特開 2024-100014 検出装置、および検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024100014

(43)【公開日】2024-07-26

(54)【発明の名称】検出装置、および検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240719BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240719BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/34 Z

C12Q1/6844 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023003703

(22)【出願日】2023-01-13

(71)【出願人】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】田中 皓人

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029BB16

4B029BB20

4B029FA12

4B063QA05

4B063QA13

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】ユーザ毎の融解温度の検出誤差を無くす。
【解決手段】検出装置２００は、ＣＰＵ２１１と、メモリ２１２と、を備える。ＣＰＵ２１１は、融解曲線を前領域と後領域とに分ける境界点を設定し、開始点と終了点とを設定し、最小二乗法により近似直線を算出し、近似直線の設定処理を繰返す。ＣＰＵ２１１は、前領域において第１直線を設定し、後領域において第２直線を設定し、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出する。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する検出装置であって、
制御装置と、
前記分析装置からの前記データを記憶する記憶装置と、を備え、
前記データは、前記核酸の温度を横軸、前記核酸の吸光度を縦軸にし前記データをプロットしたとき前記核酸の温度の上昇にともなって前記核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表され、
前記制御装置は、
前記記憶装置に記憶された前記データを前記融解曲線として表したときに前記核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定し、
前記前領域における前記データのうち前記核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第１データに対して最低温度を第１開始点、最高温度を第１終了点と設定し、
前記第１開始点と前記第１終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、
前記第１終了点が前記境界点に至るまで、前記第１データの範囲を前記境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第１データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、
前記後領域における前記データのうち前記核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第２データに対して最高温度を第２開始点、最低温度を第２終了点と設定し、
前記第２開始点と前記第２終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、
前記第２終了点が前記境界点に至るまで、前記第２データの範囲を前記境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第２データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、
前記第１データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、前記第１データの前記第１開始点から前記第１終了点までの温度差をＷ１、前記第１データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定し、
前記第２データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、前記第２データの前記第２開始点から前記第２終了点までの温度差をＷ２、前記第２データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定し、
前記第１直線と前記第２直線とにおいて前記核酸の温度が同一となる前記核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと前記融解曲線との交点に対応する前記核酸の温度を前記融解温度として検出する、検出装置。

【請求項2】

前記制御装置は、
前記前領域において前記第１データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ１を変更して前記第１直線の設定処理を繰返し、
前記後領域において前記第２データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ２を変更して前記第２直線の設定処理を繰返し、
前記第１直線と前記第２直線とにおいて前記核酸の温度が同一となる前記核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと前記融解曲線との交点に対応する前記核酸の温度を前記融解温度として検出する、請求項１に記載の検出装置。

【請求項3】

前記制御装置は、
前記第１データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、前記第１直線の設定処理を終了し、
前記第２データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、前記第２直線の設定処理を終了する、請求項２に記載の検出装置。

【請求項4】

前記制御装置は、前記境界点を基準に前記溶解曲線を点対称に回転させるように前記後領域のデータのプロット位置を反転し、前記第２直線の設定処理を実行した後、設定された前記第２直線のデータのプロット位置を前記境界点を基準に再度反転する、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の検出装置。

【請求項5】

分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する方法であって、
前記データは、前記核酸の温度を横軸、前記核酸の吸光度を縦軸にし前記データをプロットしたとき前記核酸の温度の上昇にともなって前記核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表され、
前記方法は、
記憶された前記データを前記融解曲線として表したときに前記核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定するステップと、
前記前領域における前記データのうち前記核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第１データに対して最低温度を第１開始点、最高温度を第１終了点と設定するステップと、
前記第１開始点と前記第１終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、
前記第１終了点が前記境界点に至るまで、前記第１データの範囲を前記境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第１データを用いた近似直線の設定処理を繰返すステップと、
前記後領域における前記データのうち前記核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第２データに対して最高温度を第２開始点、最低温度を第２終了点と設定するステップと、
前記第２開始点と前記第２終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、
前記第２終了点が前記境界点に至るまで、前記第２データの範囲を前記境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第２データを用いた近似直線の設定処理を繰返すステップと、
前記第１データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、前記第１データの前記第１開始点から前記第１終了点までの温度差をＷ１、前記第１データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定するステップと、
前記第２データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、前記第２データの前記第２開始点から前記第２終了点までの温度差をＷ２、前記第２データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定するステップと、
前記第１直線と前記第２直線とにおいて前記核酸の温度が同一となる前記核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと前記融解曲線との交点に対応する前記核酸の温度を前記融解温度として検出するステップと、を実行する、方法。

【請求項6】

前記方法は、
前記前領域において前記第１データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ１を変更して前記第１直線の設定処理を繰返すステップと、
前記後領域において前記第２データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ２を変更して前記第２直線の設定処理を繰返すステップと、
前記第１直線と前記第２直線とにおいて前記核酸の温度が同一となる前記核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと前記融解曲線との交点に対応する前記核酸の温度を前記融解温度として検出するステップと、を実行する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記方法は、
前記第１データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、前記第１直線の設定処理を終了するステップと、
前記第２データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、前記第２直線の設定処理を終了するステップと、を実行する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記方法は、前記境界点を基準に前記溶解曲線を点対称に回転させるように前記後領域のデータのプロット位置を反転し、前記第２直線の設定処理を実行した後、設定された前記第２直線のデータのプロット位置を前記境界点を基準に再度反転するステップを実行する、請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、核酸の融解温度を検出するための検出装置、および検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等の核酸の安定性を示す指標に融解温度（以下、Ｔｍ値とも称する）がある。核酸は、２本鎖構造をしている。核酸は、核酸を溶解させた溶液の温度を上昇させることによって２本鎖構造が徐々に離れ、高温溶液中においては完全に離れて１本鎖構造となる。核酸が２本鎖構造から１本鎖構造に変化する際、波長２６０μｍ付近の紫外光の吸光度が大きく上昇する。核酸は、このような特性を有するため、横軸を温度、縦軸を吸光度とした融解曲線のグラフを作成すると、グラフが急激に変化する領域が現れる。Ｔｍ値は、このような領域において１本鎖構造と２本鎖構造との占める割合が等しくなる温度である。

【0003】

特開２００３－１２１３９６号公報（特許文献１）には、ＤＮＡの吸光度を高い精度で算出することが可能な装置が開示されている。これにより、特開２００３－１２１３９６号公報（特許文献１）では、高い精度の融解曲線のグラフを作成することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００３－１２１３９６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

Ｔｍ値は、例えば以下に示す方法（以下、「中線法」とも称する。）により求めることができる。中線法では、核酸のグラフの前領域（２本鎖構造の領域）と後領域（１本鎖構造の領域）とにおいて開始点と終了点とをそれぞれ設定し、２点を結ぶ直線を引く。中線法は、その２つの直線から核酸の温度が同一温度となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点における核酸の温度をＴｍ値とする方法である。特開２００３－１２１３９６号公報（特許文献１）には、Ｔｍ値の詳細な検出方法については開示されていない。

【0006】

Ｔｍ値の算出に中線法を用いる場合、開始点と終了点とはユーザが任意に設定する。このため、Ｔｍ値は、同じデータを用いた場合であってもユーザ毎に開始点と終了点とのバラツキが生じるため、検出に誤差が生じることがある。

【0007】

本開示は、かかる問題を解決するためになされたものであり、その目的は、ユーザ毎の融解温度（Ｔｍ値）の検出誤差を無くすことが可能な検出装置、および検出方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示に係る検出装置は、分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する検出装置に関する。検出装置は、制御装置と、分析装置からのデータを記憶する記憶装置と、を備える。データは、核酸の温度を横軸、核酸の吸光度を縦軸にしデータをプロットしたとき核酸の温度の上昇にともなって核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表される。制御装置は、記憶装置に記憶されたデータを融解曲線として表したときに核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定し、前領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第１データに対して最低温度を第１開始点、最高温度を第１終了点と設定し、第１開始点と第１終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、第１終了点が境界点に至るまで、第１データの範囲を境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第１データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、後領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第２データに対して最高温度を第２開始点、最低温度を第２終了点と設定し、第２開始点と第２終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、第２終了点が境界点に至るまで、第２データの範囲を境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第２データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、第１データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、第１データの第１開始点から第１終了点までの温度差をＷ１、第１データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定し、第２データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、第２データの第２開始点から第２終了点までの温度差をＷ２、第２データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定し、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出する。

【0009】

本開示に係る検出方法は、分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する方法に関する。データは、核酸の温度を横軸、核酸の吸光度を縦軸にしデータをプロットしたとき核酸の温度の上昇にともなって核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表される。方法は、分析装置からのデータを記憶するステップと、記憶されたデータを融解曲線として表したときに核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定するステップと、前領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する第１数のデータに対して融解曲線上に核酸の温度が低い点から順に開始点と終了点とを設定するステップと、開始点と終了点との範囲における第１数のデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、終了点が境界点に至るまで、開始点および終了点を１点ずつ境界点の方向に移動させつつ、第１数のデータから定める近似直線の設定処理を繰返すステップと、後領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する第２数のデータに対して融解曲線上に核酸の温度が高い点から順に開始点と終了点とを設定するステップと、開始点と終了点との範囲における第２数のデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、終了点が境界点に至るまで、開始点および終了点を１点ずつ境界点の方向に移動させつつ、第２数のデータから定める近似直線の設定処理を繰返すステップと、融解曲線において隣合う第１数のデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、第１数のデータの開始点から終了点までの幅をＷ１、第１数のデータから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定するステップと、融解曲線において隣合う第２数のデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、第２数のデータの開始点から終了点までの幅をＷ２、第２数のデータから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定するステップと、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出するステップと、を実行する。

【0010】

本開示の検出装置、および検出方法によれば、融解温度が一義的に決定されるため、ユーザ毎の融解温度（Ｔｍ値）の検出誤差を無くすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】分析装置、および検出装置の要部の構成を示す図である。

【図2】理想的な融解曲線のグラフを示す図である。

【図3】実施の形態に係る融解曲線のグラフを示す図である。

【図4】データ範囲を設定した場合の融解曲線のグラフを示す図である。

【図5】データ範囲を移動した場合の融解曲線のグラフを示す図である。

【図6】データ範囲を減少した場合の融解曲線のグラフを示す図である。

【図7】Ｔｍ値の検出処理を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中の同一または相当部分については、同一の符号を付して、その説明は原則的に繰り返さない。

【0013】

図１により実施の形態に係る検出装置２００が適用される分析装置１００について説明する。図１は、分析装置１００、および検出装置２００の要部の構成を示す図である。

【0014】

分析装置１００は、主要部として、いわゆるダブルビーム方式の紫外可視分光光度計の測光部１と、各種の演算処理、制御処理を行なう第１制御装置１１０と、マルチセル３２を備えた試料ユニット３０とを含む。第１制御装置１１０には、所定の制御プログラムが搭載されており、この制御プログラムを実行することにより後述するような各種の処理が実行される。分析装置１００には、検出装置２００が接続されている。

【0015】

第１制御装置１１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１１１と、メモリ１１２とを含む。ＣＰＵ１１１は、メモリ１１２に記憶されたプログラムを実行することによって、測光部１、試料ユニット３０内の各部の動作を制御する。第１制御装置１１０に接続された操作部２４は、例えばキーボード、ポインティングデバイスなどであり、測定に関連する各種パラメータの設定や各種測定、処理の指示を行なうためのものである。第１制御装置１１０に接続された表示部２５は、操作のための補助的情報、測定結果等を画面に表示するものである。

【0016】

測光部１では、光源２から発した光が分光器３に入射され、ここで所望の波長を有する単色光が取り出される。波長としては、２３０～２８０μｍ位の範囲内の紫外光が利用されることが多い。単色光は、反射鏡４によりセクタ鏡５に送られ、セクタ鏡５により試料側光束Ｓと対照側光束Ｒの２光束に分割される。セクタ鏡５には光の遮蔽部が設けられており、試料側光束Ｓおよび対照側光束Ｒの発生期間と交互に遮光期間が発生するようにしている。

【0017】

試料側光束Ｓは、反射鏡６を介して、試料ユニット３０に備えられたマルチセル３２のうちの１つのセルに照射される。マルチセル３２のうちの１つのセルを通過した光は、反射鏡８、１０を介して光検出器１１の受光面に送られる。他方、対照側光束Ｒは、反射鏡７を介して試料ユニット３０内のアパーチャ板３１に照射される。アパーチャ板３１を通過することによって試料側と光束径が揃えられる。アパーチャ板３１を通過した光は、反射鏡９を介して同じく光検出器１１の受光面に送られる。なお、アパーチャ板３１の代わりにダミーのセルを配置してもよい。

【0018】

光検出器１１の出力信号は、サンプルホールド回路、アナログ－デジタル変換器などを含むインターフェイス部（Ｉ/Ｆ）１２を介して検出装置２００へ入力される。検出装置２００は、第２制御装置２１０を備えている。第２制御装置２１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１１と、メモリ２１２とを含む。ＣＰＵ２１１は、メモリ２１２に記憶されたプログラムを実行することによって、各種の演算処理を実行する。

【0019】

ＣＰＵ２１１は、例えば、検出装置２００に入力されメモリ２１２に記憶される分析装置１００からのデータを用いて吸光度を算出するための各種の演算処理を実行する。ＣＰＵ２１１は、演算結果である吸光度を用い、核酸の温度と吸光度との関係を示すグラフである融解曲線を作成する。ＣＰＵ２１１は、融解曲線のグラフに基づいてＴｍ値を検出する。Ｔｍ値の検出の具体的な手法については後述する。

【0020】

試料ユニット３０において、マルチセル３２は、容量が１０～１００μl程度である小型の石英製のセルを複数一列に並べて配置したものであり、その全体がスライド駆動部３７によって試料側光束Ｓと略直交する方向に往復直線運動をするように構成されている。これにより、いずれのセルにも選択的に試料側光束Ｓが照射される。このマルチセル３２は、恒温ブロック３３に保持されている。恒温ブロック３３は、ペルチエ素子などを利用した温冷ユニット３４で迅速に加温または冷却されるようになっている。恒温ブロック３３には、１ないし複数の温度センサ３６が付設されている。温度センサ３６による検出温度は、温度制御部３５に与えられている。温度制御部３５は、ＣＰＵ１１１より温度の制御目標値Ｔｃを受け取り、検出温度がその制御目標値Ｔｃになるように、つまりその差がゼロになるように温冷ユニット３４に供給する電力を制御する。分析装置１００では、制御目標値Ｔｃを適宜に設定することにより、所定の温度範囲（通常は温冷ユニット３４の能力の範囲）で任意の温度における試料の吸光度の測定が可能である。

【0021】

図２は、理想的な融解曲線のグラフを示す図である。分析条件、試料の状態等により、実際のグラフにはノイズが発生するが、図２では、ノイズが無い理想的な融解曲線のグラフを示している。図２の横軸は、核酸を溶解させた溶液の温度、縦軸は、波長２６０μｍ付近の紫外光の吸光度を示している。

【0022】

図２において、温度が低く吸光度の変化率が低い領域を前遷移領域と称する。前遷移領域は、核酸を溶解させた溶液の温度を上昇させることによって２本鎖構造が徐々に離れていく領域である。図２において、温度が高く吸光度の変化率が低い領域を後遷移領域と称する。後遷移領域は、核酸を溶解させた溶液の温度を上昇させることによって核酸のほとんどが１本鎖構造となる領域である。図２において、前遷移領域と後遷移領域との間の領域であって、吸光度の変化率が高い領域を遷移領域と称する。遷移領域は、２本鎖構造が１本鎖構造へと遷移していく領域であり、吸光度が急激に増加する領域である。遷移領域における１本鎖構造と２本鎖構造との占める割合が等しくなる温度が融解温度（Ｔｍ値）である。

【0023】

ここで、従来の方法による融解温度（Ｔｍ値）の検出について説明する。ユーザは、前遷移領域におけるグラフの傾きが安定している部分において開始点と終了点とを任意に設定する。ユーザは、後遷移領域においても同様にグラフの傾きが安定している部分において開始点と終了点とを任意に設定する。融解温度（Ｔｍ値）の算出では、前遷移領域における開始点と終了点とを結ぶ直線と、後遷移領域における開始点と終了点とを結ぶ直線とにおいて核酸の温度が同一温度となる核酸の吸光度の中間値を結ぶライン（中線）を求める。融解温度（Ｔｍ値）は、この中線と融解曲線のグラフとの交点における核酸の温度として検出される。

【0024】

ここで、従来の融解温度（Ｔｍ値）の検出方法では、ユーザが開始点と終了点とを任意に設定している。このため、Ｔｍ値は、同じデータを用いた場合であってもユーザ毎に開始点と終了点とのバラツキが生じるため、検出に誤差が生じることがある。また、分析条件、試料の状態等により、実際のグラフにはノイズが発生する。このため、そのようなグラフを用いた場合、Ｔｍ値の検出の誤差が大きくなる可能性がある。本開示の検出装置２００、および検出装置２００を用いた検出方法によれば、Ｔｍ値の検出においてユーザ毎の誤差を無くすことができる。以下に、具体的なＴｍ値の検出方法について説明する。

【0025】

図３は、実施の形態に係る融解曲線のグラフを示す図である。図３に示すように、実際のグラフは、図２の理想的なグラフにノイズが重畳したグラフとなっている。以下に示す処理は、検出装置２００の第２制御装置２１０におけるＣＰＵ２１１が実行する処理として説明する。ＣＰＵ２１１は、融解曲線のグラフにおいて、境界点を決定する。境界点は、遷移領域に対応する領域に設定されるグラフ上の点であり、例えば吸光度のデータの中央値に設定される。境界点より前の領域を前領域、境界点よりも後の領域を後領域とする。

【0026】

図４は、データ範囲ΔＴを設定した場合の融解曲線のグラフを示す図である。ＣＰＵ２１１は、前領域の範囲において所定のデータ数で規定される第１データに対して最低温度を開始点、最高温度を終了点としてデータ範囲ΔＴを設定する。データ範囲ΔＴは、ユーザが任意に設定可能な温度範囲である。データ範囲ΔＴは、ＣＰＵ２１１が自動的に設定するようにしてもよい。データ範囲ΔＴを設定することは、開始点と終了点とを含む範囲のデータの点数を設定することでもある。ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴの両端の２点間を含む範囲のデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出する。最小二乗法とは、誤差を伴う測定値の処理において、その誤差の二乗の和を最小にすることによって最も確からしい関係式を求める方法である。

【0027】

本実施の形態の検出装置２００では、設定したデータ範囲ΔＴを移動および減少させ、移動および減少させたデータに対して近似直線の設定処理を繰返している。本実施の形態の検出装置２００では、複数得られる近似直線のうち最も適切な近似直線を前領域および後領域において１本ずつ設定している。これによって、単純に一度のみデータ範囲ΔＴを設定して近似直線を求める場合よりも適切な近似直線の設定が可能となる。以下に、データ範囲ΔＴを移動する場合、およびデータ範囲ΔＴを減少する場合について、グラフを用いて説明する。

【0028】

図５は、データ範囲ΔＴを移動した場合の融解曲線のグラフを示す図である。ＣＰＵ２１１は、前領域の範囲において終了点が境界点に至るまで、データ範囲ΔＴを境界点の方向に移動させる。ＣＰＵ２１１は、移動したデータ範囲ΔＴのデータを演算対象として最小二乗法により近似直線を算出する。ＣＰＵ２１１は、終了点が境界点に至るまで近似直線の算出処理を繰返す。図５では、初期位置から複数点移動した際の状況が示されている。なお、開始点の初期位置は、グラフの温度が最も低い点を用いてもよいし、境界点の方へ何点か移動させた点を用いてもよい。前領域におけるグラフ上の近似直線は、温度が低い場合よりも温度が高い場合の方が近似直線の傾き大きくなる特性がある。

【0029】

図６は、データ範囲ΔＴを減少した場合の融解曲線のグラフを示す図である。ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴのデータについて終了点を境界点まで移動して近似直線を設定する処理を実行した後、図６に示すようなデータ範囲ΔＴのデータに対して所定の割合であるαをかけてデータ点数を減少させたデータ範囲ΔＴ×αのデータにおいて近似直線を設定する処理を同様に実行する。αは、ユーザが任意に設定可能な数値である。ユーザは、例えば、０．９（９０％）から０．２（２０％）の範囲で０．１（１０％）刻みで減少させるとよい。なお、ΔＴにαをかけた値が整数とならない場合は、小数点以下を切り捨て整数の値の範囲でデータ点数の設定をすればよい。

【0030】

次に、Ｔｍ値の検出処理について具体的に説明する。図７は、Ｔｍ値の検出処理を示すフローチャートである。Ｔｍ値の検出処理は、ＣＰＵ２１１がメモリ２１２に記憶されている各種プログラムを実行することで実行される。以下では、フローチャート中の各ステップを、単に「Ｓ」と表記する。

【0031】

Ｔｍ値の検出処理において、ＣＰＵ２１１は、サンプリング点の情報を取得する（Ｓ１１）。具体的に、ＣＰＵ２１１は、分析装置１００から検出装置２００のメモリ２１２に入力されるデータを用いて吸光度を算出し、核酸の温度と算出された吸光度との関係を示すデータを作成する。このデータは、核酸の温度を横軸、核酸の吸光度を縦軸にしてデータをプロットしたときに核酸の温度上昇にともなって核酸の吸光度が上昇する融解曲線として表される。ＣＰＵ２１１は、複数の点から作成される融解曲線のデータをサンプリング点の情報として取得する。

【0032】

次いで、ＣＰＵ２１１は、図３のような前領域と後領域との境界となる境界点を設定する（Ｓ１２）。ＣＰＵ２１１は、吸光度のデータの中央値として求められる点を境界点として設定する。次いで、ＣＰＵ２１１は、図４に示すような前領域の範囲においてデータ範囲ΔＴの温度範囲のデータを設定する（Ｓ１３）。Ｓ１３の処理は、前領域においてデータ範囲ΔＴのうち最低温度を開始点、最高温度を終了点と設定し、データ範囲ΔＴのデータ点数を設定することでもある。

【0033】

次いで、ＣＰＵ２１１は、図４に示すようにΔＴ間のデータを用いて最小二乗法により直線フィッティングを実行する（Ｓ１４）。ＣＰＵ２１１は、Ｓ１４において終了点が境界点に至るまで、データの範囲を境界点の方向に１点ずつ移動させつつ、移動後の各データを用いた近似直線の設定処理を繰返す。ＣＰＵ２１１は、後述するＳ１５の処理でＮＯの場合、およびＳ１８の処理でＮＯの場合のように近似直線の設定処理が終了していな状態でＳ１４の処理を繰返す。

【0034】

次いで、ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴの終了点が境界点に到達したか否かを判定する（Ｓ１５）。ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴの終了点が境界点に到達していないと判定した場合（Ｓ１５のＮＯ）、Ｓ１４の処理を実行する。ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴの終了点が境界点に到達したと判定した場合（Ｓ１５のＹＥＳ）、データ範囲ΔＴを１０％減らす（Ｓ１６）。Ｓ１６の処理は、データ範囲ΔＴの幅を減らすことであるとともにデータ点数を削減することでもある。減少割合は、ユーザが任意に設定可能である。データ範囲ΔＴに減少割合をかけた値が整数とならない場合は、小数点以下を切り捨て整数の値の範囲でデータ点数の設定をすればよい。

【0035】

次いで、ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴが２０％以下まで減少したか否かを判定する（Ｓ１７）。２０％は、ユーザが任意に設定可能な下限値である。しかしながら、データ点数をあまりにも減らしてしまうとデータの誤差の影響が大きくなってしまい正確なＴｍ値の検出に支障が生じるため、減少割合は２０％程度までとすることが望ましい。ＣＰＵ２１１は、データ範囲ΔＴが２０％以下まで減少していないと判定した場合（Ｓ１７のＮＯ）、Ｓ１８においてサンプリング点が２点未満となったか否かを判定する。サンプリング点が２点未満となること（サンプリング点が１点であること）は、直線フィッティングの設定処理が実行されないことを意味する。なお、データ範囲ΔＴが２０％以下まで減少したとしてもサンプリング点が２点未満となることは通常想定されないが、何らかのエラーが発生した場合のエラー処理としてＳ１８の処理が設けられている。

【0036】

ＣＰＵ２１１は、サンプリング点が２点未満となっていないと判定した場合（Ｓ１８のＮＯ）、Ｓ１４の処理を繰返す。ＣＰＵ２１１は、Ｓ１７においてデータ範囲ΔＴが２０％以下まで減少したと判定した場合（Ｓ１７のＹＥＳ）、あるいはＳ１８においてサンプリング点が２点未満となったと判定した場合（Ｓ１８のＹＥＳＳ）、Ｓ１９の処理へ移行する。ＣＰＵ２１１は、Ｓ１９において後領域における直線フィッティングの設定処理が終了したか否かを判定する。

【0037】

ＣＰＵ２１１は、後領域における直線フィッティングの設定処理が終了していないと判定した場合（Ｓ１９のＮＯ）、境界点を中心に後領域のデータを反転する（Ｓ２０）。ここで、後領域では、データ範囲ΔＴのうち最高温度を開始点、最低温度を終了点と設定するが、Ｓ２０では前領域の処理手法を後領域の処理に流用するためにデータを反転している。Ｓ２０の処理は、境界点を基準に融解曲線を点対称に回転させるように後領域のデータのプロット位置を反転する処理である。つまり、Ｓ２０の処理では、境界点を基準に核酸の温度および核酸の吸光度に対応する後領域の各サンプリング点のデータを反転するようにデータを変更する処理が実行される。

【0038】

次いで、ＣＰＵ２１１は、図７のＳ１３において実行したように、後領域の範囲においてデータ範囲ΔＴの温度範囲のデータを設定し（Ｓ２１）、Ｓ１４の処理へ移行する。Ｓ２１の処理は、後領域においてデータ範囲ΔＴのうち最高温度を開始点、最低温度を終了点と設定し、データ範囲ΔＴのデータ点数を設定することでもある。なお、Ｓ２１では、Ｓ２０においてデータが反転されているため、実際の処理としては開始点がデータ範囲ΔＴの最低温度となり、終了点がデータ範囲ΔＴの最高温度となる。

【0039】

ＣＰＵ２１１は、Ｓ２０において境界点を基準に後領域のデータを反転する処理を実行することにより、Ｓ１４～Ｓ１８の処理を共通化することができ、処理負担を軽減することができる。なお、Ｓ２０の処理を実行せずに後領域においてデータ範囲ΔＴのうち最高温度を開始点、最低温度を終了点と設定し、終了点が境界点に至るまでデータ範囲ΔＴを境界点に移動させつつ、移動後の各データを用いて直線フィッティングの処理を実行してもよい。

【0040】

ＣＰＵ２１１は、後領域における直線フィッティングの設定処理が終了したと判定した場合（Ｓ１９のＹＥＳ）、直線フィッティングの算出処理を終了する（Ｓ２２）。次いで、ＣＰＵ２１１は、求めた近似直線の傾きと重み付けの関係式から前領域と後領域とにおいて最大値となる直線をフィッティングラインに設定する（Ｓ２３）。

【0041】

Ｓ２３の処理について具体的に説明する。融解曲線において隣り合うデータのプロット間隔（温度差）をＷ、Ｗの変化に比例して増加する定数を重み係数Ｋ、メモリ２１２に予め設定されている定数をＣとしてシュミレーションをした場合、Ｋ＝Ｗ×Ｃという関係が成立する。このように、データのプロット間隔に基づいて重み係数Ｋは変化する。前領域のデータ範囲ΔＴのデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数である重み係数をＫ１とし、後領域のデータ範囲ΔＴのデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数である重み係数をＫ２とする。

【0042】

Ｓ２３の処理では、前領域における開始点から終了までの温度差をＷ１、Ｓ１４により求めた近似直線の傾きをｒとした場合、Ａ１＝Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒにおいてＡ１が最大となる近似直線を第１直線として前領域におけるフィッティングラインに設定する。Ｓ２３の処理では、後領域における開始点から終了までの温度差をＷ２、Ｓ１４により求めた近似直線の傾きをｒとした場合、Ａ２＝Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒにおいてＡ２が最大となる近似直線を第２直線として後領域におけるフィッティングラインに設定する。

【0043】

次いで、ＣＰＵ２１１は、前領域と後領域とにＳ２３の処理で設定したフィッティングラインを引き、中線法により融解曲線とフィッティングラインとの交点となる核酸の温度をＴｍ値（融解温度）として検出し、表示部２５へ出力し（Ｓ２４）、処理を終了する。

【0044】

ここで、実際の核酸の計測の具体例について説明する。核酸として試薬Ｍ１３－２５ｍｅｒを用い、試薬の濃度を２０μＭ、光路長を１ｍｍ、測定温度を４０～９５℃とする。このような条件において分析装置１００により測定を実施した場合、前領域のデータ範囲ΔＴが約３０℃の範囲、後領域のデータ範囲ΔＴが約１５℃の範囲でデータ範囲ΔＴを設定することができる。試薬Ｍ１３－２５ｍｅｒでは、後領域が前領域よりも狭いため、後領域のデータ範囲ΔＴが前領域のデータ範囲ΔＴよりも小さくなっている。このように、様々な条件によりデータ範囲ΔＴは変化する。本実施の形態の検出装置２００では、データ範囲ΔＴがどのように設定されたとしても図７の処理により、Ｔｍ値を一義的に検出することができる。

【0045】

図７に示すように、検出装置２００では、ＣＰＵ２１１によって前領域および後領域のフィッティングラインが最小二乗法による複数の近似直線から各１本ずつ設定される。ＣＰＵ２１１は、前領域におけるフィッティングラインである第１直線と、後領域におけるフィッティングラインである第２直線とから、中線法により融解曲線とフィッティングラインとの交点となる核酸の温度をＴｍ値（融解温度）として検出し、表示部２５へ出力する。このように、検出装置２００では、前領域と後領域とにおいてフィッティングラインが自動的に１本ずつ定まるため、ユーザ毎の融解温度（Ｔｍ値）の検出誤差を無くすことができる。

【0046】

［態様］
上述した複数の例示的な実施の形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

【0047】

（第１項） 一態様に係る検出装置は、分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する検出装置に関する。検出装置は、制御装置と、分析装置からのデータを記憶する記憶装置と、を備える。データは、核酸の温度を横軸、核酸の吸光度を縦軸にしデータをプロットしたとき核酸の温度の上昇にともなって核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表される。制御装置は、記憶装置に記憶されたデータを融解曲線として表したときに核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定し、前領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第１データに対して最低温度を第１開始点、最高温度を第１終了点と設定し、第１開始点と第１終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、第１終了点が境界点に至るまで、第１データの範囲を境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第１データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、後領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する所定のデータ数で規定される第２データに対して最高温度を第２開始点、最低温度を第２終了点と設定し、第２開始点と第２終了点との範囲におけるデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出し、第２終了点が境界点に至るまで、第２データの範囲を境界点の方向に移動させつつ、移動後の各第２データを用いた近似直線の設定処理を繰返し、第１データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、第１データの第１開始点から第１終了点までの温度差をＷ１、第１データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定し、第２データにおける隣り合うデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、第２データの第２開始点から第２終了点までの温度差をＷ２、第２データから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定し、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出する。

【0048】

第１項に記載の検出装置によれば、融解温度が一義的に検出されるため、ユーザ毎の融解温度の検出誤差を無くすことができる。

【0049】

（第２項） 第１項に記載の検出装置は、制御装置が、前領域において第１データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ１を変更して第１直線の設定処理を繰返し、後領域において第２データのデータ数を所定の数ずつ減少させ、減少させたデータ数に応じてＷ２を変更して第２直線の設定処理を繰返し、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出する。

【0050】

第２項に記載の検出装置によれば、データ数を所定の数ずつ減少させた上で第１直線および第２直線の設定が実行されるため、融解温度の検出誤差を無くすことができる。

【0051】

（第３項） 第１項または第２項に記載の検出装置は、制御装置が、第１データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、第１直線の設定処理を終了し、第２データのデータ数が予め定めた下限値となった場合に、第２直線の設定処理を終了する。

【0052】

第３項に記載の検出装置によれば、下限値が定められているため、検出誤差が増加するような不要な範囲のデータを使用しないようにすることができる。

【0053】

（第４項） 第１項から第３項のいずれか１項記載の検出装置は、制御装置が、境界点を基準に溶解曲線を点対称に回転させるように後領域のデータのプロット位置を反転し、第２直線の設定処理を実行した後、設定された第２直線のデータのプロット位置を境界点を基準に再度反転する。

【0054】

第４項に記載の検出装置によれば、後領域を前領域と同様に処理することができるため処理負担を軽減することができる。

【0055】

（第５項） 一態様に係る検出方法は、分析装置によって測定された核酸の温度と紫外光に対応する核酸の吸光度との関係を示すデータを用いて核酸の融解温度を検出する方法に関する。データは、核酸の温度を横軸、核酸の吸光度を縦軸にしデータをプロットしたとき核酸の温度の上昇にともなって核酸の吸光度が上昇する融解曲線で表される。方法は、分析装置からのデータを記憶するステップと、記憶されたデータを融解曲線として表したときに核酸の温度に応じて前領域と後領域とに分ける境界点を設定するステップと、前領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する第１数のデータに対して融解曲線上に核酸の温度が低い点から順に開始点と終了点とを設定するステップと、開始点と終了点との範囲における第１数のデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、終了点が境界点に至るまで、開始点および終了点を１点ずつ境界点の方向に移動させつつ、第１数のデータから定める近似直線の設定処理を繰返すステップと、後領域におけるデータのうち核酸の温度に応じて連続して変化する第２数のデータに対して融解曲線上に核酸の温度が高い点から順に開始点と終了点とを設定するステップと、開始点と終了点との範囲における第２数のデータを用いて最小二乗法により近似直線を算出するステップと、終了点が境界点に至るまで、開始点および終了点を１点ずつ境界点の方向に移動させつつ、第２数のデータから定める近似直線の設定処理を繰返すステップと、融解曲線において隣合う第１数のデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第１の定数をＫ１、第１数のデータの開始点から終了点までの幅をＷ１、第１数のデータから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ１×Ｗ１＋１／ｒが最大となる第１直線を設定するステップと、融解曲線において隣合う第２数のデータのプロット間隔に基づいて予め設定される第２の定数をＫ２、第２数のデータの開始点から終了点までの幅をＷ２、第２数のデータから算出される近似直線の傾きをｒとした場合に、Ｋ２×Ｗ２＋１／ｒが最大となる第２直線を設定するステップと、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出するステップと、を実行する。

【0056】

第５項に記載の検出方法によれば、融解温度が一義的に検出されるため、ユーザ毎の融解温度の検出誤差を無くすことができる。

【0057】

（第６項） 第５項に記載の検出方法は、前領域において第１数のデータの幅を所定の割合ずつ減少させ、減少させた幅に応じてＷ１を変更し第１直線の設定処理を繰返すステップと、後領域において第２数のデータの幅を所定の割合ずつ減少させ、減少させた幅に応じてＷ２を変更し第２直線の設定処理を繰返すステップと、第１直線と第２直線とにおいて核酸の温度が同一となる核酸の吸光度の中間値を結ぶラインと融解曲線との交点に対応する核酸の温度を融解温度として検出するステップと、を実行する。

【0058】

第６項に記載の検出方法によれば、幅を所定の割合ずつ減少した上で第１直線および第２直線の設定が実行されるため、融解温度の検出誤差を無くすことができる。

【0059】

（第７項） 第５項または第６項に記載の検出方法は、第１数のデータのプロット数が予め定めた下限値となった場合に、第１直線の設定処理を終了するステップと、第２数のデータのプロット数が予め定めた下限値となった場合に、第２直線の設定処理を終了するステップと、を実行する。

【0060】

第７項に記載の検出方法によれば、下限値が定められているため、検出誤差が増加するような不要な範囲のデータを使用しないようにすることができる。

【0061】

（第８項） 第５項から第７項のいずれか１項記載の検出方法は、境界点を基準に溶解曲線を点対称に回転させるように後領域のデータのプロット位置を反転し、第２直線の設定処理を実行した後、設定された第２直線のデータのプロット位置を境界点を基準に再度反転するステップを実行する。

【0062】

第８項に記載の検出方法によれば、後領域を前領域と同様に処理することができるため処理負担を軽減することができる。

【0063】

今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【符号の説明】

【0064】

１ 測光部、２ 光源、３ 分光器、４，６，７，８，９ 反射鏡、５ セクタ鏡、１１ 光検出器、２４ 操作部、２５ 表示部、３０ 試料ユニット、３１ アパーチャ板、３２ マルチセル、３３ 恒温ブロック、３４ 温冷ユニット、３５ 温度制御部、３６ 温度センサ、３７ スライド駆動部、１００ 分析装置、１１０ 第１制御装置、１１１，２１１ ＣＰＵ、１１２，２１２ メモリ、２００ 検出装置、２１０ 第２制御装置。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】