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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024100465
(43)【公開日】2024-07-26
(54)【発明の名称】修飾タンパク質の分離方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/18 20060101AFI20240719BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C07K1/18
C07K16/32
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023004482
(22)【出願日】2023-01-16
(71)【出願人】
【識別番号】000004123
【氏名又は名称】ＪＦＥエンジニアリング株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100116713
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 正己
(74)【代理人】
【識別番号】100179844
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 芳國
(72)【発明者】
【氏名】橋本 有佳子
(72)【発明者】
【氏名】井村 亮太
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045DA76
4H045EA28
4H045GA23
(57)【要約】
【課題】修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含む液体から修飾タンパク質を分離する方法を提供すること。
【解決手段】タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
【選択図】なし
【解決手段】タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
【請求項2】
更に、下記工程３を含む、請求項１に記載の修飾タンパク質の分離方法。
工程３：前記第１の画分に次いで前記カラムから流出する前記非修飾タンパク質を含有する第２の画分を回収する工程
工程３：前記第１の画分に次いで前記カラムから流出する前記非修飾タンパク質を含有する第２の画分を回収する工程
【請求項3】
更に、前記工程３で回収した第２の画分を修飾タンパク質の製造方法における原料として使用する、請求項２に記載の修飾タンパク質の分離方法。
【請求項4】
前記陽イオン交換体が陽イオン交換樹脂である、請求項１に記載の修飾タンパク質の分離方法。
【請求項5】
前記タンパク質が抗体であり、前記修飾化合物がキレート形成性化合物である、請求項１に記載の修飾タンパク質の分離方法。
【請求項6】
前記抗体がトラスツズマブであり、前記キレート形成性化合物がp-SCN-Bn-Deferoxamineである、請求項５に記載の修飾タンパク質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は修飾タンパク質の分離方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質には抗体のように標的とする抗原に対して特異的な結合特性を有するものがあるため、このようなタンパク質に機能性物質（抗がん剤、放射性核種、等）を標識して薬物送達システム（ＤＤＳ：drug delivery system)として利用するというアイデアが盛んに研究されている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【0003】
標準的なタンパク質修飾方法としては、タンパク質中のリシンを標的としてアミン反応性試薬と反応させて機能性物質を導入する方法がある。タンパク質の修飾反応後、タンパク質はゲルろ過クロマトグラフィー又は限外ろ過法などの方法で脱塩して未反応の薬剤を除去してから動物実験や臨床研究に利用される（特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０２２－８７１３５号公報
【特許文献2】国際公開第２００９／２００９４号
【特許文献3】特開２０１９－１１２３０９号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ ３６－１，２０２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来技術における、ゲルろ過法もしくは限外ろ過法などの分離方法は、抗体の分子量が他共存物質と比べて極めて大きいことに着目した分離法であり、低分子化合物（塩類や未反応の機能性薬剤）を除去することはできる。しかしながら、修飾抗体と非修飾抗体とには大きな分子量の違いが無いため修飾抗体と非修飾抗体とを分離することができない。
非修飾抗体は機能性物質が標識されておらず機能性物質に基づく効能が期待できないため患者への投与量は厳密に管理されることが望ましい。しかしながら従来技術では非修飾抗体を除去することができないため、最終プロダクト溶液に非修飾抗体が残存し、機能性物質抗体を所定量患者に投与するためには非修飾抗体も同時に患者にも投与されるという問題がある。また、抗体に限らず医療を目的としたタンパク質全般の修飾に関しても同様の課題がある
非修飾抗体は機能性物質が標識されておらず機能性物質に基づく効能が期待できないため患者への投与量は厳密に管理されることが望ましい。しかしながら従来技術では非修飾抗体を除去することができないため、最終プロダクト溶液に非修飾抗体が残存し、機能性物質抗体を所定量患者に投与するためには非修飾抗体も同時に患者にも投与されるという問題がある。また、抗体に限らず医療を目的としたタンパク質全般の修飾に関しても同様の課題がある
【0007】
本発明は、修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含む液体から修飾タンパク質を分離する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質（タンパク質のひとつとして抗体を含む）と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質（タンパク質のひとつとして抗体を含む）と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
【発明の効果】
【0009】
本発明の方法によれば、修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含む液体から修飾タンパク質を分離することができる。なお、本願明細書の実施例においてはタンパク質として抗体を用いた。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明においては、修飾抗体及び非修飾抗体を含む液体を陽イオン交換カラムに通液することで、修飾抗体と非修飾抗体とを分離する。
本発明と従来技術とを対比するために、まず従来技術のゲルろ過クロマトグラフィーの原理について図６を参照して説明する。
本発明と従来技術とを対比するために、まず従来技術のゲルろ過クロマトグラフィーの原理について図６を参照して説明する。
【0012】
混合液中に大きさが異なる分子ａ、分子ｂ、分子ｃ（分子の大きさ：分子ａ＞分子ｂ＞分子ｃ）が含まれているとき、混合液中の各分子をゲルろ過クロマトグラフィーによって分離する方法は次のようにして行う。
図６のＡに示すように、各分子を含む液体をゲルろ過クロマトグラフィーカラムに通液する。
混合液がカラムに充填された移動相を通過すると分子量に応じて異なる時間で分子が排出される。
このため、図６のＢに示すように、まず、分子ａがカラムを通過して溶出する。
次いで、図６のＣに示すように、分子ｂが溶出し、最後に図６のＤに示すように、分子ｃが溶出する。
このように各分子が溶出するタイミングで各画分を回収することで分離が行われる。
図６のＡに示すように、各分子を含む液体をゲルろ過クロマトグラフィーカラムに通液する。
混合液がカラムに充填された移動相を通過すると分子量に応じて異なる時間で分子が排出される。
このため、図６のＢに示すように、まず、分子ａがカラムを通過して溶出する。
次いで、図６のＣに示すように、分子ｂが溶出し、最後に図６のＤに示すように、分子ｃが溶出する。
このように各分子が溶出するタイミングで各画分を回収することで分離が行われる。
【0013】
しかしながら修飾抗体と非修飾抗体とは分子量がほぼ同一であり分子の大きさに大きな差異はないため、両者の分離は困難である。
本発明では修飾抗体と非修飾抗体とのイオン価数の差を利用して修飾抗体と非修飾抗体とをイオン交換クロマトグラフィーで分離することを特徴とする。
本発明では修飾抗体と非修飾抗体とのイオン価数の差を利用して修飾抗体と非修飾抗体とをイオン交換クロマトグラフィーで分離することを特徴とする。
【0014】
図１に、抗体としてトラスツズマブを用い、この抗体を修飾化合物としてのデフェロキサミン（ＤＦＯ：deferoxamine）で修飾する場合の反応の反応式を模式的に示す。
デフェロキサミン（以下、ＤＦＯという）はキレート形成性化合物であり、放射性同位元素を配位させることができる。
抗体をＤＦＯで修飾し、次いで、ＤＦＯに放射性同位元素を配位させることによって標識抗体を得ることができる。放射性元素（例えば、放射性ジルコニウム）は、抗体に標識させて、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）による撮像のためのトレーサとして使用することができる。
デフェロキサミン（以下、ＤＦＯという）はキレート形成性化合物であり、放射性同位元素を配位させることができる。
抗体をＤＦＯで修飾し、次いで、ＤＦＯに放射性同位元素を配位させることによって標識抗体を得ることができる。放射性元素（例えば、放射性ジルコニウム）は、抗体に標識させて、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）による撮像のためのトレーサとして使用することができる。
【0015】
トラスツズマブとＤＦＯとを反応させると、図１に示すように、反応液には修飾抗体、非修飾抗体及び未反応のＤＦＯが含まれる。
タンパク質中には正電荷を有する塩基性アミノ酸（リシン等）が存在する。塩基性アミノ酸の一つであるリシンは側鎖にアミノ基（－ＮＨ３ ＋）を有している。アミノ基は反応性が高く機能性物質の導入に利用することができる。アミノ基反応性物質としてはイソチオシアネートやＮ－ヒドロキシコハク酸イミドなどが知られており、多くの機能性物質ではこれらのアミノ基反応性物質が末端に導入された試薬が市販されている。イソチオシアネートやＮ－ヒドロキシコハク酸イミドはアミノ基と反応するとそれぞれチオ尿素およびアミドとなり、電荷を有しない化学構造となる。すなわち機能性物質導入前は正電荷を有していたリシンは機能性物質が導入されることで電荷が失われる。ＤＦＯの場合も末端にイソチオシアネートが導入されたp-SCN-Bn-Deferoxamine(Ｃ３３Ｈ５２Ｎ８Ｏ８Ｓ２)が市販されており、これを抗体と反応させると反応したリシンは正電荷を失う。
このため、修飾抗体は非修飾抗体よりも静電力が弱くなる。
タンパク質中には正電荷を有する塩基性アミノ酸（リシン等）が存在する。塩基性アミノ酸の一つであるリシンは側鎖にアミノ基（－ＮＨ３ ＋）を有している。アミノ基は反応性が高く機能性物質の導入に利用することができる。アミノ基反応性物質としてはイソチオシアネートやＮ－ヒドロキシコハク酸イミドなどが知られており、多くの機能性物質ではこれらのアミノ基反応性物質が末端に導入された試薬が市販されている。イソチオシアネートやＮ－ヒドロキシコハク酸イミドはアミノ基と反応するとそれぞれチオ尿素およびアミドとなり、電荷を有しない化学構造となる。すなわち機能性物質導入前は正電荷を有していたリシンは機能性物質が導入されることで電荷が失われる。ＤＦＯの場合も末端にイソチオシアネートが導入されたp-SCN-Bn-Deferoxamine(Ｃ３３Ｈ５２Ｎ８Ｏ８Ｓ２)が市販されており、これを抗体と反応させると反応したリシンは正電荷を失う。
このため、修飾抗体は非修飾抗体よりも静電力が弱くなる。
【0016】
静電引力による分離のメカニズムを図２に基づいて説明する。
修飾抗体はＤＦＯがリシンに結合しておりリシンの電荷が失われているためにイオン交換カラムへの吸着力が低下する。
修飾抗体及び非修飾抗体を含む液体を陽イオン交換カラムに通液すると、タンパク中の塩基性アミノ酸（例えばリシン）と陽イオン交換体とが静電引力で引き合うために非修飾抗体（塩基性アミノ酸リッチなタンパク質）はカラムに吸着しやすく、修飾抗体（塩基性アミノ酸プアーなタンパク質）はカラムに吸着しづらい。
修飾抗体はＤＦＯがリシンに結合しておりリシンの電荷が失われているためにイオン交換カラムへの吸着力が低下する。
修飾抗体及び非修飾抗体を含む液体を陽イオン交換カラムに通液すると、タンパク中の塩基性アミノ酸（例えばリシン）と陽イオン交換体とが静電引力で引き合うために非修飾抗体（塩基性アミノ酸リッチなタンパク質）はカラムに吸着しやすく、修飾抗体（塩基性アミノ酸プアーなタンパク質）はカラムに吸着しづらい。
【0017】
本発明の修飾抗体の分離方法を図３に基づいて説明する。
本発明の修飾抗体の分離方法は下記の工程１、２によって行われる。また、下記工程３は必要に応じて行われる。
工程１：図３のＡに示すように、修飾抗体と非修飾抗体との混合液を、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液する。
図３のＢに示すように、イオン交換クロマトグラフィーにより、修飾抗体ａと非修飾抗体ｂとが分離される。
工程２：図３のＣに示すように、吸光度検出器を用いて、カラムから抗体が溶出するのを検知したら、溶出液を回収しこれを第１の画分とする。
この第１の画分には、修飾抗体が含まれている。
工程３：第１の画分を回収した後、更に、吸光度検出器を用いて、カラムから抗体が溶出するのを検知したら、溶出液を回収し、これを第２の画分とする。
第２の画分には、非修飾抗体が含まれている。
本発明の修飾抗体の分離方法は下記の工程１、２によって行われる。また、下記工程３は必要に応じて行われる。
工程１：図３のＡに示すように、修飾抗体と非修飾抗体との混合液を、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液する。
図３のＢに示すように、イオン交換クロマトグラフィーにより、修飾抗体ａと非修飾抗体ｂとが分離される。
工程２：図３のＣに示すように、吸光度検出器を用いて、カラムから抗体が溶出するのを検知したら、溶出液を回収しこれを第１の画分とする。
この第１の画分には、修飾抗体が含まれている。
工程３：第１の画分を回収した後、更に、吸光度検出器を用いて、カラムから抗体が溶出するのを検知したら、溶出液を回収し、これを第２の画分とする。
第２の画分には、非修飾抗体が含まれている。
【0018】
本発明を、抗体を放射性元素で標識する際に用いられる修飾抗体に適用した実施の態様について以下述べる。
抗体としては抗がん剤として用いられるトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体）を用いた。
抗体修飾化合物としては放射性同位元素を配位させることができるキレート形成性化合物であるＤＦＯ（デフェロキサミン）を用いた。
抗体としては抗がん剤として用いられるトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体）を用いた。
抗体修飾化合物としては放射性同位元素を配位させることができるキレート形成性化合物であるＤＦＯ（デフェロキサミン）を用いた。
【0019】
まず、マイクロチューブを用いて、０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶媒置換したトラスツズマブ（１ｍｇ／ｍＬ濃度）とp-SCN-Bn-Deferoxamineとトラスツズマブの１分子に対してデフェロキサミンが１５分子となるような量比で反応させた。反応は３７℃、１時間の条件で行った。反応後、脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ、ＰＤ－１０）を用いて未反応のp-SCN-Bn-Deferoxamineを除去した。
【0020】
上記で得た修飾抗体と非修飾抗体とを含む反応液を図３に示すようなイオン交換体を充填したカラムに通液した。
イオン交換体としては陽イオン交換樹樹脂を充填したイオン交換カラムであるＹＭＣ社の「ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ」ＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＳＰ ＨＰを用いた。
溶離条件は以下の通りとした。
固相：ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ
移動相Ａ：１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）
移動相Ｂ：１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）＋１Ｍ ＮａＣｌ
通液速度：０．６ｍＬ／ｍｉｎで一定
グラジエント：移動相Ｂの濃度
０％（０ｍｉｎ）→１０％（１ｍｉｎ）→１２％（３０ｍｉｎ）
イオン交換体としては陽イオン交換樹樹脂を充填したイオン交換カラムであるＹＭＣ社の「ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ」ＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＳＰ ＨＰを用いた。
溶離条件は以下の通りとした。
固相：ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ
移動相Ａ：１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）
移動相Ｂ：１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）＋１Ｍ ＮａＣｌ
通液速度：０．６ｍＬ／ｍｉｎで一定
グラジエント：移動相Ｂの濃度
０％（０ｍｉｎ）→１０％（１ｍｉｎ）→１２％（３０ｍｉｎ）
【0021】
【0022】
ＤＦＯと抗体との量比を種々代えて修飾抗体の分離率（％）を求めた。
その結果を図５に示す。
なお、カラムを長くすることにより分離率は高まる。
図５において、横軸はＤＦＯ／抗体（ＤＦＯを抗体に対して何倍量添加したか）を表し、縦軸は分離率を示す。
本発明における分離率（％）は以下のように定義される。
イオン交換体に注入したＤＦＯ－トラスツズマブ量を１００％とし、１５分～１９分の画分で回収されたＤＦＯ－トラスツズマブの比率を分離率として定義する。
その結果を図５に示す。
なお、カラムを長くすることにより分離率は高まる。
図５において、横軸はＤＦＯ／抗体（ＤＦＯを抗体に対して何倍量添加したか）を表し、縦軸は分離率を示す。
本発明における分離率（％）は以下のように定義される。
イオン交換体に注入したＤＦＯ－トラスツズマブ量を１００％とし、１５分～１９分の画分で回収されたＤＦＯ－トラスツズマブの比率を分離率として定義する。
【0023】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
（１）タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
（２）更に、下記工程３を含む、上記（１）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
工程３：前記第1の画分に次いで前記カラムから流出する前記非修飾タンパク質を含有する第２の画分を回収する工程
（３）更に、前記工程３で回収した第２の画分を修飾タンパク質の製造方法における原料として使用する、上記（２）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（４）前記陽イオン交換体が陽イオン交換樹脂である、上記（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（５）前記タンパク質が抗体であり、前記修飾化合物がキレート形成性化合物である、上記（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（６）前記抗体がトラスツズマブであり、前記キレート形成性化合物がp-SCN-Bn-Deferoxamineである、上記（５）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（１）タンパク質が修飾化合物によって修飾されてなる修飾タンパク質と、非修飾タンパク質と、を含む液体から陽イオン交換クロマトグラフィーによって前記修飾タンパク質を分離する修飾タンパク質の分離方法であって、下記の工程１、２を含むことを特徴とする修飾タンパク質の分離方法。
工程１：陽イオン交換体を充填したカラムに修飾タンパク質と非修飾タンパク質とを含有する液体を供給する工程
工程２：前記カラムから流出する前記修飾タンパク質を含有する第１の画分を回収する工程
（２）更に、下記工程３を含む、上記（１）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
工程３：前記第1の画分に次いで前記カラムから流出する前記非修飾タンパク質を含有する第２の画分を回収する工程
（３）更に、前記工程３で回収した第２の画分を修飾タンパク質の製造方法における原料として使用する、上記（２）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（４）前記陽イオン交換体が陽イオン交換樹脂である、上記（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（５）前記タンパク質が抗体であり、前記修飾化合物がキレート形成性化合物である、上記（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の修飾タンパク質の分離方法。
（６）前記抗体がトラスツズマブであり、前記キレート形成性化合物がp-SCN-Bn-Deferoxamineである、上記（５）に記載の修飾タンパク質の分離方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
