特開 2023-93773 培養容器、培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023093773

(43)【公開日】2023-07-04

(54)【発明の名称】培養容器、培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230627BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20230627BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 D

C12N5/077

C12N5/07

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023076880

(22)【出願日】2023-05-08

(62)【分割の表示】P 2021527743の分割

【原出願日】2020-06-25

(31)【優先権主張番号】P 2019121816

(32)【優先日】2019-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000006633

【氏名又は名称】京セラ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(71)【出願人】

【識別番号】508253111

【氏名又は名称】株式会社オーガンテック

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100132045

【弁理士】

【氏名又は名称】坪内 伸

(74)【代理人】

【識別番号】100154003

【弁理士】

【氏名又は名称】片岡 憲一郎

(72)【発明者】

【氏名】森 悠

(72)【発明者】

【氏名】岸本 恭介

(72)【発明者】

【氏名】坂井 久

(72)【発明者】

【氏名】上野 涼

(72)【発明者】

【氏名】辻 孝

(72)【発明者】

【氏名】岡本 尚一

(72)【発明者】

【氏名】小川 美帆

(57)【要約】

【課題】再生毛包原基を簡便に又は安定して製造することが可能な培養容器及びその培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法を提供することである。
【解決手段】第１側壁部１１と、下方に向かって径が小さくなる第１底部１２とを有する第１凹部１０と、第２側壁部２１と、下方に向かって径が小さくなる第２底部２２とを有し、第１凹部１０の第１底部１２に開口した第２凹部２０と、を備え、第１底部１２の開き角度は、第２側壁部２１の開き角度よりも大きい培養容器１及び上記培養容器の第２凹部２０内で上皮性細胞３２ａを含む細胞集団を凝集させる工程と、第２凹部２０内で間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程と、第２凹部２０にガイド糸３１を挿入する工程と、培養支持体を使用せずに凝集させた上皮性細胞３２ａを含む細胞集団と凝集させた間葉性細胞３２ｂを接触させながら培養する工程とを含む、再生毛包原基の製造方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガイド糸を付するための培養容器であって、
第１側壁部と、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する第１底部とを有する第１凹部と、
第２側壁部と、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する第２底部とを有し、前記第１凹部の前記第１底部に開口した第２凹部と、を備え、
前記第１底部の開き角度は、前記第２側壁部の開き角度よりも大きい、培養容器。

【請求項2】

請求項１に記載の培養容器であって、
前記第１底部の開き角度は、３０°以上及び９０°以下である、培養容器。

【請求項3】

請求項１または２に記載の培養容器であって、
前記第２側壁部の開き角度は、０°以上及び３０°以下である、培養容器。

【請求項4】

請求項１～３のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２側壁部は、前記第１底部から下方に延びている、培養容器。

【請求項5】

請求項１～４のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第１底部の開き角度は、前記第１側壁部の開き角度よりも大きい、培養容器。

【請求項6】

請求項１～５のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第１側壁部の開き角度は、０°以上及び１０°以下である、培養容器。

【請求項7】

請求項１～６のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２底部の開き角度は、前記第２側壁部の開き角度よりも大きい、培養容器。

【請求項8】

請求項１～７のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２底部の開き角度は、６０°以上及び１７０°以下である、培養容器。

【請求項9】

請求項１～８のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２凹部は、前記開口を上面視したときに前記開口の中央部に、前記第２底部の頂点を有する、培養容器。

【請求項10】

請求項１～９のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２底部は前記第２側壁部から下方に延びている、培養容器。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれかに記載の培養容器であって、
前記第２底部の表面粗さは前記第２側壁部よりも大きい、培養容器。

【請求項12】

再生毛包原基の製造方法であって、
請求項１～１１のいずれかに記載の前記培養容器の前記第２凹部内で上皮性細胞を含む細胞集団を凝集させる工程と、
前記第２凹部内で間葉性細胞を含む細胞集団を凝集させる工程と、
前記第２凹部に前記ガイド糸を挿入する工程と、
培養支持体を使用せずに凝集させた上皮性細胞を含む細胞集団と凝集させた間葉性細胞を接触させながら培養する工程と、を含む、再生毛包原基の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、２０１９年６月２８日に出願された日本国特許出願２０１９－１２１８１６号の優先権を主張するものであり、この先の出願の開示全体をここに参照のために取り込む。

【技術分野】

【0002】

本開示は、培養容器、培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法に関する。

【背景技術】

【0003】

男性型脱毛症（ＡＧＡ）をはじめ、先天性脱毛、瘢痕（はんこん）、熱傷性脱毛、女性の休止期脱毛などの脱毛症の治療方法として、患者の正常な頭皮から摂取した少量の毛包器官から上皮性幹細胞と間葉性幹細胞とを分離し、これらの幹細胞からなる細胞集団を凝集させたものにガイド糸を挿入して再生毛包原基を製造し、この再生毛包原基を患者の脱毛症部位に移植するようにした治療方法が知られている（例えば特許文献１参照）。

【0004】

このような毛包再生治療によれば、毛包器官から分離した上皮性幹細胞と間葉性幹細胞とを培養することで少量の検体から大量の再生毛包原基を製造することができるので、侵襲性を高めることなく、患者の頭皮の毛髪（毛包）の総数を増加させることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１２／１０８０６９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示の実施形態に係る培養容器は、ガイド糸を付するための培養容器であって、第１側壁部と、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する第１底部とを有する第１凹部と、第２側壁部と、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する第２底部とを有し、前記第１凹部の前記第１底部に開口した第２凹部と、を備え、前記第１底部の開き角度は、前記第２側壁部の開き角度よりも大きい、培養容器、である。

【0007】

また、本開示の実施形態に係る再生毛包原基の製造方法は、本開示に係る何れかの前記培養容器の前記第２凹部内で上皮性細胞を含む細胞集団を凝集させる工程と、前記第２凹部内で間葉性細胞を含む細胞集団を凝集させる工程と、前記第２凹部に前記ガイド糸を挿入する工程と、培養支持体を使用せずに凝集させた上皮性細胞を含む細胞集団と凝集させた間葉性細胞を接触させながら培養する工程と、を含む、再生毛包原基の製造方法、である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本開示の一実施の形態に係る培養容器の縦断面図である。

【図2】図１に示す培養容器の平面図である。

【図3】図１に示す培養容器の第２凹部の部分の拡大断面図である。

【図4A】図１に示す培養容器により再生毛包原基を培養している様子を模式的に示す図である。

【図4B】図４Ａにおけるガイド糸の先端部分の拡大図である。

【図5】変形例の第２凹部の拡大断面図である。

【図6A】本開示の一実施の形態に係る再生毛包原基の製造方法により再生毛包原基を製造する手順を示す説明図である。

【図6B】本開示の一実施の形態に係る再生毛包原基の製造方法により再生毛包原基を製造する手順を示す説明図である。

【図6C】本開示の一実施の形態に係る再生毛包原基の製造方法により再生毛包原基を製造する手順を示す説明図である。

【図7】実施例で使用した培養容器の、第２凹部の穴径と深さの表を示す図である。

【図8】実施例の培養容器で製造したマウス再生毛包原基の代表的な写真と、再生毛包原基の形成率と、を示す図である。

【図9】Ｎｏ．３の培養容器を用いて製造した代表的なマウス再生毛包原基の写真と、再生毛包原基を移植した後の発毛した写真と、を示す図である。

【図10】Ｎｏ．４の培養容器を用いて製造した代表的なマウス再生毛包原基の写真と、再生毛包原基を移植した後の発毛した写真と、を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

従来では、毛包器官から分離した上皮性幹細胞と間葉性幹細胞との細胞集団を凝集させて高密度、区画化した後、当該細胞集団にガイド糸を挿入してガイド糸付きの再生毛包原基を製造するようにしている。しかしながら、従来は、人の手作業で再生毛包原基を製造していたため、再生毛包原基の仕上がりのバラつきが大きく、また、製造に時間がかかっていた。

【0010】

本開示の目的は、再生毛包原基を簡便に又は安定して製造することが可能な培養容器及びその培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法を提供することにある。

【0011】

本開示の実施形態によれば、再生毛包原基を簡便に又は安定して製造することが可能な培養容器及びその培養容器を使用した再生毛包原基の製造方法を提供することができる。

【0012】

以下、図面を参照しつつ、本開示の一実施の形態に係る培養容器及び再生毛包原基の製造方法を詳細に例示説明する。

【0013】

なお、本明細書、特許請求の範囲において、上下方向は、培養容器を図１に示す正立姿勢とした状態における上下方向を意味するものとする。

【0014】

図１～図３に示すように、本実施の形態に係る培養容器１は、第１凹部１０と第２凹部２０とを備えている。第１凹部１０と第２凹部２０は、それぞれ培養容器１の収納空間２を構成している。

【0015】

収納空間２は、例えば、培養容器１（第１凹部１０）の上方を向く開口に着脱自在に装着される蓋体などの閉塞部材により液密に閉塞される構成とすることができる。

【0016】

第１凹部１０は第１側壁部１１と第１底部１２とを備えている。第１側壁部１１は円筒状の形状を有し、上下方向の各部位において径（内径）は一定となっている。第１底部１２は、下方に向かって径（内径）が小さくなるように傾斜する円錐台状の形状を有し、第１側壁部１１の下端に一体に接続している。第１底部１２の上下方向の長さは、第１側壁部１１の上下方向の長さよりも長くなっている。なお、第１側壁部１１も傾斜してもよい。

【0017】

第１凹部１０の上下方向の長さ（深さ）は７～１１ｍｍとすることができ、第１側壁部１１の上下方向の長さ（深さ）は４～６ｍｍとすることができ、第１底部１２の上下方向の長さ（深さ）は３～５ｍｍとすることができる。本実施の形態では、第１凹部１０の上下方向の長さ（深さ）は９ｍｍであり、第１側壁部１１の上下方向の長さ（深さ）は５．１ｍｍであり、第１底部１２の上下方向の長さ（深さ）は３．９ｍｍである。また、第１側壁部１１の直径は４．０～５．５ｍｍとすることができ、本実施の形態では４．９ｍｍである。また、第１底部１２の開き角度θ１は３０～９０°とすることができ、第１側壁部１１の開き角度θ２は０～１０°とすることができる。本実施の形態では、第１底部１２の開き角度θ１は６０°であり、第１側壁部１１の開き角度θ２は４°である。

【0018】

本実施の形態では、第１凹部１０は第１側壁部１１を備えた構成とされているが、第１底部１２が下方に向かって径が小さくなるように傾斜している構成の場合には、第１側壁部１１を備えない構成とすることもできる。また、本実施の形態では、第１底部１２は下方に向かって径が一定の割合で直線的に小さくなる円錐台状の形状とされているが、これに限らず、例えば下方に向かって徐々に径が小さくなる凸状または凹状の湾曲面形状とするなど、その形状は種々変更可能である。特に、第１凹部１０が第１側壁部１１を備えた構成の場合には、第１底部１２は上下方向に対して垂直な平面形状とすることもできる。

【0019】

第２凹部２０は第２側壁部２１と第２底部２２とを備えている。第２凹部２０は第１凹部１０の下方に設けられ、第２側壁部２１において第１凹部１０の第１底部１２の中央部に開口している。第２凹部２０の上下方向の長さ（深さ）は、第１凹部１０の上下方向の長さ（深さ）よりも短く（浅く）なっている。

【0020】

第２側壁部２１は上下方向の各部位において径（内径）が一定の円筒状の形状を有し、第１底部１２への開口２３は円形となっている。また、第２側壁部２１は、その上下方向の長さＡが開口２３の径（直径）Ｂよりも長い縦長の形状となっている。

【0021】

第２底部２２は、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する円錐状の形状を有し、第２側壁部２１の下端に一体に接続している。第２底部２２の頂点２４は、第２凹部２０の開口２３を上面視（平面視）したときに第２底部２２の中央部に位置している。第２側壁部２１と第２底部２２とが接続した接続部２５は円形であり、接続部２５の径（直径）Ｂは開口２３の径（直径）と同一となっている。

【0022】

第２底部２２の上下方向の長さ、すなわち第２底部２２の深さＣは、接続部２５の径（直径）Ｂよりも小さいのが好ましい。

【0023】

また、第２底部２２の深さＣは、第２側壁部２１の上下方向の長さＡよりも小さいのが好ましい。

【0024】

さらに、第２底部２２の表面粗さは、第２側壁部２１の表面粗さよりも大きいのが好ましい。

【0025】

第２凹部２０の上下方向の長さ（深さ）は０．５６～１．７０ｍｍとすることができ、第２側壁部２１の上下方向の長さ（深さ）は０．５～１．５ｍｍとすることができ、第２底部２２の上下方向の長さ（深さ）は０．０６～０．２０ｍｍとすることができる。本実施の形態では、第２凹部２０の上下方向の長さ（深さ）は１．０ｍｍであり、第２側壁部２１の上下方向の長さ（深さ）は０．９ｍｍであり、第２底部２２の上下方向の長さ（深さ）は０．０９ｍｍである。また、第２側壁部２１すなわち接続部２５の径Ｂは０．３～１．０ｍｍとすることができ、本実施の形態では０．４２ｍｍである。また、第２底部２２の開き角度θ３は６０～１７０°とすることができる。本実施の形態では、第２底部２２の開き角度θ３は１２０°である。

【0026】

図４に示すように、培養容器１は、収納空間２において再生毛包原基３０を培養することができる。再生毛包原基３０は、ガイド糸３１と、ガイド糸３１の先端部に位置した複数の細胞３２と、を有するものである。

【0027】

上記の再生毛包原基３０において、ガイド糸３１は、例えばナイロン等のポリマー、ステンレス等の金属、炭素繊維、ガラス繊維等の化学繊維などにより糸状（繊維状）に形成されたものとすることができる。本実施の形態では、ガイド糸３１はナイロン製である。ガイド糸３１としては、第２凹部２０の第２側壁部２１の直径（接続部２５の径Ｂ）よりも細く、且つ、第２凹部２０の上下方向の長さよりも長さが長いものが用いられる。

【0028】

ガイド糸３１の長さは３～１０ｍｍとすることができ、ガイド糸３１の直径は０．０２～１．２０ｍｍとすることができる。本実施の形態では、ガイド糸３１の長さは５ｍｍ、ガイド糸３１の直径は０．５ｍｍである。

【0029】

上記の再生毛包原基３０において、複数の細胞３２は、例えば、複数の上皮性細胞３２ａ（図４中においてクロスハッチングを付して示す。）を含む細胞集団と、複数の間葉性細胞３２ｂ（図４中においてハッチングを付して示す。）を含む細胞集団とで構成されたものとすることができる。この場合、複数の上皮性細胞３２ａを含む細胞集団よりもガイド糸３１の先端３１ａの側（第２底部２２の側）に複数の間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団が配置されるのが好ましい。

【0030】

「上皮性細胞」とは、上皮組織から採取した細胞及び採取した細胞を培養して得られる細胞を意味し、例えば毛包由来バルジ領域の外毛根鞘の最外層から採取した細胞（バルジ領域由来の上皮性細胞）、成体又は胎児皮膚の表皮から採取した細胞、多能性幹細胞から誘導した上皮性細胞、毛包、皮膚を構成する上皮性幹細胞に分化する可能性がある上皮性前駆細胞やそれらの幹細胞などを挙げることができる。

【0031】

「間葉性細胞」とは、間葉組織から採取した細胞及び採取した細胞を培養して得られる細胞を意味し、例えば、毛乳頭由来の細胞（例えば、毛乳頭細胞）、毛母細胞、毛根鞘細胞、内毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞（最外層の細胞を除く）、成体又は胎児皮膚間葉性細胞、多能性幹細胞から誘導した毛包間葉性細胞、血液細胞を含まない骨髄細胞、骨髄由来の間葉性細胞、顎骨内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉性細胞またはこれらの細胞に分化する可能性がある間葉性前駆細胞や幹細胞等を挙げることができる。

【0032】

「多能性幹細胞」とは、生体の様々な組織に分化する能力を有する細胞を意味し、例えば、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ｎｔＥＳ細胞 （ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）、ＧＳ細胞（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）が挙げられる、

【0033】

再生毛包原基を作製するために使用する上皮性細胞及び間葉性細胞は、哺乳動物のヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコなど種々の動物等から採取することができる。

【0034】

毛包、皮膚などの組織から外科的に採取又はディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン等の酵素を反応させることにより、上皮組織及び間葉組織に分離させ、分離させた上皮組織又は間葉組織とディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン等の酵素とを反応させることにより、上皮性細胞又は間葉性細胞を採取することができる。酵素の反応時間は組織の大きさ、組織を構成する細胞の性質（例えば、細胞間結合に関与するタンパク質や細胞間結合の強度等）等によって適宜変更する。また、上皮組織及び間葉組織との分離又は上皮組織や間葉組織から上皮性細胞又は間葉性細胞を採取するために反応させる酵素は２種類以上混合させてもよい。

【0035】

「細胞集団」とは細胞が液内で分散している状態である細胞懸濁液を意味し、採取した上皮性細胞又は間葉性細胞又はこれらの細胞を培養した細胞に当該細胞を培養できる培地を添加し、混合により分散させることによって調製できる。

【0036】

大量の上皮性細胞又は間葉性細胞を得るために当該細胞を培養することができる。当該細胞を培養する場合、培養に用いられる培地としては、動物細胞の培養に用いられる基礎培地でよく、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）やＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地などを挙げることができる。また、上皮性細胞又は間葉性細胞を効率的に増殖させるために血清やＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等の細胞増殖因子を添加することができる。また、細胞の機能を維持するための添加剤としてＹ２７６３２、Ｎｏｇｇｉｎ又はＳＡＧなどを添加してもよく、ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎやＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ等の抗生物質を必要に応じて添加してもよい。上皮性細胞又は間葉性細胞の性質によって基礎培地、血清、細胞増殖因子、添加剤を適宜変更する。細胞の培養条件は細胞が増殖できる環境でよく、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。

【0037】

複数の上皮性細胞３２ａを含む細胞集団としては、バルジ領域上皮由来の細胞を含む細胞集団を用いるのが好ましい。また、複数の間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団としては、毛乳頭由来の細胞を含む細胞集団を用いるのが好ましい。

【0038】

上記構成の再生毛包原基３０は、ガイド糸３１の先端部に複数の細胞３２を位置させた構成を有するので、頭皮に設けた切開部分を通して頭皮の内部に複数の細胞３２を移植する際に、ピンセットによりガイド糸３１を掴むことができるので、移植時における取り扱いが容易である。また、頭皮の外部にガイド糸３１を突出させるように複数の細胞３２を頭皮に移植することにより、複数の細胞３２を複数の上皮性細胞３２ａを含む細胞集団と、複数の間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団とで構成されたものとした場合に、上皮性細胞３２ａを含む細胞集団を頭皮の表面側に、間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を頭皮の内部側に位置するように複数の細胞３２を容易に移植することができる。さらに、ガイド糸３１は、移植後の頭皮皮膚組織の上皮性細胞と再生毛包原基３０を構成する上皮性細胞３２ａとの連続性を向上させることにより、発毛作用を促進する。

【0039】

本実施の形態の培養容器１を用いて再生毛包原基３０を培養する際には、収納空間２は培養液４０で満たされ、複数の細胞３２は第２凹部２０の内部に収容され、ガイド糸３１は下方側を向く先端３１ａにおいて第２底部２２に接し、上方側を向く他端側の部分は複数の細胞３２から上方に突出する。

【0040】

ここで、本実施の形態の培養容器１では、第２凹部２０の第２底部２２は、収納空間２に収納された再生毛包原基３０のガイド糸３１を、開口２３を上面視（平面視）したときに開口２３の中央部に位置決め可能な構成となっている。すなわち、第２底部２２は、再生毛包原基３０が収納空間２に収納されたときに、再生毛包原基３０のガイド糸３１を第２凹部２０の軸心に沿って配置されるように位置決めやすくすることができる。

【0041】

本実施の形態では、第２底部２２は、下方に向かって径が小さくなるように傾斜する円錐状の形状を有し、上面視において中央部に位置する頂点２４が下方に向けて最も深く凹んだ形状となっている。したがって、培養容器１の収納空間２に再生毛包原基３０を収納したときに、ガイド糸３１の先端３１ａの、頂点２４から径方向への移動を低減して、開口２３を上面視したときに開口２３の中央部に位置するようにガイド糸３１を位置決めしやすくすることができる。

【0042】

このように、本実施の形態の培養容器１では、第２凹部２０は、開口２３を上面視したときに開口２３の中央部にガイド糸３１を位置決め可能な、第２底部２２を有しているので、ガイド糸３１と、ガイド糸３１の先端部に位置した複数の細胞３２と、を有する再生毛包原基３０を収納空間２で培養する際に、当該ガイド糸３１を第２凹部２０の中央部に位置決めすることができる。これにより、ガイド糸３１を第２凹部２０の軸心に沿って配置することができるので、再生毛包原基３０を簡便に又は安定して製造することができる。

【0043】

また、本実施の形態の培養容器１では、第２底部２２を下方に向かって径が小さくなるように傾斜した構成としたので、ガイド糸３１を第２凹部２０の内部に挿入したときに、ガイド糸３１の先端３１ａが第２底部２２の傾斜に沿って第２底部２２の中央部に案内されるようにして、ガイド糸３１をより容易に開口２３の中央部に位置決めすることができる。

【0044】

特に、本実施の形態のように、第２底部２２を円錐状の形状とした場合には、ガイド糸３１を第２凹部２０の内部に挿入したときに、ガイド糸３１の先端３１ａが頂点２４により案内されるようにして、ガイド糸３１を開口２３の中央部に位置決めすることができる。

【0045】

本実施の形態では、第２凹部２０は第２側壁部２１を備えているが、第２底部２２が下方に向かって径が小さくなるように傾斜している構成の場合には、第２側壁部２１を備えない構成とすることもできる。また、本実施の形態では、第２底部２２は、下方に向かって径が小さくなる円錐状の形状とされているが、これに限らず、開口２３を上面視したときに開口２３の中央部にガイド糸３１を位置決め可能であれば、例えば下方に向かって徐々に径が小さくなる凸状または凹状の湾曲面形状とするなど、その形状は種々変更可能である。

【0046】

本実施の形態では、第１底部１２を下方に向かって径が小さくなるように傾斜した構成としたので、再生毛包原基３０を収納空間２に収納する際に、ガイド糸３１の先端３１ａ及び複数の細胞３２が第１底部１２に沿って第２凹部２０に案内されるようにして、ガイド糸３１の先端３１ａ及び複数の細胞３２を第２凹部２０に容易に収納させることができる。

【0047】

上記構成の培養容器１は、例えばポリスチレン製とすることができる。この場合、培養容器１は、ポリスチレンの塊を切削加工して形成されたものとしてもよく、成形型を用いてポリスチレンを射出成形して形成されたものとしてもよい。成形型を用いてポリスチレンを射出成形して培養容器１を製造する場合には、培養容器１の量産が容易である。

【0048】

なお、培養容器１は、ポリスチレン製に限らず、例えば、テフロン（登録商標）、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アクリル、ＰＦＡなどの他の樹脂材料で形成されたものとすることができ、また、ガラス等の他の材質で形成されたものとすることもできる。

【0049】

上記構成の培養容器１では、第２凹部２０は、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが開口２３の径Ｂよりも長い形状となっているので、第２凹部２０で培養される複数の細胞３２は発毛に適した形状となるように培養することができる。なお、第２凹部２０は、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが開口２３の径Ｂと同一の長さとなる形状としてもよく、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが開口２３の径Ｂよりも短い形状としてもよい。

【0050】

また、上記構成の培養容器１では、第２凹部２０は、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが第２底部２２の深さＣよりも長い形状となっているので、第２凹部２０で培養される複数の細胞３２を、ガイド糸３１の先端３１ａの側となる底部が丸みを帯びた発毛に適した形状となるように培養することができる。なお、第２凹部２０は、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが第２底部２２の深さＣと同一の長さとなる形状としてもよく、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが第２底部２２の深さＣよりも短い形状としてもよい。

【0051】

さらに、上記構成の培養容器１では、第２凹部２０は、第２底部２２の深さＣが接続部２５の径Ｂよりも小さい形状となっているので、第２凹部２０で培養される複数の細胞３２を、安定して、ガイド糸３１の先端３１ａの側となる底部が丸みを帯びた発毛に適した形状となるように培養することができる。なお、第２凹部２０は、第２底部２２の深さＣが接続部２５の径Ｂと同一の長さとなる形状としてもよく、第２底部２２の深さＣが接続部２５の径Ｂよりも大きい形状としてもよい。

【0052】

さらに、上記構成の培養容器１では、第２底部２２の表面粗さは、第２側壁部２１の表面粗さよりも大きくされているので、第２凹部２０で培養される複数の細胞３２を、安定して、培養することができる。なお、第２凹部２０は、第２底部２２の表面粗さが第２側壁部２１の表面粗さと同一となる構成としてもよく、第２底部２２の表面粗さが第２側壁部２１の表面粗さよりも小さくされた構成としてもよい。

【0053】

上記構成の培養容器１では、第１凹部１０及び第２凹部２０が再生毛包原基３０の製造に適した形状となっているので、複数の細胞３２が発毛に適した形状の再生毛包原基３０を製造することができる。

【0054】

図５は、変形例の第２凹部２０の拡大断面図である。

【0055】

図５に示すように、第２凹部２０は、第２側壁部２１が下方に向かって径が小さくなるように傾斜した構成とすることもできる。この場合、培養容器１は、第１底部１２、第２側壁部２１及び第２底部２２が、それぞれ上下方向に対して傾斜した構成となり、第１底部１２及び第２底部２２の上下方向に対する角度は、第２側壁部２１の上下方向に対する角度よりも大きくなっている。なお、第２側壁部２１の開き角度θ４は０～３０°とすることができる。本実施の形態では、第２側壁部２１の開き角度θ４は２°である。

【0056】

このような構成により、ガイド糸３１の先端３１ａ及び複数の細胞３２が下方に向かって径が小さくなるように傾斜した第１底部１２に沿って第２凹部２０にまで案内されるとともに、下方に向かって径が小さくなるように傾斜した第２側壁部２１に沿って第２底部２２にまで案内されるようにして、ガイド糸３１の先端３１ａを第２底部２２の中央部に容易に位置決めさせるとともに複数の細胞３２を第２凹部２０の内部に容易に収納させることができる。

【0057】

次に、図６を参照しつつ本実施の形態の培養容器１を用いて再生毛包原基３０を製造する方法について説明する。

【0058】

本実施の形態の再生毛包原基の製造方法では、まず、培養容器１の第２凹部２０内で間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程を行う。当該工程においては、間葉性細胞を複数含む細胞懸濁液５０（細胞密度：１ｘ１０^５個～２ｘ１０^６個／ｍＬ）を培養容器１の収納空間２に適量充填し（１０～１００μＬ）、遠心により（５００～７００ｘｇで1～１０分間）、複数の間葉性細胞３２ｂを第２凹部２０の第２底部２２の側に凝集させる（細胞数：１ｘ１０^３～２ｘ１０^５個）。なお、当該工程において、添加する細胞懸濁液量は容器から溢れない量であればよく、また、遠心条件においても細胞の機能障害が生じない条件であればよい。これにより、図６Ａに示すように、第２凹部２０の内部に第２底部２２に隣接させて複数の間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる。

【0059】

次に、培養容器１の第２凹部２０内で上皮性細胞３２ａを含む細胞集団を凝集させる工程を行う。当該工程においては、間葉性細胞を複数含む細胞懸濁液５０の上澄み液を除去した後、上皮性細胞を複数含む細胞懸濁液６０（細胞密度：１ｘ１０^５～４ｘ１０^６個／ｍＬ）を培養容器１の収納空間２に適量充填し（１０～１００μＬ）、遠心により（５００～７００ｘｇで1～１０分間）、複数の上皮性細胞３２ａを第２凹部２０において間葉性細胞３２ｂの上方に重ねて凝集させる（細胞数：１ｘ１０^３～４ｘ１０^５個）。当該工程において、添加する細胞懸濁液量は容器から溢れない量であればよく、また、遠心条件においても細胞の機能障害が生じない条件であればよい。これにより、図６Ｂに示すように、第２凹部２０の内部に、間葉性細胞３２ｂの上方に重ねて複数の上皮性細胞３２ａを含む細胞集団を凝集させる。なお、細胞懸濁液５０の上澄み液は除去しなくてもよい。

【0060】

次に、図６Ｃに示すように、第２凹部２０にガイド糸３１を挿入する。第２凹部２０に挿入されたガイド糸３１は、間葉性細胞３２ｂ及び上皮性細胞３２ａからなる細胞集団を上方から下方に向けて貫通し、その下方側を向く先端３１ａは第２底部２２に当接する。上記の通り、第２凹部２０の第２底部２２は、開口２３を上面視したときに開口２３の中央部にガイド糸３１を位置決め可能な構成となっているので、先端３１ａが第２底部２２に接したガイド糸３１は、第２底部２２により先端３１ａが頂点２４に一致するように位置決めされて開口２３を上面視したときに開口２３の中央部に位置するように配置される。これにより、ガイド糸３１を、間葉性細胞３２ｂ及び上皮性細胞３２ａからなる細胞集団の中央部を貫通するように配置される。

【0061】

次に、上記の工程で凝集させた上皮性細胞３２ａを含む細胞集団と凝集させた間葉性細胞３２ｂを、第２凹部２０の内部で互いに接触させながら培養することができる。当該培養は、上皮性細胞と間葉性細胞の機能を維持しつつ、相互作用できる培養条件でよく、例えば約３７℃の温度で５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内で１２～３６時間培養すればよい。

【0062】

このような再生毛包原基の製造方法により、ガイド糸３１の先端部の周囲に、凝集させた間葉性細胞３２ｂ及び凝集させた上皮性細胞３２ａからなる複数の細胞３２が均一に位置するようにして、発毛に適した形状の再生毛包原基３０を簡便に安定して製造することができる。

【0063】

例えば、培養容器１として、第２側壁部２１の上下方向の長さＡが９００±１０μｍ、第２凹部２０の開口２３及び接続部２５の径Ｂが４５０±１０μｍのものを用いることで、再生毛包原基３０を簡便に安定的に製造しやすくすることができる。

【0064】

なお、本実施の形態では、培養容器１の第２凹部２０内で上皮性細胞３２ａからなる細胞集団を凝縮させる工程を行う前に、間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程を行うようにしているが、培養容器１の第２凹部２０内で上皮性細胞３２ａを含む細胞集団を凝縮させる工程を行ってから、間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程を行うようにしてもよい。

【0065】

また、本実施の形態では、上皮性細胞３２ａを含む細胞集団と間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程の後にガイド糸３１を挿入する工程を行うようにしているが、最初に第２凹部２０にガイド糸３１を挿入して当該ガイド糸３１を第２底部２２によって開口２３の中央部に位置決めした後に、上皮性細胞３２ａを含む細胞集団と間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を凝集させる工程を行うようにしてもよい。この場合においても、ガイド糸３１の先端部の周囲に、間葉性細胞３２ｂ及び上皮性細胞３２ａからなる細胞集団が均一に位置する再生毛包原基３０を容易かつ精度よく製造することができる。

【0066】

本実施の形態では、上皮性細胞３２ａを含む細胞集団をバルジ領域上皮由来の細胞を含む細胞集団としたが、これに限らず、上皮性細胞３２ａを含む細胞集団として他の細胞集団を用いることもできる。また、本実施の形態では、間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団を毛乳頭由来の細胞を含む細胞集団としたが、これに限らず、間葉性細胞３２ｂを含む細胞集団として他の細胞集団を用いることもできる。

【実施例0067】

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。なお、本発明は、細胞播種数、培地交換の時期、培養期間、使用する試薬、試薬の濃度、酵素の反応時間などを種々変更した様々な態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものではない。

【0068】

図７に示すように、実施例の培養容器として、それぞれ上記構成を有するとともに、第２凹部の穴径（開口の径）が０．３０ｍｍ、第２凹部の深さが０．７５ｍｍのＮｏ．１の容器、第２凹部の穴径が０．３０ｍｍ、第２凹部の深さが１．００ｍｍのＮｏ．２の容器、第２凹部の穴径が０．４５ｍｍ、第２凹部の深さが０．７５ｍｍのＮｏ．３の容器、第２凹部の穴径が０．４５ｍｍ、第２凹部の深さが０．９０ｍｍのＮｏ．４の容器、及び、第２凹部の穴径が０．４５ｍｍ、第２凹部の深さが１．００ｍｍのＮｏ．５の容器を用意した。また、それぞれの容器について、ポリスチレン又はテフロン（登録商標）を切削加工して形成したもの（切削型））、を用意した。

【0069】

［実施例１］マウスを用いた再生毛包原基の製造及び器官誘導能評価

【0070】

（１）試薬の調製

【0071】

（１－１）解剖用培地の調製
ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、終濃度：１０％）、ＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１０ｍＭ）及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１％）を混合した。

【0072】

（１－２）マウス毛乳頭細胞培養用培地の調製
ＤＭＥＭにＦＢＳ（終濃度：１０％）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度：１％）及びｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬社製、終濃度：１０ｎｇ／ｍＬ）を添加後、混合した。

【0073】

（１－３）０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ―ＥＤＴＡの調製
０．５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－２ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製）で１０倍希釈し、混合することにより調製した。

【0074】

（１－４）マウス毛乳頭細胞回収用培地の調製
ＤＭＥＭにＦＢＳ（終濃度：１０％）及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度：１％）を添加後、混合した。

【0075】

（１－５）分離酵素液の調製
Ｄｉｓｐａｓｅ（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製、濃度：５０ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｕ／ｍＬ）にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製、終濃度：５０Ｕ／ｍＬ）を添加し、混合した。

【0076】

（１－６）単一化酵素反応液の調製
２．５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＰＢＳ（－）で５０倍希釈し、混合した（終濃度：０．０５％）。

【0077】

（１－７）ＮＦＦＳＥ培地の調製
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１０ｍＭ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１ｘ）、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１ｘ）、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、終濃度：１ｘ）、Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２、富士フイルム和光純薬社製、終濃度：１０μＭ）、ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＨＨ ａｇｏｎｉｓｔ（ＳＡＧ、ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、終濃度：５０ｎｇ／ｍＬ）、及びＢＭＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｏｇｇｉｎ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、５０ｎｇ／ｍＬ）、ならびにＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度：１％）を添加し、混合した。

【0078】

（１－８）ＨＥＰＥＳの調製
ＨＥＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ社（同仁化学研究所）製）をＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、ＮａＯＨ（富士フイルム和光純薬社製）でｐＨを７．４に調整することにより、１Ｍ ＨＥＰＥＳを調製した。

【0079】

（１－９）ＮａＨＣＯ_３の調製
ＮａＨＣＯ_３（富士フィルム和光純薬社製）をＭｉｌｌｉＱ水に溶解することにより、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３を調製した。

【0080】

（１－１０）ＤＭＥＭの調製
１Ｌ用のＤＭＥＭパウダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＭｉｌｌｉＱ水１００ｍＬで溶解させることにより、１０ｘＤＭＥＭを調製した。

【0081】

（２）マウス毛乳頭の培養

【0082】

（２－１）マウス毛乳頭の採取及び播種
７－８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ社）またはＣ５７ＢＬ／６－ＴｇＮ（ａｃｔ－ＥＧＦＰ）マウス（ＳＬＣ社）を頸椎脱臼により安楽死させた後、剪刀を用いて髭を除去した。剪刀を用いて毛球部を傷つけないように頬髭組織を採取した。頬髭組織をイソジン（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ社製）、ＰＢＳ（－）、解剖用培地（前掲）で各２回ずつ消毒及び洗浄した。解剖用培地中で頬髭組織の皮下組織を除去した後、頬髭組織から頬髭毛包を引き抜くことにより、頬髭毛包を回収した。成長期Ｉ～ＩＶ期の頬髭毛包を選択後、メスを用いて毛球部の上部を切断し、２５Ｇ注射針を用いて毛球部から毛乳頭を摘出した。なお、摘出した毛乳頭は解剖用培地に回収した。回収した毛乳頭を３５ｍｍ培養用ｄｉｓｈ（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製）または６０ｍｍ培養用ｄｉｓｈ（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製）に播種し、マウス毛乳頭細胞培養用培地（前掲）で６～８日間培養した。

【0083】

（２－２）マウス毛乳頭細胞の回収
培養６～８日後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。洗浄後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（前掲）を添加し、全体行き渡らせた後、３７℃で５分間反応させた。マウス毛乳頭細胞回収用培地（前掲）を添加することにより、反応を停止させ、細胞を回収することにより、細胞回収液を調製した。細胞回収液を２５０ｘｇ、４℃、５分間遠心し、上清を除去後、マウス毛乳頭細胞回収用培地で懸濁することにより、マウス毛乳頭細胞懸濁液を調製した。調製後、細胞濃度を計測した。マウス毛乳頭細胞懸濁液をマウス毛乳頭細胞回収用培地で１×１０^４個／１０～５０μＬになるように調製した。

【0084】

（３）マウス上皮性細胞の培養

【0085】

（３－１）マウス上皮性細胞の採取及び播種
頬髭毛包のリングブルストをメスで切断し、コラーゲン鞘を除去することにより、バルジ領域組織を分離した。解剖用培地を添加した３５ｍｍ ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製）にバルジ領域組織を回収した。解剖用培地を除去し、分離酵素液（前掲）を添加後（約１５０本のバルジ領域組織に対して１ｍＬ添加）、３７℃設定及びＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター（パナソニックヘルスケア社製）で５分間反応させた。反応後、解剖用培地で２回洗浄し、３５Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ ＴｙｐｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）含有解剖用培地を２ｍＬ添加後、２５Ｇ注射針を用いて外科的にバルジ領域組織の周囲にある間葉組織を除去することにより、バルジ領域上皮組織を採取した。ＰＢＳ（－）でバルジ領域上皮組織を２回洗浄後、単一化酵素反応液（前掲）を約１５０本のバルジ領域上皮組織に対して２ｍＬ添加し、３７℃設定及びＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーターで１時間反応させた。反応後、７０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ ＴｙｐｅＩ含有解剖用培地を１ｍＬ添加することにより、酵素反応を停止させ、ピペッティングで混合し、３５μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に通し、３１０ｘｇ、４℃で３分間遠心した。遠心後、解剖用培地を添加及び混合することにより、マウス上皮性細胞を調製した。マウス上皮性細胞の細胞濃度を測定後、細胞懸濁液をチューブに分取した。チューブを３１０ｘｇ、４℃で３分間遠心して上清を除去し、ＨＥＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ社（同仁化学研究所）社製、終濃度：１０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ_３（前掲、終濃度：１０ｍＭ）及びＤＭＥＭ（前掲、終濃度：１ｘ）を含有する１％アテロコラーゲン溶液（高研）を添加及び混合することにより、５×１０^４～１×１０^５個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。遠心により気泡を除去後、細胞懸濁液を６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製）に９０μＬ／ウェルずつ播種した。３７℃設定及びＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター内で３０分程度ゲルを固化させた後、ＮＦＦＳＥ培地を３ｍＬ／ウェルで添加し、３７℃設定及びＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーターで５～６日間、３次元培養を行った。

【0086】

（３－２）マウス上皮性細胞の回収
培養５～６日後、細胞がコロニー形成しているゲルについて、セルスクレーパーでゲルを培養皿から剥離した。剥離したゲルを１．５ｍＬチューブに回収し（最大ゲル３個／チューブ）、培養上清を１ｍＬ添加した。ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩを終濃度が１００Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で６０～９０分間反応させることにより、ゲルを溶解させた。５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）を１ｍＬで１回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ（－）で希釈した０．１２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５００μＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた。３５Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ ＴｙｐｅＩ含有解剖用培地を１ｍＬ添加及び混合することにより、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を３５μｍセルストレーナーに通し、５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心した。遠心後、上清を除去し、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で懸濁することにより、マウス上皮性細胞懸濁液を調製した。調製後、細胞濃度を計測した。マウス上皮性細胞懸濁液をＮＦＦＳＥ培地で１×１０^４～２×１０^４個／２０～５０μＬになるように調製した。

【0087】

（４）培養容器（再構成用容器）の洗浄
９９．５％エタノール（富士フイルム和光純薬社製）をＭｉｌｌｉＱ水で希釈した７０％エタノールに、Ｎｏ．１～Ｎｏ．５の切削型の培養容器をそれぞれ浸し、超音波を室温で３０分間処置し、実体顕微鏡（Ｃａｒｌ ＺＥＩＳＳ社製）で切削の残存物の有無を確認した。中性洗剤（花王社製）を添加したＭｉｌｌｉＱ水（５０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に対して中性洗剤を７滴添加）に培養容器を浸し、シェーカー（６０ｒｐｍ）で室温、３時間洗浄した。洗浄後、培養容器を１時間流水洗浄後（流水洗浄開始３０分後に実体顕微鏡で切削の残存物の有無を確認）、ＭｉｌｌｉＱ水に浸し、シェーカー（６０ｒｐｍ）で室温、１時間洗浄した。なお、空気抜きをピペッティングで実施した。ＭｉｌｌｉＱ水を交換し、シェーカー（６０ｒｐｍ）で室温、一晩洗浄した。さらにＭｉｌｌｉＱ水を交換し、シェーカー（６０ｒｐｍ）で室温、１時間洗浄した。７０％エタノールで２回消毒し、さらに９９．５％エタノールで２回消毒した（空気抜きをピペッティングで実施した）。安全キャビネット内（ＳＡＮＹＯ社製）で培養容器をシャーレ上で風乾した。

【0088】

（６）再生毛包原基の作製
Ｎｏ．１～Ｎｏ．５の切削型の培養容器を用いて再生毛包原基を作製した。洗浄したそれぞれの培養容器を９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製）に挿入した。それぞれの培養容器について、マウス毛乳頭細胞培養用培地を第２凹部の上部まで添加後、マウス毛乳頭細胞懸濁液を培養容器に１０～５０μＬ添加し（細胞数：１x１０^４個／容器）、５９０ ｘｇ、室温、３～５分間で遠心した。遠心後、第２凹部の上部まで上清を除去し、マウス上皮性細胞懸濁液を培養容器に２０～５０μＬ添加し（細胞数：１×１０^４～２×１０^４個／容器）、５９０ ｘｇ、室温、３～５分間で遠心した。遠心後、全長５ｍｍのナイロン糸（松田医科工業社製）をガイド糸として培養容器内のマウス毛乳頭細胞とマウス上皮性細胞を貫通させるように第２凹部に挿入した。挿入後、３７℃設定及びＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター内にて１６～２６時間器官培養した。培養後、ガイド糸からマウス毛乳頭細胞凝集体及びマウス上皮性細胞凝集体が外れないようにガイド糸を引き抜き、位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ ＺＥＩＳＳ社製）で再生毛包原基の写真を撮影した。マウス毛乳頭細胞凝集体及びマウス上皮性細胞凝集体の状態、凝集体同士の接触状態、ガイド糸と各凝集体の位置関係から再生毛包原基が形成できているか否かを判断し、再生毛包原基の形成率（再生毛包原基の形成数／再生毛包原基の総作製数×１００）を算出した結果、第２凹部の穴径が０．４５ｍｍの培養容器でより高い再生毛包原基の形成率を示したことから、より安定な再生毛包原基を製造できる（図８）。

【0089】

（６）再生毛包原基の器官誘導能評価
再生毛包原基を、従来法に従いマウスの皮内に移植した。すなわち、６から８週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ社）を定法に従って麻酔を行い、背部をイソジン消毒した後に自然横臥位をとらせた。Ｖランスマイクロメス（日本アルコン社製）を用いて穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。移植創は体表面より垂直方向に約４００μｍの深度までとし、水平方向は約１ｍｍ程度とした。ガイド糸を挿入した再生毛包原基を、移植創の体表側に上皮性細胞成分が向くように、先鋭ピンセットＮｏ．５（夏目製作所社製）を用いて挿入した。移植創上端部に再生毛包原基の上皮性細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節し、ナイロン糸製のガイド糸が体表面に露出するように位置させた。ガイド糸を移植創に近接した皮膚表面にステリストリップ（スリーエム社製）で固定し、その後、ナースバン（サンプラネット社製、登録商標）及びサージカルテープ（スリーエム社製）で移植創を保護した。移植後５～７日で保護テープ（ナースバン及びサージカルテープ）を除去した。移植物の生着を目視で判定した後に経過観察（２～４日に１回）を行った。経過観察は、麻酔下のマウスの移植部位を蛍光実体顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）による観察・撮影を行い、再生毛包の器官誘導能を評価した。結果を図９、図１０に示す。Ｎｏ．３及びＮｏ．４の培養容器で作製した再生毛包原基は発毛したことから、器官誘導能を有していた（白矢頭）。
本開示は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能である。

【符号の説明】

【0090】

１ 培養容器
２ 収納空間
１０ 第１凹部
１１ 第１側壁部
１２ 第１底部
２０ 第２凹部
２１ 第２側壁部
２２ 第２底部
２３ 開口
２４ 頂点
２５ 接続部
３０ 再生毛包原基
３１ ガイド糸
３１ａ 先端
３２ 細胞
３２ａ 上皮性細胞
３２ｂ 間葉性細胞
４０ 培養液
５０ 間葉性細胞を複数含む細胞懸濁液
６０ 上皮性細胞を複数含む細胞懸濁液

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】