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特開2023-97775ノギンタンパク質を分泌する細胞およびそれを用いたオルガノイドの作製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023097775
(43)【公開日】2023-07-10
(54)【発明の名称】ノギンタンパク質を分泌する細胞およびそれを用いたオルガノイドの作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230703BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230703BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230703BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12P21/02 C
C07K14/47
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021214059
(22)【出願日】2021-12-28
(71)【出願人】
【識別番号】304020177
【氏名又は名称】国立大学法人山口大学
(74)【代理人】
【識別番号】100177714
【弁理士】
【氏名又は名称】藤本 昌平
(72)【発明者】
【氏名】古元 礼子
(72)【発明者】
【氏名】徳永 雅之
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA20
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】 多分化能幹細胞、ヒトおよびマウス組織から様々なオルガノイドを誘導するために必要なタンパク質であるノギンのみを分泌する細胞であって、オルガノイドの誘導効率を向上させることのできるノギンを分泌可能な細胞の提供を課題とする。
【解決手段】 ノギンをコードする核酸を有するノギン分泌細胞を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】 ノギンをコードする核酸を有するノギン分泌細胞を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ノギンをコードする核酸を有する、ノギン分泌細胞。
【請求項2】
請求項１に記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列であり、前記ノギンがオルガノイド誘導用である、ノギン分泌細胞。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
分泌されるノギンが以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列であり、前記ノギンがオルガノイド誘導用である、ノギン分泌細胞。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
【請求項3】
請求項１または２に記載のノギン分泌細胞であって、
前記分泌されるノギンに精製用タグが付加されている、ノギン分泌細胞。
前記分泌されるノギンに精製用タグが付加されている、ノギン分泌細胞。
【請求項4】
請求項１～３のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが二量体を形成している、ノギン分泌細胞。
分泌されるノギンが二量体を形成している、ノギン分泌細胞。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
前記ノギン分泌細胞が、ノギンをコードする核酸を有するＨＥＫ２９３細胞である、ノギン分泌細胞。
前記ノギン分泌細胞が、ノギンをコードする核酸を有するＨＥＫ２９３細胞である、ノギン分泌細胞。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のノギン分泌細胞であって、
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎまたはＷｎｔ－３ａの分泌をしない、ノギン分泌細胞。
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎまたはＷｎｔ－３ａの分泌をしない、ノギン分泌細胞。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のノギン分泌細胞であって、
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として寄託されている、ノギン分泌細胞。
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として寄託されている、ノギン分泌細胞。
【請求項8】
ノギンを含む培養物の製造方法であって、
請求項１～７のいずれか一項に記載のノギン分泌細胞を培養する工程を含む、製造方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載のノギン分泌細胞を培養する工程を含む、製造方法。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載のノギン分泌細胞を培養した培地から回収した培養物またはその精製物を含む、ノギン含有組成物。
【請求項10】
オルガノイドの作製方法であって、
請求項８に記載の製造方法によって得られたノギンを含む組成物を用いて細胞からオルガノイドを樹立する工程を含む、作製方法。
請求項８に記載の製造方法によって得られたノギンを含む組成物を用いて細胞からオルガノイドを樹立する工程を含む、作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）タンパク質を分泌する細胞およびそれを用いたオルガノイドの作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生命科学研究において、一般的には細胞の平面培養（２次元培養）が用いられているが、生体の組織や臓器は実際には３次元の立体構造を取っている。２次元培養ではプラスチックのプレート上で細胞を培養するため、細胞が平面的に引き伸ばされて強い張力を受けており、さらに細胞同士の接着や情報伝達も２次元方向のため、厳密な生理的状態を再現できない。このため３次元培養の方が本来の生理的な状態に近く、生体に近い反応を再現できる。例えば、がん細胞に対する抗がん剤などの薬剤の効果を調べるために、２次元培養が多く用いられているが、２次元培養では薬剤の到達が平面的なので、低濃度でも効果が高く現れ、実際に患者に投与すると想定される濃度では薬剤の効果が認められない場合がある。一方、３次元培養では薬剤の到達や情報の伝達も３次元的で、実際の細胞塊の内部と外部で薬剤の濃度が異なり、より生体に近い環境を再現して薬剤の効果を調べることができる。３次元培養では、細胞が凝集して塊を形成したスフェロイドがこれまで一般的であったが、最近スフェロイドに加えて幹細胞から作るオルガノイドの技術が確立された。オルガノイドは患者由来の臓器や組織、ｉＰＳ細胞からも作製が可能であり、病態の解明に非常に有用で再生医療への応用も期待される。しかし、３次元培養は２次元培養よりも高コストであり、広く一般的に採用される方法ではない。特にオルガノイド培養は生体組織に存在する少数の幹細胞やｉＰＳ細胞から各種誘導因子や阻害剤を用いて、増殖・分化誘導を行うため、高い技術と費用が必要である。
【0003】
オルガノイドの培養にあたっては、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、スポンジン（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ）、ウィント（Ｗｎｔ－３ａ）又はアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）などの組換えタンパク質を購入して添加するか、これらのタンパク質を分泌する細胞の培養上清を添加する必要がある。オルガノイドの種類や培養の段階によって、加える添加物の種類や量の調整が必要である。
特に腸細胞のオルガノイド培養に際しては、少なくともノギン、スポンジン、ウィントの３種のタンパク質が必要であり、スポンジン、ウィントについては、それのみを分泌する細胞が市販されている。一方で、ノギンのみを分泌する細胞が市販されていないため、ノギンを含む複数種類のタンパクを分泌する細胞からノギンを抽出して利用するか、ノギン以外の分泌タンパク質の存在を無視して、ノギンタンパク質を利用する他になかった。また、オルガノイドの種類によってはノギン以外のスポンジン、ウィントが不要な場合もあり、そのような場合はノギン組換えタンパク質を購入して添加するしかなく、コストがかかっていた。よって、コスト面などからノギンのみを分泌する細胞の樹立が望まれていた。
特に腸細胞のオルガノイド培養に際しては、少なくともノギン、スポンジン、ウィントの３種のタンパク質が必要であり、スポンジン、ウィントについては、それのみを分泌する細胞が市販されている。一方で、ノギンのみを分泌する細胞が市販されていないため、ノギンを含む複数種類のタンパクを分泌する細胞からノギンを抽出して利用するか、ノギン以外の分泌タンパク質の存在を無視して、ノギンタンパク質を利用する他になかった。また、オルガノイドの種類によってはノギン以外のスポンジン、ウィントが不要な場合もあり、そのような場合はノギン組換えタンパク質を購入して添加するしかなく、コストがかかっていた。よって、コスト面などからノギンのみを分泌する細胞の樹立が望まれていた。
【0004】
特許文献１は、背側組織作用因子および組成物に関する発明を開示しており、特に神経組織の誘導促進活性を有するヒトノギンを真核宿主細胞中で発現させるための発現ベクターを開示する。さらに特許文献１は、２つの哺乳類細胞系（ＣＯＳ細胞及びマウス２９３細胞）において生物活性ノギンの発現に成功したことを記載している。また特許文献２は、軸索伸長促進剤としてノギンをコードする核酸を含み細胞中でノギンを発現することのできる組換えベクターを開示している。
しかしながら、オルガノイド作製に適したノギン産生細胞の提供については報告がない。
しかしながら、オルガノイド作製に適したノギン産生細胞の提供については報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第３４３１１５３号公報
【特許文献2】特開２００８－２５５０７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記課題に鑑み、多分化能幹細胞、ヒト、マウス、イヌ及びほかの動物組織から様々なオルガノイドを誘導するために必要なタンパク質であるノギンを分泌する細胞であって、オルガノイドの誘導効率を向上させることのできるノギンを分泌可能な細胞の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは鋭意検討の結果、ノギンを分泌する細胞の樹立に成功した。また当該細胞が分泌するノギンを用いることでオルガノイドの誘導効率を向上させることを確認し、本発明の完成に至った。すなわち本発明は以下の態様を含む：
本発明の一態様は、
〔１〕ノギンをコードする核酸を有する、ノギン分泌細胞に関する。
ここで、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列であり、前記ノギンがオルガノイド誘導用であることを特徴とする：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のノギン分泌細胞であって、
前記分泌されるノギンに精製用タグが付加されていることを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕または〔３〕に記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが二量体を形成している、ノギン分泌細胞。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
前記ノギン分泌細胞が、ノギンをコードする核酸を有するＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎまたはＷｎｔ－３ａの分泌をしないことを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として寄託されていることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
〔８〕ノギンを含む培養物の製造方法であって、
上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞を培養する工程を含む、製造方法に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔９〕上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞を培養した培地から回収した培養物またはその精製物を含む、ノギン含有組成物に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔１０〕オルガノイドの作製方法であって、
上記〔９〕に記載のノギン含有組成物を用いて細胞からオルガノイドを樹立する工程を含む、作製方法に関する。
本発明の一態様は、
〔１〕ノギンをコードする核酸を有する、ノギン分泌細胞に関する。
ここで、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列であり、前記ノギンがオルガノイド誘導用であることを特徴とする：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のノギン分泌細胞であって、
前記分泌されるノギンに精製用タグが付加されていることを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕または〔３〕に記載のノギン分泌細胞であって、
分泌されるノギンが二量体を形成している、ノギン分泌細胞。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
前記ノギン分泌細胞が、ノギンをコードする核酸を有するＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎまたはＷｎｔ－３ａの分泌をしないことを特徴とする。
また、本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞であって、
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として寄託されていることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
〔８〕ノギンを含む培養物の製造方法であって、
上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞を培養する工程を含む、製造方法に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔９〕上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のノギン分泌細胞を培養した培地から回収した培養物またはその精製物を含む、ノギン含有組成物に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔１０〕オルガノイドの作製方法であって、
上記〔９〕に記載のノギン含有組成物を用いて細胞からオルガノイドを樹立する工程を含む、作製方法に関する。
【発明の効果】
【0008】
本発明により提供されるノギン分泌細胞を用いることで、高価な組み換え型ノギンタンパク質を購入する必要がなくなり各種試験のコストを抑えることが可能となる。また、オルガノイド作製においてスポンジンやウィントなどのタンパク質単体投与と同様に、必要とされる培養タイミングで必要量だけ、あるいは他のタンパク質を自由に組み合わせてノギンタンパク質を投与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、下記実施例で作製した、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター、または、Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをトランスフェクションしたノギン発現細胞について、トランスフェクション後培養７日目に光学顕微鏡下で撮像した画像を示す。
【図2】図２は、下記実施例で作製した、ｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ発現ベクターをトランスフェクションしたノギン発現細胞について、トランスフェクション後培養７日目に光学顕微鏡（左側下段の画像）および蛍光顕微鏡（左側上段の画像）下で撮像した画像ならびにそれらの合成画像（右側上段の画像）を示す。
【図3】図３は、下記実施例で作製した、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター、または、Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをトランスフェクションしたノギン発現細胞について、トランスフェクション後培養１４日目に光学顕微鏡下で撮像した画像を示す。
【図4】図４は、下記実施例で作製した、ｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ発現ベクターをトランスフェクションしたノギン発現細胞について、トランスフェクション後培養１４日目に光学顕微鏡（左側下段の画像）および蛍光顕微鏡（左側上段の画像）下で撮像した画像ならびにそれらの合成画像（右側上段の画像）を示す。
【図5】図５は、下記実施例で用いたｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ発現ベクター、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃ発現ベクター、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴII発現ベクターの各ベクターより産生されるポリペプチドの概略図およびアミノ酸残基数を示す。図中、ＦｌはＦＬＡＧ（登録商標）タグを示す。
【図6】図６は、下記実施例で用いたｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＦＣ発現ベクター、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴII発現ベクターの各ベクターより産生されるポリペプチドにおいて、シグナルペプチド切断後の概略図およびアミノ酸残基数を示す。図中、ＦＩはＦＬＡＧ（登録商標）タグを示す。
【図7】図７は、下記実施例で作製したノギン発現細胞の培養上清より回収したＦｃタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色（左図）およびＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（右図）を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン１はそれぞれ未変性溶出サンプルを示し、レーン２はＳＤＳバッファーを用いて変性処理したサンプルを示す。
【図8】図８は、下記実施例で作製したノギン発現細胞の培養上清より回収したＳＴIIタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＯＤ標識抗Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ II抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン１はアフィニティ精製をせずにＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したサンプルを示し、レーン２はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ビーズによるアフィニティ精製を経たサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したサンプルを示し、レーン３はＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズによる精製を経たサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したサンプルを示す。図中の矢印は約２７ｋＤaのバンドを示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の一態様は、ノギンをコードする核酸を有する、ノギン分泌細胞を提供する。
本発明のノギン分泌細胞により分泌されるノギンタンパク質の由来は特に限定されず、当該ノギン分泌細胞は各種生物由来のノギンタンパク質を好適に産生することができる。好ましくは哺乳動物由来のノギンタンパク質である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ等を挙げることができ、好ましくはヒトまたはマウスである。
一実施の形態において、ノギンをコードする核酸は、以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸として示すことができる：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつ、オルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列。
本発明のノギン分泌細胞により分泌されるノギンタンパク質の由来は特に限定されず、当該ノギン分泌細胞は各種生物由来のノギンタンパク質を好適に産生することができる。好ましくは哺乳動物由来のノギンタンパク質である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ等を挙げることができ、好ましくはヒトまたはマウスである。
一実施の形態において、ノギンをコードする核酸は、以下の（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸として示すことができる：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換したアミノ酸配列であり、かつ、オルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列。
【0011】
上記のように、本明細書におけるノギンには、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上同一性を有し、かつオルガノイド誘導能を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも含まれる。なお好ましい実施の形態において、当該ポリペプチドは配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0012】
本明細書において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは２２個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して付加、欠失、置換などの変異を有する場合、当該アミノ酸配列のＮ末端側に変異を有することが好ましく。また、当該アミノ酸配列のＣ末端側のジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成するシステイン以外のアミノ酸に変異を有することがより好ましい。
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して付加、欠失、置換などの変異を有する場合、当該アミノ酸配列のＮ末端側に変異を有することが好ましく。また、当該アミノ酸配列のＣ末端側のジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成するシステイン以外のアミノ酸に変異を有することがより好ましい。
【0013】
「ノギンをコードする核酸」には、細胞外へノギンを分泌するための分泌シグナルペプチド、および、タンパク質精製用のタグなどをコードする核酸を付加することが好ましい。
分泌シグナルペプチドは、発現させるタンパク質であるノギンのＮ末端側に前記シグナルペプチドのＣ末端側を結合した融合タンパク質の形で発現させるように付加すればよい。分泌シグナルペプチドは、宿主細胞からノギンを細胞外へ分泌できる限りにおいて限定されず公知の分泌シグナルペプチドを採用することができる。分泌シグナルプチドとしては以下に限定されないが、国際公開第２０１５／１３３０７４号パンフレット及び国際公開第２０１１／０７８３５１号パンフレットに記載の分泌シグナルペプチドを挙げることができる。当業者は、宿主細胞や培養条件等により適宜好ましい分泌シグナルペプチドを選択することができる。
タンパク質精製用のタグは、発現させるタンパク質のＣ末端側でもＮ末端側でもよいが、翻訳後修飾を考慮するとＣ末端側であることが好ましい。発現させるタンパク質に前記タンパク質精製用タグのＮ末端側を結合した融合タンパク質の形で発現させるように付加すればよい。タンパク質精製用のタグは、培養液中に分泌されたノギンを回収可能な限りにおいて限定されず公知のタグを採用することができる。タンパク質精製用のタグとしては以下に限定されないが、目的に応じて適宜選択することができ、例えば配列番号２に記載の部分ヒトＩｇＧ重鎖ＦｃタグなどのＦｃタグ、配列番号３に記載のストレプトアビジンに結合する８アミノ酸残基から成るＳｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐｔ－ｔａｇ（登録商標）II／ＳＴII）、ヒスチジンタグ、システインタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグを挙げることができる。当業者は、宿主細胞や培養条件に応じて精製に適した好ましいタグを選択することができる。なお、ノギンとタンパク質精製用のタグは、例えば配列番号４に示すリンカーによってつながっていてもよい。
分泌シグナルペプチドは、発現させるタンパク質であるノギンのＮ末端側に前記シグナルペプチドのＣ末端側を結合した融合タンパク質の形で発現させるように付加すればよい。分泌シグナルペプチドは、宿主細胞からノギンを細胞外へ分泌できる限りにおいて限定されず公知の分泌シグナルペプチドを採用することができる。分泌シグナルプチドとしては以下に限定されないが、国際公開第２０１５／１３３０７４号パンフレット及び国際公開第２０１１／０７８３５１号パンフレットに記載の分泌シグナルペプチドを挙げることができる。当業者は、宿主細胞や培養条件等により適宜好ましい分泌シグナルペプチドを選択することができる。
タンパク質精製用のタグは、発現させるタンパク質のＣ末端側でもＮ末端側でもよいが、翻訳後修飾を考慮するとＣ末端側であることが好ましい。発現させるタンパク質に前記タンパク質精製用タグのＮ末端側を結合した融合タンパク質の形で発現させるように付加すればよい。タンパク質精製用のタグは、培養液中に分泌されたノギンを回収可能な限りにおいて限定されず公知のタグを採用することができる。タンパク質精製用のタグとしては以下に限定されないが、目的に応じて適宜選択することができ、例えば配列番号２に記載の部分ヒトＩｇＧ重鎖ＦｃタグなどのＦｃタグ、配列番号３に記載のストレプトアビジンに結合する８アミノ酸残基から成るＳｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐｔ－ｔａｇ（登録商標）II／ＳＴII）、ヒスチジンタグ、システインタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグを挙げることができる。当業者は、宿主細胞や培養条件に応じて精製に適した好ましいタグを選択することができる。なお、ノギンとタンパク質精製用のタグは、例えば配列番号４に示すリンカーによってつながっていてもよい。
【0014】
ノギンタンパク質発現細胞により発現されるノギンタンパク質は、オルガノイド誘導能を有する限り、ノギンタンパク質のフラグメントでもよく、ノギンタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。ノギンタンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば上記のタンパク質精製用タグのアミノ酸配列の付加などが挙げられる。また、ノギンタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、オルガノイド誘導能を有する限り、データベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。実質的に同一のアミノ酸配列は、データベースから取得できるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。
【0015】
本明細書において、「オルガノイド誘導能を有する」とは、本明細書に記載のオルガノイド作製方法または公知のオルガノイド作製方法における培養に使用した際に、ノギンタンパク質としての作用を発揮して対象の細胞をオルガノイドに誘導することができることをいう。
対象細胞のオルガノイドへの誘導は、例えば後述の実施例に記載の方法のように、Ｗｎｔ－３ａ及びＲ－ｓｐｏｎｄｉｎと共に本発明のノギン含有組成物を培地に添加して対象細胞を培養することにより確認することができる。
対象細胞のオルガノイドへの誘導は、例えば後述の実施例に記載の方法のように、Ｗｎｔ－３ａ及びＲ－ｓｐｏｎｄｉｎと共に本発明のノギン含有組成物を培地に添加して対象細胞を培養することにより確認することができる。
【0016】
ノギン分泌細胞の由来となる細胞としては、ノギン遺伝子の導入が可能であり、培養によりノギンを発現して分泌可能な細胞であれば限定されず公知の培養細胞を採用することができる。遺伝子導入条件や培養条件が確立されており操作が容易な細胞であればより好ましく、以下に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞などを挙げることができる。
【0017】
本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎまたはＷｎｔ－３ａの分泌をしない。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎやＷｎｔ－３ａは、ノギンと同様にオルガノイド作製において重要な因子である。オルガノイド誘導に有用なＲ－ｓｐｏｎｄｉｎやＷｎｔ－３ａを分泌せず、ノギンのみを分泌するノギン分泌細胞を用いることで、ノギンタンパク質のみを所望の濃度やタイミングでオルガノイド誘導に用いることができる。
【0018】
また本発明のノギン分泌細胞は一実施の形態において、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市東かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として２０２１年２月１０日に寄託されている細胞である。
【0019】
ノギンタンパク質を発現する細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のノギンタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入してノギンタンパク質発現細胞を作製することができる。作製されたノギンタンパク質を安定発現する細胞、またはノギンタンパク質を一過性に発現する細胞は、いずれも本発明のノギン発現細胞として好適に用いることができる。ノギンタンパク質のアミノ酸配列やノギンタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。ヒトノギンタンパク質のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＡＡＡ８３２５９、ヒトノギンタンパク質をコードする塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＵ３１２０２、マウスノギンタンパク質のアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＥＤＬ１５８７３、マウスノギンタンパク質の塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００８７１１．２である。
【0020】
本発明の一態様は、上記のノギン分泌細胞を培養する工程を含む、ノギンを含む培養物の製造方法を提供する。
ノギンタンパク質発現細胞の培養に用いる培地は特に限定されず、細胞の種類に応じて適切な培地を公知の培地（例えば、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗ／Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＷＡＫＯ＃０４４－２９７６５））から選択して用いることができる。培養期間も特に限定されず、培地交換せずに培養可能な期間を適宜選択すればよい。血清は、細胞培養用に調製された血清であれば特に限定されないが、ウシ由来の血清であることが好ましい。ウシ由来の血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、新生コウシ血清、コウシ血清等が挙げられ、いずれも好適に用いることができる。血清の添加量は特に限定されず、使用するノギンタンパク質発現細胞の培養に推奨される濃度になるように培地に添加すればよい。以下に限定されないが、一実施の形態においては、ＦＢＳを１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で公知の培地に添加することができる。
ノギンタンパク質発現細胞の培養に用いる培地は特に限定されず、細胞の種類に応じて適切な培地を公知の培地（例えば、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗ／Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＷＡＫＯ＃０４４－２９７６５））から選択して用いることができる。培養期間も特に限定されず、培地交換せずに培養可能な期間を適宜選択すればよい。血清は、細胞培養用に調製された血清であれば特に限定されないが、ウシ由来の血清であることが好ましい。ウシ由来の血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、新生コウシ血清、コウシ血清等が挙げられ、いずれも好適に用いることができる。血清の添加量は特に限定されず、使用するノギンタンパク質発現細胞の培養に推奨される濃度になるように培地に添加すればよい。以下に限定されないが、一実施の形態においては、ＦＢＳを１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で公知の培地に添加することができる。
【0021】
ノギンタンパク質発現細胞を培地で培養することで、ノギンタンパク質発現細胞が発現したノギンタンパク質を含む培養物が得られる。培養物としては、培養上清、培養上清と細胞の混合物、培養上清と細胞破砕物の混合物などが挙げられ、公知の方法により調製することができる。ノギンタンパク質は、シグナルペプチドの付加により培地中に分泌される。したがって、培養物は培養上清を含むものであることが好ましく、細胞を除去した培養上清がより好ましい。
【0022】
本発明の別の態様は、上記ノギン分泌細胞を培養した培地から回収した培養物またはその精製物を含む、ノギン含有組成物を提供する。ノギン含有組成物は例えば、ノギン発現細胞を培養した培地の培養上清をそのまま用いることもできるし、精製後の精製物を含むものとして用いることもできる。
精製物の調製方法は、ノギンタンパク質をタンパク質精製用のタグを付加したタグ融合ノギンタンパク質として発現させて、タグを利用したアフィニティ精製にて回収することができる。精製手段は、用いたタグに応じて公知の最適なシステムを選択することができる。Ｆｃタグを利用する方法を実施する場合は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズなどを用いることができ、Ｓｔｒｅｐタグを用いる場合には、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを用いることができる。
調製したノギン含有組成物は、真空フィルターなどの公知の方法により滅菌処理を行い、使用するまで分注凍結保存しておくことが好ましい。
精製物の調製方法は、ノギンタンパク質をタンパク質精製用のタグを付加したタグ融合ノギンタンパク質として発現させて、タグを利用したアフィニティ精製にて回収することができる。精製手段は、用いたタグに応じて公知の最適なシステムを選択することができる。Ｆｃタグを利用する方法を実施する場合は、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズなどを用いることができ、Ｓｔｒｅｐタグを用いる場合には、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを用いることができる。
調製したノギン含有組成物は、真空フィルターなどの公知の方法により滅菌処理を行い、使用するまで分注凍結保存しておくことが好ましい。
【0023】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0024】
（１.ノギンタンパク質発現ベクターの作製）
マウスノギンのＯＲＦ及び部分ヒトＩｇＧ重鎖（Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド（ｐＣＤＮＡ３ ｍＮｏｇ－ｈＦｃ：慶應義塾大学より入手）を鋳型とし、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｅｎｚｙｍｅを用いてマウスノギンをコードするｃＤＮＡ（配列番号５）及びヒトＩｇＧ重鎖（Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号６）を含むｃＤＮＡを増幅させた。得られた増幅ｃＤＮＡはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ（ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅ／ｐｒｏｍｏｔｅｒでドライブするＥＧＦＰ発現ベクターであり、３×はＦｌａｇタグ配列が３連続した配列を意味し、Ｋは制限酵素ＫｐｎＩサイトを含有することを意味する）の制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｍｅＩ処理サイトにライゲーションしてＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター（ｐＰＢＰ－３×Ｆｌａｇ－Ｎｏｇｇｉｎｇ－Ｆｃ）を作製した。なお、３×ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を配列番号７に記載する。
同様に、上記プラスミドｐＣＤＮＡ３ ｍＮｏｇ－ｈＦｃ（慶應義塾大学より入手）を鋳型とし、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇIIをコードする塩基配列を含むプライマー、及びＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｅｎｚｙｍｅを用いてマウスノギンをコードするｃＤＮＡ（配列番号５）を含むｃＤＮＡを増幅させた。得られたマウスノギン及びＳｔｒｅｐ－ＴａｇIIをコードするｃＤＮＡはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫの制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｍｅＩ処理サイトにライゲーションしてＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクター（ｐＰＢＰ－３×Ｆｌａｇ－Ｎｏｇｇｉｎｇ－ＳＴII）を作製した。なお、ＳＴIIをコードする塩基配列は配列番号８に記載する。
得られたプラスミドを常法に従い大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。形質転換後、コロニー形成させたＤＨ５αからプラスミドを分離し、制限酵素処理、および、ゲル電気泳動により制限酵素サイトとサイズの確認を行った。また、シークエンスにより塩基配列が正しいことを確認した。
以下に記載するＨＥＫ２９３細胞への遺伝子導入には、本実施例で作製したＤＨ５αコロニーから抽出および精製して得られたベクターを用いた。
マウスノギンのＯＲＦ及び部分ヒトＩｇＧ重鎖（Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミド（ｐＣＤＮＡ３ ｍＮｏｇ－ｈＦｃ：慶應義塾大学より入手）を鋳型とし、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｅｎｚｙｍｅを用いてマウスノギンをコードするｃＤＮＡ（配列番号５）及びヒトＩｇＧ重鎖（Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号６）を含むｃＤＮＡを増幅させた。得られた増幅ｃＤＮＡはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ（ＣＭＶ ｅｎｈａｎｃｅ／ｐｒｏｍｏｔｅｒでドライブするＥＧＦＰ発現ベクターであり、３×はＦｌａｇタグ配列が３連続した配列を意味し、Ｋは制限酵素ＫｐｎＩサイトを含有することを意味する）の制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｍｅＩ処理サイトにライゲーションしてＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター（ｐＰＢＰ－３×Ｆｌａｇ－Ｎｏｇｇｉｎｇ－Ｆｃ）を作製した。なお、３×ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を配列番号７に記載する。
同様に、上記プラスミドｐＣＤＮＡ３ ｍＮｏｇ－ｈＦｃ（慶應義塾大学より入手）を鋳型とし、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇIIをコードする塩基配列を含むプライマー、及びＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｅｎｚｙｍｅを用いてマウスノギンをコードするｃＤＮＡ（配列番号５）を含むｃＤＮＡを増幅させた。得られたマウスノギン及びＳｔｒｅｐ－ＴａｇIIをコードするｃＤＮＡはＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫの制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｍｅＩ処理サイトにライゲーションしてＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクター（ｐＰＢＰ－３×Ｆｌａｇ－Ｎｏｇｇｉｎｇ－ＳＴII）を作製した。なお、ＳＴIIをコードする塩基配列は配列番号８に記載する。
得られたプラスミドを常法に従い大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。形質転換後、コロニー形成させたＤＨ５αからプラスミドを分離し、制限酵素処理、および、ゲル電気泳動により制限酵素サイトとサイズの確認を行った。また、シークエンスにより塩基配列が正しいことを確認した。
以下に記載するＨＥＫ２９３細胞への遺伝子導入には、本実施例で作製したＤＨ５αコロニーから抽出および精製して得られたベクターを用いた。
【0025】
（２．ノギン発現細胞の作製）
ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞にｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ発現ベクター（ベクターコントロール）、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター、またはＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔrａｎｓｐｏｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって遺伝子導入した。具体的には、以下のようにしてトランスフェクションを行った。
まずＨＥＫ２９３細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種（２×１０５細胞／ｗｅｌｌ）した（培養１日目）。その翌日にトランスフェクション試薬ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Roche Diagnostics社）を用いて遺伝子導入を試みた（培養２日目）。Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターまたはＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランポゼース発現ベクターｐＣＭＶ－ＨｙＰＢａｓｅと１：１の比率でトランスフェクションした。またトランスフェクション効率を確認するためのコントロールとして、ノギンｃＤＮＡを挿入していないｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ（７１２１ｂｐ）もトランスフェクションに使用した。
ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞にｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ発現ベクター（ベクターコントロール）、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクター、またはＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔrａｎｓｐｏｓｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって遺伝子導入した。具体的には、以下のようにしてトランスフェクションを行った。
まずＨＥＫ２９３細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種（２×１０５細胞／ｗｅｌｌ）した（培養１日目）。その翌日にトランスフェクション試薬ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９（Roche Diagnostics社）を用いて遺伝子導入を試みた（培養２日目）。Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターまたはＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランポゼース発現ベクターｐＣＭＶ－ＨｙＰＢａｓｅと１：１の比率でトランスフェクションした。またトランスフェクション効率を確認するためのコントロールとして、ノギンｃＤＮＡを挿入していないｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ（７１２１ｂｐ）もトランスフェクションに使用した。
【0026】
トランスフェクションから７２時間後（培養５日目）にトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュにＨＥＫ２９３細胞を播き直した。図１および図２に、培養７日目における各発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の光学顕微鏡または蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。培養８日目に、選択薬剤としてピューロマイシン（Ｃａｔ＃ａｎｔ－ｐｒ－１；Ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１μｇ／ｍＬ：Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を添加してノギンタンパク質を発現する細胞をスクリーニングし、樹立した。培養１１日目に培養液を新しい培養液に置換し培養を継続した。図３および図４に、培養１４日目における各発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の光学顕微鏡または蛍光顕微鏡下で撮像した画像を示す。培養１５日目にノギンタンパク質を発現する細胞をフィルターろ過により回収した。回収した細胞は、血清不含細胞凍結保存溶液であるセルメニティ（ワケンビーテック製）を用いて細胞ストックとして凍結保存した。また、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞のうち１株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０２１年２月１０日付けで受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１として寄託した。
【0027】
（３．ノギン発現細胞の培養および培養上清の調製）
本実施例では、上記で作製したノギン発現細胞を培養することで培養液中にノギンの分泌を確認した。
３－１．培地の組成
本実施例の培養に用いた培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質含有ＤＭＥＭ培地）の組成は下記の通りである：
本実施例では、上記で作製したノギン発現細胞を培養することで培養液中にノギンの分泌を確認した。
３－１．培地の組成
本実施例の培養に用いた培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質含有ＤＭＥＭ培地）の組成は下記の通りである：
【表1】
【0028】
３－２．凍結保存細胞の解凍
凍結保存していたノギン発現細胞（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１）は以下の方法で解凍した。培地を１５ｍＬチューブに５ｍＬ注ぎ、また１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０ｍＬ注ぎ、それぞれを３７℃のインキュベーターで温めた。ノギン発現細胞を含む凍結保存液をバイアルディープフリーザーから取り出し、速やかに３７℃の恒温槽で１～２分加温して小氷片が残るぐらいまで溶かした。溶けたノギン発現細胞液をピペッターで培地の入った１５ｍＬチューブに移し、懸濁した。次いで、１，０００ｒｐｍで５分間遠心処理を行った。遠心処理後に上清を除去し、新鮮な培地１ｍＬを加えた。１５ｍＬチューブ内の培地の全量を培地の入った１０ｃｍ ｄｉｓｈに移した。その後、３７℃、５％ ＣＯ２で培養を行った。翌日、培地を新鮮な培地に交換した。ノギン発現細胞を起こしてから３日後にピューロマイシンを最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。
凍結保存していたノギン発現細胞（ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１）は以下の方法で解凍した。培地を１５ｍＬチューブに５ｍＬ注ぎ、また１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０ｍＬ注ぎ、それぞれを３７℃のインキュベーターで温めた。ノギン発現細胞を含む凍結保存液をバイアルディープフリーザーから取り出し、速やかに３７℃の恒温槽で１～２分加温して小氷片が残るぐらいまで溶かした。溶けたノギン発現細胞液をピペッターで培地の入った１５ｍＬチューブに移し、懸濁した。次いで、１，０００ｒｐｍで５分間遠心処理を行った。遠心処理後に上清を除去し、新鮮な培地１ｍＬを加えた。１５ｍＬチューブ内の培地の全量を培地の入った１０ｃｍ ｄｉｓｈに移した。その後、３７℃、５％ ＣＯ２で培養を行った。翌日、培地を新鮮な培地に交換した。ノギン発現細胞を起こしてから３日後にピューロマイシンを最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。
【0029】
３－３．培養上清の調製
解凍したノギン発現細胞は９０％のコンフルエント状態になるまで培養したのち、以下のようにして継代培養を行った。培地をアスピレーションにより除去した。細胞を５～１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。洗浄後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ ＥＤＴＡを１ｍＬ添加し、３７℃で２分間インキュベートした。５ｍＬの培地を加え、細胞を回収後、１５ｍＬチューブに移した。次いで、１，０００ｒｐｍで５分間遠心処理を行った。遠心処理後に上清を除去した。新鮮な選択培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、ピューロマイシン含有ＤＭＥＭ培地）を加え、新たなＴ１７５ｃｍ２フラスコへ分配した（１：４希釈；２５ｍＬ）。その後、３７℃で３～５日間、コンフルエントの状態になるまで培養を行った。細胞がコンフルエントの状態になったら、トリプシン処理を行い、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコへ移し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ不含）を２５ｍＬ加えた（１：５希釈）。その後３７℃で３～５日間コンフルエント状態になるまでインキュベートした。再度、細胞がコンフルエントの状態になったら、トリプシン処理を行い、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコへ移し、２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ不含）培地（１：２希釈）を用いて細胞を培養した。その後３７℃で１週間コンフルエント状態になるまでインキュベートした。これらの継代培養によりＰｕｒｏｍｙｃｉｎの培地への持ち込みを防いだ。１週間の培養後、培養上清を回収し、新たに２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。それからさらに培養２日後、培養上清を回収し、新たに２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。なお、培養上清の回収は、３～４回繰り返して行うことができる。
回収した培養上清は３００ｇで５分間遠心処理し、次いで真空フィルターを用いて滅菌処理した。滅菌処理した培養上清を１５ｍＬの凍結保存用バイアルに一定量ずつ分注し、－２０℃にて使用するまで凍結保存した。
解凍したノギン発現細胞は９０％のコンフルエント状態になるまで培養したのち、以下のようにして継代培養を行った。培地をアスピレーションにより除去した。細胞を５～１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。洗浄後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ ＥＤＴＡを１ｍＬ添加し、３７℃で２分間インキュベートした。５ｍＬの培地を加え、細胞を回収後、１５ｍＬチューブに移した。次いで、１，０００ｒｐｍで５分間遠心処理を行った。遠心処理後に上清を除去した。新鮮な選択培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、ピューロマイシン含有ＤＭＥＭ培地）を加え、新たなＴ１７５ｃｍ２フラスコへ分配した（１：４希釈；２５ｍＬ）。その後、３７℃で３～５日間、コンフルエントの状態になるまで培養を行った。細胞がコンフルエントの状態になったら、トリプシン処理を行い、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコへ移し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ不含）を２５ｍＬ加えた（１：５希釈）。その後３７℃で３～５日間コンフルエント状態になるまでインキュベートした。再度、細胞がコンフルエントの状態になったら、トリプシン処理を行い、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコへ移し、２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ不含）培地（１：２希釈）を用いて細胞を培養した。その後３７℃で１週間コンフルエント状態になるまでインキュベートした。これらの継代培養によりＰｕｒｏｍｙｃｉｎの培地への持ち込みを防いだ。１週間の培養後、培養上清を回収し、新たに２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。それからさらに培養２日後、培養上清を回収し、新たに２５ｍＬの１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。なお、培養上清の回収は、３～４回繰り返して行うことができる。
回収した培養上清は３００ｇで５分間遠心処理し、次いで真空フィルターを用いて滅菌処理した。滅菌処理した培養上清を１５ｍＬの凍結保存用バイアルに一定量ずつ分注し、－２０℃にて使用するまで凍結保存した。
【0030】
３－４．電気泳動およびウェスタンブロッティング
図５に上記実施例で用いたｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＦＣ、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳｔIIの各ベクターより産生されるポリペプチドの概略図およびアミノ酸残基数を示す。また図６に、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＦＣ、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳｔIIの各ベクターより産生されるポリペプチドにおいて、シグナルペプチド切断後の概略図およびアミノ酸残基数を示す。
Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズを用いたアフィニティ精製によりＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質を回収した。回収後のＦｃタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色およびＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（POD Goat anti-human IgG, Cat# 109-035-003：Jackson社）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、図７に示すように、ノギンおよびＦｃタグからなる単量体を示す約５７ｋＤａのバンドが確認できた。
また、Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＳｔｒｅｐ Ｔａｃｔｉｎビーズを用いたアフィニティ精製によりＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質を回収した。回収後のＳｔｒｅｐタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＯＤ標識抗Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ II抗体（Anti-Strep-tag II antibody, mouse mono, Cat# M211-3：MBL社）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、図８に示すように、ノギンおよびＳＴIIタグからなる単量体を示す約２７ｋＤａのバンドが確認できた。
図５に上記実施例で用いたｐＰＢＰ－３×ＥＧＦＰＫ、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＦＣ、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳｔIIの各ベクターより産生されるポリペプチドの概略図およびアミノ酸残基数を示す。また図６に、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＦＣ、および、ｐＰＢＰ－３×Ｎｏｇｇｉｎ－ＳｔIIの各ベクターより産生されるポリペプチドにおいて、シグナルペプチド切断後の概略図およびアミノ酸残基数を示す。
Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズを用いたアフィニティ精製によりＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質を回収した。回収後のＦｃタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色およびＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（POD Goat anti-human IgG, Cat# 109-035-003：Jackson社）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、図７に示すように、ノギンおよびＦｃタグからなる単量体を示す約５７ｋＤａのバンドが確認できた。
また、Ｎｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清からＳｔｒｅｐ Ｔａｃｔｉｎビーズを用いたアフィニティ精製によりＮｏｇｇｉｎ－ＳＴIIタグタンパク質を回収した。回収後のＳｔｒｅｐタグ融合ノギンタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＯＤ標識抗Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ II抗体（Anti-Strep-tag II antibody, mouse mono, Cat# M211-3：MBL社）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、図８に示すように、ノギンおよびＳＴIIタグからなる単量体を示す約２７ｋＤａのバンドが確認できた。
【0031】
（４．オルガノイドの作製）
上記でＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清にノギンを含有することが確認できた。そこで、この培養上清をノギン含有組成物として、オルガノイドを作製可能かどうかについて調べた。
上記でＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清にノギンを含有することが確認できた。そこで、この培養上清をノギン含有組成物として、オルガノイドを作製可能かどうかについて調べた。
【0032】
Ｗｎｔ－３ａ及びＲ－ｓｐｏｎｄｉｎを含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に、市販の組換え型マウスノギン（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）又は上記で得られたＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した形質転換体（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０３３８１）の培養上清（０，１０，２０，３０％）を加えて、マウス腸組織由来細胞を３７℃で６日間培養してオルガノイドを作製した。培養後の顕微鏡写真を図９に示す。図９に示すように、市販の組換え型マウスノギンを加えた場合と同様に、Ｎｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清を加えた場合でもオルガノイドが形成されることが確認された。また、培養上清を用いることでオルガノイドが形成されていることから、ノギンは細胞外に分泌されていること、細胞を破砕せずに培養上清をノギン含有組成物として用いることが可能であることが確認された。
【0033】
（５.細胞内でのノギンタンパク質の２量体形成）
ノギンはジスルフィド結合により二量体を形成することが知られている（Jay Groppe et al., Nature Vol.420, 12 December 2002, 636-642(2002)）。そこで、発現したノギンが細胞内で二量体を形成しているか否かを調べた。
ノギンはジスルフィド結合により二量体を形成することが知られている（Jay Groppe et al., Nature Vol.420, 12 December 2002, 636-642(2002)）。そこで、発現したノギンが細胞内で二量体を形成しているか否かを調べた。
【0034】
表２に示すＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを用いてノギン細胞抽出液を調製した。まず培地を吸引除去して４ｍＬの冷却したＰＢＳで２回洗浄した。次に、８０μＬのＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを加え、セルスクレーパーで沈殿を回収して１．５ｍＬチューブに移した。攪拌後に１０分氷上に起き、３分に１回ボルテックスで撹拌し、超音波処理で細胞を破壊した。１４，０００ｒｐｍ、４０分、４℃下で遠心して上澄みを使用するまで－８０℃でストックした。ウェスタンブロット解析を行う際には、後述の２×ＳＤＳ－サンプルバッファー又は未変性条件サンプルバッファーを等量加えてノギン細胞抽出液とした。
【0035】
【表2】
【0036】
次にＮｏｇｇｉｎ－Ｆｃタグタンパク質発現ベクターを導入した細胞の培養上清（Ｎｏｇｇｉｎ細胞培地）及び上記ノギン細胞抽出液を、以下の３群に分けて処理した。
（ａ）プロテインＧで精製なし ／未変性（ＳＤＳバッファー処理なし）
（ｂ）プロテインＧで精製あり ／未変性（ＳＤＳバッファー処理なし）
（ｃ）プロテインＧで精製あり ／ 変性（ＳＤＳバッファー処理あり）
そしてウェスタンブロット解析を行った。結果を図１０に示す。上記（ａ）～（ｃ）をそれぞれレーン１～３にアプライした。なお、変性条件（ＳＤＳバッファー処理あり）は、２×ＳＤＳ－サンプルバッファー（組成：（１）０．１２５ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ６．８（２）４ｗ／ｖ％ ＳＤＳ，（３）２０ｗ／ｖ％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，（４）０．００２ｗ／ｖ％ ＢＰＢ，（５）１０ｖｏｌ％ ２－メルカプトエタノール）を等量加え、混合し、９５℃、５分加熱とした。また、未変性条件（ＳＤＳバッファー処理なし）は、未変性条件サンプルバッファー（組成：（１）０．１２５ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ６．８（３）２０ｗ／ｖ％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，（４）０．００２ｗ／ｖ％ ＢＰＢ，（５）１０ｖｏｌ％ ２－メルカプトエタノール）を等量加え、混合（加熱なし）とした。
（ａ）プロテインＧで精製なし ／未変性（ＳＤＳバッファー処理なし）
（ｂ）プロテインＧで精製あり ／未変性（ＳＤＳバッファー処理なし）
（ｃ）プロテインＧで精製あり ／ 変性（ＳＤＳバッファー処理あり）
そしてウェスタンブロット解析を行った。結果を図１０に示す。上記（ａ）～（ｃ）をそれぞれレーン１～３にアプライした。なお、変性条件（ＳＤＳバッファー処理あり）は、２×ＳＤＳ－サンプルバッファー（組成：（１）０．１２５ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ６．８（２）４ｗ／ｖ％ ＳＤＳ，（３）２０ｗ／ｖ％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，（４）０．００２ｗ／ｖ％ ＢＰＢ，（５）１０ｖｏｌ％ ２－メルカプトエタノール）を等量加え、混合し、９５℃、５分加熱とした。また、未変性条件（ＳＤＳバッファー処理なし）は、未変性条件サンプルバッファー（組成：（１）０．１２５ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ６．８（３）２０ｗ／ｖ％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，（４）０．００２ｗ／ｖ％ ＢＰＢ，（５）１０ｖｏｌ％ ２－メルカプトエタノール）を等量加え、混合（加熱なし）とした。
【0037】
図１０から明らかなように、ノギン細胞の抽出液、ノギン細胞培地のいずれも、未変性のレーン２では１１０ｋＤａ付近にバンドがあり、変性のレーン３で５７ｋＤａ付近のバンドが確認された。したがって、ノギンが細胞内で２量体を形成し、かかる２量体が細胞外に分泌されていることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】