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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023093581
(43)【公開日】2023-07-04
(54)【発明の名称】血管障害を治療するための調節性マクロファージ
(51)【国際特許分類】
A61K 35/15 20150101AFI20230627BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230627BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20230627BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230627BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230627BHJP
【ＦＩ】
A61K35/15
A61P9/10
A61P9/14
A61P17/02
A61P37/02
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023064853
(22)【出願日】2023-04-12
(62)【分割の表示】P 2020515645の分割
【原出願日】2018-09-12
(31)【優先権主張番号】17190982.3
(32)【優先日】2017-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】518322746
【氏名又は名称】トリゼル ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】フェンドリヒ フレッド
(57)【要約】 （修正有）
【課題】糖尿病性足潰瘍または静脈性下腿潰瘍等の下肢の微小血管障害または大血管障害を治療する方法、並びに、創傷治癒を誘導する方法を提供する。
【解決手段】マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージを投与する方法である。前記方法が、患者へ１×１０5～１×１０7のマクロファージを、皮下注射または筋肉内注射によって、潰瘍へ直接投与することが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージを投与する方法である。前記方法が、患者へ１×１０5～１×１０7のマクロファージを、皮下注射または筋肉内注射によって、潰瘍へ直接投与することが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において下肢の微小血管障害または大血管障害を治療する方法で使用するための、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージ。
【請求項2】
対象において創傷治癒を誘導する方法で使用するための、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージ。
【請求項3】
前記マクロファージが、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯおよびＴＧＦβ１を発現する、請求項１または２に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項4】
前記マクロファージが、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１およびＰＡＥＰを発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項5】
前記マクロファージが、ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１およびＰＡＥＰを発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項6】
前記マクロファージが更に、マクロファージ系列マーカーＣＤ３３、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂおよびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択されるマーカーのうち、少なくとも１つを更に発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項7】
前記微小血管障害または前記大血管障害が、糖尿病性微小血管障害または大血管障害である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項8】
前記微小血管障害または前記大血管障害が、糖尿病性足潰瘍または静脈性下腿潰瘍である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項9】
前記方法が、患者へ１×１０5～１×１０7のマクロファージを投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項10】
前記方法が、皮下注射または筋肉内注射によって、該潰瘍へ直接マクロファージを投与することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項11】
前記が、血管炎、動脈炎、血管形成異常、白色萎縮、強皮症、ディターマン症候群、糖尿病性血管障害、閉塞性血管内膜炎、紅痛症、線維筋性形成異常症、足穿孔症、メンケベルグ中膜石灰化硬化症、オスラー病、コンパートメント症候群、Paget-von-Schroetter症候群、レイノー病および足潰瘍からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項12】
前記大血管障害が、動脈瘤、解離、アテローム性動脈硬化症、アテローム性血栓症、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＤ）、間欠性跛行、壊死および壊疽、血管奇形、ルリッシュ症候群または圧迫症候群からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項13】
前記対象が糖尿病に罹患している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法で使用するための免疫調節性マクロファージ。
【請求項14】
マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージを含む、対象において下肢の微小血管障害または大血管障害を治療する方法で使用するための医薬組成物。
【請求項15】
マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージを含む、対象において創傷治癒を誘導するための方法で使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血管の病理学的変化に関連する疾患を治療するための免疫調節性マクロファージの使用に関する。本発明は詳細には、下肢の微小血管障害および大血管障害を治療するための免疫調節性マクロファージの使用に関する。本発明は更には、組織再構築を促進し、創傷治癒を促すための免疫調節性マクロファージの使用に関する。免疫調節性マクロファージを含む、列挙した治療にて使用するための医薬組成物もまた開示されている。
【背景技術】
【0002】
下肢の血管性潰瘍は、患者およびヘルスケアシステムに関する深刻な問題を引き起こす。足潰瘍は急性または慢性であり得る。急性足潰瘍は、場合によっては治癒の正常期に引き続いて起こると定義される。こうした潰瘍は４週間未満で治癒の兆候を示すと予想されており、外傷性および術後の創傷を含む。慢性足潰瘍は４週間超持続するものであり、多くの場合、複雑で十分理解されていない原因のものである。慢性足潰瘍は通常、糖尿病を患っている患者に生じる。
【0003】
静脈内レーザー焼灼、高周波焼灼およびフォーム硬化療法を含み、表在する伏在静脈幹の不全を管理する最小限の侵襲性方法が、足潰瘍を抱える患者を治療するために使用されている。加えて、足潰瘍患者向けには、穿通枝結紮は通常、表在静脈手術と組み合わされる。しかしこの方法の効果は今のところ不十分である。少数の薬物が足潰瘍治癒を促進する際に有益であることが示されている。しかしながら足潰瘍の治癒は未だ複雑なものであり、再発が頻繁に観察されている。
【0004】
足潰瘍治療分野で築かれた進歩にも関わらず、急性または慢性足潰瘍（特に慢性足潰瘍）を治療するための更なる化合物および方法を提供する、継続的な必要性が存在し続けている。驚くべきことに現在、糖尿病性足潰瘍といった慢性創傷を治療するため、特定の免疫調節細胞が使用できることがわかった。本明細書に示されるように、こうした細胞を慢性創傷およびその近くへと直接投与することで、治癒の加速をもたらす。
【0005】
特定の疾患治療を目的とする免疫調節細胞の使用、特に、これらの細胞［１］を受け取るレシピエントの免疫学的耐性を確立することを目的とする使用は、近年大きな注目を集めている。現在、調節性Ｔ細胞［２］、免疫寛容誘導性樹状細胞［３］および調節性マクロファージ［４］を含めたいくつかの免疫調節細胞種が前臨床開発の時点に到達しつつあり、そのことは、免疫抑制剤としてそれらを初期治験で調査するのを可能にするであろう。
【0006】
Ｔ細胞およびＢ細胞媒介性自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応を含む、多数の免疫学的症状を治療するための免疫調節細胞の使用が企図されている。これらの症状では、細胞に基づく免疫調節療法は、全身的な免疫抑制療法または抗炎症療法の必要性を低減または更には除去することが意図されており、それによって患者をその付随合併症から救う。調節細胞によって支援される類の免疫学的耐性は優勢かつ自己持続性であるため、細胞に基づく免疫調節療法が、それ以外ならば長期の全身的な免疫抑制療法または抗炎症療法を必要とするであろう疾患において、治療選択肢を提供する、という可能性が存在し得る。
【0007】
移植および他の臨床的適応において、補助的免疫抑制剤としての使用のためにとりわけ有望な１つの候補細胞種は、免疫調節性マクロファージ（本明細書および文献では「Ｍｒｅｇ」と呼ぶ）である。Ｍｒｅｇ細胞は、マクロファージ分化の特有の状態を反映しており、その堅牢な表現型および強力なＴ細胞抑制剤機能によって他の活性状態にあるマクロファージとは区別される［５］。ヒトＭｒｅｇは、試験管内でマイトジェン刺激によるＴ細胞増殖を強力に抑制し、それは、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：ＩＦＮ）γ誘導性インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ活性と接触依存的な活性化Ｔ細胞除去とに起因するものであり得る。加えて、Ｍｒｅｇは、活性化誘導調節性Ｔ細胞の発達を促し、代わってそれはエフェクターＴ細胞の増殖を抑制しかつ樹状細胞の成熟を抑制する。したがって、Ｍｒｅｇをレシピエントに投与する場合には免疫調節のフィード－フォワードループが開始されて外来移植物の長期の抗原特異的免疫学的低応答性をもたらすものと仮定される。
【0008】
一連の事例研究および２つの初期治験において、Ｍｒｅｇ含有細胞製剤は既に臨床試験に使用され、補助的免疫抑制治療の一形態として合計１９名の腎移植レシピエントに投与された［５］～［９］。これらの試験的研究は、固形臓器移植のためのこの技術の妥当性を明確に実証している。別の２名の生体腎移植レシピエントは現在、約８．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｋｇのより純粋なドナー由来Ｍｒｅｇで治療されている［５］。生体腎移植におけるＭｒｅｇ療法の更なる治験は今や、ＯＮＥ Ｓｔｕｄｙ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０２０８５６２９）の枠組み内で規制上の承認を得ている。この治験は、外科手術の７日前における５００ｍｇ／日のミコフェノール酸モフェチルによる援護下で用量２．５×１０6～７．５×１０6個／ｋｇ体重のドナー由来Ｍｒｅｇ細胞によって１６名の患者を治療することを目的としている。Ｍｒｅｇによる潰瘍治療は今までの先行技術では企図されておらず、足潰瘍の管理に大きく貢献する。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、確立されたプロトコールに従い調製されたＭｒｅｇ細胞が、足潰瘍、特に慢性足潰瘍の治癒を加速させるといった見識に基づく。したがって、第１の態様では、本発明は、対象において下肢の微小血管障害および大血管障害を治療する方法で使用するための、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージに関する。
【0010】
本明細書で使用されるように、微小血管障害は、脳の小血管、冠状小血管または足の小脈管といった体内の小血管および毛細血管に悪影響を及ぼす血管疾患である。微小血管障害の間、毛細血管の基底膜は厚く硬くなり、これは毛細血管または小動脈の閉塞または破裂を引き起こす。結果、組織の壊死および機能損失が生じる。対照的に、大血管障害は動脈といった大血管に悪影響を及ぼす血管疾患である。より大きな動脈の閉塞は、糖尿病における心臓発作、心発作および末梢血管疾患の高い発病率につながる。多くの場合、足の動脈閉塞により治癒が遅い潰瘍が足全体に生じる。末梢血管疾患はまた、間欠性跛行を引き起こす。これはすなわち歩行中の疼痛であり、可動性を極度に損なうものである。多くの場合、特に糖尿病患者においては、大血管障害は片方または両方の脚の切断を必要とした。
【0011】
微小血管障害および大血管障害の一因は、長期的な糖尿病にある。糖尿病患者では、血糖値が高くなることで、血管内皮細胞が通常より多くのグルコースを吸収してしまう。続いてこの血管内皮細胞は、その表面上に通常より多くの糖タンパク質を形成する。また、この細胞により血管壁の基底膜がそれまでよりも異常に厚く弱くなってしまう。結果、血管壁は漏れやすくなり、身体中を通る血流が遅くなる。このため、損傷を受けた一部組織は１時間十分な酸素を受け取ることがない。
【0012】
本発明によれば、治療される微小血管障害は、好ましくは血管炎、動脈炎、血管形成異常、白色萎縮、強皮症、ディターマン症候群（Ｄｅｔｅｒｍａｎｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿病性血管障害、閉塞性血管内膜炎、紅痛症、線維筋性形成異常症、足穿孔症、メンケベルグ中膜石灰化硬化症、オスラー病、コンパートメント症候群、Paget-von-Schroetter症候群、レイノー病および足潰瘍からなる疾患の群から選択される。特に好ましい態様では、本発明による治療されることになる微小血管障害または大血管障害は足潰瘍である。本明細書で使用されるように、足潰瘍は糖尿病性足潰瘍および静脈性下腿潰瘍を含む。
【0013】
本発明によれば、治療される大血管障害は、好ましくは動脈瘤、解離、アテローム性動脈硬化症、アテローム性血栓症、末梢動脈閉塞性疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｉａｌ ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＡＤ）、間欠性跛行、壊死および壊疽、血管奇形、ルリッシュ症候群または圧迫症候群の群から選択される。
【0014】
実際には、免疫調節性マクロファージは医薬組成物として製剤化される。医薬組成物は、第１組成物として、有効量のＭｒｅｇ細胞またはその細胞成分画分を含む。本明細書で使用されるように、患者に投与されるＭｒｅｇ細胞の有効量は、治療される患者体重当たりで、約１×１０4～約１×１０8／ｋｇ、好ましくは約１×１０5～約１×１０7／ｋｇ、より好ましくは、約１×１０6／ｋｇ、約２×１０6／ｋｇ、約３×１０6／ｋｇ、約４×１０6／ｋｇ、約５×１０6／ｋｇ体重、約６×１０6／ｋｇ、約７×１０6／ｋｇまたは約８×１０6／ｋｇなど、約１×１０6～約９×１０6／ｋｇの範囲である。
【0015】
同様に、本発明がＭｒｅｇ細胞の細胞成分画分の投与を含む場合、この画分は、上記の細胞投与に関連する範囲のうち１つに対応するＭｒｅｇ細胞量に基づき調製されることが好ましい。本明細書で使用されるように、Ｍｒｅｇ細胞の細胞成分画分はネクローシス細胞粒子、アポトーシス細胞粒子またはエキソソームを含んでもよい。低浸透圧性溶液、洗浄剤もしくは酸を用いた溶解、凍結溶解もしくは加熱、超音波処理、照射、機械的破壊または長期貯蔵で細胞を処理して調製された細胞可溶化物もまた使用されてよい。細胞成分画分は、全ての細胞タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、精製ＭＨＣ分子を含有する細胞抽出物もまた含んでよい。
【0016】
Ｍｒｅｇ細胞またはその細胞成分画分以外では、医薬組成物は緩衝剤、ｐＨ調整剤、防腐剤および同様のものといった更なる添加剤を含むことが可能である。医薬組成物内へと含まれる添加剤の性質およびその量は、投与予定ルートによって決定する。
【0017】
一般的には、個別の投与ルートは治療が必要な患者へＭｒｅｇ細胞またはその細胞成分画分を与えるのに適している。好ましくは、本発明の医薬組成物は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与または皮内投与といった非経口的投与のために製剤化される。一実施形態では、Ｍｒｅｇ細胞もしくはその細胞成分画分または当該細胞もしくは画分を含む組成物は、例えば注射または注入といった静脈内投与によって患者に投与される。注射または注入による静脈内投与に好適な医薬組成物は、通常は滅菌水溶液または懸濁液および滅菌溶液または懸濁液を即時調製するための滅菌粉末を含む。薬物製剤化分野で知られている慣例的な方法を適用することで、Ｍｒｅｇ細胞または細胞成分画分の医薬組成物への製剤化が実現可能である。好適な方法は例えば、標準教科書内に記載される。
【0018】
注射または注入による投与向けには、好適な担体は生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を含んでよい。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールおよび同様のもの）ならびにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンといったコーティングの使用、分散液の場合に必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することが可能である。滅菌ろ過で用いられる１つ以上の上記成分と共に、適切な溶媒中に必要量の細胞または細胞成分画分を導入することにより、滅菌注射溶液は調製されることができる。一般的には、懸濁液は活性化合物（すなわち、細胞またはその細胞成分画分）を、基本的な分散媒および上記の成分由来である、必要とされる他の成分を含有する滅菌媒介物へと導入することにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、上記滅菌ろ過溶液由来の任意の追加の望ましい成分を加えた、細胞またはその細胞成分画分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。医薬組成物は、投与時に安定していなければならず、好ましくは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを組成物中に含むことにより、細菌および真菌類といった微生物の汚染作用に対し保護される。
【0019】
医薬組成物を注射しようとする場合、注射される総量は１～１００ｍｌ、好ましくは２０ｍｌ、３０ｍｌまたは４０ｍｌといった１０～５０ｍｌである。医薬組成物を注入しようとする場合、注入される総量は５０～５００ｍｌである。９０ｍｌ～２５０ｍｌの量が特に好ましく、９０ｍｌ～１５０ｍｌの量が更により好ましい。
【0020】
Ｍｒｅｇ細胞は、個別の投与治療方式によって治療の必要がある患者へ投与されることができる。例えば細胞または細胞画分が静脈内注入により患者に投与される場合、投与されるＭｒｅｇ細胞または細胞画分の総量は、１回または２回以上の注入によって提供可能である。好ましい実施形態では、Ｍｒｅｇ細胞または細胞画分は２００μｍフィルタを有する注入セットを用いて患者に提供される。Ｍｒｅｇ細胞または細胞画分を含む懸濁液は、０．９％ＮａＣｌでプライミングされてよい。懸濁液は１回の注入で供与されてよく、より好ましくは、例えば６０分以内、３０分以内、２０分以内または１５分以内といった６０分未満内での短時間の注入で供与されてよい。好ましくは、中心静脈カテーテルをＭｒｅｇ細胞懸濁液の投与用として使用する。
【0021】
Ｍｒｅｇ細胞または細胞画分の投与は、先述した他の活性剤投与と同時にまたは投与後に完了することができる。例えば、Ｍｒｅｇ細胞または細胞画分が、微小血管障害または大血管障害を患っている患者に投与される場合、ドベシル酸カルシウムといった血液過粘稠に対する化合物、ナフタゾンといった毛細血管強化効果を発現する化合物などは、Ｍｒｅｇ投与前か、Ｍｒｅｇ投与と同時か、またはＭｒｅｇ投与後に投与されることができる。
【0022】
本発明の第１の態様に記載される方法によって得られたＭｒｅｇ細胞は安定した表現型を示すが、安全上、Ｍｒｅｇ細胞またはＭｒｅｇ細胞から得られた細胞成分画分は細胞培地から収集後２４時間以内に投与されることが推奨される。好ましくは、培養物から細胞を収集後、細胞は２０時間以内、１６時間以内、１２時間以内、８時間以内または４時間以内に投与される。
【0023】
別の態様では、本発明は、対象における外科的創傷、外傷性創傷または他の創傷の治癒を促進する方法で使用されるための免疫調節性マクロファージに関する。Ｍｒｅｇ療法は急性または慢性創傷の治癒を促進するため、任意には、従来の管理（すなわち、洗浄、縫合およびドレッシング）と組み合わせて使用されてよい。創傷は開放性または閉鎖性であってよい。開放性創傷は切開、裂傷、擦傷、剥離、貫通性外傷または刺傷を含んでよい。閉鎖性創傷は挫滅外傷または血腫を含んでよい。切開は外傷性または医原性（すなわち外科的切開）であってよい。Ｍｒｅｇは自家植皮または同種異系植皮の生着を促進するために使用されてよい。Ｍｒｅｇは、熱、極低温、化学薬品、摩擦、放射線または電流に皮膚が曝露することにより生じ得る熱傷の治癒を加速させることができる従来の管理と組み合わせて使用されてもよい。潰瘍の治療と関連付けて作成された記載は、創傷または熱傷の治療に同様に適用される。
【0024】
本発明の方法で使用するためのＭｒｅｇの調製は、文献で広く記載されている。Ｍｒｅｇ細胞は、ヒトＣＤ１４＋血液単球から誘導される。Ｍｒｅｇ細胞の特徴ある生物学的特性を誘導するため、単球は成長因子、サイトカインおよび受容体リガンドの特異的な組合せにより処理される。本プロセスにより得られた細胞は、血液単球、他の種の単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞および他の抑制型の骨髄単球性細胞産物と該細胞を区別する特別な表現型により特徴付けられる。
【0025】
Ｍｒｅｇを調製するための好適なプロセスは、
（ａ）対象の血液試料からＣＤ１４陽性単球を単離することと、
（ｂ）（ｉ）Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦならびに（ｉｉ）ＣＤ１６のリガンドを含有する培地中で単球を培養することと、
（ｃ）ＩＦＮ－γと細胞を接触させることと、
（ｄ）培地からＭｒｅｇ細胞を得ることと、を含む。
（ａ）対象の血液試料からＣＤ１４陽性単球を単離することと、
（ｂ）（ｉ）Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦならびに（ｉｉ）ＣＤ１６のリガンドを含有する培地中で単球を培養することと、
（ｃ）ＩＦＮ－γと細胞を接触させることと、
（ｄ）培地からＭｒｅｇ細胞を得ることと、を含む。
【0026】
本方法は、出発物質として血液単球を使用する。本方法はヒト血液単球からＭｒｅｇ細胞を生成するために使用される方法であることが好ましいが、本方法はヒト由来細胞の分化に制限されない。実際には、他の種の非ヒト細胞、特に、例えば非ヒト霊長類細胞またはブタ細胞といった脊椎動物細胞にもまた適用可能である。
【0027】
本方法は、ヒトドナーのＣＤ１４陽性単球をＭｒｅｇに分化させるために使用されてよい。本発明の方法の出発物質としての役割を果たす単球は、ヒトドナーの末梢血から得られる。ドナーは、健常な対象または１つ以上の疾患を患っている患者であり得る。単球ドナーは、意図される分化Ｍｒｅｇ細胞のレシピエントであってよい（自家アプローチ）。代替的には、単球ドナーは分化したＭｒｅｇ細胞の所定のレシピエントとは異なる人間であってよい（同種異系アプローチ）。後者の場合、ドナーおよびレシピエントは遺伝的な関連があってもなくてもよい。ドナーとレシピエント間の好ましい関係は、所定の臨床用途によって変化する。自家Ｍｒｅｇ細胞の使用は、特定の副作用防止に役立ち得る。したがって、自家Ｍｒｅｇ細胞の使用が通常好ましい。
【0028】
末梢血由来の単核細胞を濃縮するための種々の方法が当該技術分野で知られており、これらの各方法を上記調製方法に関して使用することができる。例えば、静脈穿刺によって得た血液を抗凝血剤で処理することができ、続いて分離用媒体、例えばＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを使用することによって分離することができる。このため、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ溶液上に抗凝血剤処理済血液試料を積層して遠心分離し、それによって種々の細胞種を含有する層が形成されることになる。下層は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ試薬によって凝集および沈降した赤血球を含有する。赤血球層のすぐ上の層は、大部分において、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ層を通って移動した顆粒球を含有する。単球およびリンパ球は、それらのより低い密度のために、血漿とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓとの間の界面に見いだされる。単核球画分の濃縮は、層の単離ならびにそれに続く洗浄および遠心分離によって実現可能である。
【0029】
単核白血球を血液試料から分離するための別の慣例的に用いられている方法には、白血球搬出法が挙げられる。白血球搬出法は、末梢血から白血球をそれらの相対密度によって連続プロセスで得る特異な類のアフェレーシスである。この手順において対象の血液は、選択された白血球の画分を収集して残りの血球および血漿をドナーに返す特別な遠心分離装置に通される。白血球搬出法は、今日においては白血球または幹細胞を末梢血から得るための慣例的な臨床手段である。本発明に関して白血球搬出法を行うために使用することができる種々の装置はいくつかの製造業者から入手することができ、例えば、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴからのＳｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ（登録商標）アフェレーシスシステムがある。ＣＯＢＥ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒａアフェレーシスシステムの使用によって白血球搬出法を実施する場合、製造業者によって提供される操作説明書のプロトコールを用いることが好ましい、というのも、このプロトコールはＡｕｔｏＰＢＳＣプロトコールに比べてより良い品質の単球をもたらすことがわかったからである。
【0030】
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓのような分離用媒体の使用および白血球搬出装置の使用はどちらも、単球だけでなくリンパ球も含有する細胞画分をもたらすものである。本発明によれば、単球は、細胞をＭｒｅｇ調製方法に投入する前に既知の方法、例えば、磁気ビーズ分離、フローサイトメトリーによる選別、浄化、ろ過またはプラスチック付着によってリンパ球から濃縮および分離され得る。しかしながら、Ｍｒｅｇ調製方法においては、一様な単球画分を使用することは必須ではない。実際、単球画分における０．１～２０％、好ましくは１０～２０％の量のリンパ球の存在は、Ｍｒｅｇへの単球の分化に良い影響を与え得る。
【0031】
単球が濃縮された単核球製剤を得るためには、末梢血単核球を例えばＣＤ１４陽性単球と結合するＣＤ１４マイクロビーズに接触させてもよい。上記方法の工程（ａ）における単球は白血球搬出法により単離されてよく、その後、ＣＤ１４親和分子を用いた分離工程の対象となってよい。ＣＤ１４親和分子は好ましくはＣＤ１４抗体である。こうした精製工程は非単球を有する出発物質の汚染を大いに軽減する。Ｔ細胞汚染の軽減は、患者の安全性という視点から非常に価値がある、というのも、それはドナー対レシピエント反応の潜在的なリスクを最小限に抑えるからである。ＣＤ１４単球の単離は、自動単離システムによって支援されることができる。例えば、本発明の方法で使用されるＣＤ１４単球は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で単離することができる。
【0032】
白血球搬出法および／またはその他の方法によって単離した単球画分は、Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦならびにＣＤ１６リガンドと共にインキュベートすることによる分化のために直接使用することができ、またはそれを更なる使用の時まで抗凝血性クエン酸デキストロース溶液（Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘ－ｔｒｏｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＡＣＤ－Ａ）中もしくはその他の任意の適切な緩衝剤を補充した自家血漿中に貯蔵することができる。単離した単球画分を別の分化プロセス実施場所へ輸送しなければならない場合には、細胞の単離から２４時間以内、好ましくは単球の単離から１８時間以内、１２時間以内、６時間以内、４時間以内または２時間以内に、Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦとのインキュベーションによる細胞の分化を開始する配慮がなされなければならない。長期間の貯蔵のためには、単球画分を適切な凍結保存溶液中に再懸濁させて２０℃未満の温度、好ましくは８０℃未満の温度で長期間貯蔵してもよい。
【0033】
単球を単離した後、細胞をＭ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドの存在下でインキュベートする。例えば、Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦならびにＣＤ１６リガンドを含有する培地中で細胞を懸濁させてもよい。代替的には、細胞培養の開始からしばらく経った後にＭ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドを添加することも可能である。上記方法の工程（ｂ）で使用する培地は、単球および／またはマクロファージの培養での使用に適切なものとして文献に記載されているいかなる培地であってもよい。適切な培地としては、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌマクロファージ生成培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２混和物、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、またはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。培地は好ましくは、化学的に定義された培地である。培地は、Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦの他に、上皮成長因子（ＥＧＦ）、またはＩＬ－４といった成長因子およびサイトカイン；脂肪酸、コレステロールおよびその他の脂質；ビタミン、トランスフェリンおよび微量元素；インスリン、グルココルチコイド；コレカルシフェロールまたはエルゴカルシフェロール、およびその他のホルモン；非特異的免疫グロブリンおよびその他の血漿タンパク質を含む、Ｍｒｅｇの生存および分化を促進する他の因子を含有することができる。本発明の好ましい実施形態では、培地は、ＲＰＭＩ－１６４０またはそれに由来する培地である。
【0034】
単離したＣＤ１４陽性単球をインキュベートするために使用する培地は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ、ＣＳＦ１としても知られる）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはその両方を含有してよい。Ｍ－ＣＳＦは、当該技術分野において、単球、マクロファージおよび骨髄前駆細胞の増殖、分化および生存に影響を与える造血性成長因子として知られている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＳＦ２としても知られる）は、サイトカインとして機能し、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、上皮細胞および線維芽細胞によって分泌される、単量体型糖タンパク質である。様々な種からのＭ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦタンパク質について記載されており、様々な製造業者からの購入が可能である。Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦの選択は、Ｍｒｅｇ細胞へと分化させる単球の由来によって変化するだろう。例えば、上記記載のプロセスを用いてヒト単球をＭｒｅｇに分化させるのであれば、使用する培地はヒトＭ－ＣＳＦおよび／またはヒトＧＭ－ＣＳＦ、好ましくは組換え型ヒトＭ－ＣＳＦおよび／または組換え型ヒトＧＭ－ＣＳＦを含有するであろう。同様に、分化方法においてブタ単球を使用するのであれば、培地に添加するＭ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦはブタ由来のものであろう。
【0035】
大抵、上記方法の工程（ｂ）の培地中のＭ－ＣＳＦの濃度は、培地１ｍｌあたり１～１００ｎｇタンパク質の範囲である。培地中のＭ－ＣＳＦの量を測定する経過実験は、初期用量５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを使用した培養物が培養２日目までに生理学的レベル以下の濃度を含有していたようにＭ－ＣＳＦが経時的に消費または分解され、それとは対照的に、初期用量２５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを使用した培養物が７日間の培養期間全体を通して１０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度を維持したということを明らかにした。この結果、培地中のＭ－ＣＳＦ濃度は、２０～２５ｎｇ／ｍｌなど、通常は２０～７５ｎｇ／ｍｌの範囲である。Ｍ－ＣＳＦの代わりにＧＭ－ＣＳＦを使用する場合、Ｍ－ＣＳＦに関して上に概説したのと同じ濃度を培地中で用いることができる。ＧＭ－ＣＳＦはＭ－ＣＳＦと比べて強力であると思われることから、培地１ｍｌあたり０．１～１００ｎｇタンパク質のＧＭ－ＣＳＦの濃度が示唆される。Ｍ－ＣＳＦとＧＭ－ＣＳＦとの両方を培地で使用する場合、これら２つの成長因子の全体濃度は上記の範囲内、すなわち２０～７５ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
【0036】
上記方法の工程（ｂ）で使用する培地は、Ｍ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦの他に、ＣＤ１６リガンドも含む。単球上のＣＤ１６細胞表面受容体の刺激はそれらのＭｒｅｇ細胞への分化を誘導するために必要である。ＣＤ１６細胞表面受容体の刺激は、ヒトまたは非ヒト免疫グロブリン、より好ましくはヒト免疫グロブリンまたはその断片の添加によって得ることができる。免疫グロブリン断片は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ断片であり得る。免疫グロブリンはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を通じて活性し、Ｍｒｅｇ表現型を誘導すると想定されている。ＣＤ１６リガンド刺激を得るための単純な方法は、培地にヒト血清を添加することである。結果、Ｍｒｅｇ細胞の生成に使用される培地は、１～２０％のヒトＡＢ型血清を含有し得る。
【0037】
Ｍｒｅｇ細胞を血管新生の誘導が望まれる治療用途で使用することが意図される場合、本発明の方法の工程（ｂ）にて単球を培養するために使用される培地は、Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドの他、リポリサッカライド（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）または高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ１）といったトル様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含むことができ、ＶＥＧＦ－Ａのような血管新生因子の産生を増強する。ＴＬＲリガンドは、１０００ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌの濃度範囲で培地に添加することができる。ＴＬＲリガンドは、産生方法の任意の段階で添加することができる。これは、単球を培養するのに使用される初期培地、すなわち培養０日目の時点で存在することができ、または例えば培養５日目、６日目もしくは７日目といった後の段階で添加することができる。好ましくは、ＴＬＲリガンドはＩＦＮ－γの添加と同時に添加される。
【0038】
本発明の方法の工程（ｃ）では、細胞はサイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）と接触する。本発明の方法で使用されるＩＦＮ－γの選択は、本発明の方法に供される単球の由来によって変化する。仮にヒト単球がＭｒｅｇへと分化されると、添加されるＩＦＮ－γは通常組換え型ヒトＩＦＮ－γとなる。単球培養物へと添加されるＩＦＮ－γ量は、５～１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。１ｍｌの培地あたり２５ｎｇのＩＦＮ－γ量が特に適切である。
【0039】
ＩＦＮ－γはＭ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドと同時に培地に添加することができる。これは、例えば単球の培養開始時にサイトカインが添加され得ることを意味する。こうした方法において、本発明の方法によって分化される単球は、全培養期間中、Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１６リガンドおよびＩＦＮ－γの存在下で培養される。しかしながら通常は、ＩＦＮ－γの存在下での培養期間は、Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦの存在下での培養期間よりも大幅に短い。これは、ＩＦＮ－γがＭ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦの存在下で細胞が３日間培養された後に添加され、ＩＦＮ－γの存在下での培養が、更に１８～７２時間続くことを意味する。
【0040】
Ｍ－ＣＳＦ／ＧＭ－ＣＳＦおよびＣＤ１６リガンドの存在下で細胞を６日間培養し、ＩＦＮ－γを１８～２４時間パルスして、その後７日目に収集する際、特に良好な結果が得られた。分化したマクロファージは、マクロファージを用いた使用に適する、５％のヒト血清アルブミンを追加したリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）などの緩衝剤で洗浄してよい。Ｍｒｅｇ細胞は、輸液バッグ、ガラス製注入装置、または輸送可能である別の閉鎖系容器に移され、貯蔵されることができる。
【0041】
上記調製プロセスにより、Ｍｒｅｇ細胞を他の調節性または非調節性マクロファージと区別する、特定のマーカー分子の発現によって特徴付けられる免疫調節性マクロファージを生じる。最も重要なのは、本発明の方法で使用するためのＭｒｅｇは、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する。これら３つのマーカーの組合せは、Ｍｒｅｇを明確に検出し、他のマクロファージとＭｒｅｇを分離するための信頼性の高い手段を提供する。
【0042】
ＣＤ２５８は、文献ではＬＩＧＨＴまたはＴＮＦＳＦ１４と呼ばれてもいるが、ＴＮＦスーパーファミリーの分泌タンパク質である。ＣＤ２５８のヒト配列は、ＮＣＢＩ遺伝子＿ＩＤ８７４０のもとで見ることができる。ＩＤＯはインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼを意味する。このマーカーをコード化しているヒト遺伝子配列は、ＮＣＢＩ遺伝子＿ＩＤ３６２０のもとで見ることができる。ＩＤＯの別名は、ＩＤＯ１またはＩＮＤＯである。ＤＨＲＳ９はレチノールデヒドロゲナーゼのＳＤＲファミリーのレチノールデヒドロゲナーゼである。このマーカーをコード化しているヒト遺伝子配列は、ＮＣＢＩ遺伝子＿ＩＤ１０１７０のもとで見ることができる。
【0043】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するための免疫調節性マクロファージは、ＴＧＦβ１およびＰＡＥＰからなる群から選択されるマーカーの少なくとも１つを更に発現する。ＴＧＦβ１は、トランスフォーミング増殖因子ベータであり、トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーに所属する多機能サイトカインを表す。このマーカーをコード化しているヒト遺伝子配列は、ＮＣＢＩ遺伝子＿ＩＤ７０４０のもとで見ることができる。ＰＡＥＰは黄体ホルモン関連子宮内膜タンパク質を表す。このマーカーをコード化しているヒト遺伝子配列は、ＮＣＢＩ遺伝子＿ＩＤ５０４７のもとで見ることができる。
【0044】
Ｍｒｅｇはマクロファージであることから、これらはまた共通のマクロファージマーカーも発現する。したがって、好ましい実施形態では、ＭｒｅｇはＣＤ３３、ＣＤ１１ｂおよびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択されるマクロファージマーカーのうち少なくとも１つを更に発現する。
【0045】
特に好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるＭｒｅｇ細胞は、以下の表現型のうち１つである：
（１）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ；
（２）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１；
（３）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＰＡＥＰ；
（４）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ；
（５）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３；
（６）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ；
（７）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ；
（８）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ；
（９）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＴＧＦβ１；
（１０）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＡＥＰ。
（１）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ；
（２）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１；
（３）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＰＡＥＰ；
（４）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ；
（５）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３；
（６）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ；
（７）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１、ＰＡＥＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ；
（８）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ；
（９）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＴＧＦβ１；
（１０）ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＡＥＰ。
【0046】
ここで、ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１およびＰＡＥＰを発現する免疫調節性マクロファージが、特に好ましい。
【0047】
好ましい態様では、本発明の方法で使用されるＭｒｅｇは、マーカーＣｌｅｃ－９ａ、ＣＤ１０およびＣＤ１０３のうち少なくとも１つを発現しない。別の好ましい態様では、本発明の方法で使用されるＭｒｅｇは、マーカーＣｌｅｃ－９ａ、ＣＤ１０およびＣＤ１０３の全てを発現しない。別の好ましい態様では、本発明の方法で使用されるＭｒｅｇは、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン－３のうち少なくとも１つを発現する。更に別の好ましい態様では、本発明の方法で使用されるＭｒｅｇは、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン－３の全てを発現する。別の好ましい態様では、本発明の方法で使用されるＭｒｅｇは、マーカーＣｌｅｃ－９ａ、ＣＤ１０およびＣＤ１０３のうち少なくとも１つを発現しないが、マーカーＣＤ３８、ＣＤ２０９およびシンデカン－３のうち少なくとも１つを発現する。
【0048】
マーカーの発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質量によって測定されることができる。特に好ましい実施形態では、マーカーの検出は転写量で行われる。転写量での遺伝子発現を観測するための適切な方法には、ｍＲＮＡ量の定量的または半定量的検出が可能であるものが挙げられる。例えば、定量ＲＴ－ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング分析または当該技術分野で周知である他の方法である。
【0049】
転写量での検出は、第１工程として、例えば血液試料から得られるマクロファージといった分析されるマクロファージからのｍＲＮＡの単離を通常は必要とする。ｍＲＮＡといったＲＮＡを単離するための方法は当該技術分野で周知であり、文献にて詳細が議論されている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。こうした方法は通常、試験にかけられる対象から得られた細胞または組織の溶解を含む。細胞溶解は、細胞の原形質膜を破壊することができる洗浄剤の使用により実施されてよい。例えば、グアニジンチオシアネートおよび／またはＳＤＳを含有する緩衝剤が細胞溶解に使用されてよい。この方法は、発現量の観測といった、更に下流の用途の妨げとなり得る微量のＤＮＡを含まない純粋なＲＮＡを得るため、細胞のＤＮＡが酵素消化される工程を含んでよい。ＲＮＡの分解を導く酵素の阻害剤は、溶解緩衝剤に添加されてもよい。高純度ＲＮＡを調製するためのキットは、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａおよびその他といった、いくつかの製造業者から入手することができる。
【0050】
市販のキットを使用することで細胞試料または組織試料から単離されたＲＮＡは、通常様々な種のＲＮＡを含む。好ましくは、組織試料から得られたＲＮＡは、ｍＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む全ＲＮＡである。本発明の方法向けには、他の細胞のＲＮＡの画分に対し、ｍＲＮＡ画分を濃縮させることが望ましい。好ましくは、ｍＲＮＡは他のＲＮＡ分子から分離される。ｍＲＮＡを濃縮または精製するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ｍＲＮＡはポリ（Ａ）尾部をその３’末端に含有するため、セルロースまたはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）マトリックスといった固体マトリックスに結合するオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを実施することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。アフィニティーマトリックスに結合したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％のＳＤＳを用いて溶離可能である。
【0051】
転写量で発現を検出するために一般的に使用される方法の１つは、ＲＴ－ＰＣＲである。この方法では、ｍＲＮＡテンプレートは逆転写（ＲＴ）反応によりｃＤＮＡへと転写される。ＲＮＡテンプレートの逆転写は逆転写酵素により触媒され、反応は特異的なオリゴヌクレオチドプライマーか、または代替的にはオリゴ－ｄＴプライマーによって開始される。次いで、ｃＤＮＡは続くＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用される。続くＰＣＲ工程では、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよび例えばＴａｑポリメラーゼといったポリメラーゼ酵素の使用により、ｃＤＮＡは増幅される。好ましい実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応はリアルタイムＲＴ－ＰＣＲとして実施される。これにより、増幅されたＤＮＡの検出および同時定量化がリアルタイムで可能となる。定量化は、コピーの絶対数、または追加的な遺伝子発現産物の使用により標準化される相対量のいずれかとして起こる。
【0052】
更に好ましい実施形態では、ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲはマーカーの発現量測定のために使用される。ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲは、特異的でありＰＣＲ中の増幅産物の蓄積物を検出する、蛍光体を基にしたＲＴ－ＰＣＲ法である。ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲでは、ＲＮＡは逆転写酵素により最初にｃＤＮＡへと転写される。続くＰＣＲ反応では、ＤＮＡテンプレート内にあり、かつ２つのＰＣＲプライマー間に位置付けられた１０～６０個のヌクレオチドの断片に相補的である、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブが添加される。蛍光体およびクエンチャー色素は、それぞれプローブの５’および３’末端に共有結合的に付着する。代替的には、クエンチャー色素は内部ヌクレオチドにも付着することができるが、一方で蛍光体はプローブの５’もしくは３’端部に付着するか、またはその逆にも同様に付着する。当該蛍光体が選択的に励起する際、プローブに付着する蛍光体およびクエンチャー色素の間が近接することにより、蛍光体からの蛍光発光の妨害となる。ＰＣＲでＤＮＡ合成中、Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性はテンプレートＤＮＡにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプローブを切断させる。これにより、蛍光体およびクエンチャー色素を立体的に分離させる。蛍光はＰＣＲサイクル中に検出される。これは放出された蛍光体およびＰＣＲ中に存在するＤＮＡテンプレートの量に直接比例する。当該技術分野で知られる全ての蛍光体クエンチャー対は、本発明の方法で使用可能である。適切な蛍光体の例は、ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレスチン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレスチン）またはＶＩＣである。好適なクエンチャー色素は、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。ＴａｑＭａｎアプローチでプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの構造および標識は、文献にて非常に詳細に記載されている。ＴａｑＭａｎ反応は、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００システム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施されることができる。
【0053】
マイクロアレイは、発現プロファイリングにて一般的に使用される別の手段である。マイクロアレイは、例えば核酸プローブなど立体的に分解されたプローブを、基板上に順序正しく配列したものを指す。こうしたアレイは、例えばＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ遺伝子といった関心のある遺伝子に対して相補的である、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のオリゴヌクレオチドを含有することができる。このことにより、各遺伝子配列またはその転写をハイブリダイズする。基板は好ましくは、個別の既知の位置（スポット）に付着した複数のプローブを有する表面を有する、固相基板である。マイクロアレイ上のスポットは通常、マイクロアレイ上に印刷されるか、またはフォトリソグラフィまたはインクジェット印刷によって合成されるかのいずれかである。一般的なマイクロアレイ上に数千のスポットが存在し得、各スポットは、核酸の断片またはオリゴヌクレオチドといった大量の同一プローブを含有することができる。こうしたマイクロアレイは、通常、１ｃｍ2あたり少なくとも１００個のオリゴヌクレオチドまたは断片の密度を有する。特定の実施形態では、アレイは、１ｃｍ2あたり約少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１０5個、少なくとも１０6個、少なくとも１０7個のオリゴヌクレオチドまたは断片の密度を有することができる。支持体は、プローブが固定位置もしくはスポットに付着されている表面上のガラスまたはプラスチック製のスライドまたは膜であることができる。
【0054】
本明細書で言及されるＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応で使用されるプライマーまたはプローブは、例えばＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９またはＩＤＯ遺伝子といった各マーカー遺伝子内で、特異的なハイブリダイズおよびそれに続く標的配列の増幅が可能となるように設計されている。本開示に基づき、当業者は、各Ｔｒｅｇマーカー遺伝子の発現を検出するために使用されることができるオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを設計することが、容易に可能であるだろう。ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ用の配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための方法は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ
ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，”ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ”，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３といった科学文献にて非常に詳細に議論されている。ＰＣＲプライマーを設計する際考慮されるべきパラメータには、例えばヌクレオチドの数、プライマーのＧ／Ｃ含有量、溶解温度、２次構造につながり得る相補的ヌクレオチドの存在および同様のものが挙げられる。本発明の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０個のヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドプライマーは、当該技術分野で知られている任意の適切な技術によって調製されることができる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えばホスホアミダイト法によって、合成的に誘導されてよい。天然に生じたヌクレオチド塩基であるアデニン、チミン（ウリジン）、シトシンまたはグアニンを含有するオリゴマーまたはポリマーとは別にして、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンおよび同等のものといった修飾塩基を含み得る。
ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，”ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ”，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３といった科学文献にて非常に詳細に議論されている。ＰＣＲプライマーを設計する際考慮されるべきパラメータには、例えばヌクレオチドの数、プライマーのＧ／Ｃ含有量、溶解温度、２次構造につながり得る相補的ヌクレオチドの存在および同様のものが挙げられる。本発明の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも８個のヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０個のヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドプライマーは、当該技術分野で知られている任意の適切な技術によって調製されることができる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えばホスホアミダイト法によって、合成的に誘導されてよい。天然に生じたヌクレオチド塩基であるアデニン、チミン（ウリジン）、シトシンまたはグアニンを含有するオリゴマーまたはポリマーとは別にして、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンおよび同等のものといった修飾塩基を含み得る。
【0055】
本明細書に示されるマーカーの検出用プローブおよびプライマーは、各マーカーのヒトゲノム配列に基づく慣例法によって設計されることができる。これらのマーカーの配列は当該技術分野で知られており、配列データベースで検索することができる。プローブおよびプライマーは、その全長にわたり、ゲノム配列に完全に相補的であると示す必要は必ずしもないことが理解されるだろう。プローブおよびプライマーが各ｍＲＮＡに対して特異的結合を示す限り、限られた数の配列のずれは許容可能である。標準的には、同種のｍＲＮＡ分子に対するプローブおよびプライマーの全体配列の同一性は、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。ヌクレオチド配列間の一致度を測定するためのコンピュータプログラムは、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡから入手することができる）で入手することができ、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰなどが挙げられる。これは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに基づいている。これらのプログラムは、製造業者によって推奨される標準パラメータを用いて使用されることができる。
【0056】
例えばＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯなどのマーカーの高レベルのｍＲＮＡが検出される場合、この細胞はＭｒｅｇであると仮定することができる。休止マクロファージといった非Ｍｒｅｇ細胞はまた、ある程度上記で示されたマーカーのうち１つか２つ以上を発現し得るが、こうした発現は比較的低い。それ故、本発明によれば、非Ｍｒｅｇ細胞、特に休止マクロファージによるマーカーの発現がネガティブコントロールとして使用されることが好ましい。ネガティブコントロール、すなわち休止マクロファージの各量よりも少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約７５０％または少なくとも約１０００％高いＲＮＡレベルでのマーカー発現の測定は、試験にかけられる細胞がＭｒｅｇ細胞であることを明確に示す。
【0057】
更に別の特に好ましい実施形態では、例えばＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯといったＭｒｅｇマーカーの検出は、翻訳レベルでのマーカー遺伝子発現の検出を含む。これは、ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯといった各Ｍｒｅｇマーカーのタンパク質量が測定されることを意味する。Ｍｒｅｇタンパク質量は、生物学的試料中でマーカータンパク質を特に検出することが可能である、任意の適切な方法により測定されてよい。タンパク質の検出は、タンパク質に特に結合する分子に基づいてよく、または試料中に存在する他のタンパク質からのタンパク質の分離に基づいてよい。Ｔｒｅｇマーカータンパク質に特に結合する分子は、抗体およびＭｒｅｇマーカー向けの結合活性を有する抗体断片を含む。ＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯのようなＭｒｅｇマーカータンパク質に誘導される多数の抗体が調製され、商業的な追跡が可能である。こうした抗体またはその断片は、ウェスタンブロット法、定量的ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、偏光分析法（定量的）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または定量的な電子顕微鏡法を含む免疫組織化学的方法を用いる、Ｍｒｅｇマーカータンパク質の検出のために使用されてよい。本発明の特に好ましい実施形態では、マーカーの検出はＥＬＩＳＡを含む。特異的結合を検出可能である他の方法は、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を含む。生物学的試料内の他の成分からタンパク質を分離することにより、Ｔｒｅｇマーカータンパク質の定量的検出が可能となる方法は、定量的質量分析法、２次元ゲル電気泳動といった電気泳動法、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーといったクロマトグラフィー法を含む。
【0058】
上述の通り、非Ｍｒｅｇ細胞も例えばＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯといった、上で言及したＭｒｅｇマーカーを低量で産生し得る可能性がある。したがって、非調節性マクロファージといった非Ｍｒｅｇ細胞のタンパク質量は、ネガティブコントロールを提供するためには測定もされるべきである。仮に試験にかけられる細胞に対するタンパク質量により、マーカー発現がネガティブコントロールよりも高いことが明らかにされると、試験される細胞がＭｒｅｇであると結論づけることができる。特異的には、ネガティブコントロール、すなわち非調節マクロファージなどの非Ｍｒｅｇ細胞での各量よりも、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約７５０％、または少なくとも約１０００％高いタンパク質量でのマーカー発現を測定することは、試験された細胞がＭｒｅｇ細胞であることを明確に示す。
【0059】
本発明の一層より好ましい実施形態では、Ｍｒｅｇマーカーの検出はフローサイトメトリーを含む。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーおよび細胞内分子の発現を分析するために広く使用される方法である。フローサイトメトリーは、細胞カウント、細胞分取およびバイオマーカープロファイリングなどの用途向けに慣例的に使用されている。特にフローサイトメトリーは、異種細胞集団内で異なる細胞種を決定するために使用されることができる。フローサイトメトリーは、細胞表面上のマーカーを検出する蛍光標識された抗体により生じた蛍光強度を測定するために主に使用される。これは細胞内マーカーの検出のために使用されることもできるが、こうした検出はあまり所望されていない。というのは、抗体は通常、細胞を殺す細胞を透過させなくてはならないからである。これは、生存可能な同一細胞集団の貯蔵を目的とした、細胞分取用途用の細胞内マーカーの検出を妨げる。
【0060】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するためのＭｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ｉＴｒｅｇを誘導する能力を有する。Ｔｒｅｇを誘導するための能力は、Ｍｒｅｇを５日間、同種異系Ｔ細胞と１：２の比率で共培養する時までに試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図2A】ＲＴ－ｑＰＣＲにより強いＤＨＲＳ９ ｍＲＮＡの発現がＭｒｅｇ内で検出されたが、これは比較マクロファージ種（ｎ＝６；平均±ＳＤ）ではないことを示す。
【図2B】ＤＨＲＳ９タンパク質の発現により、Ｍｒｅｇと比較マクロファージとを区別することを実証する、免疫ブロット法の結果を示す。
【図2C】マイクロアレイ分析（ｎ＝３、平均±ＳＤ）により定量化された比較マクロファージのパネル内でのＴＮＦＳＦ１４／ＣＤ２５８ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図2D】フローサイトメトリーによって検出された、ヒトＭｒｅｇによるＣＤ２５８の細胞表面発現を示す。
【図2E】ヒトＭｒｅｇを有するナイーブＣＤ２５-ＦｏｘＰ３-ＣＤ４+Ｔ細胞の直接相互作用が、活性化ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+ＣＤ４+Ｔ細胞への変換を引き起こすことを示すための、実験用システムを例示する。
【図2F】１：２の比率で共培養した際、ヒトＭｒｅｇとの相互作用によってナイーブＣＤ２５－ＦｏｘＰ３-ＣＤ４+Ｔ細胞から生成されたｉＴｒｅｇを示す。
【図2G】マイクロアレイ分析（ｎ＝３、平均±ＳＤ）により定量化された比較マクロファージのパネル内でのＩＤＯ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図2H】細胞内染色およびフローサイトメトリーにより検出されたヒトＭｒｅｇによる、ＩＤＯの発現を示す。
【図2I】マイクロアレイ分析（ｎ＝３、平均±ＳＤ）により定量化された比較マクロファージのパネル内でのＰＡＥＰ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図2J】ＰＡＥＰに対する中和抗体を用いた分泌ＰＡＥＰタンパク質の中和が、ｉＴｒｅｇ生成における著しい減少につながったことを示す。
【図2K】マイクロアレイ分析（ｎ＝３、平均±ＳＤ）により定量化された比較マクロファージのパネル内でのＴＧＦβ１ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図2L】ヒトＭｒｅｇおよび比較マクロファージによる、ＴＧＦβ１の２４時間の分泌を示す。
【図2M】Ｔｒｅｇ誘導に関するＰＣＭＯを有する、Ｍｒｅｇの比較を示す。
【実施例0062】
Ｍｒｅｇを現行の滅菌医薬品の製造に関するＧＭＰ基準に基づいて製造した。汚染および不衛生に対し、製品、材料および機器を防護するといった注意が全加工工程で払われる。
【0063】
実施例１：Ｍｒｅｇの調製
第１のＭｒｅｇ製剤（「Ｍｒｅｇ Ａ」）を、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎの改善プロトコールに基づいて調製した。Ｍｒｅｇ生成用出発物質として使用される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集するため、健康なヒトドナーに白血球搬出法を施した。全ドナーは、感染症を含む関連疾患のマーカーを対象とし、白血球搬出法に先駆け最大３０日間スクリーニングされた。ドナーは、白血球搬出法当日にも同じ疾患マーカーを再度スクリーニングされた。白血球搬出法は、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｄｅｖｉｃｅまたは同様の装置を用いて実施した。ＣＤ１４＋単球は、製造業者の指示に基づき、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを用いて白血球搬出法産物から単離された。
第１のＭｒｅｇ製剤（「Ｍｒｅｇ Ａ」）を、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎの改善プロトコールに基づいて調製した。Ｍｒｅｇ生成用出発物質として使用される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集するため、健康なヒトドナーに白血球搬出法を施した。全ドナーは、感染症を含む関連疾患のマーカーを対象とし、白血球搬出法に先駆け最大３０日間スクリーニングされた。ドナーは、白血球搬出法当日にも同じ疾患マーカーを再度スクリーニングされた。白血球搬出法は、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｄｅｖｉｃｅまたは同様の装置を用いて実施した。ＣＤ１４＋単球は、製造業者の指示に基づき、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを用いて白血球搬出法産物から単離された。
【0064】
１０％のヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、および、０．１％ヒト血清アルブミン（Ａｖｅｎｔｉ）で希釈(carried on)した組換え型ヒトＭ－ＣＳＦ（ＲＳＣＤシステム）を終濃度５ｎｇ／ｍｌが添加され、フェノールレッド（Ｌｏｎｚａ）を含まないＲＰＭＩ ｌ６４０ベースの培地３０ｍｌ中に、密度３５×１０6単球／１７５ｃｍ2培養フラスコ（Ｃｅｌｌ＋Ｔ１７５フラスコ；Ｓａｒｓｔｅｄｔ）で、プラスチック付着単球を添加した。細胞を６日間、そのうち、１日目、２日目および４日目に完全培地を交換して培養した。６日目には、２５ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＩＦＮ－γ（Ｉｍｕｋｉｎ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）で培養物を刺激した。７日目には、トリプシンＥＤＴＡ処理（フェノールレッド非含有ＴｒｐＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、その後慎重に掻き取ることにより、付着単球画分を回収した。全フラスコからのＭｒｅｇは、５％ヒトアルブミンを含有する生理食塩水溶液で貯蔵および再懸濁された。
【0065】
第２のＭｒｅｇ製剤（「Ｍｒｅｇ Ｂ」）は、国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５５８３９の実施例１に記載されるプロトコールに基づいて調製された。Ｍｒｅｇ生成用出発物質として使用される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集するため、健康なヒトドナーに白血球搬出法を施した。全ドナーは、感染症を含む関連疾患のマーカーを対象とし、白血球搬出法に先駆け最大３０日間スクリーニングされた。ドナーは、白血球搬出法当日にも同じ疾患マーカーを再度スクリーニングされた。白血球搬出法は、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｄｅｖｉｃｅまたは同様の装置を用いて実施した。
【0066】
ＣＤ１４＋単球は、製造業者の指示に基づき、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを用いて白血球搬出法産物から単離された。簡潔には、白血球搬出法産物を０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝剤で充填されたバッグへと移動させた。製造業者の指示に従い、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ１４試薬で標識する前に細胞は一旦洗浄された。ＣＤ１４＋単球を磁気分離によって単離するため、標識細胞懸濁液を滅菌チューブセットに接続し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置へと導入した。陽性単離されたＣＤ１４＋単球画分は培地で洗浄され、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離緩衝剤を除去した。１０％ヒト男性ＡＢ型血清（貯蔵および熱不活性化されたもの）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および２５ｎｇ／ｍｌ組換え型ヒト単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を追加されたＲＰＭＩ媒体中で、１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度にて、単離したＣＤ１４＋単球を再懸濁した。各バッグは１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2内部表面領域で播種されるように、この単球懸濁液をＭｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）細胞分化バッグへと分配した。培養のため、分化バッグは３６～３８℃、５±１％ＣＯ2、６０％以上の湿度に設定された培養器内の棚に水平に置かれた。単球は、１日経過した後、培養バッグの下面上に沈殿させることが可能であった。１日目にバッグを反転させ、単球が反対側の面に付着できるようにした。培養は更に５日間、培養器中で継続された。単球のＭｒｅｇへの最終分化を誘導し、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を誘導するため、２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γを添加することにより、単球を刺激した。ＩＦＮ－γ添加後、もう１度分化バッグを反転した。次いで、３６～３８℃、５±１％ＣＯ２、６０％以上の湿度で更に１８～２４時間、バッグをインキュベートした。７日目に分化したＭｒｅｇを収集した。全ての平行な培養バッグからの細胞は、貯蔵され、表現型分析および機能的分析前に洗浄した。
【0067】
実施例２：Ｍｒｅｇの表現型特徴付け
実施例１で得られた「Ｍｒｅｇ Ａ」細胞を、種々のマーカーの発現のため試験した。とりわけ、Ｍｒｅｇに対する特異性を潜在的に有する種々のマーカーの発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより検査した。
実施例１で得られた「Ｍｒｅｇ Ａ」細胞を、種々のマーカーの発現のため試験した。とりわけ、Ｍｒｅｇに対する特異性を潜在的に有する種々のマーカーの発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより検査した。
【0068】
ＤＨＲＳ９：ＤＨＲＳ９発現により単球由来マクロファージおよび樹状細胞由来のヒトＭｒｅｇを区別することを示すことができた。強いＤＨＲＳ９ ｍＲＮＡ発現は、Ｍｒｅｇ中で検出されたが、比較マクロファージ種（（ｎ＝６；平均±ＳＤ）は検出されなかった。図４Ａを参照されたい。特別仕様のウサギ抗ＤＨＲＳ９ｐＡｂによる免疫ブロット法により、ＤＨＲＳ９タンパク質発現は比較マクロファージ由来のＭｒｅｇを区別することを実証した。図４Ｂを参照されたい。
【0069】
ＣＤ２５８：ＣＤ２５８（ＴＮＦＳＦ１４）は、ヒトＭｒｅｇの情報マーカーであることが明らかにされた。ＴＮＦＳＦ１４ ｍＲＮＡ発現は、Ｍｒｅｇ中で検出されたが、比較マクロファージ（ｎ＝３；平均±ＳＤ）中では検出されなかった。図４Ｃを参照されたい。
【0070】
ＩＤＯ：ＭｒｅｇはＩＤＯを発現することが明らかにされていたが、その一方、比較マクロファージはこのマーカーを発現しない。ＭｒｅｇによるＩＤＯの発現は、フローサイトメトリーによって検出された。図４Ｄを参照されたい。
【0071】
ＰＡＥＰ：ＭｒｅｇはＰＡＥＰを発現することが明らかにされていたが、その一方、比較マクロファージはこのマーカーを発現しない。図４Ｅは、比較マクロファージ（ｎ＝３；平均±ＳＤ）のパネルにてＰＡＥＰ ｍＲＮＡが発現することを示している。
【0072】
ＴＧＦβ１：ＭｒｅｇはＴＧＦβ１を発現することが明らかにされていたが、その一方、比較マクロファージはこのマーカーを発現しない。図４Ｆは、比較マクロファージ（ｎ＝３；平均±ＳＤ）のパネルにてＴＧＦβ１ｍＲＮＡが発現することを示している。
【0073】
Ｔｒｅｇ誘導：末梢血ＣＤ１４＋単球から生成されたヒトＭｒｅｇは、１：２の比率で同種異系Ｔ細胞と５日間共培養された。次いでＴ細胞はフローサイトメトリーおよび機能アッセイによって分析された。５日間同種異系Ｍｒｅｇで共培養されたＴ細胞は、Ｔ細胞抑制型ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ｉＴｒｅｇ（図４Ｆ）用に濃縮された。これは、αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで５日間刺激することによって生成されたＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３－／低 ポリクローナル活性化Ｔ細胞と容易に区別された。ＭｒｅｇをＰＣＭＯ細胞と比較した。結果を図２Ｍに示す。これより、Ｔｒｅｇを誘導する能力は、Ｍｒｅｇには制限されることを理解することができる。
【0074】
実施例３：足潰瘍治療用Ｍｒｅｇ
右下肢ＩＩａ期および左下肢ＩＩＩ期末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を患っている７８歳の高齢男性患者は、複数回の経皮的血管形成術（ＰＴＡ）処置、ならびに左膝窩動脈と共に、総大腿動脈（ＡＦＣ）と浅大腿動脈（ＡＦＳ）の各バイパス手術を受けたことがあった。彼は歩行中および安静時、特に夜中に強い疼痛が出現することに悩まされていた。
右下肢ＩＩａ期および左下肢ＩＩＩ期末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を患っている７８歳の高齢男性患者は、複数回の経皮的血管形成術（ＰＴＡ）処置、ならびに左膝窩動脈と共に、総大腿動脈（ＡＦＣ）と浅大腿動脈（ＡＦＳ）の各バイパス手術を受けたことがあった。彼は歩行中および安静時、特に夜中に強い疼痛が出現することに悩まされていた。
【0075】
患者は実施例１より得られたＭｒｅｇ製剤（「Ｍｒｅｇ Ａ」）による治療を受けた。とりわけ、１２ｍｌの５％のヒト血清アルブミンで希釈された１×１０7Ｍｒｅｇは、潰瘍の外側部分に沿って６か所の注射部位、すなわち１つの注射部位につき２ｍｌずつ注射された。創傷下の筋組織に届く場合には、注射は筋肉内へと供された。それ以外の場合には、注射は皮下に供された。追加治療はその後一切実施しなかった。乾燥した包帯により創傷は滅菌状態を保たれ、包帯は毎日取り換えられた。
【0076】
結果：患者の臨床経過観察は、経時的に創傷が閉鎖したという点で著しい改善を示している。臨床的には、夜に生じる疼痛は、安静時の虚血性疼痛を伴うことなく完全に消失した。この改善はＭｒｅｇ注射後３か月で最初に観察された。歩行距離は２ｋｍ以上に改善された。治療結果を図１に示す。
【0077】
実施例４：ＰＡＤ治療用Ｍｒｅｇ
拡張した動脈障害コンポーネントおよび右下肢にＩＶ期末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する糖尿病（diabetes mellitus with an extended arteriopathic component and peripheral artery disease (PAD)）を患っている６４歳の高齢女性患者がいた。彼女は骨がむき出しの状態である踵部潰瘍を発症していた。浅大腿動脈（ＡＦＳ）または下腿の広範囲で側副血行路がもはや存在していなかった。下腿の接続血管が欠如していたため、手術可能な治療介入は一切不可能であった。大腿部切断が最後の治療手段として考えられていた。
拡張した動脈障害コンポーネントおよび右下肢にＩＶ期末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する糖尿病（diabetes mellitus with an extended arteriopathic component and peripheral artery disease (PAD)）を患っている６４歳の高齢女性患者がいた。彼女は骨がむき出しの状態である踵部潰瘍を発症していた。浅大腿動脈（ＡＦＳ）または下腿の広範囲で側副血行路がもはや存在していなかった。下腿の接続血管が欠如していたため、手術可能な治療介入は一切不可能であった。大腿部切断が最後の治療手段として考えられていた。
【0078】
患者は実施例１により得られたＭｒｅｇ製剤（「Ｍｒｅｇ Ａ」）による治療を受けた。実施例３で記載されるように、総量で５０，０００のＭｒｅｇが５つの個別識別されている（血管造影）治療ポイントにて投与された。追加治療はその後一切実施しなかった。創傷は滅菌状態を保ち、毎日包帯を取り換えた。
【0079】
結果：患者の臨床経過観察は、注射２週間後に創傷が治癒したという点で著しい改善を実証した。３か月後、創傷治癒は完全に終了し、右脚の血行も補償された。追加の側副血行路の形成も血管造影により実証された。大腿部切断は回避された。
【0080】
文献
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dendritic cells in transplantation. Transplant Res 2012; 1: 13.
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transplant acceptance-inducing cells to the recipients of renal transplants
from deceased donors is technically feasible. Clin Transplant 2009; 23: 140
-5.
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-5.
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図2L】
【図2M】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＤ）に罹患している対象において創傷治癒を誘導する方法で使用するための、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージ。
【請求項2】
前記マクロファージが、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯおよびＴＧＦβ１を発現する、請求項１に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項3】
前記マクロファージが、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９、ＩＤＯ、ＴＧＦβ１およびＰＡＥＰを発現する、請求項１又は２に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項4】
前記マクロファージが更に、マクロファージ系列マーカーＣＤ３３、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂおよびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択されるマーカーのうち、少なくとも１つを更に発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項5】
前記創傷が糖尿病性である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項6】
前記方法が、患者へ１×１０5～１×１０7のマクロファージを投与することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項7】
前記方法が、皮下注射または筋肉内注射によって、該創傷へ直接マクロファージを投与することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項8】
前記対象が糖尿病に罹患している、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫調節性マクロファージ。
【請求項9】
対象の末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＤ）における創傷治癒を誘導するための方法で使用するための、マーカーＣＤ２５８、ＤＨＲＳ９およびＩＤＯを発現する免疫調節性マクロファージを含む、医薬組成物。