特開 2024-100747 癌治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024100747

(43)【公開日】2024-07-26

(54)【発明の名称】癌治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20240719BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/4985 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K31/519

A61K31/517

A61K31/4985

A61K31/5377

A61K39/395 T

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024003760

(22)【出願日】2024-01-15

(31)【優先権主張番号】P 2023003798

(32)【優先日】2023-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載年月日：２０２３年９月１日 オンライン抄録 掲載アドレス： ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ－ａｐｐｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｎｅｔ／ｗｅｂ／ｊｃａ２０２３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ 〔刊行物等〕 集会名 ：第８２回日本癌学会学術総会 開催日 ：２０２３年９月２１日（２０２３年９月２１日～２３日）

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】米阪 仁雄

(72)【発明者】

【氏名】中川 和彦

(72)【発明者】

【氏名】寺村 岳士

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC41

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB36

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC46

4C086BC73

4C086BC76

4C086CB09

4C086GA07

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC41

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】ＫＲＡＳ阻害剤は、細胞増殖シグナルを抑制することで癌細胞の増殖を阻止することができる。しかし、一部の症例では治療抵抗性を示すという課題があった。
【解決手段】ＰＴＰＲＲ遺伝子が非メチル化若しくは発現低下した癌治療用の医薬組成物であって、
ＫＲＡＳを阻害する第１医薬組成物と、
ＥＧＦＲを阻害する第２医薬組成物で構成されることを特徴とする医薬組成物は、ＫＲＡＳ阻害剤で耐性を獲得した癌細胞であっても耐性を克服し、細胞増殖を抑制することができる。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＴＰＲＲ遺伝子が非メチル化若しくは発現低下した癌治療用の医薬組成物であって、
ＫＲＡＳを阻害する第１医薬組成物と、
ＥＧＦＲを阻害する第２医薬組成物で構成されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項2】

前記癌は前記第１医薬組成物に対して耐性を有する癌である請求項１に記載された医薬組成物。

【請求項3】

前記第１医薬組成物が、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ阻害剤であるソトラシブ、アダグラシブ、ＲＧ６３３０、ＬＹ３５３７９８２、ＪＦＱ４４３、ＲＭＣ６２９１、ＢＩ１７０１９６３、ＭＲＴＸ１１３３、ＢＩ－０４７４、ＢＩ－２８６５から選ばれる少なくとも１つの医薬組成物であり、前記第２医薬組成物がＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、アミバンタマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、フモネルチニブ、ブリガチニブ、ナザルチニブ、ラゼルチニブから選ばれる少なくとも１つの医薬組成物であることを特徴とする請求項２に記載された前記第１医薬組成物に対して耐性を有した癌の治療用組成物。

【請求項4】

前記癌が、非小細胞肺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮体癌、胆道癌のいずれかである請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された前記第１医薬組成物に対して耐性を有した癌の治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＫＲＡＳ阻害剤に耐性を有する癌に対して、耐性を克服し効果を発揮できる癌治療用組成物を提供する。

【背景技術】

【0002】

ＲＡＳは細胞内のシグナル伝達経路の一部であり、チロシンキナーゼレセプター、３量体Ｇ蛋白、サイトカインレセプター、カルシウムチャネル等を介した細胞外からの刺激を受けて活性状態になり、下流のシグナルを活性化する。ＲＡＳにはＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳの３種が知られている。

【0003】

ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する癌細胞では異常ＫＲＡＳは、ＧＤＰと結合した不活性状態でなく、常にＧＴＰと結合した活性化状態となる。そしてＲＡＦなどの下流シグナルを刺激し、癌細胞の増殖を促すと考えられている。

【0004】

従来変異型ＫＲＡＳを阻害する薬剤はなかったが、２０２２年にソトラシブ（商品名ルマケラス（登録商標）：特許文献１）が日本国内でも製造販売承認が取得された。ソトラシブは、変異型ＫＲＡＳとＧＤＰの結合を維持することでＫＲＡＳの活性化を阻止する。そして下流のシグナル伝達を阻害することで、癌細胞の増殖を抑制する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０２２－１８５０１２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＫＲＡＳ遺伝子変異は肺癌など様々な癌の発生・進行に関与している。ＫＲＡＳ阻害剤はＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ遺伝子変異（１２番目のアミノ酸であるグアニンのシトシンへの置換をもたらす）を有する癌（特に肺癌や大腸癌）の治療薬として有用である。しかし、一部の症例では同剤に対して治療効果が乏しい、すなわち「耐性」を示すという課題があった。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ＫＲＡＳ阻害剤に耐性である癌に対する治療薬（医薬組成物）を提供する。さらに本発明の発明者は、その機序を検討する過程で、本発明に係る医薬組成物は、ＰＴＰＲＲ遺伝子の非メチル化若しくは発現低下が認められる癌であれば、それまでのＫＲＡＳ阻害剤の投薬の有無に関わらず、耐性を克服して癌細胞の増殖を抑制する効果を発揮することを見出した。

【0008】

具体的に本発明に係る医薬組成物は、
ＰＴＰＲＲ遺伝子が非メチル化若しくは発現低下した癌治療用の医薬組成物であって、
ＫＲＡＳを阻害する第１医薬組成物と、
ＥＧＦＲを阻害する第２医薬組成物で構成されることを特徴とする。

【発明の効果】

【0009】

本発明に係る癌治療用組成物は、ＫＲＡＳ阻害剤に耐性を有する癌でも、その耐性を克服してＫＲＡＳ阻害剤による効果を発揮させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】Ｈ２１２２、ＡＲ１４およびＡＲ３０をマイクロアレイによる網羅的な遺伝子解析の結果を示すグラフである。

【図2】ＰＴＰＲＲ遺伝子を強制的に導入した際の効果を示すグラフである。（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果であり、（ｂ）はソトラシブの濃度と細胞生存率の関係を示すグラフである。

【図3】肺癌由来の細胞であるＨ２１２２とソトラシブ耐性を有したクローンであるＨ２１２２－ＡＲ１４およびＨ２１２２－ＡＲ３０のＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域のメチル化の有無を示す図である。

【図4】Ｈ２１２２、Ｈ２１２２－ＡＲ１４、Ｈ２１２２－ＡＲ３０のＰＴＰＲＲ蛋白とコントロールＡＣＴＩＮ蛋白の発現を示すウエスタンブロッティングの結果である。

【図5】ＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域にあるＴＢＥ（ＴＣＦ ｂｉｎｄｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）１～５への転写調整因子ＴＣＦ７Ｌ２の結合量を、Ｈ２１２２、ＡＲ１４およびＡＲ３０について評価した結果を表す図である。

【図6】Ｈ２１２２とＨ２１２２－ＡＲ３０について、ＥＧＦＲの発現とそのチロシン部位のリン酸化を示すウエスタンブロッティングの結果である。

【図7】Ｈ２１２２に対し牛胎児血清を一定時間暴露し、抗ＰＴＰＲＲ抗体あるいはコントロールＩｇＧ抗体を用いた共免疫沈降、あるいは全抽出液によるウエスタンブロッティングをおこなった結果の図である。

【図8】Ｈ２１２２－ＡＲ３０を移植したマウスにソトラシブ単独、セツキシマブ単独、両薬併用投与の各々についての腫瘍体積の変動を経時的に示すグラフである。

【図9】公的データベース（Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅｓ， ＩＣＧＣ／ＴＣＧＡ， Ｎａｔｕｒｅ ２０２０）の種々の腫瘍組織１２１０検体についてＰＴＰＲＲ ｍＲＮＡ発現を解析したものを示すグラフである。

【図10】Ｈ２１２２についてｓｉＲＮＡを用いて人為的にＰＴＰＲＲ遺伝子の発現を抑制した際のソトラシブ感受性を調べたグラフである。

【図11】Ｈ２１２２についてｓｉＲＮＡを用いて人為的にＰＴＰＲＲ遺伝子の発現を抑制した際にＥＧＦＲ蛋白のリン酸化が亢進することを示すウエスタンブロッティングの結果である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に本発明に係る癌治療用組成物について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。また、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

【0012】

本発明に係る癌治療用組成物は、ＫＲＡＳ（Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｒａｔ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｍｏｌｏｇ）阻害剤およびＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：上皮成長因子受容体）阻害剤で構成される。ＫＲＡＳ阻害剤としては、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃを阻害する薬剤が好適に利用でき、ソトラシブ、アダグラシブ、ＲＧ６３３０、ＬＹ３５３７９８２、ＪＦＱ４４３、ＲＭＣ６２９１、ＢＩ１７０１９６３、ＭＲＴＸ１１３３、ＢＩ－０４７４、ＢＩ－２８６５といった薬剤から少なくとも１種を選択することができる。

【0013】

ＥＧＦＲ阻害剤としては、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、アミバンタマブといった抗体薬以外にゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、フモネルチニブ、ブリガチニブ、ナザルチニブ、ラゼルチニブといった小分子阻害剤等が好適に利用できる。

【0014】

各々の薬剤について薬効（ＫＲＡＳ活性阻害、ＥＧＦＲ活性阻害）の発揮可能な投与量を用いることが望ましい。

【0015】

本発明の癌治療用組成物は、ＫＲＡＳ阻害剤に対し耐性である癌に対して用いられる。ＫＲＡＳ阻害剤に対する耐性は、ＰＴＰＲＲ遺伝子の非メチル化若しくはＰＴＰＲＲ遺伝子の発現低下を確認する。具体的にはＰＴＰＲＲ遺伝子のメチル化はバイサルファイト処置を経たＤＮＡ解析や次世代シークエンサーによって評価される。あるいはＰＴＰＲＲ遺伝子の発現は免疫学的手法や次世代シークエンサーを用いたＲＮＡシーケンス法によって評価される。

【実施例0016】

＜細胞の準備＞
親株であるＨ２１２２細胞に対し低濃度のソトラシブを持続的に暴露した。暴露の方法は、培養液中にソトラシブを添加することで行った。細胞が死滅しないよう注意しつつ薬剤濃度を漸増し、およそ半年間ソトラシブを持続暴露しながら細胞を培養した。最終的に１μＭの薬剤濃度まで漸増し、同濃度下でも細胞は容易に増殖できた。次にこの細胞集団からクローンを樹立した。すなわち細胞を１個ずつ分離し培養した。各クローンをＨ２１２２ＡＲ１、２、３、４・・・・と名付けた。以降の種々の実験は親株とクローン株Ｈ２１２２ＡＲ１４とクローン株Ｈ２１２２ＡＲ３０を用いて行った。以後それぞれＨ２１２２、ＡＲ１４、ＡＲ３０と呼ぶ。

【0017】

［遺伝子の網羅的遺伝子は発現解析］
Ｈ２１２２、ＡＲ１４およびＡＲ３０をマイクロアレイによる網羅的な遺伝子解析を公知の方法で行った。より具体的には、各細胞よりｍＲＮＡを抽出し、蛍光ラベルを付与した。これをマイクロアレイ上に固定されたプローブと結合させ、蛍光強度を測定し各遺伝子の発現を測定した。各々の細胞について２回測定を行い、平均値を求めた。

【0018】

結果を図１に示す。図１（ａ）は、Ｈ２１２２に対するＡＲ１４の遺伝子発現を示し、図１（ｂ）は、Ｈ２１２２に対するＡＲ３０の遺伝子発現を示す。それぞれ横軸はＨ２１２２の遺伝子であり、横軸縦軸ともにＬｏｇ２変換した結果である。図中の点は個々の遺伝子を示す。この結果、遺伝子発現の変動が大きく、かつＫＲＡＳの下流シグナル（ＥＲＫ）に影響を及ぼし得る遺伝子として脱リン酸化酵素のひとつであるＰＴＰＲＲ遺伝子（両グラフとも矢印で示した）が認められた。ＰＴＰＲＲ遺伝子の発現はＡＲ１４およびＡＲ３０共にＨ２１２２よりも抑制されていた。

【0019】

［脱リン酸化酵素について］
次にＰＴＰＲＲを含めＫＲＡＳの下流シグナル（ＥＲＫ）に影響を及ぼし得る複数の脱リン酸化酵素の遺伝子発現を比較した。Ｈ２１２２細胞に対し、ＡＲ１４及びＡＲ３０細胞について有意差検定（ｔ検定）を行いｐ値が０．００５未満の遺伝子のみをそれぞれ表１および表２に示す。ＡＲ１４、ＡＲ３０細胞のいずれにおいてもＰＴＰＲＲ遺伝子の変動（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）が最も大きかった。

【0020】

【表1】

【0021】

【表2】

【0022】

次にＫＲＡＳ阻害剤耐性細胞であるＡＲ３０にＰＴＰＲＲ遺伝子を強制的に発現させた。ＰＴＰＲＲウイルスベクター（ｐＰＢ－ＣＡＧ－ＰＴＰＲＲ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒ）あるいはＧＦＰコントロールベクターをＡＲ３０細胞に導入し、ピューロマイシンを含む培地で培養した。ＡＲ３０ＰＴＰＲＲ株及びコントロールであるＡＲ３０ＧＦＰ株を樹立した。

【0023】

図２（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を表し、図２（ｂ）は、ソトラシブに対する感受性を示したものである。図２（ａ）を参照して、コントロールであるＡＲ３０ＧＦＰ株に比べＡＲ３０ＰＴＰＲＲ株でＰＴＰＲＲ蛋白の発現が亢進していることが確認された。

【0024】

図２（ｂ）ではソトラシブへの感受性試験の結果を示す。９６穴プレートに一定数のＡＲ３０ＧＦＰあるいはＡＲ３０ＰＴＰＲＲを散布し、種々の濃度のソトラシブを含む培地で３日間培養した。その後に細胞の生存率を評価した。図の横軸はソトラシブの濃度（μＭ）であり、縦軸は細胞生存率（％）である。ＰＴＰＲＲ遺伝子を導入したＡＲ３０ＰＴＰＲＲは、コントロールであるＡＲ３０ＧＦＰに比べてより強く濃度依存的に細胞生存率が低下した。以上よりＰＴＰＲＲ遺伝子の導入によりソトラシブへの感受性が高まったことが示された。

【0025】

［ＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域のメチル化の確認］
Ｈ２１２２，ＡＲ１４、ＡＲ３０からＤＮＡを抽出した。それぞれのＤＮＡに対して、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換）を行った。ＰＣＲ法でＤＮＡを増幅させた。その後にＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域の塩基配列解析（バイサルファイトシーケンス）を行った。

【0026】

図３にバイサルファイトシーケンスの結果を示す。ＤＮＡのメチル化はゲノムＤＮＡ上のＣＧ連続配列のシトシンに生じる。ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムでバイサルファイト化すると、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンでは化学変換が起こらない。そのため、バイサルファイト後のゲノムＤＮＡをシーケンスしたのち、元の配列と比較することで非メチル化あるいはメチル化シトシンを判別することができる。

【0027】

図３ではＨ２１２２、ＡＲ１４、ＡＲ３０について、４回のそれぞれ独立したクローン（ＣＬ１からＣＬ４）による反復試行を示している。横が各シーケンス内に認められるシトシン－グアニン（ＣＧ）である。左から右に５’末端から３’末端を示し、それぞれ１から９の番号を記した。

【0028】

それぞれの行列は各細胞株におけるＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域のＤＮＡシーケンスを示しており、丸印はメチル化されうるＣＧを表す。また、黒丸「●」はメチル化されているＣＧを、白丸「〇」はメチル化されていないＣＧを表している。

【0029】

すなわち、Ｈ２１２２細胞株のＣＬ１はＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域のシーケンスを示しており、当該シーケンスの中にはメチル化されうるＣＧが９箇所存在し、もっとも５’末端に近いＣＧはメチル化されておらず（白丸「〇」）、以降のＣＧ８箇所は全てメチル化されている（黒丸「●」）ことを示している。なお、バツ印「×」はシークエンス不良等により判別が困難であったことを示している。

【0030】

図３によると、Ｈ２１２２株では当該領域のシトシンは大部分が黒丸（「●」）であり、メチル化されているが、変異株であるＡＲ１４およびＡＲ３０では多くが白丸（「〇」）となっており、非メチル化状態になっていることがわかる。

【0031】

［ＰＴＰＲＲ蛋白の発現：ウエスタンブロッティングによる確認］
Ｈ２１２２とＡＲ１４およびＡＲ３０のＰＴＰＲＲ蛋白の発現について調べた。まず各腫瘍細胞を溶解し、蛋白を含む溶解液を準備した。蛋白を含む溶解液の電気泳動を行った後に、メンブレンに転写した。メンブレンに対しＰＴＰＲＲ蛋白等を認識する抗体を暴露した。その後、化学発光法によりメンブレン上の評価したい蛋白のバンドを検出した。

【0032】

図４にＨ２１２２とＡＲ１４およびＡＲ３０のＰＴＰＲＲ蛋白の発現に関するウエスタンブロッティングの結果を示す。図４の上段は、抗ＰＴＰＲＲ抗体を用いた結果であり、下段は抗ＡＣＴＩＮ抗体を用いた結果である。ＰＴＰＲＲ蛋白発現がＨ２１２２に比べＡＲ１４、ＡＲ３０で低下していることを示すウエスタンブロッティングの図である。すなわちＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域の非メチル化がＰＴＰＲＲ蛋白の発現低下をもたらすことが示された。

【0033】

次にクロマチン免疫沈降法でＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域の転写因子結合部位への転写調整因子ＴＣＦ７Ｌ２の結合の程度を評価した。全ＤＮＡに対してＴＣＦ７Ｌ２に結合しているＰＴＰＲＲのプロモーター領域のＤＮＡの割合を示す。

【0034】

図５には、ＰＴＰＲＲ遺伝子のプロモーター領域の転写因子結合部位ＴＢＥ１～５への転写調整因子ＴＣＦ７Ｌ２の結合程度を調べた結果を示す。Ｈ２１２２、ＡＲ１４およびＡＲ３０において、ＴＣＦ７Ｌ２がＴＢＥ１～５にどの程度結合したかを示すグラフである。横軸はＴＢＥの種別を表し、縦軸は全ＤＮＡに対する結合ＤＮＡの割合を表す。ＡＲ１４およびＡＲ３０は、Ｈ２１２２と比較してＰＴＰＲＲ遺伝子プロモーター領域の転写因子結合部位への転写因子ＴＣＦ７Ｌ２の結合が亢進していることが明らかになった。

【0035】

以上より、ソトラシブ耐性クローン細胞であるＡＲ１４およびＡＲ３０でＰＴＰＲＲ遺伝子の発現が低下した機序としては、非メチル化によって転写調整因子ＴＣＦ７Ｌ２のＰＴＰＲＲ遺伝子のプロモーター領域への結合が促進され、抑制的に働くためと考えられた。

【0036】

［ＥＧＦＲ蛋白とそのリン酸化の発現：ウエスタンブロッティングによる確認］
次にＨ２１２２とＡＲ３０のＥＧＦＲ蛋白とそのリン酸化について調べた。ＥＧＦＲ蛋白は細胞膜上に存在する膜型チロシンキナーゼの一つであり、その活性化はＥＧＦＲ蛋白のリン酸化をもたらし、さらにＫＲＡＳを含む下流シグナルの活性化をきたす。各腫瘍細胞より蛋白を抽出し電気泳動を行った後に、メンブレンに転写した。Ｈ２１２２とＡＲ３０のＥＧＦＲ蛋白及び複数の同リン酸化を認識する抗体を暴露した。化学発光法により評価したい蛋白のバンドを検出した。

【0037】

図６にＨ２１２２とＡＲ３０のＥＧＦＲ蛋白とそのリン酸化の発現に関するウエスタンブロッティングの結果を示す。ｐＥＧＦＲ（Ｙ８４５）、ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）、ｐＥＧＦＲ（Ｙ１１７３）はそれぞれＥＧＦＲ蛋白の８４５番目、１０６８番目、１１７３番目のチロシンのリン酸化を示す。なお、各バンドの下の数値はＨ２１２２のバンドの濃さを１００とした場合のＡＲ３０のバンドの濃さを表す。ｔ（ｔｏｔａｌ）ＥＧＦＲはＥＧＦＲ蛋白の総発現を示し、その発現量はＨ２１２２とＡＲ３０間で違いがみられなかった。一方でＡＲ３０ではＥＧＦＲ蛋白のリン酸化が亢進していた。

【0038】

次にＰＴＰＲＲ蛋白とＥＧＦＲ蛋白の関係を明らかにするために共免疫沈降試験をおこなった。Ｈ２１２２細胞に１０％の牛胎児血清を暴露することでＥＧＦＲ蛋白を活性化した。そして血清暴露前、暴露後５分、３０分で細胞回収し、それぞれ蛋白の抽出を行った。抽出液にコントロールであるＩｇＧあるいは抗ＰＴＰＲＲ抗体を加え反応させた後に、抗体と蛋白の複合体を分離し、電気泳動、メンブレンへの転写を行った。

【0039】

同メンブレンに抗ＥＧＦＲ抗体を暴露し、ＥＧＦＲ蛋白の検出を行った。結果を図７に示す。血清暴露５分後にＥＧＦＲ蛋白とＰＴＰＲＲ蛋白の複合体が検出され、３０分後には複合体は消退した。一方で細胞の全抽出液を用いたＥＧＦＲ蛋白のリン酸化（Ｙ８４５、Ｙ１０６８）のウエスタンブロッティング法による評価では血清暴露５分後にリン酸化は亢進し、３０分後には減弱した。以上の結果が示すことは、血清により活性化されたＥＧＦＲ蛋白に脱リン酸化酵素であるＰＴＰＲＲ蛋白が結合し、ＥＧＦＲ蛋白の脱リン酸化をもたらした。

【0040】

一方、耐性株でみられるようにＰＴＰＲＲ遺伝子の発現低下が起こると活性化されたＥＧＦＲ蛋白の脱リン酸化が抑制されず、ＥＧＦＲ蛋白のリン酸化が恒常的になると考えられた。

【0041】

＜ＫＲＡＳ阻害剤の耐性克服＞
次にＫＲＡＳ阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の併用効果について評価をおこなった。ＫＲＡＳ阻害剤としてソトラシブ、ＥＧＦＲ阻害剤としてセツキシマブを使用した。ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ）にＨ２１２２－ＡＲ３０細胞を移植した。腫瘍がマウスに生着した後に薬剤の投与を開始した。コントロール群、ソトラシブ群（１００ｍｇ／ｋｇ、連日投与）、セツキシマブ群（４０ｍｇ／ｋｇ、隔週投与）、ソトラシブ＋セツキシマブ併用群（投与スケジュールは同上）の４群を用意した。各群８匹ずつで構成した。４週間薬剤を投与し、週に２回腫瘍の体積を測定した。

【0042】

結果を図８に示す。横軸は実験開始からの経過日数（Ｄａｙｓ）であり、縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ^３）である。黒丸（－●－）はコントロール群であり、黒四角（－■－）はソトラシブ（ＫＲＡＳ阻害剤）を１００ｍｇ／ｋｇの量を連日投与したソトラシブ群である。黒三角（－▲－）は、セツキシマブ（ＥＧＦＲ阻害剤）を４０ｍｇ／ｋｇの量を隔週投与したセツキシマブ群である。また、黒逆三角（－▼－）は、ソトラシブとセツキシマブをそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ連日および４０ｍｇ／ｋｇ隔週で投与したソトラシブ＋セツキシマブ併用群である。

【0043】

図８を参照して、ソトラシブ群およびセツキシマブ群は、コントロール群と同様に、日数が経過するに従い、腫瘍体積は増大した。すなわちＨ２１２２－ＡＲ３０細胞は、ＫＲＡＳ阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性であることが示される。一方、ソトラシブ＋セツキシマブ併用群は、薬剤投与開始直後から腫瘍の増大は認めず、抗腫瘍効果が示された。

【0044】

以上のように、ＫＲＡＳ阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤を併用することで、ＫＲＡＳ阻害剤に耐性を有する癌細胞の増殖を抑制することができる。

【0045】

［ＰＴＰＲＲ遺伝子抑制細胞］
上記の結果より、ＫＲＡＳ阻害剤への耐性はＰＴＰＲＲ遺伝子の発現抑制が原因であった。図９には公的データベース（Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅｓ， ＩＣＧＣ／ＴＣＧＡ， Ｎａｔｕｒｅ ２０２０）の種々の腫瘍組織１２１０検体についてＰＴＰＲＲ ｍＲＮＡ発現を解析したものを示す。縦軸は全サンプルに対しＺスコア化されたＰＴＰＲＲ ｍＲＮＡの発現を示し、横軸は癌種を示す。

【0046】

各癌腫に対するＰＴＰＲＲ遺伝子の発現は、多様である。同一癌腫においても、個々の腫瘍により多様性を持っている。さらに、このデータはＫＲＡＳ阻害剤を投与されていない症例も含まれている。すなわち、ＫＲＡＳ阻害剤耐性を有する癌細胞は、ＫＲＡＳ阻害剤を投与されていなくても、存在する蓋然性が高い。

【0047】

そこで、人為的にＰＴＰＲＲ遺伝子を抑制した細胞を発生させ、ＫＲＡＳ阻害剤に対する効果及びＥＧＦＲ蛋白のリン酸化への影響を調べた。

【0048】

Ｈ２１２２細胞に対しＰＴＰＲＲ遺伝子に相補的に結合するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰ＋２３１５－１）あるいはコントロールとなる非特異的なｓｉＲＮＡ（ＳＣ－１）を反応させた。ｓｉＰ＋２３１５－１はＰＴＰＲＲ遺伝子の発現を選択的に抑制した。そしてそれぞれの細胞に対し種々の濃度のソトラシブを一定期間暴露した後に細胞の生存率を求めた。結果を図１０に示す。

【0049】

図１０を参照して、横軸はソトラシブの濃度を示し、縦軸は細胞の生存率を示す。まずコントロール（ＳＣ－１）ではソトラシブの濃度依存的に生存率が低下した。一方ＰＴＰＲＲの発現を抑制したｓｉＰ＋２３１５－１では、コントロールに比べソトラシブの効果が減弱された。

【0050】

またｓｉＰ＋２３１５－１は、コントロールに比べＥＧＦＲ蛋白のリン酸化亢進をもたらした。図１１はコントロールおよびｓｉＰ＋２３１５－１はＰＴＰＲＲ遺伝子の発現を選択的に抑制した細胞から得たＤＮＡのウエスタンブロッティングの結果である。１段目はＥＧＦＲ蛋白の１１７３番目のチロシンのリン酸化を示す。２段目はトータルのＥＧＦＲを示し、３段目はＰＴＰＲＲ蛋白、４段目はＡＣＴＩＮ蛋白を示す。ＥＧＦＲ蛋白のリン酸化はコントロール（ＳＣ－１）よりＰＴＰＲＲ遺伝子の発現を選択的に抑制した細胞（ｓｉＰ＋２３１５－１）の方のバンドが濃かった。このことからＫＲＡＳ阻害剤が未投与でもＰＴＰＲＲ発現の乏しい腫瘍ではＫＲＡＳ阻害剤＋ＥＧＦＲ阻害剤の併用治療が有効である可能性がある。

【産業上の利用可能性】

【0051】

本発明に係る癌治療用組成物は、ＫＲＡＳ阻害剤により耐性を獲得した癌細胞であっても、その耐性を克服し、細胞増殖を抑制することができ、ＫＲＡＳの変異がもたらす疾患に対して有効である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】