特開 2023-980 自己免疫疾患の予防又は治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023000980

(43)【公開日】2023-01-04

(54)【発明の名称】自己免疫疾患の予防又は治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20221222BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20221222BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20221222BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20221222BHJP

   A61K 31/37 20060101ALI20221222BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20221222BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20221222BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P37/02

A61P27/02

A61K31/513

A61K31/519

A61K31/37

C12N15/12 ZNA

C12N15/24

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021180537

(22)【出願日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】P 2021101743

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100177714

【弁理士】

【氏名又は名称】藤本 昌平

(72)【発明者】

【氏名】柴田 健輔

(72)【発明者】

【氏名】園田 康平

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 英一

(72)【発明者】

【氏名】山名 智志

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZB071

4C084ZB212

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA19

4C086BC43

4C086CB09

4C086GA16

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZB07

(57)【要約】

【課題】本発明の課題は、自己免疫性ぶどう膜炎をはじめとする自己免疫疾患に対する予防又は治療を提供することにある。
【解決手段】ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤を作製する。ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストが、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）であることが好ましい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【請求項2】

ＭＲ１拘束性Ｔ細胞が、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞であることを特徴とする請求項１記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【請求項3】

ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストが、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）、５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）、６－メチル－Ｄ－リビチルルマジン（ｒＲＬ－６－ＣＨ_２ＯＨ）又は次の式（I）で表される２Ｈ－クロメン誘導体若しくはその塩であることを特徴とする請求項１又は２記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【化1】

［式中、Ｒ１は、置換又は無置換の炭素数２～８の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基、或いは、置換又は無置換の炭素数３～８のシクロアルキル基を表す。］

【請求項4】

ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストが、５－ＯＰ－ＲＵであることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【請求項5】

２Ｈ－クロメン誘導体が、次の式（V）で表される４－（シクロペンチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オンであることを特徴とする請求項３記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【化2】

【請求項6】

自己免疫疾患が、自己免疫性ぶどう膜炎であることを特徴とする請求項１～５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は自己免疫疾患の予防又は治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ぶどう膜炎は、虹彩、毛様体及び脈絡膜からなるぶどう膜が炎症を起こす眼の病気である。ぶどう膜炎には、細菌やウイルスによる感染性の他、サルコイドーシス、ベーチェット病やフォークト－小柳－原田病（ＶＫＨ）等の非感染性のものがある。上記ＶＫＨは、欧米に比較してアジアで多く、日本では全ブドウ膜炎患者の８．１％を占めている。かかるＶＫＨは、目、皮膚、内耳、髄膜等の複数の臓器に存在するメラニンを標的とし、メラノサイトに富む組織に特有のＴ細胞性自己免疫疾患である。このＶＫＨは、通常、持続性の眼炎症や視力低下を引き起こし、最終的には失明に至るものの、その進行メカニズムは完全には解明されていない。

【0003】

上記のＶＫＨの他、サルコイドーシス、及びベーチェット病においても、特定のヒト白血球抗原ハプロタイプが関連していることを踏まえると、この非感染性ぶどう膜炎の発症には、白血球の一種であるＴ細胞が中心的な役割を果たすとされている。Ｔ細胞を介した自己免疫反応が発症の引き金となることが、網膜アレスチン、リカバーリン及び光受容体間結合タンパク質を含む網膜抗原で免疫された自己免疫性ブドウ膜炎の動物モデルや網膜抗原特異的Ｔ細胞移植実験等から明らかにされている。しかしながら、非感染性ぶどう膜炎に関して、その発症機序やＴ細胞サブセットの保護的役割は解明されていない（非特許文献１参照）。

【0004】

ここで自己免疫反応に関与するＴ細胞の一つに、粘膜関連インバリアント（Ｍｕｃｏｓａｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ）Ｔ細胞（以下、「ＭＡＩＴ細胞」ともいう）がある。このＭＡＩＴ細胞は、病原体の排除や、組織修復を促進することによって恒常性を維持する上で重要な役割を果たすＴ細胞である。また、このＭＡＩＴ細胞は多様なＴＣＲβ鎖と対になったユニークな不変のＴＲＡＶ１－ＴＲＡＪ３３^＋鎖を持っており、かかるＴＲＡＶ１－ＴＲＡＪ３３^＋鎖を介して５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）や５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）等の微生物ビタミンＢ２前駆体由来の代謝物や同族のリガンドを認識し、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、グランザイムＢ等のサイトカインを分泌する（非特許文献２～４参照）。

【0005】

上記免疫調整性サイトカインのうち、ＩＬ－２２は、主にヘルパーＴ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、自然リンパ球等のリンパ球によって産生され、ＩＬ－２２受容体（ＩＬ－２２Ｒ）は、肺、腸、皮膚、肝臓、腎臓に発現することが知られている。ＩＬ－２２の受容体への結合は、宿主の防御、組織の修復、及び再生に関与する多種多様な分子を状況依存的に誘導することで免疫制御に関わる。具体的には、ヒトとマウスにおいては、ＩＬ－２２を介したシグナルは、組織バリア機能と自己免疫疾患にとって重要であることが報告されている（非特許文献４参照）。さらに、ＩＬ－２２は、眼の神経細胞死を救うことで、自己免疫性ぶどう膜炎に保護効果を誘導することが報告されている（非特許文献５、６参照）。

【0006】

ＭＡＩＴ細胞に関する医療の応用としては、たとえば、ＭＡＩＴ細胞機能抑制剤を有効成分とする炎症性疾患改善剤又は虚血性疾患急性期改善剤や（特許文献１参照）、ＭＡＩＴ細胞が初期化された人工多能性幹細胞の分化誘導により得られたＭＡＩＴ様細胞、がんの治療及び／又は予防剤（特許文献２参照）が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１９－８９７３５号公報

【特許文献2】国際公開第２０２１／０８５４５０号パンフレット

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Pedro, P.H., et al. (2014) Autoimmun Rev 13, 909-916

【非特許文献2】Rahimpour, A., et al. (2015) J Exp Med 212, 1095-1108.

【非特許文献3】Corbett, A.J., et al. (2014) Nature 509, 361-365.

【非特許文献4】Hinks, T.S.C., et al. (2019) Cell Rep 28, 3249-3262.

【非特許文献5】Yan Ke et al., (2011) J Immunol, 187, 2130-2139

【非特許文献6】Mattapallil, M. J., et al., (2019) J Autoimmun 102, 65-76

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

自己免疫性ぶどう膜炎の原因となるＶＫＨは、眼を含むメラノサイトに富む組織に特有の自己免疫疾患であり、通常、慢性的な眼の炎症を示し、視力の低下と失明を引き起こすがそのメカニズムは完全には解明されていない。このＶＫＨに対する一次治療として臨床的には、ステロイド療法が適用されるが、その治療効果は十分ではなかった。そこで、本発明の課題は、自己免疫性ぶどう膜炎をはじめとする自己免疫疾患に対する予防又は治療剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、自己免疫性ぶどう膜炎に対する予防又は治療において、ＭＡＩＴ細胞を標的とすることに着目して研究を進めた。マウスに自己免疫性ぶどう膜炎を誘発後、硝子体内にＭＡＩＴ細胞に対するアゴニストである５－ＯＰ－ＲＵを投与したところ、眼内でＭＡＩＴ細胞の拡大が認められ、網膜病態の減弱がみられることを見出し、本発明を完成した。

【0011】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
〔２〕ＭＲ１拘束性Ｔ細胞が、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞であることを特徴とする上記〔１〕記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
〔３〕ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストが、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）、５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）、６－メチル－Ｄ－リビチルルマジン（ｒＲＬ－６－ＣＨ_２ＯＨ）又は次の式（I）で表される２Ｈ－クロメン誘導体若しくはその塩であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【0012】

【化1】

［式中、Ｒ１は、置換又は無置換の炭素数２～８の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基、或いは、置換又は無置換の炭素数３～８のシクロアルキル基を表す。］
〔４〕ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストが、５－ＯＰ－ＲＵであることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
〔５〕２Ｈ－クロメン誘導体が、次の式（V）で表される４－（シクロペンチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オンであることを特徴とする上記〔３〕記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【0013】

【化2】

〔６〕自己免疫疾患が、自己免疫性ぶどう膜炎であることを特徴とする上記〔１〕～〔５〕のいずれか記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。

【0014】

本発明の他の態様としては、自己免疫疾患の予防又は治療剤を調製するためのＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストの使用や、ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを対象に投与することを特徴とする、自己免疫疾患の予防又は治療方法や、ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストの、自己免疫疾患の予防又は治療のための使用を挙げることができる。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、自己免疫性ぶどう膜炎をはじめとする自己免疫疾患の予防又は治療を行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】実施例１において、持続性炎症を有する再発性ＶＫＨ患者（Ｒｅｌａｐｓｅ）、眼炎症のない健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）又は寛解期のＶＫＨ患者（Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の様々なＴ細胞サブセットの頻度をマルチパラメトリック解析により調べた結果を示す図である。

【図2】実施例１において、マルチパラメトリック解析のデータを視覚化するために、ＵＭＡＰ（uniform manifold approximation and projection）解析を行った結果を示す図である。

【図3】実施例１において、ｈＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ－Ｔｅｔ^＋を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中におけるＭＲ１反応性Ｔ細胞サブセットの頻度をフローサイトメトリー解析により調べた結果を示す図である。

【図4】実施例２において、野生型（ＷＴ）及びＭｒ１^－／－マウスの実験的自己免疫性ぶどう膜炎（ＥＡＵ）モデルマウスにおける臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）を調べた結果を示す図である。

【図5】実施例２において、野生型（ＷＴ）及びＴｒａｊ３３^－／－マウスの実験的自己免疫性ぶどう膜炎（ＥＡＵ）モデルマウスにおける臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）を調べた結果を示す図である。

【図6】野生型（ＷＴ）、Ｍｒ１^－／－マウス及びＴｒａｊ３３^－／－マウスにおける網膜眼底画像を示す図である。

【図7】実施例３において、５－ＯＰ－ＲＵ又はＰＢＳを投与したＥＡＵモデルマウスにおける臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）を示す図である。

【図8】実施例３において、５－ＯＰ－ＲＵ又はＰＢＳを投与したＥＡＵモデルマウスにおける網膜眼底画像を示す図である。

【図9】実施例３において、５－ＯＰ－ＲＵ又はＰＢＳを投与したＥＡＵモデルマウスにおける摘出した眼の病理組織学的スコア（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）を示す図である。

【図10】実施例３において、５－ＯＰ－ＲＵ又はＰＢＳを投与したＥＡＵモデルマウスにおける摘出した眼を固定した後の組織切片写真を示す図である。

【図11】実施例４における網膜電位（ＥＲＧ）解析におけるＥＲＧ波形を示す図である。

【図12】実施例４における網膜電位（ＥＲＧ）解析における各光強度での振幅を示す図である。

【図13】実施例５において、５－ＯＰ－ＲＵを硝子体内に投与したＥＡＵモデルマウスにおけるＩＬ－２２、ＩＬ－１９、及びＮｇｆの遺伝子発現を調べた結果を示す図である。

【図14】実施例６において、５－ＯＰ－ＲＵを精製Ｔ細胞に投与し、抗ＭＲ１ブロッキング抗体あり／なしの場合におけるＩＬ－２２の発現を調べた結果を示す図である。

【図15】実施例７において、ＭＡＩＴ細胞のアゴニストの候補とした化合物Ｄ１－Ｄ７におけるＧＦＰ蛍光強度を示す図である。

【図16】実施例７において、ＭＡＩＴ細胞のアゴニストの候補とした化合物Ｄ６、Ｄ８－Ｄ１０におけるＮＦＡＴ－ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の自己免疫疾患の予防又は治療剤は、ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤であればよく、以下、「本件自己免疫疾患の予防又は治療剤」ともいう。

【0018】

本明細書における「ＭＲ１拘束性Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を介して、主要組織適合性複合体クラスＩ関連分子（ＭＨＣ－ｒｅｌａｔｅｄ １分子：ＭＲ１）に提示された非ペプチド性抗原を認識するＴ細胞サブセットを意味する。上記ＭＲ１拘束性Ｔ細胞としては、ユニークな不変のＴＲＡＶ１－ＴＲＡＪ３３^＋鎖を有しており、比較的多様なβ鎖と会合して抗原認識に関わる粘膜関連インバリアントＴ（ｍｕｃｏｓａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ：ＭＡＩＴ）細胞や、ＭＲ１によって抗原提示されるがＭＡＩＴ細胞特有のＴ細胞受容体を持たない非定型ＭＲ１制限Ｔ細胞を挙げることができるが、これらに制限されない。

【0019】

上記ＭＡＩＴ細胞は、２０１２年に初めて、その認識抗原が非ペプチド性代謝産物のビタミンＢ合成中間体であることが同定されている細胞である（Kjer-NielsenLetal. (2012) Nature 491: 717-723）。その後の研究で、それらの認識抗原は、様々な病原体（結核菌、病原性大腸菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌）より産生されること、及び、ＭＡＩＴ細胞は、ＴＲＡＶ１－ＴＲＡＪ３３^＋鎖を介してそれらの抗原を認識することで、感染細胞に対して細胞傷害活性を有すること、更に、ＭＡＩＴ細胞が、末梢組織で感染防御を維持した記憶細胞として長期間維持されることが明らかとなっている。

【0020】

本明細書において、「自己免疫疾患」としては、組織特異的自己免疫疾患、全身性自己免疫疾患、又は移植片対宿主病を挙げることができる。組織特異的自己免疫疾患としては、クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患；多発性硬化症；Ｉ型糖尿病；脳炎；眼炎症等の組織特異的自己免疫疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。全身性自己免疫疾患としては、シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス；慢性関節リウマチ等の関節炎；血管炎；乾癬・皮膚炎等の炎症性皮膚疾患；強直性脊椎炎等を挙げることができるが、これらに制限されない。

【0021】

上記自己免疫性ぶどう膜炎は、虹彩、毛様体及び脈絡膜からなるぶどう膜が、網膜抗原を認識する病原性Ｔ細胞により誘導される炎症である。この自己免疫性ぶどう膜炎は、主に全身性自己免疫疾患のサルコイドーシス、ベーチェット病、又はフォークト－小柳－原田病（ＶＫＨ）を含む疾患で観察される。したがって、本明細書において自己免疫性ぶどう膜炎の予防又は治療剤には、全身性自己免疫疾患のサルコイドーシス、ベーチェット病、又はＶＫＨの予防又は治療剤を包含する。

【0022】

本明細書において、「ＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニスト」としては、ＭＡＩＴ細胞に結合してＭＲ１拘束性Ｔ細胞を活性化する物質であれば特に制限されない。上記アゴニストとしては、具体的には、５－（２－オキソプロピリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＰ－ＲＵ）、５－（２－オキソエチリデンアミノ）－６－Ｄ－リビチルアミノウラシル（５－ＯＥ－ＲＵ）、６－メチル－Ｄ－リビチルルマジン（ｒＲＬ－６－ＣＨ_２ＯＨ）又は次の式（I）で表される２Ｈ－クロメン誘導体若しくはその塩を挙げることができる。

【0023】

【化1】

【0024】

［式中、Ｒ１は、置換又は無置換の炭素数２～８の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基、或いは、置換又は無置換の炭素数３～８のシクロアルキル基を表す。］

【0025】

炭素数２～８の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基としては、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｉ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｉ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基を挙げることができる。炭素数２～８の直鎖若しくは分岐鎖のアルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、２－ブテニル基、イソプロペニル基、３－ブテニル基、４－ペンテニル基、５－ヘキセニル基、１－シクロヘキセニル基を挙げることができる。炭素数３～８のシクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、又はシクロオクチル基を挙げることができる。

【0026】

本明細書において、「無置換」とは、母核となる基のみであることを意味する。母核となる基の名称のみで記載しているときは、別段の断りがない限り「無置換」の意味である。一方、「置換」は、母核となる基のいずれかの水素原子が、母核と同一又は異なる構造の基で置換されていることを意味する。従って、「置換基」は、母核となる基に結合した他の基である。置換基は１個であってもよいし、２個以上であってもよい。２個以上の置換基は同一であってもよいし、異なるものであってもよい。

【0027】

上記置換基は化学的に許容され、本発明の効果を有する限りにおいて特に制限されない。置換基となり得る基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などの炭素数１～６アルキル基挙げることができる。

【0028】

上記式（I）で表される２Ｈ－クロメン誘導体としては、具体的には以下の式（II）～（VIII）で表される化合物を挙げることができる。

【0029】

化合物番号Ｄ３（以下、「Ｄ３」ともいう。）：４－（プロピルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0030】

【化2】

【0031】

化合物番号Ｄ４（以下、「Ｄ４」ともいう。）：４－（ブチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0032】

【化3】

【0033】

化合物番号Ｄ５（以下、「Ｄ５」ともいう。）：４－（アリルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0034】

【化4】

【0035】

化合物番号Ｄ６（以下、「Ｄ６」ともいう。）：４－（シクロペンチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0036】

【化5】

【0037】

化合物番号Ｄ７（以下、「Ｄ７」ともいう。）：４－（イソプロピルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0038】

【化6】

【0039】

化合物番号Ｄ８（以下、「Ｄ８」ともいう。）：４－（シクロへキシルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0040】

【化7】

【0041】

化合物番号Ｄ９（以下、「Ｄ９」ともいう。）：４－（２－メチル－シクロへキシルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0042】

【化8】

【0043】

２Ｈ－クロメン誘導体の付加塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されない。具体的には、（１）酸付加塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩若しくはリン酸塩等の無機酸塩；又は酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、安息香酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、グルタミン酸塩若しくはアスパラギン酸塩等の有機酸塩、或いは（２）塩基性塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；又はトリエチルアミン塩若しくはグアニジン塩等の有機アミン塩等を好適に挙げることができる。

【0044】

ＭＲ１拘束性Ｔ細胞の活性化は、たとえばＣＤ６９やＣＤ２５等のＭＲ１拘束性Ｔ細胞の表面マーカーの発現やＭＲ１拘束性Ｔ細胞の抗原特異的増殖等によって評価することができる。

【0045】

上記式（I）で表される２Ｈ－クロメン誘導体は、公知の方法により合成することができるほか、市販の４－ヒドロキシ－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オンを入手し、かかる化合物を出発原料として合成してもよい。

【0046】

本件自己免疫疾患の予防又は治療剤を医薬のような形態で投与する場合に、その薬剤の投与経路及び投与量は特に限定されないが、ヒトへの投与を行う場合には、投与経路としては経口又は非経口のいずれかの投与経路を選択することができる。例えば、対象に対して、適合する投与量を選択し、経口的又は非経口的に投与することが選択される。

【0047】

本件自己免疫疾患の予防又は治療剤を、医薬のような形態で投与する場合には、有効成分であるＭＲ１拘束性Ｔ細胞に対するアゴニストを、１又は２以上の薬学的に許容される製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で提供することができる。当該医薬組成物は、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、又は液剤などの経口投与用の医薬組成物として投与することができる。或いは、硝子体内投与、静脈内投与、筋肉内投与、若しくは皮下投与用の注射剤又は点滴剤、坐剤、点鼻剤、又は点眼剤などの非経口投与用の医薬組成物として投与することができる。製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、膨張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、又は粘着剤等、通常、医薬の製剤化に用いられる添加剤を用いることができ、医薬組成物の形態に応じて適宜のものを選択して使用することができる。

【0048】

本件自己免疫疾患の予防又は治療剤の投与量は、剤型、投与すべき患者の症状の軽重、年齢、体重、医師の判断等に応じて適宜変えることができるが、非経口的には、成人に対し１日あたり硝子体内、皮下、静脈内、筋肉内に０．０００００１～１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００００１～３％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０００１～１％（Ｗ／Ｖ）の有効成分濃度のものを１回又は数回投与することができる。経口剤の場合、成人に対し１日あたり０．０１～５０００ｍｇ、好ましくは０．１～２５００ｍｇ、より好ましくは０．５～１０００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。また、眼軟膏の場合には、１日あたり０．００００１～１０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは０．０００１～３％（Ｗ／Ｗ）、より好ましくは０．００１～１％（Ｗ／Ｗ）の有効成分濃度のものを１回又は数回投与することができる。

【0049】

本明細書中において、「予防」とは、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する疾患の発症及び再発を抑制、防止することを目的とする手段を意味する。

【0050】

本明細書中において、「治療」とは、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する疾患の進行、増悪を減速又は停止すること、及び細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する疾患を軽快、改善、治癒することを目的とする手段を意味する。

【0051】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。

【0052】

［実施例１］ＶＫＨ患者における血中のＭＡＩＴ細胞
これまでの研究で、ＶＫＨの病態形成にＴ細胞が寄与することが明らかとなっているが、病態と相関して変化するＴ細胞サブセットは詳細には解析されていなかった。そこでまず、アクティブなＶＫＨと関係するＴ細胞レパートリーを同定するために、マスサイトメトリーを用いたマルチパラメトリック解析を行った。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中における様々なＴ細胞サブセットの頻度を、持続性炎症を有する再発性ＶＫＨ患者（Ｒｅｌａｐｓｅ：ｎ＝６）、眼炎症のない健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ：ｎ＝８）又は寛解期のＶＫＨ患者（Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：ｎ＝７）とで比較した。

【0053】

（マルチパラメトリック解析）
表１及び２に示した３６種の金属標識抗体（Fluidigm社、Biolegend社）を用いて解析した。

【0054】

【表1】

【0055】

【表2】

【0056】

１×１０^６個／サンプルの細胞を、まずは氷上２０分間、Ｆｃ受容体結合阻害剤存在下で３個の異なる金属を結合したＣＤ４５抗体によって染色し、３つの細胞サンプルをプールし、表面染色を行った。氷上で４分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でシスプラチン類似体であるジクロロ－(エチレンジアミン)パラジウム(II)で細胞を染色した後、氷上で３０分間、金属共役表面染色抗体カクテルで染色し、その後細胞染色バッファーで２回洗浄した。次に、Cell-ID Intercalator-Ir in Fix and Permバッファー(Fluidigm社)で室温下、６０分間インキュベートした。最後に、細胞を１．６％ホルムアルデヒド溶液(Thermo Fisher Scientific社)中で一晩再懸濁した。翌日、細胞をＨｅｌｉｏｓマスサイトメーター(Fluidigm社)で分析した。データはＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒ．１０ソフトウェア(BD Biosciences社)により分析した。結果を図１に示す。

【0057】

図１では、横軸に示すそれぞれのＴ細胞サブセットの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中におけるＣＤ３^＋細胞中の割合（％）を示している。それぞれのＴ細胞サブセットは以下のように定義した。Ｔｈ１細胞 ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^＋ＣＣＲ４^－ＣＣＲ６^－；Ｔｈ２細胞 ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－；Ｔｈ１７細胞 ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋ＣＤ１６１^＋；Ｔｈ２２細胞 ＣＤ４^＋ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^＋ＣＣＲ１０^＋；Ｔ_ＦＨ細胞 ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ５^＋；ＴｈＧＭ－ＣＳＦ細胞 ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ３^－ＣＣＲ４^＋ＣＣＲ６^－ＣＣＲ１０^＋；Ｎａｉｖｅ ＣＤ８細胞 ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋；ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ（ＣＭ） ＣＤ８細胞 ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋；Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ（ＥＭ）ＣＤ８細胞 ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－；Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＴＬｓ ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^－；γδ Ｔ細胞 γδＴＣＲ^＋；ＭＡＩＴ細胞 ＴＲＡＶ１－２^＋ＣＤ１６１^＋。

【0058】

図１に示すように、ＭＡＩＴ細胞に関して、再発性ＶＫＨ患者では、炎症のない被検者（眼炎症のない健常者及び寛解期のＶＫＨ患者）と比較して有意に頻度が低下した。また、非活性化ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞頻度は、再発性ＶＫＨ患者では、健常者と比較して有意に低下した。対照的に、活性化エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の頻度は有意な増加は認められなかった。また、眼炎症との関連が指摘されているＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔ_ＦＨ細胞等のヘルパーＴ細胞サブセットは、再発性ＶＫＨと眼炎症のない被験者との比較で有意差は認められなかった。ＴｈＧＭ－ＣＳＦ細胞頻度においても、眼炎症がない被験者と比較して有意差がなかった。

【0059】

（ＵＭＡＰ解析）
上記マルチパラメトリック解析のデータを視覚化するために、ＵＭＡＰ解析を行った。ＵＭＡＰで可視化したＴ細胞クラスターのアノテーションのため、ＦｌｏｗＳＯＭ解析を行った。各コホートにおいて被験者あたり３，０００個のＣＤ３^＋細胞のデータを連結し、各コホートそれぞれ１０，０００個の細胞を分析に用いた。結果を図２に示す。

【0060】

図２により、ＭＡＩＴ細胞クラスターは炎症のない被検者（Ｈｅａｌｔｈｙ又はＲｅｍｉｓｓｉｏｎ）で頻度が増加していたが、再発性ＶＫＨ患者（Ｒｅｌａｐｓｅ）では頻度は低かった。

【0061】

（フローサイトメトリー解析）
次にフローサイトメトリーを行うことにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中におけるＭＲ１反応性Ｔ細胞サブセットの頻度を、持続性炎症を有する再発性ＶＫＨ患者（Ｒｅｌａｐｓｅ）、眼炎症のない健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）又は寛解期のＶＫＨ患者（Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）とで比較した。

【0062】

５－ＯＰ－ＲＵをヒトＭＲ－１四量体に結合させて作製したＭＡＩＴ細胞特異的検出試薬（ｈＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ－Ｔｅｔ^＋）を細胞と共に３０分、氷上でインキュベートして細胞を染色した。上記５－ＯＰ－ＲＵは、５－アミノ－６－リビチルアミノウラシル（５－Ａ－ＲＵ：Toronto Research Chemicals社）とメチルグリオキサ－ル（シグマアルドリッチ社）を反応させて作製した。次に、染色した細胞をＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ(BD Biosciences社)にて解析した。そのデータはＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒ．１０ソフトウェア（BD Biosciences社)により分析した。死細胞は、７－アミノ－アクチノマイシンＤ含有溶液（Biolegend社）で染色することで除外した。ｈＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ－Ｔｅｔ^＋を用いて解析した結果を図３に示す。

【0063】

図３に示すように、再発性ＶＫＨ患者（Ｒｅｌａｐｓｅ）は、寛解期のＶＫＨ患者（Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）と比較して末梢血単核細胞に含まれるＭＲ１拘束性Ｔ細胞の割合が有意に低下していることが明らかとなった。したがって、ＭＲ１拘束性Ｔ細胞の頻度の低下がＶＫＨ患者の眼炎症と関わる可能性が高いことが明らかとなった。

【0064】

［実施例２］眼炎症に関与するＭＲ１拘束性Ｔ細胞
実施例１では、眼の炎症においてＭＲ１拘束性Ｔ細胞の関与が示された。そこで、さらに実験的自己免疫性ぶどう膜炎（ＥＡＵ）モデルマウスを用いて眼炎症におけるＭＲ１拘束性Ｔ細胞の関与について調べた。

【0065】

Ｔｒａｊ３３遺伝子のホモ接合性欠損であり、ＭＡＩＴ細胞を特異的に欠くＴｒａｊ３３遺伝子欠損マウス（Ｔｒａｊ３３^－／－）は、Ｃ５７ＢＬ／６の胚を用いたＣｒｉｓＰＲ－Ｃａｓ９系により作製した。オフターゲット解析はＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔソフトウエア(URL:crispr.dbcls.jp)又はＣＲＩＳＰＲデザインソフトウエア(URL：crispr.mit.edu)を用いた。Ｔｒａｊ３３遺伝子を破壊するための標的配列は配列番号１に示す塩基配列（AGCAACTATCAGTTGATCTG）とした。

【0066】

ＭＲ１反応性Ｔ細胞を全て欠くＭＲ１欠損マウス（Ｍｒ１^－／－）は、Ｄｒ．Ｓｕｓａｎ Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ（Washington University in St. Louis, MO, USA）より提供を受けた。

【0067】

ＥＡＵモデルマウスは、武田らの文献（Jpn J Ophthalmol (2018) 62, 398-406.）に基づいて作製した。簡潔に説明すると、まず、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（野生型 ｎ＝１２：Kyudo社）、Ｔｒａｊ３３^－／－（ｎ＝１４）又はＭｒ１^－／－（ｎ＝７）を、マイコバクテリウムツベルクローシス Ｈ３７Ｒａを含む完全フロイントアジュバント(BD Biosciences社)中に２００μgのヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質ペプチド残基１～２０（ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ：配列番号２）を含むエマルジョンで免疫化した。ＰＴＸ ０．５μｇを単回腹腔内注射した後、上記エマルジョンを皮下注射した。

【0068】

ｓｌｉｔ－ｌａｍｐ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ及びArimaらによって開発されたポータブルカメラ（In Acta Ophthalmol, pp. e814-e816.）を用いて、３～４日毎に０－４のスケールで眼炎症の臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）をAgarwalらの方法（Methods Mol Biol 900, 443-469.）により等級付けした。野生型（ＷＴ）及びＭｒ１^－／－の結果を図４に、野生型（ＷＴ）及びＴｒａｊ３３^－／－の結果を図５に示す。図４、５中、横軸は免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）してＥＡＵを誘発してからの日数、縦軸は臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ）である。また、それぞれのマウスの１０日目、１４日目、２１日目の網膜眼底画像を図６に示す。

【0069】

図４及び５から明らかなように、Ｍｒ１^－／－マウス及びＴｒａｊ３３^－／－マウスでは、ＥＡＵを誘発してから１４日目から臨床スコアが増加し、１７日目には野生型と比較して有意な差がみられた。また、図６に示すように、Ｍｒ１^－／－マウス及びＴｒａｊ３３^－／－マウスのいずれも１４日目、２１日目に網膜血管炎や網脈絡膜浸潤を含むＥＡＵの病理的な特徴が観察された。また、Ｍｒ１^－／－マウスでは、組織病理学分析において、血管炎及び光受容体損傷に関連する炎症が確認された（図示なし）。

【0070】

図４及び５の結果より、ＭＲ１欠損マウス（Ｍｒ１^－／－）及びＭＡＩＴ細胞を特異的に欠くＴｒａｊ３３遺伝子欠損マウス（Ｔｒａｊ３３^－／－）の２つのモデルでＭＲ１拘束性Ｔ細胞が自己免疫性ぶどう膜炎における炎症の進行を負に制御していることが示唆された。

【0071】

［実施例３］ＭＡＩＴ細胞のアゴニストによるぶどう膜炎の治療
ＭＡＩＴ細胞のアゴニストである５－ＯＰ－ＲＵによってぶどう膜炎の治療が可能か否かを、上記ＥＡＵモデルマウスを用いて調べた。

【0072】

実施例１に記載したＥＡＵモデルマウスにおいて、ＥＡＵを誘発してから８日目に、ＰＢＳに溶解した５－ＯＰ－ＲＵ（７６ｐｍｏｌ（２５．１ｎｇ）／ｅｙｅ：ｎ＝１２）を硝子体内投与した。コントロールとしてＰＢＳ（ｎ＝１１）を硝子体内に投与した。ＥＡＵを誘発してから１０日目、１４日目、１７日目に実施例１と同様に臨床スコアを求めると共に網膜眼底画像を得た。臨床スコアの結果を図７に、網膜眼底画像の結果を図８に示す。さらに、病理組織学的解析として、摘出した眼を４％パラホルムアルデヒドで固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、病理組織学的スコア（histopathological score）をAgarwalらの方法（Methods Mol Biol 900, 443-469.）によって等級付けした結果を図９に、ヘマトキシリン・エオジン染色後の組織切片写真を図１０に示す。

【0073】

図７、８より、５－ＯＰ－ＲＵ投与によって、臨床スコアを低減し、網膜眼底においても眼内炎症の顕著な低下が認められた。さらに、図９、１０より、５－ＯＰ－ＲＵ投与によって、網膜組織におけるＥＡＵの病理学的特徴の改善がみられた。なお、上記改善は、Ｔｒａｊ３３^－／－マウスに５－ＯＰ－ＲＵを投与した場合にはみられなかった（図示なし）。また、ＥＡＵに対する保護効果が示唆されているＩＬ－２２を投与した場合にも同様のＥＡＵの病理学的特徴の改善がみられた。したがって、５－ＯＰ－ＲＵ等のＭＡＩＴ細胞のアゴニストによってＭＡＩＴ細胞を活性化することにより、網膜における炎症を低減することが可能であることが明らかとなった。

【0074】

［実施例４］５－ＯＰ－ＲＵによる視機能の回復
ぶどう膜炎の治療においては、炎症の抑制だけでなく、視機能の回復が大事である。そこで、５－ＯＰ－ＲＵの投与で、ＥＡＵモデルマウスによって低下した視機能が回復するか否かを網膜電位（ＥＲＧ）解析により調べた。このＥＲＧ解析を用いれば、暗順応(暗所)または明順応(明所)条件のいずれかで、光刺激に対する網膜細胞の電気応答を測定することにより、視機能を評価することができる。なお、ＥＲＧ解析において、ａ波は桿体や錐体などの光受容体によって産生され、ｂ波は光受容体や双極細胞、アマクリン細胞、網膜ミュラー細胞などの神経網膜細胞を含むさまざまな網膜細胞によって産生される波形である。

【0075】

ＥＲＧ解析は、コントロールとしての５－ＯＰ－ＲＵの投与なしの野生型マウス(Ｎｏｒｍａｌ：ｎ＝４)、５－ＯＰ－ＲＵの投与なしでＥＡＵ誘導後１７日のＥＡＵモデルマウス（ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ：ｎ＝７）、及び５－ＯＰ－ＲＵを投与ありでＥＡＵ誘導後１７日のＥＡＵモデルマウス（５－ＯＰ－ＲＵ－ｔｒｅａｔｅｄ：ｎ＝７）を一晩暗順応させた後、ＰｕＲＥＣ(メイヨー社)を用いて薄暗赤色光下でＥＲＧ波形を記録することにより行った。具体的には、上記マウスにケタミン(１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５～１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射して麻酔した。次に、０．５％トロピカミドと０．５％フェニレフリンを併用した溶液で散瞳を誘発した。さらに、０．４％オキシブプロカイン点眼により角膜の局所麻酔を行った。これらの処理後、上記マウスを３７℃に保ちながらＥＲＧ波形を２０分間記録した。ＥＲＧは、Ｇａｎｚｆｅｌｄボウル又は発光ダイオード内臓コンタクトレンズ電極（メイヨー社）を用いて両眼で同時に行った。コンタクトレンズ電極を角膜上のアクティブ電極として配置した。基準電極と接地電極をそれぞれ口と尾に配置した。反応を１０，０００回測定し、その結果を０．３～５００Ｈｚのバンドパスフィルター処理をした。１×１０^－４～１０ｃｄ・ｓ／ｍ^－２の強度で０．３ミリ秒の白色フラッシュを同間隔で照射することにより暗順応のＥＲＧ（Ｓｃｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）を誘発した。１０分間ブリーチした後、３×１０^－１～１０ｃｄ・ｓ／ｍ^－２の強度の白色フラッシュにより明順応のＥＲＧ（ｐｈｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）を誘発した。結果を図１１、１２に示す。記録されたＥＲＧ波形を図１１に、各光強度における振幅を図１２に示す。図１１中、横軸のスケールバーは１００ｍｓ、縦軸のスケールバーは５００μＶである。また、図１２中、横軸は光の強度（ｃｄ・ｓ／ｍ^－２）、縦軸は振幅（μＶ）である。

【0076】

図１１から明らかなように、５－ＯＰ－ＲＵの投与なしでＥＡＵ誘導後１７日のＥＡＵモデルマウス（ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ）は、コントロールとしての５－ＯＰ－ＲＵの投与なしの野生型マウス(Ｎｏｒｍａｌ)と比較して暗順応（Ｓｃｏｔｏｐｉｃ）および明順応（Ｐｈｏｔｏｐｉｃ）の両方のＥＲＧ反応の振幅の明らかな低下が観察されたことから、ＥＡＵによって視機能が低下したことが示唆された。一方、図１１及び１２から明らかなように、５－ＯＰ－ＲＵ投与後、低下した振幅は部分的に回復した。なお、ＥＡＵを誘発したＴｒａｊ３３－／－マウスでは、５－ＯＰ－ＲＵの投与なしの野生型マウスと比較して、５－ＯＰ－ＲＵ投与後に視機能の回復は認められなかった（図示なし）。これらの結果から、５－ＯＰ－ＲＵはＭＡＩＴ細胞依存的に、ＥＡＵによって低下した視機能を回復することが確認された。

【0077】

［実施例５］ＭＡＩＴ細胞のアゴニスト投与による抗炎症因子の発現
ＭＡＩＴ細胞のアゴニスト投与による抗炎症因子の発現をリアルタイムＰＣＲ法によって調べた。実施例３において５－ＯＰ－ＲＵを硝子体内に投与したＥＡＵモデルマウスにおいて、ＥＡＵを誘発してから１０日目の網膜からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（ｔａｋａｒａ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからTranscriptor First Strand cDNA Synthesisキット(Roche Molecular Biochemicals社)を用いてｃＤＮＡを得た。眼炎症の組織修復に関わる因子として、ＩＬ－２２、ＩＬ－１９、及びＮｇｆの遺伝子発現は、TB Green(登録商標) Premix Ex Taq又はMightyAmp^TM for Real Time (Takara Bio社)を用い、LightCycler（登録商標） 96 System (Roche Life Science社)によってリアルタイムに遺伝子発現を半定量的に調べた。なお、ＩＬ－２２、ＩＬ－１９及びＮｇｆは抗炎症作用や神経保護作用を有すると考えられている物質である。使用したプライマーは以下の表３のとおりである。

【0078】

【表3】

【0079】

ＩＬ－２２、ＩＬ－１９及びＮｇｆそれぞれの発現を図１３に示す。図１３における縦軸はβアクチンに対する相対発現量を示す。

【0080】

図１３より、５－ＯＰ－ＲＵによってＩＬ－２２、ＩＬ－１９及びＮｇｆの発現が有意に増加していることが確認された。

【0081】

［実施例６］ＭＡＩＴ細胞に対するアゴニストによるＩＬ－２２の発現

【0082】

実施例５において、ＭＡＩＴ細胞のアゴニストである５－ＯＰ－ＲＵを硝子体内に投与することで、ＩＬ－２２の発現が増加することが確認されたが、このＩＬ－２２の発現がＭＡＩＴ細胞から発現しているか否かを確認した。

【0083】

ＥＡＵ誘導後９日のＥＡＵモデルマウス由来の精製Ｔ細胞を、マイトマイシンＣ（ナカライテスク社）処理した抗原提示細胞存在下で、５－ＯＰ－ＲＵ（１０μＭ）投与群、又はコントロールとして５－ＯＰ－ＲＵ投与なし群に分けて３７℃で７２時間ほど共培養した。また、５－ＯＰ－ＲＵ投与群において、抗ＭＲ１ブロッキング抗体（αＭＲ１ Ａｂ：Biolegend社）添加ありの群、なしの群に分けた。それぞれの群の共培養後の上清を採取し、ＩＬ－２２の濃度をＥＬＩＳＡキット（Thermo Fisher Scientific社）により測定した。結果を図１４に示す。なお、抗ＭＲ１ブロッキング抗体を用いることによって、ＭＡＩＴ細胞からのＴＣＲ依存性のＩＬ－２２の産生が抑制される。

【0084】

図１４に示すように、５－ＯＰ－ＲＵを投与した場合において、抗ＭＲ１ブロッキング抗体が非存在下ではＩＬ－２２の発現がコントロールと比較して上昇するが、抗ＭＲ１ブロッキング抗体の存在下ではＩＬ－２２の発現がコントロールと同レベルまで低下した。したがって、５－ＯＰ－ＲＵの添加によりＭＡＩＴ細胞からＩＬ－２２が発現していることが確認された。なお、上記ＥＡＵモデルマウス由来の精製Ｔ細胞の代わりにヒトの末梢血由来ＭＡＩＴ細胞を用いた場合においても同様の傾向がみられた（図示なし）。

【0085】

［実施例７］ＭＡＩＴ細胞のアゴニストの探索
ＭＡＩＴ細胞のアゴニストとしては、５－ＯＰ－ＲＵや５－ＯＥ－ＲＵが知られているが、医薬用途への利用に向けてより構造的に安定なアゴニストを探索した。

【0086】

ＭＡＩＴ細胞のアゴニストを探索するために、ＭＲ１を過剰発現させた抗原提示細胞とＭＡＩＴ細胞特有のＴ細胞受容体を発現させたレポーター細胞を作製し、化合物ライブラリー（国立大学法人東京大学創薬機構より入手）を用いたスクリーニングを行った。概要を以下に示す。

【0087】

ＮＦＡＴの下流にＧＦＰの配列が組み込んであり、抗原を認識すればＧＦＰの発現が誘導されるレポーター細胞（国立大学法人大阪大学山崎氏より入手）にレトロウイルスベクターを用いてＭＡＩＴ細胞受容体遺伝子を導入し、ＭＡＩＴ細胞受容体発現ＧＦＰレポーター細胞を作製した。Ｔ細胞受容体遺伝子情報はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋより入手した。ヒトの抗原提示細胞は、ヒトＭＲ１を過剰発現させたヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５を用いた。

【0088】

１日目にＭｕｌｔｉ－ｄｒｏｐｐｅｒを用いてヒトの抗原提示細胞を１ウェルに０．２５×１０^４個／４０μＬになるように捲き、一晩培養させた。２日目には、まずＭｕｌｔｉ－ｄｒｏｐｐｅｒで化合物ライブラリーの化合物が入った３８４プレートに培地（ＲＰＭＩ－１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ１０×（シグマ・アルドリッチ社）５０ｍＬ、Ｈ_２Ｏ ４４５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ｇｉｂｃｏ社）５ｍＬとＮａＨＣＯ_３ １ｇを混合した後にフィルターに通し、ＦＢＳ１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン混合液１％、２－ＭＥ０．１％を加えて調製）を２０μＬ加え、２０００ｒｐｍ、５分ボルテックスで懸濁した。ポジティブコントロールとして５－ＯＰ－ＲＵ（１μＭ）を０．４μＬずつ加えた。Ｂｉｏｍｅｋ（ＢＥＣＫＭＡＮ社）を用いて培地を除去し、化合物が入っているプレートでピペッティングした後、溶液全てをヒトの抗原提示細胞を培養したプレートに移した。そして、１時間培養した後、Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｏｐｐｅｒを使ってヒトＭＡＩＴ細胞クローン４Ｌ４Ｔが１ウェルに１．２５×１０^４個となるように調整した細胞懸濁液を２０μＬずつ加えた。さらに一晩培養し、３日目にＩｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００で解析した。

【0089】

１０００化合物のスクリーニングを終え、蛍光値とｃｌｕｓｔｅｒ値によって１２個の化合物がアゴニスト候補として選出された。さらに２ｎｄスクリーニングとしてフローサイトメトリーで解析し、１ｓｔヒット化合物として次の式（VX）に示す４－（エチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－オンを得た。

【0090】

【化9】

【0091】

次に、上記式（VX）において芳香環以外の構造がＴ細胞受容体との結合に重要であると推測し、上記Ｄ３～Ｄ７及び以下の式（Ｘ）、（ＸＩ）に示すＤ１、Ｄ２の類縁化合物を国立大学法人東京大学創薬機構より入手し、５－ＯＰ－ＲＵと共に上記と同様の方法でＩｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００によりＧＦＰの発現を調べた。結果を図１５に示す。なお、活性相関を確かめるために、各化合物１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭの濃度で解析した。

【0092】

化合物番号Ｄ１（以下、「Ｄ１」ともいう。）：４－アミノ－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0093】

【化10】

【0094】

化合物番号Ｄ２（以下、「Ｄ２」ともいう。）：４－（メチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0095】

【化11】

【0096】

図１５より、４位のエチルアミノ側鎖をアミノ側鎖（Ｄ１）若しくはメチルアミノ側鎖（Ｄ２）に変換した化合物では活性は見られなかった。一方、４位のエチルアミノ側鎖をプロピルアミノ側鎖（Ｄ３）、ブチルアミノ側鎖（Ｄ４）、アリルアミノ側鎖（Ｄ５）、シクロペンチルアミノ側鎖（Ｄ６）、イソプロピルアミノ側鎖（Ｄ７）に変換した化合物では、１ｓｔヒット化合物よりも高いＧＦＰ発現がみられた。また、側鎖が長い化合物ほどＧＦＰ発現が高いことが確認された。なお、Ｄ６によるＧＦＰの発現は、抗ＭＲ１ブロッキング抗体を入れると阻害されたため（図示なし）、上記化合物による刺激はＴ細胞受容体を介して行われることが確認された。上記結果から、５－ＯＰ－ＲＵと同様にＤ３～Ｄ７もＭＡＩＴ細胞のアゴニストであることが明らかとなり、Ｄ３～Ｄ７も自己免疫疾患の予防又は治療剤となりうる。

【0097】

さらに、最も活性が高かった上記Ｄ６の類縁化合物として以下の式（ＸII）～（ＸＩＶ）に示すＤ８－Ｄ１０を国立大学法人東京大学創薬機構より入手し、５－ＯＰ－ＲＵと共に上記と同様の方法でＩｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００によりＧＦＰの発現を調べてＮＦＡＴ－ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を求めた。

【0098】

化合物番号Ｄ８（以下、「Ｄ８」ともいう。）：４－（シクロへキシルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン

【0099】

【化12】

【0100】

化合物番号Ｄ９（以下、「Ｄ９」ともいう。）：４－（２－メチルシクロへキシルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0101】

【化13】

【0102】

化合物番号Ｄ１０（以下、「Ｄ１０」ともいう。）：４－（シクロオクチルアミノ）－３－ニトロ－２Ｈ－クロメン－２－オン。

【0103】

【化14】

【0104】

結果を図１６に示す。図１６中、「ｎｏ」はＭＡＩＴ細胞のアゴニストの候補化合物なしであり、Ｄ６、Ｄ８～Ｄ１０は各化合物の濃度を１０μＭとなるように加えた場合である。

【0105】

図１６より、Ｄ６と共にＤ８～Ｄ１０もＭＡＩＴ細胞のアゴニストであることが明らかとなり、Ｄ８～Ｄ１０も自己免疫疾患の予防又は治療剤となりうる。

【0106】

なお、上記のように１ｓｔヒット化合物及びＤ３～Ｄ１０についてはＭＡＩＴ細胞のアゴニスト活性を有していた。ＭＡＩＴ細胞は自己免疫反応に関与するＴ細胞の１つであることから、１ｓｔヒット化合物及びＤ３～Ｄ１０はＭＡＩＴ細胞が関与する、感染症や癌等における免疫細胞の免疫機能を活性化し、当該免疫細胞の人為的機能制によって、感染症や癌に対する防御や、治療のための薬剤として提供することが可能となる。

【産業上の利用可能性】

【0107】

本発明によれば、自己免疫性ぶどう膜炎をはじめとする自己免疫疾患の予防又は治療に利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2023000980000001.app