特開 2023-98853 新規リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法、および発酵食品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023098853

(43)【公開日】2023-07-11

(54)【発明の名称】新規リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法、および発酵食品

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/14 20060101AFI20230704BHJP

   A23L 11/50 20210101ALI20230704BHJP

   A23L 11/60 20210101ALI20230704BHJP

   A23L 11/00 20210101ALI20230704BHJP

   A23J 3/14 20060101ALI20230704BHJP

【ＦＩ】

C12N1/14 Z ZNA

A23L11/50 209Z

A23L11/50 209

A23L11/60

A23L11/00 Z

A23J3/14

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022206673

(22)【出願日】2022-12-23

(31)【優先権主張番号】110149312

(32)【優先日】2021-12-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

(71)【出願人】

【識別番号】390023582

【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１９５，Ｓｅｃ．４，ＣｈｕｎｇＨｓｉｎｇＲｄ．，Ｃｈｕｔｕｎｇ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ ３１０４０

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】チュン－シェン チェン

(72)【発明者】

【氏名】チ－スァン ファン

(72)【発明者】

【氏名】シュ－セン ツァイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン－チ チェン

(72)【発明者】

【氏名】シ－チ リ

(72)【発明者】

【氏名】シャン ツァイ チェン

(72)【発明者】

【氏名】ユ ラン ファン

【テーマコード（参考）】

4B020

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B020LB13

4B020LB18

4B020LB27

4B020LG01

4B020LG08

4B020LG09

4B020LK17

4B020LP18

4B020LQ01

4B020LQ10

4B020LY04

4B020LY10

4B065AA69X

4B065AB10

4B065AC14

4B065BA22

4B065BB27

4B065BC03

4B065CA42

(57)【要約】      （修正有）

【課題】栄養価の高い代替タンパク質源を作製する方法を提供する。
【解決手段】方法は、その寄託番号がＤＳＭ ３４４００である、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を準備するステップと、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を基質に接種して発酵を行い、発酵食品を形成するステップとを含む。基質にはマメ科植物、マメ科植物の加工残留物、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

寄託番号がＤＳＭ ３４４００である単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株。

【請求項2】

リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法であって、
寄託番号がＤＳＭ ３４４００である単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を準備するステップと、
前記単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を基質に接種して発酵を行い、発酵食品を形成するステップと、
を含み、
前記基質にはマメ科植物、マメ科植物の加工残留物、またはこれらの組み合わせが含まれる、方法。

【請求項3】

前記基質が前記マメ科植物の前記加工残留物である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記マメ科植物に加工を行って前記マメ科植物の前記加工残留物を得、前記加工には、蒸煮（cooking）ステップ、プレスステップ、乾燥ステップ、粉砕ステップ、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記マメ科植物の前記加工残留物には前記マメ科植物の滓が含まれる、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記マメ科植物には大豆、黒豆、小豆、緑豆、枝豆、インゲン豆、赤インゲン豆、うずら豆、エンドウ豆、キマメ、ササゲ、そら豆、ひよこ豆、レンズマメ、フジマメ、ピーナッツ、ハウチワマメ、グラスピー、キャロブ、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記発酵には、固体発酵プロセス、液体発酵プロセスまたはこれらの組み合わせが含まれ、前記発酵の温度は２０℃から４０℃であり、かつ前記発酵は２０時間から５０時間行われる、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

前記単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株が冷凍乾燥粉末または細菌ブロス（bacterial broth）の形式で提供される、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記発酵食品には、テンペ、植物性タンパク質（ＴＶＰ）添加物または機能性飲料が含まれる、請求項２に記載の方法。

【請求項10】

前記単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を前記基質に接種して発酵を行った後に、前記方法は、前記基質に一軸湿式押出（uniaxial wet extrusion）プロセスまたは二軸湿式押出（biaxial wet extrusion）プロセスを行って、前記発酵食品を形成するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を用いる基質の発酵により形成される発酵食品であって、前記単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株の寄託番号がＤＳＭ ３４４００であり、
前記基質には、マメ科植物、マメ科植物の加工残留物、またはこれらの組み合わせが含まれ、
前記発酵食品が、６．４８Ｎから２７．５４Ｎの硬さ、または０．２４Ｎｍから０．７０Ｎｍの弾力性、または０．７０Ｎから５．００Ｎの咀嚼性、または２．７Ｎから１０．０５Ｎのガム性、または０．３２から０．８ ０の凝集性、または０．１４から０．５０の回復性（resilience）を有する、発酵食品。

【請求項12】

前記発酵食品のタンパク質含有量が未発酵の基質のタンパク質含有量に比べて２％から１０％増加しており、前記発酵食品のタンパク質含有量は２２％から２８％であり、前記発酵食品の水溶性食物繊維含有量が２．７０％から５．６７％である、請求項１１に記載の発酵食品。

【請求項13】

前記マメ科植物の前記加工残留物には前記マメ科植物の滓が含まれる、請求項１１に記載の発酵食品。

【請求項14】

前記マメ科植物には大豆、黒豆、小豆、緑豆、枝豆、インゲン豆、赤インゲン豆、うずら豆、エンドウ豆、キマメ、ササゲ、そら豆、ひよこ豆、レンズマメ、フジマメ、ピーナッツ、ハウチワマメ、グラスピー、キャロブ、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項１１に記載の発酵食品。

【請求項15】

前記発酵食品には、テンペ、植物性タンパク質（ＴＶＰ）添加物または機能性飲料が含まれる、請求項１１に記載の発酵食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１２月２９日に出願された台湾特許出願第１１０１４９３１２号の優先権を主張し、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス（Rhizopus microsporus）菌株、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法、およびそれによって作製される発酵食品に関する。

【背景技術】

【0003】

長きにわたり肉は人類の主要なタンパク質源とされている。経済の成長および世界人口の増加に伴って、肉製品の需要も増加している。しかしながら、食肉生産から生じる炭素排出量は極めて高く、多数の家畜の排泄物は大量の温室効果ガスを放出する。具体的には、反芻動物（例えば、牛や羊）が反芻すると、腸内で大量のメタンガスが生成される。地球温暖化におけるメタンの影響は、二酸化炭素に比べて約２０倍も高く、気候危機の悪化に与えるインパクトは大きい。

【0004】

近年、人々のよりヘルシーな食事への追求、ならびに動物愛護および環境性への注目の高まりにより、肉以外の代替タンパク質源を見つけること、およびタンパク質源を多様化すること、という課題が、ますます世界の注目を浴びている。 代替タンパク質源には、例えば植物由来のタンパク質、昆虫由来のタンパク質、生体工学技術を用いて開発された人造肉、および菌発酵により作られるタンパク質等が含まれる。しかしながら、栄養価の高い代替タンパク質源の開発は、関連分野において依然として研究目標の１つである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示の実施形態によれば、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株が提供される。当該単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の寄託番号はＤＳＭ ３４４００である。

【0006】

本開示の実施形態によれば、リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法が提供される。 当該方法は次のステップ：寄託番号がDSM 34400である、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を準備するステップと、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を基質に接種して発酵させ、発酵食品を形成するステップとを含み、該基質には、マメ科植物、マメ科植物の加工残留物、またはこれらの組み合わせが含まれる。

【0007】

本開示の実施形態によれば、発酵食品が提供される。当該発酵食品は、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を用いる基質の発酵により形成される。単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株 の寄託番号はDSM 34400である。基質には、マメ科植物, マメ科植物の加工残留物、またはこれらの組み合わせが含まれる。さらに、当該発酵食品は、硬さ（hardness）６．４８Ｎから２７．５４Ｎ、弾力性（springiness）０．２４ Ｎｍから０．７０ Ｎｍ、咀嚼性（chewiness）０．７０ Ｎから５．００ Ｎ、ガム性（gumminess）２．７Ｎから１０．０５Ｎ、凝集性（cohesiveness ）０．３２から０．８０、 回復性（resilience）０．１４から ０．５０である。

【0008】

添付の図面を参照にしながら、以下の実施形態において詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１Ａから図１Ｃは、本開示の実施形態による、培地におけるコロニーから糸状の単一菌株Ｔｐ－１ をスクリーニングするプロセスを示している。

【図2】本開示の実施形態による、ＢＬＡＳＴを用いた菌株Ｔｐ－１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とリゾープス・ミクロスポレス（Rhizopus microspores）単離物ＴＢ５５の配列とのアライメント結果を示している。

【図3】本開示の実施形態による、ＰＤＡ培地における成長時の菌株Ｔｐ－１の成長曲線図（培養時間と面積パーセンテージとの関係）を示している。

【図4】本開示の実施形態による、比率の異なる豆滓（bean dregs）を含むＰＤＡ培地における成長時の菌株Ｔｐ－１の成長曲線図（培養時間と面積パーセンテージとの関係）を示している。

【図5】本開示の実施形態による、比率の異なる豆滓（bean dregs）を含むＰＤＢ培地中で菌株Ｔｐ－１を培養する前および培養した後に撮影した写真の比較を示している。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本開示に係る単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株, リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法、および発酵食品を、以下の記載において詳細に説明する。本開示が十分に理解されるよう、以下の詳細な説明では、説明の目的で多数の特性の詳細および実施形態を示すという点が理解されなければならない。以下の詳細な説明に記載された特定の要素および構成は、本開示を明確に説明するために示されている。ここに示される例示的な実施形態は説明の目的で用いられるにすぎず、本開示を限定するものではないという点については明らかであろう。

【0011】

以下の記載において、用語“約（about）”および“実質的に（substantially）”は、通常は所定値の＋／－１０％、または通常は所定値の＋／－５％、または通常は所定値の＋／－３％ 、または通常は所定値の＋／－２％または通常は所定値の＋／－１％ 、または通常は所定値の＋／－０．５％を意味する。本開示の所定値はおおよその値である。特に説明がない場合、所定値は“約”および“実質的に”の意味を含むものとする。加えて、用語“第１の値から第２の値までの範囲で”または“第１の値から第２の値の範囲で”は、その範囲が、第１の値、第２の値およびそれらの間の他の値を含むことを意味する。

【0012】

別段の定めがない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本開示の属する分野における当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。各ケースにおいて、通常用いられる辞書に定義されている用語は、本開示の関連技術および本開示の背景または文脈に一致する意味を持つと解釈されるべきであり、定義されていない限り、理想化された、または過度に正式な方式で解釈されるべきではない、ということが理解されなければならない。

【0013】

本開示の実施形態によれば、新規リゾープス・ミクロスポラス菌株 は、台湾高雄旗山に植えられたバナナのバナナ葉から単離精製したものである。リゾープス・ミクロスポラス菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に寄託されており、その寄託番号はＤＳＭ ３４４００である。また、リゾープス・ミクロスポラス菌株は、食品工業発展研究所（ Food Industry Research and Development Institute）にも寄託されており、その寄託番号はＢＣＲＣ ９３０２２６である。さらに、本開示の実施形態によれば、豆類またはそれらの加工残留物を培養基質として用いること、および上述のリゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵プロセスを実行することによって、作製される発酵食品のタンパク質含有量が高まり、かつヒトの腸管で消化されやすくなる。また、作製される発酵食品は、植物性タンパク質（ＴＶＰ）添加物にも加工し易い。さらに、当該発酵食品は、植物由来のタンパク質として、家畜、家禽および海産物に取って代わることができる。当該発酵食品は、低カロリー、低コレステロールおよび質の高いタンパク質という特徴を有するため、健康食品の多様なソースが提供されることとなり、かつ環境においてかなりの程度でネットゼロ（net zero）二酸化炭素排出に貢献もする。

【0014】

上述したように、単離精製された新規のリゾープス・ミクロスポラス菌株が本開示において提供され、その寄託番号はＤＳＭ ３４４００（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ に２０２２年９月２９日に寄託）およびＢＣＲＣ ９３０２２６（食品工業発展研究所の生物資源保存・研究センター（the Bioresource Collection and Research Center of the Food Industry Research and Development Institute ））に２０２１年９月２３日に寄託）である。詳細には、この菌株は、台湾高雄旗山のバナナ産地のバナナ葉から、微生物スクリーニング（microbial screening）、培養、単離精製のステップにより得たものである。この菌株はリゾープス・ミクロスポラスＴＢ５５菌株と同定されている。いくつかの実施形態によれば、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と少なくとも約９５％の類似性を有し、例えば、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有し得る。いくつかの実施形態によれば、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株のヌクレオチド配列は ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。

【0015】

本開示において、リゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法が提供される。当該方法は次のステップ：（ａ）寄託番号がDSM 34400 （BCRC 930226）である、上述の単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を準備するステップと、（b）単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を基質に接種して発酵を行い、発酵食品を形成するステップとを含む。さらに、基質には、限定はされないが、マメ科植物、マメ科植物の加工残留物、別の適した基質、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。

【0016】

いくつかの実施形態によれば、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株は、冷凍乾燥粉末または細菌ブロス（bacterial broth）の形式で提供される。

【0017】

いくつかの実施形態によれば、マメ科植物には、大豆、黒豆、小豆、緑豆、枝豆、インゲン豆、赤インゲン豆、うずら豆、エンドウ豆、キマメ、ササゲ、そら豆、ひよこ豆、レンズマメ、フジマメ、ピーナッツ、ハウチワマメ、グラスピー、キャロブ、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。

【0018】

いくつかの実施形態によれば、マメ科植物の加工残留物にはマメ科植物の滓（dregs）が含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、マメ科植物に加工を行って、上述の加工残留物を得ることができ、当該加工には、蒸煮（ｃｏｏｋｉｎｇ）ステップ、プレスステップ、乾燥ステップ、粉砕ステップ、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、加工残留物の含水量は約１５％未満、例えば１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％ 未満または ５％未満であってよい。

【0019】

いくつかの実施形態によれば、発酵に用いられる基質は、マメ科植物の滓、つまり豆滓（おから）であり得る。豆滓は豆の加工の副産物であり、豆の加工は通常、大量の豆滓を生じる。豆滓はイソフラボン、フェノール酸およびフィトステロール等のような多くの機能性成分を含有する。しかし、通常豆滓は、腐敗や臭いを引き起こしやすくし得るその製造中の高含水量のために、恐らくは廃棄される、または飼料もしくは肥料として使用されるしかない。特に、本開示の実施形態によれば、豆滓をサーキュラー・エコノミーの方式で再利用することができ、豆滓のタンパク質含有量および栄養価を発酵プロセスにより高めることができ、かつ豆滓の廃棄量を減らし、環境への負荷を低減することができる。

【0020】

いくつかの実施形態によれば、基質中のリゾープス・ミクロスポラス菌株の発酵には、固体発酵プロセス、液体発酵プロセスまたはこれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態によれば、発酵の温度は、約２０℃ から約 ４０℃、例えば ２５℃、３０℃、または ３５℃であってよい。いくつかの実施形態によれば、発酵は約２０時間から約５０時間、または約２４時間から約４８時間、例えば２８時間、３２時間、３６時間、４０時間、または４４時間行うことができる。

【0021】

いくつかの実施形態によれば、単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を基質に接種して発酵を行い、その基質にさらに一軸湿式押出（uniaxial wet extrusion ）プロセスまたは二軸湿式押出（biaxial wet extrusion）プロセス を行って、発酵食品を形成することができる。いくつかの実施形態によれば、前述の方法により作製された発酵食品には、テンペ 、植物性タンパク質（ＴＶＰ）添加物，機能性飲料、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。いくつかの実施形態によれば、発酵により生成される発酵ブロス（fermentation broth）を、そのまま機能性飲料とすることができる。

【0022】

加えて、本開示の実施形態は発酵食品も提供する。当該発酵食品は、上述の単離精製されたリゾープス・ミクロスポラス菌株を用いる基質の発酵により形成される。発酵食品の硬さは約６．４８Ｎから約２７．５４Ｎであってよい。発酵食品の弾力性は約０．２４Ｎｍから約０．７０Ｎｍであってよい。発酵食品の咀嚼性は約０．７Ｎから約５．００Ｎであってよい。発酵食品のガム性は約２．７Ｎから約１０．０５Ｎであってよい。発酵食品の凝集性は約０．３２から約０．８０であってよい。発酵食品の回復性（resilience）は約０．１４から約０．５０であってよい。いくつかの実施形態によれば、硬さ、弾力性、咀嚼性、ガム性、凝集性、および回復性（resilience）のような上記パラメータは、 テクスチャーアナライザー （Horn Instruments co., ltd., モデル： ＵｎｉｖｅｒｓａｌＴＡ）により得られた測定結果である。

【0023】

上述したように、基質には、限定はされないが、マメ科植物、マメ科植物の加工残留物 、別の適した基質、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。

【0024】

いくつかの実施形態によれば、マメ科植物には、大豆、黒豆、小豆、緑豆、枝豆、インゲン豆、赤インゲン豆、うずら豆、エンドウ豆、キマメ、ササゲ、そら豆、ひよこ豆、レンズマメ、フジマメ、ピーナッツ、ハウチワマメ、グラスピー、キャロブ、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。

【0025】

いくつかの実施形態によれば、マメ科植物の加工残留物には、マメ科植物の滓が含まれ得るが、これに限定はされない。さらに、いくつかの実施形態によれば、発酵食品にはテンペ、植物性タンパク質（ＴＶＰ）添加物、機能性飲料、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。

【0026】

本開示の実施形態により提供されるリゾープス・ミクロスポラス菌株を用いて発酵食品を作製する方法で作製された発酵食品は、タンパク質および水溶性食物繊維の含有量が高められ、血糖を調節し、コレステロールを低下させ、小腸での糖の吸収を遅らせ、 かつ腸蠕動を強化することができる、という点に留意すべきである。加えて、結果として得られる発酵食品 （例えばテンペ）は、タンパク質の消化および吸収率を改善することができ、消化されやすく、鼓腸が引き起こされにくくなるため、高齢者、虚弱、および消化器系が弱い者のタンパク質への要求を満たすことができる。

【0027】

具体的には、いくつかの実施形態によれば、結果として得られる発酵食品のタンパク質含有量は、未発酵の基質に比べ、約２％から約１０％高まり得る。具体的には、いくつかの実施形態によれば、結果として得られる発酵食品のタンパク質含有量は、当該発酵食品の全重量に対し、約２２％から約２８％であり得る。いくつかの実施形態によれば、結果として得られる発酵食品の水溶性食物繊維含有量は、当該発酵食品の全重量に対し、約２．７０％から約５．６７％であり得る。

【0028】

本開示の上述およびその他の目的、特徴ならびに利点がより十分かつ容易に理解されるように、いくつかの実施例および比較例を以下に示し、詳細に説明していくが、それらは本開示の範囲を限定するものではない。

【0029】

実施例１：新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の単離、精製および同定

【0030】

台湾高雄旗山地区に植えられたバナナ葉を採取した。洗浄および乾燥後、そのバナナ葉で脱皮した大豆を覆い、発酵および成長させた。バナナ葉に付着した糸状菌（filamentous fungi）を取り、次いで培養、スクリーニング、単離、精製および同定を行った。

【0031】

先ず、糸状菌の培養に用いるブロス（ポテトデキストロースブロス, STBIO MEDIA, INC.）を１００μl取り、二次水（secondary water）９００ μｌ を加え、ＰＤＡ培地プレート（ポテトデキストロースアガーブロス; Becton, Dickinson and Company, USA）に塗布し、３０℃で２４時間培養した。次いで、培地上のコロニーを選び取り、同一のＰＤＡ培地プレートに再びストリークし、菌株の精製を行った。３０℃で２４時間培養した後に、菌糸を選び取り、グラム染色法を用いて染色し、電子顕微鏡で観察し、電子顕微鏡で単一の菌相の菌株が観察されるまで数回（several rounds）スクリーニングを繰り返した。図１Ａから１Ｃを参照されたい。これらは培地上のコロニーから糸状の単一菌株（菌株番号Ｔｐ－１）をスクリーニングするプロセスを示している。次いで、２０％グリセロールをその単離精製された菌株に加え、－８０℃で凍結保存し、その菌株の一部を後続の核酸同定のために取った。

【0032】

ＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔの使用説明書に基づいて、上述した菌株のＤＮＡを抽出した。真菌（Fungal）ユニバーサルプライマー対 ＩＴＳ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される）およびＩＴＳ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される） （MISSION BIOTECH CO., LTD.）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応によりの内部転写スペーサー（internal transcribed spacer，ＩＴＳ）の配列決定を行った 。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＡＢＩ）ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＫｉｔおよびシークエンシングマシンＡＢＩ ３７３０ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、菌株Ｔｐ－１のＤＮＡ抽出サンプルの配列決定を行い、得られたヌクレオチド配列 をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示した。

【0033】

次いで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列と既知の生物学的配列データベース（アメリカ国立生物工学情報センター，ＮＣＢＩ）とのアライメントをＢＬＡＳＴ （Basic Local Alignment Search Tool）を用いて行った。このプログラムは、ヌクレオチドまたはタンパク質配列と配列データベースとを整列させ、統計的有意性を算出し、生理学および生化学的特徴の検証を組み合わせるものである。上述の単離精製された菌株 Ｔｐ－１は、データベース中のリゾープス・ミクロスポレス（Rhizopus microspores）単離物ＴＢ５５に９９％より高く類似していたことが確認された。

【0034】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とリゾープス・ミクロスポレス（Rhizopus microspores）単離物ＴＢ５５（ｇｅｎｅ ｂａｎｋ：ＭＦ４４５２９０．１）との配列アライメント結果が図２に示されている。ＴＢ５５の配列読み取り長さは６９５ｂｐであり、配列中の６６０ ｂｐはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と同じであり、配列中の３５ｂｐはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と異なっている。よって、単離精製された菌株Ｔｐ－１はリゾープス・ミクロスポラス（Rhizopus microsporus）のＴＢ５５菌株に属するが、Ｔｐ－１とＴＢ５５とは異なる菌株であるということが決定され得る。

【0035】

同定が完了した後、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株Ｔｐ－１をＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨに寄託および保存した。寄託番号はＤＳＭ ３４４００６であった。また、単離精製された新規リゾープス・ミクロスポラス菌株Ｔｐ－１を食品工業発展研究所の生物資源保存・研究センターにも寄託および保存した。寄託番号はＢＣＲＣ ９３０２２６であった。

【0036】

実施例２：新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の成長曲線のプロットおよび分析

【0037】

白金耳（inoculation loop）を用いＴｐ－１菌株サンプルから適量のカビ胞子をＰＤＡ培地プレート（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）ポテトデキストロースアガー）に採取し、３０℃で培養し、一定の時間（８から１２時間）おきに撮影した。リゾプス（Rhizopus）の形態は糸状であるため、固体のＰＤＡ培地プレート上ではジグザグし（staggered）、不規則な形状に成長する。よって、定量分析に面積率計算法（area percentage calculation）を用い、成長菌株の面積パーセンテージと時間の関係を用いて成長曲線をプロットした。発酵プロセスにおける菌株Ｔｐ－１のライフサイクルを知ることができるため、後続の発酵の条件（例えば発酵時間）について評価することができる。

【0038】

図３を参照されたい。これは、ＰＤＡ培地プレートにおける成長時の菌株Ｔｐ－１の成長曲線図（培養時間と面積パーセンテージとの関係）を示している。図３に示されるように、培養後約３０時間で菌株Ｔｐ－１の成長率が高まり始め、培養約３４時間から４９時間の期間は、菌株Ｔｐ－１の急速成長期であった。培養後約５０～５７時間に成長は徐々に速度を落とし、培地プレートで成長しているＴｐ－１の面積パーセンテージは９０％をこえ、培地における白色の菌糸の分布が飽和に近付いた。菌株Ｔｐ－１の成長分析から、菌株Ｔｐ－１が固体の発酵プロセスの生成に適していることがわかる。

【0039】

実施例３：豆加工残留物の添加による新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の成長および機能性テスト分析

【0040】

白金耳を用い、Ｔｐ－１菌株サンプルから適量のカビ胞子を、豆滓を０％、５％、 ６％および７％それぞれ含有する（ｗ／ｖ％）ＰＤＡ培地プレート（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）ポテトデキストロースアガー）に採取し、３０℃で培養し、一定の時間（８から１２時間）おきに撮影した。定量分析に面積率計算法を用い、成長菌株の面積パーセンテージと時間との関係を用いて成長曲線をプロットした。

【0041】

図４を参照されたい。これは、豆滓をそれぞれ異なる比率で含有するＰＤＡ培地プレートにおける成長時の菌株Ｔｐ－１の成長曲線図（培養時間と面積パーセンテージとの関係）を示している。図４に示されるように、豆滓含有培地における菌株Ｔｐ－１の全体的な成長の傾向は豆滓なしの培地に比べて良好であり、かつ豆滓含有培地における菌株Ｔｐ－１の成長速度はより速かった。さらに、豆滓６％含有培地における菌株Ｔｐ－１の成長速度が最も速く、一方、豆滓５％および豆滓７％含有培地における菌株Ｔｐ－１の成長率は全段階において類似していた。上記の結果から、菌株Ｔｐ－１はタンパク質含有量がより多い培地を好むことがわかる。

【0042】

実施例４：新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の発酵生成物の成分分析

【0043】

白金耳を用い、Ｔｐ－１菌株サンプルから適量のカビ胞子を、豆滓を０％、５％、６％および７％それぞれ含有する（ｗ／ｖ％）ＰＤＢブロス（ポテトデキストロースブロス,ＳＴＢＩＯＭＥＤＩＡ）に採取した。発酵培養を３０℃、１２０ｒｐｍで４日間行った。培養が完了した後、その培地を２０℃、９９００ｒｐｍで４０分遠心分離し、その上澄みと沈殿物を別々に保存した。次いで、沈殿物を２日間凍結乾燥し、粉砕して粉末にし、発酵生成物の粗タンパク質、粗脂肪、炭水化物，水溶性食物繊維および非水溶性食物繊維の含有量を分析した。測定方法は以下の通りとした。実験結果は表１に示されている。

【0044】

１．粗タンパク質含有量の分析

【0045】

ケルダール（Kjeldahl）窒素法を用いて総窒素量を決定した。サンプルを０．５ｇ取り、触媒５ｇ（Ｋ_２ＳＯ_４：ＣｕＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ＝９：１）および１８Ｎ濃硫酸１３ｍＬと共に分解チューブに加え、それをタンパク質分解炉中に入れ、２００℃にして１時間加熱した。そのサンプルを炭化して黒い液体にした後、４００℃にして２時間加熱した。水色の澄明な状態となるまで分解したら、取り出して冷却し、次いで蒸留水７０ｍＬおよび４０％ＮａＯＨ ５０ｍＬを加えた。窒素蒸留装置で窒素を留出し、メチルブルーおよびメチルレッド指示薬を含有する４％ホウ酸水で留出した窒素を受け、液体を赤色にした。最後に、液体がわずかに赤みを帯びた色になる（つまり、滴定が完了する）まで、０．１ＮＨＣｌを用いて滴定を行い、滴定された液体の量を記録した。粗タンパク含有量（％）＝［塩酸滴定量（ｍｌ）×塩酸濃度（Ｎ）×１．４００７×１］／サンプルの重量（ｇ）×窒素含有係数（窒素換算係数）６．２５。

【0046】

２．粗脂肪含有量の分析

【0047】

サンプル３ｇをろ紙に取り、包んだ後に円筒ろ紙（filter thimble）中に入れた。次いで、脂肪収集瓶に接続したソックスレー抽出器中に入れ、抽出器の上端部からｎ－ヘキサン１７０ｍＬを加えた。抽出器を凝縮チューブ（condenser tube）に接続してから、恒温水浴中にて５０～６０℃で１６時間還流させた。抽出後、脂肪収集瓶を取り外し、ソックスレー抽出器中のｎ－ヘキサンを回収した。その脂肪収集瓶を１０５℃のオーブンに入れて乾燥させ、取り出して乾燥皿に置き、脂肪収集瓶が恒量になるまで冷却した。粗脂肪（％）＝［（脂肪抽出後の脂肪収集瓶の重量－脂肪収集瓶の重量）］／サンプルの重量×１００％。

【0048】

３．総炭水化物含有量の分析

【0049】

総炭水化物含有量は、１００％から水分、灰分、粗タンパク質および粗脂肪のパーセンテージを引くことで得られる。

【0050】

４．水溶性食物繊維含有量の分析

【0051】

上述した抽出プロセスにより、非水溶性食物繊維をろ液と分離し、そのろ液を９５％ アルコール３００ｍＬの入ったビーカーに注ぎ入れることにより水溶性食物繊維を沈殿させ、１日静置して完全に沈殿させた。ろ紙の重量を量り、小数第４位まで記録した。その液体を磁性漏斗（magnetic funnel）に注ぎ入れて吸引ろ過を行い、７８％アルコール２０ｍＬで３回すすいでから、９５％アルコール１０ｍＬで２回すすぎ、最後にアセトン１０ｍＬで２回すすいだ。ろ紙および残留物をはかり瓶に一緒に入れ、１０５℃のオーブン中に置いて恒量になるまで乾燥させ、はかり瓶およびろ紙の重量を恒量から引き、総残留物重量を得た。水溶性食物繊維含有量（％）＝［総残留物正味重量－サンプル中のタンパク質の重量（ｇ）－サンプル中の灰分の重量（ｇ）］／サンプルの重量（ｇ）×１００％。

【0052】

５．非水溶性食物繊維含有量の分析

【0053】

恒温水浴を９５℃に予熱し、粉末サンプルを約１ｇはかり取り、小数第４位まで記録した。そのサンプルをビーカーに入れ、リン酸緩衝液５０ｍＬを加えて均一に混合してから、α－アミラーゼ１００ μｌを加えて軽く振とうした。そのビーカーにアルミニウムホイルを被せ、９５℃の恒温水浴に入れ約１５分間、５分おきに穏やかに振とうし、室温まで冷却してから、０．２７５Ｎ ＮａＯＨ １０ ｍＬを加えて穏やかに振とうした。恒温水浴を６０℃に予熱し、プロテアーゼ０．０５ｇをリン酸緩衝液１ｍＬに加えて均一に混合し、プロテアーゼリン酸緩衝液溶液１００μｌをビーカーに加えた。そのビーカーにアルミニウムホイルを被せ、６０℃の恒温水浴に入れ、約３０分間、５分おきに穏やかに振とうし、室温まで冷却してから、０．３２５Ｎ ＨＣｌ １０ｍＬを加えて穏やかに振とうした。恒温水浴を６０℃に予熱し、アミログルコシダーゼ１００μｌをビーカーに加えた。そのビーカーにアルミニウムホイルを被せ、６０℃の恒温水浴に入れ、約３０分間、５分おきに穏やかに振とうしてから、室温まで冷却した。ろ紙の重量を量り、小数第４位まで記録し、その液体を磁性漏斗（magnetic funnel）に注ぎ入れて吸引ろ過を行った。ろ紙および残留物をはかり瓶に一緒に入れ、１０５℃のオーブン中に置いて恒量になるまで乾燥させ、はかり瓶およびろ紙の重量を恒量から引き、総残留物重量を得た。非水溶性食物繊維含有量（％）＝［総残留物正味重量－サンプル中のタンパクの重量（ｇ）－サンプル中の灰分の重量（ｇ）］／サンプルの重量（ｇ）×１００％。

【0054】

【表1】

【0055】

表１の結果によれば、Ｔｐ－１を、異なる比率で豆滓を含有する（０％、５％、６％、７％（ｗ／ｖ％））培地中に接種し、９６時間発酵させた後、豆滓含有培地の粗タンパク質含有量は増加した。豆滓を含まない群と比較して、豆滓７％含有の群ではタンパク質含有量が約４％増加しており、解糖変換率（glycolysis conversion rate）は約６％であり、水溶性食物繊維は約２．１％増加した。

【0056】

比較例１：ＢＣＲＣ ３１７５０テンペ菌の発酵生成物の成分分析

【0057】

寄託番号ＢＣＲＣ ３１７５０のテンペ菌を用いて比較実験を行った。白金耳を用い、テンペ菌ＢＣＲＣ ３１７５０を、豆滓を０％、５％、６％および７％それぞれ含有する（ｗ／ｖ％）ＰＤＢブロス（ポテトデキストロースブロス, STBIO MEDIA） に接種した。発酵培養を３０℃、１２０ｒｐｍで４日間行った。図５は、豆滓を異なる比率で含有するＰＤＢ培地中の菌株Ｔｐ－１の培養前および培養後に撮った写真の比較を示している。

【0058】

加えて、培養が完了した後、その培地を２０℃、９９００ｒｐｍで４０分遠心分離し、その上澄みと沈殿物を別々に保存した。その沈殿物を２日間凍結乾燥し、粉砕して粉末にし、発酵生成物の粗タンパク質、粗脂肪、炭水化物，水溶性食物繊維および非水溶性食物繊維の含有量を分析した。測定方法は実施例４に記載されている通りとした。実験結果が表２に示されている。

【0059】

【表2】

【0060】

表２の結果によれば、ＢＣＲＣ ３１７５０テンペ菌を、異なる比率で豆滓を含有する （０％、５％、６％、７％（ｗ／ｖ％））培地中に接種し、９６時間発酵させた後、豆滓含有培地の粗タンパク質含有量は有意に増加しなかった。豆滓を含まない群と比較して、豆滓含有群における解糖は顕著でなく、また水溶性食物繊維は 約１．６％とわずかに増加した。表１と表２とを比較すると、ＢＣＲＣ ３１７５０テンペ菌に比べ、本開示により提供される新規リゾープス・ミクロスポラス菌株Ｔｐ－１は、発酵生成物のタンパク質および水溶性食物繊維含有量を高める効果、および解糖変換率（glycolysis conversion rate）を高める効果を有することがわかる。

【0061】

実施例５：新規リゾープス・ミクロスポラス菌株の発酵生成物の物理特性分析

【0062】

菌株Ｔｐ－１をそれぞれ異なる豆滓に接種し、固体発酵を行って、豆滓テンペを生成し、その物理特性をテクスチャーアナライザー（Horn Instruments co., ltd., model：UniversalTA）で測定した。豆滓テンペ（bean-dreg tempeh）Ａ、Ｂ およびＥのソースとしての豆は、台湾桃園豆腐協会より提供されたものであり（輸入大豆）、豆滓テンペＸのソースとしての豆はＰＥＡＣＥ ＶＥＧＡＮ ＣＯ．， ＬＴＤより提供されたものである（台湾の有機大豆）。

【0063】

上述した異なるソースからの豆滓に、固体発酵プロセスを行った。先ず、豆滓１ｋｇを取り、６０℃から６５℃のオーブンで２４時間乾燥させ、水蒸気で殺菌した。室温まで冷却したら、Ｔｐ－１菌株粉末または菌液約１０から２０グラムを豆滓にふりかけ、均一に撹拌してから、３０℃の発酵チャンバーに入れ、２４から４８時間後に発酵生成物を得た。発酵生成物の２ｃｍ^３の四角い塊（square）をサンプルとして取って、テクスチャーアナライザーでの測定を行い、硬さ、弾力性、咀嚼性、ガム性、凝集性および回復性（resilience）のようなその物理特性を分析した。

【0064】

上述のように生成したそれぞれ異なるソースの豆滓テンペＡ（サンプル１）、豆滓テンペＢ（サンプル２）、豆滓テンペＥ（サンプル３）、および豆滓テンペＸ（サンプル４）のテクスチャーアナライザーのデータが、表３に示されている。さらに、それらデータを、市販の大豆テンペ（XiangHehJia-Biotech CO., LTD.より購入）（サンプル ５）、市販の小麦ＴＶＰ（GOLDENCROPS CORPORATIONより提供）（サンプル６）、市販のエンドウ豆ＴＶＰ（GOLDENCROPS CORPORATIONより提供）（サンプル７）と比較した。

【0065】

【表3】

【0066】

表３の結果に示されるように、菌株Ｔｐ－１の発酵により生成された発酵生成物（豆滓テンペ）は、硬さがエンドウ豆ＴＶＰに匹敵しており、その他のパラメータ値はより低いものであった。豆滓テンペの食感（texture）は、比較的柔らかく、食べやすい（easy to chew）ということがわかる。適した調味および簡単な衛生加工処理によって、パッケージ入りのインスタント食品（ready-to-eat conditioning package）として利用することができ、医療ケアを必要とする患者または高齢者に高タンパク質の栄養を提供するものとして非常に適している。また、植物性ミート（vegetable meat）製品およびベジタリアンフードの半製品において、豆滓テンペは、天然のタンパク質原料または成分添加物として、食品の成分の多様性または風味を高めることもできる。

【0067】

以上、本開示のいくつかの実施形態およびそれらの利点を記載したが、添付の特許請求の範囲により定義された本開示の精神および範囲を逸脱することなく、各種の変化、置換および変更をそれらに加えることができるという点が理解されなければならない。加えて、各請求項はそれぞれ独立した実施形態を構成し、本開示の特許請求の範囲には請求項および実施形態の組み合わせも含まれ得る。本開示の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲の定義に従う。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【外国語明細書】