ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人 宮崎大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 国立大学法人 宮崎大学の特許一覧 ▶ 国立大学法人三重大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023097778
(43)【公開日】2023-07-10
(54)【発明の名称】癌治療剤及び癌治療剤の製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 36/07 20060101AFI20230703BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230703BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230703BHJP
C12P 1/02 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230703BHJP
【ＦＩ】
A61K36/07 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K45/00
A61K45/00 101
A61P43/00 121
C12P1/02
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021214066
(22)【出願日】2021-12-28
(71)【出願人】
【識別番号】504224153
【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学
(71)【出願人】
【識別番号】304026696
【氏名又は名称】国立大学法人三重大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】石井 栄津子
(72)【発明者】
【氏名】亀井 一郎
(72)【発明者】
【氏名】ガバザ エステバン
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B064AH19
4B064CA05
4B064CE08
4B064DA01
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZA072
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB322
4C084ZC751
4C088AA02
4C088AC16
4C088CA06
4C088MA43
4C088NA14
4C088ZB26
4C088ZC02
(57)【要約】
【課題】担子菌であるオオシロアリタケから抽出され、獲得耐性を生じ難い抗癌剤耐性抑制剤、及びこれを含む癌治療剤を提供する。
【解決手段】オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤。前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液の乾燥粉末であってもよい。前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物であってもよい。前記有効成分がオオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物であってもよい。
【選択図】なし
【解決手段】オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤。前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液の乾燥粉末であってもよい。前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物であってもよい。前記有効成分がオオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物であってもよい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤。
【請求項2】
前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液の乾燥粉末である、請求項１に記載の癌治療剤。
【請求項3】
前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物である、請求項１に記載の癌治療剤。
【請求項4】
前記有効成分がオオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物である、請求項１に記載の癌治療剤。
【請求項5】
前記有効成分がＡＸＬの発現を阻害する、請求項１～４のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項6】
前記有効成分が免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、請求項１～５のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項7】
前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の少なくとも一方である、請求項６に記載の癌治療剤。
【請求項8】
前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、請求項１～７のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項9】
前記癌治療剤が肺癌治療剤及び皮膚癌治療剤の少なくとも一方である、請求項８に記載の癌治療剤。
【請求項10】
前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株である、請求項１～７のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項11】
前記癌治療剤が皮膚癌治療剤である、請求項１０に記載の癌治療剤。
【請求項12】
さらに、抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤及び鎮痛剤の少なくとも一つを含有する請求項１～１１のいずれか一項に記載の癌治療剤。
【請求項13】
オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記培養液を乾燥させて乾燥固化物を得る工程と、前記乾燥固化物を粉砕して乾燥粉末を得る工程とを含む、癌治療剤の製造方法。
【請求項14】
さらに、前記乾燥粉末をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、請求項１３に記載の癌治療剤の製造方法。
【請求項15】
オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記残渣を乾燥させる工程と、乾燥させた前記残渣を粉砕する工程と、粉砕された前記残渣をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、癌治療剤の製造方法。
【請求項16】
前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株、又は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、請求項１３～１５の何れか一項に記載の癌治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌治療剤及び癌治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
日本の原因疾患別死亡者数で最も多いのは、悪性腫瘍、つまり癌であり、２０１９年に癌で死亡した人は約３万８千人である。死亡原因になった悪性腫瘍のうち、最多のものは肺癌で、約７万５千人が亡くなっていると報告されている。
【0003】
現在のがん治療は、主に手術、放射線照射及び化学療法であるが、４つ目の治療法として免疫療法が注目されている。癌細胞が免疫の働きにブレーキをかけて、免疫細胞の活性化を阻害していることが判明している。免疫療法は、癌細胞によるこのブレーキを解除し免疫細胞を再び活性化する治療法である。
【0004】
上記の癌細胞のメカニズムにおいて、免疫抑制シグナルを誘導し得るタンパク質は、「免疫チェックポイント分子」と呼ばれている。免疫チェックポイント分子として、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＴＬＡ４受容体等が知られている。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）リガンド経路に関与するＴ細胞上のＰＤ－１受容体及び癌細胞上で発現するリガンドである。ＣＴＬＡ４受容体は、ＣＴＬＡ４（負の補助刺激受容体）経路に関与するＴ細胞上に存在する。
【0005】
ＰＤ－１分子は、ＣＤ２８（正の補助刺激受容体）ファミリーに属する免疫抑制性補助シグナル受容体であり、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞に発現し、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との結合によって、抗原特異的にＴ細胞活性を抑制することが知られている。ＰＤ－１経路は、癌細胞に対する免疫の抑制に関与しているとされており、この経路を標的とした抗ＰＤ－１抗体や抗ＰＤ－Ｌ１抗体が癌治療薬候補として期待され、抗体医薬の開発が進んでいる。
【0006】
特許文献１は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２によって誘導される免疫抑制シグナルを阻害した結果惹起される免疫賦活を介した癌の治療若しくは感染症の治療のための組成物を開示している。特許文献２は、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体及び抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体が癌又は感染症に対する治療に有用であることを開示している。特許文献３は、ＰＤ－１抗体を有効成分として含む癌治療剤を開示している。
【0007】
また、癌の種類に特有な遺伝子変異が存在することがわかってきている。肺癌では「ＡＬＫ融合遺伝子変異」及び「ＥＧＦＲ遺伝子変異」といった遺伝子変異が存在することが判明している。ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）は、癌細胞表面に存在し、癌細胞が増殖するためのスイッチのような役割を果たしている。このＥＧＦＲを構成する遺伝子の一部（チロシナーゼ部位）に変異があると、癌細胞を増殖させるスイッチが常にオンとなっているような状態となり、癌細胞が限りなく増殖してしまう。肺癌では、これらの遺伝子変異をターゲットとした「個別化治療」を行えるようになりつつあり、ＥＧＦＲチロシナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）や抗ＥＧＦＲ抗体等が開発されている。
【0008】
受容体チロシンキナーゼであるＡＸＬの活性化が新たなＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性機序となることが報告されている。さらに、ＡＸＬと上皮間葉転換（ＥＭＴ）との関連が指摘され、予後の悪化や腫瘍増大、転移にも関与することが報告されている。ＡＸＬは、様々な癌において過剰発現し、増殖や進展に関与していることが知られている。また、ＡＸＬの活性化は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩの他、抗癌剤であるシスプラチンやＨＥＲ２標的薬であるラパチニブ等の種々の抗癌剤の耐性獲得に関与していることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開公報２００４／００４７７１号公報
【特許文献2】特開２００９－２８６７９５号公報
【特許文献3】特開２０１４－０６５７４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記の免疫チェックポイント分子に対して阻害的に作用する薬剤、いわゆる「免疫チェックポイント阻害剤」は、臨床的にも効果が認められつつある。しかしながら、抗体医薬による治療は、非常に費用がかかるため、患者にとっての負担が過度なものとなり得る。
【0011】
また、免疫チェックポイント阻害剤を長期にわたって投与すると、悪性腫瘍が再増悪する症例も観察されている（獲得耐性ともいう）。この獲得耐性は、癌治療において新たな障害となっている。
【0012】
キノコ類は、古来より東洋医学にも使用されており、悪性腫瘍の予防や治療に対しても、免疫強化やアポトーシスの誘導などにより有益であるとされている。しかしながら、キノコ等の天然物から得られる化合物の免疫チェックポイント阻害効果及びＡＸＬの阻害効果等に関する報告はあまり知られていない。
【0013】
本発明の目的は、担子菌であるオオシロアリタケから抽出され、獲得耐性を生じ難い抗癌剤耐性抑制剤、及びこれを含む癌治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤。
［２］前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液の乾燥粉末である、［１］に記載の癌治療剤。
［３］前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物である、［１］に記載の癌治療剤。
［４］前記有効成分がオオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物である、［１］に記載の癌治療剤。
［５］前記有効成分がＡＸＬの発現を阻害する、［１］～［４］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［６］前記有効成分が免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、［１］～［５］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［７］前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の少なくとも一方である、［６］に記載の癌治療剤。
［８］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［９］前記癌治療剤が肺癌治療剤及び皮膚癌治療剤の少なくとも一方である、［８］に記載の癌治療剤。
［１０］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［１１］前記癌治療剤が皮膚癌治療剤である、［１０］に記載の癌治療剤。
［１２］さらに、抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤及び鎮痛剤の少なくとも一つを含有する、［１］～［１１］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［１３］オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記培養液を乾燥させて乾燥固化物を得る工程と、前記乾燥固化物を粉砕して乾燥粉末を得る工程とを含む、癌治療剤の製造方法。
［１４］さらに、前記乾燥粉末をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、［１３］に記載の癌治療剤の製造方法。
［１５］オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記残渣を乾燥させる工程と、乾燥させた前記残渣を粉砕する工程と、粉砕された前記残渣をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、癌治療剤の製造方法。
［１６］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株、又は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、［１３］～［１５］の何れか１つに記載の癌治療剤の製造方法。
［１］オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤。
［２］前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液の乾燥粉末である、［１］に記載の癌治療剤。
［３］前記有効成分が人工的に培養されたオオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物である、［１］に記載の癌治療剤。
［４］前記有効成分がオオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物である、［１］に記載の癌治療剤。
［５］前記有効成分がＡＸＬの発現を阻害する、［１］～［４］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［６］前記有効成分が免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、［１］～［５］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［７］前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の少なくとも一方である、［６］に記載の癌治療剤。
［８］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［９］前記癌治療剤が肺癌治療剤及び皮膚癌治療剤の少なくとも一方である、［８］に記載の癌治療剤。
［１０］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［１１］前記癌治療剤が皮膚癌治療剤である、［１０］に記載の癌治療剤。
［１２］さらに、抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤及び鎮痛剤の少なくとも一つを含有する、［１］～［１１］のいずれか一つに記載の癌治療剤。
［１３］オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記培養液を乾燥させて乾燥固化物を得る工程と、前記乾燥固化物を粉砕して乾燥粉末を得る工程とを含む、癌治療剤の製造方法。
［１４］さらに、前記乾燥粉末をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、［１３］に記載の癌治療剤の製造方法。
［１５］オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記残渣を乾燥させる工程と、乾燥させた前記残渣を粉砕する工程と、粉砕された前記残渣をアルコールと共に振とうする工程と、前記アルコールを回収し濃縮乾固してアルコール抽出物を得る工程と、を含む、癌治療剤の製造方法。
［１６］前記オオシロアリタケは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１０８株、又は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として寄託された担子菌であるオオシロアリタケTermitomyces sp. Ｔ－１２０株である、［１３］～［１５］の何れか１つに記載の癌治療剤の製造方法。
【発明の効果】
【0015】
上記態様によれば、担子菌であるオオシロアリタケから抽出され、獲得耐性を生じ難い抗癌剤耐性抑制剤、及びこれを含む癌治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明の一態様である実施例１～３のヒト肺癌細胞株Ａ５４９におけるＡＸＬ発現抑制効果を示すグラフである。
【図2】本発明の一態様である実施例１～３のヒト肺癌細胞株Ａ５４９におけるＰＤ－Ｌ１発現抑制効果を示すグラフである。
【図3】本発明の一態様である実施例１～３のヒト肺癌細胞株Ａ５４９におけるＰＤ－Ｌ１発現抑制効果を示すグラフである。
【図4】本発明の一態様である実施例２～５のマウス皮膚癌細胞株Ｂ１６．Ｆ１０１におけるＡＸＬ発現抑制効果を示すグラフである。
【図5】本発明の一態様である実施例２～５のマウス皮膚癌細胞株Ｂ１６．Ｆ１０１におけるＰＤ－Ｌ１発現抑制効果を示すグラフである。
【図6】本発明の一態様である実施例２～５のマウス皮膚癌細胞株Ｂ１６．Ｆ１０１におけるＰＤ－Ｌ２発現抑制効果を示すグラフである。
【図7】本発明の一態様である実施例１の抽出物によるヒト肺癌細胞株Ａ５４９におけるアポトーシス誘導作用を示す図である。
【図8】本発明の一態様である実施例１の抽出物によるヒト肺癌細胞株Ａ５４９におけるアポトーシス誘導作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の一態様は、オオシロアリタケ由来の有効成分を含有する、癌治療剤である。また、本発明の他の態様は、オオシロアリタケを液体培養する工程と、前記液体培養により得られるオオシロアリタケの培養物をろ過して培養液と残渣とに分離する工程と、前記培養液を乾燥させて乾燥固化物を得る工程と、前記乾燥固化物を粉砕する工程とを含む、癌治療剤の製造方法である。
【0018】
本発明において、「癌治療剤」とは、癌治療において有効な効果を現す物質をいう。癌治療において有効な効果とは、抗癌剤治療に対して耐性を発揮するように作用し得るメカニズム、例えば免疫チェックポイント分子の発現の上昇や、ＡＸＬの活性化を抑制する効果が挙げられる。
【0019】
＜オオシロアリタケ由来の有効成分及びその製造方法＞
本発明で使用するオオシロアリタケ（Termitomyces sp.）は、熱帯性食用担子菌オオシロアリタケ属菌である。アジアやアフリカに自生し、日本での自生地域として沖縄県石垣島及び西表島が挙げられる。
本発明で使用するオオシロアリタケ（Termitomyces sp.）は、熱帯性食用担子菌オオシロアリタケ属菌である。アジアやアフリカに自生し、日本での自生地域として沖縄県石垣島及び西表島が挙げられる。
【0020】
本発明のオオシロアリタケ由来の有効成分は、オオシロアリタケの培養物から調製してもよい。より好ましくは、オオシロアリタケのＴ－１２０株の培養物又はオオシロアリタケのＴ－１０８株の培養物から調製される。オオシロアリタケのＴ－１２０株及びＴ－１０８株は、沖縄県石垣島で発見され、２０２１年に本願発明者によって最初に単離された。Ｔ－１２０株は、２０２１年１２月２１日付で、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１として、Ｔ－１０８株は、２０２１年１２月２１日付で、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されている。
【0021】
オオシロアリタケは、子実体として採取したものでもよく、菌糸体として培養してもよい。生産性を高める観点から、オオシロアリタケを菌糸体として培養することが好ましい。
【0022】
オオシロアリタケの有効成分は、以下の３つが挙げられる。
１．オオシロアリタケの培養液の乾燥粉末
２．オオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物
３．オオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物
１．オオシロアリタケの培養液の乾燥粉末
２．オオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物
３．オオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物
【0023】
オオシロアリタケの有効成分が、１．オオシロアリタケの培養液の乾燥粉末である場合、本発明の一態様における癌治療剤の製造方法は、以下の工程を含む。
【0024】
まず、オオシロアリタケ菌株を液体培地に接種し液体培養する。オオシロアリタケの菌株は、自生する菌株でもよく、継代培養した菌株でもよい。培地は、オオシロアリタケが生育する培地であれば特に限定されないが、例えばポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ，Ｄｉｆｃｏ社製）、酵母エキス、麦芽エキス及びポリペプトン等のうち少なくとも１つを含んでいる培地が挙げられる。培養液のｐＨは、ｐＨ５．０～７．０が好ましく、ｐＨ５．５～６．０がより好ましい。培養温度は、２０～３０℃であることが好ましく、２４～２７℃であることがより好ましい。培養時の湿度は、４０～８０％ＲＨであることが好ましく、５０～６０％ＲＨであることがより好ましい。培養時の振とう速度は、０～１００ｒｐｍであることが好ましく、０～５０ｒｐｍであることがより好ましい。液体培地は、通気していてもよく、通気ガスは酸素を含むことが好ましい。培養期間は、オオシロアリタケが十分に生育する限り特に限定されないが、菌糸体として培養する場合、例えば３０日間～１２０日間が挙げられる。
【0025】
上述の方法で得られるオオシロアリタケの培養物を、ろ過により菌糸体と培養液とに分離する。得られる培養液を凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末を得ることができる。
【0026】
オオシロアリタケの有効成分が、２．オオシロアリタケの子実体又は菌糸体からのアルコール抽出物である場合、本発明の一態様における癌治療剤の製造方法は、以下の工程を含む。
【0027】
上述の方法で得られた乾燥粉末をアルコールに添加し、一昼夜振とうすることで乾燥粉末に含まれる有効成分を抽出する。アルコールを回収し、新たなアルコールの添加及び一昼夜の振とうの工程を繰り返す。この抽出工程は複数回行ってもよく、例えば２～４回行ってもよい。回収したアルコール全てをエバポレーターにて濃縮乾固し、窒素ガス雰囲気下にて再度凍結乾燥することで、オオシロアリタケを培養した後の培養液からのアルコール抽出物が得られる。
【0028】
アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール及びイソプロパノール等の１価アルコール；及びエチレングリコール、１，２－プロパンジオール及び１，３－プロパンジオール等の２価アルコールが挙げられる。前記アルコールは、１価アルコールが好ましく、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールがより好ましい。
【0029】
アルコールに代えて、アルコール水溶液を用いてもよい。アルコール水溶液は、１種以上の前記アルコールを含む水溶液である。前記アルコール水溶液の総質量に対する前記アルコールの合計の含有量は、有効成分の抽出効率を高める観点から、５０～９９質量％が好ましく、６０～９５質量％がより好ましく、７０～９０質量％がさらに好ましい。
【0030】
抽出工程の前記アルコール若しくは前記アルコール水溶液の温度は、例えば４～４０℃が挙げられる。抽出時の前記粉砕物と前記アルコール若しくは前記アルコール水溶液の質量比は、例えば１０：１～１：１０の範囲で適宜調整すればよい。
【0031】
オオシロアリタケの有効成分が、３．オオシロアリタケの培養液からのアルコール抽出物である場合、本発明の一態様における癌治療剤の製造方法は、以下の工程を含む。
【0032】
オオシロアリタケの子実体又は菌糸体を凍結乾燥し、その後粉砕する。菌糸体は、先述の方法でオオシロアリタケを培養し、培養物をろ過して得られる菌糸体であってもよい。粉砕物をアルコールに添加し、一昼夜振とうすることで粉砕物に含まれる有効成分を抽出する。使用するアルコールは、上述のものを使用することができ、アルコールに変えて上述のアルコール水溶液を用いてもよい。アルコールを回収し、新たなアルコールの添加及び一昼夜の振とうの工程を繰り返す。この抽出工程は複数回行ってもよく、例えば２～４回行ってもよい。回収したアルコール全てをエバポレーターにて濃縮乾固し、窒素ガス雰囲気下にて再度凍結乾燥することで、アルコール抽出物が得られる。
【0033】
＜免疫チェックポイント分子及びＡＸＬ＞
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、免疫チェックポイント分子の発現を阻害することができる。本発明の一態様において、その発現が阻害される免疫チェックポイント分子としては、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が挙げられる。
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、免疫チェックポイント分子の発現を阻害することができる。本発明の一態様において、その発現が阻害される免疫チェックポイント分子としては、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が挙げられる。
【0034】
ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４とも呼ばれる）及びＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３とも呼ばれる）は、免疫グロブリンファミリーに属する５５ｋＤのＩ型膜タンパク質であるＰＤ－１のリガンドとして知られている。ヒトＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡの塩基配列情報等は、GenBank accession No. AF233516（NCBIデータベース等でGene ID: 29126）又はNM_014143、ヒトＰＤ－Ｌ２のｃＤＮＡの塩基配列情報等は、GenBank accession No.NM_025239（Gene ID: 80380）からそれぞれ取得することができる。
【0035】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、ＡＸＬの発現を阻害することができる。ＡＸＬは、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＡＸＬは、細胞増殖や分化の制御に関与する複雑なシグナル伝達ネットワークに関わっており、発癌にも関与することが知られている。ヒトＡＸＬのｃＤＮＡの塩基配列情報等は、NCBIデータベース等でGenBank accession No. NM_001699（Gene ID: 558）として取得することができる。
【0036】
＜免疫チェックポイント分子及びＡＸＬの発現阻害の評価＞
ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現阻害は、これらの分子を発現する細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの系で確認することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの系としては、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬを発現する標的細胞を含む系を利用することができる。標的細胞としては、ヒト癌細胞が挙げられる。ヒト癌細胞の例として、胃癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、骨髄腫細胞及び皮膚癌細胞等が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏの系としては、例えば癌を発症させた動物モデルを用いて確認することができる。
ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現阻害は、これらの分子を発現する細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの系で確認することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの系としては、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬを発現する標的細胞を含む系を利用することができる。標的細胞としては、ヒト癌細胞が挙げられる。ヒト癌細胞の例として、胃癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、骨髄腫細胞及び皮膚癌細胞等が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏの系としては、例えば癌を発症させた動物モデルを用いて確認することができる。
【0037】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子の発現阻害は、特に限定するものではないが、例えば以下の方法で行われる。上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの系を用いて本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分を添加又は投与したサンプル及び添加又は投与していないサンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応によってｃＤＮＡ化する。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲによりｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ断片の増幅を行った後、その発現量を確認することができる。プライマーはまた、プライマーセットとして市販されているものを使用することもできる。なお、当分野において通常行われているように、発現量が一定であると考えられるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対する比としてＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現量を表すことができる。本発明の一態様におけるオオシロアリタケの抽出物によるこれらの分子の発現の阻害の有無は、本発明の一態様におけるオオシロアリタケの抽出物を添加又は投与しない場合との比較によって決定することができる。
【0038】
上記の方法でＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の少なくとも一方の発現量が少ないと確認された場合、本明細書においては、免疫チェックポイント阻害効果があると判断する。また、上記の方法でＡＸＬの発現量が少ないと確認された場合、癌治療薬としての効果、例えば癌細胞の増殖、浸潤及び転移の少なくとも１つを抑制する効果や、抗がん剤の獲得耐性の抑制に効果があると判断する。
【0039】
＜アポトーシス誘導作用の評価＞
ｉｎ ｖｉｔｒｏの系において本発明の一態様におけるオオシロアリタケの抽出物存在下で標的細胞を培養し、フローサイトメトリーにて標的細胞のアポトーシスを評価することで、オオシロアリタケの抽出物のアポトーシス誘導作用を評価することができる。アポトーシス誘導作用が大きいことは、標的細胞、即ち癌細胞の増殖を抑制できることを意味する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの系において本発明の一態様におけるオオシロアリタケの抽出物存在下で標的細胞を培養し、フローサイトメトリーにて標的細胞のアポトーシスを評価することで、オオシロアリタケの抽出物のアポトーシス誘導作用を評価することができる。アポトーシス誘導作用が大きいことは、標的細胞、即ち癌細胞の増殖を抑制できることを意味する。
【0040】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、免疫チェックポイント分子であるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の発現を抑制することができる。また、本発明の一態様におけるオオシロアリタケの抽出物は、ＡＸＬの発現を抑制することができる。従って、オオシロアリタケの抽出物を含む癌治療剤は、免疫チェックポイント阻害効果を有する。また、オオシロアリタケの抽出物を含む癌治療剤は、癌細胞の増殖、浸潤及び転移の少なくとも１つを抑制する効果を有し、獲得耐性を生じ難い。
【0041】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、前記Ｔ－１２０株由来の有効成分であってもよい。後述の実施例で示す通り、前記Ｔ－１２０株由来の有効成分は、少なくとも肺癌細胞及び皮膚癌細胞のＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現を抑制することができる。前記Ｔ－１２０株由来の有効成分を含有する癌治療剤は、肺癌治療剤及び皮膚癌治療剤として用いることができる。前記Ｔ－１２０株由来の有効成分は、オオシロアリタケを培養した後の培養液からのアルコール抽出物及びオオシロアリタケを培養した後の培養液の少なくとも一方であることが好ましい。
【0042】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、前記Ｔ－１０８株由来の有効成分であってもよい。後述の実施例で示す通り、前記Ｔ－１０８株由来の有効成分は、ＰＤ－Ｌ１の発現を抑制することができる。より具体的には、前記Ｔ－１０８株由来の有効成分は、少なくとも皮膚癌細胞のＰＤ－Ｌ１の発現を抑制することができる。前記Ｔ－１０８株由来の有効成分を含有する癌治療剤は、皮膚癌治療剤として用いることができる。前記Ｔ－１０８株由来の有効成分は、オオシロアリタケを培養した後の培養液からのアルコール抽出物であることが好ましい。
【0043】
＜その他の有効成分＞
本発明の一態様における癌治療剤は、オオシロアリタケ由来の有効成分に加え、更なる有効成分、例えば抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤及び鎮痛剤の少なくとも一つを含んでいてもよいが、本発明はこれに限定されない。
本発明の一態様における癌治療剤は、オオシロアリタケ由来の有効成分に加え、更なる有効成分、例えば抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤及び鎮痛剤の少なくとも一つを含んでいてもよいが、本発明はこれに限定されない。
【0044】
本発明の一態様における癌治療剤の対象となる疾患は、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、皮膚癌等が挙げられるが、特に限定されるものではない。免疫チェックポイント分子の関わるメカニズムや獲得耐性に関するメカニズムは、あらゆる癌細胞に対する免疫応答において見られる。従って、本発明の一態様における癌治療剤は、免疫チェックポイント分子等の免疫を抑制するタンパク質や獲得耐性に関するタンパク質の発現を阻害して、標的細胞である癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。
【0045】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分と更なる有効成分とは、別個に投与することもでき、また同時に、例えば単一の医薬組成物として配合することもできる。医薬組成物の形態、投与経路等は、特に限定されるものではなく、当分野において通常用いられる形態、投与経路を適宜選択することができるが、好ましくは経口投与又は静脈注射等が挙げられる。医薬組成物として製剤化する場合には、調剤において通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料及び被膜形成剤等の少なくとも１つを適宜配合することができる。本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、注射剤としての投与も可能である。注射剤としての投与する場合、溶解補助剤等の使用、エマルジョン形態を利用することも可能である。
【0046】
癌治療剤として投与する場合、投与量は、投与経路、患者の年齢、体重及び症状などの種々の要因を考慮して適宜設定することができる。一例として、１日当たり０．２～８ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり０．４～４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で使用可能である。投与の回数及び頻度等は、治療及び予防が予期される疾患により、また投与対象者の体調等によって適宜調整することができる。
【0047】
本発明の一態様におけるオオシロアリタケ由来の有効成分は、保健機能食品及び病者用食品等の飲食品として、又はサプリメントとして使用することができる。飲食品又はサプリメントとして使用する場合、オオシロアリタケ由来の有効成分のヒトにおける推奨摂取量は、1日あたり好ましくは１ｍｇ～５ｇ、より好ましくは１００ｍｇ～２ｇの範囲である。飲食品又はサプリメントの形態は、粉末、錠剤、カプセル剤及び液剤等のいずれの形態であっても良く、本発明はこれらに限定されるものではない。飲食品又はサプリメントは、医薬組成物と同様に、通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料及び被膜形成剤等の少なくとも１つを適宜含有することができる。また、オオシロアリタケ由来の有効成分は、一般的な食品と共に摂取するための形態であってもよいし、食品中に混合されていてもよい。
【実施例0048】
以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されるものではない。
【0049】
［肺癌細胞試験］
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）ＣＣＬ１８５）を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２下で前培養後、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ由来の有効成分を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ａ５４９細胞のペレットを回収した。
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）ＣＣＬ１８５）を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２下で前培養後、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ由来の有効成分を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ａ５４９細胞のペレットを回収した。
【0050】
回収した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてＲＮＡを鋳型としたＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その後、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬのそれぞれに対応するプライマーを使用し、ｍＲＮＡの存在量を調べた。ＰＣＲは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡについてはフォワードプライマー１（配列番号１）及びリバースプライマー１（配列番号２）、ＰＤ－Ｌ２ ｍＲＮＡについてはフォワードプライマー２（配列番号３）及びリバースプライマー２（配列番号４）、ＡＸＬ ｍＲＮＡについては、フォワードプライマー３（配列番号５）及びリバースプライマー３（配列番号６）、対照として使用したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡについてはフォワードプライマー４（配列番号７）及びリバースプライマー（配列番号８）のプライマーセットを用いて実施した。
【0051】
［皮膚癌細胞試験］
マウスメラノーマ細胞Ｂ１６．Ｆ１０（ＪＣＲＢ１６７５）を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２下で前培養後、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ由来の有効成分を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ｂ１６．Ｆ１０細胞のペレットを回収した。
マウスメラノーマ細胞Ｂ１６．Ｆ１０（ＪＣＲＢ１６７５）を１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２下で前培養後、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ由来の有効成分を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ｂ１６．Ｆ１０細胞のペレットを回収した。
【0052】
回収した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素Ｒｅｖｅｒｔｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてＲＮＡを鋳型としたＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その後、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬのそれぞれに対応する上述のプライマーを使用し、ｍＲＮＡの存在量を調べた。
【0053】
［アポトーシス誘導作用］
上述の［癌細胞試験］に記載の方法で、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を培養し、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ抽出液を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ａ５４９細胞のペレットを回収した。アポトーシス検出キット（ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＰＩ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ 及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色した。その後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）にて、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩを測定した。
上述の［癌細胞試験］に記載の方法で、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を培養し、１２ウェルプレート上に、１×１０６／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。その後、後述する方法で得られたオオシロアリタケ抽出液を２０μｇ／ｍｌになるように各プレート上に添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理し、１５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離に供し、Ａ５４９細胞のペレットを回収した。アポトーシス検出キット（ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＰＩ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ 及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色した。その後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）にて、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩを測定した。
【0054】
（実施例１）
ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ，Ｄｉｆｃｏ社製）培地１０ｍＬに、沖縄県石垣島及び西表島に自生するオオシロアリタケ菌株（Ｔ－１２０株、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１）を接種し、２５℃で静置培養した。約１ヶ月後に、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。得られた培養液は、凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．５ｇ）を得た。以下、この乾燥粉末をオオシロアリタケ由来の有効成分１と記載する場合がある。
ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ，Ｄｉｆｃｏ社製）培地１０ｍＬに、沖縄県石垣島及び西表島に自生するオオシロアリタケ菌株（Ｔ－１２０株、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４１）を接種し、２５℃で静置培養した。約１ヶ月後に、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。得られた培養液は、凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．５ｇ）を得た。以下、この乾燥粉末をオオシロアリタケ由来の有効成分１と記載する場合がある。
【0055】
（実施例２）
実施例１と同じ方法でＴ－１２０株を培養し、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。分離した菌糸体を凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．１ｇ）を得た。得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分２と記載する場合がある。
実施例１と同じ方法でＴ－１２０株を培養し、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。分離した菌糸体を凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．１ｇ）を得た。得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分２と記載する場合がある。
【0056】
（実施例３）
実施例１で得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分３と記載する場合がある。
実施例１で得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分３と記載する場合がある。
【0057】
（実施例４）
ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ，Ｄｉｆｃｏ社製）培地１０ｍＬに、沖縄石垣島及び西表島に自生するオオシロアリタケ菌株（Ｔ－１０８株、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２）を接種し、２５℃で静置培養した。約１ヶ月後に、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。得られた菌糸体は、凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．１ｇ）を得た。
ポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ，Ｄｉｆｃｏ社製）培地１０ｍＬに、沖縄石垣島及び西表島に自生するオオシロアリタケ菌株（Ｔ－１０８株、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５４２）を接種し、２５℃で静置培養した。約１ヶ月後に、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。得られた菌糸体は、凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．１ｇ）を得た。
【0058】
得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分４と記載する場合がある。
【0059】
（実施例５）
実施例４と同じ方法でＴ－１０８株を培養し、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。分離した培養液を凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．５ｇ）を得た。得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分５と記載する場合がある。
実施例４と同じ方法でＴ－１０８株を培養し、ろ過により菌糸体と培養液とに分離した。分離した培養液を凍結乾燥し、その後粉砕して乾燥粉末（０．５ｇ）を得た。得られた乾燥粉末１００ｍｇにメタノール４０ｍＬを添加し、一昼夜振とうさせた。その後、残渣とメタノールを分別して回収し、残渣に新たなメタノールの添加及び一昼夜の振とうの工程を２回繰り返した後、回収したメタノール抽出液の全てをエバポレーターにて濃縮乾固した。その後、窒素ガスを添加して再度凍結乾燥し、アルコール抽出物を得た。以下、このアルコール抽出物をオオシロアリタケ由来の有効成分５と記載する場合がある。
【0060】
得られたオオシロアリタケ由来の有効成分１～５を用いて、上述の［肺癌細胞試験］を行った。また、オオシロアリタケの有効成分２～５を用いて、上述の［皮膚癌細胞試験］を行った。さらに、オオシロアリタケ由来の有効成分１を用いて、［アポトーシス誘導作用］を行った。
【0061】
（比較例１）
オオシロアリタケ由来の有効成分に代えてポテトデキストロースブロスを用いて、上述の［肺癌細胞試験］及び［皮膚癌細胞試験］を行った。
オオシロアリタケ由来の有効成分に代えてポテトデキストロースブロスを用いて、上述の［肺癌細胞試験］及び［皮膚癌細胞試験］を行った。
【0062】
（比較例２）
株式会社岩出菌学研究所から入手したヒメマツタケ（Agaricus blazei，岩出１０１株）の乾燥子実体１００ｇを０．３ｍｍ～３．０ｍｍ程度の大きさに粉砕した。粉砕物を約９０℃の熱水によって１８０分間抽出し、熱水抽出物４４．２ｇを得た。抽出されずに残った残渣（５５ｇ）を約３０℃で２４時間約５％ＮａＯＨ水溶液で抽出し、得られた濾液の画分を乾燥し、ヒメマツタケのアルカリ抽出物４１．５ｇを得た。
株式会社岩出菌学研究所から入手したヒメマツタケ（Agaricus blazei，岩出１０１株）の乾燥子実体１００ｇを０．３ｍｍ～３．０ｍｍ程度の大きさに粉砕した。粉砕物を約９０℃の熱水によって１８０分間抽出し、熱水抽出物４４．２ｇを得た。抽出されずに残った残渣（５５ｇ）を約３０℃で２４時間約５％ＮａＯＨ水溶液で抽出し、得られた濾液の画分を乾燥し、ヒメマツタケのアルカリ抽出物４１．５ｇを得た。
【0063】
オオシロアリタケ由来の有効成分に代えてヒメマツタケのアルカリ抽出物を用いて、上述の［肺癌細胞試験］、［皮膚癌細胞試験］及び［アポトーシス誘導作用］を行った。
【0064】
（比較例３）
オオシロアリタケ由来の有効成分に代えて生理食塩水を用いて、上述の［肺癌細胞試験］、［皮膚癌細胞試験］及び［アポトーシス誘導作用］を行った。
オオシロアリタケ由来の有効成分に代えて生理食塩水を用いて、上述の［肺癌細胞試験］、［皮膚癌細胞試験］及び［アポトーシス誘導作用］を行った。
【0065】
実施例１～３及び比較例１～３の［肺癌細胞試験］におけるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの結果をそれぞれ図１～３に示す。また、実施例２～５及び比較例１～３の［皮膚癌細胞試験］におけるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの結果をそれぞれ図４～６に示す。なお、実施例１～５及び比較例１～３のデータ数Ｎは、３である。ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬに関するｍＲＮＡの量は、対象であるＧＡＰＤＨの発現量に対する比として算出し、ネガティブコントロールである比較例３の平均値を１．０とした場合の値として記載されている。
【0066】
比較例２で用いたヒメマツタケの抽出物は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現を低下させる効果が知られている。よって、比較例２をポジティブコントロールとした。
【0067】
［肺癌細胞試験］において、実施例１～３におけるＡＸＬに関するｍＲＮＡ量は、比較例１及び３と比較して有意に減少したことが確認された。特に、実施例１では、比較例２と比較してもｍＲＮＡ量が少ないことが確認された。
【0068】
［肺癌細胞試験］において、実施例２～３におけるＰＤ－Ｌ１に関するｍＲＮＡ量は、比較例１及び３の場合と比較して減少傾向にあることが確認された。特に実施例３では、比較例２と同程度の効果があることがわかった。
【0069】
［肺癌細胞試験］において、実施例１～３におけるＰＤ－Ｌ２に関するｍＲＮＡ量は、比較例２には劣るものの、比較例１及び３の場合と比較して有意に減少したことが確認された。
【0070】
［皮膚癌細胞試験］において、実施例３におけるＡＸＬに関するｍＲＮＡ量は、比較例１及び３と比較して有意に減少したことが確認された。
【0071】
［皮膚癌細胞試験］において、実施例２～３及び５におけるＰＤ－Ｌ１に関するｍＲＮＡ量は、比較例１及び３の場合と比較して減少傾向にあることが確認された。特に実施例３では、比較例２と比較してもｍＲＮＡ量が少ないことが確認された。
【0072】
［皮膚癌細胞試験］において、実施例２～３におけるＰＤ－Ｌ２に関するｍＲＮＡ量は、比較例１及び３の場合と比較して有意に減少したことが確認された。特に実施例３では、比較例２と同程度の効果があることがわかった。
【0073】
実施例１及び比較例２～３の［アポトーシス誘導作用］の結果を図７～８に示す。図７の各グラフで４分割された領域の内、左下の領域が生細胞領域であり、右下の領域がアポトーシス初期領域であり、右上がアポトーシス後期領域である。アポトーシス初期領域及びアポトーシス後期領域にプロットされた点が多いほど、アポトーシス誘導作用が強いことを意味する。図８は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋で染色された細胞の割合を示す。
【0074】
実施例１においてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋で染色された細胞の割合は、比較例３と比較して優位に多く、比較例２と同程度であることが確認された。
【0075】
以上の結果から、オオシロアリタケの抽出物は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現を抑制することが確認された。Ｔ１２０株は、肺癌細胞及び皮膚癌細胞のＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現を抑制することが確認された。Ｔ１０８株は、皮膚癌細胞に対し、ＰＤ－Ｌ１の発現抑制効果があることが確認された。
【0076】
また、実施例１～５ではオオシロアリタケの子実体ではなく人工的に培養した菌糸体又は培養液からの有効成分を用いている。実施例１～５の結果から、人工的に培養した菌糸体又は培養液からの有効成分であってもＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２及びＡＸＬの発現を抑制することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0077】
本発明によれば、担子菌であるオオシロアリタケから抽出され、獲得耐性を生じ難い抗癌剤耐性抑制剤、及びこれを含む癌治療剤を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】