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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023094613
(43)【公開日】2023-07-05
(54)【発明の名称】部位特異的抗体コンジュゲーション及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230628BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230628BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230628BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230628BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230628BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230628BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230628BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230628BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230628BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230628BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230628BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230628BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230628BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230628BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230628BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230628BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230628BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230628BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230628BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P25/28
A61P25/00
A61P27/02
A61P31/00
A61P29/00
A61P9/10
A61P37/02
A61P25/16
A61K47/68
【審査請求】有
【請求項の数】40
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022206731
(22)【出願日】2022-12-23
(31)【優先権主張番号】21217585.5
(32)【優先日】2021-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】キルスティン・ホーファー
(72)【発明者】
【氏名】ライナー・エー・マルティン
(72)【発明者】
【氏名】モハメド・ヨスリー・ハッサン・モハメド
(72)【発明者】
【氏名】トビアス・オエルシュレーゲル
(72)【発明者】
【氏名】フェリクス・フランツ・シューマッハ
(72)【発明者】
【氏名】タチアナ・セラ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA27
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC10
4C076CC11
4C076CC27
4C076CC31
4C076EE41
4C076EE59
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB11
4C085CC23
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA21
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】医薬品としての使用のための、及び疾患の処置における使用のための医薬組成物としての、重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体、並びに該修飾抗体と治療実体のコンジュゲートを提供する。
【解決手段】少なくとも抗体重鎖を含む修飾抗体であって、前記抗体重鎖が、前記抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体である。
【選択図】なし
【解決手段】少なくとも抗体重鎖を含む修飾抗体であって、前記抗体重鎖が、前記抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも抗体重鎖を含む修飾抗体であって、前記抗体重鎖が、前記抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【請求項2】
少なくとも抗体軽鎖を含む修飾抗体であって、前記抗体軽鎖が、前記抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【請求項3】
重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体であって、前記重鎖又は／及び前記軽鎖が、前記抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに前記抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【請求項4】
ＫａｌｂＴＧに対する前記第１の認識部位が、各前記抗体鎖のアミノ酸配列内に存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項5】
前記修飾抗体が、前記抗体重鎖のＣ末端の、又はＣ末端に融合したＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項6】
前記修飾抗体が、前記抗体重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）又は位置４４７（ＨＣ４４７）にＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項7】
前記修飾抗体が２つの同一の抗体重鎖を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項8】
前記修飾抗体が２つの異なる抗体重鎖を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項9】
前記修飾抗体が、ＫａｌｂＴＧに対する前記認識部位（複数可）に加えて、以下の変異（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）：
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項10】
少なくとも１つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む修飾抗体Ｆｃ領域であって、前記修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、前記抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体Ｆｃ領域。
【請求項11】
ＫａｌｂＴＧに対する前記第１の認識部位（複数可）が、アミノ酸配列ＲＹＧＱＲ（配列番号１１）、ＲＷＲＱＲ（配列番号１２）、ＹＲＱＲＴ（配列番号１３）、ＩＲＱＲＱ（配列番号１４）、ＦＲＹＲＱ（配列番号１５）、ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）及びＲＶＲＱＲ（配列番号１８）を含む第１の認識部位の群から互いに独立して選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【請求項12】
ＫａｌｂＴＧに対する前記認識部位（複数可）が、前記位置の後に挿入されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【請求項13】
ＫａｌｂＴＧに対する前記認識部位（複数可）が、２つのフレキシブルペプチドリンカーの間に介在している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【請求項14】
前記ペプチドリンカーが、それぞれがアミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｎ＝１、２、３、４、５；配列番号１９）を有する１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つの反復単位を含む、請求項１３に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【請求項15】
前記修飾抗体が、配列番号０１：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表56】
【表57】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表58】
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表59】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項16】
前記修飾抗体が、配列番号０２：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表60】
【表61】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表62】
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表63】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項17】
前記修飾抗体が、配列番号０３：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表64】
【表65】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表66】
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表67】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項18】
前記修飾抗体が、配列番号０４：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表68】
【表69】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表70】
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表71】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項19】
前記修飾抗体が、配列番号０５：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表72】
【表73】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表74】
によって識別される前記位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表75】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項20】
前記修飾抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項21】
前記修飾抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項22】
前記修飾抗体が、配列番号３４のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項23】
前記修飾抗体が、配列番号０６：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表76】
【表77】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項24】
前記修飾抗体が、配列番号０７：
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表78】
【表79】
によって識別される１つ以上の位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）
のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項25】
前記修飾抗体が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項26】
前記修飾抗体が、受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する受容体に特異的に結合する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項27】
前記修飾抗体が、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）からなる抗原群から選択される抗原に特異的に結合する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【請求項28】
共有結合型コンジュゲートであって、
（ｉ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体と、
（ｉｉ）（ｉ）の前記修飾抗体のＫａｌｂＴＧに対する前記１つ以上の第１の認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体ドメイン（複数可）と
を含み、
前記非抗体ドメインが、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位を含む、共有結合型コンジュゲート。
（ｉ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体と、
（ｉｉ）（ｉ）の前記修飾抗体のＫａｌｂＴＧに対する前記１つ以上の第１の認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体ドメイン（複数可）と
を含み、
前記非抗体ドメインが、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位を含む、共有結合型コンジュゲート。
【請求項29】
前記非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）前記修飾抗体に存在する前記第１の認識部位と相補的である、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、前記治療実体と前記第２の認識部位との間の第２のリンカーと
を含む、請求項２８に記載の共有結合型コンジュゲート。
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）前記修飾抗体に存在する前記第１の認識部位と相補的である、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、前記治療実体と前記第２の認識部位との間の第２のリンカーと
を含む、請求項２８に記載の共有結合型コンジュゲート。
【請求項30】
ＫａｌｂＴＧに対する前記第２の認識部位が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫタグである、請求項２８～２９のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【請求項31】
前記第２のリンカーが、アルキルリンカー又はポリエチレンリンカー又はペプチドリンカー又はそれらの混合物である、請求項２９～３０のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【請求項32】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を治療実体に共有結合的にコンジュゲートさせる方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、前記非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される前記修飾抗体に存在する前記第１の認識部位と相補的である、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、前記治療実体とＫａｌｂＴＧに対する前記第２の認識部位との間の第２のリンカーと
を含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の前記修飾抗体及びｂ）の前記非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下でインキュベーションすることであって、それによりＫａｌｂＴＧに対する前記第１の認識部位と前記第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、
それにより、前記修飾抗体を前記治療実体にコンジュゲートする、インキュベーションすることと
を含む、方法。
ａ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、前記非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される前記修飾抗体に存在する前記第１の認識部位と相補的である、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、前記治療実体とＫａｌｂＴＧに対する前記第２の認識部位との間の第２のリンカーと
を含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の前記修飾抗体及びｂ）の前記非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下でインキュベーションすることであって、それによりＫａｌｂＴＧに対する前記第１の認識部位と前記第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、
それにより、前記修飾抗体を前記治療実体にコンジュゲートする、インキュベーションすることと
を含む、方法。
【請求項33】
前記ＫａｌｂＴＧに対する前記第２の認識部位が、ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＫａｌｂＴＧが、アミノ酸配列（３文字表記）
を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の修飾抗体、修飾Ｆｃ領域、共有結合型コンジュゲート及び方法。
【表80】
を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の修飾抗体、修飾Ｆｃ領域、共有結合型コンジュゲート及び方法。
【請求項35】
請求項２９～３１及び３４のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項36】
医薬として使用するための、請求項２９～３１及び３４のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート、又は請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法に従って製造された共有結合型コンジュゲート。
【請求項37】
神経疾患が、神経障害、神経変性疾患、がん、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳転移を伴うＣＤ２０陽性がん、及び脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんからなる群から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項38】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体をコードする核酸又は核酸の組成物。
【請求項39】
請求項３８に記載の核酸又は核酸組成物を含む、細胞。
【請求項40】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を製造するための方法であって、
－請求項３９に記載の細胞を培養する工程、
－前記修飾抗体を前記細胞又は／及び培養培地から回収し、
それにより、請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を製造する工程を含む、方法。
－請求項３９に記載の細胞を培養する工程、
－前記修飾抗体を前記細胞又は／及び培養培地から回収し、
それにより、請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾抗体を製造する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体技術の分野、特に抗体－薬物コンジュゲートの分野にある。特に、本発明は、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼのための１つ以上の人工認識部位を含む修飾抗体、及び前記修飾抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
医薬は、疾患を処置、治癒又は予防するために使用される化学物質である。医薬はいくつかの経路を介して投与することができ、多くの医薬品は１つを超える経路によって投与することができる。典型的な投与経路としては、限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョン（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、眼内、骨内、皮下又は髄腔内）の経口、直腸、舌下又は局所の注射が挙げられる。明らかに、医薬は通常、患者の体内に全身的に分布しており、望ましくない領域でのその活性のために有害作用を有する可能性がある。他の領域に到達することは困難な場合がある。標的治療は、作用することが意図されている体内の領域に向けられた医薬を使用することによってこの欠点を克服することを目的とする。標的化治療は、従来の非標的化形態の処置よりも効果的であり、副作用が少ないと予想される。
【0003】
治療実体を意図された作用場所に向ける１つの方法は、標的細胞又は組織において特異的に結合する抗体にそれを結合させることによるものである。抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）等の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関連する課題の１つは、それらの製造である。ほとんどの薬物－抗体連結は、チオール－マレイミド化学を可能にする部分的に還元された鎖間ジスルフィド結合、又は活性化エステルを使用したリジン官能化若しくは人工的に導入されたシステイン残基のいずれかを利用する。この方法は、異なる部位に結合した異なる数の薬物を有するコンジュゲート抗体種の統計的混合物をもたらす。モノメチルアウリスタチンＥペイロードを有するＡＤＣでは、４、６、又は８の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣ種は、次第に疎水性となることが実証され、ＤＡＲ２種よりもはるかに凝集しやすいことが示された（Ａｄｅｍ ｅｔ ａｌ．）。
【0004】
したがって、治療実体の結合の数及び部位をより正確に制御して、標的化治療のためのＡＤＣ、例えばＡＯＣを提供することが望ましい。それにより、ＡＤＣの均一性が高められるはずである。改善された部位特異的コンジュゲーション技術は、治療用ＡＤＣ並びに診断用抗体標識又は抗体－酵素コンジュゲートの調製における潜在的な使用のために、多くの製薬会社の関心の対象であり続けている。
【0005】
ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来の微生物トランスグルタミナーゼは、タンパク質架橋並びに部位特異的タンパク質標識のための安価で使いやすい酵素として浮上している（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0006】
クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）からの新規トランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の発見及びそれぞれのペプチド基質の同定は、Ｓｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）によって記載されている。ＫａｌｂＴＧは、以前に記載された微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）と比較して、同様の効率を示すが、特異性及び発達性が改善されている。
【0007】
米国特許出願公開第２０２０／０２４９２３１号は、トランスグルタミナーゼ種の同定及び特徴付けのためのシステム及び方法を報告した。
【0008】
ＩｇＧ重鎖Ｃ末端は、抗体標識のためのｍＴＧのための適切なＱタグ挿入部位として記載されている（例えば、国際公開第２０２１／１７４０９１号を参照）。
【発明の概要】
【0009】
上記の欠点を回避するため、本発明の目的は、ＫａｌｂＴＧ媒介コンジュゲーションに関して修飾抗体の改善された特性をもたらすＱタグモチーフの組み込みのためのＩｇＧ分子内の部位を同定することであった。Ｑタグの組み込みは、抗体の折り畳み又は機能を損なわず、又は発現収率を低下させず、コンジュゲーションに必要なアクセス可能性並びに治療実体の治療活性を提供すべきである。本発明によるそのような部位の成功した同定は、定義された化学量論及び制御された部位特異的様式でのＩｇＧ分子あたり１つ以上の治療部分の組み込みを可能にする。それにより、より均一なコンジュゲート生成物を提供することができ、例えば、必要な精製及び分離努力を軽減し、より好ましい薬物様特性を有する分子を得ることができる。さらに、コンジュゲーションプロセス及び／又はコンジュゲートペイロードによる抗体のその抗原への結合を損なうリスクが低減される。
【0010】
本発明者らは、とりわけ、ペイロードをＩｇＧ重鎖Ｃ末端に結合させると、凝集及び疎水性が増加することを観察した。ＫａｌｂＴＧを使用して医薬として有用な抗体－薬物コンジュゲートを調製できるようにするために、ＫａｌｂＴＧ Ｑ－タグは、本発明によるＩｇＧ骨格内の規定された部位に導入されなければならない。
【0011】
本発明は、重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体であって、重鎖又は／及び軽鎖が、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）又はその機能的に活性なバリアントに対する１つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む修飾抗体に関する。１つ以上の第１の認識部位（複数可）は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖内の１つ以上の選択された位置（複数可）に導入される。
【0012】
本発明の一態様は、重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体であって、重鎖又は／及び軽鎖が、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）から選択される１つ以上の位置（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）にあるか、又はこれらの位置の後に挿入された、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ以上の（第１の）認識部位（複数可）を含む、修飾抗体である。したがって、本発明の修飾抗体では、ＫａｌｂＴＧの認識部位は、抗体重鎖ポリペプチドの定常領域の内部に位置し、すなわち抗体重鎖のＮ末端若しくはＣ末端のいずれにも、又は／及び抗体軽鎖定常ドメインの内部若しくはＣ末端に位置していない。
【0013】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明の修飾抗体は、重鎖のＣ末端、すなわち、位置４４６（ＨＣ４４６）又は位置４４７（ＨＣ４４７）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）に、又はこれに融合したＫａｌｂＴＧに対する認識部位を更に含む。
【0014】
本発明との関連で、「ある位置におけるＫａｌｂＴＧの認識部位の挿入」という用語は、抗体のそれぞれの鎖の非修飾アミノ酸配列中のその位置に存在するアミノ酸残基が認識部位によって置換される、すなわち、認識部位がアミノ酸残基の代わりに挿入されるか、又は認識部位が、好ましい一実施形態では、アミノ酸配列中のその位置の直後に、２つの短いフレキシブルリンカーペプチドの間に間隔を置いての直接のいずれかで挿入される、すなわち、アミノ酸残基が維持されることを意味する。
【0015】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0016】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、１つ以上の位置が、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）及び重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0017】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、修飾抗体が２つの同一の重鎖又は重鎖Ｆｃ領域を含む。
【0018】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、修飾抗体は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）から選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２、４又はそれを超える（第１の）認識部位（複数可）を含む。
【0019】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明による修飾抗体が２つの異なる重鎖又は抗体Ｆｃ領域を含み、それにより、差異が少なくともヘテロ二量体化を誘導するためのそれぞれの突然変異から生じる。
【0020】
特定の実施形態では、修飾抗体は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）から選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に互いに独立して挿入される、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１、２、３又はそれを超える（第１の）認識部位（複数可）を含む。
【0021】
同様に、本発明は、修飾抗体Ｆｃ領域に関し、修飾抗体Ｆｃ領域は、重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）の群から選択される１つ以上の位置にそれらの後に挿入された、クツネリア・アルビダＫｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ以上の（第１の）認識部位（複数可）を含む。
【0022】
したがって、本発明の修飾抗体Ｆｃ領域では、ＫａｌｂＴＧの認識部位は、抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの定常領域の内部に位置し、すなわちいかなる末端にも位置しない。さらに、本発明の修飾抗体Ｆｃ領域は、重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）又は位置４４７（ＨＣ４４７）、すなわちＣ末端にＫａｌｂＴＧの更なる第１の認識部位を含み得る（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。本発明との関連で、「ある位置におけるＫａｌｂＴＧの認識部位の挿入」という用語は、非修飾配列中のその位置に存在するアミノ酸が認識部位によって置き換えられるか、又は好ましい一実施形態では、認識部位が、更にその位置の後に、直接又は２つのフレキシブルな短いリンカーペプチドの間に間隔を置いてのいずれかで挿入されることを意味する。
【0023】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0024】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、１つ以上の位置が、重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0025】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0026】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0027】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0028】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0029】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0030】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0031】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0032】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0033】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0034】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0035】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0036】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含み、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。
【0037】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）が、その位置の直後に挿入される。特定の実施形態では、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）は、２つのフレキシブルペプチドリンカーの間に挿入されている。特定の実施形態では、クツネリア・アルビダＫｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）を有する。
【0038】
本発明は更に、本発明による修飾抗体をコードする１つ以上の核酸、並びに（ｉ）本発明による修飾抗体、及び（ｉｉ）直接又は第１のリンカーを介してのいずれかで１つ以上の第１の認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体部分（ペイロード（複数可））を含む共有結合型コンジュゲートに関する。特定の実施形態では、非抗体部分は、治療実体、及び任意に第２のリンカーを含む。
【0039】
本発明は更に、本発明による修飾抗体を非抗体部分に共有結合的にコンジュゲートする方法に関する。非抗体部分が治療実体を含む場合、本発明は更に、医薬としての使用のための、並びに疾患の処置における使用のための医薬組成物としての本発明による修飾抗体と治療実体とのコンジュゲートに関する。
【0040】
ＫａｌｂＴＧは、グルタミン側（Ｇｌｎ、Ｑ）鎖とリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）側鎖との間のイソペプチド結合の形成を触媒する。形成されたイソペプチド結合は、ε－（γ－グルタミル）リジン結合／架橋である。酵素結合形成は共有結合性であり、したがってほとんど不可逆的である。ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）はＫａｌｂＴＧ Ｇｌｎ含有モチーフ（Ｑタグ）として同定され、ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）はＬｙｓ含有アクセプターモチーフ（Ｋタグ）として同定された。
【0041】
したがって、本発明は、少なくとも以下の実施形態を包含する。
【0042】
１．少なくとも抗体重鎖を含む修飾抗体であって、抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【0043】
２．少なくとも抗体軽鎖を含む修飾抗体であって、抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【0044】
３．重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体であって、重鎖又は／及び軽鎖が、抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体。
【0045】
４．ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が、各抗体鎖のアミノ酸配列内に存在する、実施形態１～３のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0046】
５．修飾抗体が、抗体重鎖のＣ末端の、又はＣ末端に融合したＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む、実施形態１～４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0047】
６．修飾抗体が、抗体重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）又は位置４４７（ＨＣ４４７）にＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0048】
７．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0049】
８．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から互いに独立して選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0050】
９．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から互いに独立に選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0051】
１０．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から互いに独立に選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0052】
１１．修飾抗体が、抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）からなる群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に含むか、又はこれらの位置の後に挿入されている、ＫａｌｂＴＧに対する偶数個の第１の認識部位（複数可）を含む、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0053】
１２．偶数が、２又は４又は６又は８である、実施形態１１に記載の修飾抗体。
【0054】
１３．偶数が２又は４である、実施形態１１～１２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0055】
１４．修飾抗体が、抗体軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）からなる群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に含むか、又はこれらの位置の後に挿入されている、ＫａｌｂＴＧに対する偶数個の第１の認識部位（複数可）を含む、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0056】
１５．奇数が、１又は３又は５又は７である、実施形態１４に記載の修飾抗体。
【0057】
１６．奇数が、１又は３である、実施形態１４～１５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0058】
１７．修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体軽鎖の少なくとも１つの同族対を含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0059】
１８．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0060】
１９．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0061】
２０．抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0062】
２１．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に、又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0063】
２２．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0064】
２３．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0065】
２４．抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0066】
２５．修飾抗体が、抗体重鎖及び同族抗体軽鎖の２つの対を含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0067】
２６．
（ｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体軽鎖の各々の２つの対を含み、抗体重鎖又は／及び抗体軽鎖の各々が、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は
（ｉｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体軽鎖の各々の２つの対を含み、抗体重鎖又は／及び抗体軽鎖のうち１つが、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は
（ｉｉｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体重鎖の１つの対と、１つの追加の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとを含み、抗体重鎖又は／及び抗体重鎖Ｆｃ領域断片又は抗体軽鎖が、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
（ｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体軽鎖の各々の２つの対を含み、抗体重鎖又は／及び抗体軽鎖の各々が、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は
（ｉｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体軽鎖の各々の２つの対を含み、抗体重鎖又は／及び抗体軽鎖のうち１つが、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は
（ｉｉｉ）修飾抗体が、抗体重鎖及び抗体重鎖の１つの対と、１つの追加の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドとを含み、抗体重鎖又は／及び抗体重鎖Ｆｃ領域断片又は抗体軽鎖が、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0068】
２７．第１の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の２１４（ＬＣ２１４）位又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態２５に記載の修飾抗体。
【0069】
２８．第１の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の２１４（ＬＣ２１４）位又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態２５に記載の修飾抗体。
【0070】
２９．第１の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態２５に記載の修飾抗体。
【0071】
３０．第１の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態２５に記載の修飾抗体。
【0072】
３１．第１の対の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含み、第２の対の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の２１４（ＬＣ２１４）位又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態２５に記載の修飾抗体。
【0073】
３２．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0074】
３３．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0075】
３４．両方の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0076】
３５．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に、又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0077】
３６．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、両方の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0078】
３７．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、両方の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0079】
３８．両方の抗体重鎖が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含み、両方の抗体軽鎖が、抗体軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0080】
３９．修飾抗体が２つの同一の抗体重鎖を含む、実施形態１～３８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0081】
４０．修飾抗体が２つの異なる抗体重鎖を含む、実施形態１～３８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0082】
４１．相違が、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくともそれぞれの変異から生じる、実施形態４０に記載の修飾抗体。
【0083】
４２．修飾抗体が、ＫａｌｂＴＧに対する認識部位（複数可）に加えて、以下の変異（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を含む、実施形態１～４１のいずれか一項に記載の修飾抗体：
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
【0084】
４３．少なくとも１つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む修飾抗体Ｆｃ領域であって、修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、クツネリア・アルビダ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の第１の認識部位（複数可）を含む、修飾抗体Ｆｃ領域。
【0085】
４４．ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が、各抗体鎖のアミノ酸配列内に存在する、実施形態４３に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0086】
４５．修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、そのＣ末端に又はそのＣ末端に融合したＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む、実施形態４３～４４のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0087】
４６．抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）又は位置４４７（ＨＣ４４７）にＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を更に含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～４５のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0088】
４７．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から互いに独立して選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～４６のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0089】
４８．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から互いに独立して選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～４７のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0090】
４９．１つ又は２つ又は３つ又は４つ以上の位置が、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から互いに独立して選択される（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～４８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0091】
５０．修飾抗体Ｆｃ領域が、抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する偶数個の第１の認識部位（複数可）を含む、実施形態４３～４９のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0092】
５１．偶数が、２又は４又は６又は８である、実施形態５０に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0093】
５２．偶数が２又は４である、実施形態４９～５０のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0094】
５３．修飾抗体Ｆｃ領域が、抗体重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を含む位置の群から互いに独立して選択される１つ以上の位置に、又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する奇数個の第１の認識部位（複数可）を含む、実施形態４３～４９のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0095】
５４．奇数が、１又は３又は５又は７である、実施形態５３に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0096】
５５．奇数が、１又は３である、実施形態５３～５４のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0097】
５６．修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５５のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0098】
５７．修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５６のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0099】
５８．修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５７のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0100】
５９．修飾抗体Ｆｃ領域が、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の２つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0101】
６０．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含み、一方の修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含み、他方の修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0102】
６１．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含み、その両方の修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する１つの第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0103】
６２．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含み、その両方の修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）に又はその後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位を含む（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0104】
６３．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含み、その両方の修飾抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドが、抗体重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）に又はそれらの後に挿入されたＫａｌｂＴＧに対する２つの第１の認識部位（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、実施形態４３～５８のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0105】
６４．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの同一の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、実施形態４３～６３のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0106】
６５．修飾抗体Ｆｃ領域が、２つの異なる抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、実施形態４３～６３のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0107】
６６．相違が、ヘテロ二量体化を誘導するための少なくともそれぞれの変異から生じる、実施形態６５に記載の修飾抗体Ｆｃ領域。
【0108】
６７．修飾抗体が、ＫａｌｂＴＧに対する認識部位（複数可）に加えて、以下の変異（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を含む、実施形態４３～６６のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域：
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
【0109】
６８．実施形態４３～６７のいずれか一項に記載の修飾抗体Ｆｃ領域を含む、修飾抗体。
【0110】
６９．ＫａｌｂＴＧに対する第１認識部位（複数可）が、Ｇｌｎ含有５アミノ酸長モチーフを含むか又は有する、実施形態１～６８のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0111】
７０．ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位（複数可）が、アミノ酸配列ＲＹＧＱＲ（配列番号１１）、ＲＷＲＱＲ（配列番号１２）、ＹＲＱＲＴ（配列番号１３）、ＩＲＱＲＱ（配列番号１４）、ＦＲＹＲＱ（配列番号１５）、ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）及びＲＶＲＱＲ（配列番号１８）を含む第１の認識部位の群から互いに独立して選択される、実施形態１～６９のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0112】
７１．ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位（複数可）が、互いに独立して、アミノ酸配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）又はＲＶＲＱＲ（配列番号１８）から選択される、実施形態１～７０のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0113】
７２．ＫａｌｂＴＧの第１認識部位（複数可）がＹＲＹＲＱ（配列番号１７）である、実施形態１～７１のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0114】
７３．ＫａｌｂＴＧに対する認識部位（複数可）が、位置の後に挿入されている、実施形態１～７２のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0115】
７４．ＫａｌｂＴＧに対する認識部位（複数可）が、２つのフレキシブルペプチドリンカーの間に介在している、実施形態１～７３のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0116】
７５．各ペプチドリンカーが、互いに独立して、１～２０個のアミノ酸を含む、実施形態７４に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0117】
７６．各ペプチドリンカーが互いに独立して１～１０個のアミノ酸を含む、実施形態７４～７５のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0118】
７７．各ペプチドリンカーが互いに独立して１～５個のアミノ酸を含む、実施形態７４～７６のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0119】
７８．ペプチドリンカーが、Ｑタグ、ＫａｌｂＴＧ、抗体の折り畳み、及び修飾抗体に結合するペイロードの機能を本質的に妨害しない、実施形態７４～７７のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0120】
７９．ペプチドリンカーが、主に又は排他的に、Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ及び／又はＡｌａ及び／又はＴｈｒ及び／又はＧｌｕアミノ酸残基を含む、実施形態７４～７９のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0121】
８０．ペプチドリンカーが、互いに独立して、ＧＧＧＰ（配列番号２０）、ＥＳＧＳ（配列番号２１）、ＡＰＡＰ（配列番号２２）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２３）及びＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号２４）を含むペプチドリンカーの群から選択される、実施形態７４～８０のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0122】
８１．ペプチドリンカーが、互いに独立して、主として又は完全に、Ｇｌｙ及びＳｅｒからなる、実施形態７４～８０のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0123】
８２．ペプチドリンカーが（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎであり、ｍ＝１、２、３又は４及びｎ＝１、２、３、４又は５であり、ｍ及びｎが互いに独立して選択される、実施形態７４～８１のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0124】
８３．ｍ＝３、ｎ＝１である、実施形態８２のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0125】
８４．ペプチドリンカーが、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｎ＝１、２、３、４、５；配列番号１９）をそれぞれ有する１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つの反復単位を含む、実施形態７４～８３のいずれか一項に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0126】
８５．ペプチドリンカーが、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｎ＝１；配列番号１９）を有する１つの反復単位を含む、実施形態８４に記載の修飾抗体又は修飾抗体Ｆｃ領域。
【0127】
８６．修飾抗体が１つ又は２つ又は３つ又は４つのＦａｂ断片を含む、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の修飾抗体。
【0128】
８７．修飾抗体が、同族抗体軽鎖－重鎖対を形成する１つの完全長抗体軽鎖及び１つの完全長抗体重鎖と、完全長抗体重鎖のＦｃ領域に会合するヒンジ領域を含む１つの抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチド断片とを含む一価単一特異性抗体である、実施形態１～８６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0129】
８８．修飾抗体がヒトＩｇ重鎖定常領域に基づく、実施形態１～８７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0130】
８９．修飾抗体が、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域に基づく、実施形態１～８８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0131】
９０．修飾抗体が、ヒトＩｇＧ１重鎖ポリペプチドに基づき、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0132】
９１．修飾抗体が、ヒトＩｇＧ２重鎖ポリペプチドに基づき、配列番号３に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0133】
９２．修飾抗体が、ヒトＩｇＧ３重鎖ポリペプチドに基づき、配列番号４に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0134】
９３．修飾抗体が、ヒトＩｇＧ４重鎖ポリペプチドに基づき、配列番号５に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0135】
９４．修飾抗体が、配列番号０１
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表1】
【表2】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表3】
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表4】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0136】
９５．修飾抗体が、配列番号０２
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表5】
【表6】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表7】
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表8】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0137】
９６．修飾抗体が、配列番号０３
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表9】
【表10】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表11】
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表12】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0138】
９７．修飾抗体が、配列番号０４
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表13】
【表14】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表15】
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表16】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0139】
９８．修飾抗体が、配列番号０５
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表17】
【表18】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入され、
【表19】
によって識別される位置の１つにＫａｌｂＴＧに対する更なる第１の認識部位が挿入される場合にのみ、
【表20】
によって識別される位置の後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入される）のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0140】
９９．修飾抗体が、配列番号８又は配列番号９又は配列番号３４に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上又は最大１００％同一である抗体重鎖定常領域アミノ酸配列を含む、実施形態１～９８のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0141】
１００．修飾抗体が配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～９９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0142】
１０１．修飾抗体が配列番号９のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～９９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0143】
１０２．修飾抗体が配列番号３４のアミノ酸配列を有する抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～９９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0144】
１０３．修飾抗体が、ヒトカッパ抗体又はラムダ抗体の軽鎖に基づき、配列番号６又は７に示すアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の抗体軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～１０２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0145】
１０４．修飾抗体が、配列番号１０に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する、実施形態１～８９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0146】
１０５．修飾抗体が、配列番号０６
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入されている）のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表21】
【表22】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入されている）のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0147】
１０６．修飾抗体が、配列番号０７
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入されている）のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【表23】
【表24】
によって識別される１つ以上の位置に、又はその後に、ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位が挿入されている）のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、実施形態１～１０４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0148】
１０７．修飾抗体が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する抗体軽鎖定常領域を含む、実施形態１～１０６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0149】
１０８．修飾抗体が、（ｉ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を有する非修飾抗体軽鎖定常ドメイン、又は（ｉｉ）非修飾抗体重鎖定常領域が、配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０７のいずれか１つに記載の修飾抗体。
【0150】
１０９．修飾抗体が、
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む非修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる修飾重鎖定常領域であって、ＫａｌｂＴＧに対する少なくとも１つの認識部位が挿入されている、修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む非修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる修飾重鎖定常領域であって、ＫａｌｂＴＧに対する少なくとも１つの認識部位が挿入されている、修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0151】
１１０．修飾抗体が、
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾軽鎖定常ドメインであって、少なくとも１つのＫａｌｂＴＧに対する認識部位が挿入されている修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる非修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾軽鎖定常ドメインであって、少なくとも１つのＫａｌｂＴＧに対する認識部位が挿入されている修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる非修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0152】
１１１．修飾抗体が、
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0153】
１１２．修飾抗体が、
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0154】
１１３．修飾抗体が、
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号６又は７のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0155】
１１４．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0156】
１１５．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0157】
１１６．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0158】
１１７．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0159】
１１８．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0160】
１１９．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む又はそれからなる修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0161】
１２０．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0162】
１２１．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0163】
１２２．修飾抗体が、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む修飾抗体軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む修飾抗体重鎖定常領域を含む、実施形態１～１０７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0164】
１２３．修飾抗体が抗原に結合する、実施形態１～１２２のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0165】
１２４．修飾抗体が、血液脳関門の通過を可能にする構造に特異的に結合する、実施形態１～１２３のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0166】
１２５．修飾抗体が、受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する受容体に特異的に結合する、実施形態１～１２４のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0167】
１２６．修飾抗体が、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）からなる抗原群から選択される抗原に特異的に結合する、実施形態１～１２５のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0168】
１２７．修飾抗体が、ヒトトランスフェリン受容体１に特異的に結合する、実施形態１～１２６のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0169】
１２８．修飾抗体が、１つ又は２つの抗原に特異的に結合し、前記１つ又は２つの抗原が特定の細胞型に特異的である、実施形態１～１２７のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0170】
１２９．抗原の一方又は両方が、腫瘍細胞に特異的な腫瘍マーカーである、実施形態１２８記載の修飾抗体。
【0171】
１３０．細胞種が乳がん細胞である、実施形態１２８～１２９のいずれか一項に記載の修飾抗体。
【0172】
１３１．共有結合型コンジュゲートであって、
（ｉ）実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体と、
（ｉｉ）（ｉ）の修飾抗体のＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体ドメイン（複数可）と、を含み、
非抗体ドメインが、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位を含む、共有結合型コンジュゲート。
（ｉ）実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体と、
（ｉｉ）（ｉ）の修飾抗体のＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の第１の認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体ドメイン（複数可）と、を含み、
非抗体ドメインが、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位を含む、共有結合型コンジュゲート。
【0173】
１３２．非抗体ドメインが、治療実体と、任意に第２のリンカーを含む治療部分である、実施形態１３１に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0174】
１３３．非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、すなわち、修飾抗体がＱタグを含む場合、非抗体ドメインはＫタグを含むか、又はその逆であり、特に、第２の認識部位はＬｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）（Ｋタグ）を含むか、又は有する、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーとを含む、実施形態１３１又は１３２に記載の共有結合型コンジュゲート。
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、すなわち、修飾抗体がＱタグを含む場合、非抗体ドメインはＫタグを含むか、又はその逆であり、特に、第２の認識部位はＬｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）（Ｋタグ）を含むか、又は有する、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーとを含む、実施形態１３１又は１３２に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0175】
１３４．ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位が、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫタグである、実施形態１３１～１３３のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0176】
１３５．治療実体が核酸である、実施形態１３１～１３４のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0177】
１３６．治療実体がＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの混合物である、実施形態１３１～１３５のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0178】
１３７．治療実体が非コードＲＮＡ分子である、実施形態１３１～１３６のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0179】
１３８．治療実体が、１５～２４塩基対長の非コードＲＮＡ分子である、実施形態１３１～１３７のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0180】
１３９．治療実体が、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）残基を含む、実施形態１３１～１３８のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0181】
１４０．治療実体が、ＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合されたＬＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態１３１～１３９のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0182】
１４１．治療実体がｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１３１～１４０のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0183】
１４２．治療実体が、ＬＮＡヌクレオチド、毒素、有機小分子及び免疫調節因子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む群から選択される、実施形態１３１～１４１のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0184】
１４３．有機小分子が２，５００ダルトン以下の分子量を有する、実施形態１４２に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0185】
１４４．有機小分子が１，０００ダルトン以下の分子量を有する、実施形態１４２～１４３のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0186】
１４５．第２のリンカーが、アルキルリンカー又はポリエチレンリンカー又はペプチドリンカー又はそれらの混合物である、実施形態１３１～１４４のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0187】
１４６．第２のリンカーがエチレングリコール単位を含む、実施形態１３１～１４５のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0188】
１４７．第２のリンカーが約２～５０個のエチレングリコール単位を含む、実施形態１３１～１４６のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0189】
１４８．第２のリンカーが脂肪族炭素鎖を含む、実施形態１３１～１４７のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0190】
１４９．第２のリンカーが、非置換又は置換Ｃ１～６アルキルを含み得、置換Ｃ１～６アルキルの場合、置換基が、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、カルボニルアルコキシ、アシルアミノ、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シアノ、アジド、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、アミノスルホニル、スルホニルアミノ、スルホニル及びオキソからなる群から選択される、実施形態１３１～１４８のいずれか一項に記載に共有結合型コンジュゲート
【0191】
１５０．第２のリンカーがペプチドリンカーである、実施形態１３１～１４５のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0192】
１５１．コンジュゲートが実施形態１３１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体と１つ以上治療用核酸とを含み、各治療用核酸がイソペプチド結合を介して単一のＱタグに連結されており、任意に、第２のリンカーを介してＫタグの末端残基にアミド結合している、実施形態１～１５０のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0193】
１５２．１つ以上の治療用核酸（複数可）がアンチセンスオリゴヌクレオチド（複数可）である、実施形態１５１に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0194】
１５３．第２のリンカーが１つ以上のエチレングリコール単位を含む、実施形態１５１～１５２のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0195】
１５４．非抗体ドメインが、脳疾患を処置又は予防するためのＲＮＡ又はＬＮＡと、任意にＰＥＧリンカーとを含む治療実体を含む、実施形態１３１～１５３のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0196】
１５５．脳疾患がパーキンソン病又はアルツハイマー病である、実施形態１５４に記載の共有結合型コンジュゲート。
【0197】
１５６．方法が、
ａ）実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、非抗体ドメインが、（ｉ）治療実体、（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、及び（ｉｉｉ）任意に、治療実体とＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位との間の第２のリンカーを含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の修飾抗体及びｂ）の非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下でインキュベートすることであって、それによりＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位と第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、
それにより、修飾抗体を治療実体にコンジュゲートする、インキュベートすることと、を含む、実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体を治療実体に共有結合的にコンジュゲートする方法。
ａ）実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、非抗体ドメインが、（ｉ）治療実体、（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、及び（ｉｉｉ）任意に、治療実体とＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位との間の第２のリンカーを含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の修飾抗体及びｂ）の非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下でインキュベートすることであって、それによりＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位と第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、
それにより、修飾抗体を治療実体にコンジュゲートする、インキュベートすることと、を含む、実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体を治療実体に共有結合的にコンジュゲートする方法。
【0198】
１５７．工程ｃ）が、ＫａｌｂＴＧの活性を助長する条件下で行われる、実施形態１５６に記載の方法。
【0199】
１５８．ＫａｌｂＴＧに対する第１の認識部位がアミノ酸配列ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）を有する、実施形態１５６～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【0200】
１５９．ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位のアミノ酸配列が、ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）である、実施形態１５６～１５８のいずれか一項に記載の方法。
【0201】
１６０．ＫａｌｂＴＧが、アミノ酸配列（３文字表記）を含む、実施形態１～１５９のいずれか一項に記載の修飾抗体、修飾Ｆｃ領域、共有結合型コンジュゲート及び方法。
【表25】
【0202】
１６１．実施形態１３１～１５５及び１６０のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲートを含む、医薬組成物。
【0203】
１６２．医薬として使用するための、実施形態１３１～１５５及び１６０のいずれか一項に記載の共有結合型コンジュゲート、又は実施形態１５６～１６０のいずれか一項に記載の方法に従って製造される共有結合型コンジュゲート。
【0204】
１６３．使用が、神経疾患又は脳疾患又はがんを処置するものである、実施形態１６２に記載の使用。
【0205】
１６４．神経疾患が、神経障害、神経変性疾患、がん、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳転移を伴うＣＤ２０陽性がん、及び脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんからなる群から選択される、実施形態１６２～１６３のいずれか一項に記載の使用。
【0206】
１６５．神経疾患が、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳ炎症から選択される、実施形態１６２～１６４のいずれか一項に記載の使用。
【0207】
１６６．使用が、アルツハイマー病又はパーキンソン病又は乳がんを処置するためのものである、実施形態１６２～１６５のいずれか一項に記載の使用。
【0208】
１６７．実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体をコードする、核酸又は核酸組成物。
【0209】
１６８．実施形態１６７に記載の核酸又は核酸組成物を含む、細胞。
【0210】
１６９．実施形態１～１３０のいずれか一項に記載の修飾抗体の製造方法であって、
－実施形態１６８に記載の細胞を培養する工程、
－細胞又は／及び培養培地から修飾抗体を回収し、それにより、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の修飾抗体を産生する工程を含む、方法。
－実施形態１６８に記載の細胞を培養する工程、
－細胞又は／及び培養培地から修飾抗体を回収し、それにより、実施形態１～１３０のいずれか１つに記載の修飾抗体を産生する工程を含む、方法。
【0211】
１７０．細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１６９に記載の方法。
【0212】
１７１．細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態１６９～１７０のいずれか一項に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【0213】
本発明は、少なくとも部分的には、ＱタグをＩｇＧ１抗体等の抗体内の全ての部位に組み込むことができず、ペイロードへのコンジュゲーションに付随する適合性を有するという知見に基づく。抗体定常ドメイン領域を、ＫａｌｂＴＧを介したコンジュゲーションについてスクリーニングした。これに関連して、ＫａｌｂＴＧ Ｑタグを、ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖定常領域内の表面露出ドメイン間及びドメイン内のフレキシブルループ並びにそれぞれの重鎖及び軽鎖のＣ末端に挿入した。合計で、ＩｇＧ１重鎖及び軽鎖内の９つの異なる部位を試験した。ＫａｌｂＴＧ Ｑ－ｔａｇモチーフは、アミノ酸配列ＧＧＧＳ－ＹＲＹＲＱ－ＧＧＧＳ（配列番号２５）として２つのフレキシブルリンカーの間／内に間隔を置いて挿入された。知見の一般的な適用可能性を示すために、更に、異なる結合特異性の５つの抗体（ｍＡｂ－１～ｍＡｂ－５）を試験した。単一のＫａｌｂＴＧ認識部位挿入を有するこれらの分子を、それらの発現率について評価した。結果を実施例及び表１に示す。
【表26】
【0214】
挿入部位に応じて発現力価が変化した、すなわち減少した、又は更に改善されたことが分かるが、これは完全に予想外であった。
【0215】
修飾抗体を、ＫａｌｂＴＧによる酵素的修飾のためのＱタグのコンジュゲーション及びアクセス可能性について更に試験した。２つの異なるペイロード、小分子（蛍光色素）及び小さな一本鎖核酸を試験した。抗体が対称性である場合、すなわち２つの同一の重鎖対及び軽鎖対を含む場合、分子あたり２つのＱタグが存在した。抗体が非対称である場合、すなわち２つの異なる重鎖対及び軽鎖対を含む場合、分子当たり単一のＱタグが存在した。したがって、対称抗体については１００％のコンジュゲーション効率で２の薬物対抗体比（ＤＡＲ、すなわち抗体分子あたりのペイロード分子の数）が予想され、非対称抗体については１００％のコンジュゲーション効率で１のＤＡＲが予想された。ｍＡｂ－５の場合の蛍光色素についての結果を表２に示す。
【表27】
【0216】
ｍＡｂ－１及び２の場合は１５ヌクレオチド長、ｍＡｂ－４の場合は２０ヌクレオチド長の一本鎖核酸の結果を表３に示す（ＨＩＣ及びＵＶ－ｖｉｓによって決定）。
【表28】
【0217】
Ｍａｂ－１及びｍＡｂ－２を一段階法でコンジュゲート化した、ｍＡｂ－４を２段階法でコンジュゲートした（クリックケミストリーを使用して、最初にＫタグ、次いでＫタグを核酸にコンジュゲートした）。それにより、本発明による抗体を使用する本発明による方法の一般的な適用性が示され、すなわち、本方法は、抗体の結合特異性並びにペイロードをＫタグにコンジュゲートするために使用される技術とは無関係である、すなわち、直接的又は逐次的のいずれかである。
【0218】
一例としてｍＡｂ－２の場合、５つの異なるＱタグ、ＲＹＧＱＲ（配列番号１１）、ＲＷＲＱＲ（配列番号１２）、ＹＲＱＲＴ（配列番号１３）、ＩＲＱＲＱ（両方のＱを修飾することができる；配列番号１４）及びＦＲＹＲＱ（配列番号１５）がそれぞれ３つの異なる位置、すなわちＨＣ２９７、ＨＣ４４６及びＬＣ１４３に導入されている。発現収率（１Ｌ、μｇ／ｍＬ）及びコンジュゲーション（後方；ＨＩＣ／ＵＶ－ｖｉｓ）の結果を表４に示す。
【表29】
【0219】
さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による、それぞれ１５ヌクレオチド及び２０ヌクレオチドからなる一本鎖核酸にコンジュゲートさせた修飾抗体の生物物理学的特徴付けを行った。これを、ｍＡｂ－２（１５ヌクレオチド）について表５及び図１に例示的に示す。親水性マーカーの保持時間は９．２５分であり、疎水性マーカーの相対保持時間は２５．９分であった（ｍＡｂ－２）。
【表30】
【0220】
したがって、本発明者らは、発現収率に悪影響を及ぼさず、酵素のアクセス可能性を可能にする／提供する、ＩｇＧ骨格の長さに及ぶいくつかのＫａｌｂＴＧ Ｑタグ挿入部位の同定に成功した。
【0221】
したがって、Ｑタグの発現収率及び酵素的アクセス可能性に関する適切な挿入部位は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、１４３（ＬＣ１４３）及び２１４（ＬＣ２１４）並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、１７７（ＨＣ１７７）、２９７（ＨＣ２９７）、３４１（ＨＣ３４１）及び４０１（ＨＣ４０１）である（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0222】
さらに、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスを使用したｉｎ ｖｉｖｏ分析による、１つ又は２つの一本鎖核酸にそれぞれコンジュゲートさせた修飾抗体の薬物動態パラメーターを作成した。これらの結果を表６に示す。
【表31】
【0223】
したがって、ＱタグのＰＫ特性に関する好ましい挿入部位は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）並びに重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）及び２９７（ＨＣ２９７）にある（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0224】
したがって、第１の態様では、本発明は、重鎖及び軽鎖を含む修飾抗体に関し、重鎖又は／及び軽鎖は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）から選択される１つ以上の位置（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）にあるか、又はこれらの位置の後に挿入された、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ以上の（第１の）認識部位（複数可）を含む。したがって、本発明の修飾抗体では、ＫａｌｂＴＧの認識部位は、Ｉｇ重鎖ポリペプチドの定常領域の内部に位置し、すなわちいかなる末端にも、又は／及びＩｇ軽鎖定常ドメインの内部若しくはＣ末端にも位置しない。さらに、本発明の修飾抗体は、重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）、すなわちＣ末端にＫａｌｂＴＧの更なる第１の認識部位を含んでいてもよい。ある位置にＫａｌｂＴＧの認識部位を挿入するという関連では、非修飾配列中のその位置に存在するアミノ酸が認識部位によって置き換えられるか、又は認識部位が好ましくはその位置の後に更に挿入されることを意味する。
【0225】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0226】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0227】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、１つ以上の位置は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0228】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明による修飾抗体は２つの同一の重鎖又は重鎖Ｆｃ領域を含む。更なる実施形態では、そのような修飾抗体は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）から選択される１つ以上の位置に、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する２つ、４つ又はそれを超える（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0229】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明による修飾抗体が２つの異なる重鎖を含み、それにより、差異がヘテロ二量体化を誘導するためのそれぞれの突然変異から生じる。更なる実施形態では、そのような修飾抗体は、軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、位置１４３（ＬＣ１４３）及び位置２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）から選択される１つ以上の同一又は異なる位置に、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する１つ、２つ又はそれを超える（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0230】
同様に、本発明は、重鎖Ｆｃ領域を含む修飾抗体Ｆｃ領域に関し、重鎖Ｆｃ領域は、重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）、位置３４１（ＨＣ３４１）及び位置４０１（ＨＣ４０１）を含む位置の群から選択される１つ以上の位置にあるか、又はこれらの位置の後に挿入された、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つ以上の（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。したがって、本発明の修飾抗体Ｆｃ領域では、ＫａｌｂＴＧの認識部位は、Ｉｇ重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドの定常領域の内部に位置し、すなわちいかなる末端にも位置しない。さらに、本発明の修飾抗体Ｆｃ領域は、重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）、すなわちＣ末端にＫａｌｂＴＧの更なる第１の認識部位を含んでいてもよい。ある位置にＫａｌｂＴＧの認識部位を挿入するという関連では、非修飾配列中のその位置に存在するアミノ酸が認識部位によって置き換えられるか、又は認識部位が好ましくはその位置の後に更に挿入されることを意味する。
【0231】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、位置１７７（ＨＣ１７７）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置３４１（ＨＣ３４１）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0232】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、１つ以上の位置は、重鎖の位置３４１（ＨＣ３４１）、位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0233】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、１つ以上の位置は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）を含む位置の群から選択される（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0234】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）にあるクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0235】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）にあるクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0236】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にあるクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0237】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）にあるクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）。
【0238】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0239】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0240】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との少なくとも１つの（同族）対を含み、重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）及び位置２９７（ＨＣ２９７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0241】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0242】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0243】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の２９７（ＨＣ２９７）位にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の重鎖は、重鎖の１７７（ＨＣ１７７）位にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0244】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の１７７（ＨＣ１７７）位にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の重鎖は、重鎖の２９７（ＨＣ２９７）位にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）（ＫａｌｂＴＧ）由来のトランスグルタミナーゼに対する（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0245】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、抗体重鎖と抗体軽鎖との２つの（同族）対を含み、第１の対の重鎖は、重鎖の位置２９７（ＨＣ２９７）及び位置１７７（ＨＣ１７７）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する２つの（第１の）認識部位（複数可）を含み（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵナンバリングスキームに従う）、第２の対の軽鎖は、軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）にクツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）に対する１つの（第１の）認識部位（複数可）を含む（アミノ酸ナンバリングはＫａｂａｔのナンバリングスキームに従う）。
【0246】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）が、その位置の直後に挿入される。特定の実施形態では、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ）由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）は、２つのフレキシブルリンカーの間に挿入される。特定の実施形態では、クツネリア・アルビダＫｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａ由来のトランスグルタミナーゼ（ＫａｌｂＴＧ）の認識部位（複数可）は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）を有する。
【0247】
「抗体」及び「Ｉｇ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。それらは最も広い意味で使用され、例えば、結合特異性とは無関係のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長又はインタクトなモノクローナル抗体を含む）、一価抗体、（例えば１つのＦａｂを欠く完全長抗体）、多価抗体、すなわち二価又は四価の多重特異性抗体である抗体、及び上に概説した修飾の少なくとも１つを含む限り、完全長抗体の断片を含む。
【0248】
天然に存在する抗体は、重鎖のみ（例えば、重鎖のみのＶＨＨ抗体）、又は重鎖及び軽鎖（例えば野生型ＩｇＧ抗体）のアセンブリによって生成される。各重鎖は、４つのドメイン：可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成される。これらはフレキシブルヒンジ領域によって接続されている。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。重鎖及び軽鎖が存在する場合、軽鎖は同族の重鎖、すなわちＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖のＦａｂ断片と対合して、抗体の結合部位を形成する。関連する軽鎖及び重鎖Ｆａｂ断片を合わせてＦａｂ断片と表記する。重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを合わせて、抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドと表記する。１つの抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、例えば第２の抗体重鎖からの追加の抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドと二量体化してＦｃ領域を形成する。Ｆｃ領域は、フレキシブルヒンジ領域を介してＦａｂ断片（複数可）に接続される。したがって、特定の実施形態では、抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに加えて、ヒンジ領域の全部又は一部を更に含む。ヒンジ領域は、２つの抗体重鎖Ｆｃ領域ポリペプチドを互いに共有結合的に連結するいくつかのジスルフィド架橋を含む。Ｆａｂ断片では、軽鎖と重鎖のＦａｂ断片も１つのジスルフィド架橋によって接続されている。しかしながら、接続性はＩｇＧサブクラス間で異なる。全長ＩｇＧの全体構造はＹ字形に似ており、Ｆｃ領域が塩基を形成し、２つのＦａｂ断片がアームを形成し、抗原への結合に利用可能である。
【0249】
可変ドメイン内には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるループが存在する。これらは主に、抗体とその抗原との直接相互作用を担う。これらのＣＤＲにおけるアミノ酸の数の著しい変動のために、可変領域について複数のナンバリングスキームが存在する。本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔに従うナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照）は、カッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う」と称することによって更に明確にしている）に使用される。
【0250】
本明細書で使用される場合、「修飾抗体」という用語は、（所望の部位に）少なくとも１つの（人工）内部Ｑタグを含む本発明による抗体又は抗体Ｆｃ領域を示す。修飾抗体には、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗ｉｄ）抗体、重鎖のみの抗体及びその機能的断片が含まれるが、これらに限定されない。「機能的断片」という用語は、断片が由来する抗体の抗原結合活性の一部又は全部を保持するインタクトな抗体の一部を指す。抗体の機能的断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片等が挙げられる。特に、本発明による修飾抗体は、本発明による修飾が存在する限り、抗体分子及び抗体分子の免疫学的に活性な部分、例えば抗原結合ドメイン又は抗原に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、１つ以上の超える相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。本明細書で提供される修飾抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ、特定の実施形態ではＩｇＧ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２、好ましい一実施形態ではＩｇＧ１）、又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）のものであり得る。抗体は、ヒト化、キメラ及び／又は親和性成熟、並びに他の種、例えばマウス、ウサギ及びヒツジ由来の抗体であり得る。
【0251】
本発明によれば、特定の実施形態では、修飾抗体は、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む。したがって、特定の実施形態では、修飾抗体は、１つ又は２つ又は３つ又は４つのＦａｂ断片を含む。特定の実施形態では、修飾抗体は、同族軽鎖－重鎖対（１つの結合部位を含む）を形成する１つの（完全長）軽鎖及び１つの（完全長）重鎖と、（完全長）重鎖のＦｃ領域に関連するヒンジ領域を含む１つの重鎖Ｆｃ領域断片とを含む一価単一特異性抗体である。
【0252】
本発明によれば、特定の実施形態では、修飾抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体、特にヒト化、マウス、ウサギ、又はヒツジ抗体に基づくことができる。例示的かつ適切な配列を以下に示し、
の注釈では、「Ｘ」はアミノ酸残基／位置を示し、
はＱタグモチーフの挿入部位（リンカー配列あり又はなし）を示す：
【表32】
の注釈では、「Ｘ」はアミノ酸残基／位置を示し、
【表33】
はＱタグモチーフの挿入部位（リンカー配列あり又はなし）を示す：
【表34】
【表35】
【表36】
【表37】
【表38】
【0253】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明による修飾抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇ重鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域に基づく。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、本発明による少なくとも１つのＱタグを含む。
【0254】
特定の実施形態では、本発明による修飾抗体の基となり得るヒトＩｇＧ１重鎖ポリペプチドは、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を含む。本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体はＩｇＧ１抗体に基づくものであり、したがって、修飾／バリアントＩｇＧ１抗体である。特定の実施形態では、本発明による修飾抗体の基となり得るヒトＩｇＧ２重鎖ポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明による修飾抗体の基となり得るヒトＩｇＧ３重鎖ポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明による修飾抗体の基となり得るヒトＩｇＧ４重鎖ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を含む。
【0255】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明による修飾抗体が、本発明による挿入されたＫａｌｂＴＧ認識部位に加えて、以下の更なる変異（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を含む：
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
ａ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
ｂ）両Ｆｃ領域ポリペプチド中のＰ３２９Ｇ；
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｗ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
ｄ）一方のＦｃ領域ポリペプチド中のＳ３５４Ｃ、及び他方のＦｃ領域ポリペプチド中のＹ３４９Ｃ；
ｅ）ａ）及びｂ）；
ｆ）ａ）及びｂ）及びｃ）；又は
ｇ）ａ）及びｂ）及びｃ）及びｄ）。
【0256】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチドにおいて変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドにおいて変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含む。本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、修飾抗体は、第１のＦｃ領域ポリペプチド中に変異Ｓ３５４Ｃ及びＹ３４９Ｃの一方を更に含み、第２のＦｃ領域ポリペプチド中に他方を更に含む。
【0257】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、ヒト重鎖ポリペプチドに基づいており、配列番号８又は配列番号９又は配列番号３４に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を有する。
【0258】
【表39】
【0259】
本発明によれば、本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、修飾抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体、特に軽鎖定常ドメインを更に含むヒト化抗体に基づくものであり得る。本発明による修飾された軽鎖定常ドメインの例示的かつ適切な配列を以下に示し、
の注釈において、「Ｘ」はアミノ酸残基／位置を示し、
はＱタグモチーフの挿入部位を示す（リンカー配列あり又はなし）：
【表40】
の注釈において、「Ｘ」はアミノ酸残基／位置を示し、
【表41】
はＱタグモチーフの挿入部位を示す（リンカー配列あり又はなし）：
【表42】
【0260】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、本発明による修飾抗体の基となり得るヒト軽鎖ポリペプチドは、配列番号６又は７に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一である定常領域アミノ酸配列を含む。
【0261】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体のヒト軽鎖ポリペプチドは、配列番号１０：
に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する。
【表43】
に示すアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上及び最大１００％同一の定常領域アミノ酸配列を有する。
【0262】
好ましくは、非修飾軽鎖定常ドメインは、配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は該非修飾重鎖定常領域は、配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0263】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む非修飾軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる修飾重鎖定常領域であって、ＫａｌｂＴＧに対する少なくとも１つの認識部位が挿入されている、修飾重鎖定常領域を含む。
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む非修飾軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる修飾重鎖定常領域であって、ＫａｌｂＴＧに対する少なくとも１つの認識部位が挿入されている、修飾重鎖定常領域を含む。
【0264】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾軽鎖定常ドメインであって、少なくとも１つのＫａｌｂＴＧ認識部位が挿入されている修飾軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる非修飾重鎖定常領域を含む。
ａ）配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む修飾軽鎖定常ドメインであって、少なくとも１つのＫａｌｂＴＧ認識部位が挿入されている修飾軽鎖定常ドメイン；及び
ｂ）配列番号１～５のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる非修飾重鎖定常領域を含む。
【0265】
また好ましくは、軽鎖定常ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなるか、又は該重鎖定常領域が、配列番号８又は９又は３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはこれからなる。
【0266】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる軽鎖定常ドメインを含み、ｂ）配列番号８又は９又は３４のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はこれからなる修飾重鎖定常領域を含む。
【0267】
上に詳述したように、本発明による修飾抗体は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体であり得る。例示的な二重特異性抗体又は多重特異性抗体としては、以下のものが挙げられる：
－ドメイン交換を伴う全長抗体：
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１及びＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨ及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；及び
第２のＦａｂ断片が、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換を伴う全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖及びＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び修飾された第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的に操作される；
－ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）追加のＦａｂ断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、追加のＦａｂ断片とを含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－１アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）
－重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）；
－２アーム一本鎖フォーマット（＝２アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）
－軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）；
－一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）
－重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）。
－ドメイン交換を伴う全長抗体：
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１及びＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨ及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；及び
第２のＦａｂ断片が、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換を伴う全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖及びＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖及び修飾された第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的に操作される；
－ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）追加のＦａｂ断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、追加のＦａｂ断片とを含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含み、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－１アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）
－重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）；
－２アーム一本鎖フォーマット（＝２アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）
－軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）；
－一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ホール変異あり）
－重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ ノブ変異あり）。
【0268】
「特異的に結合する」という用語は、抗体が少なくとも１０－８ｍｏｌ／ｌの解離定数（＝ＫＤｉｓｓ）でその同族抗原と相互作用することを示す。したがって、「特異的に結合する」という用語は、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数（＝ＫＤｉｓｓ）を有する抗体のその同族抗原への結合を意味する。「特異的に結合しない（ｎｏｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」又は「特異的に結合しない（ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ）」という用語は、最大１０－７ｍｏｌ／ｌ以上、すなわち、例えば１０－５ｍｏｌ／ｌの解離定数（＝ＫＤｉｓｓ）での非関連抗原への抗体の結合を示す。同時に、「特異的に結合しない」という特性は、それぞれの非関連抗原に対して１０－７ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤｉｓｓによって保証される。特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体は、その同族抗原に対するその反応性と、無関係の抗原に対するその反応性との間に少なくとも１００倍のＫＤｉｓｓ－ギャップを有するであろう。
【0269】
抗体、特にＫＤｉｓｓの結合特性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置によって評価することができる。この方法では、結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化によって評価される。調査中の抗体を固相（チップと呼ばれる）に結合させ、問題の抗原をこの被覆チップに適用することによってその結合を評価することが簡便である。
【0270】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。
【0271】
多重特異性抗体はまた、特定の実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１及びＣＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原（複数可）に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが多重特異性抗体に含まれる場合、前記Ｆａｂ（複数可）は同じ抗原に特異的に結合する。
【0272】
「抗原」という用語は、抗体が選択的に結合することができる所定の標的を指す。抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン若しくはその断片、又は他の天然に存在する若しくは合成化合物であり得る。特定の実施形態では、抗原はポリペプチドである。別の実施形態では、抗原は治療に関連する。更に別の実施形態では、抗原は、体内の特定の領域、例えば特定の器官若しくは細胞型又は疾患領域に特異的であるか、又は送達を可能にする。これは、受容体又は腫瘍マーカー等の細胞の表面上の特定の構造であり得る。本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、抗原はヒトトランスフェリン受容体である。
【0273】
好ましくは、（ｉ）抗体は、重鎖及び／及び軽鎖の各々の２つのペアを含み、重鎖又は／及び軽鎖の各々が１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は（ｉｉ）抗体は、重鎖及び軽鎖の各々の２つのペアを含み、重鎖又は／及び軽鎖の一方が１つ以上の第１の認識部位を含むか、又は（ｉｉｉ）抗体は、重鎖及び軽鎖の１つのペア及び１つの追加の重鎖Ｆｃ領域を含み、重鎖又は／及び重鎖Ｆｃ領域断片、又は軽鎖は１つ以上の第１の認識部位を含む。
【0274】
本発明によれば、修飾抗体は、重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドに、ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の認識部位を含む。認識部位は、ＫａｌｂＴＧのモチーフを含み、ＫａｌｂＴＧは、修飾抗体と、修飾抗体に結合する化合物（ペイロード）との間のイソペプチド結合の形成を触媒することができる。典型的には、イソペプチド結合は、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）側鎖とリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）側鎖との間に形成される。好ましくは、本発明の修飾抗体を得るために抗体に導入される修飾は、抗体重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチド内の（人工）Ｑタグ、すなわちＫａｌｂＴＧによって認識されるＧｌｎ含有モチーフの生成を含む。適切なＱタグは、参照により本明細書に明示的に組み込まれる国際公開第２０１７／１０２７５９号に開示されている。特定の実施形態では、互いに独立した１つ以上の第１のＫａｌｂＴＧ認識部位は、Ｇｌｎ含有モチーフ、特に配列ＲＹＧＱＲ（配列番号１１）、ＲＷＲＱＲ（配列番号１２）、ＹＲＱＲＴ（配列番号１３）、ＩＲＱＲＱ（配列番号１４）、ＦＲＹＲＱ（配列番号１５）、又はＹＲＹＲＱ（配列番号１７）、特にＹＲＹＲＱ（配列番号１７）を含むか又は有する。Ｑタグは、置換又は挿入、好ましくは挿入等の１つ以上のアミノ酸修飾によって生成され得る。特定の実施形態では、Ｑタグは、ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）又はＲＶＲＱＲ（配列番号１８）、特にＹＲＹＲＱ（配列番号１７）を含むアミノ酸配列の挿入及び／又は置換によって生成される。好ましくは、挿入されたアミノ酸配列は、５から２０アミノ酸の長さを有し、ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）又はＲＶＲＱＲ（配列番号１８）、特にＹＲＹＲＱ（配列番号１７）を含む。特定の実施形態では、挿入は、リンカーを有しないＱタグモチーフであり、すなわち、挿入は、ＹＲＹＲＱ（配列番号１７）又はＲＶＲＱＲ（配列番号１８）、特にＹＲＹＲＱ（配列番号１７）からなる。ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の認識部位の導入は、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域における唯一の修飾であり得る。あるいは、精製のためのタグ（例えば、Ｈｉｓタグ）又は他の修飾、例えば安定性又はヘテロ二量体化の増加又はエフェクター機能の修飾等の更なる修飾が、単独で又は任意の組み合わせで存在してもよい。
【0275】
上記のように、ＫａｌｂＴＧの１つ以上の第１の認識部位（複数可）は、抗体の特定の部位、すなわち軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０）、１４３（ＬＣ１４３）及び２１４（ＬＣ２１４）、並びに重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８）、１７７（ＨＣ１７７）、２９７（ＨＣ２９７）、３４１（ＨＣ３４１）及び４０１（ＨＣ４０１）、特にＨＣ１７７及び／又はＨＣ２９７及び／又はＬＣ２１４から選択される１つ以上の位置に挿入される。特定の実施形態では、本発明の修飾抗体は、特に第１の認識部位で結合したドメインとは異なるドメインに連結するために、重鎖の位置４４６（ＨＣ４４６）、すなわちＣ末端にＫａｌｂＴＧの更なる（第２の）認識部位を含み得る。好ましくは、１つ以上の１の認識部位は、重鎖の位置１７７（ＨＣ１７７）若しくは２９７（ＨＣ２９７）又は軽鎖の位置２１４（ＬＣ２１４）において互いに独立している。
【0276】
特定の実施形態では、Ｑタグは、１つ又は２つのリンカー（複数可）の間に／を介して間隔を空けた抗体軽鎖／重鎖アミノ酸配列に挿入される。リンカーは、柔軟性を高め得るか、又はより大きなペイロードとのコンジュゲーション可能にし得る。特定の実施形態では、各リンカー配列は、互いに独立して、１～２０個のアミノ酸、特定の実施形態では１～１０個のアミノ酸、更なる実施形態では１～５個のアミノ酸を含み、前記リンカーは、Ｑタグ、ＫａｌｂＴＧ、抗体の折り畳み、及び修飾抗体に結合されるペイロードの機能を本質的に妨害しない。リンカーは、ＱタグにＮ末端及び／又はＣ末端に結合していてもよい。特定の実施形態では、リンカーアミノ酸は、グリシン又はセリンのような小さいアミノ酸である。アミノ酸リンカー及びそれらの組成物は、当技術分野で公知である（例えばＣｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．を参照）。アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、トレオニン及びグルタミン酸は、通常、フレキシブルリンカーのアミノ酸を構成する。したがって、リンカー（複数可）は、主に又は完全にＧｌｙ及び／又はＳｅｒ及び／又はＡｌａ及び／又はＴｈｒ及び／又はＧｌｕ、例えばＧＧＧＰ（配列番号２０）、ＥＳＧＳ（配列番号２１）又はＡＰＡＰ（配列番号２２）からなり得る。また、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２３）又はＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号２４）を含む又はそれからなるリンカーが存在してもよい。本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、リンカーは、互いに独立して、主に又は完全にＧｌｙ及びＳｅｒからなり、例えば、（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎであって、ｍ＝１、２、３又は４及びｎ＝１、２、３、４又は５であり、ｍ及びｎは互いに独立して、好ましくはｍ＝３及びｎ＝１である。本発明の全ての態様及び実施形態の１つの好ましい実施形態では、１つ以上の第１の認識部位は、その末端で１つ又は２つのリンカー（複数可）を介して重鎖又は／及び軽鎖アミノ酸配列に挿入され、特にリンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒから主に又は完全になり、例えば（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９）であって、ｎ＝１、２、３、４又は５であり、好ましくはｎ＝１である。
【0277】
リンカーが存在する場合、抗体へのアミノ酸配列Ｘ１－ＹＲＹＲＱ－Ｘ２（配列番号１７）又はＸ１－ＲＶＲＱＲ－Ｘ２（配列番号１８）の挿入である。Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、存在しないか、又はリンカー、特にリンカーアミノ酸である。本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、挿入は、２つのフレキシブルリンカー、特にＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）又はＧＧＧＳＲＶＲＱＲＧＧＧＳ（配列番号２６）、特にＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）を有するＱタグモチーフのものである。
【0278】
第１の認識部位（太字）を有する（配列番号３２、１１３と呼ばれる）及び有さない（配列番号３３、１１０と呼ばれる）ヒンジ領域の一部を含む例示的なＦｃ領域は、以下の配列を有する。
【表44】
【0279】
第２の態様では、本発明は、本発明による修飾抗体の鎖をコードする１つ以上の核酸に関する。
【0280】
本発明の修飾抗体をコードする核酸は、抗体を組換え生産するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで単離又は生成することができる。核酸は、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は更なる発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。
【0281】
「核酸」とは、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸の基本構造単位であるヌクレオチドには、天然のヌクレオチドだけでなく、修飾された糖又は塩基部位を有する類縁体も含まれる。本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、修飾され得る。そのような修飾には、コードされる配列が変化しない限り、ヌクレオチドの付加、欠失、又は非保存的若しくは保存的置換が含まれる。
【0282】
本発明による修飾抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を用いて単離又は合成することができる。
【0283】
多くの移入ベクター及び発現ベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【0284】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞において目的の遺伝子を発現させるための手段としてのプラスミドベクター；コスミドベクター；ウイルスベクター、例えば、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター等を指す。ベクター中の修飾抗体をコードする核酸は、プロモーター及びポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結されている。
【0285】
「作動的に連結された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合部位のアレイ）と別の核酸配列との間の機能的連結を指し、それにより制御配列は、他の核酸の転写及び／又は翻訳を制御する。
【0286】
真核細胞を宿主とする場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）を用いてもよく、又は動物ウイルス由来の哺乳動物プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター及びマウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）を用いてもよい。さらに、ポリアデニル化シグナル配列が、転写終結配列としてコード核酸の後に存在する。
【0287】
細胞は、前述のベクターで形質転換され得る。本発明の抗体を作製するために使用される細胞は、原核細胞、酵母細胞又は高等真核細胞であり得るが、それらに限定されない。
【0288】
しかしながら、最も興味深いのは動物細胞であり、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＧＳ－ＣＨＯ、ＣＨＯ ＤＸＢ－１１、ＣＨＯ ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【0289】
第３の態様では、本発明は、（ｉ）本発明による修飾抗体、及び（ｉｉ）ＫａｌｂＴＧに対する１つ以上の（第１の）認識部位（複数可）に共有結合的にコンジュゲートされた１つ以上の非抗体（ペイロード）ドメイン（複数可）を含む共有結合型コンジュゲートであって、非抗体ドメインがＫａｌｂＴＧの相補的な第２の認識部位を含む、共有結合型コンジュゲートに関する。本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、非抗体ドメインは、治療実体及び任意に第２のリンカーを含む治療部分である。
【0290】
上に詳述したように、本発明の修飾抗体は、ＫａｌｂＴＧの助けを借りて、１つ以上のペイロード、例えば治療部分を抗体の１つ以上の内部部位（複数可）に特異的にコンジュゲートするために提供される。それにより、標的化治療に使用され得るＡＤＣが得られる。コンジュゲートは、目的の標的に結合することができ、それによってペイロード、例えば治療部分を体内の意図された領域に輸送する。特定の実施形態では、本発明による修飾抗体は、標的を認識し、その相補性決定領域（ＣＤＲ）でそれに結合し、特に標的は細胞上に存在する生体分子である。
【0291】
上に詳述したように、治療部分を患者の体内の特定の領域に標的化することが望ましい場合がある。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ分布を改善し、有害な副作用を低減し得る。明らかに、治療部分を、そうでなければ到達しにくい領域に送達することが意図され得る。一例として、治療部分を脳内に誘導することが想定され得る。血液脳関門のために、特に治療部分が特定のサイズ制限を超える場合、脳に直接投与されない場合、「裸の」治療部分をそこに送達することは困難である。血液脳関門を克服し、治療部分を脳内に輸送するのを助ける治療アプローチが明らかに有利である。顕著には、治療薬を体内の別の領域に導くために同じアプローチが使用され得る。
【0292】
本発明では、体内の構造に特異的に結合する抗体の分子認識単位は、治療部分の標的化に使用される。上記を考慮すると、治療実体は、目的の疾患の処置又は予防に有用な任意の化合物、特に特定の器官又は細胞型又は疾患領域等の体内の特定の領域に送達される化合物であり得ることは明らかである。
【0293】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、症状、障害、若しくは疾患、又は症状、障害、若しくは疾患に関連する１つ以上の症候を緩和又は抑止すること、又は症状、障害若しくは疾患自体の原因（複数可）を緩和若しくは根絶することを含むことを意味する。「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、症状、障害、若しくは疾患、及び／又はその付随症候の発症を遅延及び／又は排除する方法；対象が症状、障害若しくは疾患を獲得することを妨げる方法；又は対象が症状、障害若しくは疾患を獲得するリスクを低下させる方法を含むことを意味する。
【0294】
このために、治療実体及び任意に第２のリンカーを含む非抗体ペイロードが、本発明の修飾抗体に共有結合的にコンジュゲートされる。治療部分は、活性治療実体又はプロドラッグを含む。任意に、第２のリンカーが存在してもよい。第２のリンカーは、例えばアルキル基又はポリエチレン基を含む化学的リンカー、又はペプチドリンカーであり得る。
【0295】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、治療実体は、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、特にＬＮＡヌクレオチドを含むＡＳＯ等の核酸であり、及び／又は治療実体は、毒素又は有機小分子又は免疫調節因子である。
【0296】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、治療実体は核酸である。特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらの混合物である。ＲＮＡという用語はまた、アンチセンスＲＮＡ、並びにｍｉＲＮＡに類似し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する、典型的には２０～２４塩基対長の二本鎖非コードＲＮＡ分子のクラスである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。それは、転写後にｍＲＮＡを分解することによって相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げ、それによって翻訳を妨げる。特定の実施形態では、核酸は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素と４’炭素とを接続する余分な架橋で修飾された修飾ＲＮＡヌクレオチドである。架橋は、３’－エンド（ノース）配座のリボースを「ロック」する。この構造は、酵素分解に対する安定性の増加に起因し得、更に、ＬＮＡの構造は、モノマー又はオリゴヌクレオチドの構成要素としての改善された特異性及び親和性を有する。特定の実施形態では、ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又は核酸中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合される。
【0297】
特定の実施形態では、追加的又は代替的に、治療実体は小分子であり得る。薬理学の分野では、小分子は低分子量（＜２，５００ダルトン、特に＜１，０００ダルトン）である。多くの小分子治療実体は、有機小分子である。有機小分子は、典型的には、特定の生物学的高分子に結合し、エフェクターとして作用し、標的の活性又は機能を変化させる。これらの化合物は、天然（一次及び二次代謝産物等）又は人工（すなわち、天然に存在しない）であり得、それらは疾患に対して有益な効果を有する。
【0298】
本発明において、治療実体は、任意に第２のリンカーを介して本発明の修飾抗体に共有結合している非抗体ドメインである。リンカーの長さ、剛性及び化学組成は、コンジュゲーション反応速度及び得られるコンジュゲートの安定性に影響を及ぼし得るため、リンカーは、意図される標的及び治療実体に依存し得る。本発明の全ての態様及び実施形態の１つの好ましい実施形態では、（第２の）リンカーは、アルキルリンカー又はポリエチレンリンカー又はペプチドリンカー又はそれらの混合物である。特定の実施形態では、（第２の）リンカーは、エチレングリコール（ＰＥＧ）単位、例えば約２～５０個のエチレングリコール単位を含む。例示的なリンカーとしては、ポリエチレングリコールリンカー（（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＰＥＧｎ－ＮＨ２、ｎ＝２～２５）が挙げられる。特定の実施形態では、（第２の）リンカーは、脂肪族炭素鎖である。リンカーは、非置換又は置換Ｃ１～６アルキル等の非置換又は置換アルキルを含んでもよく、Ｃ１～６アルキルは、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルコキシカルボニル、カルボニルアルコキシ、アシルアミノ、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シアノ、アジド、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、チオール、チオアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、アミノスルホニル、スルホニルアミノ、スルホニル及びオキソからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい。特定の実施形態では、（第２の）リンカーは、ペプチドリンカー、すなわち、アミノ酸から構成されるリンカーである。
【0299】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、コンジュゲートは、本発明による修飾抗体と、１つ以上治療用核酸、例えばＡＳＯとを含み、各治療用核酸は、イソペプチド結合を介して単一のＱ－タグに連結され、任意に、上で定義したように、第２のリンカー、特にＰＥＧリンカーを介してＫ－タグの末端残基にアミド結合されている。
【0300】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、コンジュゲートは、約１～約８、約１～約４、又は約１～約２の範囲のＤＡＲを有する。別の実施形態では、コンジュゲートは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７又は約８のＤＡＲを有する。
【0301】
抗体が標的に結合すると、コンジュゲートはエンドサイトーシスによってそれぞれの細胞に輸送され、治療実体は放出され、意図した方法（例えば、疾患を処置する）で作用することができる。
【0302】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は１つの標的を認識し、前記標的は受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する受容体、例えばヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）又はヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、特にＴｆＲ１である。
【0303】
例えばＴｆＲ１又はＩＧＦ－１Ｒ等の特異的受容体の場合、抗体が標的に結合すると、コンジュゲートはエンドサイトーシスによってそれぞれの細胞に輸送され、エンドソームから放出され、細胞から再びエキソサイトーシスされる。細胞が血液脳関門等の障壁の一部である場合、それによってそれぞれの障壁を越える輸送が達成される。それにより、治療実体は、本発明による修飾抗体にコンジュゲートされていない治療実体が到達することができなかった身体の区画に輸送される。
【0304】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、修飾抗体は、血液脳関門の通過を可能にする構造に特異的に結合する。特定の実施形態では、血液脳関門の通過を可能にする構造はヒトトランスフェリン受容体である。
【0305】
特定の実施形態では、修飾抗体は、１つ又は２つの標的（複数可）を認識し、前記１つ又は２つの標的は、腫瘍細胞（例えば、乳がん細胞）に特異的な腫瘍マーカー等の特定の細胞型に特異的である。
【0306】
本発明の全ての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、本発明による修飾抗体は、脳疾患、例えばパーキンソン病又はアルツハイマー病を処置又は予防するためのＲＮＡ又はＬＮＡを含む治療実体、及び任意にＰＥＧリンカーを含む非抗体ドメインにコンジュゲートされる。
【0307】
第４の態様では、本発明は、本発明による修飾抗体を治療実体に共有結合的にコンジュゲートさせる方法に関し、該方法は、
ａ）本発明による修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体、
（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される修飾抗体中に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、好ましい一実施形態では、Ｌｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）を含むか又は有する、第２の認識部位、及び
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーを含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の修飾抗体及びｂ）の非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下、かつ、ＫａｌｂＴＧの活性を助長する条件下でインキュベート又は反応させ、それにより、第１の認識部位と第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、したがって、修飾抗体を治療実体にコンジュゲートさせることと、を含む。
ａ）本発明による修飾抗体を提供することと、
ｂ）非抗体ドメインを提供することであって、非抗体ドメインが、
（ｉ）治療実体、
（ｉｉ）（ｉ）の下で提供される修飾抗体中に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、好ましい一実施形態では、Ｌｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）を含むか又は有する、第２の認識部位、及び
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーを含む、非抗体ドメインを提供することと、
ｃ）ａ）の修飾抗体及びｂ）の非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片の存在下、かつ、ＫａｌｂＴＧの活性を助長する条件下でインキュベート又は反応させ、それにより、第１の認識部位と第２の認識部位との間にイソペプチド結合を形成し、したがって、修飾抗体を治療実体にコンジュゲートさせることと、を含む。
【0308】
本方法の第１の工程では、本発明の修飾抗体及び非抗体ドメインが提供される。
【0309】
非抗体ドメインは、
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、すなわち、修飾抗体がＱタグを含む場合、非抗体ドメインはＫタグを含むか、又はその逆であり、特に、第２の認識部位はＬｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）（Ｋタグ）を含むか、又は有する、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーとを含む。
（ｉ）治療実体と、
（ｉｉ）修飾抗体に存在する第１の認識部位に相補的なＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位、すなわち、修飾抗体がＱタグを含む場合、非抗体ドメインはＫタグを含むか、又はその逆であり、特に、第２の認識部位はＬｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）（Ｋタグ）を含むか、又は有する、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位と、
（ｉｉｉ）任意に、治療実体と第２の認識部位との間の第２のリンカーとを含む。
【0310】
ドメインは、上で定義したとおりであり得る。
【0311】
修飾抗体及び非抗体ドメインを、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片（野生型ＫａｌｂＴＧと同等の酵素活性を有するＫａｌｂＴＧのバリアント又は断片を意味する）の存在下、及びＫａｌｂＴＧの活性を助長する条件下でインキュベートする、すなわち反応させ、それにより、第１及び第２の認識部位の間にイソペプチド結合が形成され、したがって修飾抗体が治療実体にコンジュゲートされる。
【0312】
本発明によるこの方法の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、抗体は、ＫａｌｂＴＧの酵素活性を使用してそれぞれの１つ以上のＫタグにコンジュゲートされる１つ以上のＱタグ（複数可）を含む。
【0313】
非抗体ドメインは、ＫａｌｂＴＧに対する第２の認識部位を含む。本発明によるこの方法の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、非抗体ドメインは、ペプチド配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＫタグを含む。
【0314】
ＫａｌｂＴＧを含む微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、Ｇｌｎ－Ｌｙｓイソペプチド結合の形成を触媒し、食品及びバイオテクノロジー用途におけるタンパク質及びペプチドの架橋に広く使用されている（例えば、タンパク質が豊富な食品の質感を改善するために、又は抗体－薬物コンジュゲートを生成することにおいて）。
【0315】
しかしながら、ＫａｌｂＴＧは、既知のｍＴＧ基質又は一般的に使用される標的タンパク質、例えば抗体との交差反応性を本質的に示さず、したがって、所定の部位での特異的コンジュゲーションを可能にする。
【0316】
したがって、ＫａｌｂＴＧのための第２の認識部位（Ｋタグ）を含む、特に第２の認識部位がＬｙｓ含有モチーフ、特に配列ＲＹＥＳＫ（配列番号１６）を含む又は有する本質的に任意のペイロードは、１つ以上の第１の認識部位（複数可）、すなわちＱタグで修飾抗体にコンジュゲート／結合され得る。
【0317】
ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアント若しくは断片は、Ｓｔｅｆｆｅｎ ａｔ ａｌ．（２０１７）又は国際公開第２０１６／１００７３５号Ａ１に定義されるとおりであり得る（いずれも参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
【0318】
機能的に活性なバリアント又は断片は、国際公開２０１６／１００７３５号Ａ１（その中の配列番号６を参照）のＫａｌｂＴＧと少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するトランスグルタミナーゼであり得る。あるいは、ＫａｌｂＴＧ又はその機能的に活性なバリアントは、例えば精製目的のために、タグ等の標識を追加的に含む融合タンパク質の一部であり得る。
【0319】
特定の実施形態では、ＫａｌｂＴＧは、アミノ酸配列（３文字コード）を含む。
【表45】
【0320】
本発明による方法の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、前記連結は制御され、例えば、非抗体ドメインと修飾抗体との化学量論比、例えばＱタグ／Ｋタグ対当たり約１：１で達成される。２つ又は更には複数のペイロードを修飾抗体に結合させるために、１つの修飾抗体上の２つ以上の第１の認識部位を使用することによって、複数のコンジュゲーションを達成することもできる。
【0321】
第５の態様では、本発明の修飾抗体を含むか、又は本発明の方法に従って製造された共有結合型コンジュゲートは、医薬として使用するためのもの、特にアルツハイマー病若しくはパーキンソン病等の神経疾患若しくは脳疾患の処置に使用するためのもの、又は乳がん等のがんの処置に使用するためのものである。
【0322】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、疾患は神経疾患である。特定の実施形態では、神経疾患は、神経障害、神経変性疾患、がん、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳転移を伴うＣＤ２０陽性がん、及び脳転移を伴うＨＥＲ２陽性がんからなる群から選択される。
【0323】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、神経疾患は、ニューロパチー障害、神経変性疾患、がん、眼疾患障害、発作障害、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、ウイルス性又は微生物性疾患、虚血、行動障害、及びＣＮＳ炎症からなる群から選択される。
【0324】
上に詳述したように、本発明による修飾抗体を含むコンジュゲートは、医薬として、特に（アルツハイマー病又はパーキンソン病の好ましい一実施形態において）神経疾患又は脳疾患の処置において、又は乳がん等のがんの処置に使用するために使用することができる。
【0325】
コンジュゲートは、組成物に包含され得る。医薬組成物とも呼ばれるそのような組成物は、医薬分野での使用又は医薬としての使用を意図した組成物であり、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、医薬組成物が投与される対象に対して許容できないほどに毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。組成物は、任意に、薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又は担体、例えば緩衝物質、安定剤又は保存剤、及び任意に、更なる有効成分、特に医薬組成物に関連して公知の成分を含有し得る。
【0326】
一般に、追加の成分の性質は、医薬組成物の特定の形態及び使用される投与様式に依存する。薬学的に許容され得る担体は、組成物を増強若しくは安定化するか、又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。そのような担体としては、生理的に適合性の生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、溶媒、分散媒、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は投与様式に適するべきである。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬学的及び生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤及びｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性補助物質を含有することができる。
【0327】
医薬組成物は、安定剤を含み得る。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じる有害な条件等から組成物を保護し、及び／又はある条件若しくは状態での本発明のコンジュゲートの安定性又は貯蔵寿命を延長する物質を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース及びマンノース等の糖；マンニトール等の糖アルコール；グリシン又はグルタミン酸等のアミノ酸；及びヒト血清アルブミン又はゼラチン等のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0328】
典型的には、コンジュゲートの治療有効用量又は有効用量が、本発明の医薬組成物において用いられる。投与されるコンジュゲートの量は、最初に、同等の連結されていない治療薬の用量及び／又は投与レジメンのガイダンスに基づいて決定することができる。一般に、コンジュゲートは、標的化送達を提供することができ、したがって、投与レジメンにおける用量の減少又は投与の減少の少なくとも１つを提供することができる。したがって、コンジュゲートは、本発明のコンジュゲート中に存在する前の治療薬と比較して、投与レジメン中の用量の減少及び／又は投与の減少を提供することができる。上記のように、コンジュゲートは、薬物送達の制御された化学量論を提供することができるため、コンジュゲートの投与量は、抗体－治療実体抱合体ごとに提供される薬物分子の数に基づいて計算することができる。
【0329】
本発明の医薬組成物は、１回若しくは数回、又は複数回投与され得る。コンジュゲートの投与頻度は、種々の因子のいずれか、例えば症候の重症度等に応じて変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、４ヶ月に１回、３ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、１週間おきに（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おきに（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日に２回（ｑｉｄ）又は１日に３回（ｔｉｄ）投与される。
【0330】
特定の実施形態では、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物は、１つ以上の追加の化合物と同時に投与される。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物は、追加の化合物（複数可）の前又は後に投与される。
【0331】
本発明の医薬組成物は、個体を処置するための医薬として使用され得る。個体は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、個体はヒトである。
【0332】
本明細書に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物は、当技術分野で公知の送達技術を使用して、細胞、細胞群、腫瘍、組織、又は対象に送達することができる。一般に、コンジュゲートを送達するための当技術分野で認識されている任意の適切な方法を、本明細書に記載の組成物との使用に適合させることができる。例えば、送達は、局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、直接注射、埋め込み、又は局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与）、全身投与、又は皮下、静脈内、眼内、腹腔内、若しくは頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及び髄腔内）を含む非経口経路、又は筋肉内投与によるものであり得る。本発明の共有結合型コンジュゲートは、静脈内、筋肉内又は動脈内に投与することが好ましく、静脈内に投与することがより好ましい。投与の容易さ及び投与量の均一性のため、上述の医薬組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含有する。そのような単位剤形の例は、注射可能な溶液又は懸濁液等である。
【0333】
上に詳述したように、本発明のコンジュゲート／医薬組成物は、アルツハイマー病又はパーキンソン病等の神経疾患又は脳疾患の処置に特に有用である。「神経疾患」という用語は、とりわけ、神経変性疾患、神経炎症性疾患又は発作障害、特に脳のものを包含する。神経変性疾患は、ニューロンの死を含むニューロンの構造又は機能の進行性喪失を特徴とする。パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び多発性硬化症を含む多くの神経変性疾患は、神経変性過程の結果として起こる。非定型タンパク質集合及び誘導された細胞死を含む異なる神経変性障害間には多くの類似点がある。神経変性は更に、分子から全身に及ぶ多くの異なるレベルの神経回路に見ることができる。「神経変性疾患」及び「神経炎症性疾患」という用語は、部分的に重複する範囲を有する。炎症応答は、神経変性疾患の顕著な特徴であり、神経細胞死において異なる機構を介して関与するか、又は寄与する。キヌレニン経路（ＫＰ）に沿ったトリプトファン異化は、これらの機構の１つを表す。発作障害は、脳細胞間の異常なシグナル伝達を特徴とする脳障害である。発作障害は、脳の一部（部分発作）又は脳全体（全般発作）を冒し得る。最も顕著な発作性障害はてんかんである。血液脳関門を通過するために、受容体媒介型受容体誘導性エンドサイトーシスをコンジュゲートの標的として使用することができる。例えば、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）又は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、特にＴｆＲ１が挙げられる。
【0334】
他に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的及び科学的用語及び任意の頭字語は、本開示の分野の当業者により共通して理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の、又は同等の任意の方法及び材料を本明細書で提示された実施において使用することができるが、特定の方法、及び材料が本明細書に記載されている。
【0335】
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されない。理由はこれらが変動し得るからである。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施に使用することができ、例示的な方法及び材料を本明細書に記載する。さらに、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的のためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【0336】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈される。同様に、「又は」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「及び」を含むことを意図している。「複数」という用語は、２つ以上を指す。
【0337】
以下の図、配列及び実施例は、本発明の様々な実施形態を例示することを意図している。したがって、説明された特定の変更は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な同等物、変更、及び修正を行うことができることは当業者には明らかであり、したがって、そのような同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0338】
【図1】１５残基を有する一本鎖核酸にコンジュゲートした９つの異なるＱタグ挿入部位を有するｍＡｂ－２（ＨＥＲ ２）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを示す。
【図2】ｍＡｂと核酸ペイロードとの単一工程ＫａｌｂＴＧ媒介コンジュゲーションの例示的な反応を示す。
【実施例0339】
実施例１
本発明による修飾抗体の組換え生産
遺伝子の合成
所望の遺伝子セグメントを化学合成によって調製し、合成した遺伝子断片をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国サンフランシスコ）によってＨＥＫ２９３細胞及びＥｘｐｉ２９３細胞での発現に適したベクターにクローニングした。
本発明による修飾抗体の組換え生産
遺伝子の合成
所望の遺伝子セグメントを化学合成によって調製し、合成した遺伝子断片をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国サンフランシスコ）によってＨＥＫ２９３細胞及びＥｘｐｉ２９３細胞での発現に適したベクターにクローニングした。
【0340】
哺乳動物細胞における修飾抗体の発現
抗体産生を、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で培養したＨＥＫ２９３細胞又はＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）中のＥｘｐｉ２９３細胞における単一発現カセットプラスミドの一過性共トランスフェクションによってそれぞれ行った。トランスフェクションは、対称標準ＩｇＧ１フォーマットの場合、ＨＣ：ＬＣ発現プラスミドのプラスミド比＝１：１で、又は非対称ノブ・イントゥ・ホールフォーマットの場合、ＨＣ１：ＨＣ２：ＬＣ発現プラスミドのプラスミド比＝１：１：１で、製造者の説明書に指定されているように行った。細胞培養上清をトランスフェクションの７日後に回収した。上清を低温（例えば－２０℃）で保存した。
抗体産生を、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で培養したＨＥＫ２９３細胞又はＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）中のＥｘｐｉ２９３細胞における単一発現カセットプラスミドの一過性共トランスフェクションによってそれぞれ行った。トランスフェクションは、対称標準ＩｇＧ１フォーマットの場合、ＨＣ：ＬＣ発現プラスミドのプラスミド比＝１：１で、又は非対称ノブ・イントゥ・ホールフォーマットの場合、ＨＣ１：ＨＣ２：ＬＣ発現プラスミドのプラスミド比＝１：１：１で、製造者の説明書に指定されているように行った。細胞培養上清をトランスフェクションの７日後に回収した。上清を低温（例えば－２０℃）で保存した。
【0341】
タンパク質力価の定量
上清試料のタンパク質力価を、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）でＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍカラム、２．１×３０ｍｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって決定した。０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４で平衡化したカラムに上清をロードし、続いて０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出した。力価を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量し、続いて、分析物の溶出ピーク面積（曲線下）を参照標準曲線と比較することによってタンパク質濃度を計算した。
上清試料のタンパク質力価を、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）でＰＯＲＯＳ Ａ ２０μｍカラム、２．１×３０ｍｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって決定した。０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４で平衡化したカラムに上清をロードし、続いて０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出した。力価を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量し、続いて、分析物の溶出ピーク面積（曲線下）を参照標準曲線と比較することによってタンパク質濃度を計算した。
【0342】
哺乳動物培養上清からの修飾抗体の精製
培養上清中の抗体を、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄することによって除去した。修飾抗体を５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）で溶出し、溶出液のｐＨを２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）の添加によって直ちにｐＨ７．５に調整した。２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを第２の精製工程として行った。精製した修飾抗体を－８０℃で保存した。
培養上清中の抗体を、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗浄することによって除去した。修飾抗体を５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）で溶出し、溶出液のｐＨを２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）の添加によって直ちにｐＨ７．５に調整した。２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを第２の精製工程として行った。精製した修飾抗体を－８０℃で保存した。
【0343】
中規模自動化（Ｍｉｌａｎ）を用いた抗体の精製
抗体を、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）からのカラムを備えた液体処理システム（Ｔｅｃａｎ、スイス国メンネドルフ）でＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ、米国マサチューセッツ州マールボロー）を使用して、上記のようなプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して一段階で精製した。平衡化、試料ローディング及び洗浄の工程を記載のように行い、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０を使用してカラムから抗体を溶出した。溶出した抗体画分を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で中和し、濃度を２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
抗体を、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）からのカラムを備えた液体処理システム（Ｔｅｃａｎ、スイス国メンネドルフ）でＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ、米国マサチューセッツ州マールボロー）を使用して、上記のようなプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して一段階で精製した。平衡化、試料ローディング及び洗浄の工程を記載のように行い、２５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０を使用してカラムから抗体を溶出した。溶出した抗体画分を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で中和し、濃度を２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。
【0344】
例示的抗体の概要
抗体１１０：
説明：
Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１サブクラスに基づく抗ＨＥＲ２抗体；アミノ酸残基１７７（ＨＣ１７７）後のＨＣへのＱタグ挿入（ＥＵナンバリング）；Ｑタグ及びスペーサー配列：ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）
抗体１１０：
説明：
Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１サブクラスに基づく抗ＨＥＲ２抗体；アミノ酸残基１７７（ＨＣ１７７）後のＨＣへのＱタグ挿入（ＥＵナンバリング）；Ｑタグ及びスペーサー配列：ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）
【表46】
【0345】
抗体１１３：
説明：
Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１サブクラスに基づく抗ＨＥＲ２抗体；アミノ酸残基４０１（ＨＣ４０１）後のＨＣへのＱタグ挿入（ＥＵナンバリング）；Ｑタグ及びスペーサー配列：ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）
説明：
Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１サブクラスに基づく抗ＨＥＲ２抗体；アミノ酸残基４０１（ＨＣ４０１）後のＨＣへのＱタグ挿入（ＥＵナンバリング）；Ｑタグ及びスペーサー配列：ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）
【表47】
【表48】
【0346】
修飾抗体の発現は、導入されたＱタグの位置に影響される。ＬＣ１１０、ＬＣ２１４、ＨＣ１１８、ＨＣ１７７、ＨＣ２９７、ＨＣ３４１及びＨＣ４０１の後に導入すると、最高の収率が得られた。
【0347】
実施例２
本発明による修飾抗体の蛍光色素へのＫａｌｂＴＧコンジュゲーション
ＫａｌｂＴＧを用いたコンジュゲーション
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のため、抗体をＫタグ小分子（蛍光色素、１０×モル過剰）と混合し、ＫａｌｂＴＧを添加した（モル比ｍＡｂ：ＫａｌｂＴＧ＞１００：１）。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化ペイロード及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製したコンジュゲートを－８０℃で保存した。
本発明による修飾抗体の蛍光色素へのＫａｌｂＴＧコンジュゲーション
ＫａｌｂＴＧを用いたコンジュゲーション
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のため、抗体をＫタグ小分子（蛍光色素、１０×モル過剰）と混合し、ＫａｌｂＴＧを添加した（モル比ｍＡｂ：ＫａｌｂＴＧ＞１００：１）。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化ペイロード及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製したコンジュゲートを－８０℃で保存した。
【0348】
コンジュゲートの分析
タンパク質の定量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて行った。さらに、定性的ＤＡＲ測定を、以下の実施例４に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行った。コンジュゲートの純度を、製造者の説明書（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に従ってＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）タンパク質特性評価システムを使用して変性及び還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。
タンパク質の定量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて行った。さらに、定性的ＤＡＲ測定を、以下の実施例４に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行った。コンジュゲートの純度を、製造者の説明書（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に従ってＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）タンパク質特性評価システムを使用して変性及び還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。
【0349】
凝集体含有量は、高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ６．２で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ ３０００分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ国グリースハイム）を使用してＳＥＣによって決定した。
【0350】
コンジュゲートの同一性を、ＥＳＩ－Ｑ－ＴｏＦ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ ４３３、Ｂｒｕｋｅｒ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）によって確認した。ＭＳ分析のため、Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）を使用して試料を脱グリコシル化し、続いて２％ギ酸、４０％アセトニトリルに脱塩した。
【表49】
【0351】
実施例３
核酸への本発明による修飾抗体のＫａｌｂＴＧコンジュゲーション
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ＤＮＡ及びＬＮＡホスホロアミダイト及び全ての標準試薬は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（ドイツ国ダルムシュタット）から購入した。Ｋタグペプチドは、Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｎ Ａｐ（デンマーク国コペンハーゲン）及びＢｉｏｓｙｎｔａｎ（ドイツ国ベルリン）によってカスタム合成した。
核酸への本発明による修飾抗体のＫａｌｂＴＧコンジュゲーション
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ＤＮＡ及びＬＮＡホスホロアミダイト及び全ての標準試薬は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（ドイツ国ダルムシュタット）から購入した。Ｋタグペプチドは、Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｎ Ａｐ（デンマーク国コペンハーゲン）及びＢｉｏｓｙｎｔａｎ（ドイツ国ベルリン）によってカスタム合成した。
【0352】
オリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、デンマーク国ブロンビー）上のＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ ３５０支持体（Ｋｉｎｏｖａｔｅ、カリフォルニア州オーシャンサイド）上で１３０ｍｍｏｌスケールで合成した。合成後、オリゴヌクレオチドを支持体から一晩切断した。オリゴヌクレオチドをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜を使用して脱塩した。凍結乾燥後、化合物を最後に液体クロマトグラフィー－質量分析（逆相及びエレクトロスプレーイオン化－質量分析）によって特徴付けた。
【0353】
オリゴヌクレオチドを、Ｋタグにコンジュゲートするためのそれぞれのリンカー（１段階反応）又はクリック化学コンジュゲーションのためのアクセプター部分（２段階反応）のいずれかにコンジュゲートした。次いで、コンジュゲートを、以下に記載されるように逆相ＨＰＬＣによる精製に直接供した。
【0354】
アセトン中の２％過塩素酸リチウムによるリンカーオリゴヌクレオチドの沈殿後、得られた沈殿物をアセトンで洗浄し、真空下で乾燥させ、ＰＢＳに再溶解した。１．５当量のＫ－タグペプチドをＰＢＳに溶解し、添加した。室温で１時間後、反応混合物を逆相ＨＰＬＣによる精製に直接供した。
【0355】
上記の両方の反応物を、溶離液として０．１Ｍ酢酸アンモニウム及びアセトニトリルを使用して、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ １８ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ、３００Å、１０μｍ、１０ｍｍ×１５０ｍｍでの逆相ＨＰＬＣによって精製した。プールした画分を凍結乾燥し、水に再溶解し、ＮａＯＨ水溶液でｐＨをｐＨ７．０に調整した。最終凍結乾燥後、化合物を最後に液体クロマトグラフィー－質量分析（逆相及びエレクトロスプレーイオン化－質量分析）によって特徴付けた。
【0356】
Ｑタグを有する抗体へのＬＮＡ－ＡＳＯの酵素的コンジュゲーション
ＫａｌｂＴＧを用いた１段階コンジュゲーション
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（約１５０ｍＭ塩化物イオン、ｐＨ７．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のために、抗体を過剰のＫタグ付きオリゴヌクレオチドと混合し、ＫａｌｂＴＧ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）を添加した。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化ペイロード及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製したコンジュゲートを－８０℃で保存した。
ＫａｌｂＴＧを用いた１段階コンジュゲーション
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（約１５０ｍＭ塩化物イオン、ｐＨ７．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のために、抗体を過剰のＫタグ付きオリゴヌクレオチドと混合し、ＫａｌｂＴＧ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）を添加した。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化ペイロード及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製したコンジュゲートを－８０℃で保存した。
【0357】
ＫａｌｂＴＧ及びクリックケミストリーを使用した２段階コンジュゲーション
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のために、抗体をクリックコンジュゲーションの第１の部分を含む過剰のＫタグ付きリンカー（１０倍モル過剰）と混合し、ＫａｌｂＴＧを添加した。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化リンカー及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製した抗体－リンカーコンジュゲートを、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中のクリックコンジュゲーションのそれぞれの他の部分にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの過剰量に添加し、反応混合物を振盪しながら室温で一晩インキュベートした。抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、精製されたコンジュゲートを－８０℃で保存した。
Ｑタグを含有する精製抗体を、透析を介してコンジュゲーション緩衝液（ＮａＣｌ、ｐＨ８．５を含むヒスチジン緩衝液）に移した。ＫａｌｂＴＧ反応のために、抗体をクリックコンジュゲーションの第１の部分を含む過剰のＫタグ付きリンカー（１０倍モル過剰）と混合し、ＫａｌｂＴＧを添加した。反応混合物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、続いて溶液に１０ｍＭ硫酸アンモニウムを添加することによって反応をクエンチした。非コンジュゲート化リンカー及び残留酵素を除去するために、コンジュゲート化修飾抗体を、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製した抗体－リンカーコンジュゲートを、ＰＢＳ、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ７．５中のクリックコンジュゲーションのそれぞれの他の部分にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの過剰量に添加し、反応混合物を振盪しながら室温で一晩インキュベートした。抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、精製されたコンジュゲートを－８０℃で保存した。
【0358】
コンジュゲートの分析
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの定量を、ＳｏｌｏＶＰＥシステム（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ニュージャージー州ブリッジウォーター）を用いて２６０、２８０及び３５０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって行った。ランベルト・ベールの式を用いて、コンジュゲート濃度及び定量的薬物抗体比（ＤＡＲ）を計算した。さらに、定性的ＤＡＲ測定を、以下の実施例４に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行った。コンジュゲートの純度を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）タンパク質特性評価システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して変性及び還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。凝集体含有量は、高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ６．２で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ ３０００分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ国グリースハイム）を使用してＳＥＣによって決定した。コンジュゲートの同一性を、ＥＳＩ－Ｑ－ＴｏＦ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ ４３３、Ｂｒｕｋｅｒ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）によって確認した。ＭＳ分析のため、Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）を使用して試料を脱グリコシル化し、続いて２％ギ酸、４０％アセトニトリルに脱塩した。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの定量を、ＳｏｌｏＶＰＥシステム（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ニュージャージー州ブリッジウォーター）を用いて２６０、２８０及び３５０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって行った。ランベルト・ベールの式を用いて、コンジュゲート濃度及び定量的薬物抗体比（ＤＡＲ）を計算した。さらに、定性的ＤＡＲ測定を、以下の実施例４に記載の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行った。コンジュゲートの純度を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）タンパク質特性評価システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して変性及び還元条件下でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。凝集体含有量は、高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で、０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ６．２で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ ３０００分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ国グリースハイム）を使用してＳＥＣによって決定した。コンジュゲートの同一性を、ＥＳＩ－Ｑ－ＴｏＦ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ ４３３、Ｂｒｕｋｅｒ、米国マサチューセッツ州ビレリカ）によって確認した。ＭＳ分析のため、Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）を使用して試料を脱グリコシル化し、続いて２％ギ酸、４０％アセトニトリルに脱塩した。
【表50】
【0359】
修飾抗体のコンジュゲーションは、導入されたＱタグの位置に影響される。ＬＣ１１０、ＬＣ１４３、ＬＣ２１４、ＨＣ１１８、ＨＣ１７７、ＨＣ２９７、及びＨＣ３４１の位置の後の導入は、最良のコンジュゲーション効率をもたらした。
【表51】
【0360】
実施例４
本発明によるＫａｌｂＴＧコンジュゲート修飾抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、ＴＳＫｇｅｌブチル－ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６×３５ｍｍ、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本国東京）を流速１ｍＬ／分で使用して高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で行った。カラムを溶離液Ａ（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４二水和物、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０）で平衡化し、各試料６０μｇをカラムにロードした。続いて、溶離液Ａと溶離液Ｂとの間の勾配（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４二水和物、２５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ｐＨ７．０）を適用した。
勾配：
０分 ５％Ｂ
０～３０分 ５％Ｂ→８０％Ｂ
３０～３４分 ８０％Ｂ－＞１００％Ｂ
３４～４４分 １００％Ｂ
４５～５５分 ０％Ｂ
本発明によるＫａｌｂＴＧコンジュゲート修飾抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、ＴＳＫｇｅｌブチル－ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６×３５ｍｍ、ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本国東京）を流速１ｍＬ／分で使用して高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で行った。カラムを溶離液Ａ（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４二水和物、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０）で平衡化し、各試料６０μｇをカラムにロードした。続いて、溶離液Ａと溶離液Ｂとの間の勾配（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４二水和物、２５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、ｐＨ７．０）を適用した。
勾配：
０分 ５％Ｂ
０～３０分 ５％Ｂ→８０％Ｂ
３０～３４分 ８０％Ｂ－＞１００％Ｂ
３４～４４分 １００％Ｂ
４５～５５分 ０％Ｂ
【0361】
２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に測定することによって、溶出プロファイルを得た。薬物抗体比（ＤＡＲ）を、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用したピーク積分によって決定した。
【0362】
【0363】
親水性マーカーは９．２５分の保持時間を有し、疎水性マーカーはそれぞれ２５．９分（ｍＡｂ－２）又は９．００分及び２４．７分（ｍＡｂ－４）の相対保持時間を有した。
【0364】
コンジュゲートの疎水性は、導入されたＱタグの位置に影響される。ＬＣ１１０、ＬＣ２１４及びＨＣ２９７の位置の後の導入は、コンジュゲートされた修飾抗体に対してコンジュゲートされていない抗体の最大で２倍の変化をもたらしたが、ＨＣ１７７は、試験された全ての内部挿入部位の相対保持時間が最小であった。
【0365】
実施例５
ｉｎ ｖｉｖｏ分析
試験計画
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（ｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２＋／＋マウス）を、試験する１２の異なる化合物に従って１２のコホート（ｎ＝３／コホート）にランダムに割り当てた。
ｉｎ ｖｉｖｏ分析
試験計画
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（ｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２＋／＋マウス）を、試験する１２の異なる化合物に従って１２のコホート（ｎ＝３／コホート）にランダムに割り当てた。
【0366】
全ての化合物は、全長抗体軽鎖の同族対と、抗体Ｆｃ領域断片
を有する全長抗体重鎖対とを含む１アーム抗トランスフェリン受容体抗体に基づく。
【表53】
を有する全長抗体重鎖対とを含む１アーム抗トランスフェリン受容体抗体に基づく。
【0367】
Ｑタグは、それぞれの位置の後にアミノ酸配列ＧＧＧＳＹＲＹＲＱＧＧＧＳ（配列番号２５）が挿入されていた。
【0368】
化合物１：コンジュゲートされた核酸を含まない参照
化合物２：全長重鎖の位置ＨＣ１１８の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物３：全長重鎖の位置ＨＣ１７７の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物４：全長重鎖の位置ＨＣ２９５の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物５：全長重鎖の位置ＨＣ２９７の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物６：全長重鎖の位置ＨＣ３４１の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物７：全長重鎖の位置ＨＣ４０１の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物８：全長重鎖の位置ＨＣ４４６の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物９：位置ＬＣ２１４の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物１０：完全長重鎖の位置ＨＣ２９７及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
化合物１１：完全長重鎖の位置ＨＣ３４１及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
化合物１２：完全長重鎖の位置ＨＣ４４６及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
化合物２：全長重鎖の位置ＨＣ１１８の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物３：全長重鎖の位置ＨＣ１７７の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物４：全長重鎖の位置ＨＣ２９５の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物５：全長重鎖の位置ＨＣ２９７の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物６：全長重鎖の位置ＨＣ３４１の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物７：全長重鎖の位置ＨＣ４０１の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物８：全長重鎖の位置ＨＣ４４６の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物９：位置ＬＣ２１４の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた１つの核酸
化合物１０：完全長重鎖の位置ＨＣ２９７及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
化合物１１：完全長重鎖の位置ＨＣ３４１及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
化合物１２：完全長重鎖の位置ＨＣ４４６及びＦｃ領域断片の後に挿入されたＱタグにコンジュゲートされた２つの核酸
【0369】
化合物を２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）中の溶液として製剤化し、２０ｍｇ／ｋｇ体重の単一公称用量及び２ｍＬ／ｋｇの投与量として静脈内投与した（例外的に、化合物１を３．３ｍＬ／ｋｇの投与量及び１６．７ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与した）。製剤をそれぞれ、２つの外側尾静脈のうちの１つにゆっくりとボーラスによって注射した。血液の連続マイクロサンプリング（２０μＬ／時点／マウス）を尾静脈穿刺によって行った。血液試料を、投与の５分後、１時間後、７時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後及び３３６時間後にＫ３－ＥＤＴＡ被覆Ｍｉｎｉｖｅｔｔｅ（登録商標）ＰＯＣＴに収集した。Ｍｉｎｉｖｅｔｔｅ（登録商標）が充填されたら、血液を直ちに０．２ｍｌ ＰＣＲエッペンドルフチューブ（登録商標）に移し、４℃、約１０，０００×ｇで約５分間遠心分離した。最終サンプリングのため、血液を心臓穿刺によって採取し、Ｋ３－ＥＤＴＡ被覆ポリプロピレンチューブに移した。血漿試料を更なる処理及び分析のために－２０℃で保存した。
【0370】
生物分析
化合物の薬物動態（ＰＫ）は、２つの別個の方法：抗体成分を定量する１つの方法及びコンジュゲートのロックド核酸成分を定量する第２の方法によって決定した。
化合物の薬物動態（ＰＫ）は、２つの別個の方法：抗体成分を定量する１つの方法及びコンジュゲートのロックド核酸成分を定量する第２の方法によって決定した。
【0371】
血漿試料中のＰＫを決定するため、Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．に基づく非ＧＬＰ条件下で、ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ４１１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ国マンハイム）装置上のヒトＣＨ２ドメインに特異的な一般的電気化学発光免疫アッセイ（ＥＣＬＩＡ）法を使用した。簡潔には、試験試料を、第１の検出抗体（ビオチン化）、第２の検出抗体（ルテニウム化）及びＳＡビーズと共に検出容器に段階的に添加した。各化合物の特定の標準曲線の較正範囲は、１％Ｃ５７ＢＬ／６マウス血漿中の０．６９ｎｇ／ｍＬ～１，５００ｎｇ／ｍＬアッセイ濃度であった。分析感度は１００％血漿中で６９ｎｇ／ｍＬであった。標準曲線、品質対照及び試料希釈物を、１％マトリックス濃度をもたらすＣ５７ＢＬ／６マウス血漿を含むアッセイ緩衝液中で調製した。血漿試料を２つの異なる希釈液（１：１００～１：８００）で分析した。
【0372】
同一の血漿試料を、非ＧＬＰ条件下でハイブリダイゼーション酵素結合免疫吸着アッセイ（ｈＥＬＩＳＡ）を使用して分析した。
【0373】
ｈＥＬＩＳＡ法では、参照として非コンジュゲート核酸を使用して、標準、品質管理及び予備希釈試料を調製した。ビオチン化捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及びジゴキシゲニル化検出オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションのため添加し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに移した。検出のため、ポリクローナル抗ジゴキシゲニン－ＰＯＤ Ｆａｂ断片及びＴＭＢ溶液を使用した。色彩強度を４５０ｎｍ（６９０ｎｍ参照波長）で測光法により分析した。色彩強度は、試験試料中の分析物濃度に比例していた。１％Ｃ５７ＢＬ／６マウス血漿中の０．８ｐＭ～１１１ｐＭアッセイ濃度についての標準曲線の較正範囲。血漿試料、標準曲線、品質管理のために、全ての希釈物を、１％マトリックス濃度をもたらすＣ５７ＢＬ／６マウス血漿を含むアッセイ緩衝液中で調製した。血漿試料を２つの異なる希釈液（１：１００～１：４００，０００）で分析した。分析感度は１００％血漿中で９０ｐＭであった。
【0374】
結果
【表54】
【0375】
【表55】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【配列表】
【外国語明細書】