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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024101848
(43)【公開日】2024-07-30
(54)【発明の名称】前立腺がんの判定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240723BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023006009
(22)【出願日】2023-01-18
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000236436
【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140442
【弁理士】
【氏名又は名称】柴山 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100176773
【弁理士】
【氏名又は名称】坂西 俊明
(72)【発明者】
【氏名】松本 浩幸
(72)【発明者】
【氏名】新家 智美
(72)【発明者】
【氏名】岡田 裕之
(57)【要約】
【課題】本発明は、感度を維持しつつ特異度が向上した前立腺がんの判定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定することを含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定することを含む、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む、方法。
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む、方法。
【請求項2】
前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む、スクリーニング方法。
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む、スクリーニング方法。
【請求項3】
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む、方法。
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む、方法。
【請求項4】
前記尿中のＡＡＴ量が、内部標準物質で規格化された量である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記内部標準物質が、クレアチニン（Ｃｒｅ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記尿中のＡＡＴ量が、尿中のＡＡＴ量を尿中のＣｒｅ量で除すことで規格化された量である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の閾値が、０．０１μｇ／ｍｇ以上２μｇ／ｍｇ未満の範囲内にある、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の閾値が、１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にある、請求項３～７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するための前立腺がんの判定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺がんの罹患率と死亡率は年々増加している。従来、前立腺がんの検査としては、血清中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を定量する検査であるＰＳＡ検査が主に行われている。ＰＳＡ検査は、血清中のＰＳＡ量が所定の閾値以上（通常は４ｎｇ／ｍＬ以上）である被験者を前立腺がんである、又は前立腺がんの疑いがあると判定する方法である（例えば、非特許文献１）。
【0003】
また、被験者の尿を使用したがんの検査方法も知られている。例えば、特許文献１には、被験者から採取された尿を所定の前処理をして処理尿を得る前処理工程と、処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１－アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備える癌の検査方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１５－１６９６０８号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Haese A. et al., “Clinical Evaluation of the Elecsys Total Prostate-specificAntigen Assay on the Elecsys 1010 and 2010 Systems”, Clinical Chemistry 48(6),944-947 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
非特許文献１に記載されるようにＰＳＡ検査は、前立腺がんに対する感度は高い一方で特異度が低い。また、本発明者らの検討によれば、尿中のα１－アンチトリプシン（以下、「ＡＡＴ」ともいう。）量に基づいて前立腺がんを判定する方法も、感度は高い一方で特異度が低いことが明らかになった（後述の実施例のＮｏ．８参照）。これらの検査のいずれも、特異度が低いことから、偽陽性が多いという問題がある。
【0007】
本発明は、感度を維持しつつ特異度が向上した前立腺がんの判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、血清中のＰＳＡ量に基づく判定と、尿中のＡＡＴ量に基づく判定とを組み合わせることで、意外にも、感度及び特異度が共に高い前立腺がん判定方法になることを見い出した。なお、一般的に感度が高くかつ特異度が低い検査を組み合わせても特異度が向上するとは言えない。本発明は、この新規な知見に基づくものである。
【0009】
本発明は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法（以下、「判定方法」ともいう。）であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定することを含む、方法に関する。
【0010】
本発明の判定方法は、血清中のＰＳＡ量に基づく判定と、尿中のＡＡＴ量に基づく判定とを組み合わせているため、感度及び特異度が共に高い。
【0011】
上記判定方法において、尿中のＡＡＴ量は、内部標準物質で規格化された量であることが好ましい。尿中のＡＡＴ量として、内部標準物質で規格化された量を使用することで、より正確な判定を行うことができる。また、内部標準物質が、尿中のクレアチニン（Ｃｒｅ）であることが好ましい。
【0012】
上記判定方法において、尿中のＡＡＴ量として、尿中のクレアチニン（Ｃｒｅ）で規格化された量を使用する場合、第２の閾値は、０．０１μｇ／ｍｇ以上２μｇ／ｍｇ未満の範囲内にあってよい。
【0013】
上記判定方法において、第１の閾値は、１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあってよい。
【0014】
本発明はまた、前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択することを含む、スクリーニング方法と捉えることもできる。
【0015】
本発明は更に、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む、方法と捉えることもできる。
【0016】
本発明は、例えば、以下の各発明を包含する。
［１］
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む、方法。
［２］
前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む、スクリーニング方法。
［３］
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む、方法。
［４］
上記尿中のＡＡＴ量が、内部標準物質で規格化された量である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記内部標準物質が、尿中のクレアチニン（Ｃｒｅ）である、［４］に記載の方法。
［６］
上記尿中のＡＡＴ量が、尿中のＡＡＴ量を尿中のＣｒｅ量で除すことで規格化された量である、［５］に記載の方法。
［７］
上記第２の閾値が、０．０１μｇ／ｍｇ以上２μｇ／ｍｇ未満の範囲内にある、［６］に記載の方法。
［８］
上記第１の閾値が、１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にある、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１］
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む、方法。
［２］
前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む、スクリーニング方法。
［３］
被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、
血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、
尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む、方法。
［４］
上記尿中のＡＡＴ量が、内部標準物質で規格化された量である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記内部標準物質が、尿中のクレアチニン（Ｃｒｅ）である、［４］に記載の方法。
［６］
上記尿中のＡＡＴ量が、尿中のＡＡＴ量を尿中のＣｒｅ量で除すことで規格化された量である、［５］に記載の方法。
［７］
上記第２の閾値が、０．０１μｇ／ｍｇ以上２μｇ／ｍｇ未満の範囲内にある、［６］に記載の方法。
［８］
上記第１の閾値が、１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にある、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、感度を維持しつつ特異度が向上した前立腺がんの判定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0020】
〔判定方法〕
本実施形態に係る判定方法は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む。
本実施形態に係る判定方法は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定する方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定すること、を含む。
【0021】
被験者は、例えば、ヒト、サル、マウス及びラットであってよいが、ヒトであることが好ましい。
【0022】
血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較することは、血清中のＰＳＡ量が、第１の閾値以上又は第１の閾値未満であると判定することであってもよい。
【0023】
第１の閾値は、例えば、被験者から得た血清を用いた統計的な処理によって設定してもよく、ＲＯＣ曲線に基づいて設定してもよい。
【0024】
統計的な処理による設定は、例えば、予め前立腺がんに罹患しているか否かを診断された被験者から得た血清をサンプルとし、被験者の血清中のＰＳＡ量のデータを得る。複数の被験者（例えば、５０人）から得た「前立腺がんの罹患の有無」のデータ、及び「血清中のＰＳＡ量」のデータを統計的に処理することにより、これらデータ間の相関を解析する。解析された結果から、感度を維持しつつ特異度が高くなるように閾値を設定すればよく、その中で例えば、陽性率の高さ（感度の高さ）を重視するか、偽陽性率の低さ（特異度の高さ）を重視するか、又は陽性率と偽陽性率をどの程度でバランスさせるか等の目的に応じて、閾値を設定することができる。
【0025】
ＲＯＣ曲線に基づく閾値の設定方法としては、例えば、左上隅からの距離が最小となる点を閾値としてもよく、ＲＯＣ曲線下面積が０．５００となる斜点線から最も離れた点（Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ）を閾値としてもよく、任意の感度又は特異度になるような閾値を設定してもよい。
【0026】
第１の閾値は特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあってよく、１．５ｎｇ／ｍＬ以上４．５ｎｇ／ｍＬ以下、２ｎｇ／ｍＬ以上４ｎｇ／ｍＬ以下、３ｎｇ／ｍＬ以上４ｎｇ／ｍＬ以下の範囲内にあってもよい。
【0027】
一実施形態に係る判定方法は、血清中のＰＳＡ量を定量することを更に含んでいてもよい。血清中ＰＳＡ量は、当業者がタンパク質の定量又は同定に通常用いる方法によって、血清から定量できる。血清は、被験者から採取した血液を遠心分離する、血液分離フィルターを使用する方法等の常法に従って得ることができる。
【0028】
血清中ＰＳＡ量の定量方法としては、血清中ＰＳＡ量を定量できれば特に限定されないが、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、フローストリップ法及びラテックス凝集免疫法等の抗原抗体反応検出法、並びにアミノ酸配列決定法及び質量分析法等が挙げられる。
【0029】
尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較することは、尿中のＡＡＴ量が、第２の閾値以上又は第２の閾値未満であると判定することであってもよい。
【0030】
尿中のＡＡＴは、尿中で検出できるものであればよく、完全長のＡＡＴのみであっても、完全長のＡＡＴ及び部分的に加水分解されたＡＡＴであってもよい。
【0031】
尿中のＡＡＴ量は、内部標準物質で規格化された量であってもよい。これにより、尿中のＡＡＴ量をより正確に定量することができ、ひいてはより正確な判定を行うことができる。内部標準物質は、尿中に一定濃度で存在する物質であることが好ましい。内部標準物質でＡＡＴ量を規格化することで、例えば、尿量の多寡等の影響を除した値を得ることができる。規格化は、例えば、尿中のＡＡＴ量を尿中の内部標準物質量で除すことであってもよい。
【0032】
内部標準物質としては例えば、総タンパク質、アルブミン、クレアチニン（Ｃｒｅ）等が挙げられ、Ｃｒｅであることが好ましい。
【0033】
第２の閾値の設定は、上述の第１の閾値の設定と同様にして設定することができる。
【0034】
第２の閾値は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｇ／ｍｇ以上、０．０３μｇ／ｍｇ以上、０．０５μｇ／ｍｇ以上、０．１μｇ／ｍｇ以上、０．２μｇ／ｍｇ以上、０．３μｇ／ｍｇ以上、０．４μｇ／ｍｇ以上、０．５μｇ／ｍｇ以上、０．６μｇ／ｍｇ以上、０．７μｇ／ｍｇ以上、０．８μｇ／ｍｇ以上、０．９μｇ／ｍｇ以上、１μｇ／ｍｇ以上の範囲内であってもよい。また、第２の閾値は、例えば、９μｇ／ｍｇ以下、８μｇ／ｍｇ以下、７μｇ／ｍｇ以下、６μｇ／ｍｇ以下、５μｇ／ｍｇ以下、４μｇ／ｍｇ以下、３μｇ／ｍｇ以下、２μｇ／ｍｇ以下、１．３μｇ／ｍｇ以下の範囲内であってもよい。
【0035】
第２の閾値は、尿中のＡＡＴ量が尿中のＡＡＴ量を尿中のＣｒｅで除することにより規格化されたものである場合、より感度を維持しつつ特異度が向上するという観点から、０．０１μｇ／ｍｇ以上２μｇ／ｍｇ未満の範囲内であってよく、０．０３μｇ／ｍｇ以上１．８μｇ／ｍｇ以下、０．１μｇ／ｍｇ以上１．５μｇ／ｍｇ以下、０．５μｇ／ｍｇ以上１．３μｇ／ｍｇ以下、０．８μｇ／ｍｇ以上１．３μｇ／ｍｇ以下の範囲内であってもよい。
【0036】
一実施形態に係る判定方法は、尿中のＡＡＴ量を定量することを更に含んでいてもよい。尿中のＡＡＴ量の定量は、当業者がタンパク質の定量又は同定に通常用いる方法によって、尿中から定量できる。
【0037】
尿中ＡＡＴ量の定量方法としては、尿中ＡＡＴ量を定量できれば特に限定されないが、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローストリップ法及びラテックス凝集免疫法等の抗原抗体反応検出法、並びにアミノ酸配列決定法及び質量分析法等が挙げられ、好ましくは抗原抗体反応検出法であり、より好ましくはＥＬＩＳＡ法である。
【0038】
ＥＬＩＳＡ法により尿中のＡＡＴ量を定量する場合、ＥＬＩＳＡ法は、ＡＡＴが抗α１－アンチトリプシン抗体又はその機能的断片に結合する性質を利用して、尿中のＡＡＴ量を定量するものであればよく、例えば、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法のいずれであってもよい。ＥＬＩＳＡ法は本技術分野においてよく知られた技術であり、当業者であれば、抗体及び標識等の試薬の選定、ブロッキング、抗原抗体反応及び各種洗浄等の諸条件（例えば、試薬の種類、温度、時間、回数等）、並びに標識の検出条件等の各種条件を適宜設定することができる。
【0039】
尿中のＡＡＴ量を定量する際には、得られた尿をそのまま定量に用いてもよく、得られた前処理を施した尿を定量に用いてもよい。前処理としては、定量方法等によって適宜選択すればよいが、例えば尿中のＡＡＴ以外の夾雑物を除去する処理（以下、「除去処理」ともいう。）、尿中のＡＡＴを変性させる処理（以下、「変性処理」ともいう。）等が挙げられる。前処理を行うことで、より正確に尿中のＡＡＴ量を定量することができる。
【0040】
除去処理としては、例えば、ゲルろ過による方法、電気泳動とゲルからの切り出しとを組み合わせた方法、サイズ排除クロマトグラフィーによる方法、限外ろ過による方法、逆浸透による方法、遠心分離による方法、沈殿による方法、透析による方法等が挙げられる。除去処理は、１種を単独で行ってもよく、また２種以上を組み合わせて行ってもよい。
【0041】
本明細書において、「変性処理」とは、タンパク質の高次構造を破壊することでタンパク質を変性させる処理を意味する。変性処理としては例えば、熱変性処理、低温変性処理、酸変性処理、アルカリ変性処理、圧力変性処理、超音波処理、変性剤による変性処理、有機溶媒処理等が挙げられる。変性処理は、１種を単独で行ってもよく、また２種以上を組み合わせて行ってもよい。
【0042】
変性剤としては、例えば、尿素及びグアニジン塩酸塩（又は塩酸グアニジン）等の水素結合を破壊する変性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、コール酸ナトリウム等の疎水結合を破壊する変性剤、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等のジスルフィド結合を還元する変性剤を挙げることができる。変性剤は、１種を単独で用いてもよく、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0043】
血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較することと、尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較することは、任意の順で実施することができる。また、例えば、血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較した結果、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上である場合のみ、尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較することを実施してもよい。また、尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較した結果、尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である場合のみ、血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較することを実施してもよい。さらに、例えば、ある第１の時点にて血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上である一方で、尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以下である被験者のみ、第１の時点から一定期間経過後の第２の時点において尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較してもよい。逆に、ある第１の時点にて血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以下である一方で、尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者のみ、第１の時点から一定期間経過後の第２の時点において血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較してもよい。
【0044】
血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定することは、血清中のＰＳＡ量を第１の閾値と比較すること、及び尿中のＡＡＴ量を第２の閾値と比較することに基づいているため、被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると機械的に判定できる。
【0045】
〔スクリーニング方法〕
本実施形態に係るスクリーニング方法は、前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む。
本実施形態に係るスクリーニング方法は、前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者を選択するスクリーニング方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択すること、を含む。
【0046】
本実施形態に係るスクリーニング方法における血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、及び尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較することは、上述したとおりである。血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがある被験者として選択することは、上述の血清中のＰＳＡ量が第１の閾値以上であり、かつ尿中のＡＡＴ量が第２の閾値以上である被験者を前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定することと同様である。
【0047】
本実施形態に係るスクリーニング方法は、上述の判定方法で説明した各実施形態を適用できる。
【0048】
〔データ収集方法〕
本実施形態に係るデータ収集方法は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む。
本実施形態に係るデータ収集方法は、被験者が前立腺がんに罹患している、又は罹患している疑いがあると判定するためのデータ収集方法であって、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較すること、を含む。
【0049】
本実施形態に係るデータ収集方法における血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較すること、及び尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較することは、上述したとおりである。また、血清中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）量を第１の閾値と比較することにより比較データ１を得ることができる。同様に、尿中のα１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）量を第２の閾値と比較することにより比較データ２を得ることができる。本実施形態に係るデータ収集方法は、この比較データ１及び比較データ２を収集する方法と捉えることもできる。
【0050】
本実施形態に係るデータ収集方法は、上述の判定方法で説明した各実施形態を適用できる。また、本実施形態に係るデータ収集方法は、血清中のＰＳＡ量を定量することにより得られる血清中ＰＳＡ量データを収集すること、尿中のＡＡＴ量を定量することにより得られる尿中ＡＡＴ量データを収集すること、尿中ＡＡＴ量を内部標準物質で規格化した規格化尿中ＡＡＴ量（例えば、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値）データを収集することを含むものであってよい。
【実施例0051】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0052】
（１．血清中ＰＳＡ量及び尿中ＡＡＴ量の定量）
がん検診を受診する男性７１８名に対して、受診当日、各種検査前の状態で採尿及び採血を行った。採取した尿を使用し、尿中のα１－アンチトリプシン量及びクレアチニン量を定量した。次いで、尿中のα１－アンチトリプシン量（単位：μｇ／ｍＬ）を尿中のクレアチニン量（単位：ｍｇ／ｍＬ）で除した値（以下、「尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値（単位：μｇ／ｍｇ）」ともいう。）を以下のとおりに求めた。採取した血液を使用し、血清中ＰＳＡ量（単位：ｎｇ／ｍＬ）を以下のとおりに定量した。
がん検診を受診する男性７１８名に対して、受診当日、各種検査前の状態で採尿及び採血を行った。採取した尿を使用し、尿中のα１－アンチトリプシン量及びクレアチニン量を定量した。次いで、尿中のα１－アンチトリプシン量（単位：μｇ／ｍＬ）を尿中のクレアチニン量（単位：ｍｇ／ｍＬ）で除した値（以下、「尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値（単位：μｇ／ｍｇ）」ともいう。）を以下のとおりに求めた。採取した血液を使用し、血清中ＰＳＡ量（単位：ｎｇ／ｍＬ）を以下のとおりに定量した。
【0053】
＜尿中ＡＡＴ量の定量＞
被験者より採取した尿に対して、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）した。得られた上清のうち５０μｌを分取し、等量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を混和後、限外ろ過により分子量１０ｋＤａ以下の溶質が分画される画分を除去した。限外ろ過は、限外ろ過装置（ミリポア社製、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０）のメンブレン上に添加して遠心分離（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）し、遠心分離後、メンブレン上に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１００μｌを添加して更に遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）する工程を計４回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を５０μｌ添加して遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、得られた溶液を測定試料とし、ＥＬＩＳＡ法による尿中ＡＡＴ量の定量に供した。
被験者より採取した尿に対して、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）した。得られた上清のうち５０μｌを分取し、等量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を混和後、限外ろ過により分子量１０ｋＤａ以下の溶質が分画される画分を除去した。限外ろ過は、限外ろ過装置（ミリポア社製、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０）のメンブレン上に添加して遠心分離（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）し、遠心分離後、メンブレン上に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１００μｌを添加して更に遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）する工程を計４回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を５０μｌ添加して遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、得られた溶液を測定試料とし、ＥＬＩＳＡ法による尿中ＡＡＴ量の定量に供した。
【0054】
尿中ＡＡＴ量の定量系は、以下の手順で構築した。抗α１－アンチトリプシンポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１２５ｎｇ／１００μｌとなるよう０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、Ｎｕｎｃ社製イムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）の各ウェルへ１００μｌずつ添加し、４℃にて一昼夜反応（固相化反応）させた。固相化反応後、ダルベッコりん酸緩衝液（以下、「Ｄ－ＰＢＳ（－）」）で各ウェルを３回洗浄し、超純水で５倍希釈したポリマー系ブロッキング溶液（Ｎ１０１，日油社製）を各ウェルへ２００μｌずつ添加し、４℃にて一昼夜反応（ブロッキング反応）させた。ブロッキング反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ－ＰＢＳ（－）で各ウェルを５回洗浄し、抗α１－アンチトリプシン抗体固相化プレートを得た。
【0055】
上記測定試料に０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ－ＰＢＳ（－）を添加して様々な濃度の希釈系列を調製し、上記抗α１－アンチトリプシン抗体固相化プレートを用いてＥＬＩＳＡ法による検出系で測定を行った。同一濃度につき２つのウェルを使用して各ウェルへ１００μｌずつ添加し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ添加）、４℃にて一昼夜反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ－ＰＢＳ（－）で各ウェルを５回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ－ＰＢＳ（－）で１０ｎｇ／１００μｌに調製したＨＲＰ標識抗α１－アンチトリプシンポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ－ＰＢＳ（－）で各ウェルを５回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ硫酸を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、室温にて１５分間反応させた。反応後、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0056】
＜尿中クレアチニン量の定量＞
被験者より採取した尿に対して、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）した。得られた上清を用い、生化学自動分析装置ＪＣＡ－ＢＭ６０５０ ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ（日本電子社製）によってクレアチニンキット シカリキッド―Ｓ ＣＲＥ（関東化学社製）を使用してクレアチニン量を定量した。
被験者より採取した尿に対して、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）した。得られた上清を用い、生化学自動分析装置ＪＣＡ－ＢＭ６０５０ ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ（日本電子社製）によってクレアチニンキット シカリキッド―Ｓ ＣＲＥ（関東化学社製）を使用してクレアチニン量を定量した。
【0057】
得られた定量値と、同一のプレート上の別のウェルで同時に測定して得られたヒトＡＡＴの標品タンパク質の検量線とから、尿中ＡＡＴ量の定量値を求め、同じ試料中のクレアチニン量の定量値で除することで、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値（単位：μｇ／ｍｇ）を算出した。
【0058】
＜血清中ＰＳＡ量の定量＞
被験者より抗凝固剤の入っていない採血管で採取した血液に対して、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間）して血清を得た。得られた血清を用い、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＵｎｉＣｅｌ Ｄｘｌ８００（ベックマン・コールター社製）によって、前立腺特異抗原キット アクセス ハイブリテックＰＳＡ（ベックマン・コールター社製）を使用してＰＳＡ量を定量した。
被験者より抗凝固剤の入っていない採血管で採取した血液に対して、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間）して血清を得た。得られた血清を用い、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＵｎｉＣｅｌ Ｄｘｌ８００（ベックマン・コールター社製）によって、前立腺特異抗原キット アクセス ハイブリテックＰＳＡ（ベックマン・コールター社製）を使用してＰＳＡ量を定量した。
【0059】
（２．前立腺がんについての血清中ＰＳＡ量と尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値との関連性の評価）
検診受診から２年以内に、前立腺がんの罹患が確定した被験者は８名であった。さらに、前立腺炎又は前立腺肥大症と診断された被験者は３名であった。前立腺がんの罹患が確定した８名、及び前立腺炎又は前立腺肥大症３名を除く計７０７名を健常者とし、この７１８名について、それぞれの血清中ＰＳＡ量と尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値との関連性を評価した。図１は、血清中ＰＳＡ量及び尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値をプロットした散布図である。
検診受診から２年以内に、前立腺がんの罹患が確定した被験者は８名であった。さらに、前立腺炎又は前立腺肥大症と診断された被験者は３名であった。前立腺がんの罹患が確定した８名、及び前立腺炎又は前立腺肥大症３名を除く計７０７名を健常者とし、この７１８名について、それぞれの血清中ＰＳＡ量と尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値との関連性を評価した。図１は、血清中ＰＳＡ量及び尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値をプロットした散布図である。
【0060】
血清中ＰＳＡ量の閾値を４．０ｎｇ／ｍＬとし、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を変化させた場合の感度及び特異度を算出した。感度及び特異度は、血清中ＰＳＡ量の閾値のみを設定した場合（Ｎｏ．１）、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値のみを設定した場合（Ｎｏ．２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２及び２４）、血清中ＰＳＡ量及び尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を両方設定した場合（Ｎｏ．３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３及び２５）に分けて算出した。結果を表１及び表２に示す。図２は、図１の散布図において、設定した血清中ＰＳＡ量の閾値及び尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を示す補助線を追加し、スケールを拡大した図である。図２中、血清中ＰＳＡ量の閾値は横線で示し、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値は１～１１の縦線で示す。なお、１～１１の縦線（尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値）はそれぞれ、Ｎｏ．２～３，４～５，６～７，８～９，１０～１１，１２～１３，１４～１５，１６～１７，１８～１９，２０～２１，２２～２３におけるＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値に対応している。
【0061】
また、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線に基づく解析を実施したところ、（感度＋特異度－１）が最大値となる閾値（Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ）は、１．３μｇ／ｍｇであった。
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【0064】
血清中ＰＳＡ量の閾値を、ＰＳＡ検査値のカットオフ値である４．０ｎｇ／ｍＬに設定した場合（Ｎｏ．１）、感度１（１００％）、特異度０．９３５（９３．５％）であり、いわゆる偽陽性となった受診者は計４６名であった。
【0065】
尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を最適カットオフ値である１．３μｇ／ｍｇに設定した場合（Ｎｏ．８）、感度１（１００％）、特異度０．７８２（７８．２％）であり、いわゆる偽陽性となった受診者は計１５５名であった。
【0066】
また、表１及び表２に示すとおり、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値と血清中ＰＳＡ量の閾値とを組み合わせて被験者を分離した場合（Ｎｏ．３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３及び２５）、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値が増加するほど特異度が上昇することが判明した。このことは、血清中ＰＳＡ量の閾値をＰＳＡ検査値のカットオフ値である４．０ｎｇ／ｍＬに設定した場合、当該閾値以上である被験者における偽陽性者を、さらに尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値との比較を組み合わせることで減少できていることを意味している。特に、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を１．３μｇ／ｍｇに設定した場合、血清中ＰＳＡ量の閾値（４．０ｎｇ／ｍＬ）の設定と組み合わせて被験者を分離すると、感度が１（１００％）のまま、特異度が約０．９９３（９９．３％）となり、いわゆる偽陽性となった被験者は計５名となった。
【0067】
一方、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を２．０μｇ／ｍｇに設定した場合、特異度は変化しないものの、感度が０．８７５（８７．５％）となった。血清中ＰＳＡ量の閾値をＰＳＡ検査値のカットオフ値である４．０ｎｇ／ｍＬに設定した場合、当該閾値以上である被験者において、前立腺がんの罹患が確定した８名全員は陽性と判定できず、いわゆる偽陰性となる被験者が発生していることを意味している。さらに、表１及び表２の結果から、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を大きく設定するにしたがって、特異度は上昇し、反対に感度が低下することが明らかになった。
【0068】
図２からも分かる通り、前立腺炎又は前立腺肥大症と診断された被験者についても、血清中ＰＳＡ量が高くなる傾向がある。したがって、従来の被験者の血清中ＰＳＡ量を閾値と比較する方法においては、被験者が前立腺炎又は前立腺肥大症であるのか、前立腺がんであるのか判断が難しかった。対して本発明は、図２にも示されている通り、第１及び第２の閾値を適切に設定することにより（本実施例の場合には、例えば、血清中ＰＳＡ量の閾値を４ｎｇ／ｍＬに設定し、ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値を０．８μｇ／ｍｇとすることにより）、前立腺がんの被験者と前立腺炎又は前立腺肥大症の被験者を区別することが可能となり、前立腺がん判定の特異度が上昇することが明らかになった。
【0069】
以上の結果から、血清中ＰＳＡ量が任意の閾値以上の被験者に対して、尿中ＡＡＴ／Ｃｒｅ値を組み合わせて分離することで、血清中ＰＳＡ量の定量及び閾値との比較に基づく検査単独で問題となる偽陽性者を減少させることが可能となった。ＡＡＴ／Ｃｒｅ値の閾値については、血清中ＰＳＡ量の定量値から得られた陽性率の高さ（感度の高さ）を重視するか、偽陽性率の低さ（特異度の高さ）を重視するか、又は陽性率と偽陽性率をどの程度でバランスさせるか等の目的に応じて閾値を設定することも可能であることが判明した。
【図1】
【図2】
