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特開2023-93639新規製剤

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023093639

(43)【公開日】2023-07-04

(54)【発明の名称】新規製剤

(51)【国際特許分類】

A61K 31/7088 20060101AFI20230627BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20230627BHJP

A61P 1/00 20060101ALI20230627BHJP

A61P 11/06 20060101ALI20230627BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20230627BHJP

A61P 11/02 20060101ALI20230627BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20230627BHJP

A61K 47/38 20060101ALI20230627BHJP

A61K 47/14 20170101ALI20230627BHJP

A61K 47/02 20060101ALI20230627BHJP

A61K 47/04 20060101ALI20230627BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20230627BHJP

C12N 15/11 20060101ALI20230627BHJP

C12N 15/117 20100101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088 ZNA

A61P1/04

A61P1/00

A61P11/06

A61P27/02

A61P11/02

A61P37/06

A61K47/38

A61K47/14

A61K47/02

A61K47/04

A61P43/00 111

C12N15/11 Z

C12N15/117 Z

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023069687

(22)【出願日】2023-04-20

(62)【分割の表示】P 2019537123の分割

【原出願日】2018-01-08

(31)【優先権主張番号】1700257.7

(32)【優先日】2017-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(71)【出願人】

【識別番号】519242528

【氏名又は名称】アトランティックファーマセウティカルズ（ホールディングス）リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100101281

【弁理士】

【氏名又は名称】辻永和徳

(72)【発明者】

【氏名】ウォーターワーストビィ

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソンロリン

(72)【発明者】

【氏名】トーマスジャネット

(72)【発明者】

【氏名】ウエブミッシェル

(57)【要約】（修正有）

【課題】粘膜の炎症を制御するためのオリゴヌクレオチドの新規な配合物を提供する。
【解決手段】特定の配列のオリゴヌクレオチドとカチオンを含み、該カチオンは任意にＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、およびＣｒ^＋＋＋から選択され、好ましくはＮａ^＋であり、より好ましくは４０－２００ｍＭのＮａ^＋であり、任意に２－２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１とカチオンを含み、該カチオンは任意にＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、およびＣｒ^＋＋＋から選択され、好ましくはＮａ^＋であり、より好ましくは４０－２００ｍＭのＮａ^＋であり、任意に２－２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む、医薬品組成物。

【請求項2】

Ｎａ^＋が１００－１９０ｍＭ、より好ましくは１４０－１６０ｍＭである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ヒドロキシメチルセルロース、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、水酸化ナトリウム、塩酸および／または水の１つ以上をさらに含む、請求項１または２記載の組成物。

【請求項4】

前記組成物が、液体シロップ、ゲル、フィルム、クリーム、粉末、錠剤および／または浣腸剤の形態である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

成分が以下の範囲内にある、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物：
配列番号１４ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース７－８ｍｇ、必要に応じて７．５ｍｇ
メチルパラベンナトリウム１６．６ｍＭ２．８－３．０ｍｇ
プロピルパラベンナトリウム１．４ｍＭ０．２８－３ｍｇ
一塩基性リン酸ナトリウム一水和物３７．５ｍＭ４．４－４．６ｍｇ。

【請求項6】

医薬に使用するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記使用が、炎症性腸疾患、直腸断端病、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、鼻炎または副鼻腔炎または移植片対宿主病の予防または治療での使用である、請求項６記載の組成物。

【請求項8】

炎症性腸疾患、直腸断端病、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、鼻炎または副鼻腔炎または移植片対宿主病の予防または治療のための、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物における、配列番号１の使用。

【請求項9】

炎症性腸疾患、直腸断端病、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、鼻炎または副鼻腔炎または移植片対宿主病の治療方法であって、必要とする患者に請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。

【請求項10】

請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法であって、配列番号１とカチオンを混合することを含み、該カチオンは任意にＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、およびＣｒ^＋＋＋から選択され、好ましくはＮａ^＋であり、より好ましくは４０－２００ｍＭのＮａ^＋であり、任意に２－２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む、方法。

【請求項11】

組成物が浣腸剤の形態であり、組成物が１日あたり２ｍｇ／ｍｌで配列番号１の濃度を提供する剤形に処方される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

組成物が浣腸剤の形態であり、組成物が１日あたり１－４ｍｇ／ｍｌで配列番号１の濃度を提供する剤形に処方される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、配列番号１のオリゴヌクレオチドの新規製剤に関する。

【背景技術】

【0002】

粘膜表面は、宿主生物の内部環境と外部環境との間の最初の界面を表す。
したがって、粘膜表面は、外来病原体または抗原への曝露から宿主を保護する様々な細胞構造および無細胞構造に富んでいる。これらの重要な表面は、口腔および鼻腔（副鼻腔）の粘膜表面、肺および消化器系ならびに眼の周囲の粘膜組織によって表される。

【0003】

粘膜を構成する細胞は、さまざまな外来物質を感知し反応するようにされている。これらの細胞はまた、そのような浸潤を周囲の組織に伝達し、感染と闘い、損傷を修復し、そして必要ならば抗体の形で特異的免疫応答を誘導するための追加の炎症性細胞および免疫細胞の流入を動員するための様々な分子経路を詳述する。これらのメカニズムは生物にとって重要で実際に命を救う機能を果たしているが、それらの慢性的および／または誤った活性化はかなりの罹患および死亡をもたらし得る。

【0004】

炎症細胞の慢性的な流入およびそれに続く免疫系の細胞の局所的な活性化は、慢性粘膜炎症を抑制することができる２つの主要な遺伝子座（loci）である。これらの反応は「自然免疫系（innate immune system）」の一部である。樹状細胞およびマクロファージなどの自然免疫系の最初の応答細胞は、病原体を摂取し、そして血液から二次的に活性細胞および防御細胞を引き出すサイトカインを放出する。

【0005】

これらの二次浸潤細胞は、局所血管（血管内皮）をライニングする細胞の表面上の分子によって炎症部位に「引き寄せられる（drawn to）」必要がある。そのような分子はそれ自体、最初の病原体侵入部位で放出されるサイトカインに応答して発現される。これらの分子は循環する血球上の受容体に結合し、局所的な癒着とそれに続く浸潤部位への血管外遊出を可能にする。接着分子は細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）として知られており、そしてこれらの種々のものが発見されている。様々なＩＣＡＭの発現および／または機能をブロックすることは、炎症性疾患を抑制するためのいくつかの治療用製品の開発をもたらした。

【0006】

自然免疫系の細胞はまた、細菌、ウイルス、真菌および他の病原体によって発現される微生物成分を感知し結合する表面受容体の十分に発達したレパートリーを有する。これらの受容体は「トール様受容体」（toll-like receptors：ＴＬＲ）と呼ばれており、そしてこのファミリーの１２のメンバーがヒトゲノムにおいて現在知られている。病原体にコードされたＴＬＲリガンド（Pathogen-encoded TLR ligands）は３つの広いカテゴリーに分類される：脂質およびリポペプチド（ＴＬＲ２／１；ＴＬＲ２／６およびＴＬＲ４）、タンパク質（ＴＬＲ５およびＴＬＲ１１）ならびに核酸（ＴＬＲ３、７、８および９）。特定のＴＬＲの治療標的化は、免疫系を刺激する手段（ワクチン製造）として利用されており、他のＴＬＲを標的とする薬剤は特定の免疫機能を阻害するために開発されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、粘膜の炎症を標的とし制御するための理想的な治療薬は、粘膜の炎症に対して急性の効果と長期にわたる効果の両方を有する薬剤であり、実際に疾患を変化させる可能性がある。

【0008】

本発明はこれに対処する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、第１の態様として、以下のリストから任意に選択されるカチオンと共に配列番号１を含む医薬組成物に関する；Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋およびＣｒ^＋＋＋、好ましくはＮａ^＋、より好ましくは４０－２００ｍＭのＮａ^＋であり、任意に２－２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む。濃度範囲は好ましくは、Ｎａ^＋またはＫ^＋については４０－２００ｍＭ、Ｍｇ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋またはＣｒ^＋＋＋については２－２０ｍＭである。例えば、医薬組成物は、４０－２００ｍＭのＮａ^＋と２－２０ｍＭのＭｇ^２＋、または４０－２００ｍＭのＮａ^＋と４０－２００ｍＭのＫ^＋の組み合わせを有することができる。例えば、組成物はＮａ^＋とＫ^＋、またはＮａ^＋とＭｇ^＋＋、またはＮａ^＋とＣａ^＋＋、またはＮａ^＋とＢａ^＋＋、またはＮａ^＋とＭｎ^＋＋、またはＮａ^＋とＮｉ^＋＋、またはＮａ^＋とＬｉ^＋＋、又はＮａ^＋とＺｎ^＋＋、またはＮａ^＋とＣｒ^＋＋＋、またはＫ^＋とＭｇ^＋＋、またはＫ^＋とＣａ^＋＋、またはＫ^＋とＢａ^＋＋、またはＫ^＋とＭｎ^＋＋、またはＫ^＋とＮｉ^＋＋、またはＫ^＋とＬｉ^＋＋、またはＫ^＋とＺｎ^＋＋、またはＫ^＋とＣｒ^＋＋＋の組み合わせを含むことができる。

【0010】

第１の態様の組成物はまた、ヒドロキシメチルセルロース、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、水酸化ナトリウム、塩酸および／または水のうちの１つ以上を含むことができる。

【0011】

組成物は、液体シロップ剤、ゲル剤、フィルム剤、クリーム剤、粉剤、錠剤、浣腸剤および／または好ましくは吸入に適している粒子状の形態であることができる。

【0012】

本発明の組成物は、ゲル、クリーム、ローション、溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、吸入に適している粉末または粒子、錠剤、スプレー、エアロゾル、フォーム、膏薬、微粒子、ナノ粒子、または生体接着剤として製剤化することができる。リポソーム、ミセルおよび／またはミクロスフェアを含むように調製することができる。

【0013】

組成物は以下の範囲の成分を有することができる。
配列番号１４ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース７－８ｍｇ、任意に７．５ｍｇ、
メチルパラベンナトリウム１６．６ｍＭ２．８－３．０ｍｇ
プロピルパラベンナトリウム１．４ｍＭ０．２８－３ｍｇ
一塩基性リン酸ナトリウム一水和物３７．５ｍＭ４．４－４．６ｍｇ

【0014】

ここで与えられた範囲は１用量当たり合計６０ｍｌで１ｍｌ当たりである。したがって、６０ｍｌ中２４０ｍｇの治療薬では、４ｍｇ／ｍｌである。上記の特定の用量は、液体浣腸製剤であることができる。

【0015】

本発明の第二の態様は、医薬に使用するための第一の態様の組成物に関する。薬は人間または動物用薬であることができる。動物用薬は、任意の動物であることができ、生産動物および／またはペット動物を含み、特にイヌ、ネコおよび／またはウマ動物を含む。

【0016】

本発明の第２の態様によれば、医薬は、炎症性腸疾患、直腸断端病、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、鼻炎または副鼻腔炎または移植片対宿主病（graft versus host disease）の予防または治療用であり得る。

【0017】

本発明の第３の態様は、炎症性腸疾患、直腸断端疾患、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、鼻炎または副鼻腔炎の予防または治療のための本発明の第１の態様による医薬の製造における配列番号１の使用に関する。
本発明の第１の態様の全ての特徴は第３の態様にも当てはまる。

【0018】

本発明の第４の態様は、炎症性腸疾患、直腸断端病、放射線誘発性直腸炎、嚢炎、喘息、眼の炎症、ドライアイ、鼻炎、副鼻腔炎、または対宿主性付与病を治療する方法に関する。の方法はそれを必要とする患者への本発明の第１の態様の組成物の投与を含む。
本発明の第１の態様の全ての特徴は第４の態様にも当てはまる。患者はヒト（成人または若年）または動物であり得る。

【0019】

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様の組成物を製造する方法に関し、この方法は、配列番号１をカチオンと組み合わせることを含み、該カチオンは、以下のリストから任意に選択される；Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｂａ^＋＋、Ｍｎ^＋＋、Ｎｉ^＋＋、Ｌｉ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、およびＣｒ^＋＋＋。好ましくはＮａ^＋、より好ましくは４０－２００ｍＭのＮａ^＋、任意に２－２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む。

【0020】

この新しい組成物を製造するための方法は、当技術分野において公知の標準的な方法である。

【0021】

本発明は、組成物が浣腸剤の形態であり、組成物が１日あたり４ｍｇ／ｍｌのＳＥＱＩＤＮＯ：１の濃度を提供する剤形に処方される、請求項１から６のいずれか一項に記載の本発明の第１の態様による組成物を提供する。

【0022】

組成物は浣腸剤の形態であってもよく、ここで組成物は１日当たり０．２５－４ｍｇ／ｍｌの濃度の配列番号１を提供する剤形に処方される。

【0023】

配列番号１は以下の通りである：5'-gcccaagctg gcatccgtca-3'。
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号１は、アリカフォルセン（alicaforsen）としても知られている。

【0024】

適用部位での活性成分の保持を補助するために、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含有する製剤に対するある種の増強もまた必要であり得る。例えば、製剤は、製剤を室温で液体にするが、体温ではゲル状態に固化させる成分を用いて調製することができる。他の例では、製剤を液体として調製し、鼻粘膜などの粘膜表面に塗布した後、メチルセルロースなどの不活性乾燥粉末を塗布して、塗布部位に製剤を保持することができる。他の例では、組成物の乾燥粉末製剤を不活性乾燥粉末と混合して粘膜部位に一緒に塗布することができる。

【0025】

本発明によるオリゴヌクレオチド配列番号１は、好ましくは約２０－約８０の核酸塩基単位を含む。より好ましいオリゴヌクレオチドは、約２０－５０の核酸塩基単位を含み、約２０－３０の核酸塩基単位を有することがさらにより好ましく、そして約２０－２２の核酸塩基単位を有することが最も好ましい。理解されるように、核酸塩基単位は、ホスホジエステルまたは他の結合を介して隣接する核酸塩基単位に適切に結合した塩基－糖の組み合わせである。当業者は、約２０－約８０核酸塩基単位は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０の核酸塩基単位を含むことを理解するであろう。

【0026】

さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチド長の配列番号１のフラグメントを含む。このフラグメントは、ヒトＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡの３ ’非翻訳領域内の配列とハイブリダイズすることができる。フラグメントは、ヌクレオチド「cctgacg gatgccagct tgg」（配列番号２）と中程度またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。フラグメントには、「cccaagctg gcatccgtca」（配列番号３）、「gcccaagctg gcatccgtc」（配列番号４）および「gcccaagctg gca」（配列番号５）が含まれる。

【0027】

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（stringency）」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、適切なアニーリングのためには、より長いプローブはより高い温度を必要とし、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境に存在するときに変性したＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度が高い。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度はそれほどストリンジェントではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照のこと。

【0028】

本明細書中で定義されるように、「ストリンジェントな条件」または「非常にストリンジェントな条件」は、以下のものによって定義され得る：（１）洗浄に低いイオン強度および高温を用いる、たとえば５０℃で、０．０１５ｍＭ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム塩；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えばホルムアミド、例えば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用する；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０［ｍｕ］ｇ／ｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中５５℃で洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣで高ストリンジェントな洗浄を行う。

【0029】

「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ニューヨーク：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、１９８９年に記載されているように定義することができ、洗浄液の使用およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳを含み、上記のものよりストリンジェンシーが低い。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ（denatured sheared salmon sperm DNA）を含む溶液中、３７℃で一晩インキュベートし、続いて約３７－５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、プローブの長さなどの要因に適応するために必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整するかを理解するであろう。

【0030】

本明細書中で使用される場合、中程度または高ストリンジェンシーの条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて、当業者によって容易に決定されることができる。基本条件はSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1 , pp. 1.101 -104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)に述べられている。

【0031】

オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含むように修飾することができる。各ホスホジエステル結合において非架橋酸素分子を硫黄分子で置換することによるオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート修飾は、未修飾ＤＮＡと比較してエキソヌクレアーゼ耐性を有意に増加させ、そして薬物半減期を延長する（Ｇｅａｒｙら、Ａｎｔｉ－ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ、１２：３８３?９４，１９９７）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、最低限の抗原性、非細胞傷害性および忍容性が良好であり、そしてそれらの薬物動態学的および薬力学的特性は十分に特徴付けられている（例えば、Ｂｕｔｌｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ、７７：３７９－８８、１９９７；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉら、Ａｎｔｉ－ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓ、６：６４７?６１，１９９１）。

【0032】

ホスホロチオエート骨格修飾に加えて、他の多くの可能な骨格、糖および他の修飾が当業者に周知である。

【0033】

実際の投与量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療されているものの性質および重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば投与量などの決定は、最終的には一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、通常は治療する疾患、個々の患者の状態、配達場所、投与方法および医師に知られている他の要因を考慮に入れる。

【0034】

例えば、一実施形態では、適切な用量は、例えば１浣腸あたり１日あたり２ｍｇ／ｍｌであり得る。

【0035】

別の実施形態では、最小用量は、例えば１浣腸あたり１日当たり０．２５ｍｇ／ｍＬであろう。

【0036】

組成物は、１日１回、２回、３回または４回または定期的に投与することができる。
組成物は、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週にわたって投与することができる。

【0037】

例えば、一実施形態において、治療当たりの適切な用量は、０．０５ｍｇ－４００ｍｇであり得る。治療薬は１日１から８回投与することができる。適切な用量濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ－１０ｍｇ／ｍＬであり得る。喘息患者に投与される適切な投与量は、０．５－５ｍＬ、特に約１ｍＬであり得る。ドライアイまたは眼の炎症の患者に投与される適切な用量は、１－１００μｌ、特に約５０μｌであり得る。適切な浣腸剤投与量は、１０－１００ｍＬ、特に約６０ｍＬであり得る。

【0038】

組成物は、１日に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回もしくは８回または定期的に投与することができる。
組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週にわたって投与することができる。
組成物は１、２、３、４、５または６日間投与することができる。

【0039】

組成物は、存在する悪化、炎症、疼痛および／または患部の放出に関してもよく、または予防的（予防的処置）であってもよい。治療は、治療、症状の軽減または予防的効果を含み得る。

【0040】

本発明によって治療可能な疾患の具体例には、以下に記載される粘膜の炎症状態が含まれる。各疾患は、特定の血液由来の炎症性細胞の流入および炎症部位に局在している免疫細胞の活性化を必要とする。したがって、そのような疾患は、理想的には、本発明によって提供されるように、炎症細胞の流入と自然免疫系の活性化の両方をブロックすることができる薬剤によって治療される。

【0041】

炎症性腸疾患には、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）が含まれる。どちらも腸粘膜の炎症性疾患である。潰瘍性大腸炎は大腸に限局しているが、クローン病は口腔を含む腸粘膜のあらゆる領域を含み得る。ＵＣおよびＣＤは両方とも、環境刺激および自己免疫刺激に応答した炎症性細胞および免疫細胞の流入によって特徴付けられる。２つの疾患の組織病理学は異なるが、ステロイド、抗ＴＮＦ抗体およびメサラミンなどの多くの治療薬が両方の状態を治療するために使用されている。

【0042】

嚢炎(pouchitis)は、結腸の外科的除去および回腸－肛門吻合術によるＪ－ポーチの形成の後に残る遠位腸粘膜の炎症である。嚢炎における粘膜炎症は、潰瘍性大腸炎において観察されるものと類似しているが、それは、より広い範囲への微生物の関与を有し得る。それは活性化された炎症細胞の流入および局所免疫系の活性化を特徴とする。

【0043】

直腸断端病（rectal stump disease ）は、結腸切除術後に残る直腸粘膜に影響を与える炎症状態です。

【0044】

喘息は、一連の刺激に対する気道過敏症（ＡＨＲ）と協調した呼吸困難および喘鳴のエピソードに代表される複雑で多因子性の障害である。気道壁の慢性炎症性粘膜は、喘息増悪を促進する主な要因であると考えられています。分極ＣＤ４Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞がアレルギー性喘息患者の気管支粘膜に浸潤して蓄積すること、およびこれらの細胞から分泌されるサイトカイン（インターロイキン－（ＩＬ）－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９およびＩＬ－１３）はアレルギー性喘息の急性増悪および病理学的特徴の促進に大きく関与している。ＩＣＡＭ－１の下方制御およびＴＬＲ－９の阻害による先天性免疫応答の抑制を介して炎症細胞の流入を阻害することは、本発明によって提供される有効な治療アプローチである。いくつかの臨床試験では、喘息を治療するためのＴＬＲ９アゴニストの使用が検討されている。例えば、アストラゼネカは、Ｄｙｎａｖａｘからライセンスを受けているＴＬＲ９アゴニストＡＺＤ１４１９を有し、好酸球性、中等度から重度の喘息患者の吸入経路によるフェーズ２ａにある。ＴＬＲ９アゴニストは、Ｔｈ２（後期）応答および増強されたＴｈ１応答を抑制する。

【0045】

ＣｙｔｏｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、アレルギー性気管支喘息の治療にＴＬＲ－９アゴニストＣＹＴ００３－ＱｂＧ１０を使用した臨床試験を実施している。喘息を治療するために臨床試験で評価されている他のＴＬＲ９アゴニストは、ＡＩＣ（Ｄｙｎａｖａｘ）、ＡＶＥ０６７５およびＳＡＲ－２１６０９（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ／ＣｏｌｅｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＱＡＸ－９３５（ＩｄｅｒａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。

【0046】

好酸球性副鼻腔炎（ＥＳ）は、環境抗原に反応して、好酸球および他の単球およびリンパ球が血液から鼻粘膜に慢性的に流入することを特徴とする鼻粘膜の炎症である。この反応は鼻汁（鼻漏）、うっ血、鼻ポリープなどのさまざまな症状を引き起こす。好酸球性副鼻腔炎には、副鼻腔炎および鼻炎が含まれる。ＬｉｃａｒｉＡらによる論文（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１４年１０月－１２月、２７（４）：４９９－５０８）は、共通の病因性メカニズムを共有する共存する炎症プロセスによって相互接続された上気道および下気道がどのようにしてユニークな実体として考えられるかを説明した。この論文は、以前の研究が鼻副鼻腔炎と喘息の間の関係をどのように強く実証したかを説明している。これは「ユナイテッドエアウェイズ（United Airways）」の概念の導入につながっている。これはＷＨＯの「アレルギー性鼻炎とその喘息への影響（ＡＲＩＡ）」の文書にも含まれている。この概念は、これらの疾患の治療にも重要な影響を及ぼす。本発明は、好酸球性副鼻腔炎を治療するために使用される。

【0047】

移植片対宿主病は、白血病のような血球癌の治療のために行われる骨髄移植の後に起こる。移植の間、宿主の血球形成器官は放射線治療によって除去され、そしてドナー（移植片）骨髄が移植されて器官の機能が回復する。この処置は癌を効果的に治療することができるが、移植された免疫系は宿主組織を「拒絶」し始める可能性がある。敏感な組織には、肝臓、皮膚、肺、消化管などがある。全身免疫抑制は、これらの組織の大部分で拒絶反応を抑制するために使用されるが、消化管（ＧＩ）粘膜は全身療法で治療することが特に困難である。小腸および結腸で起こる炎症は、腸管腔に直接送達される標的療法でよりよく治療される。経口製剤または直腸の浣腸製剤のいずれかで、本発明は移植片対宿主病を抑えるために使用される。

【0048】

Ｃａｌｃａｔｅｒｒａら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００８、１８１、６１３２－６１３９）による論文において、著者らはＴＬＲ９の阻害がＧＶＨＤの治療につながる可能性があることを実証している。著者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウスを使用して、移植レシピエントとしてＴＬＲ９ノックアウトマウスを使用した場合、野生型レシピエントマウスと比較して生存率が向上したことを実証した。マウスは、骨髄破壊的照射され、１０^７個の骨髄細胞と４×１０^７個の完全ＭＨＣメジャー及びマイナーのＡｇ－異種のＢＡＬＢ／ｃドナーから得られた脾細胞を注射した。レシピエントマウスをＧＶＨＤの臨床的徴候、体重および生存についてモニターした。興味深いことに、ＴＬＲ４ノックアウトを有するそれらのマウスは野生型レシピエントマウスと比較して改善された生存率を示さなかった。すべての野生型マウスおよびＴＬＲ４－／－マウスは６０日以内に重症急性ＧＶＨＤで死亡したが、ＴＬＲ９－／－マウスは有意に高い生存率を示し、８匹のマウスのうち４匹は実験の終了時にまだ生きていた。ＴＬＲ９－／－マウスのＧＶＨＤ臨床スコアはまた、ＴＬＲ４－／－およびＣ５７Ｂ／６マウスにおけるものよりも有意に低く、これは、小腸における減少した腸損傷およびＴＬＲ９－／－マウスにおける大腸におけるより少ない効果と相関した。最終的に、実験の終わりに、全てのＴＬＲ９－／－生存マウスは完全な免疫再構成を達成し、１００％ドナー末梢血リンパ球細胞を示した。本稿の結果は、ＴＬＲ９がＧＶＨＤの病因において果たす重要な役割を実証している。

【0049】

眼の炎症も本発明で治療することができる。そのような状態は、涙液の産生の減少が眼の粘膜の局所的炎症をもたらすドライアイまたはシェーグレン病である。ドライアイ病は眼科患者の一般的な不満である。ドライアイの対処されていない状態は、角膜の上皮細胞表面の侵食および擦過を引き起こし、感染に対する感受性を高める可能性がある。病気の進行は角膜の潰瘍化、さらには視力の喪失につながることがある。病気や体調によっては、アレルギー、糖尿病、涙腺欠乏症、狼瘡、パーキンソン病、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、酒さなどのドライアイ障害を起こしやすくすることがある。利尿薬、抗うつ薬、アレルギー薬、経口避妊薬、うっ血除去薬などをはじめとする他の病気のための薬はドライアイ障害を引き起こすか、または悪化させることがある。加齢に伴う変化も同様にドライアイを誘発または悪化させる可能性がある。閉経後の女性は、ドライアイを誘発または悪化させる可能性があるホルモンレベルの変化を経験し、甲状腺の不均衡も同様の変化を引き起こす可能性がある。最終的には、老化それ自体が、脂質生成を減少し、ドライアイを結果として生ずる可能性がある。

【0050】

本発明は、それを必要とする対象においてドライアイ、慢性ドライアイ（ＣＤＥ）疾患、またはドライアイ症候群を治療するために使用することができる。ドライアイ、慢性ドライアイ（ＣＤＥ）疾患、またはドライアイ症候群に罹患している対象は、当該分野で公知の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはそれらの組み合わせによって同定され得る。ドライアイ、慢性ドライアイ（ＣＤＥ）病、またはドライアイ症候群の典型的な症状には、例えば、眼の刺痛、灼熱感、または引っ掻き感覚、眼またはその周囲のかすかな粘液のような症状が含まれるが、これらに限定されない。煙や風による目の刺激の増加、目の疲れ、光への過敏性、目の赤み、目の中の異物の感覚、コンタクトレンズの着用の困難、過度の涙生成、目の腫れ、目の不快感、目の痛み、およびかすみ目（一日の終わりに、または長期間のフォーカシングの後に悪化する）。

【0051】

いくつかの実施形態では、ドライアイは涙モル浸透圧濃度試験（tear osmolarity test）によって診断される。涙モル浸透圧濃度試験は、涙中の固体粒子の数を測定する。涙液浸透圧モル濃度が高いほど、涙液の水分が少なく、粒子（塩、タンパク質、脂質、ムチンなど）が多いことを示す。３０８ｍＯｓｍｓ／Ｌ未満の涙液モル浸透圧スコアは正常であり、３０８－３２０ｍＯｓｍｓ／Ｌは軽度のドライアイであり、３２０－３４０ｍＯｓｍｓ／Ｌは中程度のドライアイであり、３４０ｍＯｓｍｓ／Ｌを超えると重度のドライアイである。本発明は、軽度のドライアイ、中程度のドライアイ、中程度から重度のドライアイ、および激しいドライアイを治療するために使用することができる。

【0052】

重度のドライアイの症状には、とりわけ結膜充血（充血）；たとえば眼球結膜充血、下足根結膜充血、鼻球結膜充血；眼瞼縁充血、中心角膜染色および眼の発赤が含まれる。

【0053】

より具体的には、治療は「治療的」および「予防的」を含み、これらの種類の治療はそれらの最も広い文脈で考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、必ずしも対象が最終的に病状に罹患しないことを意味しない。

【0054】

したがって、治療的および予防的処置は、特定の状態の症状の改善、または特定の状態を発症する危険性の予防または低減することを含む。「予防的」という用語は、特定の症状の重症度または発症を軽減すると見なすことができる。「予防的」はまた、以前にその状態と診断された患者における特定の状態の再発を防止することを含む。「治療的」はまた、既存の状態の重症度を軽減し得る。

【0055】

要約すると、本発明は以下を記載する詳細を提供する。

【0056】

・粘膜の炎症は、自然免疫系システムの複数の経路を標的にすることができる薬剤によってより効果的に治療することができる。
・炎症性／免疫細胞（ＩＣＡＭ－１）の流入を遮断し、自然系免疫反応（ＴＬＲ－９）の活性化を遮断すると、急性反応と持続性反応の両方が可能になる。
・ＩＣＡＭ－１を遮断することが知られている配列番号１の２０塩基オリゴヌクレオチドは、それがＴＬＲ－９の活性化も阻害するので、急性応答と耐久性応答の両方を発揮する。
・配列番号１の一次配列はそのＴＬＲ?９アンタゴニストとしての作用を予測しない。
・配列番号１の特定の一次配列は、ＴＬＲ－９活性に影響を与える可能性があるが最も安定したまたは最適な構造を予測しない構造の二次配列を示唆する。
・配列番号１の二次構造に影響を与える条件もまた、ＴＬＲ－９アンタゴニストとしてのその活性に影響を与える。
・配列番号１の一次配列を有するオリゴヌクレオチドは、その二次構造を最適化する条件に供されると、一次配列単独で予測されるよりも強力な粘膜炎症治療剤であることが発見された。

【0057】

ＴＬＲは、宿主が外来分子に対する免疫応答を認識してマウントするための重要な手段である。それらはまた、自然的および適応的免疫応答をリンクするメカニズムを提供する。具体的には、ＴＬＲ－９は、哺乳動物ＤＮＡには存在しない特定の非メチル化ＣｐＧモチーフを介して細菌およびウイルスのＤＮＡを認識する。したがって、粘膜内に含まれる細胞は「外来」ＤＮＡの存在を「感知」しそしてそれに応答することができる。そのようなリガンドの結合は免疫系を活性化して病原体にさらに応答しそしてそれを除去する。

【0058】

ＣｐＧジヌクレオチド配列を含有する合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）がＴＬＲ－９経路を介して免疫応答を刺激し得ることもまた知られている。さらに、合成オリゴヌクレオチドの使用は炎症性サイトカインの阻害剤としての有用性を示しており、これらの作用はＴＬＲ－９に対する阻害作用を介して媒介されることが知られている。

【0059】

ＴＬＲ－９への結合に必要とされるＤＮＡオリゴヌクレオチドの特性を記述する公開された文献は広範囲であり、アゴニストおよびアンタゴニスト配列の両方に焦点を合わせている。

【0060】

ＣｐＧモチーフは刺激活性に必要であることが知られているが、アンタゴニスト配列を絶対的に予測することが知られているカノニカル配列（canonical sequences）はない。特定の阻害剤が当該分野で以前に記載されている。これらのトリプレット含有阻害性ＯＤＮに加えて、いくつかのグループが、ＣｐＧ含有ＯＤＮによるＴＬＲ－９媒介活性化を阻害し得る他の特定のＤＮＡ配列を報告している。これらの「阻害性（inhibitory）」または「抑制性（suppressive）」モチーフは、ポリ「Ｇ」（例えば「ＧＧＧ」）または「ＧＣ」配列が豊富であり、メチル化される傾向があり、哺乳動物およびある種のウイルスのＤＮＡ中に存在する。他の阻害配列は、その配列内に「ＧＧＧＧ」モチーフを含むと同定されている。哺乳動物のテロメアに高頻度で存在する特定の反復ＴＴＡＧＧＧ要素は、ＣｐＧ－誘導免疫の活性化をダウンレギュレートすることが観察され、ＴＴＡＧＧＧ要素を含む合成オリゴヌクレオチドがこの活性を模倣し、またあるＴｈ１―依存性自己免疫疾患の予防／治療に有効でありうる。

【0061】

ＯＤＮの二次構造もまた、ＴＬＲ－９への結合に必要なＤＮＡ構造を定義するための基礎として研究されてきた。しかしながら、構造に対する配列特異的効果がＯＤＮアゴニストまたはアンタゴニスト活性を変化させることが観察されるが、結合親和性を絶対的に特定する二次構造は存在しないようである。

【0062】

驚くべき発見は、配列番号１がＴＬＲ－９のアンタゴニストでありそしてアゴニスト活性を欠いていることである。さらに、本発明は、配列番号１の予測される二次構造に寄与し、そしてその二次構造をＴＬＲ－９拮抗作用に関連づける特定の条件を規定する。

【0063】

次の図は出願の一部である。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】図１は、ＴＬＲ－９の刺激についての、配列番号１用量反応グラフである。

【図2】図２は、配列番号１によるＴＬＲ－９阻害の用量反応である。

【図3】図３は、ＩＣＡＭ－１およびＴＬＲ－９についての配列番号１の阻害曲線を示すグラフである。

【図4】図４は、配列番号１およびＯＤＮ２００６ヘテロ二本鎖対配列番号１ホモ二本鎖についての二本鎖安定性の熱力学的予測である。

【図5】図５は、大腸菌ゲノムＤＮＡによって活性化されたＴＬＲ－９の阻害を示すグラフである。

【図6】図６は、４℃でのｄｄＨ２Ｏ中の配列番号１の上部ＣＤスペクトル、および下部スペクトル２０－９５℃を示す。

【図7a】図７ａは、温度の関数として１９０ｎｍのピーク強度を示す。

【図7b】図７ｂは、温度の関数としての２２０ｎｍのピーク強度を示す。

【図8】図８は、５ｍＭスペルミン中の配列番号１のスペクトルを示す。

【図9】図９は実験装置の概略図を示す。

【図10】図１０は、ＴＬＲ－９のＯＤＮ２００６活性の配列番号１による阻害についてのＩＣ５０を示す。

【図11】図１１は、６日目および１０日目でのスコポラミンドライアイマウスモデルにおけるアリカフォルセン（１ｍＭおよび１０ｍＭ用量）の角膜フルオレセイン染色（Corneal Fluorescein Staining；ＣＦＳ）評価を示す。各円は片目を表し、線は群の平均である。二元配置および一元配置分散分析を行い、続いて多重比較のためのダネット検定を行った。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。

【図12】図１２は、アレルギー性喘息の卵白アルブミン誘発マウスモデルにおけるアリカフォルセンの評価を示す。一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定とビヒクルコントロールとの比較。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。１ｍＭのアリカフォルセンとビヒクルコントロールを比較したスチューデントアンペアード両側Ｔ検定（Student's unpaired, two-tailed T-test）。＃ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0065】

本発明は、限定的ではない以下の実施例を提供する。
実施例１：ＴＬＲ－９阻害活性
配列番号１を用量反応活性についてスクリーニングして、７つの異なる用量（０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５および１０μＭ）で３回の実験でＴＬＲ９活性化について可能性のあるＥＣ５０を決定した。簡単に説明すると、ＴＬＲ９／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターＨＥＫ２９３細胞株（Ａｂｅｏｍｉｃｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を９６ウエル白色固体プレートに１ウエルあたり５×１０^４細胞で１６時間培養された。細胞を、３回の実験で、異なる用量の配列番号１、ならびにＴＬＲ－９の公知のアゴニストであるＣｐＧＯＤＮ－２００６の２０μｇ／ｍｌで、１６時間処理した。次にルシフェラーゼ活性を測定し分析した。

【0066】

図１に示すように、配列番号１は１００μＭの高濃度までアゴニスト活性を欠いていたが、１．０μＭ用量のＯＤＮ２００６はＴＬＲ－９誘導遺伝子活性化において７．５倍の増加をもたらした。

【0067】

次に、配列番号１を用量反応性阻害活性についてスクリーニングして、３回の実験で、７通りの異なる用量（０．１、１、５、１０、２５、５０および１００μＭ）でのＴＬＲ９媒介ＮＦ－κＢ誘導に対するＩＣ５０を決定した。簡単に説明すると、ＴＬＲ９／ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターＨＥＫ２９３細胞株を、９６ウェル白色固体プレートに、１ウェルあたり５×１０^４細胞で１６時間培養した。細胞は３回の実験で、異なる用量の配列番号１で１時間前処理した。次いで、細胞を２０μｇ／ｍｌのＣｐＧＯＤＮ２００６で処理してＴＬＲ９を活性化した。１６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し分析した。これらの結果を図２に示す。

【0068】

ＴＬＲ－９のアンタゴニストとしての配列番号１の活性は、ＩＣＡＭ－１発現の阻害よりも高い濃度を必要とする。浣腸製剤に使用された用量に関して、比較した用量反応を図３に示す。

【0069】

図３のデータから、ＩＢＤの治療に使用される配列番号１の治療用量（６５９μＭ）が両方の作用メカニズムに対して治療レベルの薬物を提供するのに十分であることが明らかである。

【0070】

アクチベーターＯＤＮ２００６の結合に対する配列番号１の直接の阻害効果を除外することもまた必要であった。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１プログラム（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いた２つの構造のスクリーニングは、アリカフォルセンがＯＤＮ２００６とよりもそれ自身と二量体を形成する可能性がエネルギー的に高いことを示した。この比較は図４に示される。

【0071】

図４のデータは、配列番号１がＯＤＮ２００６とヘテロ二量体よりもホモ二量体を形成する可能性が高いことを示している。さらなる実験では、活性化剤としてのE.coliゲノムＤＮＡの存在下で配列番号１のアンタゴニスト活性を試験した。このアッセイにおいて、配列番号１は、ＴＬＲ－９の活性化に対して拮抗的なままであった（図５）。

【0072】

例２：最適な二次構造の予測
図４に示すホモ二量体は、配列番号１について最もエネルギー的に好ましい二本鎖構造である。興味深いのは、この二次構造がＴＬＲ－９阻害活性に影響を及ぼし得るかどうか、そしてどの条件下で二本鎖が最も安定であるかであった。

【0073】

予測された二本鎖構造は、ＧＡミスマッチおよび他の２つのＧＣ対によりフランクされた４つのワトソン－クリック型結合によって安定化されている。ＣｐＧモチーフは、各二重鎖メンバーについて重ならない３’末端に拘束されないままである。

【0074】

したがって、配列番号１を円二色性（ＣＤ）分光法にかけて、可能性のある二次構造についての情報を集めた。ＤＮＡのＣＤは、二重鎖構造の３つの主要な形態（Ｂ、ＡおよびＺ）すべてを検出するために利用することができ、そして加熱のような構造を破壊する条件に敏感である。興味深いのは、生理学的温度以上で検出された二次構造の安定性であった。図６に示されるのは、４℃でのｄｄＨ２Ｏ中の試料の配列番号１のＣＤスペクトルである。このプロフィールは、Ｂ型ＤＮＡの二本鎖に特徴的な特徴、すなわち、約２８０ｎｍにおける特徴的な低強度のポジティブバンド、約２１０ｎｍおよび約２５５ｎｍにおける２つの低強度のネガティブバンド、および約１９０ｎｍにおけるポジティブな強いバンドを示す。

【0075】

１９０ｎｍのポジティブなバンドは４℃から２０℃の間の温度に敏感であることがわかった。さらに８０℃に加熱すると、信号強度の８５％を超える損失が示された。このバックグラウンドシグナルは４０℃で達成され、この構造がこれらの条件下で生理学的温度に対して安定であることはありそうもない。

【0076】

推定二本鎖のさらなる熱変性もまた、５０ｍＭおよび１５０ｍＭの濃度のＮａ＋の存在下で研究された。このＵＶ領域におけるＣＤスペクトルを妨げるＣｌ^－イオンとしてフッ化ナトリウムを使用した。

【0077】

図７（ａ）に見られるように、１９０ｎｍピークの強度は、５０および１５０ｍＭの両方のナトリウム条件下で加熱に対してより安定であり、その構造の少なくとも５０％を４０℃まで保持する。さらに、サンプルを２０℃に冷却すると、１９０ｎｍピークの強度は予熱レベルに戻った。これは、観察された二次構造が融解後に可逆的であることを意味する。

【0078】

加熱しても２１０ｎｍのネガティブなピークに有意な変化は検出されなかった。しかしながら、２２０ｎｍにおけるポジティブなピークは１９０ｎｍのピークのそれと同様に応答することが見出された。これらのデータを図７（ｂ）に示す。

【0079】

構造の安定性に対するＭｇ^＋＋およびポリアミンの影響を試験するために追加の実験を行った。驚くべきことに、５０ｍＭのＮａ^＋の存在下で５ｍＭのポリアミン、スペルミンは、二次構造を完全に無効にした（図８）。

【0080】

これは、各リン酸基（ホスホロチオエート）上のＯ－の代わりに２０個の硫黄置換を含む、配列番号１の改変リン酸骨格（altered phosphate backbone）の機能であり得る。

【0081】

実施例３：ＴＬＲ－９拮抗作用に対する構造変化の影響
配列番号１の二次構造を安定化および／または不安定化することが知られている処理の効果を試験するために、一連の実験で、配列番号１のＴＬＲ－９アンタゴニスト活性に対する熱、Ｎａ^＋、Ｍｇ^＋およびスペルミンの効果を調べた。これらのテストのサンプルと条件は、図９に示される。

【0082】

簡潔には、配列番号１のサンプルを、１５ｍＭＭｇ^＋＋または５ｍＭスペルミンのいずれかまたはＭｇ^＋＋とスペルミンの両方の存在下で、５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．２のトリス緩衝液に溶解した。１つのサンプルを室温に保ち、残りのサンプルを９０℃に３分間加熱した後、室温に冷却した。次いで、サンプルを指示された濃度に希釈し、標的細胞と共に１時間インキュベートし、そして１．０μＭのＯＤＮ２００６を添加してＴＬＲ－９を刺激した。実験結果を図１０に示す。

【0083】

図１０において、配列番号１の二次構造を変化させることが観察された条件は、ＴＬＲ－９の阻害剤としてのその活性にも影響を与えることが分かる。また、これらの条件は、それらが配列番号１の二次構造に影響を与える機会を有する加熱および冷却工程の間にも維持されたことにも留意されたい。しかしながら、一旦細胞培養培地に希釈されると、条件は培地の条件に変更され、そして温度は３７℃に戻るだろう。それ故、見られる差異は通常の生理学的条件下で安定である。

【0084】

試料を細胞とインキュベートしたときの条件のこの変更は、たとえプレインキュベーション条件が二本鎖の二次構造を除去したことをＣＤスペクトルが示しているとしても、いくらかの活性がスペルミン処理試料において依然として観察される理由であり得る。あるいは、スペルミンを用いて見られた結果は、非二本鎖分子（モノマー）のＴＬＲ－９阻害活性の保持を表し得る。

【0085】

実施例４：アリカフォルセンによる眼の炎症の治療
眼の炎症状態に対する配列番号１の効果を試験するために、スコポラミン投与によるドライアイのマウスモデルにおける２つの異なる濃度のアリカフォルセンの効果を調べた。

【0086】

ドライアイマウスマウスモデル
マウスのモデルでは、尾の中部への経皮スコポラミンパッチの貼付が、涙液生成を減少させる、したがって涙腺機能不全を模倣するために使用された。スコポラミンの機能は、涙腺におけるコリン作動性受容体の薬理学的遮断を誘発し、それゆえ房水生成（aqueous production）を減少させることである。乾燥は環境ストレスを加えることによって増幅され．。動物は低湿度環境と一定の気流にさらされる。

【0087】

実験方法
研究に使用された動物：
種：マウス。
種類：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（色素沈着）。
年齢：約６－７週間（導入の初日に）。
数／性別：５５匹のメス（研究用４０、予備１５）。

【0088】

研究を通して、動物は食物と水に自由にアクセスできた。標準的な乾燥ペレット飼料が与えられた。水道水はペットボトルから自由に摂取できた。

【0089】

この研究には４０匹の動物が含まれた。健康および均質な体重に基づいて動物を選択した。目に見える眼の欠陥（角膜混濁）のない健康な動物だけがこの研究に関わった。３日目の両眼からの角膜フルオレセイン染色スコアの平均に基づいて、エクセル（登録商標）ソフトウェアのマクロ機能を用いて動物を試験群に無作為に分けた。

【0090】

色素沈着したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、１５Ｌ／分前後の空気流を有するケージ内で、制御された環境室（およそ相対湿度＜２５％、温度２２℃±２℃）に暴露し、１１日間のスコポラミンの経皮投与（０．５ｍｇ／７２時間）することによってドライアイ症状を誘発した。

【0091】

スコポラミン投与
マウスを経皮スコポラミン投与（０．５ｍｇ／７２時間；ＳｃｏｐｏｄｅｒｍＴＴＳ（登録商標））で処置した。経皮スコポラミンパッチをマウスの尾の根の近くに巻き付け、セロハンテープで固定した。パッチは４８時間ごとに再適用された。

【0092】

投与経路とその正当性
マウスを１０匹の動物からなる４群に無作為に分けた。研究は、各群５匹の動物が代表される２つの実験セットに分けられた。全てのマウスを１日目に処置し、次いで以下の計画に従って合計１０日間処置した。

【0093】

－Ｏｐｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）グループ：３日目および１０日目に１日２回投与し、９日目に４日目に１日３回投与。
－アリカフォルセン（１０ｍＭおよび１ｍＭ）群：１日１回投与。
－ビヒクルグループ：１日１回投与。
マイクロピペットを使用して、全ての試験用物質、対照用物質および比較用物質を両眼に注入した（投与当たり５μＬ）。

【0094】

４群の各動物について、それぞれフェノールレッドスレッド（phenol red thread：ＰRＴ）および角膜蛍光染色（corneal fluorescence staining：ＣＦＳ）を用いて、３、６および１０日目に、涙液産生および角膜欠損をベースラインで評価した。

【0095】

一般的な臨床徴候
体重：全ての動物の体重を記録した。
全体的な見かけ：毎日、一般的な臨床徴候および全ての動物の外観が観察された。
眼科検査：２種類の眼科検査が実施された。

【0096】

Ａ）水性涙液生成ＰＲＴ試験の測定
試験の３日目の投与前および、試験の他の日での２回目の処置の少なくとも１時間後に、涙の産生を両眼のＰＲＴ試験（Ｚｏｎｅ－Ｑｕｉｃｋ、ＦＣＩ－Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ）で測定した。糸を外側結膜円蓋の外側角に３０秒間置いた。涙で濡れた糸は赤くなり、水性涙液の生成を示した。このデータはミリメートル単位で表した。

【0097】

Ｂ）角膜蛍光染色（ＣＦＳ）
異なる時点で、試験の３日目の投与前および、試験の他の日での２回目の処置の少なくとも１時間後に測定を実施した。０．５％フルオレセイン点眼（０．５μＬ）点眼後、青色光を用いた細隙灯観察によって全群の動物の眼を調べた。点状染色は、角膜が分割された５つの領域の各々に０から３のスコアを与える標準化された国立眼科研究所（ＮＥＩ）等級付けシステムを用いて記録された。

【0098】

結果：
動物の行動と体重
ドライアイの状態のため、０日目から１０日目までの間に全群の大部分の動物でわずかな体重減少が観察された。
アリカフォルセン（１０ｍＭおよび１ｍＭ）、ビヒクル、およびＯｐｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）は動物の行動に影響を及ぼさなかった。

【0099】

ＰＲＴテスト：
３日目に、全ての群について涙液産生量が減少した。未処置群の値は１０日目まで安定していた。これらのデータはこのマウスモデルにおいてドライアイの良好な誘発を示した。

【0100】

ＣＦＳテスト
ＣＦＳからの結果は、以下の表１および図１１に要約されている。

【0101】

【表1】

【0102】

ビヒクル群は３日目から１０日目までドライアイ症状を示し、この試験が有効であることを示した。

【0103】

ＣＦＳスコア：
Ｏｐｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）で処置した群は、６日目（ｐ＝０．００２１）および１０日目（ｐ＝０．００２０）において、ビヒクル群よりも低い角膜蛍光染色スコアを示した。

【0104】

アリカフォルセン（１ｍＭおよび１０ｍＭ）で処置した群は、６日目にビヒクル群と同様の角膜蛍光染色スコアを有した。アリカフォルセン（１ｍＭおよび１０ｍＭ）で処置した群は１０日目にビヒクル群よりも低い角膜蛍光染色スコアを示し、そしてアリカフォルセン（１ｍＭ）で処置した群はビヒクルと比較して有意差（ｐ＝０．０４２９）を示した。
これらの実験条件下で、アリカフォルセンの複数回局所投与（１ｍＭおよび１０ｍＭ）は臨床的に十分に許容された。
ビヒクル群は３日目から１０日目までドライアイ症状を示し、この試験が有効であることを示した。
０．２％Ｏｐｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）とアリカフォルセン（１ｍＭ）の群は、角膜蛍光染色により測定された時にドライアイ症状の統計的に有意な減少を示した

【0105】

実施例５：アリカフォルセンによる喘息の治療
喘息、オボアルブミンなどの症状に対するアリカフォルセンの効果をテストするために、（ＯＶＡ）誘発アレルギー性喘息マウスモデルを、アリカフォルセンで治療した。

【0106】

方法：
アレルギー性喘息は、ＯＶＡに対する最初の感作とそれに続く精製ＯＶＡのその後の鼻腔内攻撃によって、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてモデル化された。

【0107】

体重の変化および一般的な病気の徴候についてマウスを試験を通してモニターした。炎症性細胞流入および炎症性サイトカインＩＬ－１３の存在について気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を調べることによって、ＯＶＡに対するアレルギー反応を測定した。

【0108】

さらに、実験群の動物は、鼻腔内（ＩＮ）でのアリカフォルセン、１ｍＭの投与濃度の対照用ビヒクル（ＰＢＳ）、または陽性の抗炎症対照としての腹腔内（ＩＰ）デキサメタゾンの(dexamethasone)いずれかの投与で処置した。

【0109】

試験材料
試験アイテム
以下の表２および３は、試験中に使用された試験アイテムおよび試験材料を詳述する。

【0110】

【表2】

【0111】

【表3】

【0112】

１ｍＭの濃度のアリカフォルセンの投与量は、０．８７８薬物含有率および６７９５．９ｇ／ｍｏｌのＭＷに基づいて調製された。研究の間、調製した溶液を２－８℃で保存した。

【0113】

１ｍＬのデキサメタゾンストック溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を３ｍＬの生理食塩水に添加して１ｍｇ／ｍＬの溶液濃度とした。

【0114】

ＯＶＡ／水酸化アルミニウム感作：
鶏卵ＯＶＡアルブミン（ＯＶＡ）をＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ溶液を水酸化アルミニウムアジュバントで１：１に希釈し、使用するまで２－８℃で一晩保存した。最終投与濃度は、２００μＬのＯＶＡ／水酸化アルミニウム混合物あたり１００μｇのＯＶＡであった。

【0115】

攻撃のためのＯＶＡ：
１ｍｇの滅菌ＰＢＳを１０ｍｇのＯＶＡに添加して１０ｍｇ／ｍＬの溶液濃度とした。０．３５ｍＬのＯＶＡ原液を１．７５ｍＬのＰＢＳに添加して１．６７ｍｇ／ｍＬの溶液濃度とした。最終投与濃度＝３０μＬ中５０ｇのＯＶＡ。

【0116】

研究に使用された動物：
テストグループ

【0117】

【表4】

【0118】

以下の表４は、研究に用いた実験群を列挙している。

【0119】

【表5】

【0120】

疾患の誘導（グループ２－６）：
ＯＶＡ感作：
０日目および１４日目に、各動物に、１００μｇのＯＶＡを含有する２００μＬのＯＶＡ／Ａｌｍ（水酸化アルミニウム）乳剤のＩＰ注射を投与した。

【0121】

ＯＶＡ攻撃：
１４日目および２５から２７日目に、各動物に、５０μｇのＯＶＡを含有する３０μＬのＰＢＳの鼻腔内攻撃を投与した。

【0122】

試験アイテムによる治療
アリカフォルセンを１ｍＭの濃度で鼻腔内（ＩＮ）に３０μＬ投与した。処置は、試験日１４日目および２５から２７日目のＯＶＡ攻撃と同じ日に行われた（合計４処置）。処置は、ＯＶＡ攻撃の１時間後に投与した。

【0123】

ポジティブコントロール処置：
１０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを、試験日４日目および２５から２７日目に２００μＬ体積／動物（腹腔内）で投与した（合計４回の処置）。

【0124】

観察と検査
臨床徴候：
注意深い検査は毎日行われた。皮膚、毛皮、目、粘膜、分泌物および排泄物の発生、ならびに自律神経活動の変化に関する観察が行われた。歩行、姿勢、および取扱いに対する反応、または奇妙な行動、振戦、痙攣、睡眠および昏睡の存在における有意な変化が記録された。

【0125】

体重：
動物の体重を試験開始直前およびその後週２回測定した。

【0126】

終了、組織サンプリングおよびその後の分析：
２８日目に、すべてのマウスをデタミン＋キシラジン過量投与および放血により安楽死させた。

【0127】

ＢＡＬＦの収集と分析
安楽死させた動物に気管支肺胞洗浄を行った。簡単に説明すると、血管カテーテルを気管内に配置した。１ｍｌのＰＢＳを肺に注入し、シリンジに戻した。次いでＰＢＳを滴下し、そして再び回収した。得られた気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を５００×ｇで５分間遠心分離した。

【0128】

ＢＡＬＦの非細胞部分を－８０℃で保存した。ＩＬ－１３のレベルはＬｕｍｉｎｅｘ技術によって分析した。
ＢＡＬＦの細胞部分を用いて細胞流入を分析した。ＢＡＬＦ内の白血球の総数および存在する異なる細胞型をフローサイトメトリーによって調べた。
顆粒球：ＣＤ４５^＋；非自家蛍光：Ｇｒ－１^＋
好酸球：ＣＤ４５^＋：非自家蛍光；Ｇｒ－１^＋；シグレックＦ^＋

【0129】

結果：
未感作マウス（naive mice）と比較した場合、感作され、ＯＶＡタンパク質で攻撃された動物は、実験の終了時に、有意に増加した総白血球、顆粒球および好酸球の肺胞流入を含む疾患の徴候を示した。さらに、罹患動物は、ＢＡＬＦ中の有意に増加したＩＬ－１３レベルを示した。

【0130】

陽性対照デキサメタゾンによる治療は、ＢＡＬＦ中の顆粒球および好酸球数ならびにＩＬ－１３レベルを有意に減少させ、これはＯＶＡに対するアレルギー反応の減少を示している。

【0131】

アリカフォルセン（１ｍＭ）の鼻腔内投与は、ＢＡＬＦ中の有意に低いレベルの総白血球（ＣＤ４５＋細胞）をもたらし、そして好酸球の割合を有意に減少させた。ビヒクル群と比較して、１ｍＭのアリカフォルセン処置群において総顆粒球頻度の有意な減少もまたあった。さらに、１ｍＭのアリカフォルセンによる処理は、ＢＡＬＦ中のＩＬ－１３レベルを有意に低下させた。これらのデータは、ＯＶＡに対するアレルギー反応の減少を示した。

【0132】

結果を図１２および以下の表５に示す。結果は、アレルギー性喘息のマウスモデルに対するアリカフォルセンの抗炎症効果を実証している。

【0133】

【表6】