特開 2024-102065 最適化されたプロモーター配列、イントロンを含まない発現構築物及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024102065

(43)【公開日】2024-07-30

(54)【発明の名称】最適化されたプロモーター配列、イントロンを含まない発現構築物及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240723BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240723BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240723BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240723BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 7/10 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 38/36 20060101ALN20240723BHJP

   A61K 38/37 20060101ALN20240723BHJP

   A61K 38/47 20060101ALN20240723BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

A61P7/04

A61K35/76

A61K48/00

A61P25/28

A61P25/00

A61P37/06

A61P37/08

A61P29/00

A61P7/10

A61K47/24

A61K47/12

A61K9/08

A61K9/10

A61K38/36

A61K38/37

A61K38/47

【審査請求】有

【請求項の数】104

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024060919

(22)【出願日】2024-04-04

(62)【分割の表示】P 2021510015の分割

【原出願日】2019-08-23

(31)【優先権主張番号】62/722,547

(32)【優先日】2018-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/725,096

(32)【優先日】2018-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/784,116

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518138077

【氏名又は名称】スパーク セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＡＲＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】アングエラ， シャビエル

(72)【発明者】

【氏名】エルコビー， リーロン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】導入遺伝子発現、導入遺伝子発現を駆動するエンハンサー及びプロモーター機能の改善により、遺伝子療法の治療用途が高められた発現カセットを提供する。
【解決手段】Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメント及び末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む発現カセットであって、特定の配列と少なくとも９８％同一の配列を含み、前記ＩＴＲは前記調節エレメントの５’側に隣接し、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在しない、発現カセットである。
【選択図】図２０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列を含む発現カセットであって、配列番号１の配列と少なくとも９８％同一の配列を含む、発現カセット。

【請求項2】

配列番号１の配列と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。

【請求項3】

配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。

【請求項4】

配列番号１の配列からなる、請求項１に記載の発現カセット。

【請求項5】

Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメントを含む発現カセットであって、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在せず、前記発現カセットが、配列番号１の配列と少なくとも９１％同一の配列を含む、発現カセット。

【請求項6】

ａ．配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、
ｂ．Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列であって、配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％同一性を有する核酸配列と
を含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、前記核酸配列に作動可能に連結されており、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在しない、発現カセット。

【請求項7】

ａ．配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、
ｂ．Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列であって、配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％同一性を有する核酸配列と
を含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、前記核酸配列に作動可能に連結されており、前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、非翻訳核酸の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する、発現カセット。

【請求項8】

前記調節エレメントが、配列番号２～配列番号６７のいずれかと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項9】

前記調節エレメントが、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ総数の低減されたＣｐＧを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項10】

前記調節エレメントが、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ位置で、ＣｐＧがＣｐＴ、ＣｐＡ、ＴｐＧ、又はＡｐＧに置換された、配列番号２～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列を含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項11】

前記核酸配列が、前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い発現を示す、請求項５～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項12】

コードされた前記ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い生物活性を示す、請求項５～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項13】

生物活性が、ＦＶＩＩＩアッセイ又はＦＶＩＩＩ欠損モデルにおける凝固アッセイ又は出血の低減によって決定される、請求項１２に記載の発現カセット。

【請求項14】

前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌヌクレオチドを有する発現カセットのパッケージングと比較して、より効率的にＡＡＶベクターにパッケージングされる、請求項５～１３のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項15】

より少ないシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、核酸配列。

【請求項16】

１個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項17】

２個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項18】

３個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項19】

４個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項20】

５個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項21】

６個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項22】

７個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項23】

８個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項24】

９個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項25】

１０個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項26】

１１個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項27】

１２個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項28】

１３個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項29】

１４個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項30】

１５個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項31】

１６個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項32】

１個又は０個のＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項33】

０個のＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３を含む、請求項１５に記載の核酸配列。

【請求項34】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項35】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも２番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項36】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも３番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項37】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも４番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項38】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも５番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項39】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも６番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項40】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも７番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項41】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも８番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項42】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも９番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項43】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１０番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項44】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１１番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項45】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１２番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項46】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１３番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項47】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１４番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項48】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１５番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項49】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１６番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の核酸配列。

【請求項50】

請求項１５～４９のいずれか一項に記載の核酸配列の配列と少なくとも９５％同一の核酸配列。

【請求項51】

５’及び／又は３’に隣接する５個～７個のヌクレオチドを有するか、又は有さない配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項52】

配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかに記載されるものと同じ数の低減されたＣｐＧを有する、ポリヌクレオチド。

【請求項53】

配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかに記載されるものと同じ位置で、低減されたＣｐＧを有する、ポリヌクレオチド。

【請求項54】

前記改変された前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３は、少なくとも１つのＣｐＧにおけるＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は少なくとも１つのＣｐＧにおけるＣヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＴｐＧ若しくはＡｐＧジヌクレオチドになっている、請求項１５～５３のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項55】

前記改変された前記配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、Ｇヌクレオチドが置換されていない、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項56】

前記改変された前記配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ又はＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ又はＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項57】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２又は配列番号２３における少なくとも１つのさらなるＣｐＧジヌクレオチドは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２又は配列番号２３においてＣｐＴジヌクレオチドになっている、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項58】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも１つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＡヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項59】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも２つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＴジヌクレオチドになっている、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項60】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも２つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１５～５４のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項61】

前記改変された前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３は、少なくとも１つのＣｐＧにおけるＧ及び／又はＣヌクレオチドが欠失している、請求項１５～６０のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項62】

導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１５～６１のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項63】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５０％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１５～６１のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項64】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約２５％～５０％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１５～６１のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項65】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５％～１００％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１５～６１のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチド。

【請求項66】

請求項１５～６１のいずれか一項に記載の核酸配列又はポリヌクレオチドと、導入遺伝子とを含む発現カセット。

【請求項67】

前記核酸配列又はポリヌクレオチドが、前記導入遺伝子の５’に配置されている、請求項６６に記載の発現カセット。

【請求項68】

前記導入遺伝子が、肝臓細胞において発現され体循環に分泌される治療用タンパク質をコードする、請求項６６又は６７に記載の発現カセット。

【請求項69】

前記治療用タンパク質が、神経変性疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項70】

前記治療用タンパク質が、防御用ＡｐｏＥアイソフォームである、請求項６９に記載の発現カセット。

【請求項71】

前記治療用タンパク質が、ＡｐｏＥ ε２アイソフォームである、請求項７０に記載の発現カセット。

【請求項72】

前記治療用タンパク質が、自己免疫疾患又はアレルギー疾患を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項73】

前記治療用タンパク質が、望ましくない抗原と、前記細胞からの前記治療用タンパク質の分泌を駆動するリーダー配列とを含む融合タンパク質である、請求項７２に記載の発現カセット。

【請求項74】

前記望ましくない抗原が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の細胞外ドメイン又はその断片である、請求項７３に記載の発現カセット。

【請求項75】

前記治療用タンパク質が、血液凝固又は凝固因子タンパク質である、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項76】

前記血液凝固又は凝固因子タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）又はプロテインＣである、請求項７５に記載の発現カセット。

【請求項77】

前記第ＶＩＩＩ因子が、配列番号６８の配列と少なくとも９５％同一の核酸配列によってコードされる、請求項７６に記載の発現カセット。

【請求項78】

前記治療用タンパク質が、リソソーム貯蔵酵素である、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項79】

前記リソソーム貯蔵酵素が、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）又はアルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）である、請求項７８に記載の発現カセット。

【請求項80】

前記治療用タンパク質が、炎症性疾患又は障害を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項81】

前記治療用タンパク質が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項82】

前記治療用タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＥＩ）である、請求項８１に記載の発現カセット。

【請求項83】

請求項１～８２のいずれか一項に記載の核酸配列、又はポリヌクレオチド又は発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項84】

ａ）ＡＡＶキャプシド、及び
ｂ）１つ又は複数のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）であって、前記核酸配列、前記ポリヌクレオチド、及び／又は前記導入遺伝子の５’又は３’末端に隣接する、ＡＡＶ ＩＴＲ
のうちの１つ又は複数を含む、請求項８３に記載のＡＡＶベクター。

【請求項85】

前記隣接する５’又は３’ＩＴＲ内に配置されるイントロンをさらに含む、請求項８４に記載のＡＡＶベクター。

【請求項86】

前記イントロン又は１つ若しくは複数のＩＴＲの少なくとも１つが、低減されたＣｐＧを有するように改変されている、請求項８５に記載のＡＡＶベクター。

【請求項87】

前記ＡＡＶキャプシド血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９０％以上の配列同一性を有する改変若しくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９５％以上の配列同一性を有するキャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して１００％の配列同一性を有するキャプシドを含む、請求項８３～８６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項88】

前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、若しくはＲｈ７４ ＡＡＶ血清型、又はそれらの組合せを含む、請求項８３～８７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項89】

ＩＴＲ、ポリＡシグナル及び／又はイントロン配列をさらに含む、請求項８３～８８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項90】

請求項８３～８９のいずれか一項に記載の複数のＡＡＶベクターを生物学的に適合可能な担体又は賦形剤中に含む医薬組成物。

【請求項91】

空のＡＡＶキャプシドをさらに含む、請求項９０に記載の医薬組成物。

【請求項92】

前記空のＡＡＶキャプシドと前記ＡＡＶベクターの比が、約１００：１～５０：１、約５０：１～２５：１、約２５：１～１０：１、約１０：１～１：１、約１：１～１：１０、約１：１０～１：２５、約１：２５～１：５０、又は約１：５０～１：１００内又は間に存在する、請求項９１に記載の医薬組成物。

【請求項93】

前記空のＡＡＶキャプシドと前記ＡＡＶベクターの比が、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である、請求項９１に記載の医薬組成物。

【請求項94】

界面活性剤をさらに含む、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項95】

血液凝固又は凝固因子を必要とするヒトを治療する方法であって、
（ａ）請求項１～１４、請求項６６～６８、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項８３～８９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、又は請求項９０～９４のいずれか一項に記載の医薬組成物を用意するステップと、
（ｂ）ある量の前記発現カセット、ポリヌクレオチド、ＡＡＶベクター、又は医薬組成物を、前記患者に投与するステップと
を含み、前記血液凝固又は凝固因子が、前記ヒトにおいて発現される、方法。

【請求項96】

前記ヒトが、血友病Ａ又は血友病Ｂを有する、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記ＡＡＶベクターが、静脈内に、動脈内に、腔内に、筋内に、又はカテーテルによって、前記患者に投与される、請求項９５に記載の方法。

【請求項98】

前記血液凝固又は凝固因子が、増加したレベルで発現される、請求項９５に記載の方法。

【請求項99】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの１％を上回って発現される、請求項９５に記載の方法。

【請求項100】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約１％～４０％で発現される、請求項９５に記載の方法。

【請求項101】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約５％～３０％で発現される、請求項９５に記載の方法。

【請求項102】

前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトの体重１キログラム当たり約１×１０^８～約１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項９５に記載の方法。

【請求項103】

前記ヒトが、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害抗体を有する血友病Ａを有する、請求項９５に記載の方法。

【請求項104】

血友病Ａの治療を必要とするヒトにおいて、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害抗体を有する血友病Ａを治療する方法であって、
（ａ）請求項１～１４、請求項６６～６８、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項８３～８９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、又は請求項９０～９４のいずれか一項に記載の医薬組成物を用意するステップと、
（ｂ）ある量の前記発現カセット、ポリヌクレオチド、ＡＡＶベクター、又は医薬組成物を、前記ヒトに投与するステップと
を含み、前記血液凝固又は凝固因子が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であり、前記ヒトにおいて発現される、方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

〔導入〕
[0002]遺伝子療法は、例えば、遺伝的欠損若しくは欠陥、又は異常タンパク質の発現を抑制することが望ましいタンパク質の異常機能若しくは活性に起因した、タンパク質機能又は活性の損失に関与する治療用途において極めて有望である。導入遺伝子発現、導入遺伝子発現を駆動するエンハンサー及びプロモーター機能の改善により、遺伝子療法の治療用途が高められる。本発明は、とりわけ、この必要性に対処する。

【発明の概要】

【0002】

[0003]本発明によれば、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列を含む発現カセットが提供される。

【0003】

[0004]ある特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１の配列と少なくとも９８％同一の配列を含むか、配列番号１の配列と少なくとも９９％同一であるか、配列番号１の配列を含むか、又は配列番号１の配列からなる。

【0004】

[0005]ある特定の実施形態において、発現カセットは、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメントを含み、調節エレメントと核酸配列との間にイントロンが存在せず、発現カセットは、配列番号１の配列と少なくとも９１％同一の配列を含む。

【0005】

[0006]ある特定の実施形態において、発現カセットは、（ａ）配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、（ｂ）Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列とを含み、（ａ）の核酸配列は、配列番号７７の配列と少なくとも９０％同一であり、調節エレメントが、核酸配列に作動可能に連結されており、調節エレメントとＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸配列との間にイントロンが存在しない。

【0006】

[0007]ある特定の実施形態において、発現カセットは、（ａ）配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、（ｂ）Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列であって、配列番号７７の配列と少なくとも９０％同一の核酸配列とを含み、調節エレメントは、核酸配列に作動可能に連結されており、調節エレメントと、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸配列との間に、非翻訳核酸の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する。

【0007】

[0008]ある特定の実施形態において、発現カセットにおける調節エレメントは、配列番号２～配列番号６７のいずれかと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。

【0008】

[0009]ある特定の実施形態において、発現カセットにおける調節エレメントは、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ総数の低減されたＣｐＧを有する。

【0009】

[0010]ある特定の実施形態において、発現カセットにおける調節エレメントは、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ位置（複数可）で、ＣｐＧ（複数可）がＣｐＴ、ＣｐＡ、ＴｐＧ、又はＡｐＧに置換された、配列番号２～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列を含む。

【0010】

[0011]ある特定の実施形態において、発現カセットにおける核酸配列は、調節エレメントと核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い発現を示す。

【0011】

[0012]ある特定の実施形態において、発現カセットにおけるコードされたＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、調節エレメントと核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い生物活性を示す。

【0012】

[0013]ある特定の実施形態において、生物活性は、ＦＶＩＩＩアッセイ又はＦＶＩＩＩ欠損モデルにおける凝固アッセイ又は出血の低減によって決定される。

【0013】

[0014]ある特定の実施形態において、発現カセットは、調節エレメントと核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットのパッケージングと比較して、より効率的にＡＡＶベクターにパッケージングされる。

【0014】

[0015]本発明によれば、調節エレメント（プロモーター）のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）が低減された核酸配列が提供される。例示的なプロモーターとして、ＴＴＲ（トランスサイレチン遺伝子）プロモーター及びＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ（ヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子／ヒトアルファ－１アンチトリプシン遺伝子）プロモーターが挙げられる。同様に、例示的なプロモーターとして、フィブリノゲンガンマ鎖遺伝子（ＦＧＧ）プロモーター、アルブミンプロモーター、及び血清アミロイドＡ１遺伝子（ＳＡＡ１）プロモーターが挙げられる。さらに、例示的なプロモーターとして、ハイブリッドプロモーター又はプロモーターキメラを生じる、ｈＡＡＴプロモーター、アルブミンプロモーター、及び／又はＳＡＡ１プロモーターのうちの１つ又は複数に融合されたＴＴＲプロモーターが挙げられる。

【0015】

[0016]ＣｐＧが低減された核酸調節エレメントは、細胞へ導入された場合に、ＣｐＧが低減されていない調節エレメントと比較して、遺伝子発現レベルの変更を示すバリアントを含む。ある特定の実施形態において、ＣｐＧが低減された調節エレメントは、哺乳動物において、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）等のタンパク質をコードする導入遺伝子等の導入遺伝子又は異種核酸の発現の増加を提供することができ、並びに血液凝固因子等のタンパク質の循環レベルの増加、及び有益な治療成績のために止血を達成することによって、遺伝子導入の状況において有効性の増加を提供することができる。

【0016】

[0017]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１個少ないＣｐＧを有する。

【0017】

[0018]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも２個少ないＣｐＧを有する。

【0018】

[0019]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも３個少ないＣｐＧを有する。

【0019】

[0020]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも４個少ないＣｐＧを有する。

【0020】

[0021]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも５個少ないＣｐＧを有する。

【0021】

[0022]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも６個少ないＣｐＧを有する。

【0022】

[0023]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも７個少ないＣｐＧを有する。

【0023】

[0024]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも８個少ないＣｐＧを有する。

【0024】

[0025]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも９個少ないＣｐＧを有する。

【0025】

[0026]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１０個少ないＣｐＧを有する。

【0026】

[0027]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１１個少ないＣｐＧを有する。

【0027】

[0028]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１２個少ないＣｐＧを有する。

【0028】

[0029]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１３個少ないＣｐＧを有する。

【0029】

[0030]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１４個少ないＣｐＧを有する。

【0030】

[0031]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１５個少ないＣｐＧを有する。

【0031】

[0032]ある特定の実施形態において、核酸配列は、野生型のＣｐＧが低減されてない調節エレメント（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれか）よりも少なくとも１６個少ないＣｐＧを有する。

【0032】

[0033]ある特定の実施形態において、核酸配列は、１６個以下のＣｐＧを有するか、１５個以下のＣｐＧを有するか、１４個以下のＣｐＧを有するか、１３個以下のＣｐＧを有するか、１２個以下のＣｐＧを有するか、１１個以下のＣｐＧを有するか、１０個以下のＣｐＧを有するか、９個以下のＣｐＧを有するか、８個以下のＣｐＧを有するか、７個以下のＣｐＧを有するか、６個以下のＣｐＧを有するか、５個以下のＣｐＧを有するか、４個以下のＣｐＧを有するか、３個以下のＣｐＧを有するか、２個以下のＣｐＧを有するか、又は１個以下のＣｐＧを有する。

【0033】

[0034]ある特定の実施形態において、核酸配列は、多くても１５個のＣｐＧ、１４個のＣｐＧ、１３個のＣｐＧ、１２個のＣｐＧ、１１個のＣｐＧ、１０個のＣｐＧ、９個のＣｐＧ、８個のＣｐＧ、７個のＣｐＧ、６個のＣｐＧ、５個のＣｐＧ、４個のＣｐＧ、３個のＣｐＧ、２個のＣｐＧ、又は１個のＣｐＧを有する。ある特定の実施形態において、核酸配列は、ＣｐＧを有さない。

【0034】

[0035]ある特定の実施形態において、配列番号２２又は配列番号２３を含む核酸配列は、１５個以下のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）、１４個以下のＣｐＧ、１３個以下のＣｐＧ、１２個以下のＣｐＧ、１１個以下のＣｐＧ、１０個以下のＣｐＧ、９個以下のＣｐＧ、８個以下のＣｐＧ、７個以下のＣｐＧ、６個以下のＣｐＧ、５個以下のＣｐＧ、４個以下のＣｐＧ、３個以下のＣｐＧ、２個以下のＣｐＧ、又は１個若しくは０個のＣｐＧを有するように改変されている。ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、０個のＣｐＧを有するように改変されている。

【0035】

[0036]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変されている。

【0036】

[0037]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0037】

[0038]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、２番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0038】

[0039]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、３番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0039】

[0040]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、４番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0040】

[0041]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、５番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0041】

[0042]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、６番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0042】

[0043]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、７番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0043】

[0044]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、８番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0044】

[0045]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、９番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0045】

[0046]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１０番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0046】

[0047]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１１番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0047】

[0048]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１２番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0048】

[0049]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１３番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0049】

[0050]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１４番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0050】

[0051]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１５番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0051】

[0052]ある特定の実施形態において、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、任意選択で、Ｃ／ＥＢＰ部位におけるＣを除いて、あらゆるＣｐＧ部位におけるＣがＴに改変されるように改変され、但し、１６番目のＣｐＧ部位は改変されないままである。

【0052】

[0053]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0053】

[0054]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも２番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0054】

[0055]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも３番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0055】

[0056]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも４番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0056】

[0057]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも５番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0057】

[0058]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも６番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0058】

[0059]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも７番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0059】

[0060]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも８番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0060】

[0061]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも９番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0061】

[0062]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１０番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0062】

[0063]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１１番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0063】

[0064]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１２番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0064】

[0065]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１３番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0065】

[0066]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１４番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0066】

[0067]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１５番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0067】

[0068]ある特定の実施形態において、核酸配列は、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける５’末端から少なくとも１６番目のＣｐＧがＣｐＧ以外に改変されるように改変されている。

【0068】

[0069]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける１つ又は複数のＣｐＧのシトシンは、チミンに改変されている。ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける１つ又は複数のＣｐＧのシトシンは、アデニンに改変されている。

【0069】

[0070]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、１つ又は複数のＣｐＧにおけるＣが欠失するように改変されている。

【0070】

[0071]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、１つ又は複数のＣｐＧにおけるＧが欠失するように改変されている。

【0071】

[0072]ある特定の実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号２２及び配列番号２３のいずれかにおける核酸配列は、１つ又は複数のＣｐＧにおけるＣ及びＧが欠失するように改変されている。

【0072】

[0073]例示的なＣｐＧが低減されたＴＴＲプロモーターは、配列番号４～配列番号１３に記載されている。

【0073】

[0074]例示的なＣｐＧが低減されたハイブリッドプロモーターは、配列番号１４～配列番号２１に記載されている。

【0074】

[0075]例示的なＣｐＧが低減されたＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号２４～配列番号６７に記載されている。

【0075】

[0076]ある特定の実施形態において、ｈＡＡＴプロモーター、及び／又はＦＧＧプロモーター、及び／又はアルブミンプロモーター、及び／又はＳＡＡ１プロモーターの少なくとも１つの全て若しくは一部に融合されたＴＴＲプロモーターの全て又は一部を含む、ハイブリッドプロモーターにおける１つ又は複数のＣｐＧのシトシンは、チミン（Ｃ→Ｔ）又はアデニン（Ｇ→Ａ）に改変されている。ＴＴＲプロモーターは、任意の５’→３’配向性で先述のプロモーターのいずれか１つ又は組合せに融合され得る。

【0076】

[0077]ある特定の実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、５’→３’配向性のＴＴＲ／ｈＡＡＴ又はｈＡＡＴ／ＴＴＲを有する。ある特定の実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、５’→３’配向性のＴＴＲ／ＦＧＧ又はＦＧＧ／ＴＴＲを有する。ある特定の実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、５’→３’配向性のＴＴＲ／ｈＡＡＴ／アルブミン又はｈＡＡＴ／ＴＴＲ／アルブミン又はアルブミン／ＴＴＲ／ｈＡＡＴ又はＴＴＲ／アルブミン／ｈＡＡＴ、ｈＡＡＴ／アルブミン／ＴＴＲ又はアルブミン／ｈＡＡＴ／ＴＴＲ等を有する。

【0077】

[0078]ある特定の実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、５’→３’配向性のＴＴＲ／ＦＧＧ／アルブミン又はｈＡＡＴ／ＴＴＲ／ＦＧＧ又はＦＧＧ／ＴＴＲ／ｈＡＡＴ又はＴＴＲ／ＦＧＧ／ｈＡＡＴ等を有する。

【0078】

[0079]ある特定の実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーター、ＦＧＧプロモーター、アルブミンプロモーター、及びＳＡＡ１プロモーターの４つ全ての全て又は一部に融合されたＴＴＲプロモーターを有する。ＴＴＲプロモーターは、任意の５’→３’配向性で、且つ任意のプロモーター順序で、先述のプロモーターの全て又は一部に融合され得る。

【0079】

[0080]ある特定の実施形態において、ＣｐＧが低減された核酸配列等の本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、導入遺伝子に作動可能に連結されている。

【0080】

[0081]ある特定の実施形態において、本明細書に記載の改変された配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３等の本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、導入遺伝子に作動可能に連結されている。

【0081】

[0082]ある特定の実施形態において、本明細書に記載の改変された配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３等の本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、未改変の配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５％～１００％以内であるか、或いは未改変の配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５０％以内であるか、或いは未改変の配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２によって付与される転写の約２５％～５０％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する。

【0082】

[0083]ある特定の実施形態において、本明細書に記載の改変された配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３等の核酸又はポリヌクレオチドは、導入遺伝子の５’に配置されている。

【0083】

[0084]ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、血液凝固又は凝固タンパク質をコードする。

【0084】

[0085]ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）又はプロテインＣをコードする。

【0085】

[0086]ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する第ＶＩＩＩ因子をコードする。

【0086】

[0087]ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、阻害ＲＮＡに転写される。ある特定の実施形態において、阻害ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0087】

[0088]ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、肝臓細胞において発現され体循環に分泌される治療用タンパク質をコードする。

【0088】

[0089]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、神経変性疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療又は防止する。

【0089】

[0090]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、防御用ＡｐｏＥアイソフォームである。

【0090】

[0091]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、ＡｐｏＥ ε２アイソフォームである。

【0091】

[0092]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、自己免疫疾患又はアレルギー疾患を治療又は防止する。

【0092】

[0093]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、望ましくない抗原と、細胞からの上記治療用タンパク質の分泌を駆動するリーダー配列とを含む融合タンパク質である。

【0093】

[0094]ある特定の実施形態において、望ましくない抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の細胞外ドメイン又はその断片である。

【0094】

[0095]ある特定の実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に記載の改変された配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３等の本発明の核酸配列又はポリヌクレオチドを含み、核酸配列又はポリヌクレオチドは、導入遺伝子の５’末端の上流に配置され、任意選択で、核酸配列又はポリヌクレオチドと、導入遺伝子の５’末端との間に配置される非翻訳核酸配列の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する。

【0095】

[0096]ある特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に対して９５％以上の配列同一性を有する１番目のヌクレオチド配列を含み、２番目のヌクレオチド配列の５’末端の上流に配置される１番目のヌクレオチドは、配列番号７７の配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、任意選択で、１番目のヌクレオチド配列と、２番目のヌクレオチド配列の５’末端との間に配置される非翻訳核酸配列の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する。

【0096】

[0097]ある特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１の配列又は配列番号１の配列に対して少なくとも９８％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0097】

[0098]ある特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号１の配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0098】

[0099]ある特定の実施形態において、発現カセットは、本質的に配列番号１からなる。

【0099】

[0100]ある特定の実施形態において、導入遺伝子又は２番目のヌクレオチド配列は、Ｂ－ドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、ＦＶＩＩＩ血液凝固活性を有し、且つ配列番号６８の配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有する、ＦＶＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードする。

【0100】

[0101]ある特定の実施形態において、導入遺伝子又は２番目のヌクレオチド配列は、Ｂ－ドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号７７の配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、ＦＶＩＩＩ血液凝固活性を有するタンパク質をコードする。

【0101】

[0102]ある特定の実施形態において、非翻訳の核酸配列は、イントロンではないか、又はイントロンを含まない。

【0102】

[0103]ある特定の実施形態において、１番目のヌクレオチド配列は、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかと少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。

【0103】

[0104]ある特定の実施形態において、１番目のヌクレオチド配列は、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列において記載されるものと同じ総数の低減されたＣｐＧを有する。

【0104】

[0105]ある特定の実施形態において、１番目のヌクレオチド配列は、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ位置（複数可）で、ＣｐＧ（複数可）がＣｐＴ、ＣｐＡ、ＴｐＧ、又はＡｐＧに置換された核酸配列を含む。

【0105】

[0106]ある特定の実施形態において、２番目のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列の５’末端との間に１０８個以上のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからの発現と比較して、より高い発現を示す。

【0106】

[0107]ある特定の実施形態において、２番目のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列の５’末端との間に１０８個以上のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからの発現と比較して、より高い生物活性を示す。

【0107】

[0108]ある特定の実施形態において、生物活性は、ＦＶＩＩＩアッセイ又はＦＶＩＩＩ欠損モデルにおける凝固アッセイ又は出血の低減によって決定される。

【0108】

[0109]ある特定の実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列の５’末端との間に１０８個以上のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドのパッケージングと比較して、より効率的にＡＡＶベクターにパッケージングされる。

【0109】

[0110]ある特定の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本明細書に記載の核酸配列、又はポリヌクレオチド又は発現カセットを含む。

【0110】

[0111]ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ａ）ＡＡＶキャプシド、及びｂ）１つ又は複数のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）であって、核酸配列、ポリヌクレオチド、及び／又は導入遺伝子の５’又は３’末端に隣接する、ＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）のうちの１つ又は複数を含む。

【0111】

[0112]ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、隣接する５’又は３’ＩＴＲ内に配置されるイントロンをさらに含む。

【0112】

[0113]ある特定の実施形態において、イントロン又は１つ若しくは複数のＩＴＲは、低減されたＣｐＧを有するように改変される。

【0113】

[0114]ある特定の実施形態において、ＡＡＶキャプシド血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９０％以上の配列同一性を有する改変若しくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９５％以上の配列同一性を有するキャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して１００％の配列同一性を有するキャプシドを含む。

【0114】

[0115]ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、若しくはＲｈ７４ ＡＡＶ血清型、又はそれらの組合せのいずれかの１つ又は複数のＩＴＲを含む。

【0115】

[0116]ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＩＴＲ、ポリＡシグナル及び／又はイントロン配列をさらに含む。

【0116】

[0117]ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、任意の医薬組成物である。

【0117】

[0118]ある特定の実施形態において、医薬組成物は、生物学的に適合可能な担体又は賦形剤を含む。

【0118】

[0119]ある特定の実施形態において、医薬組成物は、空のＡＡＶキャプシドをさらに含む。

【0119】

[0120]ある特定の実施形態において、組成物又は医薬組成物は、約１００：１～５０：１、約５０：１～２５：１、約２５：１～１０：１、約１０：１～１：１、約１：１～１：１０、約１：１０～１：２５、約１：２５～１：５０、又は約１：５０～１：１００内又は間の空のＡＡＶキャプシドとＡＡＶベクターの比を含む。

【0120】

[0121]ある特定の実施形態において、組成物又は医薬組成物における空のＡＡＶキャプシドとＡＡＶベクターの比は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である。

【0121】

[0122]ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、界面活性剤をさらに含む。

【0122】

[0123]ある特定の実施形態において、遺伝子療法を必要とするヒトを治療する方法が提供される。

【0123】

[0124]ある特定の実施形態において、ヒトは、血液凝固又は凝固因子を必要とする。

【0124】

[0125]ある特定の実施形態において、ヒトを治療する方法は、（ａ）本明細書に記載の発現カセット、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載のＡＡＶベクター、又は本明細書に記載の医薬組成物を用意するステップと、（ｂ）ある量の発現カセット、ポリヌクレオチド、ＡＡＶベクター、又医薬組成物の量を、ヒトに投与するステップとを含む。

【0125】

[0126]ある特定の実施形態において、ヒトは、血友病Ａ又は血友病Ｂを有する。

【0126】

[0127]ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、静脈内に、動脈内に、腔内に、筋内に、又はカテーテルによって、ヒトに投与される。

【0127】

[0128]ある特定の実施形態において、血液凝固又は凝固因子は、投与後に増加したレベルで発現される。

【0128】

[0129]ある特定の実施形態において、血液凝固又は凝固因子は、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの１％を上回って発現される。

【0129】

[0130]ある特定の実施形態において、血液凝固又は凝固因子は、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約１％～４０％で発現される。

【0130】

[0131]ある特定の実施形態において、血液凝固又は凝固因子は、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約５％～３０％で発現される。

【0131】

[0132]ある特定の実施形態において、記ＡＡＶベクターは、ヒトの体重１キログラム当たり約１×１０^８～約１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される。

【図面の簡単な説明】

【0132】

【図1】「ＣｐＧ１」～「ＣｐＧ２２」と表示されたＣｐＧが低減されたＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ調節エレメント－ｈＦＩＸコード構築物のハイドロダイナミック送達の２４時間後のマウスの血漿中の、活性アッセイによって測定されるヒト第ＶＸ因子（ｈＦＩＸ）レベルを示す図である。配列番号２４～配列番号６７は、それぞれ、制限酵素部位を有する、及び制限酵素部位を有さない、調節エレメントＣｐＧ１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ～ＣｐＧ２２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴに相当し、実施例１３においてさらに記載されている。レベルｈＦＩＸは、ＣｐＧが低減されていないＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ（配列番号２３）を含有する参照プラスミドの倍数として表す。

【図2】「ＣｐＧ１」～「ＣｐＧ５」と表示されたＣｐＧが低減されたＴＴＲｍプロモーターｈＦＶＩＩＩコード構築物のハイドロダイナミック送達の２４時間後のマウスの血漿中の、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）抗原レベルを示す図である。配列番号４～配列番号２１は、それぞれ、隣接する制限酵素部位を有する、及び隣接する制限酵素部位を有さない、プロモーターＣｐＧ１－ＴＴＲｍ～ＣｐＧ５－ＴＴＲｍに相当し、実施例１３においてさらに記載されている。レベルは、正常なヒト血漿ＦＶＩＩＩのパーセントとして表し、ここでは、１００％＝１５０ｎｇ／ｍＬである。「ＴＴＲｍ」は、ＣｐＧが低減されていないＴＴＲｍプロモーター（配列番号３）を含有するｈＦＶＩＩＩコード構築物を指す。

【図3】「ハイブリッド６」～「ハイブリッド９」と表示されたＣｐＧが低減されたハイブリッドプロモーターｈＦＶＩＩＩコード構築物のハイドロダイナミック送達の２４時間後のマウスの血漿中の、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを示す図である。配列番号１４～配列番号２１は、それぞれ、ＣｐＧが低減されたプロモーターハイブリッド６～ハイブリッド９に相当した。レベルは、正常なヒト血漿ＦＶＩＩＩのパーセントとして表し、ここでは、１００％＝１５０ｎｇ／ｍＬである。「ＴＴＲｍ」は、ＣｐＧが低減されていないＴＴＲｍプロモーター（配列番号３）を含有するｈＦＶＩＩＩコード構築物を指す。

【図4】６．４ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量での、ＡＡＶキャプシド形成されたＣｐＧが低減されていない（ＴＴＲｍ）並びにＣｐＧが低減されたハイブリッド６、ハイブリッド７、ハイブリッド８及びハイブリッド９プロモーター－ｈＦＶＩＩＩ構築物の送達の２週後、４週後及び８週後のマウスの血漿中の、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを示す図である。レベルは、正常なヒト血漿ＦＶＩＩＩのパーセントとして表し、ここでは、１００％＝１５０ｎｇ／ｍＬである。

【図5】２．５６ｅ１１個、６．４ｅ１１個及び１．６ｅ１２個のｖｇ／ｋｇの用量での、ＡＡＶキャプシド形成されたＣｐＧが低減されていない（ＴＴＲｍ－ｈＦＶＩＩＩ）、ハイブリッド７及びハイブリッド９プロモーター－ｈＦＶＩＩＩ構築物の送達の８週後のマウスの血漿中の、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを示す図である。レベルは、正常なヒト血漿ＦＶＩＩＩのパーセントとして表し、ここでは、１００％＝１５０ｎｇ／ｍＬである。

【図6】６．４ｅ１１個のｖｇ／ｋｇの用量での、ＡＡＶ形成されたＣｐＧが低減されていない（ＴＴＲｍ－ｈＦＶＩＩＩ）、ハイブリッド７及びハイブリッド９プロモーター－ｈＦＶＩＩＩ構築物の静脈内投与の８週後のマウスの肝臓、脳、精巣、脾臓及び腎臓における、ｈＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの発現を示す図である。ｈＦＶＩＩＩ ＲＮＡは、肝臓以外のいずれの組織でも観察されず、プロモーターの肝臓特異性を実証した。肝臓、脳、精巣、脾臓及び腎臓に関する結果群は、それぞれ、ＴＴＲｍ－ｈＦＶＩＩＩ、ハイブリッド７－ｈＦＶＩＩＩ、及びハイブリッド９－ｈＦＶＩＩＩに関して、左側から右側に示される。

【図7】「ＡＡＶ－ＷＩＮＴ」と称されるイントロンを有する発現カセット（ＴＴＲｍ－イントロン－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）及び「ＡＡＶ－ＩＮＴＬ」と称されるイントロンを有さない発現カセット（ＴＴＲｍ－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤイントロンなし、配列番号１）の模式的な比較を示す図である。ＡＡＶ－ＷＩＮＴは、ＡＡＶ－ＩＮＴＬ中には存在しない、ＴＴＲｍプロモーターと、Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする導入遺伝子（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）との間に位置する合成イントロン（配列番号９３）を有する。ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするこれらのカセットにおけるコドン最適化核酸配列は、配列番号７７において記載される。

【図8】研究＃１の６．４ｅ９個のｖｇ／マウス投与量に関して、マウス血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。結果は、各治療群における動物（ｎ＝５）の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。

【図9】研究＃１の１．６ｅ１０個のｖｇ／マウス投与量に関して、マウス血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。結果は、各治療群における動物（ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩ、ｎ＝４；ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩイントロンなし、ｎ＝５）の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。

【図10】研究＃２のマウス血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。結果は、各治療群における動物（ｎ＝１０）の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。

【図11】研究＃１の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。低用量（２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ）群１（ＡＡＶ－ＷＩＮＴ、線と四角、ｎ＝２）及び群２（ＡＡＶ－ＩＮＴＬ、配列番号１、線と三角形、ｎ＝３）での個々のサルの結果を示す。低用量ＡＡＶ－ＷＩＮＴの動物１匹は、投薬の８日前の試料において観察されたＡＡＶに対する陽性の中和抗体に起因して除去した。

【図12】研究＃１のＮＨＰ血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。高用量（６ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ）群３（ＡＡＶ－ＷＩＮＴ、線と四角、ｎ＝２）及び群４（ＡＡＶ－ＩＮＴＬ、配列番号１、線と三角形、ｎ＝３）での個々のサルの結果を示す。高用量ＡＡＶ－ＷＩＮＴの動物１匹であるＰ０１０１は、治療時にＦＶＩＩＩ発現が観察されないことに起因して除去した。

【図13】研究＃２のＮＨＰの血漿試料で実施したＥＬＩＳＡによって検出されるようなｈＦＶＩＩＩレベルを示す図である。ＡＡＶ－ＷＩＮＴ（線と四角、ｎ＝５）及びＡＡＶ－ＩＮＴＬ（配列番号１、線と三角形、ｎ＝５）に関する２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ用量での個々のサルの結果を示す。

【図14】３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）での細胞ベースのベクター効力アッセイの結果を示す図である。細胞上清を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４によって、ｈＦＶＩＩＩ活性に関して評価して、二重反復でアッセイした２つの生物学的反復の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。「ＡＡＶ－ＷＩＮＴ」及び「ＡＡＶ－ＩＮＴＬ」は、ウイルスの元の未希釈ストックバイアルであるのに対して、「ＡＡＶ－ＷＩＮＴ投薬」及び「ＡＡＶ－ＩＮＴＬ投薬」は、注入のために希釈した材料を示す。

【図15】各ＭＯＩに関するＡＡＶ－ＷＩＮＴに対する倍数変化として再プロットした図１４の結果を示す図である。

【図16】３つの異なるＭＯＩでのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞ベースのベクター効力アッセイにおけるベクター効力の評価を示す図である。細胞上清を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４によって、ｈＦＶＩＩＩ活性に関して評価して、二重反復でアッセイした２つの生物学的反復の平均値である。エラーバーは、標準偏差を表す。ＡＡＶ－ＷＩＮＴ及びＡＡＶ－ＩＮＴＬ（配列番号１）は、２つの異なるロット由来のウイルスの元の未希釈ストックバイアルである。

【図17】ｍＴＴＲ－イントロン－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ及びｍＴＴＲ－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ（配列番号１）の独立したプラスミドＤＮＡ調製物（ｐｒｅｐ）でトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞の上清由来の、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４によってアッセイしたｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＦＶＩＩＩレベルに関する発現カセットの比較を示す図である。個々のデータ点を黒丸として示し、バーそれぞれは、二重反復でアッセイされた２つの生物学的反復の平均値（ｎ＝２）を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。

【図18】本明細書でＬＫ０３－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと称される、ＬＫ０３ ＡＡＶベクター（配列番号９１）においてキャプシド形成された５×１０^１１個のｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ発現カセット（配列番号１）を注入した４名のヒト対象（参加者１（丸）、参加者２（四角）、参加者３（三角）及び参加者４（ひし形））における毎日のＦＶＩＩＩ活性レベルを示す図である。

【図19】５×１０^１１個のｖｇ／ｋｇのＬＫ０３－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを注入した４名のヒト対象（参加者１（丸）、参加者２（四角）、参加者３（三角）及び参加者４（ひし形））におけるＦＶＩＩＩ活性レベルの毎週の平均値を示す図である。

【図20】５×１０^１１個のｖｇ／ｋｇのＬＫ０３－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを注入した４名のヒト対象（参加者１（丸）、参加者２（四角）、参加者３（三角）及び参加者４（ひし形））におけるＦＶＩＩＩ活性レベルの４週のブロック平均値を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0133】

〔詳細な説明〕
[0153]第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及び欠失されたＢドメインを有するＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）（例えば、ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）及びヒトＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ））の発現のためのイントロンなしの発現カセット核酸配列が本明細書で開示される。研究者により、ＡＡＶ送達ベクターにおけるものを含む、発現カセットにおけるイントロンの包含は、導入遺伝子発現の増加に寄与し得ることが報告されている（Ｈｕａｎｇら、１９９０年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１８：９３７～９４７頁；Ｃｈｏｉら、２０１４年、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ、７：１７頁；Ｐｏｗｅｌｌら、２０１５年、Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．、１９：４９～５７頁；Ｌｕら、２０１７年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２８：１２５～１３４頁）。驚くべきことに、本明細書に開示するように、イントロンの部分的又は完全除去は、細胞培養物、マウス及び非ヒト霊長類においてＡＡＶベクター効力及び導入遺伝子（この場合は、第ＶＩＩＩ因子）発現レベルの増加をもたらした。「イントロンを含まない」発現カセット設計は、血友病Ａ等の血液凝固障害の治療のためのベクターの改善であり、より低いベクター用量で有効性を提供し、コスト及び時間等の製造に対する障壁を減少させる他に、患者の安全性及び成績に有益性を付与し得る。

【0134】

[0154]また、参照野生型哺乳動物（例えば、ヒト）配列と比較してＣｐＧが低減された核酸配列及び／又は参照野生型哺乳動物（例えば、ヒト）配列に対して１００％未満の配列同一性を有する核酸配列が開示される。ＣｐＧが低減された核酸配列は、１つ又は複数の下記のプロモーター：ＴＴＲプロモーター、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター、ＦＧＧプロモーター、アルブミンプロモーター、及びＳＡＡ１プロモーターを包含する。ＣｐＧが低減された核酸配列は、ＴＴＲプロモーター及び少なくとも１つ又は複数の下記プロモーター：ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター、ＦＧＧプロモーター、アルブミンプロモーター、及びＳＡＡ１プロモーターの融合体及びハイブリッドを包含する。

【0135】

[0155]「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指す。ポリヌクレオチドとして、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、及びスプライシングされたか、若しくはスプライジングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子又は短分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子又は短分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドとして、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及び意図的に改変又は変更されたポリヌクレオチド（例えば、バリアント核酸）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、単鎖、二重鎖又は三重鎖であってもよく、直鎖状又は環状であってもよく、任意の長さを有し得る。ポリヌクレオチドについて論述する際、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’への方向で配列を提供するという慣習に従って、本明細書で記載され得る。

【0136】

[0156]本明細書で使用する場合、「改変する」又は「バリアント」及びそれらの文法的変形は、核酸、ポリヌクレオチド又はそれらの部分配列が、参照配列から外れることを意味する。したがって、改変及びバリアント配列は、参照配列よりも、実質的に同じであるか、より高いか、若しくはより低い発現、活性又は機能を有し得るが、参照配列の部分活性又は機能を少なくとも保持する。改変又はバリアントの特定の例は、ＣｐＧが低減されたＴＴＲプロモーター、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーター、ＦＧＧプロモーター、アルブミンプロモーター及びＳＡＡ１プロモーターである。

【0137】

[0157]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」バリアントは、野生型と比較して、遺伝的に変更された改変配列を指す。核酸又はポリヌクレオチドバリアントは、コドンが改変されているが、野生型配列等の参照配列に対して少なくとも部分的配列同一性を保持する配列を指し得る。タンパク質をコードする核酸又はポリヌクレオチドは、コードされるタンパク質配列を変更させることなく遺伝的に改変され得る。或いは、配列は、バリアントタンパク質をコードするように遺伝的に改変され得る。例えば、かかる核酸バリアントの幾つかのコドンは、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸を変更させることなく変更される（例えば、ＣｐＧが低減）。

【0138】

[0158]ＣｐＧ含有量が低減されたプロモーターを有する発現ベクターは、ＣｐＧ含有量が低減されていないプロモーターと比較して、改善を示し得る。発現を比較する場合、ＣｐＧが低減されたプロモーターは、野生型又はＣｐＧが低減されていないプロモーターと比較される。

【0139】

[0159]「バリアント」又は「改変」という用語は、本明細書のＣｐＧが低減された核酸配列に対する言及のどの場合でも出現するには及ばない。同様に、「ＣｐＧが低減された核酸」等の用語は、「バリアント」又は「改変」を省略し得るが、「ＣｐＧが低減された核酸」に対する言及は、遺伝子レベルでバリアントを包含する。

【0140】

[0160]バリアントの特定の例は、ＣｐＧが低減された核酸である。ＣｐＧ低減は、Ｃ又はＧヌクレオチドを異なるヌクレオチドに変更すること、例えば、ＣをＴに変更すること、又はＧをＡに変更することによって達成され得る。ＣｐＧ低減はまた、Ｃヌクレオチドを欠失させること、又はＧヌクレオチドを欠失させること、又はＣ及びＧヌクレオチドの両方を欠失させることによって達成され得る。

【0141】

[0161]「バリアント又は改変」ＦＶＩＩＩは、未改変の野生型ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ（配列番号６８）と比較して、遺伝的に変更されているＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを指す。かかるバリアントは、「第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする核酸バリアント」とも称され得る。

【0142】

[0162]「バリアント第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）」はまた、改変タンパク質が、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、アミノ酸変更を有するような改変ＦＶＩＩＩタンパク質を意味し得る。活性及び／又は安定性を比較すると、コードされたバリアントＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂ－ドメインを保持する場合には、それを野生型ＦＶＩＩＩと比較することが適切であり、コードされたバリアントＦＶＩＩＩタンパク質が、Ｂ－ドメイン欠失を有する場合には、同様にＢ－ドメイン欠失を有する野生型ＦＶＩＩＩと比較される。

【0143】

[0163]バリアントＦＶＩＩＩは、Ｂ－ドメインの一部である。したがって、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、Ｂ－ドメインの一部を含む。通常、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤにおいて、Ｂ－ドメインの大部分が欠失されている。

【0144】

[0164]バリアントＦＶＩＩＩは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号６９）として記載される「ＳＱ」配列を包含し得る。通常、ＳＱを有するかかるバリアントＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ／ＳＱ）は、ＢＤＤを有し、例えば、ＢＤの少なくとも全て又は一部が欠失されている。ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ等のバリアントＦＶＩＩＩは、「ＳＱ」配列の全て又は一部、即ち、配列番号６９の全て又は一部を有し得る。したがって、例えば、ＳＱ配列（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号６９）を有するバリアントＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲの全て又はほんの一部を有し得る。例えば、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、含まれるＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個のアミノ酸残基を有し得る。したがって、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個の内部欠失並びに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個のアミノ又はカルボキシ末端欠失を有するＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲは、本明細書に記載されるバリアントＦＶＩＩＩタンパク質中に含まれる。

【0145】

[0165]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」配列によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、天然に存在する野生型タンパク質と同様に完全長自然配列、並びに部分配列、改変形態又はバリアントが、自然完全長タンパク質の幾らかの機能性を保持する限りは、機能性部分配列、改変形態又は配列バリアントを包含する。例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸（例えば、ＣｐＧが低減された核酸）は、本明細書に記載のＢドメイン欠失を有し、凝固機能を保持することができる。本発明の方法及び使用において、核酸配列によってコードされるかかるポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、治療される哺乳動物において、欠乏しているか、又はその発現が不十分であるか、又は欠損している内因性タンパク質と同一であってもよいが、同一である必要はない。

【0146】

[0166]例えば、また制限されずに、改変は、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸置換（例えば、１個～３個、３個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～４０個、４０個～５０個、５０個～１００個、１００個～１５０個、１５０個～２００個、２００個～２５０個、５００個～７５０個、７５０個～８５０個以上のヌクレオチド又は残基）を包含する。本明細書に記載するように、核酸改変の例は、ＣｐＧ低減である。

【0147】

[0167]アミノ酸改変の例は、Ｂドメイン欠失を有するＦＶＩＩＩ等の、参照配列、例えばＦＶＩＩＩの保存的アミノ酸置換又は欠失（例えば、部分配列又は断片）である。ある特定の実施形態において、改変又はバリアント配列は、未改変配列の機能又は活性の少なくとも一部を保持する。

【0148】

[0168]本明細書のＣｐＧが低減されたプロモーターの他の哺乳動物形態を含む、核酸の哺乳動物形態及び非哺乳動物形態全てが、既知であろうと、又は未知であろうと明らかに包含される。

【0149】

[0169]「ベクター」という用語は、小担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）、又は核酸の挿入若しくは取込みによって操作され得る他のビヒクルを指す。ベクターは、遺伝子操作（即ち、「ベクターのクローニング」）に、ポリヌクレオチドを細胞及び／又は臓器に導入／移入するのに、また細胞において、挿入されたポリヌクレオチドを転写又は翻訳するのに使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必須調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有するベクターである。ベクター核酸配列は概して、細胞における伝播のための少なくとも１つの複製起点、及び任意選択で、異種核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、末端逆位配列（複数可）（ＩＴＲ）、任意選択の選択可能マーカー、ポリアデニル化シグナル等のさらなるエレメントを含有する。

【0150】

[0170]本明細書で開示されるように、イントロンを欠如するベクターは、合成イントロンを有する同じベクターと比較して、優れた特徴を示した。したがって、本発明は、調節エレメントに作動可能に連結されている導入遺伝子を含む発現カセットであって、調節エレメント（例えば、本明細書に記載のＣｐＧが低減されたプロモーター）が、導入遺伝子の５’末端の上流に配置され、調節エレメントと導入遺伝子の５’末端との間に、非翻訳核酸配列の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する、発現カセットを提供する。

【0151】

[0171]本発明はまた、配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列に対して９５％以上の配列同一性を有する１番目のヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、１番目のヌクレオチド配列が、配列番号７７の配列に対して９５％以上の配列同一性を有する２番目のヌクレオチド配列の５’末端の上流に配置され、１番目のヌクレオチド配列と２番目のヌクレオチド配列の５’末端との間に、非翻訳核酸配列の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する、発現カセットを提供する。

【0152】

[0172]本発明はさらに、配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列に対して９５％以上の配列同一性を有する１番目のヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、１番目のヌクレオチド配列が、配列番号７１～配列番号８８のいずれかの配列に対して９５％以上の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列同一性）を有する２番目のヌクレオチド配列の５’末端の上流に配置され、１番目のヌクレオチド配列と２番目のヌクレオチド配列の５’末端との間に、非翻訳核酸配列の０個～５個、５個～１０個、１０個～１５個、１５個～２０個、２０個～２５個、２５個～３０個、３０個～３５個、３５個～４０個、４０個～４５個、４５個～５０個、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１０５個、１０６個又は１０７個以下のヌクレオチドが存在する、発現カセットを提供する。

【0153】

[0173]本発明はさらに、調節エレメントと導入遺伝子との間に配置される非翻訳（非コード）核酸を有する発現カセットであって、非翻訳核酸がイントロンではない、発現カセットを提供する。かかる発現カセットは、イントロンを含まないカセットと称され得る。

【0154】

[0174]イントロンは、ドナー部位及びスプライスアクセプター部位を有する配列であり、細胞機構がｍＲＮＡへのＲＮＡ成熟のプロセス中に非翻訳ヌクレオチド配列をスプライシングで切り出すのを可能にする。本明細書で使用する場合、「イントロンを含まない」は、ドナー部位及びスプライスアクセプター部位を欠如する非翻訳核酸配列を指すが、非翻訳核酸配列が、制限酵素認識／切断部位、コザック配列、転写因子認識／結合部位等の他の部位を欠如していることを意味しない。換言すると、イントロンを含まないは、核酸配列が、任意の非翻訳核酸配列（複数可）を完全に欠如していることを意味しない。

【0155】

[0175]ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルスに由来する。ＡＡＶベクターは、それらが細胞に浸透して、核酸／遺伝物質を導入することができ、その結果、核酸／遺伝物質が、細胞において安定に維持され得るため、遺伝子療法ベクターとして有用である。ＡＡＶは、ヒトにおける病原性疾患と関連付けられないため、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ発病又は疾患を引き起こさずに、異種核酸配列（即ち、治療用タンパク質及び阻害ＲＮＡをコードする）を、ヒト患者に送達することが可能である。

【0156】

[0176]組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター等のベクターの修飾語、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチド等の配列の修飾語としての「組換え」という用語は、組成物が、一般的には決して起こらない様式で操作（即ち、変更）されていることを意味する。組換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノム中には一般的に存在しない核酸（異種配列）がウイルスゲノム内に挿入されているものである。組換えＡＡＶベクターの例は、遺伝子がＡＡＶゲノム内の一般的に関連付けられる５’領域、３’領域及び／又はイントロン領域を有して、又は有さずに、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）が、ベクターにクローニングされているものである。「組換え」という用語は、常にＡＡＶベクター、並びにポリヌクレオチド等の配列に関連して使用されるわけではなく、いかなるかかる省略にもかかわらず、ＡＡＶベクター、ポリヌクレオチド等を含む組換え形態は、明らかに包含される。

【0157】

[0177]「ｒＡＡＶベクター」は、分子方法を使用して、野生型ＡＡＶゲノムの全て又は一部を除去することと、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸等の非自然（異種）核酸で置き換えることとによって、ＡＡＶの野生型ゲノムから得られる。通常、ｒＡＡＶベクターに関して、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の末端逆位配列（ＩＴＲ）配列が保持される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの全て又は一部が、ＡＡＶゲノム核酸に関する非自然配列で、例えば、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸で置き換えられているため、ＡＡＶゲノムと区別される。したがって、非自然（異種）配列の取込みにより、ＡＡＶは「組換え」ＡＡＶベクターとして規定され、それは、「ｒＡＡＶベクター」と称され得る。

【0158】

[0178]組換えＡＡＶベクター配列は、パッケージングされてもよく、これは、本明細書でｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏでの続く細胞感染（形質導入）のための「粒子」と称される。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子にキャプシド形成又はパッケージングされる場合、粒子は、「ｒＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ粒子」又は「ｒＡＡＶビリオン」とも称され得る。かかるｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶビリオンは、ベクターゲノムをキャプシド形成又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例として、ＡＡＶの場合には、キャプシドタンパク質が挙げられる。

【0159】

[0179]「ベクターゲノム」又は利便性良く省略される「ｖｇ」は、最終的にはパッケージング又はキャプシド形成されて、ｒＡＡＶ粒子を形成する組換えプラスミド配列の一部を指す。組換えプラスミドを使用して、組換えＡＡＶベクターを構築又は製造する場合、ＡＡＶベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に相当しない「プラスミド」の一部を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、これは、伝播及び組換えＡＡＶベクター産生に必要とされるプロセスである、プラスミドのクローニング並びに増幅にとって重要であるが、それ自体はｒＡＡＶ粒子にパッケージング又はキャプシド形成されない。したがって、「ベクターゲノム」は、ｒＡＡＶによってパッケージング又はキャプシド形成される核酸を指す。

【0160】

[0180]「ＡＡＶヘルパー機能」は、順次、増殖性ＡＡＶ複製及びパッケージングに関してトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物及びＡＡＶベクターを提供するように発現され得るＡＡＶ由来のコード配列（タンパク質）を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐ及びｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を保有することが示されている。Ｃａｐ発現産物（キャプシド）は、必須のパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターゲノムから欠如しているトランスでのＡＡＶ機能を補完するのに使用される。

【0161】

[0181]「ＡＡＶヘルパー構築物」は一般的に、例えば、遺伝子療法で対象への目的の核酸配列の送達のための形質導入用ＡＡＶベクターを産生するのに使用されるべきであるＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸配列を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶ ｒｅｖ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供して、ＡＡＶベクター複製及びキャプシド形成に必要な欠損しているＡＡＶ機能を補完するのに使用される。ヘルパー構築物は概して、ＡＡＶ ＩＴＲを欠如しており、複製することはできず、またそれ自身をパッケージングすることもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態で存在し得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードするプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５等の、多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２～３８２８頁、及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６～２９４５頁を参照）。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第６，３７６，２３７号を参照）。

【0162】

[0182]「アクセサリー機能」という用語は、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルス／細胞機能を指す。この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶキャプシドパッケージングの活性化に関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要とされるタンパク質及びＲＮＡを包含する。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型）及びワクシニアウイルス等の既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

【0163】

[0183]「アクセサリー機能ベクター」は概して、アクセサリー機能を提供するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。かかる配列は、アクセサリー機能ベクター上に存在し、適切な宿主細胞にランスフェクトされ得る。アクセサリー機能ベクターは、宿主細胞におけるｒＡＶＶビリオン産生を支持することが可能である。アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態で存在し得る。さらに、アデノウイルス遺伝子の完全補体は、アクセサリー機能に必要とされない。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製可能であると報告されている（Ｉｔｏら、（１９７０年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３頁、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７頁）。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することがわかっており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域が、アクセサリー機能を提供することに関与されない可能性が高いことを示している（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５頁）。Ｅ１領域が欠乏しているか、又はＥ４領域が欠失されたアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持することが不可能である。したがって、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的又は間接的に、ＡＡＶ複製に必要であるようである（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８頁；Ｊａｎｉｋら、（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５頁；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５頁）。他の特徴付けられるアデノウイルス変異体として、Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２年）、上記；Ｊａｎｉｋら、（１９８１年）、上記；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２頁）、Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９頁；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０頁；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５頁；Ｊａｙら、（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７頁；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７頁）、Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓにて（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０年））、Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）、上記）及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）、上記；Ｃａｒｔｅｒら、（１９９５年））が挙げられる。Ｅ１Ｂコード領域において変異を有するアデノウイルスによって提供されるアクセサリー機能の研究は、相反する結果をもたらしたが、Ｅ１Ｂ５５ｋは、ＡＡＶビリオン産生に必要であり得るのに対して、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要とされない（Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６～２１０頁）。さらに、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８～９４５頁は、様々なアデノウイルス遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターについて記載している。例示的なアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及び無傷のＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠如しているアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。かかるアクセサリー機能ベクターは、例えば、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。

【0164】

[0184]本明細書で使用する場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶを指すのに使用される特徴である。血清学的独自性は、別のＡＡＶと比較して、あるＡＡＶに対する抗体間での交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性の差は通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基の差に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差に起因する）。

【0165】

[0185]伝統的な定義で、血清型は、目的のウイルスが、中和活性に関する全ての既存の特性化された血清型に特異的な血清に対して検査されてきたことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス単離体が、発見されて、及び／又はキャプシド変異体が生成されると、現存する血清型のいずれかと血清学的な差が存在し得るか、又は存在し得ない。したがって、新たなウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的な差を有さない場合、この新たなウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、相当する血清型の亜群又はバリアントである。多くの場合、血清型の伝統的な定義に従って、キャプシド配列改変を有する変異体ウイルスが別の血清型であるかどうかを決定するための、中和活性に関する血清学検査は、キャプシド配列改変を有する変異体ウイルスでは、いまだに実施されていない。したがって、利便性のために、また反復を回避するために、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに所与の血清型の亜群又はバリアント内に存在し得る血清学的に異ならないウイルスの両方を広範に指す。

【0166】

[0186]ｒＡＡＶベクターは、任意のウイルス株又は血清型を包含する。例えば、限定されずに、ｒＡＡＶベクターゲノム又は粒子（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３等のキャプシド）は、例えば、ＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０又はＡＡＶ－２ｉ８等の任意のＡＡＶ血清型に基づき得る。かかるベクターは、同じ株又は血清型（又は亜群又はバリアント）に基づいてもよく、或いは互いに異なってもよい。例えば、限定されずに、１つの血清型ゲノムに基づくｒＡＡＶプラスミド若しくはベクターのゲノム又は粒子（キャプシド）は、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と同一であり得る。さらに、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターのゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするキャプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と異なるＡＡＶ血清型ゲノムに基づいてもよく、この場合、３つのキャプシドタンパク質の少なくとも１つは、例えば、異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３（配列番号９１）、ＳＰＫ（配列番号９２）、又はそれらのバリアントであり得る。より詳細には、ｒＡＡＶ２ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み得るが、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３（配列番号９１）、ＳＰＫ（配列番号９２）又はそれらのバリアント等の異なる血清型由来のキャプシドである。したがって、ＡＡＶベクターは、特定の血清型並びにシュードタイプとも称される混合血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。

【0167】

[0187]ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３（配列番号９１）、ＳＰＫ（配列番号９２）キャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）と少なくとも７０％又はそれより高く（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％９９％、９９．５％等）同一のキャプシド配列を含むか、又はそのキャプシド配列からなる。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、又は－ｒｈ１０ ＩＴＲ（複数可）と少なくとも７０％又はそれより高く（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含むか、又は配列からなる。

【0168】

[0188]ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許第２０１３／００５９７３２号（米国特許出願第１３／５９４，７７３号、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３（配列番号９１）等を開示している）に記載されるように、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８、それらのバリアント（例えば、アミノ酸挿入、付加、置換及び欠失等のＩＴＲ及びキャプシドバリアント）を含む。

【0169】

[0189]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３（配列番号９１）、ＳＰＫ（配列番号９２）及びバリアント、ハイブリッド及びキメラ配列等のｒＡＡＶは、１つ又は複数の機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する１つ又は複数の異種ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含むように、当業者に既知の組換え技法を使用して構築され得る。かかるＡＡＶベクターは通常、レスキュー、複製、及び組換えベクターの、ｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングに対する必要に応じて、少なくとも１つの機能性隣接ＩＴＲ配列（複数可）を保持する。したがって、ｒＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングに関してシスで必要とされる配列（例えば、機能性ＩＴＲ配列）を含む。

【0170】

[0190]本明細書で使用する場合、「真実のＡＡＶベクター」又は「真実のｒＡＡＶベクター」という語句は、標的細胞を感染することが可能な異種核酸を含むＡＡＶベクターを指す。この語句は、空のベクター（異種核酸を含まない）、及び完全挿入物（例えば、異種核酸断片）を欠如しているＡＡＶベクター又は宿主細胞核酸を含有するＡＡＶベクターを排除する。

【0171】

[0191]「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指す。

【0172】

[0192]核酸として、ゲノムｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、及びスプライシングされたか、若しくはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子又は短分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子又は短分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。

【0173】

[0193]核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及び意図的に改変又は変更されたポリヌクレオチドを包含する。核酸は、一本鎖、二重鎖、又は三重鎖であってもよく、直鎖状又は環状であってもよく、任意の長さを有し得る。核酸について論述する際、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向で配列を提供するという慣例に従って、本明細書に記載され得る。

【0174】

[0194]「異種」核酸配列は、ポリヌクレオチドの、細胞へのベクター媒介性の導入／送達の目的で、ＡＡＶプラスミド又はベクターへ挿入されるヌクレオチドを指す。異種核酸配列は、ＡＡＶ核酸とは異なり、即ち、ＡＡＶ核酸に関して自然ではない。細胞へ導入／送達されると、ベクター内に含有される異種核酸配列は、発現され得る（例えば、転写されて、適切な場合に翻訳される）。或いは、ベクター内に含有される、細胞における導入／送達された異種ポリヌクレオチドは、発現されなくてもよい。「異種」という用語は、本明細書で必ずしも、核酸配列及びポリヌクレオチドに関して使用されるわけではなく、核酸配列及びポリヌクレオチドに関する言及は、修飾語「異種」の非存在下でさえ、省略にもかかわらず、異種核酸配列及びポリヌクレオチドを包含すると意図される。

【0175】

[0195]「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞若しくは生物へ導入されると意図されるか、又は導入された核酸を利便性良く指すのに使用される。導入遺伝子は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸等の任意の核酸を包含する。導入遺伝子及び異種核酸／ポリヌクレオチド配列は、本明細書で交換可能に使用される。

【0176】

[0196]導入遺伝子を有する細胞において、導入遺伝子は、プラスミド又はＡＡＶベクター、細胞の「形質導入」又は「トランスフェクション」によって導入／移入されている。「形質導入する」及び「トランスフェクトする」という用語は、核酸等の分子の、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）又は生物の細胞若しくは臓器への導入を指す。導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸へ組み込まれてもよく、又は組み込まれなくてもよい。

【0177】

[0197]「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「異種核酸」、「導入遺伝子」及び「ＣｐＧが低減された核酸配列」は、完全長配列、並びに部分配列が、完全長配列のある程度の機能性を保持する限りは、機能性部分配列を包含する。核酸、ポリヌクレオチド、異種核酸、導入遺伝子及びＣｐＧが低減された核酸配列。

【0178】

[0198]異種核酸等の「核酸配列」によってコードされる「ポリヌクレオチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、天然に存在するタンパク質のような完全長配列、並びに部分配列、改変形態又はバリアントが、完全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限りは、機能性部分配列、改変形態又は配列バリアントを包含する。核酸配列によってコードされるかかるポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、治療される哺乳動物において、欠乏しているか、又はその発現が不十分あるか、又は欠損している内因性タンパク質と同一であってもよいが、同一である必要はない。

【0179】

[0199]「宿主細胞」は、ＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶヘルパー構築物、アクセサリー機能ベクター、又は他のトランスファーＤＮＡとして使用され得るか、又は使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされている元の細胞の子孫を包含する。したがって、「宿主細胞」は概して、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然の変異、偶発的な変異、又は計画的な変異に起因して、元の親と、形態が、又はゲノム又は総ＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。例示的な宿主細胞として、ＨＥＫ２９３等のヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。

【0180】

[0200]「形質導入細胞」は、導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入」細胞は、外因性分子、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）の、細胞への取込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入」細胞は、外因性核酸が導入されている細胞、又はその子孫である。細胞（複数可）は、伝播（培養）され、導入されたタンパク質は発現され、又は核酸は転写され、或いはｒＡＡＶ等のベクターは、細胞によって産生され得る。遺伝子療法の使用及び方法に関して、形質導入細胞は、臓器又は組織を含むことができ、順に対象に存在し得る。

【0181】

[0201]本明細書で使用する場合、細胞に関連して「安定な」、又は「安定に組み込まれる」という用語は、選択可能なマーカー又は異種核酸配列等の核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターが、染色体に挿入されている（例えば、相同組換え、非相同末端再結合、トランスフェクション等によって）か、又は染色体外でレシピエント細胞又は宿主生物において維持されて、ある期間、染色体において残存しているか、又は染色体外で維持されることを意味する。

【0182】

[0202]「細胞株」は、適切な培養条件下での連続的な、又は長期の成長及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの分裂が可能な細胞の集団を指す。細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団であり得るが、そうである必要はない。細胞株において、自発的又は誘導変化が、かかるクローン集団の保管又は移入中に、並びに組織培養における長期の継代培養中に核型で起こり得る。したがって、細胞株から得られる子孫細胞は、祖先細胞又は培養物と正確に同一でなくてもよい。本発明の精製方法に適用可能な例示的な細胞株は、ＨＥＫ２９３である。

【0183】

[0203]「発現制御エレメント」は、作動可能に連結されている核酸の発現に影響を及ぼす核酸配列（複数可）を指す。制御エレメントとして、プロモーター及びエンハンサー等の本明細書に記載の発現制御エレメントが挙げられる。ｒＡＡＶベクターは、１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含み得る。通常、かかるエレメントは、適正な異種ポリヌクレオチド転写、及び適切な場合には翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン用のスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正確なリーディングフレーム、及び停止コドン等）。かかるエレメントは通常、シスで作用し、「シス作用性」エレメントと称されるが、トランスでも作用し得る。

【0184】

[0204]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで達成され得る。通常、転写を調節する発現制御エレメントは、転写される核酸の５’末端付近に（即ち、「上流に」）並置される。発現制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端に（即ち、「下流に」）、又は転写物内に（例えば、イントロンにおいて）位置され得る。発現制御エレメント（例えば、ＣｐＧが低減されたＴＴＲ、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ、ＦＧＧ、アルブミン、及びＳＡＡ１プロモーター並びにそれらの融合体／ハイブリッド）は、転写される配列に隣接して、又は転写される配列から少し離れて（例えば、ポリヌクレオチドから１個～１０個、１０個～２５個、２５個～５０個、５０個～１００個、１００個～５００個、以上のヌクレオチド）、さらには５’末端若しくは３’末端からかなり離れて位置され得る。それにもかかわらず、ｒＡＡＶベクターの長さ制限により、発現制御配列は通常、転写される核酸から１個～１０００個のヌクレオチド以内に存在する。

【0185】

[0205]機能上、作動可能に連結されている核酸の発現は、エレメントが、核酸の転写、及び適切である場合には転写物の翻訳を調節するように、少なくとも幾分、エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー等）によって制御可能である。発現制御エレメントの具体例は、プロモーターであり、プロモーターは通常、転写される配列の５’に位置付けられる。プロモーターは通常、プロモーターが存在しない場合に発現される量（存在する場合）と比較して、作動可能に連結されている核酸からの発現を増加させる。

【0186】

[0206]プロモーターの例として、本明細書に開示されるＴＴＲプロモーターのＣｐＧが低減されたバージョン及びハイブリッド形態を含む、ＴＴＲ及びＡｐｏＥ／ｈＡＡＴプロモーターが挙げられる。プロモーターのさらなる例として、それらのＣｐＧが低減されたバージョン及びハイブリッド形態を含む、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ、ＦＧＧ、アルブミン、及びＳＡＡ１プロモーターが挙げられる。

【0187】

[0207]「エンハンサー」は本明細書で使用する場合、異種核酸配列等の核酸配列に隣接して位置付けられる配列を指し得る。エンハンサーエレメントは通常、プロモーターエレメントの上流（５’）に位置付けられるが、配列の下流（３’）、又は配列内でも機能を果たし、位置付けられ得る。したがって、エンハンサーエレメントは、選択可能マーカー、及び／又は治療用タンパク質若しくはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸の上流に又は下流に、例えば、１００個の塩基対、２００個の塩基対、又は３００個若しくはそれよりも多い塩基対内に位置付けられ得る。エンハンサーエレメントは通常、プロモーターエレメントによって付与される発現を上回る、作動可能に連結されている核酸の発現を高める。

【0188】

[0208]「作動可能に連結されている」という用語は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現を達成するように、配列に対して適切な位置で配置されることを意味する。この同じ定義が場合によっては、発現ベクター、例えばｒＡＡＶベクターにおける核酸配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）の配置に適用される。

【0189】

[0209]核酸と作動可能に連結している発現制御エレメントの例において、その関係性は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようである。より詳細には、例えば、作動可能に連結されている２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の少なくとも一方が、他方の配列に対して調節効果を発揮することが可能であるような関係性で、２つのＤＮＡが配置される（シス又はトランス）ことを意味する。

【0190】

[0210]したがって、ベクターのさらなるエレメントとして、発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終結シグナル又は停止コドン、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ又は複数のコピー等の配列（例えば、異種配列）に隣接する５’又は３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、或いはイントロンが挙げられるが、限定されない。

【0191】

[0211]さらなるエレメントとして、例えばパッケージングを改善させて、混入している核酸の存在を低減させるための、例えばフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられる。ＡＡＶベクターは通常、一般的に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、又はそれよりもわずかに大きいサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入物を受容する。したがって、より短い配列に関しては、ｒＡＡＶ粒子へのベクターパッケージングに許容できるウイルスゲノム配列の正常サイズ付近に、又は正常サイズで、長さを調節するためにスタッファー又はフィラーを包含する。ある特定の実施形態において、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７ｋｂ未満の核酸配列に関して、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わせる（例えば、ベクターに挿入される）と、約３．０ｋｂ～５．５ｋｂ、又は約４．０ｋｂ～５．０ｋｂ、又は約４．３ｋｂ～４．８ｋｂの総長を有する長さを有する。

【0192】

[0212]野生型の異種核酸又は導入遺伝子が、ＡＡＶベクター粒子内にパッケージングされるには大きすぎる場合、治療用タンパク質若しくは核酸産物等の機能性タンパク質又は核酸産物が最終的に提供されるように、異種核酸は、ＡＡＶベクターにおけるパッケージング及びＡＡＶベクターによる送達のために、改変形態、断片化形態又は切断形態で提供され得る。

【0193】

[0213]ある特定の実施形態において、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸は、改変形態若しくは切断形態で提供されるか、又は異種核酸は、別々の多重ＡＡＶベクターによって送達される多重構築物で提供される。

【0194】

[0214]ある特定の実施形態において、コード異種ポリヌクレオチドが、ＡＡＶベクターにおけるパッケージングのためにサイズが低減されるように、異種核酸は、機能に必要な部分の除去を含む、コードされたタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の機能性を維持する切断バリアントとして提供される。

【0195】

[0215]ある特定の実施形態において、異種核酸は、スプリットＡＡＶベクターにおいて提供され、それぞれが、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の異なる部分をコードする核酸を提供し、したがって、細胞において会合及び機能するタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の多重部分を送達する。

【0196】

[0216]ある特定の実施形態において、異種核酸は、重複、トランススプライシング又はハイブリッドトランススプライシング二重ベクター技術を使用して、二重ＡＡＶベクターによって提供される。ある特定の実施形態において、細胞において組み合わさり、完全発現カセットを生成する２つの重複するＡＡＶベクターが使用され、そこから、完全長タンパク質（例えば、治療用タンパク質）が発現される。

【0197】

[0217]「同一性」、「相同性」という用語及びそれらの文法的変形は、２つ以上の参照物体が、「アラインされた」配列である場合に、それらが同じであることを意味する。したがって、例として、２つのポリペプチド配列が同一である場合、２つのポリペプチド配列は、少なくとも参照領域又は部分内で、同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、２つのポリヌクレオチドは、少なくとも参照領域又は部分内で、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列の規定区域（領域又はドメイン）にわたるものであり得る。同一性の「区域」又は「領域」は、同じである２つ以上の参照物体の一部を指す。したがって、２つのタンパク質又は核酸配列が、１つ又は複数の配列の区域又は領域にわたって同一である場合、２つのタンパク質又は核酸配列は、当該領域内で同一性を共有する。「アラインされた」配列は、参照配列と比較して、欠けているか、若しくはさらなる塩基又はアミノ酸（ギャップ）に関する補正を含有する場合が多い、多重ポリヌクレオチド又はタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

【0198】

[0218]同一性は、配列の全長又は一部にわたって広がり得る。ある特定の実施形態において、パーセント同一性を共有する配列の長さは、２個、３個、４個、又は５個以上の近接核酸又はアミノ酸、例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個等の近接核酸又はアミノ酸である。ある特定の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、２１個以上の近接核酸又はアミノ酸、例えば、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個等の近接核酸又はアミノ酸である。ある特定の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、４１個以上の近接核酸又はアミノ酸、例えば、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個等の近接核酸又はアミノ酸である。ある特定の実施形態において、同一性を共有する配列の長さは、５０個以上の近接核酸又はアミノ酸、例えば、５０個～５５個、５５個～６０個、６０個～６５個、６５個～７０個、７０個～７５個、７５個～８０個、８０個～８５個、８５個～９０個、９０個～９５個、９５個～１００個、１００個～１５０個、１５０個～２００個、２００個～２５０個、２５０個～３００個、３００個～５００個、５００個～１，０００個等の近接核酸又はアミノ酸である。

【0199】

[0219]本明細書に記載されるように、ハイブリッド形態を含むＣｐＧが低減されたプロモーター等の核酸バリアントは、野生型とは異なるが、野生型プロモーターに対して配列同一性を示し得る。ハイブリッド形態を含むＣｐＧが低減されたプロモーターにおいて、ヌクレオチド配列レベルで、ＣｐＧが低減されたプロモーターは典型的には、野生型プロモーターと少なくとも約７０％同一、より典型的には少なくとも約７５％同一、さらに典型的には約８０％～９０％同一である。例えば、ＣｐＧが低減されたプロモーターは、野生型プロモーターに対して７０％～９９％同一性を有し得る。したがって、ＣｐＧが低減されたプロモーターは、野生型プロモーターに対して７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、７５％～９９％同一性を有し得る。

【0200】

[0220]アミノ酸配列レベルで、バリアントＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質等のバリアントは、参照配列と少なくとも約７０％同一、より典型的には少なくとも約７５％同一、又は約８０％同一、さらに典型的には約８５％同一、又は約９０％同一である。ある特定の実施形態において、バリアントＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質等のバリアントは、参照配列、例えばＢドメインを有するか、又は有さない野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有し得る。

【0201】

[0221]「相同的な」又は「相同性」という用語は、２つ以上の参照物体が、所与の領域又は一部にわたって少なくとも部分的に同一性を共有することを意味する。相同性又は同一性の「区域、領域又はドメイン」は、２つ以上の参照物体の一部が、相同性を共有するか、又は同じであることを意味する。したがって、２つの配列が、１つ又は複数の配列領域にわたって同一である場合、２つの配列は、これらの領域において同一性を共有する。「実質的な相同性」は、分子が相同性を共有する参照分子、又は参照分子の関連／相当する領域若しくは一部の構造又は機能（例えば、生物学的機能又は活性）のうちの１つ又は複数の少なくとも部分的な構造又は機能を有するか、又は有すると予測されるように、分子が、構造的に、又は機能的に保存されることを意味する。

【0202】

[0222]２つの配列間の同一性（相同性）の程度又は「パーセント同一性」は、コンピュータプログラム及び／又は数学的アルゴリズムを使用して確かめることができる。本発明の目的で、核酸配列の比較は、ウィスコンシン州のマディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１を使用して実施される。利便性のため、当該プログラムによって明記されるデフォルトパラメーター（ギャップ創製ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）が、配列同一性を比較するために本明細書で使用するためのものである。或いは、デフォルトパラメーターを用いてギャップ付与された（ｇａｐｐｅｄ）アラインメントを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／でワールドワイドウェブに見出される；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３～４１０頁）によって提供されるＢｌａｓｔｎ ２．０プログラムを使用して、核酸配列及びアミノ酸配列間の同一性並びに類似性のレベルを決定してもよい。ポリヌクレオチド配列比較に関して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは通常、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＢＬＯＳＵＭ ５０等のスコアリング行列と組み合わせて使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムもまた、同一性の程度を定量化するのに使用される（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １３２：１８５頁（２０００）年；及びＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５頁（１９８１年））。ドロネーベースのトポロジカルマッピングを使用したタンパク質構造類似性を定量化するためのプログラムもまた開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０頁（２００３年））。

【0203】

[0223]「治療用タンパク質」は、ある特定の実施形態において、細胞又は対象における不十分な量のタンパク質、タンパク質の非存在又は欠陥に起因する症状を軽減若しくは軽減し得るペプチド又はタンパク質である。導入遺伝子によってコードされる「治療用」タンパク質は、例えば、遺伝的欠陥を補正するため、遺伝子（発現又は機能の損失）欠損を補正するため、などの対象に対する有益性を付与することができる。

【0204】

[0224]例えば、限定されずに、本発明により有用な遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸として、血友病Ａ、阻害抗体を有する血友病Ａ患者、血友病Ｂ、阻害抗体を有する血友病Ｂ、任意の血液凝固因子：第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子の欠損症、複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ－カルボキシラーゼ欠損症等の「うっ血」又は血液凝固（出血）障害；貧血；外傷、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に関連付けられる出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓薬（即ち、ＦＸａ阻害剤）と関連付けられる過剰な抗凝固；並びにベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症及び貯蔵プール欠損症等の血小板障害が挙げられるが、これらに限定されない疾患又は障害の治療において使用され得るものが挙げられる。ある特定の実施形態において、対象は、血液凝固障害を有する。ある特定の実施形態において、対象は、血友病Ａ、阻害抗体を有する血友病Ａ患者、血友病Ｂ、阻害抗体を有する血友病Ｂ、任意の凝固因子：第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子の欠損症、又は複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症又はガンマ－カルボキシラーゼ欠損症を有する。

【0205】

[0225]ある特定の実施形態において、対象は、例えば、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血障害（例えば、阻害剤を伴うか、若しくは伴わない血友病Ａ又は血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例えば、貧血）、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ））、神経障害（例えば、癲癇）、リソソーム蓄積症（例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症２型（ＣＬＮ２）、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤＩＩＩ、コーリ病）；ガングリオシドモノシアル酸２（ＧＭ２）－ガングリオシドーシスＩ型（テイ・サックス病）、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、ムコリピドーシスＩ型（シアリドーシスＩ型及びＩＩ型）、ムコリピドーシスＩＩ型（Ｉ細胞病）、ムコリピドーシスＩＩＩ型（偽ハーラー病）及びムコリピドーシスＩＶ型、コ多糖貯留疾患（ハーラー病及びその異形、ハンター、サンフィリポＡ型、サンフィリポＢ型、サンフィリポＣ型、サンフィリポＤ型、モルキオＡ型及びモルキオＢ型、マラトー・ラミー及びスライ疾患）、ニーマン・ピック疾患Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピックＣ１型及びニーマン・ピック疾患Ｃ２型、並びにシンドラー病Ｉ型及びＩＩ型）、炎症性障害（例えば、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ））、銅又は鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病又はメンケス病）、リソソーム酸リパーゼ欠損症、癌、１型又は２型糖尿病、アデノシンデアミラーゼ欠損症、代謝性疾患又は障害（例えば、糖原病、メチルマロン酸血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、低ホスファターゼ血症、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＶＬＣＡＤ）、ガラクトース血症）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、セリアック病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、免疫血小板減少症（（ＩＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病）、アジソン病、重症筋無力症）、実質臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、又は感染性ウイルス疾患（例えば、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等）疾患、細菌疾患若しくは真菌疾患を含む疾患又は障害を有する。

【0206】

[0226]ある特定の実施形態において、対象は、中枢神経系（ＣＮＳ）を侵すか、又は中枢神経系（ＣＮＳ）に起源をもつ疾患を有する。ある特定の実施形態において、疾患は、神経変性疾患である。ある特定の実施形態において、ＣＮＳ又は神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性方麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、ポリグルタミンリピート病、又はパーキンソン病である。ある特定の実施形態において、ＣＮＳ又は神経変性疾患は、ポリグルタミンリピート病である。ある特定の実施形態において、ポリグルタミンリピート病は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、又はＳＣＡ１７）である。

【0207】

[0227]アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、脂質輸送及び脳損傷修復に関与する主要なコレステロール担体である。ヒトＡｐｏＥアイソフォームは、ｉｎ ｖｉｖｏでアミロイド－β（Ａβ）のクリアランス又は合成に差次的に影響を及ぼすと示唆されている。ＡｐｏＥのイプシロン４（ε４）対立遺伝子は、アルツハイマー病（ＡＤ）のリスクの増大と関連付けられており、ＡｐｏＥ ε２対立遺伝子の存在は、ＡＤリスクを減少させるようであり、防御的ＡｐｏＥアイソフォームである。本明細書で使用する場合、「防御的ＡｐｏＥアイソフォーム」という用語は、アルツハイマー病の１つ又は複数の症状又は兆候（例えば、物理的、生理学的、生化学的、組織学的、行動学的）を減少させるＡｐｏＥアイソフォームを指す。防御的ＡｐｏＥアイソフォームはまた、少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれよりも高く、アルツハイマー病のリスクを低減させることができるＡｐｏＥアイソフォームを指す。

【0208】

[0228]ある特定の実施形態において、本発明は、対象の非ＣＮＳ細胞、臓器又は組織への送達又は投与（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳への送達ではない）により、防御的ＡｐｏＥアイソフォーム（例えば、ＡｐｏＥ ε２）を、対象（例えば、哺乳動物）のＣＮＳへ送達する方法を提供する。

【0209】

[0229]ある特定の実施形態において、非ＣＮＳ細胞（例えば、肝臓細胞）が、防御的ＡｐｏＥアイソフォームを、対象の体循環（血管系及び血管）へ分泌するように、ＡＡＶキャプシドタンパク質と、防御的ＡｐｏＥアイソフォーム（例えば、ＡｐｏＥ ε２）をコードする核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子は、対象（例えば、哺乳動物）において非ＣＮＳ細胞（例えば、肝臓細胞）を形質導入するのに有効な様式で、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対間に挿入される。循環中の防御的ＡｐｏＥアイソフォームは、血液脳関門を通過して、ＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質）に入る。

【0210】

[0230]ある特定の実施形態において、本発明は、肝臓において、又は肝臓細胞において発現される防御的ＡｐｏＥアイソフォーム（例えば、ＡｐｏＥ ε２）をコードするベクター、発現カセット又は核酸を提供する。

【0211】

[0231]ある特定の実施形態において、異種核酸は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジソック及びチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0212】

[0232]ある特定の実施形態において、異種核酸配列は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１～ＩＬ－３６）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及び腫瘍壊死因子β、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ ＭＨＣ分子及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0213】

[0233]ある特定の実施形態において、異種核酸は、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節因子タンパク質）、血液凝固（凝固）因子（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣ等）、機能血液凝固因子の獲得、抗体、網膜色素上皮特異的な６５ｋＤａのタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロブリン、α－グロブリン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、増殖因子、インスリン様増殖因子１又はインスリン様増殖因子２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子－３及び神経栄養因子－４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α及びトランスフォーミング増殖因子β、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬物耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、免疫寛容原性若しくは免疫原性のペプチド又はタンパク質であるＴｒｅｇｉｔｏｐｅ又はｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン（ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ））、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６聴覚消失）、ＡＣＨＭ２、ＡＣＨＭ３及びＡＣＨＭ４（色覚異常）、ＰＫＤ－１又はＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カプテシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ニーマン・ピックＣ１（ＮＰＣ１）、ＶＰＣ２、スフィンド脂質活性化タンパク質、ゲノム編集のための１つ又は複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びゲノム編集のための修復鋳型として使用される１つ又は複数のドナー配列をコードする。

【0214】

[0234]ある特定の実施形態において、異種核酸によってコードされるタンパク質は、遺伝子編集ヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。ある特定の実施形態において、遺伝子編集ヌクレアーゼは、機能性ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む。

【0215】

[0235]本発明とともに使用されてもよく、また任意選択で、肝臓又は肝臓細胞（例えば、肝細胞）において発現されて、有益性を提供し得る遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）をコードする他の異種核酸として、例えば、ポンペ病用のＧＡＡ（酸性アルファ－グルコシダーゼ）；ウィルソン病の治療用のＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰアーゼ２）；ファブリー病の治療用のアルファガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）；シトルリン血症１型の治療用のＡＳＳ１（アルギノコハク酸シンターゼ）；ゴーシェ病１型の治療用のベータ－グルコセレブロシダーゼ；テイ・サックス病の治療用のベータ－ヘキソサミニダーゼＡ；遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の治療用のＳＥＲＰＩＮＧ１（Ｃ１プロテアーゼ阻害剤、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１Ｅ１））；糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）の治療用のグルコース－６－ホスファターゼ；糖原病ＩＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩＩ、コーリ病）の治療用のグリコーゲン－脱分岐酵素（ＧＤＥ）；ニーマン・ピック病の治療用のニーマン・ピックＣ１タンパク質（ＮＰＣ細胞内コレステロール輸送体１、ＮＰＣ１）；貧血の治療用のエリスロポエチン（ＥＰＯ）；各種免疫障害、ウイルス感染及び癌の治療用のインターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、並びにインターフェロン－ガンマ；各種炎症性疾患又は免疫不全の治療用のＩＬ－１～ＩＬ－３６のいずれか１つを含むインターロイキン（ＩＬ）及び相当する受容体；免疫障害の治療用のケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＸＣＬ５）を含むケモカイン；クローン病等の免疫障害の治療用の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；各種ヒト炎症性疾患の治療用の顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；各種ヒト炎症性疾患の治療用のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；上皮組織損傷の治療用のケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；反復性流産、ＨＩＶ関連の合併症、及びインスリン抵抗性の治療用の単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）等のケモカイン；各種免疫障害の治療用の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び受容体；肺気腫又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療用のアルファ１－アンチトリプシン；ムコ多糖症Ｉ（ＭＳＰ Ｉ）の治療用のアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ；ＯＴＣ欠損症の治療用のオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）；フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）又はフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）；リポタンパク質リパーゼ欠損症の治療用のリポタンパク質リパーゼ；アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ａ－Ｉ欠損症の治療用のアポリポタンパク質；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の治療用の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）；低アルブミン血症の治療用のアルブミン；レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）；カルバモイルシンターゼＩ；アルギニノコハク酸シンテターゼ；アルギニノコハク酸リアーゼ；アルギナーゼ；フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；ホモシスチン尿症の治療用のシスタチオニンベータ－シンターゼ；分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ；イソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；プロピオニルＣｏカルボキシラーゼ；メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；インスリン；ピルビン酸カルボキシラーゼ；肝ホスホリラーゼ；ホスホリラーゼキナーゼ；グリシンデカルボキシラーゼ；Ｈ－タンパク質；Ｔ－タンパク質；嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）；シュタルガルト病の治療用のＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４（ＡＢＣＡ４）；及びジストロフィンが挙げられるが、限定されない。

【0216】

[0236]ある特定の実施形態において、対象は、自己免疫疾患又は障害（例えば、多発性硬化症、抗ＭＡＧ末梢神経障害、１型糖尿病、ブレーブス病、関節リウマチ、プロテオグリカン誘導性関節炎（ＰＧＩＡ）又は重症筋無力症）、アレルギー又はアレルギー疾患を有する。

【0217】

[0237]成熟ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、脂質二重層と関連付けられる。ＭＯＧは、ＩｇＶ様細胞外ドメイン、シングルバイパス膜貫通タンパク質、膜結合性ドメイン、及び細胞質側末端を特徴とする。細胞外ＩｇＶ様ドメインは、本明細書でミニ－ＭＯＧ（ｍＭＯＧ）と示される。ＭＯＧは主に、オリゴデンドロサイトの膜において見出され、ミエリンの最終組成に多少寄与する。ＭＯＧに対する自己免疫応答は、多発性硬化症の発症及び病因と関係している。

【0218】

[0238]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、望ましくない抗原と、細胞分泌用のリーダー配列とを含む融合タンパク質である。

【0219】

[0239]ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、ＭＯＧの細胞外ドメイン、又はその断片と、細胞分泌用のリーダー配列とを含む融合タンパク質である。

【0220】

[0240]ある特定の実施形態において、発現カセットは、望ましくない抗原と、細胞分泌用のリーダー配列とを含む融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている調節エレメントを含む。

【0221】

[0241]ある特定の実施形態において、望ましくない抗原は、セルフ抗原、自己抗原、又はセルフ抗原若しくは自己抗原に対して構造的類似性又は配列同一性を有するタンパク質又はペプチドを含む。ある特定の実施形態において、セルフ抗原若しくは自己抗原に対して構造的類似性又は配列同一性を有するタンパク質又はペプチドは、微生物タンパク質又はペプチドである。ある特定の実施形態において、望ましくない抗原は、アレルゲンを含む。

【0222】

[0242]ある特定の実施形態において、アレルゲンは、植物、昆虫、又は動物アレルゲンを含む。ある特定の実施形態において、望ましくない抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテリピドタンパク質（ＰＬＰ）、又はそれらの部分配列を含む。

【0223】

[0243]ある特定の実施形態において、ＭＯＧは、その膜貫通ドメインの全て又は一部を欠如している。ある特定の実施形態において、ＭＯＧは、成熟ＭＯＧの１～１１７番目のアミノ酸を含むか、又はそれらからなる。ある特定の実施形態において、ＭＯＧ部分配列は、その細胞外ドメインの部分配列又はその膜貫通ドメインの部分配列である。ある特定の実施形態において、ＭＯＧは、成熟ＭＯＧの３５～５５番目のアミノ酸、１１８～１３２番目のアミノ酸、１８１～１９５番目のアミノ酸、又は１８６～２００番目のアミノ酸を含むか、又はそれらからなる。ある特定の実施形態において、ＭＯＧは、成熟ＭＯＧの１～２０番目のアミノ酸、１１～３０番目のアミノ酸、２１～４０番目のアミノ酸、３１～５０番目のアミノ酸等を含むか、又はそれらからなる。

【0224】

[0244]ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物における望ましくない抗原に対する細胞媒介性又は抗体媒介性の免疫応答を抑制、低減、又は阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書に記載の発現カセット、粒子、又は医薬組成物若しくはＬＮＰ組成物を用意するステップと、望ましくない抗原に対する細胞媒介性又は抗体媒介性の免疫応答を抑制するか、低減するか、又は阻害するのに十分な量の発現カセット、粒子、又は医薬組成物若しくはＬＮＰ組成物を哺乳動物（融合タンパク質は、該哺乳動物において発現される）に投与するステップとを含む。

【0225】

[0245]ある特定の実施形態において、本発明は、望ましくない抗原に対して、哺乳動物において寛容を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書に記載の発現カセット、粒子、又は医薬組成物若しくはＬＮＰ組成物を用意するステップと、望ましくない抗原に対して、寛容を誘導するのに十分な量の発現カセット、粒子、又は医薬組成物若しくはＬＮＰ組成物を哺乳動物（融合タンパク質は、該哺乳動物において発現される）に投与するステップとを含む。

【0226】

[0246]ある特定の実施形態において、本発明は、融合タンパク質を必要とする対象（例えば、ヒト）を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書に記載の発現カセット、粒子、又は医薬組成物若しくはＬＮＰ組成物を用意するステップと、ある量の発現カセット、粒子、又は医薬若しくはＬＮＰ組成物を対象（例えば、ヒト）（融合タンパク質は、該対象において発現される）に投与するステップとを含む。

【0227】

[0247]ある特定の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、自己免疫疾患又は障害を有する。ある特定の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、アレルギー又はアレルギー疾患又は障害を有する。

【0228】

[0248]ある特定の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、多発性硬化症、抗ＭＡＧ末梢神経障害、１型糖尿病、グレーブス病、関節リウマチ、プロテオグリカン誘導性関節炎（ＰＧＩＡ）又は重症筋無力症を有する。

【0229】

[0249]本明細書では、「望ましくない抗原」は、抗原自体又は抗原の全て若しくは一部を含むタンパク質に対する免疫寛容を誘導、提供、増強及び／又は刺激することが可能であり、及び／又は抗原自体又は抗原の全て若しくは一部を含むタンパク質に対して誘導される免疫応答を抑制、阻害、低減及び／又は減少するセルフ抗原又は自己抗原である。望ましくない抗原はまた、本明細書で使用する場合、アレルゲンに対する免疫寛容を誘導、提供、増強及び／又は刺激することができるアレルゲン若しくはアレルゲン性抗原、並びにアレルゲン若しくはアレルゲンを含む物体に対して誘導される免疫応答を抑制、阻害、低減及び／又は減少するアレルゲン及びアレルゲン性抗原を含む。

【0230】

[0250]本明細書に記載の望ましくない抗原はまた、対象へのそれらの移植後に、細胞、組織又は臓器の拒絶反応を招き得る同種異形抗原又は移植抗原又はマイナー組織適合性抗原を包含する。対象は通常、移植された細胞、組織又は臓器を異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）として認識して、細胞、組織又は臓器に対する免疫応答を発現する。したがって、本発明の方法は、対象への移植後に、細胞、組織又は臓器の拒絶反応を防止又は低減することに関する。

【0231】

[0251]いかなる理論又は特定のメカニズムによっても拘束されることを望まないが、望ましくない抗原は、Ｔ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）に結合するか、又はそれらを活性化することによって機能して、それにより、免疫応答を防止、抑制、阻害、低減、減少、又はそうでなければダウンレギュレートすると考えられる。この、Ｔｒｅｇへの結合又はＴｒｅｇの活性化は、次に、セルフ抗原又は自己抗原に対する免疫寛容化（ｔｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を引きこし得る。

【0232】

[0252]本明細書で使用される場合、「リーダー」配列は、タンパク質に連結されると、それが発現される細胞からの連結されたタンパク質の分泌を提供又は促進するアミノ酸配列である。リーダー配列は、本明細書で使用される場合、分泌配列としても称され得る。かかるリーダー配列及び分泌配列は、細胞分泌を提供又は促進すると意図されるが、それらが、タンパク質の分泌を防止し得るシグナル配列を有するタンパク質に連結されている場合、必ずしも分泌を促進するとは限らない場合がある。

【0233】

[0253]ある特定の実施形態において、望ましくない抗原は、自己免疫疾患タンパク質又はその部分配列を含む。自己免疫疾患タンパク質は、自己免疫疾患の開始及び／又は進行に寄与する任意の抗原（例えば、タンパク質、その部分配列、又はペプチド）を包含する。他の生物由来のタンパク質の配列又は構造は、セルフ抗原又は自己抗原に似ているので、かかる自己免疫疾患タンパク質は、微生物等の他の生物に由来し得る。

【0234】

[0254]ある特定の実施形態において、自己免疫疾患タンパク質は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ、例えば、多発性硬化症用）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、例えば、多発性硬化症用）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ、多発性硬化症用）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ、抗ＭＡＧ末梢神経障害用）、インスリン（例えば、１型糖尿病用）、膵島特異的なグルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ、例えば、１型糖尿病用）、プレプロインスリン（例えば、１型糖尿病用）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、例えば、１型糖尿病用）、チロシンホスファターゼ様自己抗原（例えば、１型糖尿病用）、インスリノーマ抗原－２（例えば、１型糖尿病用）、膵島細胞抗原（例えば、１型糖尿病用）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（例えば、グレーブス病用）、サイロトロピン受容体（例えば、グレーブス病用）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（例えば、関節リウマチ用）、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＧＲＶＲＶＮＳＡＹ）（例えば、プロテオグリカン誘導性の関節炎（ＰＧＩＡ）又は関節リウマチ用）、又はアセチルコリン受容体（例えば、重症筋無力症用）である。

【0235】

[0255]ある特定の実施形態において、自己免疫疾患タンパク質は、哺乳動物ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、又はそれらの部分配列である。幾つかの実施形態において、自己免疫疾患タンパク質は、ヒトタンパク質、例えばヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ヒトプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ヒトミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、又はそれらの部分配列である。

【0236】

[0256]本発明による有用な遺伝子産物をコードする他の異種核酸として、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、増強されたＧＦＰ、増強されたＹＦＰ、光で活性化可能なＧＦＰ、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）蛍光タンパク質（ｄｓＲｅｄ）、ｍＦｒｕｉｔｓ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＴａｇＲＦＰ、ｅｑＦＰ６１１、光で切り換え可能な（ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ）蛍光タンパク質（例えば、Ｄｒｏｎｐａ及びＥｏｓＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Ｈａｌｏ－タグ融合タンパク質、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びベータ－ガラクトシダーゼ等のレポーター又は検出可能なマーカーが挙げられるが、限定されない。

【0237】

[0257]ある特定の実施形態において、異種核酸は、阻害ＤＮＡを含むか、又は阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードする。阻害ＲＮＡの例として、例えば、低分子又は短分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子又は短分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡが挙げられるが、限定されない。

【0238】

[0258]ある特定の実施形態において、異種核酸は、阻害核酸をコードする。ある特定の実施形態において、阻害核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、阻害核酸は、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（アトロフィン１、ＡＴＮ１）と関連付けられる遺伝子であるハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子；球脊髄性萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体；脊髄小脳失調症（１型、２型、３型、６型、７型、８型、１２型、１７型）におけるヒトアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、及びアタキシン－７、Ｃａ_ｖ２．１ Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ－結合タンパク質、アタキシン８逆ストランド（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、セリン／スレオニン－プロテインホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム；脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１）；脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１）；脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおけるミオトニン－プロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）；フリードライヒ運動失調症におけるフラタキシン；筋委縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジムスターゼ１（ＳＯＤ）；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の発病に関与する遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質コンベルテーゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶ Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子；ＨＩＶ感染におけるＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染におけるＣ－Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染におけるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオキャプシドタンパク質；Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－１２２）；ｐ５３、急性腎障害又は腎臓移植後臓器機能障害又は腎障害急性腎不全；進行性の再発又は転移固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；プロテアソームサブユニットベータ－９型（ＰＳＭＢ ９）としても既知のＬＭＰ２、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータ－８型（ＰＳＭＢ ８）としても既知のＬＭＰ７、転移性黒色腫；プロテアソームサブユニットベータ－１０型（ＰＳＭＢ １０）としても既知のＭＥＣＬ１、転移性黒色腫；固形腫瘍における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質；慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制因子Ｂ－細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ－２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）；Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）；家族性大腸腺腫症におけるベータ－カテニン；アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）又は加齢性黄斑変性におけるＤＮＡ損傷誘導型転写物４タンパク質としても既知のＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性又は脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）；非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ委感染におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／ゲノム配列；ＳＡＲＳ感染における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器合胞体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染におけるＢ型肝炎及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；ＨＳＶ感染における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列；コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシンＡのような遺伝子（ＴＯＲ１Ａ）の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的なサイレンシング）；移植片において特異的な汎クラスＩ及びＨＬＡ対立遺伝子；及び常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）から選択されるポリヌクレオチドリピート病と関連付けられる遺伝子、又は遺伝子の転写物に結合する。

【0239】

[0259]核酸分子、クローニングベクター、発現ベクター等のベクター（例えば、ベクターゲノム）及びプラスミドは、組換えＤＮＡ技術方法を使用して調製され得る。ヌクレオチド配列情報の利用可能性により、様々な手段によって核酸分子の調製が可能となる。例えば、ベクター又はプラスミドを含む異種核酸は、細胞発現又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの移植による様々な標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術、及び化学的合成技法を使用して作製され得る。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動等により決定され得る。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピュータベースのデータベーススクリーニング技法を使用して単離され得る。かかる技法として、（１）相同ヌクレオチド配列を検出するための、プローブを用いたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション、（２）例えば、発現ライブラリーを使用した、共有される構造特性を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング、（３）目的の核酸配列へアニーリングすることが可能なプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、（４）関連配列の配列データベースのコンピュータ検索、及び（５）差し引きされた核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。

【0240】

[0260]本発明の核酸は、任意の利便性の高いクローニングベクターにおいてＤＮＡとして維持され得る。ある特定の実施形態において、クローンは、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞において増殖させたｐＢｌｕｒｓｃｒｉｐｔ又はｐＢｌｕｅｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホヤ、ＣＡ）等のプラスミドクローニング／発現ベクターにおいて維持される。或いは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に適したベクターにおいて維持される。

【0241】

[0261]ｒＡＡＶビリオンを生成するための当業者に既知の方法として、例えば、１つ又は複数のＡＡＶヘルパーウイルス（複数可）（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との同時感染と併せて、ＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー配列を使用したトランスフェクション又は組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及びアクセサリー機能ベクターを用いたトランスフェクションが挙げられる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、限定されずに、米国特許第６，００１，６５０号及び同第６，００４，７９７号に記載されている。組換えｒＡＡＶベクター産生（即ち、ベクター培養系におけるベクター生成）後、ｒＡＡビリオンは、宿主細胞及び細胞培養上清から得ることができ、本明細書に記載されるように精製され得る。

【0242】

[0262]導入遺伝子を含有するｒＡＡＶベクターの感染力価を決定する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｚｈｅｎら、（２００４年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４年）１５：７０９頁）。空キャプシド及びパッケージングされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子に関してアッセイする方法は、既知である（例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９年）６：１３２２～１３３０頁；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３年）７：１２２～１２８頁を参照）。

【0243】

[0263]分解／変性されたキャプシドを決定するために、精製したｒＡＡＶを、３つのキャプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲル（例えば勾配ゲル）と、続いて、試料が分離されるまでゲルを流すことと、ゲルをナイロン又はニトロセルロース膜上にブロットすることとからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。次に、抗ＡＡＶキャプシド抗体は、変性されたキャプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用される（例えば、Ｗｏｂｕｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２０００年）７４：９２８１～９２９３頁を参照）。一次抗体に結合する二次抗体は、一次抗体を検出するための手段を含有する。一次抗体と、二次抗体との間の結合は、半定量的に検出されて、キャプシドの量を決定する。

【0244】

[0264]ｒＡＡＶベクター及び他の組成物、作用物質、薬物、生物製剤（タンパク質）は、医薬組成物に取り込まれ得る。かかる医薬組成物は、とりわけ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの対象への投与及び送達に有用である。

【0245】

[0265]「単離された」という用語は、組成物の修飾語として使用される場合、組成物は、ヒトの手によって作製されるか、或いはそれらの天然に存在するｉｎ ｖｉｖｏ環境から、完全に又は少なくとも部分的に分離されることを意味する。概して、単離された組成物は、それらが通常、本来は関わりのある１つ又は複数の材料、例えば、１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。

【0246】

[0266]タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」という用語が、場合によっては本明細書で使用される。この用語は主に、核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、天然で関連付けられる他のタンパク質と十分に分離されているタンパク質を指し。

【0247】

[0267]「単離された」という用語は、本明細書の組成物又はヒトの手によって産生された組合せ、例えばｒＡＡＶ及び／又は医薬配合物を排除しない。「単離された」という用語はまた、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー等の代替的な物理的形態、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質付加）形態若しくは誘導体化された形態、又はヒトの手によって産生される宿主細胞において発現される形態を排除しない。

【0248】

[0268]「実質的に純粋な」という用語は、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等）を少なくとも５０重量％～６０重量％含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５重量％、又は約９０重量％～９９重量％の目的の組成物を含み得る。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー方法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）によって測定される。

【0249】

[0269]特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列について言及する場合の「から本質的になる」という語句は、所定の配列の特性を有する配列を意味する。例えば、核酸又はアミノ酸配列に関連して使用される場合、この語句は、配列自体、並びに配列の基本的な特徴及び新規特徴に影響を及ぼさない分子修飾を包含する。

【0250】

[0270]ある特定の実施形態において、医薬組成物はまた、薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含有する。かかる賦形剤は、組成物を受容する個体にとって有害な免疫応答をそれ自体が誘導せず、また過度な毒性を伴わずに投与され得る任意の医薬作用物質を包含する。

【0251】

[0271]本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる」及び「生理学的に許容できる」という用語は、投与、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達又は接触の１つ又は複数の経路に適した気体、液体若しくは固体又はそれらの混合物の生物学的に許容できる配合物を意味する。「薬学的に許容できる」又は「生理学的に許容できる」組成物は、生物学的に、又は他の場合で望ましくないわけでない材料であり、例えば、材料は、実質的な望ましくない生物学的影響を引き起こさずに、対象に投与され得る。したがって、かかる医薬組成物は、核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質を対象に投与する際に使用され得る。

【0252】

[0272]薬学的に許容できる賦形剤として、水、生理食塩水、グリセロール、糖及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。また、薬学的に許容できる塩、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩もそこに含まれ得る。さらに、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質は、かかるビヒクル中に存在し得る。

【0253】

[0273]医薬組成物は、塩として提供されてもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が挙げられるが、これらに限定されない多くの酸とともに形成することができる。塩は、相当する遊離塩基形態よりも水性溶媒又はプロトン性溶媒中に可溶性である傾向にある。他の場合では、調製物は、下記の：１ｍＭ～５０ｍＭヒスチジン、０．１％～０．２％スクロース、及び２％～７％マンニトールのいずれか又は全てを含有し得る、使用前に緩衝液と組み合わせられる凍結乾燥粉末であってもよい。

【0254】

[0274]医薬組成物は、薬学的投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの接触若しくは送達に適合性の溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルジョン（例えば、水中油型又は油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散液及び懸濁媒質、コーティング、等張性及び吸収促進剤又は遅延剤を含む。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、沈殿防止剤及び増粘剤を含んでもよい。かかる薬学的に許容できる担体は、錠剤（コーティングされているか、又はコーティングされていない）、カプセル（硬質又は軟質）、ミクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶を含む。補足的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）もまた、組成物に取り込まれ得る。

【0255】

[0275]医薬組成物は、本明細書に記載の、若しくは当業者に既知の投与又は送達の特定の経路に適合性であるように配合され得る。したがって、医薬組成物は、各種経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。

【0256】

[0276]非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性及び非水性の溶液、懸濁液又はエマルジョンを含み、これらの調製物は通常、滅菌であり、対象とされるレシピエントの血液と等張性であり得る。実例として、例えば、水、緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油又は合成油が挙げられるが、限定されない。水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等であるが、限定されない、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。

【0257】

[0277]さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとして、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。任意選択で、懸濁液はまた、高濃縮溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を高める作用物質を含有してもよい。
[0278]共溶媒又は補助剤が、配合物に添加されてもよく、その例として、例えば、水酸基又は他の極性基を含有する共溶媒、例えば、イソプロピルアルコール等のアルコール類；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル等のグリコール類；グリセロール；ポリエチレンアルコール及びポリオキシエチレン
脂肪酸エステルが挙げられるが、限定されない。補助剤の例として、例えば、ダイズレシチン及びオレイン酸等の界面活性剤；トリオレイン酸ソルビタン等のソルビタンエステル；及びポリビニルピロリドンが挙げられるが、限定されない。

【0258】

[0279]医組成物が調製された後、医薬組成物は、適切な容器に入れられて、治療に関して表示され得る。かかる表示には、投与の量、頻度、及び方法が含まれ得る。

【0259】

[0280]本発明の組成物、方法及び使用に適した医薬組成物及び送達系は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３年）第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ＰＡ；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６年）第１２版、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社、ホワイトハウス、ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３年）、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ランカスター、Ｐａ）；Ａｎｓｅｌ及びＳｔｏｋｌｏｓａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１年）第１１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、バルティモア、ＭＤ；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０年）、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３～３１５頁。

【0260】

[0281]ある特定の実施形態において、本発明の核酸、ポリヌクレオチド及び発現カセットは、ＡＡＶベクター粒子により送達又は投与される。ある特定の実施形態において、本発明の核酸、ポリヌクレオチド及び発現カセットは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、ワクシニアウイルス、及びヒトサイトメガロウイルス粒子を含む他のタイプのウイルス粒子により送達又は投与され得る。

【0261】

[0282]ある特定の実施形態において、本発明の核酸、ポリヌクレオチド及び発現カセットは、非ウイルス送達系を用いて送達又は投与される。非ウイルス送達系として、例えば、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、又は細胞外小胞等の化学的な方法及び遺伝子銃、エレクトロポレーション、微粒子銃、超音波の利用及びマグネトフェクション等の物理的な方法が挙げられる。

【0262】

[0283]ある特定の実施形態において、本発明の核酸、ポリヌクレオチド及び発現カセットは、ネイキッドＤＮＡ、ミニサークル、トランスポゾン、又は閉じた末端の直鎖状二重鎖ＤＮＡとして送達される。

【0263】

[0284]ある特定の実施形態において、本発明の核酸、ポリヌクレオチド及び発現カセットは、さらに被包されるか、又はリポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、微粒子、マイクロカプセル、ミセル、若しくは細胞外小胞と複合体形成されるＡＡＶベクター粒子又は他の粒子において送達又は投与される。

【0264】

[0285]「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」は、ＡＡＶの送達に有用であり、ナノスケールの、即ち、約１０ｎｍ～約１０００ｎｍ、又は約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、又は約７５ｎｍ～約１２７ｎｍの寸法を有する脂質ベースの小胞を指す。理論によって拘束されることを望まないが、ＬＮＰは、核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、又はＡＡＶベクターに、免疫系からの部分的又は完全な遮蔽を提供すると考えられる。遮蔽により、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、又はＡＡＶベクターに対する実質的な免疫応答の誘導を回避しながら、核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット、又はＡＡＶベクターの送達が可能となる。遮蔽はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒト等の対象において）、核酸、ポリヌクレオチド、発現カセット又はＡＡＶベクターに対する実質的な免疫応答の誘導を伴わずに、繰返しの投与を可能とし得る。

【0265】

[0286]ＡＡＶのｐＩ（等電点）は、約６～約６．５の範囲である。したがって、ＡＡＶ表面は、わずかに負の電荷を保有する。したがって、例えばアミノ脂質等の陽イオン性脂質を含むことは、ＬＮＰによって有益であり得る。例示的なアミノ脂質は、米国特許第９，３５２，０４２号、同第９，２２０，６８３号、同第９，１８６，３２５号、同第９，１３９，５５４号、同第９，１２６，９６６号、同第９，０１８，１８７号、同第８，９９９，３５１号、同第８，７２２，０８２号、同第８，６４２，０７６号、同第８，５６９，２５６号、同第８，４６６，１２２号、及び同第７，７４５，６５１号、並びに米国特許出願公開第２０１６／０２１３７８５号、同第２０１６／０１９９４８５号、同第２０１５／０２６５７０８号、同第２０１４／０２８８１４６号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１３／００６４８９４号、同第２０１２／０１７２４１１号、及び同第２０１０／０１１７１２５号に記載されている。

【0266】

[0287]「陽イオン性脂質」及び「アミノ脂質」という用語は、明細書中では交換可能に使用され、１つ、２つ、又は３つ以上の脂肪酸又は脂肪アルキル鎖と、ｐＨ滴定可能なアミノ基（例えば、アルキルアミノ又はジアルキルアミノ基）とを有する脂質及びそれらの塩を包含する。陽イオン性脂質は通常、陽イオン性脂質のｐＫａ未満のｐＨでは、プロトン化されており（即ち、正に帯電している）、ｐＫａを超えるｐＨでは、実質的に中性である。陽イオン性脂質はまた、滴定可能な陽イオン性脂質であり得る。ある特定の実施形態において、陽イオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）基；Ｃ１８アルキル鎖（ここで、アルキル鎖はそれぞれ独立的に、０個～３個（例えば、０個、１個、２個、又は３個）の二重結合を有する）；及びヘッド基とアルキル鎖との間のエーテル、エステル、又はケタール結合を含む。

【0267】

[0288]陽イオン性脂質として、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２及びＣ２Ｋとしても既知）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－３－ジメチルアミノプロピオネート（Ｄｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＭＣ２としても既知）、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＭＣ３としても既知）、それらの塩、及びそれらの混合物が挙げられ得るが、限定されない。また、他の陽イオン性脂質として、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、γ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、及び（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂ１１としても既知）が挙げられるが、これら限定されない。

【0268】

[0289]さらなる陽イオン性脂質として、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、１，２－ジリノレイルカルバモイル－３－ジメチルアミノプロパン（Ｄｌｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（Ｄｌｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡＰ）、１－リノレイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＲＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（Ｄｌｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’ージメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧ３）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－イル）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ］－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１，２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、デキサメタゾン－スペルミン（ＤＳ）及び二置換スペルミン（Ｄ２Ｓ）又はそれらの混合物が挙げられ得るが、限定されない。

【0269】

[0290]リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から入手可能）、及びリポフェクトアミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（登録商標）（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から入手可能）等の陽イオン性脂質の多数の市販の調製物が使用され得る。

【0270】

[0291]ある特定の実施形態において、陽イオン性脂質は、ＬＮＰの約１０重量％～脂質ナノ粒子の約８５重量％、又はＬＮＰの約５０重量％～ＬＮＰの約７５重量％の量で存在する。

【0271】

[0292]ステロールは、ＬＮＰに流動性を付与し得る。本明細書で使用する場合、「ステロール」は、植物（フィトステロール）起源又は動物（動物ステロール）起源の任意の天然に存在するステロール並びに天然に存在しない合成ステロールを指し、それらは全て、ステロイドＡ環の３位にある水酸基の存在を特徴とする。ステロールは、リポソーム、脂質小胞又は脂質粒子調製物の分野で通常使用される任意のステロール、最も標準的にはコレステロールであり得る。フィトステロールとして、カンプエステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが挙げられ得る。ステロールはまた、米国特許出願公開第２０１１／０１７７１５６号に記載されるもの等のステロール修飾脂質を包含する。ある特定の実施形態において、ステロールは、ＬＮＰの約５重量％～脂質ナノ粒子の約５０重量％、又はＬＮＰの約１０重量％～ＬＮＰの約２５重量％の量で存在し得る。

【0272】

[0293]ＬＮＰは、中性脂質を含む。中性脂質は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性のいずれかの双性イオン形態で存在する任意の脂質種を含み得る。かかる脂質として、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられるが、これらに限定されない。中性脂質の選択は概して、とりわけ、粒径及び必須の安定性の考慮によって導かれる。ある特定の実施形態において、中性脂質構成成分は、２つのアシル基を有する脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）であり得る。

【0273】

[0294]様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が利用可能であり、或いは周知の技法によって単離又は合成され得る。ある特定の実施形態において、Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質が使用され得る。ある特定の実施形態において、Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する一不飽和又は二不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の混合物を有する脂質が使用され得る。例示的な中性脂質として、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、又は任意の関連ホスファチジルコリンが挙げられるが、限定されない。中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、又はセリン及びイノシトール等の他のヘッド基を有するリン脂質で構成され得る。

【0274】

[0295]ある特定の実施形態において、中性脂質は、脂質ナノ粒子の約０．１重量％～ＬＮＰの約７５重量％、又はＬＮＰの約５重量％～ＬＮＰの約１５重量％の量で存在し得る。

【0275】

[0296]ＬＮＰで被包された核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、医薬組成物、例えば、薬学的に許容できる担体又は賦形剤に取り込まれ得る。かかる医薬組成物は、とりわけ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでのＬＮＰで被包された核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターの、対象への投与及び送達に有用である。

【0276】

[0297]ＬＮＰの調製物は、さらなる構成成分と組み合わせてもよく、さらなる構成成分として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びステロールが挙げられるが、限定されない。

【0277】

[0298]「ＰＥＧ」という用語は、２つの末端水酸基を有するエチレンＰＥＧ反復単位の直鎖状水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを指す。ＰＥＧは、それらの分子量によって分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社及び他の会社から市販されており、例えば、下記の機能性ＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－サクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－サクシンイミジルサクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）が挙げられるが、限定されない。

【0278】

[0299]ある特定の実施形態において、ＰＥＧは、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールであってもよく、任意選択で、アルキル、アルコキシ、アシル又はアリールによって置換されている。ある特定の実施形態において、ＰＥＧは、末端水酸基の位置にてメチルで置換されていてもよい。ある特定の実施形態において、ＰＥＧは、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、又は約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、又は約２，０００ダルトン又は約７５０ダルトンの平均分子量を有し得る。ＰＥＧは、任意選択で、アルキル、アルコキシ、アシル又はアリールで置換されていてもよい。ある特定の実施形態において、末端水酸基は、メトキシ又はメチル基で置換されていてもよい。

【0279】

[0300]ＰＥＧ修飾された脂質として、例えば、米国特許第８，９３６，９４２号及び同第７，８０３，３９７号に記載されるＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート（ＰＥＧ－ＤＡＡ）が挙げられるが、限定されない。有用なＰＥＧ修飾された脂質（又は脂質－ポリオキシエチレンコンジュゲート）は、様々な「固着している」脂質部分を有し、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定し得る。適切なＰＥＧ修飾された脂質の例として、例えば、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、米国特許第５，８２０，８７３号に記載されているＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾された１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられるが、限定されない。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ修飾された脂質は、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールであってもよい。ある特定の実施形態において、ＰＥＧは、ＬＮＰの約０．５重量％～ＬＮＰの約２０重量％、又はＬＮＰの約５重量％～ＬＮＰの約１５重量％の量で存在し得る。

【0280】

[0301]さらに、ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾され、且つステロール修飾されたＬＮＰであってもよい。ＬＮＰは、さらなる構成成分と組み合わせて、同じＬＮＰ又は別個のＬＮＰであってもよい。換言すると、同じＬＮＰは、ＰＥＧ修飾され、且つステロールで修飾されてもよく、或いは、第１のＬＮＰは、ＰＥＧ修飾されてもよく、第２のＬＮＰは、ステロール修飾されてもよい。任意選択で、第１の修飾されたＬＮＰ及び第２の修飾されたＬＮＰは、組み合わせてもよい。

【0281】

[0302]ある実施形態において、被包する前に、ＬＮＰは、約１０ｎｍ～５００ｎｍ、又は約５０ｎｍ～約２００ｍｍ、又は約７５ｎｍ～約１２５ｎｍの範囲のサイズを有し得る。ある特定の実施形態において、ＬＮＰで被包された核酸、発現ベクター又はＡＡＶベクターは、約１０ｎｍ～５００ｎｍの範囲のサイズを有し得る。

【0282】

[0303]「有効な量」又は「十分な量」は、単回又は複数回用量で、単独で、或いは、１つ又は複数の他の組成物（プレドニゾン等の治療剤又は免疫抑制剤）、治療、プロトコル、又は治療レジメン、作用物質と組み合わせて、任意の測定可能若しくは検出可能な度合いの対象における、任意の持続期間（長期間又は短期間）の検出可能な応答、予想される結末又は所望の結末、或いは任意の測定可能若しくは検出可能な度合いの対象への有益性を提供する量を指す。

【0283】

[0304]用量は、様々であってよく、治療が対象となる疾患のタイプ、進行、重症度、頻度、持続期間、又は可能性、所望の臨床エンドポイント、これまでの治療又は同時治療、対象の全身の健康状態、年齢、性別、人種又は免疫学的適格性及び当業者によって理解される他の要因に依存する。用量、回数、頻度又は持続期間は、治療又は療法の任意の有害な副作用、合併症又は他のリスク要因及び対象の状態によって示されるように、相対的に増加又は減少され得る。治療上又は予防上の有益性を提供するのに十分な量を提供するのに必要とされる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得る要因は、当業者に理解されよう。

【0284】

[0305]治療効果を達成するための用量、例えば、体重１キログラム当たりのベクターゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）は、投与経路、治療効果を達成するのに必要とされる異種ポリヌクレオチド発現のレベル、治療される特定の疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチド又は発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、及び発現されるタンパク質の安定性が挙げられるが、これらに限定されない幾つかの要因に基づいて多様である。当業者は、上述の要因、並びに他の要因に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノム用量範囲を決定することができる。

【0285】

[0306]概して、用量は、対象の体重１キログラム当たり少なくとも１×１０^８、例えば。１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３又は１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）以上の範囲である。マウスにおいては、１×１０^１０～１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、またイヌにおいては、１×１０^１２～１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの範囲のＡＡＶ用量が有効であった。用量は、より少なくてもよく、例えば、１キログラム当たり６×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満の用量であってもよい。より詳細には、約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量。

【0286】

[0307]ポンペ病に関して、有効な量は、対象の身体の組織において、グリコーゲン産生若しくは蓄積を阻害又は低減し、グリコーゲン分解若しくは除去を増強又は増加して、リソソーム変更を低減するか、或いは例えば、対象における緊張筋及び／又は筋力及び／又は呼吸機能を改善するＧＡＡの量である。有効な量は、例えば、血漿由来の筋芽細胞によるＧＡＡ取込みの動態を確認することによって決定され得る。約１４１ｎＭ～１４７ｎＭの筋芽細胞ＧＡＡ取込み速度（Ｋ取込み）が、有効であるようであり得る（例えば、Ｍａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２年を参照）。動物モデルにおいて、約１，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬよりも高い血漿中のＧＡＡ活性レベル、例えば約１，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬ～約２，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬは、治療上有効であると観察されている。

【0287】

[0308]例として血友病Ｂを使用すると、一般的に言うと、治療効果を達成するためには、重症疾患表現型を、中等症のものに変更させるには、正常な個体に見られる因子濃度の１％よりも高い血液凝固因子濃度が必要とされると考えられている。重症表現型は、関節損傷及び声明を脅かす出血を特徴とする。中等症の疾患表現型を、軽症疾患表現型に変換するためには、正常の５％よりも高い血液凝固因子濃度が必要とされると考えられている。

【0288】

[0309]血友病Ａ及び血友病Ｂに関する診断及び疾患重症度の分類は、それぞれ、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子活性アッセイの結果に基づいている。因子活性を評価するのに使用される２つの主なアッセイは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく一段階アッセイ（ＯＳＡ）、及び第Ｘａ因子ベースの酵素的発色団基質反応を使用する二段階発色基質アッセイ（ＣＳＡ）である。かかるアッセイは、当該技術分野で周知であり、Ａｄｃｏｃｋら、２０１８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｈｅｍ．、４０：６２１～６２９頁にさらに記載されている。

【0289】

[0310]正常なヒトにおけるＦＶＩＩＩレベルは、約１５０ｎｇ／ｍＬ（血漿）～２００ｎｇ／ｍＬ（血漿）であるが、より少なくてもよく（例えば、約１００ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬの範囲）、又はより多くてもよく（例えば、約２００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬの範囲）、例えば、ａＰＴＴ一段階凝固アッセイによって決定されるような機能性凝固に起因して、依然として正常であると認められる。したがって、治療効果は、対象／ヒトにおけるＦＶＩＩＩの総量が、正常な対象／ヒト中に存在するＦＶＩＩＩの１％、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬの１％を上回るように、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの発現によって達成され得る。

【0290】

[0311]ｒＡＡＶベクターは、ＦＶＩＩＩ又はＡＡＶベクターに対して実質的な免疫応答が存在しないように、通常用量範囲の下端のレベルにあり得る。より詳細には、最大６×１０１２個のｖｇ／ｋｇであるが、それ未満の用量、例えば、約５×１０^１１個～約５×１０^１２個のｖｇ／ｋｇ、又はより詳細には、約５×１０^１１個のｖｇ／ｋｇ又は約１×１０^１２個のｖｇ／ｋｇ。

【0291】

[0312]ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクター用量は、安全且つ有効な量のＦＶＩＩＩを送達して、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する血友病Ａ（阻害剤を有する血友病Ａ）を患う対象に、治療上の有益性を提供するするレベルにある。

【0292】

[0313]治療に（例えば、寛解させるのに、又は治療上の有益性若しくは改善を提供するのに）「有効な量」又は「十分な量」の用量は通常、疾患の１つ、複数若しくは全ての有害な症状、結果又は合併症、疾患によって引き起こされるか、若しくは疾患と関連付けられる１つ又は複数の有害な症状、障害、疾病、病態、又は合併症に対する応答を、測定可能な程度に提供するのに有効であるが、疾患の進行又は悪化を減少すること、低減すること、阻害すること、抑制すること、制限すること又は制御することが、満足のいく結末である。

【0293】

[0314]有効な量又は十分な量は、単回投与で提供され得るが、単回投与で提供されなくてもよく、複数回投与を要する場合もあり、単独で、又は別の組成物（例えば、作用物質）、治療、プロトコル又は治療レジメンと組み合わせて投与され得るが、そうである必要はない。例えば、量は、対象の必要性、治療される疾患のタイプ、状態及び重症度又は治療の副作用（存在する場合）によって示されるように比例して増加され得る。さらに、有効な量又は十分な量は、第２の組成物（例えば、別の薬物又は作用物質）、治療、プロトコル又は治療レジメンを用いずに単回又は複数回用量で付与される場合には、有効又は十分でなくてもよい。その理由は、かかる用量に加えて、さらなる用量、量又若しくは持続期間、又はさらなる組成物（例えば、薬物又は作用物質）、治療、プロトコル又は治療レジメンが、所与の対象において有効又は十分であると認められるように含まれ得るためである。有効であると認められる量はまた、別の治療、治療レジメン又はプロトコルの使用、例えば、凝固障害（例えば、血友病Ａ、又は阻害剤を有する血友病Ａとしても既知のＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する血友病Ａ）の治療用の組換え凝固因子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）の投与の低減をもたらす量を含む。

【0294】

[0315]したがって、本発明の方法及び使用は、とりわけ、別の化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス若しくは治療法の必要性又は使用の低減をもたらす方法及び使用を包含する。例えば、血液凝固疾患に関して、本発明の方法又は使用は、所与の対象において、対象における欠損又は欠乏している（異常又は変異）内因性凝固因子を補うための組換え凝固因子タンパク質の、あまり頻繁でない投与又は低減された用量の投与又は投与の排除が見られる場合に、治療上の有益性を有する。したがって、本発明によれば、別の治療若しくは療法の必要性又は使用を低減する方法及び使用が提供される。

【0295】

[0316]有効な量又は十分な量は、治療されるありとあらゆる対象において有効である必要はなく、また所与の群又は集団において治療される対象の大部分において有効である必要もない。有効な量又は十分な量は、特定の対象おける有効性又は十分性を意味し、群や一般集団における有効性又は十分性を意味するのではない。かかる方法にとって典型的であるように、対象によっては、所与の治療方法又は使用に対して、より大きい応答を示し、又はより小さい応答を示し、又は応答を示さない。

【0296】

[0317]「寛解させる」という用語は、対象の疾患若しくはその症状、又は基礎的な細胞応答における検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善として、疾患又は疾患によって引き起こされるか、若しくは疾患と関連付けられる合併症の発生、頻度、重症度、進行、若しくは持続期間における主観的又は客観的な減少、低減、阻害、抑制、制限又は制御、或いは疾患の症状若しくは基礎となる原因若しくは結末の改善、又は疾患の回復が挙げられる。ＨｅｍＡに関して、有効な量は、例えば、対象における急性出血エピソードの頻度又は重症度を低減する量、或いは例えば、凝固アッセイによって測定した場合に凝固時間を低減する量である。

【0297】

[0318]したがって、本発明の医薬組成物は、有効成分が、対象となる治療目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を包含する。治療上有効な用量を決定することは、本発明で提供される技法及びガイダンスを使用して、十分に当業者の手腕内にある。

【0298】

[0319]治療用量は、とりわけ、対象の年齢及び全身状態、異常表現型の重症度、及び発現レベルを調節する制御配列の強度に依存する。したがって、ヒトにおける治療上有効な量は、個々の患者の、ベクターベースの治療に対する応答に基づいて、医師によって決定され得る比較的広範囲に収まる。かかる用量は、単独であり得るか、又は免疫抑制剤若しくは薬との組合せであり得る。

【0299】

[0320]医薬組成物等の組成物は、導入遺伝子発現、及び任意選択で、コードされたタンパク質の産生を可能にするように、対象に送達され得る。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、対象におけるうっ血に影響を与えるのに治療上有効な量の凝結因子を、レシピエントが産生するのを可能にするのに十分な遺伝子材料を含む。

【0300】

[0321]組成物は、単独で投与されてもよい。ある特定の実施形態において、組換えＡＡＶ粒子は、免疫抑制剤を用いずに治療効果を提供する。治療効果は任意選択で、免疫抑制剤を投与せずに、ある期間、例えば２日～４日、４日～６日、６日～８日、８日～１０日、１０日～１４日、１４日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、又は３０日～５０日又はそれよりも長く、例えば、５０日～７５日、７５日～１００日、１００日～１５０日、１５０日～２００日又はそれよりも長く持続される。したがって、ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ある期間、免疫抑制剤を投与せずに、治療効果を提供する。

【0301】

[0322]本発明の組成物は、少なくとも１つの他の不活性剤又は治療剤と組み合わせて投与され得る。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターの投与に先立って、ｒＡＡＶベクターの投与と実質的に同時に、又はｒＡＡＶベクターの投与後に、１つ又は複数の免疫抑制剤と併用して投与される。ある実施形態において、ｒＡＡＶベクターの投与の１時間～１２時間、１２時間～２４時間若しくは２４時間～４８時間、又は２日～４日、４日～６日、６日～８日、８日～１０日、１０日～１４日、１４日～２０日、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～５０日、又は５０日よりも長い後に。ｒＡＡＶベクターを投与した後のある一定期間後の免疫抑制剤のかかる投与において、ｒＡＡＶベクターのある一定期間、例えば、２０日～２５日、２５日～３０日、３０日～５０日、５０日～７５日、７５日～１００日、１００日～１５０日、１５０日～２００日、又は２０日よりも長い後に、初期の発現レベル後に、コードされたタンパク質発現の減少が見られる。

【0302】

[0323]ある特定の実施形態において、免疫抑制剤は、抗炎症剤である。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤は、ステロイドである。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤は、プレドニゾン、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノレート、リツキシマブ、ラパマイシン、又はそれらの誘導体である。ある特定の実施形態において、作用物質は、安定化化合物を含む。本発明により使用され得る他の免疫抑制剤として、例えば、Ｂ細胞ターゲティング抗体、例えば、リツキシマブ；プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ；ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳動物標的、例えば、ラパマイシン；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ；Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の阻害剤；及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の阻害剤が挙げられるが、限定されない。

【0303】

[0324]組成物は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水が挙げられるが、これらに限定されない任意の滅菌生体適合性医薬担体中に投与され得る。組成物は、単独で、又はうっ血に影響を与える他の作用物質（例えば、補因子）と組み合わせて、患者に投与され得る。

【0304】

[0325]本発明の方法及び使用は、全身的、局所的若しくは局在的、又は例えば、注射若しくは注入によるが、限定されない任意の経路による送達及び投与を含む。ｉｎ ｖｉｖｏでの医薬組成物の送達は概して、従来のシリンジを使用した注射により達成されてもよいが、対流強化送達等の他の送達方法が想定される（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照）。例えば、組成物は、皮下的に、表皮的に、皮内的に、髄腔内に、眼窩内に、粘膜内に、腹腔内に、静脈内に、胸膜内に、動脈内に、経口的に、肝内に、門脈を介して、又は筋内に送達され得る。他の投与方法として、経口投与及び肺投与、坐剤、及び経皮塗布が挙げられる。例えば、血液凝固又は凝固因子障害を患う患者の治療を専門に扱う臨床医は、患者の状態及び治療の目的（例えば、ＧＡＡの増加、血液凝固の強化又は低減等）が挙げられるが、これらに限定されない多数の判断基準に基づいて、アデノウイルス随伴ベクターの投与に関して最適な経路を決定し得る。

【0305】

[0326]本発明による治療方法は、所望の治療上の、有益な、付加的な、相乗的な、若しくは補完的な活性又は効果を有する任意の化合物、作用物質、薬物、治療又は他の治療レジメン若しくはプロトコルの１つ又複数のさらなる使用を含む併用療法を包含する。例示的な併用組成物及び治療とは例えば、２の添加剤、例えば生物製剤（タンパク質）、作用物質（例えば、免疫抑制剤）及び薬物を含むが、限定されない。かかる生物製剤（タンパク質）、作用物質、薬物、治療及び療法は、本発明による任意の他の治療方法、例えば、ポンペ病等のリソソーム蓄積症に対して対象を治療する治療方法、又はＨｅｍＡ若しくはＨｅｍＢ等の血液凝固疾患に対して対象を治療する治療法に先立って、それと実質的に同時期に、又はその後に投与又は実施され得る。

【0306】

[0327]化合物、作用物質、薬物、治療又は他の療法レジメン若しくはプロトコルは、組合せ組成物として投与され得るか、或いは別々に、例えば、核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子の送達又は投与と同時に、又は連続して、又は順次（先立って、又は後に）投与され得る。したがって、本発明は、本発明による治療方法が、本明細書に記載されるか、又は当業者に既知の任意の化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、治療法又は組成物と組み合わさっている組合せを提供する。化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、治療法又は組成物は、本発明よる患者又は対象に投与される核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子の投与に先立って、それと実質的に同時期に、若しくはその後に投与又は実施され得る。

【0307】

[0328]本発明は、ヒト及び獣医学用途で使用され得る。したがって、適切な対象として、ヒト等の哺乳動物、並びに非ヒト哺乳動物が挙げられる。「対象」という用語は、動物、通常は哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト齧歯類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌ及びネコ）、家畜（ニワトリ及びアヒル等の家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。ヒト対象として、胎児、新生児、乳児、若年期及び成人対象が挙げられる。対象として、動物疾患モデル、例えば、ＨｅｍＡ及び当業者に既知の他のもの等の血液凝固疾患のマウス及び他の動物疾患モデルが挙げられる。

【0308】

[0329]本発明による治療に適した対象は、不十分な量の機能性遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）を有するか、不十分な量の機能性遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）を産生するリスクがあるか、又は機能性遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）の欠損を有するか、或いは疾患を招き得る、異常な遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）、部分的に機能性の遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）又は非機能性遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）を産生する対象が挙げられる。本発明による治療に適した対象はまた、異常な遺伝子産物（タンパク質）、若しくは欠乏している（変異）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現又は機能を低減することが、疾患の治療につながるか、或いは１つ又は複数の症状を低減するか、又は疾患を寛解させるように、疾患を招く異常な遺伝子産物（タンパク質）、若しくは欠乏している（変異）遺伝子産物（タンパク質）を有するか、又はそれらを産生するリスクがある対象も包含する。例えば、標的対象は、異常な血液凝固因子産生を有するか、不十分な血液凝固因子産生を有するか、又は血液凝固因子産生が存在しない対象、例えば血友病患者（例えば、血友病Ａ又は血友病Ｂ）、又は異常なＧＡＡを有するか、不十分なＧＡＡを有するか、又はＧＡＡが存在しない対象、例えばポンペ病を患う患者を包含する。

【0309】

[0330]対象として、ＡＡＶに対する検出不可能な中和抗体を有する対象が挙げられる。また、対象として、ＡＡＶに対する中和抗体を有する対象が挙げられる。かかる対象は、ＡＡＶに対する低力価の中和抗体を有する。

【0310】

[0331]対象は、免疫応答、例えばＡＡＶに対する抗体に関して検査され得る。候補対象（例えば、血友病又はポンペ病の対象）は、本発明の方法に従って治療に先立ってスクリーニングされ得る。対象はまた、治療後にＡＡＶに対する抗体に関して検査され、任意選択で、治療後のある期間、モニタリングされ得る。抗体を発現する対象は、免疫抑制剤（例えば、プレドニゾン）で治療され得るか、或いは１つ又は複数の追加量のＡＡＶベクターが投与され得る。

【0311】

[0332]ＡＡＶに結合する抗体に関して陰性であると認められる対象は、１：１未満の力価を有する。ＡＡＶに結合する抗体を有する対象は、１：１よりも高いが、１．５未満の力価を有する。対象はまた、１．５以上のＡＡＶ抗体力価を有し得る。これらの抗体力価は、例えば、対象由来の血液、血漿又は血清（又は他の体液）試料の段階希釈を実施することによって算出することができ、試料が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞ベースのアッセイにおいてレポーター活性によって測定される場合に、５０％又はそれよりも高く、ＡＡＶ形質伝達を阻害する第１の希釈が、抗体力価として報告される。

【0312】

[0333]全身の遺伝子移入におけるＡＡＶに対する体液性免疫を低減する（克服する）か、又は回避するための戦略は、高ベクター用量を投与すること、抗ＡＡＶ抗体を吸着するためのデコイとしてのＡＡＶ空キャプシドの使用、ＡＡＶに対する体液性免疫応答を減少、低減、阻害、防止又は根絶するための免疫抑制薬の投与、中和抗体の影響をあまり受けないようにＡＡＶキャプシド血清型を変更するか、又はＡＡＶキャプシドを操作すること、抗ＡＡＶ免疫グロブリンを吸着するための、血漿交換サイクルの使用、それにより抗ＡＡＶ抗体力価を低減すること、バルーンカテーテル、続く生理食塩水フラッシング等の送達技法の使用（Ｍｉｎｇｏｚｚｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２２：２３～３６頁）、及び免疫吸着（米国特許出願公開第２０１８／０１６９２７３ Ａ１号）を包含する。

【0313】

[0334]本発明による治療に適した対象はまた、ＡＡＶに対する抗体を有するか、又は抗体を産生するリスクがある対象を包含する。ｒＡＡＶベクターは、幾つかの技法を使用して、かかる対象に投与又は送達され得る。例えば、空のキャプシドＡＡＶ（例えば、導入遺伝子を欠如するＡＡＶ）は、送達されて、対象においてＡＡＶ抗体に結合してもよく、それにより対象の細胞を形質転換するように核酸又は核酸バリアントを保有するＡＡＶベクターを可能にする。

【0314】

[0335]空のキャプシドとｒＡＡＶベクターの比は、約２：１～約５０：１、又は約２：１～２５：１、又は約２：１～約２０：１、又は約２：１～約１５：１、又は約２：１～約１０：１であり得る。比はまた、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１であり得る。

【0315】

[0336]投与する空のキャプシドＡＡＶの量は、特定の対象において産生されるＡＡＶ抗体の量（力価）に基づいて較正され得る。空のキャプシドは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３（配列番号９１）、ＳＰＫ（配列番号９２）であり得る。

【0316】

[0337]或いは、又はさらに、ＡＡＶベクターは、直接的な筋内注射（例えば、筋肉の１つ又は複数の遅筋線維）によって送達され得る。別の代替案において、大腿動脈へ導入されるカテーテルを使用して、肝動脈を介してＡＡＶベクターを肝臓へ送達することができる。また、内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）等の非外科的手段を用いて、ＡＡＶベクターを直接肝臓に送達することができ、それにより、血流とＡＡＶ抗体とをバイパスする。顎下腺の管等の他の管系もまた、既存の抗ＡＡＶ抗体を発現するか、又は有する対象へＡＡＶベクターを送達するための扉として使用することができる。

【0317】

[0338]対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの送達は、疾患によって引き起こされるか、又は疾患と関連付けられる有害な症状、状態、合併症等の発症に先立って実施され得る。例えば、スクリーン（例えば、遺伝的）を使用して、本発明の組成物、方法及び使用に対する候補物質として、かかる対象を同定することができる。したがって、かかる対象は、機能性遺伝子産物（例えば、凝固因子）の不十分な量又は欠損に関して陽性であるとスクリーニングされたもの、又は異常、部分的に機能性若しくは非機能性遺伝子産物（例えば、凝固因子）を産生するものを包含する。

【0318】

[0339]本明細書に開示される本発明の方法及び使用による、対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの送達は、対象が治療の標的とされる疾患を有すると同定されたか、疾患の１つ又は複数の症状を有したか、或いはスクリーニングされ、また対象が、疾患の１つ又は複数の症状を有さなかったとしても、本明細書に記載されるように陽性であると同定された後、１時間～２時間、２時間～４時間、４時間～１２時間、１２時間～２４時間又は２４時間～７２時間内に実施することができる。当然のことながら、本発明の方法及び使用は、対象が、治療の標的とされる疾患を有すると同定されたか、疾患の１つ又は複数の症状を有したか、又はスクリーニングされ、また本明細書に記載されるように陽性であると同定された後の１～７、７～１４、１４～２１、又は２１～４８以上の日数、月又は年で実施することができる。

【0319】

[0340]「単位投薬形態」は本明細書で使用する場合、治療されるべき対象にとって単位投与として適した物理的に別々の単位を指し、単位はそれぞれ、１つ又は複数の用量で投与されると、所望の効果（例えば、予防効果又は治療効果）をもたらすと算出される、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル又は充填剤）と共に規定量を含有する。単位投薬形態は、例えば、アンプル及びバイアル内に入っていてもよく、それらは、液体組成物、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥状態の組成物を含んでもよく、例えば、滅菌液体担体は、投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの送達に先立って添加され得る。別個の単位投与量形態は、複数回用量キット又は容器中に含まれ得る。組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、組換えウイルス粒子及びそれらの医薬組成物は、投与の容易さ及び投薬の一様性のために、単回単位用量及び複数回単位投薬形態で包装され得る。

【0320】

[0341]対象は、関連遺伝子産物（例えば、ＧＡＡ又は血液凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）のタンパク質又は活性レベルに関して検査されて、かかる対象が本発明の方法による治療に適切であるかどうかを決定することができる。例えば、候補血友病Ａ対象は、本発明の方法による治療に先立って、ＦＶＩＩＩ量又は活性に関して検査することができ、候補ポンペ病対象は、本発明による治療に先立って、ＧＡＡ量又は活性に関して検査することができる。対象はまた、本発明の方法による治療後に、ＦＶＩＩＩ若しくはＧＡＡのタンパク質又は活性の量に関して検査することができる。かかる治療対象は、治療後に血液凝固活性（ＨｅｍＡに関して）又はＧＡＡ活性（ポンペに関して）に関して、定期的に、例えば１週～４週毎、１カ月～６カ月毎、又は１年、２年、３年、４年、５年又はそれよりも長い年毎にモニタリングすることができる。

【0321】

[0342]対象は、有害な応答に対する１つ又は複数の肝臓酵素に関して、或いはかかる対象が本発明の方法による治療にとって適切であるかどうかを決定するために検査され得る。例えば、候補血友病又はポンペ対象は、本発明の方法による治療に先立って、１つ又は酵素の肝臓酵素の量に関してスクリーニングされ得る。対象はまた、本発明の方法による治療後に１つ又は複数の肝臓酵素の量に関して検査され得る。かかる治療された対象は、肝臓酵素の上昇に関する治療後に、定期的に、例えば１週～４週毎、又は１カ月～６カ月毎にモニタリングされ得る。

【0322】

[0343]例示的な肝臓酵素として、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が挙げられるが、肝臓損傷を示す他の酵素もまた、モニタリングすることができる。循環中のこれらの酵素の正常レベルは通常、上限レベルを有する範囲として規定され、それを超えると、酵素レベルは、上昇したと認められて、したがって、肝臓損傷を示す。正常な範囲は、アッセイを行う臨床検査室によって使用される標準に幾分依存する。

【0323】

[0344]ある実施形態において、出血障害を有する対象は、出血エピソードに関してモニタリングされて、かかる対象が、本発明による治療にふさわしいか、又は本発明の治療に応答しているかどうか、及び／又は応答の量若しくは持続期間を決定することができる。対象は、出血エピソードに関してモニタリングされて、かかる対象が、さらなる治療、例えば、続くＡＡＶベクター投与又は免疫抑制剤の投与、或いはより頻繁なモニタリングが必要であるかどうかを決定することができる。血友病対象は、本発明の方法による治療に先立って、及び治療後に、出血エピソードに関してモニタリングすることができる。対象はまた、本発明の方法による治療中に、又は治療後に、出血エピソードの頻度及び重症度に関してモニタリングすることができる。

【0324】

[0345]ある実施形態において、ポンペ病を患うか、又はＧＡＡを必要とする対象は、様々な検査、アッセイ及び機能性評価によってモニタリングされて、ＧＡＡの有効性を実証、測定及び／又は評価して、かかる対象が、本発明により、治療にふさわしいか、又は治療に応答しているかどうか、或いはさらなる治療が必要であるかどうかを決定することができる。

【0325】

[0346]本発明は、包装材料と、その中に含まれる１つ又は複数の構成成分とを有するキットを提供する。キットは通常、その中に含まれる構成成分の説明を含む表示若しくは包装インサート、又はその中に含まれる構成成分のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に関する説明書を含む。キットは、一連のかかる構成成分、例えば、核酸、組換えベクター、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、又はウイルス粒子、及び任意選択で、別の化合物、作用物、薬物又は組成物等の第２の活性物を含有し得る。

【0326】

[0347]キットは、キットの１つ又は複数の構成成分を収納する物理的構造を指す。包装材料は、滅菌して構成成分を維持することができ、かかる目的で一般に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブ等）で作製され得る。

【0327】

[0348]表示又はインサートは、その中に含まれる１つ又は複数の構成成分、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学を含む有効成分（複数可）の臨床薬理学の情報の特定を含み得る。表示又はインサートは、製造業者、ロット番号、製造場所及び製造日、有効期限を特定する情報を包含し得る。表示又はインサートは、製造業者情報、ロット番号、製造場所及び製造日を特定する情報を包含し得る。表示又はインサートは、キット構成成分が使用され得る疾患に関する情報を包含し得る。表示又はインサートは、方法、使用、又は治療プロトコル又は治療レジメンにおいてキット構成成分の１つ又は複数を使用するための臨床医及び対象向けの説明書を包含し得る。説明書は、投薬量、頻度又は持続期間、及び本明細書に記載する方法、使用、治療プロトコル又は予防若しくは治療レジメンのいずれかを実行するための説明書を包含し得る。

【0328】

[0349]表示又はインサートは、予防上の有益性又は治療上の有益性等の、構成成分が提供し得る任意の有益性に関する情報を包含し得る。表示又はインサートは、潜在的な有害な副作用、合併症又は反応、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関する対象又は臨床医への警告を包含し得る。有害な副作用又は合併症はまた、対象が、組成物と不適合性であり得る１つ又は複数の他の投薬を受けていたか、受ける予定であるか、又は現在受けているか、或いは対象が、組成物と不適合性である別の治療プロトコル又は治療レジメンを受けていたか、受ける予定であるか、又は現在受けている場合にも起こる可能性があり、したがって、説明書には、かかる不適合性に関する情報が含まれ得る。

【0329】

[0350]表示又はインサートは、「印刷物」、例えば、構成成分、キット若しくは梱包材（例えば、箱）とは別々の、又はそれらに貼り付けられたか、或いはキット構成成分を含有するアンプル、チューブ若しくはバイアルに取り付けられた紙又は厚紙を含む。表示又はインサートは、バーコード化された印刷表示等のコンピュータ可読媒体、ディスク、ＣＤ－又はＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ等の光ディスク、又はＲＡＭ及びＲＯＭ等の蓄電媒体、又は磁気／光学式記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体又はメモリ型カード等のこれらのハイブリッドをさらに包含する。

【0330】

[0351]別記しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は等価な方法及び材料を、本発明の実施又は実験において使用することができるが、適切な方法及び材料を本明細書に記載する。

【0331】

[0352]本明細書で引用される特許、特許出願、刊行物、及び他の参照文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用及びＡＴＣＣ引用は全て、その全体が参照により援用される。不一致の場合、定義を含む明細書が支配する。

【0332】

[0353]本発明の生物学的分子に関する様々な用語が、上記で、また明細書及び特許請求の範囲全体でも使用される。

【0333】

[0354]本明細書に開示される特徴は全て、任意の他の組合せで組み合わせられ得る。明細書に開示される特徴はそれぞれ、同じ目的、等価な目的、又は同様の目的を果たす代替的な特徴で置き換えられ得る。したがって、明らかに別記されない限り、開示される特徴の（例えば、ＣｐＧが低減された）核酸、ベクター、プラスミド、発現／組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、又は組換えウイルス粒子は、等価な特徴又は同様の類の特徴の例である。

【0334】

[0355]本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、状況が明らかに他の場合を示さない限り、複数形を包含する。したがって、例えば、「核酸」に対する言及は、複数のかかる核酸を包含し、「ベクター」に対する言及は、複数のかかるベクターを包含し、「ウイルス」又は「粒子」に対する言及は、複数のかかるウイルス／粒子を包含する。

【0335】

[0356]本明細書で使用する場合、数値又は数値範囲は全て、状況が明らかに他の場合を示さない限り、かかる範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分率を包含する。したがって、例えば、８０％以上の同一性に対する言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等を包含する。

【0336】

[0357]より大きい（高い）か、又はより小さい整数に対する言及は、それぞれ、参照数よりも大きいか、又は小さい任意の数を包含する。したがって、例えば、１００未満に対する言及は、９９、９８、９７等から数１（１）までを包含し、また１０未満対する言及は、９、８、７等から数１（１）までを包含する。

【0337】

[0358]本明細書で使用する場合、数値又は数値範囲は全て、状況が明らかに他の場合を示さない限り、かかる範囲内の値及び整数の分率及びかかる範囲内の整数の分率を包含する。したがって、例えば、１～１０等の数的範囲に対する言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を包含する。したがって、１～５０の範囲に対する言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等～５０まで（且つ５０を含む）、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等を包含する。

【0338】

[0359]一連の範囲に対する言及は、一連内の種々の範囲の境界の値を組み合わせる範囲を包含する。したがって、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０の一連の範囲に対する言及は、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００等の範囲を包含する。

【0339】

[0360]本発明は概して、肯定的な言語を使用して本明細書に開示されて、本発明の多数の実施形態について記載する。本発明はまた、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコル又は手順等の特定の主題が、全部又は部分的に排除される実施形態を詳細に包含する。例えば、本発明のある特定の実施形態において、材料及び／又は方法ステップが排除される。したがって、本発は概して、本発明が包含しないものに関して、本明細書で表されないが、それにもかかわらず、本発明において明らかに排除されない態様は、本明細書に開示される。

【0340】

[0361]本発明の多数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、当業者は、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の各種変更及び修正を行って、それを、様々な利用法及び状態に適合させることができる。したがって、下記の実施例は、本発明の範囲を説明すると意図されるが、いかなる場合でも、特許請求される本発明の範囲を限定しない。

【実施例0341】

実施例１：方法
[0362]ＮＨＰ血漿のｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ：９６ウェルプレートを、ヒト特異的ＦＶＩＩＩ抗体で一晩コーティングして、洗浄して、ブロックした後、希釈したＮＨＰ研究対象の血漿試料とともにインキュベートした。組換えＢ－ドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩであるＸｙｎｔｈａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ社）の一連の希釈物とともに、さらなるウェルをインキュベートすることによって、標準曲線を作成した。プレートを洗浄して、続いて、ビオチン化ヒト特異的ＦＶＩＩＩ検出抗体とともにインキュベートした。プレートを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジンとともにインキュベートして、ＴＭＢ基質で処理して、マイクロプレートリーダーで読み取り、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

【0342】

[0363]マウス血漿のｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ：マウス血漿のｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡは、本質的にＮＨＰに関して上述するように実施されたが、利用した捕捉及び検出抗体は異なっていた。

【0343】

[0364]ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターの効力を測定するための細胞ベースのアッセイ：Ｈｕｈ７細胞を、４８ウェル皿においてウェル１つにつき５×１０^４個の細胞で平板培養した。研究後、残存する未希釈のストックベクター及び投薬用に希釈したベクターを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトアビジン／Ｌ－グルタミン中で、１０倍用量曲線（１×１０^６～１×１０^３の範囲のＭＯＩ）で調製した。現存する培地をＨｕｈ７細胞から除去して、ウイルス粒子含有培地と置き換えた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で７２時間、維持して、上清を収集し、ｈＦＶＩＩＩ活性に関してアッセイするまで、－８０℃で、低保持マイクロタイタープレートにおいて保管した。組換えＢ－ドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩであるＸｙｎｔｈａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ社）を、細胞成長培地に希釈することによって作成した標準曲線を用いて、上清を、コアテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）（登録商標）ＳＰ４第ＶＩＩＩ因子（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）によってアッセイした。

【0344】

[0365]ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子をコードするプラスミドのタンパク質発現効率を測定するための細胞ベースのアッセイ：Ｈｕｈ７細胞を、４８ウェル皿においてウェル１つにつき５×１０^４個の細胞で、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン中で平板培養した。プラスミドは、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して調製し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）Ｍａｘを使用して、ウェル１つにつき２５０ｎｇで細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で７２時間、維持して、上清を収集し、ｈＦＶＩＩＩ活性に関してアッセイするまで、－８０℃で、低保持マイクロタイタープレートにおいて保管した。組換えＢ－ドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩであるＸｙｎｔｈａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ社）を、細胞成長培地に希釈することによって作成した標準曲線を用いて、上清を、コアテスト（登録商標）ＳＰ４第ＶＩＩＩ因子（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）によってアッセイした。

【0345】

実施例２
[0366]ＦＩＸ構築物調節エレメント単位（配列番号２２及び配列番号２３）は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子の３２１ｂｐのイントロン及びヒトアルファ－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）遺伝子の３９７ｂｐのプロモーターで構成される。全体として、この単位は、１６個のＣｐＧを含有する。

【0346】

ＣｐＧが低減されたプロモーターの設計
[0367]ＣｐＧ部位のシトシン又はグアニンのいずれかを、コンセンサス配列に応じて変更させた。潜在的な転写因子結合部位が見出されなかった場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン（Ｃ）を、チミン（Ｔ）で置き換えた。そうすることにより、ピリミジン－プリン構造が維持された。場合によっては、Ｃヌクレオチド又は全ＣｐＧジヌクレオチドを欠失させ、場合によっては、ＣｐＧジヌクレオチドのグアニン（Ｇ）を、アラニン（Ａ）又はＣで置き換えた。

【0347】

[0368]この戦略を使用して、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ調節エレメントに基づいて、２２個の異なる配列を生成した。以下の配列番号２４～配列番号６７において、５’隣接制限酵素部位及び３’隣接制限酵素部位を有する配列を示す。

【0348】

クローニング
[0369]種々のプロモーターを合成して、ｈＦＩＸをコードするコドン最適化配列（配列番号９４）の上流でクローニングした。

【0349】

マウス研究
[0370]８週齢の雄野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）におけるプラスミド構築物のハイドロダイナミック送達によって、ヒトアルファ－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）遺伝子プロモーターの効力を評価した。プラスミド投与の２４時間後に、顎下血液収集により、非絶食血漿試料をヘパリン中に収集した。血漿を氷上に配置して、分析するまで－８０℃で保管した。動物研究は全て、施設のガイドライン及び認可プロトコルに従って実施された。
効力研究
[0371]収集した血漿を使用して、ｈＦＩＸ導入遺伝子発現を評価した。

【0350】

[0372]活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって、ヒトＦＩＸの活性レベルを測定した。試料血漿を、ヒトＦＩＸ欠損血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ社）及びａＰＰＴ試薬（Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）と１：１：１の容量比で混合した後、３７℃で１８０秒のインキュベーション期間を経ることによって、ａＰＰＴアッセイを実施した。２５ｍＭ塩化カルシウムの添加によって、凝固が開始された。Ｓｔａｒｔ ４凝固機器（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社）を使用して、血塊形成に至る時間を測定した。プールした正常血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ社）を用いて、ＴＢＳ ｐＨ７．４（４８μＬ＋１９２μＬ）中での１：５希釈に始まり、続いて段階１：２希釈（１２０μＬ＋１２０μＬ）で、標準曲線を作成した。ヒト標準曲線を使用して、ＡＡＶベクター投与の１７週後に、各試料の活性を算出し、２匹の未治療マウスにおける活性も測定した。未治療マウスにおけるＦＩＸ活性の平均値を求めて、続いて治療試料から差し引いて、外因性のＦＩＸタンパク質に起因する外部の（即ち、ヒト）活性を算出した。データを図１に示す。

【0351】

実施例３
[0373]ＦＶＩＩＩ構築物調節エレメント単位（配列番号２及び配列番号３）は、２２５ｂｐのＴＴＲプロモーターで構成される。全体として、この単位は、４個のＣｐＧを含有する。

【0352】

ＣｐＧが低減されたＴＴＲプロモーターの設計
[0374]ＣｐＧ部位のシトシン又はグアニンのいずれかを、コンセンサス配列に応じて変更させた。潜在的な結合部位が見出されなかった場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンを、チミンで置き換えた。そうすることにより、ピリミジン－プリン構造が維持された。この戦略を使用して、ＴＴＲｍ（配列番号３）調節エレメントに基づいて、５個の新規配列を生成した。制限酵素部位を有する、及び制限酵素部位を有さないＣｐＧが低減されたＴＴＲ配列を、配列番号４～配列番号１３に示す。

【0353】

[0375]４個の異なる短ＴＴＲハイブリッドプロモーターの別の組を設計した。５個の異なる肝臓特異的なプロモーターを、自然遺伝子に関する転写開始部位（ＴＳＳ）の１０００個のヌクレオチド以内の推定転写因子結合部位の存在に関して、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで評価した。続いて、元の自然プロモーター由来の特異的な領域を選択することと、それらをタンデムで構築することとによって、ＴＴＲハイブリッドプロモーターを構築した。制限酵素部位を有する、及び制限酵素部位を有さないＴＴＲハイブリッドプロモーター配列を、以下の配列番号１４～配列番号２１に示す。

【0354】

クローニング
[0376]種々のプロモーターを合成して、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号７７）の上流でクローニングした。

【0355】

マウス研究
[0377]まず、８週齢の雄野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）におけるハイドロダイナミック送達によって、ＴＴＲプロモーターの効力を評価した。プラスミド投与の２４時間後に、顎下血液収集により、非絶食血漿試料をヘパリン中に収集した。血漿を氷上に配置して、分析するまで－８０℃で保管した。ＡＡＶ送達研究に関して、血液の最初の０．５ｍＬを廃棄して、残りの試料をＥＤＴＡ中に収集して、血漿に加工処理した。動物研究は全て、施設のガイドライン及び認可プロトコルに従って実施された。

【0356】

マウス血漿におけるｈＦＶＩＩＩ抗原レベル
[0378]マウス血漿におけるｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子産物のレベルを、下記の通りにサンドイッチスタイルのＥＬＩＳＡを使用して定量化した：まず、マイクロタイタープレートのウェルを、抗ｈＦＶＩＩＩ捕捉抗体（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、２μｇ／ｍＬに希釈）でコーティングした。翌日、プレートを４回洗浄して、室温で３０分間ブロックした（６％ＢＳＡ、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）。プールしたマウス血漿に、既知の濃度の組換えＢ－ドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ（ＸＹＮＴＨＡ Ｓｏｌｏｆｕｓｅ（登録商標））を添加して、段階希釈して（１：２）、３００ｎｇ／ｍＬ～２．３４ｎｇ／ｍＬの範囲の８点標準曲線を作成した。アッセイの定量限界は、４．８ｎｇ／ｍＬである。３つのレベルの品質管理試料を調製して、各プレート上に入れて、アッセイ性能を評価した。試料をウェルに添加した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、続いて、４回洗浄した。ビオチン化抗ｈＦＶＩＩＩ検出抗体（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、１μｇ／ｍＬに希釈）を、室温で１時間プレートに添加して、捕捉したｈＦＶＩＩＩタンパク質に結合させた。洗浄後、１：５０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、室温で３０分間プレートに添加して、ビオチン化抗ｈＦＶＩＩ抗体に結合させた。プレートを洗浄して、未結合のコンジュゲート抗体を除去した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ）とともに室温で１５分インキュベートした後に、ペルオキシダーゼ活性が明らかとなった。反応をＴＭＢ停止溶液で停止させて、光学密度（ＯＤ）用の吸光度プレートリーダーによって、プレートを読み取った。得られた吸光度値は、血漿試料中に存在するｈＦＶＩＩＩの濃度に比例する。データを図２～図５に示す。

【0357】

ＲＮＡ単位及びｑＰＣＲ
[0379]脳、精巣、腎臓、脾臓、及び肝臓のマウス組織を収集して、ＤＰＢＳですすいで、複数の微量片に切断して／すり潰して、およそ３０ｍｇを、キットプロトコル（ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓユニバーサルミックスキット、Ｑｉａｇｅｎ社）において記載されるように実施されるＲＮＡ単離用に使用した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００機器を使用して、ＲＮＡ濃度を測定し、試料を、ヌクレアーゼフリー中で１５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。製造業者の説明書の通りに、Ｔｒｕｂｏ ＤＮＡフリーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ社）を使用して、ＤＮアーゼ処理を行った。ｃＤＮＡ反応に関して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡＢＩ社）における指示書に従って、ＲＮＡ ２００ｎｇを使用した。ｃＤＮＡ試料を５倍希釈して、ｃＤＮＡ ２０ｎｇをＰＣＲ反応において使用した。フォワードプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＡＴＧＡ－３’（配列番号９５）、リバースプライマー：５’－ＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡ－３’（配列番号９６）、及びプローブ：５’－５６－ＦＡＭ－ＴＧＧＡＴＧＴＧＧ／ＺＥＮ／ＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’（配列番号９７）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。マウスａｃｔＢ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）遺伝子は、正規化用のハウスキーピング遺伝子として機能を果たした。データを図６に示す。

【0358】

実施例４
[0380]導入遺伝子発現に寄与する発現カセット内のエレメントを変更させることによって、第ＦＶＩＩＩ因子の発現を増加させた。Ｂ－ドメイン欠失ｈＦＶＩＩＩ発現ＡＡＶベクターのイントロンを含まないバージョン（ＡＡＶ－ＩＮＴＬ）を作製して、イントロン含有バージョン（ＡＡＶ－ＷＩＮＴ）と比較した。ＡＡＶ－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ発現カセット（配列番号１）は、ＡＡＶ－ＸＩＮＴ ｈＦＶＩＩＩ発現カセットと同じエレメントを含有するが、但し、ＡＡＶ－ＷＩＮＴ ｈＦＶＩＩＩは、ＴＴＲｍプロモーターと、Ｂ－ドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする導入遺伝子との間に配置される合成イントロン（配列番号９３）を有する（図７）。

【0359】

実施例５
[0381]哺乳動物においてイントロンを有するカセット（ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩ）に対するイントロンを含まないカセット（ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩイントロンなし；配列番号１）の効力を評価するために、およそ８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、ＡＡＶキャプシド形成したカセットを６．４ｅ９個又は１．６ｅ１０個のｖｇ／マウスの投与量で、外側尾静脈において静脈内注射した。血漿を、表示するように幾つかの時点で収集して（図８及び図９）、ｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡによって、循環ｈＦＶＩＩＩレベルに関して評価した。

【0360】

[0382]ｈＦＶＩＩＩレベルの決定により、ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩイントロンなしが、ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩ（イントロンを有する）に対して、効力において著しい増加を示すことが示され（図８及び図９）、この効果は、検査した用量及び時点の両方で観察された（研究＃１）。これらの結果を、各群において１０匹のマウスで、１．６ｅ１０個のｖｇ／マウスを用いた、続く研究である研究＃２において繰り返した（図１０）。研究＃２により、ＴＴＲｍ ｈＦＶＩＩＩイントロンなし（ＡＡＶ－ＩＮＴＬ）が、合成イントロンを含有するベクター（ＡＡＶ－ＷＩＮＴ）よりも強力であること、またこれらの差は、少なくとも８週間持続されることが確認された。

【0361】

実施例６：ＮＨＰにおける効力、研究１
[0383]ＡＡＶ－ＩＮＴＬ及びＡＡＶ－ＷＩＮＴのＡＡＶベクターの効力を、ＮＨＰにおいて比較した（研究＃１）。２４月齢～５０月齢の、体重２ｋｇ～６ｋｇで、ＡＡＶ中和抗体に関して陰性である１２匹の雄カニクイザル（マカク・ファスキクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を、４つの無作為化群に分けて、表１に示す投薬群に基づいて、単回用量のＡＡＶ－ＷＩＮＴ又はＡＡＶ－ＩＮＴＬのいずれかを静脈内注射した。続いて、血漿試料を毎週入手して、循環ｈＦＶＩＩＩのレベルを決定した。

【0362】

【表1】

【0363】

[0384]ＡＡＶ－ＷＩＮＴ又はＡＡＶ－ＩＮＴＬのいずれかを投薬したサルの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを、ＥＬＩＳＡによって、８週の研究全体にわたって週に１回の間隔で決定した。この研究で検査したいずれかの用量、２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ（図１１）又は６ｅ１２２ｖｇ／ｋｇ（図１２）で、時点にかかわらず、ピークの循環値に基づく２倍～４倍の循環ｈＦＶＩＩＩのレベルの増加が観察された。予想通り、本発明者らは、治療の２週～３週後に発現の損失を観察し、ＢＤＤ ｈＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の発現が示された。第１の研究の結果により、ＡＡＶ－ＩＮＴＬは、ＮＨＰにおいて、ＡＡＶ－ＷＩＮＴに対して、効力の増加を示すことが実証される。

【0364】

実施例７：ＮＨＰにおける効力、研究２
[0385]第２の研究（研究＃２）は、ＡＡＶ－ＷＩＮＴに対するＡＡＶ－ＩＮＴＬのベクター効力の増加を確認するために、ＮＨＰにおいて試みた。２４月齢～５０月齢の、体重２ｋｇ～６ｋｇで、ＡＡＶ中和抗体に関して陰性である１０匹の雄カニクイザル（マカク・ファスキクラリス）を、２つの無作為化群に分けて、単回用量（２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ－ＷＩＮＴ又はＡＡＶ－ＩＮＴＬのいずれかを静脈内注射した。続いて、血漿試料を毎週入手して、循環ｈＦＶＩＩＩのレベルを決定した。

【0365】

[0386]ＡＡＶ－ＷＩＮＴ又はＡＡＶ－ＩＮＴＬのいずれかを投薬したマカクの血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを、ＥＬＩＳＡによって、８週の研究全体にわたって週に１回の間隔で決定した。この研究で検査した用量、２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇで、時点にかかわらず、ピークの循環値に基づく２倍～７倍の循環ｈＦＶＩＩＩのレベルの増加が観察された（図１３）。ＮＨＰでこれまで見られるように、ＢＤＤ ｈＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の発現に起因して、治療の２週～３週後に導入遺伝子の発現の損失が観察された。研究＃２の結果により、ＡＡＶ－ＩＮＴＬは、ＮＨＰにおいて、ＡＡＶ－ＷＩＮＴに対して、効力の増加を示すことが確認された。

【0366】

実施例８：ベクター効力の決定
[0387]正確なベクターが、適正な濃度で、ＮＨＰの各群に投薬されたかを確認するために、投薬配合物力価をｑＰＣＲによって決定し、ＡＡＶ－ＷＩＮＴと、ＡＡＶ－ＩＮＴＬとの間の差を可能にする遺伝子型決定ＰＣＲアッセイによって、ストックベクターにおける合成イントロンの存在又は不在をアッセイした。未希釈のストックベクター及び２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇの投薬配合物の両方のベクター効力を直接評価するために、細胞ベースの効力アッセイを利用した。

【0367】

[0388]ヒト肝臓細胞株を、ベクターの一連の希釈物で形質導入して、ｈＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４）によって、上清中の分泌されたＢＤＤ ｈＦＶＩＩＩを評価することによって、効力を決定した。全てのＭＯＩで、ＡＡＶ－ＩＮＴＬは、ＡＡＶ－ＷＩＮＴに対して効力の増加を示した（図１４）。とりわけ、ストックウイルス及び希釈配合物は、ベクター群内で同様の効力を示し、２ｅ１２個のｖｇ／ｋｇ群における投薬配合物の力価が適正に調製されることがさらに確認された。さらに、それぞれのＭＯＩで、ＡＡＶ－ＷＩＮＴと比較して、ＡＡＶ－ＩＮＴＬは、効力のおよそ４倍の増加を示した（図１５）。これらの値は、ＮＨＰの研究１及び研究２において観察されるＡＡＶ－ＩＮＴＬの効力の増加に一致している。

【0368】

実施例９：ロット比較
[0389]第１のＮＨＰ研究及び第２のＮＨＰ研究は、ＡＡＶ－ＷＩＮＴベクター及びＡＡＶ－ＩＮＴＬベクターの異なるロットを使用した。異なるロットにおけるベクター効力が同等であったかどうかを評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、効力を評価した（図１６）。これらの比較の結果により、バッチ間変動が最小であったこと、またＡＡＶ－ＩＮＴＬが、同様にＡＡＶ－ＷＩＮＴよりも約４倍～５倍強力のままであったことが示される。

【0369】

実施例１０：発現カセット効率の決定
[0390]効力の増加のメカニズムをｉｎ ｖｉｖｏで研究するために、ウイルス形質導入の非存在下での転写効率を決定した。それぞれ、ＡＡＶ－ＷＩＮＴ及びＡＡＶ－ＩＮＴＬ、ＴＴＲｍ－イントロン－ＢＤＤ－ｈＦＶＩＩＩ及びＴＴＲｍ－ＢＤＤ－ｈＦＶＩＩＩイントロンなしを構成する発現カセット（配列番号１）を含有するプラスミドで、ヒト肝臓細胞株をトランスフェクトした。これらの細胞由来の上清を、ヒトＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４）によって、ｈＦＶＩＩＩレベルに関してアッセイした。

【0370】

[0391]ＴＴＲｍ－イントロン－ＢＤＤ－ｈＦＶＩＩＩの３個の独立したＤＮＡ調製物及びＴＴＲｍ－ＢＤＤ－ｆＨＶＩＩＩイントロンなし（配列番号１）の２個の独立したＤＮＡ調製物の比較は、類似したｈＦＶＩＩＩレベルを示し、イントロン除去すると、発現の減少の傾向が見られた（図１７）。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、データにより、非転写メカニズムが、ＡＡＶ－ＷＩＮＴを上回るＡＡＶ－ＩＮＴＬの効力の増加を駆動していることが示唆される。

【0371】

実施例１１：データの論述
[0392]対応する用量で、ＡＡＶ－ＩＮＴＬは、ＡＡＶ－ＷＩＮＴよりも、細胞培養物、マウス及びＮＨＰモデルにおいて、ＢＤＤ－ｈＶＩＩＩの効力及び発現の増加を示した。機構的に、効力の増加は、一見したところ発現カセットからのＦＶＩＩＩ導入遺伝子の転写の増加に起因しなかったようであり、代わって、おそらくウイルスパッケージング効率又は代替メカニズムに起因している。これらの結果は、イントロンを含まない発現カセットが、ヒト臨床試験において効力の増加を有する可能性があり、患者の安全性及び有効性に対して有益性を提供し得ることを示している。

【0372】

実施例１２：ヒト臨床試験の結果
[0393]血友病Ａを患う４名の男性（Ｎ＝４）において、単回用量研究を実施し、表４に概要を示した。４名の参加者全てに、本明細書では「ＬＫ０３－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ」と称されるＬＫ０３ ＡＡＶベクター（配列番号９１）においてキャプシド形成されるＡＡＶ－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ発現カセット（配列番号１）の単回注入を、５×１０^１１個のｖｇ／ｋｇの用量で付与した。

【0373】

【表2】

【0374】

[0394]ＬＫ０３－ＩＮＴＬ ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤベクターは、４名全ての参加者において、ＦＶＩＩＩ発現を駆動することが観察された（図１８～図１９）。

【0375】

[0395]
実施例１３：配列

【0376】

【表3】

【0377】

ＡＡＶ－ＩＮＴＬ発現カセット（５’－ＩＴＲ、ＴＴＲｍ、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ、ポリＡ、及び３’ＩＴＲ）（配列番号１）の全核酸配列及び説明（表３）：
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgtcgacgtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctgctagcgtttaaacgccaccatgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttcccccccagggtgcccaagagcttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgtttcctgggggcagccatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgacctacagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgtagggagggcagcctggctaaggaaaagacccagaccctgcataagtttatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcttggcctaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggcaccacccctgaggtccatagcatcttcctggagggccacactttcctggtgaggaaccacagacaggcctctctggagatctctcccatcaccttcctgactgctcagactctgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccatattagcagccaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaagactatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcattcagatcaggtctgtggccaagaaacaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaagaggactgggactatgctcccctggtgctggcccctgatgataggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggcatcctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctatcctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccctaccaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactattctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctggcctgattgggcccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagactgactttctgtctgtgttcttttctggctataccttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggatcctggggtgccacaactctgattttaggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactactatgaggacagctatgaggacatttctgcttatctgctgtctaagaataatgccattgagcccagaagcttcagccagaatccccctgtgctgaagagacatcagagggagatcaccagaactaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtctcccaggagctttcagaagaagaccagacattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggaattcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctggggccttatatcagggctgaggtggaggataatattatggtgactttcaggaaccaggccagcaggccctactctttctatagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctacttctggaaggtccagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctatttctctgatgtggatctggagaaggatgtccattctgggctgattggccccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtccaggagtttgccctgttcttcactatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatggagaggaactgcagagctccttgcaatattcagatggaggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccacagcatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagctctctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttgggaatgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaatccccccatcattgctaggtatattaggctgcatcccacccactacagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggagcccctctaaggccaggctgcatctgcaggggaggagcaatgcctggaggcctcaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtcaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttctttcagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagtcttgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggctcaggatctgtactgagcggccgcaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg

【0378】

【表4】

【0379】

野生型ＴＴＲプロモーター（配列番号２）。４個の下線を付したヌクレオチドは、以下の変異ＴＴＲプロモーター（配列番号３）において変更されている。
gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctg

【0380】

変異ＴＴＲプロモーター（４個のヌクレオチド変化、下線を付してある）「ＴＴＲｍ」（配列番号３）：
gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctg

【0381】

ＣｐＧ１－ＴＴＲｍの核酸配列（配列番号４）。ＣｐＧ１において、４個全てのＣｐＧに関して、あらゆるＣが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１－ＴＴＲｍである。

【0382】

配列番号４：

【化1】

【0383】

配列番号５：

【化2】

【0384】

ＣｐＧ２－ＴＴＲｍの核酸配列（配列番号６）。ＣｐＧ２において、２番目、３番目及び４番目のＣｐＧに関して、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ２－ＴＴＲｍである。

【0385】

配列番号６：

【化3】

【0386】

配列番号７：

【化4】

【0387】

ＣｐＧ３－ＴＴＲｍの核酸配列（配列番号８）。ＣｐＧ３において、１番目、３番目及び４番目のＣｐＧに関して、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号９は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ３－ＴＴＲｍである。

【0388】

配列番号８：

【化5】

【0389】

配列番号９：

【化6】

ＣｐＧ４－ＴＴＲｍの核酸配列（配列番号１０）。ＣｐＧ４において、１番目、２番目及び４番目のＣｐＧに関して、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号１１は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ４－ＴＴＲｍである。

【0390】

配列番号１０：

【化7】

【0391】

配列番号１１：

【化8】

【0392】

ＣｐＧ５－ＴＴＲｍの核酸配列（配列番号１２）。ＣｐＧ５において、１番目、２番目及び３番目のＣｐＧに関して、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号１３は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ５－ＴＴＲｍである。

【0393】

配列番号１２：

【化9】

【0394】

配列番号１３：

【化10】

【0395】

ハイブリッド６プロモーター（ＴＴＲ／ｈＡＡＴ／アルブミンハイブリッド）の核酸配列（配列番号１４）。単一のＣｐＧジヌクレオチドにおいて、Ｇが、Ａに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。（イタリック体＝ＴＴＲ、下線＝アルブミン、太字＝ｈＡＡＴ。）配列番号１５は、これらの制限酵素部位を有するハイブリッド６プロモーターである。

【0396】

【化11】

【0397】

ハイブリッド７プロモーター（ＴＴＲ／ｈＡＡＴ／ハイブリッド）の核酸配列（配列番号１６）。両方のＣｐＧジヌクレオチドにおいて、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。（イタリック体＝ＴＴＲ、太字＝ｈＡＡＴ。）配列番号１７は、これらの制限酵素部位を有するハイブリッド７プロモーターである。

【0398】

【化12】

【0399】

ハイブリッド８プロモーター（ＴＴＲ／ＦＧＧ（フィブリノゲンガンマ鎖遺伝子プロモーター）／アルブミンプロモーターハイブリッド）の核酸配列（配列番号１８）。単一のＣｐＧジヌクレオチドにおいて、Ｇが、Ａに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。（下線＝アルブミン、下線イタリック体＝ＦＧＧ、イタリック体＝ＴＴＲ。）配列番号１９は、これらの制限酵素部位を有するハイブリッド８プロモーターである。

【0400】

【化13】

【0401】

ハイブリッド９プロモーター（ＴＴＲ／ＦＧＧ／ｈＡＡＴ／ＳＡＡ１ハイブリッド）の核酸配列（配列番号２０）。３個全てのＣｐＧジヌクレオチドにおいて、Ｃが、Ｔに変更されている（二重下線を付してある）。配列が、ＦＶＩＩＩ発現カセットにクローニングされた際、ＭｌｕＩ（ａｃｇｃｇｔ）及びＰｍｅＩ（ｇｔｔｔａａａｃ）制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。（イタリック体＝ＴＴＲ、太字＝ｈＡＡＴ、下線イタリック体＝ＦＧＧ、下線太字＝ＳＡＡ１。）配列番号２１は、これらの制限酵素部位を有するハイブリッド９プロモーターである。

【0402】

【化14】

【0403】

ＣｐＧが低減されていないＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ調節エレメントの核酸配列（配列番号２２）。該配列は、総計のＣｐＧを含有する（二重下線を付してある）。Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質）部位に下線を付してある。

【0404】

【化15】

【0405】

ＡｐａＩ制限部位によって５’末端及び３’末端で隣接される、ＣｐＧが低減されていないＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ調節単位の核酸配列（配列番号２３）。該配列は、総計１６個のＣｐＧを含有する（二重下線を付してある）。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位が使用された。

【0406】

【化16】

【0407】

ＣｐＧ１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号２４）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更されている。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号２５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0408】

【化17】

【0409】

ＣｐＧ２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号２６）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更の「ｃ」は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、それぞれ、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号２７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0410】

【化18】

【0411】

ＣｐＧ３－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号２８）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、２番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更の「ｃ」は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号２９は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ３－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0412】

【化19】

【0413】

ＣｐＧ４－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号３０）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、３番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更の「ｃ」は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号３１は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ４－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0414】

【化20】

【0415】

ＣｐＧ５－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号３２）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、４番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（４番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号３３は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ５－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0416】

【化21】

【0417】

ＣｐＧ６－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号３４）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、５番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（５番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号３５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ６－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0418】

【化22】

【0419】

ＣｐＧ７－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号３６）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、６番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（６番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号３７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ７－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0420】

【化23】

【0421】

ＣｐＧ８－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号３８）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、７番目の部位は、変化を伴わずにそのままである。未変更のＣｐＧ（７番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号３９は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ８－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0422】

【化24】

【0423】

ＣｐＧ９－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号４０）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、８番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（８番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号４１は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ９－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0424】

【化25】

【0425】

ＣｐＧ１０－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号４２）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、９番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（９番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号４３は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１０－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0426】

【化26】

【0427】

ＣｐＧ１１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号４４）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１０番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１０番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号４５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0428】

【化27】

【0429】

ＣｐＧ１２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号４６）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１１番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１１番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号４７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0430】

【化28】

【0431】

ＣｐＧ１３－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号４８）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１２番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１２番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号４９は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１３－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0432】

【化29】

【0433】

ＣｐＧ１４－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号５０）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１３番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１３番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５１は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１４－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0434】

【化30】

【0435】

ＣｐＧ１５－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号５２）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１４番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１４番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５３は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１５－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0436】

【化31】

【0437】

ＣｐＧ１６－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号５４）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１５番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１５番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１６－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0438】

【化32】

【0439】

ＣｐＧ１７－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号５６）。あらゆるＣが、Ｔに変更されたが、但し、１６番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり、７番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。未変更のＣｐＧ（１６番目）は太字である。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１７－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0440】

【化33】

ＣｐＧ１８－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号５８）。５番目、７番目、８番目、１０番目及び１１番目のＣｐＧが除去され、残りのＣｐＧに関しては、Ｃが、Ｔに変更されている。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号５９は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１８－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0441】

【化34】

【0442】

ＣｐＧ１９－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号６０）。１番目～５番目及び８番目～１１番目のＣｐＧにおいて、Ｃが、Ｔに変更され、７番目のＣｐＧのＣが除去される。残りのＣｐＧ（６番目及び１２番目～１６番目）は、未変更である（太字）。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号６１は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ１９－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0443】

【化35】

【0444】

ＣｐＧ２０－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号６２）。推定転写因子結合部位を有さない領域の多重欠失の結果。唯一の残りのＣｐＧにおいて、Ｇが、Ａに変更された（配列番号２２の７番目のＣｐＧ）。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号６３は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ２０－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0445】

【化36】

【0446】

ＣｐＧ２１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号６４）。全てのＣｐＧにおいて、Ｃが、Ｔに変更されたが、但し、Ｇが、それぞれ、Ｃ及びＡに変更されている５番目及び６番目のＣｐＧを除く。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号６５は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ２１－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0447】

【化37】

【0448】

ＣｐＧ２２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴの核酸配列（配列番号６６）。全てのＣｐＧにおいて、Ｃが、Ｔに変更されたが、但し、５番目のＣｐＧは、変化を伴わずにそのままであり（太字）、６番目のＣｐＧでは、Ｇが、Ａに変更された。配列が、ＦＩＸ発現カセットにクローニングされた際、ＡｐａＩ制限部位は、５’末端及び３’末端に存在する。配列番号６７は、これらの制限酵素部位（下線を付してある）を有するＣｐＧ２２－ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴである。

【0449】

【化38】

【0450】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ（ＳＱ配列太字／下線）のアミノ酸配列（配列番号６８）。

【化39】

【0451】

ＳＱ配列（配列番号６９）。
SFSQNPPVLKRHQR

【0452】

野生型ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡ（配列番号７０）。
atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcaccgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga

【0453】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７１）
atgcagattgagctgtctacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgct
accaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctg
ggggagctgcctgtggatgccaggtttccccccagggtgcccaagagcttccccttcaat
acctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagttcactgatcatctgttcaacatt
gctaaacccaggcccccctggatggggctgctgggccctaccatccaggctgaggtgtat
gacactgtggtgatcactctgaagaacatggctagccatcctgtgtctctgcatgctgtg
ggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgatcagactagccagagg
gagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggctctcacacctatgtctggcaggtgctg
aaggagaatggccccatggcctctgatcctctgtgtctgacctatagctacctgagccat
gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgtagggag
gggagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcattctgctgtttgctgtg
tttgatgagggcaagagctggcattctgaaaccaagaacagcctgatgcaggacagggat
gctgcctctgctagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtcaataggtct
ctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggc
accacccctgaggtgcacagcatctttctggagggccacaccttcctggtgaggaatcac
agacaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatg
gacctgggccagtttctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggag
gcctatgtgaaggtggactcctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaataatgag
gaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgagatttgat
gatgacaattctcccagcttcattcagatcaggtctgtggccaagaagcatcccaagacc
tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgcccccctggtgctggcc
cctgatgacaggagctataagagccagtacctgaataatggcccccagaggattgggagg
aagtataagaaggtgaggttcatggcctatactgatgaaaccttcaagaccagagaggcc
atccagcatgagtctgggatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg
ctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctaccctcatggcatcact
gatgtgaggcctctgtacagcagaaggctgcccaagggggtgaagcatctgaaggacttc
cccattctgcctggggagattttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccca
accaagtctgaccctaggtgcctgactaggtactacagcagctttgtgaatatggagagg
gacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag
aggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag
aacaggagctggtacctgactgagaacattcagaggtttctgcccaaccctgctggggtg
cagctggaggaccctgaattccaggcctctaacatcatgcacagcattaatggctatgtg
tttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacattctgagc
attggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacacctttaagcacaag
atggtgtatgaggataccctgaccctgtttcctttctctggggagactgtgttcatgagc
atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaactctgacttcaggaacaggggg
atgactgctctgctgaaggtgagcagctgtgataagaacactggggactactatgaggac
agctatgaggacatctctgcctatctgctgagcaagaataatgctattgagcccaggagc
ttctctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccagaactactctg
cagtctgaccaggaggagattgactatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggag
gattttgatatttatgatgaggatgaaaaccagagccccaggagctttcagaagaagact
aggcactatttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtcttctagcccc
catgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttc
caggagttcactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcac
ctggggctgctgggcccttatatcagggctgaggtggaggataacatcatggtgaccttc
aggaaccaggccagcaggccctacagcttctactctagcctgatcagctatgaggaggac
cagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacttat
ttctggaaggtgcagcaccatatggcccccaccaaggatgagtttgattgcaaagcctgg
gcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattggccccctg
ctggtgtgccacaccaacactctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag
tttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagagctggtacttcactgagaacatg
gagaggaactgcagggccccctgcaatatccagatggaggaccccacctttaaggaaaat
tataggtttcatgccattaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcc
caggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacattcacagc
atccacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg
tataatctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatc
tggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctg
gtgtattctaacaagtgtcagacccccctgggcatggcctctggccatatcagggacttc
cagatcactgcctctggccagtatgggcagtgggcccccaagctggccaggctgcattac
tctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagccattcagctggattaaggtggacctg
ctggctccaatgattatccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagtttagcagc
ctgtacatctctcagtttatcatcatgtactctctggatggcaaaaagtggcagacctac
aggggcaattctactggcactctgatggtgttctttggcaatgtggacagctctgggatc
aagcacaacatctttaacccccctatcattgccaggtacattaggctgcaccccacccat
tacagcatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgcagc
atgcccctgggcatggagagcaaggctatctctgatgcccagattactgccagcagctac
ttcaccaatatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcagg
tctaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag
aagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagagcctgctgactagcatg
tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccatcagtggaccctgttcttc
cagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggacagcttcacccctgtggtgaac
agcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagagctgggtgcat
cagattgccctgaggatggaggtgctggggtgtgaggcccaggacctgtactga

【0454】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７２）
atgcagattgagctgtctacctgctttttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgcc
actaggaggtactacctgggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgatctg
ggggagctgcctgtggatgccaggtttcctcccagggtgcccaagtctttccccttcaat
acctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagtttactgatcacctgttcaacatt
gccaagcccaggcccccttggatgggcctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtat
gacactgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcaccctgtgagcctgcatgctgtg
ggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagg
gagaaggaggatgataaggtgttccctggggggagccacacttatgtgtggcaggtgctg
aaggagaatggcccaatggcctctgatcccctgtgcctgacctattcttacctgagccat
gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag
ggctctctggctaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg
tttgatgaggggaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggat
gctgcctctgccagggcctggcccaaaatgcacactgtgaatggctatgtgaataggagc
ctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtattggcatgtgattggcatgggc
accacccctgaggtgcactctatcttcctggagggccatactttcctggtgaggaatcat
aggcaggccagcctggagattagccccattacctttctgactgcccagaccctgctgatg
gacctgggccagttcctgctgttttgccacatcagctctcaccagcatgatggcatggag
gcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgag
gaggctgaggattatgatgatgatctgactgattctgaaatggatgtggtgaggtttgat
gatgacaatagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcatcctaagacc
tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgctcccctggtgctggcc
cctgatgacaggtcttacaagagccagtacctgaacaatggcccccagagaattgggagg
aagtataagaaggtgagattcatggcttacactgatgagaccttcaagactagggaggcc
atccagcatgagtctggcattctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg
ctgatcatcttcaagaaccaggcctctaggccctacaatatttacccccatgggatcact
gatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcatctgaaggacttc
cccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaagatggcccc
accaagtctgaccctaggtgcctgaccaggtactactcttcttttgtgaacatggagagg
gacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccag
agggggaaccagattatgtctgacaagaggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgag
aacaggagctggtatctgactgagaacatccagaggttcctgcccaatcctgctggggtg
cagctggaggaccctgagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtg
tttgattctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagc
attggggctcagactgatttcctgtctgtgttcttttctggctacacctttaagcataag
atggtgtatgaggacactctgaccctgtttcccttctctggggagactgtgtttatgagc
atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaactctgatttcaggaacaggggc
atgactgctctgctgaaggtgtcttcttgtgacaagaacactggggactattatgaggac
agctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccagatct
ttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggaccaccctg
cagtctgaccaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggag
gactttgatatctatgatgaggatgagaaccagtctcccaggagcttccagaaaaagacc
aggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtcttctagcccc
catgtgctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttc
caggagttcactgatgggagcttcacccagcctctgtacaggggggagctgaatgagcac
ctggggctgctgggcccttatattagggctgaggtggaggacaacatcatggtgactttc
aggaatcaggcctctaggccctatagcttctacagctctctgatcagctatgaggaggat
cagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctac
ttctggaaggtgcagcaccacatggctcctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgg
gcctacttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctg
ctggtgtgtcataccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag
tttgccctgttcttcaccatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatg
gagaggaattgcagagccccttgcaacatccagatggaggacccaaccttcaaagagaac
tacaggttccatgccatcaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggct
caggaccagaggatcaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaatatccatagc
attcacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg
tataacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgccaagcaaggctgggatt
tggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctg
gtgtactccaataagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttc
cagatcactgcctctggccagtatgggcagtgggccccaaagctggccaggctgcactat
tctgggagcatcaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggattaaggtggatctg
ctggcccccatgatcattcatggcatcaaaacccagggggctagacagaagttttctagc
ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacttac
aggggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggcaatgtggacagctctggcatc
aagcacaacatctttaacccccccattattgccaggtatatcaggctgcatcccacccac
tattctattaggtctactctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaacagctgtagc
atgcccctggggatggagagcaaggctatctctgatgcccagatcactgccagctcttat
ttcaccaatatgtttgccacctggtctccctctaaggccaggctgcacctgcagggcagg
agcaatgcttggaggccccaggtgaataaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag
aagaccatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagtctctgctgactagcatg
tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatgggcatcagtggactctgttcttc
cagaatggcaaggtgaaggtcttccaggggaaccaggatagcttcactcctgtggtgaac
tctctggacccccccctgctgactaggtatctgaggatccacccccagagctgggtgcac
cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtattga

【0455】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７３）
atgcagattgaactgtctacttgtttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgct
actaggaggtactatctgggggctgtggagctgtcttgggactatatgcagtctgacctg
ggggagctgcctgtggatgctaggtttccccccagggtgcccaagagcttcccctttaac
acctctgtggtgtataagaagactctgtttgtggagttcactgaccatctgttcaacatt
gccaagccaaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtat
gacactgtggtgattactctgaagaacatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtg
ggggtgtcttactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagacctctcagagg
gagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggctctcatacctatgtgtggcaggtcctg
aaggagaatgggcccatggcctctgaccccctgtgcctgacctactcttatctgtctcat
gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag
ggcagcctggctaaggagaagacccagactctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg
tttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggat
gctgcctctgctagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacaggagc
ctgccaggcctgattggctgccataggaagtctgtgtattggcatgtgattgggatgggg
actacccctgaggtccacagcattttcctggaggggcatacctttctggtgaggaaccac
aggcaggcctctctggagatctctcccattactttcctgactgcccagaccctgctgatg
gacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatggcatggag
gcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaaaaacaatgag
gaggctgaggattatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgat
gatgataacagccccagcttcatccagattaggtctgtggccaagaagcatcccaagacc
tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgctcctctggtgctggcc
cctgatgacaggagctacaagagccagtacctgaataatggcccccagaggattggcagg
aagtataagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggcc
atccagcatgaatctgggatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg
ctgattatctttaagaaccaggctagcaggccctacaacatttacccccatggcattact
gatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaggatttc
cccattctgcctggggagatctttaagtacaaatggactgtgactgtggaggatggccct
actaagtctgatcccaggtgtctgaccagatactacagcagctttgtgaatatggagagg
gacctggcttctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccag
aggggcaatcagattatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag
aacagaagctggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcccaaccctgctggggtg
cagctggaggaccctgagttccaggctagcaatatcatgcacagcattaatggctatgtg
tttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctattggtacattctgagc
attggggcccagactgatttcctgtctgtgttcttttctggctacaccttcaagcacaag
atggtgtatgaggatactctgaccctgtttcccttctctggggagactgtgttcatgagc
atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgtcacaactctgacttcaggaacaggggc
atgactgccctgctgaaggtgagctcttgtgataagaacactggggactactatgaggac
tcttatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccaggagc
ttctctcagaatccccctgtgctgaagaggcatcagagggagatcactaggactaccctg
cagtctgaccaggaagagattgactatgatgacaccatctctgtggaaatgaagaaggag
gactttgatatctatgatgaggatgaaaaccagagccccaggagcttccagaagaagacc
aggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatgggatgagctcttctccc
catgtgctgaggaatagggctcagtctggctctgtcccacagttcaagaaggtggtgttt
caggagttcactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcat
ctgggcctgctggggccctacatcagggctgaggtggaggataacattatggtgactttc
aggaaccaggcctctaggccctacagcttctacagcagcctgatcagctatgaggaggac
cagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctat
ttctggaaggtgcagcatcacatggctcccactaaagatgagtttgactgcaaggcctgg
gcctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccctctg
ctggtctgccatactaacaccctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag
tttgccctgttctttaccatctttgatgagaccaagtcttggtacttcactgagaacatg
gagaggaactgcagggccccctgtaacatccagatggaggaccccacctttaaggagaac
tacaggttccatgccatcaatggctacatcatggacactctgcctggcctggtgatggcc
caggaccagaggatcaggtggtacctgctgtctatgggctctaatgagaacattcattct
atccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg
tacaatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatc
tggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctg
gtctatagcaataagtgccagacccccctggggatggcctctgggcatatcagagacttc
cagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactac
tctggcagcattaatgcctggagcaccaaggagcccttctcttggatcaaggtggacctg
ctggctcccatgatcatccatgggatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagc
ctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatggcaagaagtggcagacctac
aggggcaatagcactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtggacagctctggcatc
aagcacaatatcttcaacccccccatcattgccaggtacatcagactgcaccccactcat
tacagcatcaggagcactctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaatagctgctct
atgcccctgggcatggagagcaaggccatttctgatgcccagattactgcctcttcttac
ttcactaatatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcatctgcaggggagg
agcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag
aagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgaccagcatg
tatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatgggcaccagtggaccctgtttttc
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cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga

【0456】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７４）
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actaggaggtattatctgggggctgtggagctgtcctgggactacatgcagtctgatctg
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cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga

【0457】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７５）
atgcagattgagctgtctacttgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgcc
actaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctg
ggggagctgcctgtggatgccaggtttcctcccagggtgcctaagagcttccccttcaac
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cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga

【0458】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７６）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgccaccaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttccctcccagggtgcccaagtctttccccttcaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcctccctggatgggcctgctgggccccaccattcaggctgaggtgtatgacactgtggtcatcaccctgaaaaatatggctagccaccctgtgtctctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccacacttatgtgtggcaggtgctgaaagagaatggccccatggcttctgatcccctgtgtctgacctatagctacctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggctaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcttctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgtctattggcatgtgattggcatgggcactactcctgaggtgcacagcatctttctggagggccacaccttcctggtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccatcactttcctgactgctcagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgtcacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggaaccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaattctcctagcttcattcagatcagatctgtggccaaaaagcatcctaagacttgggtgcattatattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctggctcctgatgataggagctacaagtctcagtacctgaataatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccattcagcatgagtctgggattctggggcccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctacccccatgggattactgatgtgaggcccctgtactctaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggattttcctatcctgcctggggaaatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccactaagtctgatcccaggtgtctgaccaggtattatagctcttttgtgaacatggagagggatctggcctctgggctgattggccctctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtatctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggctagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgtctgcatgaggtggcctactggtatatcctgtctattggggcccagactgacttcctgtctgtgtttttttctgggtatacttttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgactctgttccccttctctggggagactgtgtttatgagcatggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaattctgacttcaggaatagggggatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgataagaatactggggactactatgaggactcttatgaggacatttctgcctatctgctgtctaagaacaatgccattgaacccaggagcttctctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggaaatcaccagaactactctgcagtctgatcaggaggaaattgactatgatgacactatttctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagcccaaggagcttccagaagaagactaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagcagcccccatgtgctgagaaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatgggagcttcacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctatattagggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttcaggaatcaggcctctaggccctacagcttctacagcagcctgattagctatgaggaggatcagaggcagggggctgaacccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgctcatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagtcttggtacttcactgagaatatggagaggaattgcagggccccctgcaatattcagatggaagaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatggctacatcatggataccctgcctggcctggtgatggcccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccactctatccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtataagatggccctgtacaacctgtaccctggggtctttgagactgtggagatgctgccttctaaggctggcatttggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaataagtgccagacccccctgggcatggcctctgggcatatcagggatttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggccccaaagctggctaggctgcactactctgggagcatcaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatccatgggattaagactcagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcattatcatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacctataggggcaactctactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtggatagctctgggatcaagcacaatatcttcaacccccccatcattgccaggtatatcaggctgcaccccacccactacagcattaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgtagcatgcctctgggcatggagtctaaggccatttctgatgcccagattactgctagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggtctcccagcaaggccaggctgcatctgcagggcaggtctaatgcttggaggccccaggtgaacaacccaaaggagtggctgcaggtggatttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagtctctgctgacctctatgtatgtgaaggagttcctgatctctagcagccaggatggccatcagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaagtgttccagggcaatcaggatagcttcactccagtggtgaacagcctggatccccctctgctgactaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga

【0459】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７７）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttcccccccagggtgcccaagagcttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgtttcctgggggcagccatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgacctacagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgtagggagggcagcctggctaaggaaaagacccagaccctgcataagtttatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcttggcctaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggcaccacccctgaggtccatagcatcttcctggagggccacactttcctggtgaggaaccacagacaggcctctctggagatctctcccatcaccttcctgactgctcagactctgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccatattagcagccaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaagactatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcattcagatcaggtctgtggccaagaaacaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaagaggactgggactatgctcccctggtgctggcccctgatgataggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggcatcctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctatcctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccctaccaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactattctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctggcctgattgggcccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagactgactttctgtctgtgttcttttctggctataccttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggatcctggggtgccacaactctgattttaggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactactatgaggacagctatgaggacatttctgcttatctgctgtctaagaataatgccattgagcccagaagcttcagccagaatccccctgtgctgaagagacatcagagggagatcaccagaactaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtctcccaggagctttcagaagaagaccagacattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggaattcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctggggccttatatcagggctgaggtggaggataatattatggtgactttcaggaaccaggccagcaggccctactctttctatagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctacttctggaaggtccagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctatttctctgatgtggatctggagaaggatgtccattctgggctgattggccccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtccaggagtttgccctgttcttcactatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatggagaggaactgcagagctccttgcaatattcagatggaggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccacagcatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagctctctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttgggaatgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaatccccccatcattgctaggtatattaggctgcatcccacccactacagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggagcccctctaaggccaggctgcatctgcaggggaggagcaatgcctggaggcctcaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtcaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttctttcagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagtcttgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggctcaggatctgtactga

【0460】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７８）
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【0461】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号７９）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgagattttgcttttctgccactaggaggtattacctgggggctgtggagctgtcttgggactacatgcagtctgatctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccacctagggtgcctaagagctttcccttcaatacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcctaggcccccctggatgggcctgctgggccctaccatccaggctgaagtgtatgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtcttactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggagaaggaagatgacaaggtgttccctgggggcagccacacctatgtctggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgatcccctgtgcctgacctactcttacctgagccatgtggacctggtgaaggatctgaattctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaagggaagagctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctggcctgattgggtgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggcactacccctgaggtgcatagcatcttcctggaaggccataccttcctggtgaggaatcataggcaggcttctctggaaatttctcccatcactttcctgactgctcagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagctctcaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggacagctgtcctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtcaggtttgatgatgacaatagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccctctggtgctggcccctgatgacaggagctataagtctcagtacctgaataatggcccccagaggattgggaggaagtataagaaggtgaggtttatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggcctctaggccctacaatatctaccctcatggcatcactgatgtgagacccctgtatagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccccaccaagtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagctcttttgtgaacatggagagggatctggcctctgggctgattggcccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaatcagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgaaaataggtcttggtatctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagtttcaggcctctaatatcatgcattctatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggctcagactgacttcctgtctgtgttcttttctggctatactttcaagcacaagatggtgtatgaggacactctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgtctatggaaaatcctgggctgtggattctgggctgccacaattctgacttcaggaatagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggattactatgaggactcttatgaagatatctctgcctatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccactctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggattttgacatttatgatgaggatgagaaccagtctcccaggagcttccagaagaagaccaggcattactttattgctgctgtggagaggctgtgggactatgggatgagcagctctcctcatgtgctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatgggagcttcacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgaccttcaggaaccaggctagcaggccttacagcttttacagcagcctgatctcttatgaagaagaccagaggcagggggctgagcccaggaagaattttgtgaagcctaatgagaccaagacttatttttggaaggtgcagcatcacatggctcctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctacttttctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccctctgctggtgtgccatactaacactctgaaccctgcccatgggaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcactatttttgatgagaccaagtcttggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagggctccctgcaacatccagatggaagaccccaccttcaaggagaactataggttccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctggcctggtgatggcccaggatcagaggattaggtggtatctgctgagcatgggctctaatgagaacatccacagcatccatttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaacctgtatcctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggaatgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcactctgttcctggtgtatagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccatatcagggatttccagatcactgcttctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcctggagcactaaggagcctttttcttggatcaaggtggacctgctggcccctatgattattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttctctagcctgtacatctctcagttcatcattatgtatagcctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttgggaatgtggactcttctgggatcaagcacaacatctttaacccccccatcattgccaggtatattaggctgcaccccacccactacagcatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaattcttgctctatgcccctgggcatggagagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagctcttacttcaccaacatgtttgccacctggtctcctagcaaggccaggctgcatctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgacctctatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttcttccagaatgggaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggatagctttacccctgtggtgaacagcctggaccctcctctgctgaccagatacctgaggatccatcctcagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga

【0462】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８０）
atgcagattgagctgagcacttgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttttctgctactaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttcccccccagggtgcccaagtcttttcctttcaacacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtgattaccctgaagaacatggctagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctattggaaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggaaaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccatacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgaccccctgtgcctgacttacagctatctgagccatgtggacctggtgaaggatctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgcagggagggcagcctggctaaggagaagactcagactctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaaggcaagagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcttggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattgggtgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcattttcctggagggccacaccttcctggtgaggaatcacaggcaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatggacctggggcagtttctgctgttctgccacatcagcagccatcagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggactcttgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcatccagattaggtctgtggccaagaagcaccctaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctggctcctgatgacaggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcttacactgatgagaccttcaagactagggaggccatccagcatgagtctggcatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatttaccctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggagactgcccaagggggtgaagcacctgaaggattttcccattctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccaccaagtctgatcccaggtgcctgactaggtactactcttcttttgtgaatatggagagggatctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaatatccagaggttcctgcctaatcctgctggggtccagctggaggatcctgagttccaggctagcaacattatgcacagcatcaatggctatgtgtttgattctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtacatcctgtctattggggcccagactgatttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaagcataagatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctggcctgtggatcctgggctgtcataactctgacttcagaaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaacactggggactactatgaggacagctatgaggatatctctgcttatctgctgagcaagaataatgccattgagcccaggagcttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggactaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagtcccccaggtctttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagcccccatgtgctgaggaacagggctcagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtcttccaggagttcactgatggctcttttacccagcctctgtacagaggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgaccttcagaaaccaggcctctaggccctacagcttctacagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctactaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcttatttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattggccccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcactatctttgatgagaccaagagctggtacttcactgagaacatggagagaaattgtagggctccctgcaatatccagatggaggaccccaccttcaaagaaaattacagattccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctgggctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatggggtctaatgagaacatccactctatccatttctctggccatgtgttcactgtgagaaagaaggaggagtataagatggctctgtacaacctgtacccaggggtgtttgagactgtggaaatgctgcccagcaaagctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagactcccctgggcatggcctctgggcacatcagggattttcagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactactctggcagcattaatgcttggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggatctgctggcccccatgatcatccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttctctagcctgtacatttctcagttcatcatcatgtacagcctggatgggaagaagtggcagacctacagggggaacagcactgggaccctgatggtgttctttggcaatgtggatagctctggcatcaagcacaatatcttcaatccccccattattgccaggtacattaggctgcatcctactcactactctattaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgttctatgcccctgggcatggagtctaaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctacttcactaatatgtttgccacctggagccctagcaaggccagactgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggaccctgttcttccagaatgggaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggatcctcccctgctgaccaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgctctgaggatggaagtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga

【0463】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８１）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgctaccaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttccctcccagggtgcccaagagcttcccctttaatacctctgtggtgtacaagaaaaccctgtttgtggagttcactgaccatctgttcaacattgccaagcccaggcccccttggatgggcctgctgggccccaccattcaggctgaggtgtatgacactgtggtcattaccctgaagaacatggcttctcaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgataaggtgttccctgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgatcccctgtgcctgacctactcttatctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgcagggagggctctctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttattctgctgtttgctgtctttgatgagggcaagagctggcattctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctgccagggcctggcccaaaatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcatcttcctggagggccacacctttctggtgaggaatcacaggcaggccagcctggagattagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaaaaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagctttattcagattaggtctgtggctaagaagcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgcccctctggtcctggcccctgatgataggtcttacaagagccagtatctgaacaatggcccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggccattcagcatgagtctgggatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacactctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccttataacatctaccctcatgggatcactgatgtgaggcccctgtactctagaaggctgcccaagggggtcaagcacctgaaggattttcccatcctgcctggggagattttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccaccaagtctgaccctaggtgcctgaccaggtactacagctcttttgtgaacatggagagggacctggcctctggcctgattggccctctgctgatttgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaacaggtcttggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcctaacccagctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatattatgcatagcattaatggctatgtgtttgatagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagactgactttctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcataagatggtgtatgaggacaccctgactctgttccctttttctggggagactgtgtttatgagcatggagaatcctggcctgtggatcctgggctgccataattctgacttcaggaacaggggcatgactgccctgctgaaagtgagcagctgtgacaagaatactggggactactatgaagacagctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttcagccagaaccccccagtgctgaagaggcaccagagagagatcaccaggactaccctgcagtctgaccaggaggagattgactatgatgacaccatttctgtggagatgaagaaggaggactttgacatttatgatgaggatgagaatcagagccccaggagcttccagaagaagactaggcactattttattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagctctccccatgtgctgaggaatagggcccagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatggcagctttacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctatatcagggctgaggtggaggacaatattatggtgacctttaggaaccaggccagcaggccctactctttctatagcagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaattttgtgaagcctaatgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggcttgggcctatttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgagaccaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggatcccaccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacactctgcctggcctggtgatggcccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccatagcatccacttctctggccatgtgttcactgtcaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctgggatgagcaccctgtttctggtgtactctaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctgggcacatcagggatttccagatcactgcttctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactactctggcagcatcaatgcctggtctaccaaggagcccttttcttggattaaggtggacctgctggcccccatgatcatccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggcaaaaagtggcagacctacaggggcaatagcactgggactctgatggtgttctttggcaatgtggacagctctgggatcaagcacaatatcttcaaccctcccatcattgctaggtacatcaggctgcaccccacccactatagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctgggcatggagtccaaagctatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggtctccctctaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtggatttccagaaaactatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagtctctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggactctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggacagcttcacccctgtggtgaactctctggatccccccctgctgaccaggtacctgaggattcatccccagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtgctggggtgtgaggctcaggacctgtattga

【0464】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８２）
atgcagattgagctgtctacttgtttttttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgatctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccccccagggtgcccaagagcttccccttcaacacctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagttcactgatcatctgtttaacattgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggcccaactatccaggctgaggtgtatgacactgtggtcatcaccctgaagaatatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgacttatagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtctgtagggaaggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttattctgctgtttgctgtgtttgatgaaggcaagagctggcactctgagaccaagaattctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctggcccaagatgcatactgtgaatggctatgtgaacagaagcctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgtgtattggcatgtgattgggatgggcactacccctgaagtgcacagcattttcctggagggccacactttcctggtgaggaaccacaggcaggcctctctggagatcagccccattactttcctgactgcccagaccctgctgatggatctgggccagttcctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggacagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaataatgaggaggctgaggattatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgataatagccccagcttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcatcccaagacctgggtgcactatattgctgctgaagaggaggactgggactatgcccctctggtgctggctcctgatgacaggagctataagagccagtatctgaacaatgggccccagaggattgggaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcattctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacactctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctacaatatttacccccatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccctaccaagtctgaccctaggtgtctgactaggtactacagcagctttgtgaacatggagagagacctggcttctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaaccagattatgtctgataagaggaatgtcatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtatctgactgagaacattcagaggttcctgcccaaccctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggccagcaacatcatgcattctattaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagactgactttctgtctgtgtttttctctgggtacaccttcaagcacaagatggtctatgaggacaccctgaccctgttccccttttctggggaaactgtgtttatgagcatggagaaccctgggctgtggatcctgggctgccacaactctgactttaggaataggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaatactggggattactatgaggacagctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcctaggagcttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgatatttatgatgaggatgagaaccagagccccaggagcttccagaagaagaccaggcactatttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagcccccatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggaatttactgatggcagctttacccagcccctgtacagaggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgacctttaggaaccaggcctctaggccctattctttttacagcagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctacttttggaaagtgcagcaccacatggcccccactaaggatgagtttgattgcaaggcctgggcctatttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacaccaacactctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttctttaccatctttgatgagactaagagctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagagccccttgcaacatccagatggaggaccctaccttcaaggagaactataggttccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatggggagcaatgagaacattcatagcatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtataagatggccctgtacaacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcactctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttccagattactgcctctgggcagtatgggcagtgggcccccaagctggccaggctgcactactctgggtctatcaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggatctgctggcccccatgatcattcatgggatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagcctgtatatttctcagttcatcatcatgtattctctggatggcaaaaagtggcagacctatagagggaacagcactgggaccctgatggtgttttttggcaatgtggatagctctggcatcaagcacaatatcttcaacccccccattattgccaggtacatcaggctgcaccccacccactactctatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgctctatgcctctggggatggaaagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagcagctatttcaccaatatgtttgccacttggagccctagcaaggctaggctgcatctgcagggcaggtctaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagactatgaaagtgactggggtgaccacccagggggtgaaaagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgattagcagcagccaggatggccaccagtggaccctgttcttccagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggatagcttcaccccagtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga

【0465】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８３）
atgcagattgagctgagcacctgctttttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgctaccaggaggtactacctgggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggtttccccccagggtgcccaagtctttcccctttaacacctctgtggtgtataagaagactctgtttgtggagttcactgatcacctgttcaatattgccaagcccaggcccccttggatgggcctgctgggccccactatccaggctgaggtgtatgacactgtggtcatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttcccaggggggtctcacacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgaccctctgtgcctgacttatagctacctgtctcatgtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggaggggagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaagagctggcactctgagaccaagaatagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgctagggcctggcctaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattgggtgtcacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatggggactactccagaagtgcacagcatcttcctggaggggcacaccttcctggtgaggaatcacaggcaggccagcctggagatttctcccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggatctggggcagttcctgctgttctgccacatcagcagccatcagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggacagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgatctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaactctcccagcttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgctcccctggtgctggctcctgatgataggagctacaagagccagtatctgaataatgggccccagaggattggcaggaagtataagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggctattcagcatgagtctggcatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctataacatctatccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtactctaggaggctgcccaagggggtcaagcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccactaagtctgaccccaggtgcctgactaggtactacagcagctttgtgaacatggagagagatctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaagagtctgtggatcagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgactgagaacattcagaggtttctgcccaaccctgctggggtccagctggaggaccctgagtttcaggccagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtatatcctgagcattggggcccagactgatttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccctgttccctttctctggggaaactgtgttcatgagcatggagaaccctgggctgtggatcctggggtgccacaattctgatttcaggaacagaggcatgactgctctgctgaaggtgtctagctgtgacaagaacactggggactactatgaggacagctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgaacccaggtctttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtctcccaggagcttccagaagaagactaggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcatctgggcctgctgggcccctacatcagggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttcagaaatcaggctagcaggccctacagcttctacagcagcctgatctcttatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcaccacatggcccccaccaaggatgagtttgattgcaaggcctgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccctctgctggtgtgccacaccaacaccctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttctttactatctttgatgagaccaagtcttggtattttactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggaccccaccttcaaggagaactacagattccatgccatcaatggctacattatggacactctgcctggcctggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctgctgtctatgggcagcaatgagaacattcactctatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcctagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagagattttcagatcactgcctctggccagtatggccagtgggctcctaagctggccaggctgcactactctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagccctttagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatccatggcatcaagactcagggggccaggcagaagttctctagcctgtacattagccagttcatcatcatgtatagcctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtggacagctctgggatcaagcacaatatcttcaacccccccattattgccaggtatattaggctgcaccccactcactacagcattaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgcagcatgcccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagatcactgccagctcttacttcaccaacatgtttgccacttggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagctctagccaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggactctttcacccctgtggtgaattctctggaccctcccctgctgactaggtatctgaggattcatccccagagctgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtattga

【0466】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８４）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttttctgccactaggaggtactacctgggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttccccccaagggtgcccaagtcttttcccttcaatacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgatcatctgtttaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtatgatactgtggtgattaccctgaagaatatggccagccatcctgtgtctctgcatgctgtgggggtgtcttattggaaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggagaaggaggatgataaggtgttccctgggggctctcacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcctatggcctctgacccactgtgcctgacttacagctatctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctgggctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggccaaggagaagactcagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagtcttggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggtctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcatagcattttcctggagggccacaccttcctggtgaggaaccacaggcaggctagcctggagatcagccccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggactcttgtcctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctggcccctgatgacaggagctataagtctcagtacctgaacaatggcccccagagaattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctatactgatgagaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggcatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggctagcaggccttacaacatctacccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggactttcccattctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatgggcccaccaagtctgaccccaggtgcctgactaggtactactctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctgggctgattggccccctgctgatctgttacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgataagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaacatccagagattcctgcccaaccctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaacatcatgcattctatcaatgggtatgtgtttgatagcctgcagctgtctgtgtgtctgcatgaggtggcctactggtacattctgagcattggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgtttatgagcatggagaaccctgggctgtggattctgggctgccacaactctgacttcagaaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgtcttcttgtgataagaacactggggactattatgaagacagctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaataatgctattgagcccaggtctttctctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatttctgtggagatgaagaaggaagactttgatatctatgatgaggatgagaaccagagccctaggagcttccagaagaagactaggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagcagcccccatgtgctgaggaatagggctcagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccaggaattcactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctggggctgctgggcccttacatcagggctgaggtggaggacaatatcatggtgacctttaggaaccaggcctctaggccttacagcttctactctagcctgatctcttatgaagaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacttacttctggaaggtgcagcaccacatggctcccaccaaggatgagtttgactgcaaggcttgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattgggcccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcagacaggtgactgtgcaggagtttgccctgttttttaccatctttgatgagactaagtcttggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggatcccaccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggattaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaatatccactctatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtataacctgtatcctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagagtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcactctgtttctggtgtatagcaacaagtgtcagacccctctgggcatggcctctgggcacattagggactttcagatcactgcttctggccagtatgggcagtgggctcccaagctggccaggctgcactattctggcagcattaatgcctggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatccatgggatcaagacccagggggctaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagtttatcatcatgtattctctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaattctactggcactctgatggtgttctttgggaatgtggatagctctgggatcaagcataatatcttcaatccccccattattgctaggtatatcaggctgcaccccacccactatagcatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgcagcatgcccctgggcatggagagcaaggctatttctgatgcccagatcactgccagcagctactttactaatatgtttgccacctggagccccagcaaggccagactgcacctgcagggcaggtctaatgcctggaggcctcaggtgaataaccccaaggagtggctgcaggtggacttccagaaaaccatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagtctctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatgggaaggtgaaggtcttccagggcaaccaggatagcttcacccctgtggtgaatagcctggatcctcctctgctgaccaggtatctgaggatccacccccagagctgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggctcaggacctgtactga

【0467】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８５）
atgcagattgagctgagcacctgtttcttcctgtgcctgctgaggttctgtttctctgccactaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccccccagggtgcctaagagcttccccttcaatacttctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagtttactgaccacctgttcaacattgctaagcccaggcctccctggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtatgatactgtggtgattaccctgaagaacatggcctctcatccagtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgaaggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggcccaatggcctctgaccccctgtgcctgacttatagctacctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaattctggcctgattggggccctgctggtgtgcagagagggctctctggctaaggagaagacccagactctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagactaagaatagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagggcctggcccaagatgcatactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgtcacaggaaatctgtctactggcatgtgattgggatgggcactacccctgaggtgcactctatcttcctggagggccataccttcctggtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccattaccttcctgactgcccagaccctgctgatggatctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatgggatggaggcttatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaactctcccagctttattcagatcaggtctgtggctaagaagcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtgctggctcctgatgacaggtcttacaagtctcagtacctgaataatggccctcagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaatcaggccagcaggccctacaacatctacccccatggcatcactgatgtgaggccactgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcatctgaaggacttccccattctgcctggggagatcttcaagtacaaatggactgtgactgtggaggatggccctaccaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactacagcagctttgtgaatatggagagggacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaatcagatcatgtctgataagaggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggccagcaatatcatgcacagcatcaatggctatgtctttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtatattctgagcattggggcccagactgatttcctgtctgtgttcttttctggctatacctttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctgggctgtggatcctgggctgccacaactctgacttcaggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactattatgaggacagctatgaggacatctctgcttacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggtctttcagccagaatccccctgtgctgaagaggcatcagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgattatgatgacactatctctgtggaaatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccccaggagcttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggattatggcatgagcagctctccccatgtgctgaggaacagagcccagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtcttccaggagttcactgatggctctttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctggggccctacattagggctgaggtggaggataacatcatggtgactttcagaaaccaggccagcaggccttacagcttttactcttctctgattagctatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcaccacatggctcccactaaggatgagtttgactgcaaggcttgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattgggcccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccatcaatggctacattatggacaccctgcctggcctggtgatggcccaggatcagaggatcaggtggtatctgctgagcatgggctctaatgagaacatccacagcatccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtataacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctgggatgagcaccctgttcctggtgtatagcaataagtgccagacccccctgggcatggcttctggccacatcagggatttccagatcactgcttctggccagtatggccagtgggctcccaagctggctaggctgcattactctgggtctatcaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcattcatggcatcaagacccagggggctaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcattatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacttacaggggcaatagcactgggactctgatggtgttctttggcaatgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaaccctcccatcattgccaggtacattaggctgcaccctacccactactctatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgatctgaactcttgcagcatgcctctgggcatggaaagcaaagccatctctgatgcccagatcactgcctctagctatttcaccaatatgtttgccacctggagccctagcaaggccaggctgcacctgcagggcagatctaatgcctggaggccccaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaagtgttccagggcaaccaggatagcttcactcctgtggtgaactctctggaccctcccctgctgactaggtacctgaggattcatccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga

【0468】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８６）
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtactacctgggggctgtggagctgtcttgggactatatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttcccccccagggtgcccaagagctttcctttcaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaatattgctaagcccaggccaccctggatgggcctgctgggccctaccattcaggctgaggtgtatgacactgtggtgattactctgaagaatatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtcttactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagacttctcagagggagaaggaggatgataaggtgttccctgggggctctcacacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcttctgatccactgtgcctgacctactcttacctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaagagctggcactctgagaccaagaattctctgatgcaggacagggatgctgcctctgccagggcctggcctaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggtctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcactacccctgaggtgcacagcattttcctggagggccacaccttcctggtcaggaaccataggcaggcctctctggagatcagccccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacattagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggactcttgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaggattatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagcttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgctcccctggtgctggctcctgatgataggagctacaagtctcagtacctgaataatggcccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagagaggctatccagcatgagtctgggatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcagaccctacaacatctacccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatgggcccaccaagtctgaccctaggtgcctgactaggtactactctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctggcctgattggccccctgctgatttgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaatcagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaataggtcttggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcctaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagtttcaggccagcaacatcatgcacagcatcaatggctatgtgtttgactctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtatatcctgagcattggggctcagactgacttcctgtctgtgttcttttctggctacacttttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccccttttctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctgggctgtggattctgggctgtcacaactctgacttcagaaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgacaagaatactggggactactatgaggacagctatgaggacatttctgcctatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttttctcagaatccccctgtgctgaagaggcaccagagagagatcaccaggaccactctgcagtctgatcaggaggagattgattatgatgacactatctctgtggagatgaagaaagaggactttgatatctatgatgaggatgagaatcagtctcccaggagcttccagaagaagactagacactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatggcagctttacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcatctgggcctgctgggcccctatattagggctgaagtggaggacaacatcatggtgacctttaggaaccaggccagcaggccctacagcttttacagcagcctgattagctatgaggaggatcagagacagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcttacttctctgatgtggacctggagaaagatgtgcactctggcctgattgggcccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgcccatgggaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgtttttcaccatctttgatgagaccaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgtaacatccagatggaggatcctactttcaaggagaactacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctgggctggtgatggcccaggatcagaggattaggtggtatctgctgtctatgggctctaatgagaacatccactctatccacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaagctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaataagtgccagactcccctgggcatggcttctgggcacatcagggatttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggctaggctgcactactctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttctcttggattaaggtggacctgctggctcccatgatcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttttctagcctgtatattagccagttcatcatcatgtatagcctggatgggaagaagtggcagacctacagggggaatagcactggcaccctgatggtgttttttggcaatgtggattcttctggcatcaagcataacatcttcaatccccctatcattgccaggtacattaggctgcatcccacccattactctatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgatctgaacagctgtagcatgcccctgggcatggagtccaaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcaggtctaatgcctggaggccccaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatgggcatcagtggaccctgttttttcagaatggcaaagtgaaggtgtttcaggggaatcaggacagctttacccctgtggtgaacagcctggatcctcctctgctgactagatacctgaggatccacccccagagctgggtccaccagattgctctgaggatggaggtgctggggtgtgaggctcaggacctgtactga

【0469】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８７）
atgcagattgagctgagcacctgcttctttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtactacctgggggctgtggaactgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccccccagggtgcccaagtctttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgaccacctgttcaatattgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggcccaaccatccaggctgaggtgtatgatactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctattggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccctggggggtctcatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgacctattcttacctgagccatgtggacctggtcaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgcagggagggcagcctggccaaggagaagactcagactctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaataggtctctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcactacccctgaggtgcactctatcttcctggaggggcacaccttcctggtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccatcaccttcctgactgcccagactctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggacagctgcccagaggaaccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagctttattcagatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggattatgcccccctggtgctggcccctgatgacaggtcttacaagtctcagtacctgaacaatggcccccagaggattgggaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgattatcttcaagaaccaggctagcaggccctataacatctacccccatggcattactgatgtgaggcccctgtactctaggagactgcccaagggggtgaagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccccactaagtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagcagctttgtgaatatggagagggatctggcttctggcctgattgggcctctgctgatttgctacaaggagtctgtggatcagagggggaaccagattatgtctgacaagaggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaatatccagaggttcctgcctaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggctagcaacattatgcacagcatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtacattctgtctattggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcacaagatggtgtatgaggacactctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggattctggggtgccacaactctgatttcaggaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaacactggggattattatgaggacagctatgaggacatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcctaggagcttcagccagaatccccctgtgctgaagagacaccagagggagatcactaggaccactctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacaccatttctgtggagatgaagaaggaggactttgatatttatgatgaggatgagaaccagagccccagaagcttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggattatggcatgtcttctagcccccatgtgctgaggaacagggctcagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatgggagcttcacccagcctctgtacaggggggagctgaatgaacatctgggcctgctggggccctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgactttcaggaatcaggcctctaggccctacagcttctactctagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcctaggaagaattttgtgaaacccaatgagaccaagacctacttttggaaggtgcagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgtaaggcctgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagagctggtatttcactgagaacatggagaggaactgtagggctccctgcaacatccagatggaggatccaactttcaaggagaactacaggttccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcccaggaccagaggattaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaacatccactctatccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcctagcaaggctggcatttggagagtggagtgtctgattggggagcacctgcatgctgggatgtctaccctgttcctggtgtactctaacaagtgccagacccccctggggatggcttctgggcacatcagagattttcagattactgcttctgggcagtatggccagtgggctcccaagctggccagactgcattactctggctctattaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggacctgctggctcccatgatcatccatggcattaagactcagggggctaggcagaagttcagcagcctgtatatttctcagtttattatcatgtattctctggatggcaagaagtggcagacttacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttggcaatgtggacagctctgggatcaagcataacatcttcaacccccccattattgccaggtacatcaggctgcaccccacccactattctatcaggagcactctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgctctatgcccctgggcatggagagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagctcttatttcaccaacatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcagaagcaatgcctggaggccccaggtgaacaatcctaaggagtggctgcaggtggacttccagaagactatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgattagcagcagccaggatgggcatcagtggaccctgttcttccagaatgggaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggacagcttcacccctgtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccaggtacctgaggatccatccccagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtattga

【0470】

ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減された核酸バリアント（配列番号８８）
atgcagattgagctgtctacctgtttttttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgctaccaggaggtattatctgggggctgtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggtttcctcccagggtgcctaagagcttccccttcaacacctctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctgggccccactatccaggctgaggtgtatgatactgtggtgattaccctgaagaacatggcctctcaccctgtgtctctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgaatatgatgatcagacctctcagagggagaaggaggatgacaaggtgtttcctgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgatcccctgtgcctgacctacagctacctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggccaaggaaaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagtcttggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctgctagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacagatctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatggggaccacccctgaggtgcatagcatcttcctggaggggcacaccttcctggtgagaaatcataggcaggccagcctggagattagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacatttctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaagagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagcttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccctaagacctgggtgcactacattgctgctgaagaggaggactgggactatgcccccctggtgctggccccagatgacaggtcttacaagagccagtacctgaataatggcccccagaggattgggaggaagtataagaaagtgaggttcatggcttacactgatgagacctttaagactagggaggccattcagcatgagtctgggattctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctataatatttatccccatgggattactgatgtcaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttccccattctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccccaccaagtctgatcctaggtgcctgaccaggtactatagcagctttgtgaacatggagagggacctggcttctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggaatctgtggaccagaggggcaaccagattatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtatctgactgagaacatccagaggttcctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggcttctaacatcatgcatagcatcaatgggtatgtgtttgactctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctattggtacatcctgagcattggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccctttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaaccctggcctgtggattctgggctgccataattctgacttcagaaacaggggcatgactgctctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaatactggggactactatgaggactcttatgaggatatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccaggagcttcagccagaacccccctgtcctgaagaggcatcagagggagatcactaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggaaatgaagaaggaggactttgatatctatgatgaggatgagaaccagagccccaggtctttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtctagcagcccccatgtgctgaggaacagagcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatgggagcttcactcagcccctgtataggggggagctgaatgagcatctgggcctgctggggccctacatcagggctgaggtggaggataacatcatggtgaccttcaggaaccaggccagcaggccctactctttctactcttctctgatcagctatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtcaagcctaatgagactaagacctacttttggaaggtgcagcaccacatggctcccactaaggatgagtttgattgcaaggcctgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgtcacaccaataccctgaaccctgcccatggcaggcaggtcactgtgcaggagtttgccctgtttttcactatctttgatgagactaagtcttggtacttcactgagaacatggaaaggaattgcagggctccctgcaacatccagatggaggaccccaccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggatcagaggattaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccacagcatccacttttctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaatctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtactctaacaagtgccagactcccctgggcatggcctctgggcacatcagggacttccagatcactgcctctgggcagtatggccagtgggcccctaagctggctaggctgcattactctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccctatgatcatccatggcatcaagacccagggggccagacagaagttctcttctctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatggcaagaagtggcagacctacagggggaattctactggcactctgatggtgttctttgggaatgtggatagctctgggatcaagcataatattttcaacccccccattattgctaggtacatcaggctgcacccaacccactactctattaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgtagcatgcccctgggcatggagagcaaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctactttaccaacatgtttgctacttggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggattttcagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaaaagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagtttctgatcagcagctctcaggatggccatcagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggatagcttcacccctgtggtgaatagcctggacccccccctgctgaccaggtacctgaggatccatccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaagcccaggacctgtactga

【0471】

ＦＶＩＩＩ Ｖ３ ｃＤＮＡ（配列番号８９）
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【0472】

ＦＶＩＩＩ ＣＯ３ ｃＤＮＡ（配列番号９０）
atgcagattgagctgtcaacttgctttttcctgtgcctgctgagattttgtttttccgctactagaagatactacctgggggctgtggaactgtcttgggattacatgcagagtgacctgggagagctgccagtggacgcacgatttccacctagagtccctaaatcattccccttcaacaccagcgtggtctataagaaaacactgttcgtggagtttactgatcacctgttcaacatcgctaagcctcggccaccctggatgggactgctgggaccaacaatccaggcagaggtgtacgacaccgtggtcattacactgaaaaacatggcctcacaccccgtgagcctgcatgctgtgggcgtcagctactggaaggcttccgaaggggcagagtatgacgatcagacttcccagagagaaaaagaggacgataaggtgtttcctggcgggtctcatacctatgtgtggcaggtcctgaaagagaatggccccatggcttccgaccctctgtgcctgacctactcttatctgagtcacgtggacctggtcaaggatctgaacagcggactgatcggagcactgctggtgtgtagggaagggagcctggctaaggagaaaacccagacactgcataagttcattctgctgttcgccgtgtttgacgaaggaaaatcatggcacagcgagacaaagaatagtctgatgcaggaccgggatgccgcttcagccagagcttggcccaaaatgcacactgtgaacggctacgtcaatcgctcactgcctggactgatcggctgccaccgaaagagcgtgtattggcatgtcatcggaatgggcaccacacctgaagtgcactccattttcctggaggggcatacctttctggtccgcaaccaccgacaggcctccctggagatctctccaattaccttcctgacagctcagactctgctgatggatctgggacagttcctgctgttttgccacatcagctcccaccagcatgatggcatggaggcctacgtgaaagtggacagctgtcccgaggaacctcagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaagactatgacgatgacctgaccgactccgagatggatgtggtccgattcgatgacgataacagcccctcctttatccagattagatctgtggccaagaaacaccctaagacatgggtccattacatcgcagccgaggaagaggactgggattatgcaccactggtgctggcaccagacgatcgatcctacaaatctcagtatctgaacaatggaccacagcggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttataccgatgaaaccttcaagactcgcgaagcaatccagcacgagagcgggattctgggaccactgctgtacggagaagtgggggacaccctgctgatcatttttaagaaccaggccagcaggccttacaatatctatccacatggaattacagatgtgcgccctctgtacagccggagactgccaaagggcgtcaaacacctgaaggacttcccaatcctgcccggggaaatttttaagtataaatggactgtcaccgtcgaggatggccccactaagagcgaccctaggtgcctgacccgctactattctagtttcgtgaatatggaaagggatctggccagcggactgatcggcccactgctgatttgttacaaagagagcgtggatcagagaggcaaccagatcatgtccgacaagaggaatgtgattctgttcagtgtctttgacgaaaaccggtcatggtatctgaccgagaacatccagagattcctgcctaatccagccggagtgcagctggaagatcctgagtttcaggcttctaacatcatgcatagtattaatggctacgtgttcgacagtctgcagctgtcagtgtgtctgcacgaggtcgcttactggtatatcctgagcattggagcacagacagatttcctgagcgtgttcttttccggctacacttttaagcataaaatggtgtatgaggacacactgactctgttccccttcagcggcgaaaccgtgtttatgtccatggagaatcccgggctgtggatcctgggatgccacaacagcgatttcaggaatcgcgggatgactgccctgctgaaagtgtcaagctgtgacaagaacaccggagactactatgaagattcatacgaggacatcagcgcatatctgctgtccaaaaacaatgccattgaacccaggtcttttagtcagaatcctccagtgctgaagaggcaccagcgcgagatcacccgcactaccctgcagagtgatcaggaagagatcgactacgacgatacaatttctgtggaaatgaagaaagaggacttcgatatctatgacgaagatgagaaccagagtcctcgatcattccagaagaaaacccggcattactttattgctgcagtggagcgcctgtgggattatggcatgtcctctagtcctcacgtgctgcgaaatcgggcccagtcagggagcgtcccacagttcaagaaagtggtcttccaggagtttacagacggatcctttactcagccactgtaccggggcgaactgaacgagcacctggggctgctgggaccctatatcagagctgaagtggaggataacattatggtcaccttcagaaatcaggcatctaggccttacagtttttattcaagcctgatctcttacgaagaggaccagaggcagggagcagaaccacgaaaaaacttcgtgaagcctaatgagaccaaaacatacttttggaaggtgcagcaccatatggccccaacaaaagacgaattcgattgcaaggcatgggcctatttttctgacgtggatctggagaaggacgtccacagtggcctgatcgggccactgctggtgtgtcatactaacaccctgaatcccgcacacggcaggcaggtcactgtccaggaattcgccctgttctttaccatctttgatgagacaaaaagctggtacttcaccgaaaacatggagcgaaattgccgggctccatgtaatattcagatggaagaccccacattcaaggagaactaccgctttcatgccatcaatgggtatattatggatactctgcccggactggtcatggctcaggaccagagaatcaggtggtacctgctgagcatggggtccaacgagaatatccactcaattcatttcagcggacacgtgtttactgtccggaagaaagaagagtataaaatggccctgtacaacctgtatcccggcgtgttcgaaaccgtcgagatgctgcctagcaaggcagggatctggagagtggaatgcctgattggggagcacctgcatgccggaatgtctaccctgtttctggtgtacagtaataagtgtcagacacccctggggatggcttccggacatatccgggatttccagattaccgcatctggacagtacggccagtgggcccctaagctggctagactgcactattccgggtctatcaacgcttggtccacaaaagagcctttctcttggattaaggtggacctgctggcaccaatgatcattcatggcatcaaaactcagggggccaggcagaagttctcctctctgtacatctcacagtttatcatcatgtacagcctggatggcaagaaatggcagacataccgcggcaatagcacagggactctgatggtgttctttggcaacgtggacagttcagggatcaagcacaacattttcaatccccctatcattgctagatacatcaggctgcacccaacccattattctattcgaagtacactgcggatggaactgatggggtgcgatctgaacagttgttcaatgcccctgggaatggagtccaaggcaatctctgacgcccagattaccgctagctcctacttcactaatatgtttgctacctggagcccctccaaagcacgactgcatctgcagggacgaagcaacgcatggcgaccacaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtcgattttcagaaaactatgaaggtgaccggagtcacaactcagggcgtgaaaagtctgctgacctcaatgtacgtcaaggagttcctgatctctagttcacaggacggccaccagtggacactgttctttcagaacggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacacctgtggtcaactctctggacccacccctgctgactcgctacctgcgaatccacccacagtcctgggtgcatcagattgcactgagaatggaagtcctgggctgcgaggcccaggacctgtattga

【0473】

ＡＡＶ－ＬＫ０３ ＶＰ１キャプシド（配列番号９１）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL

【0474】

ＡＡＶ－ＳＰＫ ＶＰ１キャプシド（配列番号９２）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

【0475】

ＡＡＶ－ＷＩＮＴにおけるイントロンの核酸配列（配列番号９３）
AGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTGACACTGACATCCACTTTTTCTTTTTCTCCACAG

【0476】

ＦＩＸ（配列番号９４）
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAAAAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGACAATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATTGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAATGCCAACAAAATTCTGAATAGACCAAAGAGGTATAACTCTGGCAAGCTTGAAGAGTTTGTACAGGGGAATCTGGAGAGAGAGTGTATGGAAGAGAAGTGCAGCTTTGAGGAAGCCAGAGAAGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTGGATGGTGATCAATGTGAGAGCAATCCCTGCTTGAATGGGGGGAGCTGTAAAGATGATATCAACAGCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAGGGGAAAAACTGTGAGCTTGATGTGACCTGTAATATCAAGAATGGCAGGTGTGAGCAATTTTGCAAGAATTCTGCTGATAACAAAGTGGTCTGTAGCTGCACTGAGGGATATAGGCTGGCTGAAAACCAGAAGAGCTGTGAACCTGCAGTGCCTTTTCCCTGTGGGAGAGTGTCTGTGAGCCAAACCAGCAAGCTGACTAGGGCTGAAGCAGTCTTTCCTGATGTAGATTATGTGAATAGCACTGAGGCTGAGACAATCCTTGACAATATCACTCAGAGCACACAGAGCTTCAATGACTTCACCAGGGTGGTAGGAGGGGAGGATGCCAAGCCTGGGCAGTTCCCCTGGCAGGTAGTGCTCAATGGAAAAGTGGATGCCTTTTGTGGAGGTTCAATTGTAAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCAGCCCACTGTGTGGAAACTGGAGTCAAGATTACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAATATTGAGGAAACTGAGCACACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATTATCCCCCACCACAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTCCTGGAACTGGATGAACCCCTGGTCTTGAACAGCTATGTGACACCCATCTGTATTGCTGATAAAGAGTACACCAACATCTTCTTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGCTGGGGCAGGGTGTTCCATAAAGGCAGGTCTGCCCTGGTATTGCAGTATTTGAGGGTGCCTCTGGTGGATAGAGCAACCTGCTTGCTGAGCACCAAGTTTACAATCTACAACAATATGTTCTGTGCAGGGTTCCATGAAGGTGGTAGAGACAGCTGCCAGGGAGATTCTGGGGGTCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGAACCAGCTTCCTGACTGGGATTATCAGCTGGGGTGAGGAGTGTGCTATGAAGGGAAAGTATGGGATCTACACAAAAGTATCCAGATATGTGAACTGGATTAAGGAGAAAACCAAGCTGACTTGA

【0477】

〔関連出願〕
[0001]本出願は、２０１８年８月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／７２２，５４７号、２０１８年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／７２５，０９６号、及び２０１８年１２月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／７８４，１１６号に対する優先権を主張する。全ての本文、表、配列表及び図面を含む、先述の出願の内容全体が、参照により本明細書に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2024102065000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-05-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

５’及び／又は３’に隣接する５個～７個のヌクレオチドを有するか、又は有さない配列番号５８又は５９のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項2】

配列番号５８又は５９のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号５８又は５９のいずれかに記載されるものと同じ数の低減されたＣｐＧを有する、ポリヌクレオチド。

【請求項3】

配列番号５８又は５９のいずれかの配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含み、配列番号５８又は５９のいずれかに記載されるものと同じ位置で、低減されたＣｐＧを有する、ポリヌクレオチド。

【請求項4】

Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメント及び末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む発現カセットであって、
配列番号１の配列と少なくとも９８％同一の配列を含み、
前記ＩＴＲは前記調節エレメントの５’側に隣接し、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在しない、
発現カセット。

【請求項5】

配列番号１の配列と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項４に記載の発現カセット。

【請求項6】

配列番号１の配列を含む、請求項４に記載の発現カセット。

【請求項7】

配列番号１の配列からなる、請求項４に記載の発現カセット。

【請求項8】

Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメント及び末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む発現カセットであって、前記ＩＴＲは前記調節エレメントの５’側に隣接し、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在せず、前記発現カセットが、配列番号１の配列と少なくとも９１％同一の配列を含む、発現カセット。

【請求項9】

ａ．配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、
ｂ．Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列であって、配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％同一性を有する核酸配列と、
ｃ.末端逆位配列（ＩＴＲ）と、
を含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、前記核酸配列に作動可能に連結されており、前記ＩＴＲは前記調節エレメントの５’側に隣接し、前記調節エレメントと前記核酸配列との間にイントロンが存在しない、発現カセット。

【請求項10】

ａ．配列番号２～配列番号６７のいずれかの配列と少なくとも９０％同一の調節エレメントと、
ｂ．Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸配列であって、配列番号７７の配列に対して少なくとも９０％同一性を有する核酸配列と
を含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、前記核酸配列に作動可能に連結されており、
前記発現カセットが、前記調節エレメントの５’側に隣接する末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含む、発現カセット。

【請求項11】

前記調節エレメントが、配列番号２～配列番号６７のいずれかと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項12】

前記調節エレメントが、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ総数の低減されたＣｐＧを含む、請求項４～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項13】

前記調節エレメントが、配列番号４～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列に記載されるものと同じ位置で、ＣｐＧがＣｐＴ、ＣｐＡ、ＴｐＧ、又はＡｐＧに置換された、配列番号２～配列番号２１又は配列番号２４～配列番号６７のいずれかの配列を含む、請求項４～１２のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項14】

前記核酸配列が、前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い発現を示す、請求項４～１３のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項15】

コードされた前記ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌクレオチドを有する発現カセットからの発現と比較して、より高い生物活性を示す、請求項４～１４のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項16】

生物活性が、ＦＶＩＩＩアッセイ又はＦＶＩＩＩ欠損モデルにおける凝固アッセイ又は出血の低減によって決定される、請求項１５に記載の発現カセット。

【請求項17】

前記調節エレメントと前記核酸配列との間に、（ａ）イントロン、又は（ｂ）非翻訳核酸の１０８個以上のヌヌクレオチドを有する発現カセットのパッケージングと比較して、より効率的にＡＡＶベクターにパッケージングされる、請求項４～１６のいずれか一項に記載の発現カセット。

【請求項18】

より少ないシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、核酸。

【請求項19】

１個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項20】

２個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項21】

３個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項22】

４個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項23】

５個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項24】

６個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項25】

７個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項26】

８個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項27】

９個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項28】

１０個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項29】

１１個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項30】

１２個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項31】

１３個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項32】

１４個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項33】

１５個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項34】

１６個少ないＣｐＧを有するように改変された、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項35】

１個又は０個のＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項36】

０個のＣｐＧを有するように改変された、配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸。

【請求項37】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項38】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも２番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項39】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも３番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項40】

配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも４番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項41】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも５番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項42】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも６番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項43】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも７番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項44】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも８番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項45】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも９番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項46】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１０番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項47】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１１番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項48】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１２番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項49】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１３番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項50】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１４番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項51】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１５番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項52】

配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から少なくとも１６番目のＣｐＧが、ＣｐＧ以外に改変されている、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項53】

請求項１８～５２のいずれか一項に記載の核酸配列の配列と少なくとも９５％同一の核酸。

【請求項54】

前記改変された前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３は、少なくとも１つのＣｐＧにおけるＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は少なくとも１つのＣｐＧにおけるＣヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＴｐＧ若しくはＡｐＧジヌクレオチドになっている、請求項１８～５３のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項55】

前記改変された前記配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、Ｇヌクレオチドが置換されていない、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項56】

前記改変された前記配列番号２２又は配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ又はＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ又はＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項57】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２又は配列番号２３における少なくとも１つのさらなるＣｐＧジヌクレオチドは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２又は配列番号２３においてＣｐＴジヌクレオチドになっている、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項58】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも１つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＡヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項59】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも２つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＴジヌクレオチドになっている、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項60】

前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における５’末端から７番目のＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴ若しくはＡヌクレオチドで置換されてＣｐＴ若しくはＣｐＡジヌクレオチドになっているか、又は前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３における少なくとも２つのさらなるＣｐＧは、ＧヌクレオチドがＴヌクレオチドで置換されて前記改変された配列番号２２若しくは配列番号２３においてＣｐＡジヌクレオチドになっている、請求項１８～５４のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項61】

前記改変された前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３は、少なくとも１つのＣｐＧにおけるＧ及び／又はＣヌクレオチドが欠失している、請求項１８～６０のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項62】

導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１８～６１のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項63】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５０％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１８～６１のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項64】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約２５％～５０％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１８～６１のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項65】

未改変の前記配列番号２、配列番号３、配列番号２２又は配列番号２３によって付与される転写の約５％～１００％以内である、作動可能に連結されている導入遺伝子上での転写を付与する、請求項１８～６１のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項66】

請求項１８～６１のいずれか一項に記載の核酸又はポリヌクレオチドと、導入遺伝子とを含む発現カセット。

【請求項67】

前記核酸又はポリヌクレオチドが、前記導入遺伝子の５’に配置されている、請求項６６に記載の発現カセット。

【請求項68】

前記導入遺伝子が、肝臓細胞において発現され体循環に分泌される治療用タンパク質をコードする、請求項６６又は６７に記載の発現カセット。

【請求項69】

前記治療用タンパク質が、神経変性疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項70】

前記治療用タンパク質が、防御用ＡｐｏＥアイソフォームである、請求項６９に記載の発現カセット。

【請求項71】

前記治療用タンパク質が、ＡｐｏＥ ε２アイソフォームである、請求項７０に記載の発現カセット。

【請求項72】

前記治療用タンパク質が、自己免疫疾患又はアレルギー疾患を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項73】

前記治療用タンパク質が、望ましくない抗原と、前記細胞からの前記治療用タンパク質の分泌を駆動するリーダー配列とを含む融合タンパク質である、請求項７２に記載の発現カセット。

【請求項74】

前記望ましくない抗原が、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の細胞外ドメイン又はその断片である、請求項７３に記載の発現カセット。

【請求項75】

前記治療用タンパク質が、血液凝固又は凝固因子タンパク質である、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項76】

前記血液凝固又は凝固因子タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）又はプロテインＣである、請求項７５に記載の発現カセット。

【請求項77】

前記第ＶＩＩＩ因子が、配列番号６８の配列と少なくとも９５％同一の核酸配列によってコードされる、請求項７６に記載の発現カセット。

【請求項78】

前記治療用タンパク質が、リソソーム貯蔵酵素である、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項79】

前記リソソーム貯蔵酵素が、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）又はアルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）である、請求項７８に記載の発現カセット。

【請求項80】

前記治療用タンパク質が、炎症性疾患又は障害を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項81】

前記治療用タンパク質が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を治療又は防止する、請求項６８に記載の発現カセット。

【請求項82】

前記治療用タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＥＩ）である、請求項８１に記載の発現カセット。

【請求項83】

請求項１～８２のいずれか一項に記載の核酸、又はポリヌクレオチド又は発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項84】

ａ）ＡＡＶキャプシド、及び
ｂ）２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）であって、前記核酸配列、前記ポリヌクレオチド、及び／又は前記導入遺伝子の５’及び３’末端に隣接する、ＡＡＶ ＩＴＲ
のうちの１つ又は複数を含む、請求項８３に記載のＡＡＶベクター。

【請求項85】

前記隣接する５’又は３’ＩＴＲ内に配置されるイントロンをさらに含む、請求項８４に記載のＡＡＶベクター。

【請求項86】

前記イントロン又は１つ若しくは複数のＩＴＲの少なくとも１つが、低減されたＣｐＧを有するように改変されている、請求項８５に記載のＡＡＶベクター。

【請求項87】

前記ＡＡＶキャプシド血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９０％以上の配列同一性を有する改変若しくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３キャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して９５％以上の配列同一性を有するキャプシド、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８、配列番号９１若しくは配列番号９２ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列に対して１００％の配列同一性を有するキャプシドを含む、請求項８３～８６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項88】

前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、若しくはＲｈ７４ ＡＡＶ血清型、又はそれらの組合せを含む、請求項８３～８７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項89】

ポリＡシグナル及び／又はイントロン配列をさらに含む、請求項８３～８８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項90】

請求項８３～８９のいずれか一項に記載の複数のＡＡＶベクターを生物学的に適合可能な担体又は賦形剤中に含む医薬組成物。

【請求項91】

空のＡＡＶキャプシドをさらに含む、請求項９０に記載の医薬組成物。

【請求項92】

前記空のＡＡＶキャプシドと前記ＡＡＶベクターの比が、約１００：１～５０：１、約５０：１～２５：１、約２５：１～１０：１、約１０：１～１：１、約１：１～１：１０、約１：１０～１：２５、約１：２５～１：５０、又は約１：５０～１：１００内又は間に存在する、請求項９１に記載の医薬組成物。

【請求項93】

前記空のＡＡＶキャプシドと前記ＡＡＶベクターの比が、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である、請求項９１に記載の医薬組成物。

【請求項94】

界面活性剤をさらに含む、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項95】

血液凝固又は凝固因子を必要とするヒトを治療するための、
請求項４～１７、請求項６６～６８及び請求項７５～７７のいずれか一項に記載の発現カセット若しくは請求項８３～８９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む医薬組成物、又は請求項９０～９４のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記血液凝固又は凝固因子が、前記ヒトにおいて発現されるものである、医薬組成物。

【請求項96】

前記ヒトが、血友病Ａ又は血友病Ｂを有するものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項97】

前記医薬組成物が、静脈内に、動脈内に、腔内に、筋内に、又はカテーテルによって、前記ヒトに投与されるためのものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項98】

前記血液凝固又は凝固因子が、増加したレベルで発現されるものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項99】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの１％を上回って発現されるものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項100】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約１％～４０％で発現されるものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項101】

前記血液凝固又は凝固因子が、血液凝固又は凝固因子を必要としないヒトで見られる血液凝固又は凝固因子のレベルの約５％～３０％で発現されるものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項102】

前記ＡＡＶベクターを、前記ヒトの体重１キログラム当たり約１×１０^８～約１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与するためのものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項103】

前記ヒトが、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害抗体を有する血友病Ａを有するものである、請求項９５に記載の医薬組成物。

【請求項104】

血友病Ａの治療を必要とするヒトにおいて、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害抗体を有する血友病Ａを治療するための、
請求項４～１７、請求項６６～６８及び請求項７５～７７のいずれか一項に記載の発現カセット若しくは請求項８３～８９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む医薬組成物、又は請求項９０～９４のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記血液凝固又は凝固因子が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であり、前記ヒトにおいて発現されるものである、医薬組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0144】

[0164]バリアントＦＶＩＩＩは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号６９）として記載される「ＳＱ」配列を包含し得る。通常、ＳＱを有するかかるバリアントＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ／ＳＱ）は、ＢＤＤを有し、例えば、ＢＤの少なくとも全て又は一部が欠失されている。ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ等のバリアントＦＶＩＩＩは、「ＳＱ」配列の全て又は一部、即ち、配列番号６９の全て又は一部を有し得る。したがって、例えば、ＳＱ配列（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号６９）を有するバリアントＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号６９）の全て又はほんの一部を有し得る。例えば、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、含まれるＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号６９）の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個のアミノ酸残基を有し得る。したがって、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個の内部欠失並びに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１３個のアミノ又はカルボキシ末端欠失を有するＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号６９）は、本明細書に記載されるバリアントＦＶＩＩＩタンパク質中に含まれる。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0234】

[0254]ある特定の実施形態において、自己免疫疾患タンパク質は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ、例えば、多発性硬化症用）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、例えば、多発性硬化症用）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ、多発性硬化症用）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ、抗ＭＡＧ末梢神経障害用）、インスリン（例えば、１型糖尿病用）、膵島特異的なグルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ、例えば、１型糖尿病用）、プレプロインスリン（例えば、１型糖尿病用）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、例えば、１型糖尿病用）、チロシンホスファターゼ様自己抗原（例えば、１型糖尿病用）、インスリノーマ抗原－２（例えば、１型糖尿病用）、膵島細胞抗原（例えば、１型糖尿病用）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体（例えば、グレーブス病用）、サイロトロピン受容体（例えば、グレーブス病用）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（例えば、関節リウマチ用）、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＧＲＶＲＶＮＳＡＹ（配列番号９８））（例えば、プロテオグリカン誘導性の関節炎（ＰＧＩＡ）又は関節リウマチ用）、又はアセチルコリン受容体（例えば、重症筋無力症用）である。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0376】

【表3】

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３５７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0357】

ＲＮＡ単位及びｑＰＣＲ
[0379]脳、精巣、腎臓、脾臓、及び肝臓のマウス組織を収集して、ＤＰＢＳですすいで、複数の微量片に切断して／すり潰して、およそ３０ｍｇを、キットプロトコル（ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓユニバーサルミックスキット、Ｑｉａｇｅｎ社）において記載されるように実施されるＲＮＡ単離用に使用した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００機器を使用して、ＲＮＡ濃度を測定し、試料を、ヌクレアーゼフリー中で１５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。製造業者の説明書の通りに、Ｔｒｕｂｏ ＤＮＡフリーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ社）を使用して、ＤＮアーゼ処理を行った。ｃＤＮＡ反応に関して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡＢＩ社）における指示書に従って、ＲＮＡ ２００ｎｇを使用した。ｃＤＮＡ試料を５倍希釈して、ｃＤＮＡ ２０ｎｇをＰＣＲ反応において使用した。フォワードプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＡＴＧＡ－３’（配列番号９５）、リバースプライマー：５’－ＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡ－３’（配列番号９６）、及びプローブ：５’－５６－ＦＡＭ－ＴＧＧＡＴＧＴＧＧ／ＺＥＮ／ＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡ－３ＩＡＢｋＦＱ－３’（配列番号９７及び配列番号９９）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。マウスａｃｔＢ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）遺伝子は、正規化用のハウスキーピング遺伝子として機能を果たした。データを図６に示す。

【外国語明細書】