＧＡ）へと変換することにより、ｉｓｃＲ遺伝子の翻訳ノッ
クアウトをＢＷ２５１１３ ΔｂｉｏＢ株に導入した。コドンの変換の成否を、この領域
のＰＣＲ増幅と、これに続くサンガーシーケンシングによって検証した。野生型ｉｓｃＲ
、ｉｓｃＲノックアウト（Ｅ２２＊）及び変異型ｉｓｃＲ（Ｃ９２Ｙ）をコードする遺伝
子を含む株を、ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢプラスミドｐＢＳ４１２で形質転換し、ＤＴＢ０
．１ｇ／ｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｌを加えたｍＭＯＰＳ中で、上記の３つの異なる
ＩＰＴＧ誘導レベル（０ｍＭ、０．０１ｍＭ及び０．１ｍＭ）で増殖させた生物学的複製
（ｎ＝３）のビオチン生産をテストした。

【0127】

ＩＰＴＧ誘導によりｂｉｏＢ発現を誘導した場合、ｉｓｃＲノックアウト（ｉｓｃＲ
ＫＯ）株と野生型ｉｓｃＲ（ｉｓｃＲ ＷＴ）株との間にビオチン生産の有意差は認めら
れなかった。これは、ｉｓｃＲをノックアウトしてもビオチン生産が改善されないことを
立証している。ＩｓｃＲ Ｃ９２Ｙ置換をコードする変異ｉｓｃＲについて、ｉｓｃＲ
ＷＴ株及びｉｓｃＲ ＫＯ株の両方と比較したビオチン生産の有意な改善が再び観察され
た。

【0128】

２．８ デノボビオチン生産は、本発明のｉｓｃＲ変異株で増強される
ｂｉｏＡ遺伝子及びビオチンオペロン全体（ΔｂｉｏＢ－ｂｉｏＤ）の両方が欠失され
、ｉｓｃＲ ＷＴ遺伝子、ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ変異遺伝子又はｉｓｃＲ Ｃ９２Ｙ変異
遺伝子のいずれかを含むＢＷ２５１１３大腸菌株を、ネイティブ大腸菌ｂｉｏＡ及びビオ
チンオペロンを構成的に過剰発現するテトラサイクリン耐性プラスミドで形質転換した。
ｂｉｏＯオペレータ部位に単一点変異が存在した（タイプ９変異、Ｉｆｕｋｕら１９９３
）。これら３つの異なる株について、上記のようにテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含
み、ＤＴＢ０．１ｇ／ｌを添加した場合及び添加しない場合のｍＭＯＰＳ（グルコース２
ｇ／ｌ）での生物学的複製（ｎ＝４）のビオチン生産を評価した（図１３）。

【0129】

基質ＤＴＢを増殖培地に添加すると、３つの株全てでビオチン力価の有意な増加が観察
され、ＤＴＢをビオチンに変換するｂｉｏＢ酵素反応自体が、これらの株でのビオチン生
産のボトルネックではなくなったことを示している（図１３）。更に、ｉｓｃＲ ＷＴ株
と比較して、両方のｉｓｃＲ変異株でグルコースからのビオチンのデノボ生産の有意な増
加が観察された。これらの結果を考慮すると、本発明の変異ｉｓｃＲ株は全て、直接前駆
体であるＤＴＢから及びグルコースからの双方のビオチン生産の増強を介助すると推論す
ることができる。

【0130】

実施例２：リポ酸生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の操作及び特性
評価
この例で使用した大腸菌の株を以下に示す。

【0131】

表３：株

【表3】

【0132】

この例で使用したプラスミドを以下に示す。

【0133】

表４：プラスミド

【表4】

【0134】

プラスミドｐＢＳ１０３７上にクローニングされたＬｉｐＡ［配列番号１０３］をコー
ドするＩＰＴＧ誘導性導入遺伝子を、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌宿主株又は
、例１に記載されるように、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子がＣ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を
有するＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子により置換された大腸菌宿主
株に導入した；これら２つの株は更に、ｂｉｏＢ又はｌｉｐＡのノックアウトを含んだ。
これらの株を、ビオチン０．１ｍＭ（ΔｂｉｏＢ株の場合）、ｌｉｐＡ発現の誘導のため
のＩＰＴＧ及び基質としてのオクタン酸０．６ｇ／ｌを加えたｍＭＯＰＳ培地（セクショ
ン１．３に記載）中で、３７℃で２４時間培養した後、上清中の遊離リポ酸を測定した。
ΔｌｉｐＡ株（ＢＳ１９１２及びＢＳ２１１４、表３）については、３７℃での２４時間
の増殖の間、増殖を追跡した。

【0135】

記載された株の培養細胞によって生産されたリポ酸を、ｐＢＳ４５１を含むＢＳ１９１
２を使用するセクション１．６に記載されたものと同様のバイオアッセイによって上清か
ら測定した。リポ酸の定量のための増殖ベースのバイオアッセイを、リポ酸を合成できな
い栄養要求性大腸菌単一ΔｌｉｐＡ変異株（Ｈｅｒｂｅｒｔ ａｎｄ Ｇｕｅｓｔ，１９
７５）（ｐＢＳ４５１を含むＢＳ１９１２）を使用して実施した。上清中の遊離リポ酸濃
度を、リポ酸の唯一の供給源として生産株から回収されたリポ酸を加え、炭素源として５
０ｎＮのコハク酸を含む最小培地でのリポ酸栄養要求性株の増殖を測定することによって
求めた。リポ酸バイオアッセイの検量線を並行して実行し、既知の濃度範囲のリポ酸標準
液を加えた最小培地で栄養要求性株を増殖させた。

【0136】

テストは、ＩｓｃＲタンパク質の変異型（Ｃ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃ
Ｒタンパク質）をコードする遺伝子を含む大腸菌株でのｌｉｐＡ遺伝子の過剰発現が、Ｉ
ｓｃＲタンパク質の天然形態をコードする遺伝子を含む親大腸菌株におけるｌｉｐＡ遺伝
子の過剰発現と比較して、リポ酸力価のより安定した生産と８０％の増加との両方をもた
らすことを示している（図１４）。従って、ｉｓｃＲ ＷＴ株（ｐＢＳ９９３を含むＢＳ
１０１１）の生産力価の標準偏差は２．７３であるが、ｉｓｃＲ Ｃ９２Ｙ（ｐＢＳ９９
３を含むＢＳ１３７５）では１．４２、ｉｓｃＲ Ｈ１０７Ｙ（ｐＢＳ９９３を含むＢＳ
１３５３）では０．１１である（株については表１を参照）。個々の株の平均生産力価に
基づき、変異株でのリポ酸生産は、ＷＴ株と比較して１．７９倍に改善されている（図１
４を参照）。

【0137】

ＬｉｐＡの過剰発現は、ＷＴ ｉｓｃＲ株（三角形、ｐＢＳ１０３７を含むＢＳ１９１
２）及びｉｓｃＲ変異株（四角形、ｐＢＳ１０３７を含むＢＳ２１１４）の両方で、ＩＰ
ＴＧによるＬｉｐＡの誘導の増加に応答して増殖速度を低下させる明確な傾向を示した（
濃い灰色、図１５）。しかし、ＷＴ ｉｓｃＲ株の増殖速度は、０．０１ｍＭ～０．０３
ｍＭでテストした全てのＩＰＴＧ誘導レベルで、変異ｉｓｃＲ株と比較してより大幅に低
下した（図１５を参照）。

【0138】

実施例３：チアミン生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の操作及び特
性評価
この例で使用した大腸菌の株を以下に示す。

【0139】

表５：株

【表5】

【0140】

この例で使用したプラスミドを以下に示す。

【0141】

表６：プラスミド

【表6】

【0142】

プラスミドｐＢＳ１４０上にクローニングされたチアミン経路遺伝子ｔｈｉＣＥＦＳＧ
ＨＭＤを、（参照株として）ネイティブｉｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌宿主株（ＢＳ７５０
）と、例１に記載されているように、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子が、それぞれＣ９２Ｙ又
はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子によって
置換されているこの参照株の誘導体（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０２０）とに導入した。こ
れらの株を、培養用のディーププレートの各ウェルで、３７℃で２４時間、ｍＭＯＰＳ培
地（セクション１．３に記載）で培養した。

【0143】

上述の株の培養細胞によって生産された細胞外及び細胞内のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰ
Ｐを、次のように回収及び抽出した：各培養液０．４ｍＬを、培養プレートに入れ、４０
００×ｇで５分間遠心分離することにより、４℃で回収した。残りの全てのステップを氷
上で実行した。細胞外ＴＰＰ、ＴＭＰ及びチアミンの分析のために、上清４０μＬを静か
に除去した。残りの上清をデカントした後、培養プレートを裏返して残留培地を除去し、
その後ボルテックスした。１００μＬの氷冷ＨＰＬＣグレードのメタノールを培養プレー
トの各ウェルに加えた。そして、細胞を再びボルテックスした。氷上で最低２０分間イン
キュベートした後、４０００×ｇで５分間の遠心分離により細胞片をペレット化した。上
清を更なる分析のための細胞内抽出物として使用した。

【0144】

蛍光検出器を使用してＴＰＰ、ＴＭＰ及びチアミンを検出するために、各培養で生成さ
れたチアミン化合物を、強い蛍光を発するチオクロムに誘導体化した。全てのステップを
室温で実行した．体積４０μｌの細胞外及び細胞内抽出物を８０μｌの４Ｍ酢酸カリウム
に加え、ピペッティングにより混合した。新たに調製したフェリシアン化カリウムを３．
８ｍＭ含有する７ＭのＮａＯＨを４０μｌ添加し、混合した。新たに調製したＨ２Ｏ２を
０．０６％含有する飽和ＫＨ_２ＰＯ_４を４０μｌ添加することにより、反応をクエンチさ
せた。６ＭのＨＣｌを４７μＬ添加することにより抽出物を中和し、次いでＨＰＬＣ又は
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎを使用した直接蛍光測定により分析した。誘導体化された全ての化合
物を、分析された抽出物と並行してチオクロムに誘導体化された、新たに調製されたＴＰ
Ｐ、ＴＭＰ及びチアミン標準液の蛍光標準曲線を使用して定量化した。

【0145】

この試験は、変異形態のＩｓｃＲタンパク質（Ｃ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩ
ｓｃＲタンパク質）をコードする遺伝子を含む宿主大腸菌株（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０
２０）におけるｔｈｉＣ遺伝子及びｔｈｉＨ遺伝子とＴＭＰホスファターゼ遺伝子（Ａｔ
５ｇ３２４７０）との組み合わせを含むチアミン経路遺伝子の過剰発現は、ネイティブな
形態のＩｓｃＲタンパク質をコードする遺伝子を含む宿主大腸菌株（ＢＳ７５０）での過
剰発現と比較して、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ、特にチアミンの生合成を増強すること
を示している。

【0146】

より具体的には、ｐＢＳ１４０を使用した場合には、ＷＴ ｉｓｃＲを持つ株（ＢＳ７
５０）とｉｓｃＲ変異をコードする株（ＢＳ２０２０、Ｈ１０７Ｙ又はＢＳ２０１９、Ｃ
９２Ｙ）との間で、チアミン類（チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ）のＯＤ正規化細胞外生産
が１．４３倍増加することがテストで示された（図１６）。

【0147】

実施例４ ビオチンを生産可能な遺伝子改変された大腸菌株の生産性を高めるためのフラ
ボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ）及びフラボドキシン（ＦｌｄＡ）還
元系の過剰発現
１ 方法
１．１：例で使用した大腸菌の株を以下に示す。

【0148】

表７：株

【表7】

【0149】

この例で使用したプラスミドを以下に示す。

【0150】

表８：プラスミド

【表8】

【0151】

ＢｉｏＢをコードするＩＰＴＧ誘導性導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ６７９上にクロ
ーニングした。ＧＦＰをコードする構成的に調節された導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ
１０５４上にクローニングした。そして、ＦｌｄＡ－Ｆｐｒをコードする合成オペロンを
含む構成的に調節された導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ１１１２上にクローニングした
。ｐＢＳ６７９を、例１に記載のように、Ｈ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質を
コードする変異ｉｓｃＲ遺伝子によってネイティブｉｓｃＲ遺伝子が置換されており、更
にｂｉｏＡＦＣＤ遺伝子のノックアウトを含む大腸菌宿主株（ＢＳ１６１５）に導入して
、ＢＳ１９３７株を得た。次に、ＢＳ１９３７株をプラスミドｐＢＳ１０５４又はｐＢＳ
１１１２のいずれかで更に形質転換し、それぞれＢＳ２７０７株（対照株）及びＢＳ２１
８５株を得た。

【0152】

株を、適切な抗生物質及びＢｉｏＢ媒介触媒の基質としてのＤＴＢ０．１ｇ／Ｌを含み
、 ＢｉｏＢ遺伝子の発現を誘導するためのＩＰＴＧ０、０．０１、０．０２５、０．０
５、０．０７５又は０．１ｍＭを加えたｍＭＯＰＳ培地（例１．３に記載）で培養した。
細胞をディープウェル培養プレートの各ウェルで、３７℃で２４時間インキュベートした
。最終ＯＤを推定し、遠心分離によって上清を回収し、例１．６に記載のビオチンバイオ
アッセイによって上清からビオチンを定量した。

【0153】

株ＢＳ１９３７について、図１２及び図１７に示すように、遺伝子改変された内在性ｉ
ｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌細胞でのＢｉｏＢ遺伝子発現がＩＰＴＧの濃度の増加によって
誘導されると、細胞はこれに対応したビオチン生産の漸進的な増加を示す。これらの遺伝
子改変された細胞でのビオチン生産は、親株ＢＳ１９３７及び、ＦｌｄＡ－Ｆｐｒの代わ
りにＧＦＰをコードする導入遺伝子を発現する対照株と比較した場合に、ＦｌｄＡ－Ｆｐ
ｒをコードする導入遺伝子（ＢＳ２１８５株）の同時発現により、更に増強される。

【0154】

ＩｓｃＲタンパク質の変異型（Ｈ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質）をコード
する遺伝子と、ＢｉｏＢ遺伝子（ｐＢＳ６７９）及びＦｌｄＡ－Ｆｐｒ遺伝子（ｐＢＳ１
１１２）の過剰発現のためのプラスミドとを含むＢＳ２１８５株のビオチン生産は、対照
株ＢＳ１９３７（ＦｌｄＡ－Ｆｐｒ遺伝子の過剰発現なし）と比較して２．１２倍に増強
された（図１８）。

【0155】

参照文献：
Datsenko KA, Wanner BL. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in E
scherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. ;97(12): 6640
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Giel, J. L., Rodionov, D., Liu, M., Blattner, F. R. & Kiley, P. J. (2006) IscR
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Herbert AA, Guest JR. (1975) Lipoic acid content of Escherichia coli and other
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ition-dependent Escherichia coli proteome. Nature Biotechnology 2015; doi: 10.10
38

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2023093532000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-04-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

遺伝子改変された細菌であって、該細菌が、ビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産が増強され、
ａ．変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、
ｉ．Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子と、
ｂ．少なくとも１つの導入遺伝子であって、
ｉｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの導入遺伝子と、
を備える、遺伝子改変された細菌。

【請求項2】

前記変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ及びＷのいずれかであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれかであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、請求項１に記載のビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌。

【請求項3】

前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．ＳＡＭ（Ｓ－アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド、
ｂ．７－ケト－８－アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド、
ｃ．７，８－ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ：２．６．１．６２又はＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド、
ｄ．デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＥＣ６．３．３．３）を有するポリペプチド、
ｅ．ピメロイル－［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．８５）を有するポリペプチド、及び
ｆ．６－カルボキシヘキサノエート－ＣｏＡリガーゼ活性（ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、ビオチンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項4】

前記少なくとも１つの導入遺伝子がリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペプチドと、
ｂ．ピルビン酸デヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分（ＥＣ２．３．１．１２）を含むポリペプチドと、
ｃ．リポエートタンパク質リガーゼＡ活性（ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、リポ酸の生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項5】

前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子をコードし、更に、
ａ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｂ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｃ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｄ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチドと、
ｅ．グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｆ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｇ．ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．３．－）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、チアミンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項6】

前記細菌が、
ａ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプチドと、
ｂ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するＴｈｉＨポリペプチド又はグリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｃ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｄ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｅ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｆ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチド、
ｇ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．－）活性を有するポリペプチドと、
をコードする更なる導入遺伝子を含む、請求項５に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項7】

前記少なくとも１つの導入遺伝子及び前記１以上の更なる導入遺伝子が構成的プロモータに作用可能に連結されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項8】

前記細菌が、エシェリキア属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、セラチア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属及びアシネトバクター属、シュードモナス属、及びアセトバクター属からなる群から選択される細菌の一種である、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項9】

ａ．請求項１～３、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたビオチンを回収し、該回収されたビオチンを任意に精製する工程と、
を含む、ビオチンの製造方法。

【請求項10】

ａ．請求項１、２、４、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたリポ酸を回収し、該回収されたリポ酸を任意に精製する工程と、
を含む、リポ酸の製造方法。

【請求項11】

ａ．請求項１、２、５～８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたチアミンを回収し、該回収されたチアミンを任意に精製する工程と、
を含む、チアミンの製造方法。

【請求項12】

前記増殖培地が、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトース又はそれらの任意の組み合わせから選択される炭素源を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの製造方法。

【請求項13】

遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該細菌が、
ｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．ＨＭＰ－Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を備えて発現し、
前記遺伝子改変された細菌は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ遺伝子であり、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、使用。

【請求項14】

請求項１３に記載の遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、使用。

【請求項15】

ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌の使用。

【請求項16】

前記細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項１～８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。

【請求項17】

ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１６に記載の遺伝子改変された細菌の使用。

【請求項18】

前記遺伝子改変された細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン－ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項９～１２のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸、及びチアミンのいずれか１つの製造方法。

【外国語明細書】