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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024102248
(43)【公開日】2024-07-30
(54)【発明の名称】骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20240723BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20240723BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20240723BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/6837 Z
C12Q1/6886 Z
C12N15/11 Z
C12Q1/6827 Z
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024075539
(22)【出願日】2024-05-08
(62)【分割の表示】P 2020133602の分割
【原出願日】2020-08-06
(31)【優先権主張番号】P 2019176891
(32)【優先日】2019-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】390003193
【氏名又は名称】東洋鋼鈑株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】高光 恵美
(72)【発明者】
【氏名】吉村 翠
(57)【要約】
【課題】骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちCARLに存する複数タイプの遺伝子変
異の有無を正確に判定する。
【解決手段】CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ１変異、タイプ３変異、タイ
プ４変異及びタイプ５変異のいずれかに対応し、人為的欠損によるミスマッチを有する。
【選択図】図１
異の有無を正確に判定する。
【解決手段】CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ１変異、タイプ３変異、タイ
プ４変異及びタイプ５変異のいずれかに対応し、人為的欠損によるミスマッチを有する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であって、配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における506番目から557番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ１変異、同塩基配列における509番目から554番目の46塩基が欠損する46塩基欠損のタイプ３変異、同塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損する34塩基欠損のタイプ４変異及び同塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨髄増殖性腫瘍の診断項目として有用な遺伝子変異を評価できるプローブセ
ット、当該プローブセットを備えるマイクロアレイに関する。
ット、当該プローブセットを備えるマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【0002】
骨髄増殖性腫瘍（MPN：Myeloproliferative neoplasms）は、骨髄系細胞の腫瘍化によ
って発症する疾患である。MPNは、骨髄系細胞（顆粒球、芽球、骨髄巨核球及び肥満細胞
等）の著しい増殖を特徴としている。MPNには、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous
leukemia：CML）、慢性好中球性白血病（chronic neutrophilic leukemia：CNL）、真性
赤血球増加症又は真性多血症（polycythemia vera：PV）、原発性骨髄線維症（primary m
yelofibrosis：PMF）、本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）、慢性好酸
球性白血病（chronic eosinophilic leukemia：CEL）、好酸球増加症候群（hypereosinop
hilic syndrome：HES）、肥満細胞症（mastocytosis）及び分類不能骨髄増殖性腫瘍（mye
loproliferative neoplasms，unclassifiable：MPN, U）が含まれる。
って発症する疾患である。MPNは、骨髄系細胞（顆粒球、芽球、骨髄巨核球及び肥満細胞
等）の著しい増殖を特徴としている。MPNには、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous
leukemia：CML）、慢性好中球性白血病（chronic neutrophilic leukemia：CNL）、真性
赤血球増加症又は真性多血症（polycythemia vera：PV）、原発性骨髄線維症（primary m
yelofibrosis：PMF）、本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）、慢性好酸
球性白血病（chronic eosinophilic leukemia：CEL）、好酸球増加症候群（hypereosinop
hilic syndrome：HES）、肥満細胞症（mastocytosis）及び分類不能骨髄増殖性腫瘍（mye
loproliferative neoplasms，unclassifiable：MPN, U）が含まれる。
【0003】
MPNの診断については、非特許文献１に記載されるように、臨床的パラメータ、骨髄形
態及び遺伝子変異データを指標としている。フィラデルフィア染色体陰性の患者に対して
、これらを組み合わせて診断することでCMLを除くMPNを診断することができる。遺伝子変
異データとしては、具体的に３つの遺伝子：JAK2、CALR及びMPLに関する変異情報、更に
は追加的に、ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2及びSF3B1に関する変異情報が利用さ
れる。特に、JAK2、CALR及びMPLは、MPN発症の分子基盤であると考えられることから当該
遺伝子群における変異の有無がMPNの確定診断における重要な要素となっている。
態及び遺伝子変異データを指標としている。フィラデルフィア染色体陰性の患者に対して
、これらを組み合わせて診断することでCMLを除くMPNを診断することができる。遺伝子変
異データとしては、具体的に３つの遺伝子：JAK2、CALR及びMPLに関する変異情報、更に
は追加的に、ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2及びSF3B1に関する変異情報が利用さ
れる。特に、JAK2、CALR及びMPLは、MPN発症の分子基盤であると考えられることから当該
遺伝子群における変異の有無がMPNの確定診断における重要な要素となっている。
【0004】
また、非特許文献２には、JAK2に関してJAK2V617F変異（617番目のバリンがフェニルア
ラニンへ置換変異）がPV、ET及びPMFにおいて多く見られること、また少数のPVにおいて
は上記変異に加えてエクソン12への挿入/欠損型変異が見られることが開示されている。J
AK2（Janus activating kinase 2）は、エリスロポエチン受容体のシグナルをつかさどる
タンパク質をコードする遺伝子である。これに加えて、非特許文献３には、JAK2に関して
エクソン１２に存在する変異が真性多血症（polycythemia vera：PV）や特発性赤血球増
加症（idiopathic erythrocytosis：IE）に関連していることが開示されている。さらに
、特許文献５には、骨髄増殖性疾患を示す変異として、JAK2遺伝子のエクソン１２に存在
する変異のうちc2035t変異（T514M変異）を検出することが開示されている。
ラニンへ置換変異）がPV、ET及びPMFにおいて多く見られること、また少数のPVにおいて
は上記変異に加えてエクソン12への挿入/欠損型変異が見られることが開示されている。J
AK2（Janus activating kinase 2）は、エリスロポエチン受容体のシグナルをつかさどる
タンパク質をコードする遺伝子である。これに加えて、非特許文献３には、JAK2に関して
エクソン１２に存在する変異が真性多血症（polycythemia vera：PV）や特発性赤血球増
加症（idiopathic erythrocytosis：IE）に関連していることが開示されている。さらに
、特許文献５には、骨髄増殖性疾患を示す変異として、JAK2遺伝子のエクソン１２に存在
する変異のうちc2035t変異（T514M変異）を検出することが開示されている。
【0005】
非特許文献２には、更にMPLに関してMPLW515L/K変異PMFがPMF及びETにおいて見られた
ことが開示されている。MPLは、トロンボポイエチン受容体をコードする遺伝子である。
ことが開示されている。MPLは、トロンボポイエチン受容体をコードする遺伝子である。
【0006】
非特許文献２には、更にまたCALRに関して、52塩基欠損のタイプ１と5塩基挿入のタイ
プ２の変異が最も頻度が高く、ET及びPMFにおいてこれら変異が見られることが開示され
ている。タイプ１変異は、PMFにおいてより高頻度であり、ETにおける骨髄線維症への変
換に関連していることが開示されている。CALRは小胞体の分子シャペロンの1つであるcal
reticulinをコードする遺伝子である。
プ２の変異が最も頻度が高く、ET及びPMFにおいてこれら変異が見られることが開示され
ている。タイプ１変異は、PMFにおいてより高頻度であり、ETにおける骨髄線維症への変
換に関連していることが開示されている。CALRは小胞体の分子シャペロンの1つであるcal
reticulinをコードする遺伝子である。
【0007】
さらに、特許文献１には、JAK2遺伝子の変異解析方法として、JAK2V617F部位特異的な
蛍光標識プローブが開示されている。特許文献２には、JAK2V617F変異が陰性であって骨
髄増殖性腫瘍を示す患者において見いだされた、JAK2V617F変異とは異なる変異を検出す
る技術が開示されている。
蛍光標識プローブが開示されている。特許文献２には、JAK2V617F変異が陰性であって骨
髄増殖性腫瘍を示す患者において見いだされた、JAK2V617F変異とは異なる変異を検出す
る技術が開示されている。
【0008】
さらにまた、特許文献３には、MPL遺伝子多型検出用プローブとして、MPLにおけるW515
K変異及びW515L変異を検出するためのプローブセットが開示されている。
K変異及びW515L変異を検出するためのプローブセットが開示されている。
【0009】
さらにまた、特許文献４には、CALRにおける変異を同定するための技術が開示されてい
る。
る。
【0010】
さらにまた、特許文献５には、JAK2核酸中の変異検出が開示され、JAK2におけるエクソ
ン12に存在する遺伝子変異が開示されている。さらにまた、特許文献６には、上述した実
情に鑑みて、骨髄増殖性腫瘍に関連する複数の遺伝子変異について同時に簡便に検出する
手段として、各遺伝子変異についてプライマーやプローブを設計したことが開示され、JA
K2におけるV617F変異、CALRにおけるタイプ１変異及びタイプ２変異、MPLにおけるW515L
変異及びW515K変異が検出対象の遺伝子変異として開示されている（３遺伝子における５
つの遺伝子変異）。
ン12に存在する遺伝子変異が開示されている。さらにまた、特許文献６には、上述した実
情に鑑みて、骨髄増殖性腫瘍に関連する複数の遺伝子変異について同時に簡便に検出する
手段として、各遺伝子変異についてプライマーやプローブを設計したことが開示され、JA
K2におけるV617F変異、CALRにおけるタイプ１変異及びタイプ２変異、MPLにおけるW515L
変異及びW515K変異が検出対象の遺伝子変異として開示されている（３遺伝子における５
つの遺伝子変異）。
【0011】
なお、目的とする遺伝子変異を検出するためのプローブの設計方法としては、当該遺伝
子変異を含む周辺領域の塩基配列に基づいてプローブを設計する。このとき、プローブと
しては、特許文献７に開示されるように、遺伝子変異を含む周辺領域の塩基配列に完全に
一致する配列、或いは、１又は数個の非天然ヌクレオチドを含む塩基配列として設計され
る。１又は数個の非天然ヌクレオチドを含むプローブは、当該非天然ヌクレオチドの箇所
において、遺伝子変異を含む周辺領域との間でハイブリダイズを形成しない（ミスマッチ
）。特許文献７によれば、このミスマッチにより、サンプル中の標的核酸が遺伝子変異を
有するかどうかを高精度に検出できると記載されている。
子変異を含む周辺領域の塩基配列に基づいてプローブを設計する。このとき、プローブと
しては、特許文献７に開示されるように、遺伝子変異を含む周辺領域の塩基配列に完全に
一致する配列、或いは、１又は数個の非天然ヌクレオチドを含む塩基配列として設計され
る。１又は数個の非天然ヌクレオチドを含むプローブは、当該非天然ヌクレオチドの箇所
において、遺伝子変異を含む周辺領域との間でハイブリダイズを形成しない（ミスマッチ
）。特許文献７によれば、このミスマッチにより、サンプル中の標的核酸が遺伝子変異を
有するかどうかを高精度に検出できると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】特開2012-034580
【特許文献2】WO2009/060804
【特許文献3】WO2011/052755
【特許文献4】特表2016-537012
【特許文献5】特許第6017136号
【特許文献6】WO2019/004334
【特許文献7】特表2000-511434
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Francesco Passamonti and Margherita Maffioli, Hematology 2016, p. 534-542
【非特許文献2】NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines), Myeloproliferative Neoplasms, Version 2.2017, October 19, 2016
【非特許文献3】Linda M. Scott et al., N Engl J Med. 2007 Feb 1;356(5):459-68
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちCARLに存する複数タイプの遺伝
子変異の有無を正確に判定できるとともに、骨髄増殖性腫瘍の有無をより高精度に判定す
ることができる遺伝子変異評価用キットを提供することを目的とする。
子変異の有無を正確に判定できるとともに、骨髄増殖性腫瘍の有無をより高精度に判定す
ることができる遺伝子変異評価用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は以下を包含する。
（１）CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であって、配列番号１０に示
した野生型CARL遺伝子の塩基配列における506番目から557番目の52塩基が欠損する52塩基
欠損のタイプ１変異、同塩基配列における509番目から554番目の46塩基が欠損する46塩基
欠損のタイプ３変異、同塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損する34塩基
欠損のタイプ４変異及び同塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損する52塩
基欠損のタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異に対応するCA
LR変異型プローブを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺
伝子変異評価用キット。
（２）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番
目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩
基配列を有し、
上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における555番目から5
59番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有し、
上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における550番目から5
58番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有し、
上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から5
64番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（３）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号９５に示した塩基配
列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配
列番号５３に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ４変異に対する
CALR変異型プローブは、配列番号５４に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、
上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５５に示した塩基配列又はそ
の相補的塩基配列を含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（４） 配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における568番目と569番目
の間にTTGTCが挿入されたタイプ２変異に対応するCALR変異型プローブを更に有すること
を特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（５）JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プロー
ブ及び/又はMPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プロ
ーブを更に有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（６）上記（１）～（５）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者
について、CARLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ３変異、タイプ４変異及びタイ
プ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定する、骨髄増殖性腫
瘍の診断に関するデータ分析方法。
（１）CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であって、配列番号１０に示
した野生型CARL遺伝子の塩基配列における506番目から557番目の52塩基が欠損する52塩基
欠損のタイプ１変異、同塩基配列における509番目から554番目の46塩基が欠損する46塩基
欠損のタイプ３変異、同塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損する34塩基
欠損のタイプ４変異及び同塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損する52塩
基欠損のタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異に対応するCA
LR変異型プローブを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺
伝子変異評価用キット。
（２）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番
目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩
基配列を有し、
上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における555番目から5
59番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有し、
上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における550番目から5
58番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有し、
上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から5
64番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を
有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（３）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号９５に示した塩基配
列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配
列番号５３に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ４変異に対する
CALR変異型プローブは、配列番号５４に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、
上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５５に示した塩基配列又はそ
の相補的塩基配列を含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（４） 配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における568番目と569番目
の間にTTGTCが挿入されたタイプ２変異に対応するCALR変異型プローブを更に有すること
を特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（５）JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プロー
ブ及び/又はMPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プロ
ーブを更に有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
（６）上記（１）～（５）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者
について、CARLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ３変異、タイプ４変異及びタイ
プ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定する、骨髄増殖性腫
瘍の診断に関するデータ分析方法。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうち特にCARLに存する複数の
遺伝子変異（タイプ１変異、タイプ３変異～タイプ５変異）を正確に判定することができ
る。したがって、本発明によれば、診断対象者の上記遺伝子変異の情報を利用した骨髄増
殖性腫瘍の診断精度を向上させることができる。
遺伝子変異（タイプ１変異、タイプ３変異～タイプ５変異）を正確に判定することができ
る。したがって、本発明によれば、診断対象者の上記遺伝子変異の情報を利用した骨髄増
殖性腫瘍の診断精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】CARLにおけるタイプ１遺伝子変異、タイプ３遺伝子変異、タイプ４遺伝子変異及びタイプ５遺伝子変異における欠損領域を説明するための構成図である。
【図2】実施例で設計したtype3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4を用いて各変異サンプル及び野生型サンプルを測定した結果を示す特性図である。
【図3】JAK2のエクソン12に含まれる複数の遺伝子変異を含む領域を増幅するために設計したプライマーを説明する構成図である。
【図4】実施例１で設計したプライマーセットを用いて得られた、４つの増幅断片に由来する蛍光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図5】V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワードプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。
【図6】V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワードプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である
【図7】JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。
【図8】JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。
【図9】エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）とV617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識されたプライマー（フォワードプライマー）との濃度比を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。
【図10】変異モデル検体を使用して、JAK2のV617F変異及びエクソン12に存在する遺伝子変異等を検出した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明に係る骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットは、CARLにおける骨髄
増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異として、いわゆるタイプ３変異、タイプ４変異及びタイ
プ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定するCALR変異型プロ
ーブを備える。
増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異として、いわゆるタイプ３変異、タイプ４変異及びタイ
プ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定するCALR変異型プロ
ーブを備える。
【0019】
なお、CALRの遺伝子変異としては、52塩基欠損のタイプ１変異と、5塩基挿入のタイプ
２変異と、46塩基欠損のタイプ３変異、34塩基欠損のタイプ４変異及びタイプ１変異とは
異なる52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異が主として知られている。これらタイ
プ１変異からタイプ５変異は、CALRタンパク質のＣ末端に位置している。原発性骨髄線維
症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thrombocyt
hemia：ET）患者において、これらいずれかの変異が20～25％の頻度で見られる。主とし
て、タイプ２の変異が本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）に関連し、
タイプ１の変異が原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）に関与している。ま
た、CALRの遺伝子変異は、詳細を後述するJAK2における遺伝子変異を有さない骨髄増殖性
腫瘍において見られる変異でもある。
２変異と、46塩基欠損のタイプ３変異、34塩基欠損のタイプ４変異及びタイプ１変異とは
異なる52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異が主として知られている。これらタイ
プ１変異からタイプ５変異は、CALRタンパク質のＣ末端に位置している。原発性骨髄線維
症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thrombocyt
hemia：ET）患者において、これらいずれかの変異が20～25％の頻度で見られる。主とし
て、タイプ２の変異が本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）に関連し、
タイプ１の変異が原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）に関与している。ま
た、CALRの遺伝子変異は、詳細を後述するJAK2における遺伝子変異を有さない骨髄増殖性
腫瘍において見られる変異でもある。
【0020】
野生型CALRをコードする塩基配列を配列番号１０に示す。タイプ１変異を有する場合、
配列番号１０に示した塩基配列において506番目から557番目の52塩基が欠損することとな
る。タイプ２変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において568番目と569番
目の間にTTGTCが挿入されることとなる。タイプ３変異を有する場合、配列番号１０に示
した塩基配列において509番目から554番目の46塩基が欠損することとなる。タイプ４変異
を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠
損することとなる。タイプ５変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において
505番目から556番目の52塩基が欠損することとなる。
配列番号１０に示した塩基配列において506番目から557番目の52塩基が欠損することとな
る。タイプ２変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において568番目と569番
目の間にTTGTCが挿入されることとなる。タイプ３変異を有する場合、配列番号１０に示
した塩基配列において509番目から554番目の46塩基が欠損することとなる。タイプ４変異
を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠
損することとなる。タイプ５変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において
505番目から556番目の52塩基が欠損することとなる。
【0021】
欠損型の遺伝子変異であるタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変
異について、野生型CALRをコードする塩基配列の一部（配列番号５６）を基準として欠損
する領域を図１に模式的に示した。図１に示すように、野生型CALRの52塩基が欠損したタ
イプ１変異（配列番号５７）、野生型CALRの46塩基が欠損したタイプ３変異（配列番号５
８）、野生型CALRの34塩基が欠損したタイプ４変異（配列番号５９）、野生型CALRの52塩
基が欠損したタイプ５変異（配列番号６０）は、それぞれ欠損位置（図中矢印）より３’
側において欠損前後で非常に類似した配列を有している。なお、図１に示したタイプ１変
異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異の各塩基配列において、欠損前後で一
致する配列に下線を付した。
異について、野生型CALRをコードする塩基配列の一部（配列番号５６）を基準として欠損
する領域を図１に模式的に示した。図１に示すように、野生型CALRの52塩基が欠損したタ
イプ１変異（配列番号５７）、野生型CALRの46塩基が欠損したタイプ３変異（配列番号５
８）、野生型CALRの34塩基が欠損したタイプ４変異（配列番号５９）、野生型CALRの52塩
基が欠損したタイプ５変異（配列番号６０）は、それぞれ欠損位置（図中矢印）より３’
側において欠損前後で非常に類似した配列を有している。なお、図１に示したタイプ１変
異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異の各塩基配列において、欠損前後で一
致する配列に下線を付した。
【0022】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、CALR変異型プローブとして、タイプ１変異を
検出するためのタイプ１変異プローブ、タイプ３変異を検出するためのタイプ３変異プロ
ーブ、タイプ４変異を検出するためのタイプ４変異プローブ及びタイプ５変異を検出する
ためのタイプ５変異プローブからなる群から選ばれる少なくとも１つのプローブを含む。
すなわち、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、タイプ３変異プローブ、タイプ４変
異プローブ及びタイプ５変異プローブの全てを含んでいても良いし、タイプ３変異プロー
ブ、タイプ４変異プローブ及びタイプ５変異プローブのうち１つ又は任意の２つのプロー
ブを含んでいても良い。
検出するためのタイプ１変異プローブ、タイプ３変異を検出するためのタイプ３変異プロ
ーブ、タイプ４変異を検出するためのタイプ４変異プローブ及びタイプ５変異を検出する
ためのタイプ５変異プローブからなる群から選ばれる少なくとも１つのプローブを含む。
すなわち、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、タイプ３変異プローブ、タイプ４変
異プローブ及びタイプ５変異プローブの全てを含んでいても良いし、タイプ３変異プロー
ブ、タイプ４変異プローブ及びタイプ５変異プローブのうち１つ又は任意の２つのプロー
ブを含んでいても良い。
【0023】
これらCALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有している。すなわち、
CARL変異型プローブは、図１に示したタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタ
イプ５変異の欠損変異後の配列に対して、少なくとも１塩基（１～数塩基、例えば１～５
塩基、好ましくは１～３塩基、より好ましくは１塩基）を欠損（すなわち人為的欠損）し
た相補鎖として設計する。ここで、人為的に欠損させる塩基としては、図１に示したよう
に、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異それぞれの欠損後の配
列において、野生型の配列と一致する領域（図１の下線部）から選ばれることが好ましい
。なお、CALR変異型プローブは、所定の塩基配列に対する相補鎖として設計することがで
きるが、当該塩基配列と同じ鎖として設計しても良い。
CARL変異型プローブは、図１に示したタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタ
イプ５変異の欠損変異後の配列に対して、少なくとも１塩基（１～数塩基、例えば１～５
塩基、好ましくは１～３塩基、より好ましくは１塩基）を欠損（すなわち人為的欠損）し
た相補鎖として設計する。ここで、人為的に欠損させる塩基としては、図１に示したよう
に、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異それぞれの欠損後の配
列において、野生型の配列と一致する領域（図１の下線部）から選ばれることが好ましい
。なお、CALR変異型プローブは、所定の塩基配列に対する相補鎖として設計することがで
きるが、当該塩基配列と同じ鎖として設計しても良い。
【0024】
すなわち、これらタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異に対応
するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）よりも３’末端側の１０塩基以内、
好ましくは８塩基以内、より好ましくは５塩基以内の領域に少なくとも１塩基が欠損した
相補鎖として設計することができる。
するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）よりも３’末端側の１０塩基以内、
好ましくは８塩基以内、より好ましくは５塩基以内の領域に少なくとも１塩基が欠損した
相補鎖として設計することができる。
【0025】
より具体的に、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印
）から数えて３’末端側の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損さ
せた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると
、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少
なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ１変異に
対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560番目～562番
目のAGAを欠損したGACGAGGAGCGGACAAGGAG（配列番号９５）の相補鎖として設計すること
が好ましい（配列番号９５の塩基配列でもよい）。
）から数えて３’末端側の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損さ
せた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると
、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少
なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ１変異に
対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560番目～562番
目のAGAを欠損したGACGAGGAGCGGACAAGGAG（配列番号９５）の相補鎖として設計すること
が好ましい（配列番号９５の塩基配列でもよい）。
【0026】
タイプ３変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）よりも３’末
端側の５塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設
計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ３変異に対
応するCALR変異型プローブは555番目～559番目の５塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠
損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ３変異に対応するCALR変異型
プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における558番目のGを欠損したGAGGAGCAGAGC
AGAGGACAA（配列番号５３）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５３の塩
基配列でもよい）。
端側の５塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設
計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ３変異に対
応するCALR変異型プローブは555番目～559番目の５塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠
損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ３変異に対応するCALR変異型
プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における558番目のGを欠損したGAGGAGCAGAGC
AGAGGACAA（配列番号５３）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５３の塩
基配列でもよい）。
【0027】
タイプ４変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）から数えて３
’末端側の９塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖とし
て設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ４変異
に対応するCALR変異型プローブは550番目～558番目の９塩基の範囲から少なくとも１塩基
を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ４変異に対応するCALR変
異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における552番目のGを欠損したCAGAGGCT
TAGAGGAGGCAGAG（配列番号５４）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５４
の塩基配列でもよい）。
’末端側の９塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖とし
て設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ４変異
に対応するCALR変異型プローブは550番目～558番目の９塩基の範囲から少なくとも１塩基
を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ４変異に対応するCALR変
異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における552番目のGを欠損したCAGAGGCT
TAGAGGAGGCAGAG（配列番号５４）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５４
の塩基配列でもよい）。
【0028】
タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）から数えて３
’末端側の２～８番目の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させ
た相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、
タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少な
くとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ５変異に対
応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560～562番目のAG
Aを欠損したGACGAGGGGCGGACAAGGAG（配列番号５５）の相補鎖として設計することが好ま
しい（配列番号５５の塩基配列でもよい）。
’末端側の２～８番目の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させ
た相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、
タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少な
くとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ５変異に対
応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560～562番目のAG
Aを欠損したGACGAGGGGCGGACAAGGAG（配列番号５５）の相補鎖として設計することが好ま
しい（配列番号５５の塩基配列でもよい）。
【0029】
ところで、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、以上のCARL遺伝子における遺伝子
変異に加えてJAK2及びMPLに存在する遺伝子変異を同時に同定するものであっても良い。
これらJAK2及びMPLにおける遺伝子変異は、CARLにおける遺伝子変異と同様に、世界保健
機関（WHO）による分類（例えば、2016年度バージョン）において骨髄増殖性腫瘍の診断
に利用されている遺伝子変異である。
変異に加えてJAK2及びMPLに存在する遺伝子変異を同時に同定するものであっても良い。
これらJAK2及びMPLにおける遺伝子変異は、CARLにおける遺伝子変異と同様に、世界保健
機関（WHO）による分類（例えば、2016年度バージョン）において骨髄増殖性腫瘍の診断
に利用されている遺伝子変異である。
【0030】
JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異としては、V617F変異及びエクソン1
2に存在する遺伝子変異を挙げることができる。すなわち、遺伝子変異評価用キットは、J
AK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるV617F変異に対応するV617F変異
型プローブと、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるエクソン12に存
在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとをJAK2変異型プローブとして含
んでいてもよい。また、遺伝子変異評価用キットは、JAK2におけるV617F変異を含む領域
を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子
変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含んでいてもよい。
2に存在する遺伝子変異を挙げることができる。すなわち、遺伝子変異評価用キットは、J
AK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるV617F変異に対応するV617F変異
型プローブと、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるエクソン12に存
在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとをJAK2変異型プローブとして含
んでいてもよい。また、遺伝子変異評価用キットは、JAK2におけるV617F変異を含む領域
を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子
変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含んでいてもよい。
【0031】
具体的に、JAK2の遺伝子変異におけるV617F変異は、617番目のバリンがフェニルアラニ
ンへ置換変異することを意味する。この変異は、JAK-STATパスウェイの活性化に寄与し、
真性多血症（polycythemia vera：PV）における顕著な特徴である。また、原発性骨髄線
維症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thromboc
ythemia：ET）患者においても、当該V617F変異は50～60％の頻度で見られる。なお、野生
型JAK2遺伝子のうち617番目のバリンを含むエクソン14の塩基配列を配列番号１１に示す
。V617F変異を有する場合、配列番号１１に示した塩基配列において351番目のGがTへ置換
変異することとなる。
ンへ置換変異することを意味する。この変異は、JAK-STATパスウェイの活性化に寄与し、
真性多血症（polycythemia vera：PV）における顕著な特徴である。また、原発性骨髄線
維症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thromboc
ythemia：ET）患者においても、当該V617F変異は50～60％の頻度で見られる。なお、野生
型JAK2遺伝子のうち617番目のバリンを含むエクソン14の塩基配列を配列番号１１に示す
。V617F変異を有する場合、配列番号１１に示した塩基配列において351番目のGがTへ置換
変異することとなる。
【0032】
また、エクソン12に存在する遺伝子変異は、世界保健機関（WHO）が示すMPNの診断基準
として知られており、特に真性多血症（polycythemia vera：PV）において検出される遺
伝子変異である。JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異としては、特に限定され
ないが、例えば、542番目のアスパラギンと543番目のグルタミン酸が欠損する変異（N542
_E543del変異と呼称する）、543番目のグルタミン酸と544番目のアスパラギン酸とが欠損
する変異（E543_D544del変異と呼称する）、541番目のアルギニンから543番目のグルタミ
ン酸までがリシンとなる変異（R541_E543＞K変異と呼称する）、537番目のフェニルアラ
ニンから539番目のリシンまでがロイシンとなる変異（F537_K539＞L変異と呼称する）、5
39番目のリシンがロイシンとなる変異（K539L(TT)変異又はK539L(CT)変異と呼称する）。
なお、K539L(TT)変異とは、539番目のリシンをコードするコドン（AAA）がロイシンをコ
ードするコドン（TTA）となる変異である。K539L(CT)変異とは、539番目のリシンをコー
ドするコドン（AAA）がロイシンをコードするコドン（CTA）となる変異である。
として知られており、特に真性多血症（polycythemia vera：PV）において検出される遺
伝子変異である。JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異としては、特に限定され
ないが、例えば、542番目のアスパラギンと543番目のグルタミン酸が欠損する変異（N542
_E543del変異と呼称する）、543番目のグルタミン酸と544番目のアスパラギン酸とが欠損
する変異（E543_D544del変異と呼称する）、541番目のアルギニンから543番目のグルタミ
ン酸までがリシンとなる変異（R541_E543＞K変異と呼称する）、537番目のフェニルアラ
ニンから539番目のリシンまでがロイシンとなる変異（F537_K539＞L変異と呼称する）、5
39番目のリシンがロイシンとなる変異（K539L(TT)変異又はK539L(CT)変異と呼称する）。
なお、K539L(TT)変異とは、539番目のリシンをコードするコドン（AAA）がロイシンをコ
ードするコドン（TTA）となる変異である。K539L(CT)変異とは、539番目のリシンをコー
ドするコドン（AAA）がロイシンをコードするコドン（CTA）となる変異である。
【0033】
ここで、野生型JAK2遺伝子のうちエクソン12をコードする塩基配列を配列番号１２に示
す。N542_E543del変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において250番目か
ら255番目の6塩基が欠損することとなる。E543_D544del変異を有する場合、配列番号１２
に示した塩基配列において253番目から258番目の6塩基が欠損することとなる。R541_E543
＞K変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において248番目から253番目の6塩
基が欠損することとなる。F537_K539＞L変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配
列において237番目から242番目の6塩基が欠損することとなる。K539L(TT)変異を有する場
合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目と242番目のAAがTTに置換変異するこ
ととなる。K539L(CT)変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目
と242番目のAAがCTに置換変異することとなる。
す。N542_E543del変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において250番目か
ら255番目の6塩基が欠損することとなる。E543_D544del変異を有する場合、配列番号１２
に示した塩基配列において253番目から258番目の6塩基が欠損することとなる。R541_E543
＞K変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において248番目から253番目の6塩
基が欠損することとなる。F537_K539＞L変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配
列において237番目から242番目の6塩基が欠損することとなる。K539L(TT)変異を有する場
合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目と242番目のAAがTTに置換変異するこ
ととなる。K539L(CT)変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目
と242番目のAAがCTに置換変異することとなる。
【0034】
さらに、MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異としては、W515K変異（515
番目のトリプトファンがリシンへ置換変異）又はW515L変異（515番目のトリプトファンが
ロイシンへ置換変異）を挙げることができる。このMPLの遺伝子変異は、本態性血小板血
症（essential thrombocythemia：ET）患者の3～5％において見られ、原発性骨髄線維症
（primary myelofibrosis：PMF）の6～10％において見られる。なお、野生型MPLをコード
する塩基配列を配列番号１３に示す。W515K変異を有する場合、配列番号１３に示した塩
基配列において305番目と306番目のTGがAAへと置換変異することとなる。W515L変異を有
する場合、配列番号１３に示した塩基配列において306番目のGがTへと置換変異すること
となる。
番目のトリプトファンがリシンへ置換変異）又はW515L変異（515番目のトリプトファンが
ロイシンへ置換変異）を挙げることができる。このMPLの遺伝子変異は、本態性血小板血
症（essential thrombocythemia：ET）患者の3～5％において見られ、原発性骨髄線維症
（primary myelofibrosis：PMF）の6～10％において見られる。なお、野生型MPLをコード
する塩基配列を配列番号１３に示す。W515K変異を有する場合、配列番号１３に示した塩
基配列において305番目と306番目のTGがAAへと置換変異することとなる。W515L変異を有
する場合、配列番号１３に示した塩基配列において306番目のGがTへと置換変異すること
となる。
【0035】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、これらJAK2、CALR及びMPLのそれぞれに存在
する遺伝子変異を同定するためのプローブセットを含んでいる。
する遺伝子変異を同定するためのプローブセットを含んでいる。
【0036】
より具体的に、JAK2のV617F変異については、配列番号１１における上記置換変異に対
応する、例えば、CTCCACAGAaACATACTCC（配列番号１４）を含むオリゴヌクレオチドを変
異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番
号１１に示した塩基配列における351番目のGからTへの置換変異に対応している。また、J
AK2のV617F変異を同定する際、野生型のJAK2に対応する野生型プローブ（上記配列におけ
る小文字のaをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、JAK2のV617F変異を同
定するには、配列番号１４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当
該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
応する、例えば、CTCCACAGAaACATACTCC（配列番号１４）を含むオリゴヌクレオチドを変
異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番
号１１に示した塩基配列における351番目のGからTへの置換変異に対応している。また、J
AK2のV617F変異を同定する際、野生型のJAK2に対応する野生型プローブ（上記配列におけ
る小文字のaをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、JAK2のV617F変異を同
定するには、配列番号１４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当
該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
【0037】
また、JAK2のN542_E543del変異については、CACAAAATCAGA-GATTTGATATTTG（配列番号１
５）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上
記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における250番目から2
55番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のE543_D544del変異については、CACAAAATCAGAA
AT-TTGATATTTGT（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用
することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩
基配列における253番目から258番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のR541_E543＞K変
異については、CACAAAATCA-AAGATTTGATATTTGT（配列番号１７）を含むオリゴヌクレオチ
ドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位
置が、配列番号１２に示した塩基配列における248番目から253番目の6塩基欠損に対応し
ている。JAK2のF537_K539＞L変異については、CCAAATGGTG-TTAATCAGAAATGAA（配列番号１
８）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上
記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における237番目から2
42番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のK539L(TT)変異については、GGTGTTTCACttAATC
AGAAATGA（配列番号１９）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用するこ
とができる。なお、上記配列における小文字のttが、配列番号１２に示した塩基配列にお
ける241番目と242番目のAAに対応している。JAK2のK539L(CT)変異については、GTGTTTCAC
ctAATCAGAAATGA（配列番号２０）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用
することができる。なお、上記配列における小文字のctが、配列番号１２に示した塩基配
列における241番目と242番目のAAに対応している。
５）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上
記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における250番目から2
55番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のE543_D544del変異については、CACAAAATCAGAA
AT-TTGATATTTGT（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用
することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩
基配列における253番目から258番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のR541_E543＞K変
異については、CACAAAATCA-AAGATTTGATATTTGT（配列番号１７）を含むオリゴヌクレオチ
ドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位
置が、配列番号１２に示した塩基配列における248番目から253番目の6塩基欠損に対応し
ている。JAK2のF537_K539＞L変異については、CCAAATGGTG-TTAATCAGAAATGAA（配列番号１
８）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上
記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における237番目から2
42番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のK539L(TT)変異については、GGTGTTTCACttAATC
AGAAATGA（配列番号１９）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用するこ
とができる。なお、上記配列における小文字のttが、配列番号１２に示した塩基配列にお
ける241番目と242番目のAAに対応している。JAK2のK539L(CT)変異については、GTGTTTCAC
ctAATCAGAAATGA（配列番号２０）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用
することができる。なお、上記配列における小文字のctが、配列番号１２に示した塩基配
列における241番目と242番目のAAに対応している。
【0038】
また、上記のJAK2のエクソン12における各変異を同定する際、各変異の野生型に対応す
る野生型プローブを使用することもできる。ここで、上記の各変異は互いにごく近いか一
部重複しているため、ひとつの野生型プローブで代表させることもできるし、いくつかの
野生型プローブを組み合わせて使用することもできる。後述する実施例では、N542_E543d
el変異、E543_D544del変異およびR541_E543＞K変異を中心になるようにした野生型プロー
ブと、F537_K539＞L変異を中心になるようにした野生型プローブの二つを使用した。
る野生型プローブを使用することもできる。ここで、上記の各変異は互いにごく近いか一
部重複しているため、ひとつの野生型プローブで代表させることもできるし、いくつかの
野生型プローブを組み合わせて使用することもできる。後述する実施例では、N542_E543d
el変異、E543_D544del変異およびR541_E543＞K変異を中心になるようにした野生型プロー
ブと、F537_K539＞L変異を中心になるようにした野生型プローブの二つを使用した。
【0039】
さらに、CALRのタイプ１の変異については、配列番号１０における上記52塩基欠損に対
応する、例えば、CTCCTTGT-CCGCTCCTCGTC（配列番号２１）を含むオリゴヌクレオチドを
プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列
番号１０に示した塩基配列における506番目から557番目の52塩基欠損に対応している。ま
た、CALRのタイプ１変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブを使用す
ることもできる。すなわち、CALRのタイプ１変異を同定するには、配列番号２１の塩基配
列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブ
とからなるプローブセットを使用しても良い。
応する、例えば、CTCCTTGT-CCGCTCCTCGTC（配列番号２１）を含むオリゴヌクレオチドを
プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列
番号１０に示した塩基配列における506番目から557番目の52塩基欠損に対応している。ま
た、CALRのタイプ１変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブを使用す
ることもできる。すなわち、CALRのタイプ１変異を同定するには、配列番号２１の塩基配
列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブ
とからなるプローブセットを使用しても良い。
【0040】
さらに、CALRのタイプ２変異については、配列番号１０における上記5塩基挿入に対応
する、例えば、ATCCTCCgacaaTTGTCCT（配列番号２２）を含むオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のgacaaが5塩基挿入で
ある。また、CALRのタイプ２変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブ
を使用することもできる。すなわち、CALRのタイプ２の変異を同定するには、配列番号２
２の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生
型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
する、例えば、ATCCTCCgacaaTTGTCCT（配列番号２２）を含むオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のgacaaが5塩基挿入で
ある。また、CALRのタイプ２変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブ
を使用することもできる。すなわち、CALRのタイプ２の変異を同定するには、配列番号２
２の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生
型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
【0041】
さらにまた、MPLのW515K変異については、配列番号１３における上記置換変異に対応す
る、例えば、GAAACTGCttCCTCAGCA（配列番号２３）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プ
ローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のttが配列番号１３
に示した塩基配列における305番目と306番目のTGのAAへの置換変異に対応している。また
、MPLのW515K変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列にお
ける小文字のttをcaとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515K変異を
同定するには、配列番号２３の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、
当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
る、例えば、GAAACTGCttCCTCAGCA（配列番号２３）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プ
ローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のttが配列番号１３
に示した塩基配列における305番目と306番目のTGのAAへの置換変異に対応している。また
、MPLのW515K変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列にお
ける小文字のttをcaとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515K変異を
同定するには、配列番号２３の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、
当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
【0042】
さらにまた、MPLのW515L変異については、配列番号１３における上記置換変異に対応す
る、例えば、GGAAACTGCAaCCTCAG（配列番号２４）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プ
ローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番号１３
に示した塩基配列における306番目のGのTへの置換変異に対応している。また、MPLのW515
L変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列における小文字の
aをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515L変異を同定するには、
配列番号２４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プロ
ーブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
る、例えば、GGAAACTGCAaCCTCAG（配列番号２４）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プ
ローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番号１３
に示した塩基配列における306番目のGのTへの置換変異に対応している。また、MPLのW515
L変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列における小文字の
aをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515L変異を同定するには、
配列番号２４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プロ
ーブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
【0043】
以上のように、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及び/又は
タイプ５変異を同定するための、ミスマッチを有するCARL変異型プローブとして配列番号
９５、５３、５４及び５５をそれぞれ例示したが、CARL変異型プローブの塩基配列は配列
番号９５、５３、５４及び５５に限定されず、配列番号５７に示したタイプ１変異の塩基
配列、配列番号５８に示したタイプ３変異の塩基配列、配列番号５９に示したタイプ４変
異の塩基配列及び配列番号６０に示したタイプ５変異の塩基配列に基づいて適宜設計する
ことができる。
タイプ５変異を同定するための、ミスマッチを有するCARL変異型プローブとして配列番号
９５、５３、５４及び５５をそれぞれ例示したが、CARL変異型プローブの塩基配列は配列
番号９５、５３、５４及び５５に限定されず、配列番号５７に示したタイプ１変異の塩基
配列、配列番号５８に示したタイプ３変異の塩基配列、配列番号５９に示したタイプ４変
異の塩基配列及び配列番号６０に示したタイプ５変異の塩基配列に基づいて適宜設計する
ことができる。
【0044】
さらに、JAK2に存在する遺伝子変異を同定するための変異型プローブを例示したが、変
異型プローブの塩基配列は配列番号１４～２０に限定されず、配列番号１１及び１２に示
したJAK2の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。CALRに存在するタイプ１変異
及びタイプ２変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２１及び２２をそれぞ
れ例示したが、変異型プローブの塩基配列は配列番号２１及び２２に限定されず、配列番
号１０に示したCALRの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。MPLに存在する遺
伝子変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２３及び２４を例示したが、変
異型プローブの塩基配列は配列番号２３及び２４に限定されず、配列番号１３に示したMP
Lの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
異型プローブの塩基配列は配列番号１４～２０に限定されず、配列番号１１及び１２に示
したJAK2の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。CALRに存在するタイプ１変異
及びタイプ２変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２１及び２２をそれぞ
れ例示したが、変異型プローブの塩基配列は配列番号２１及び２２に限定されず、配列番
号１０に示したCALRの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。MPLに存在する遺
伝子変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２３及び２４を例示したが、変
異型プローブの塩基配列は配列番号２３及び２４に限定されず、配列番号１３に示したMP
Lの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
【0045】
これらプローブの塩基長としては、特に限定しないが、例えば１０～３０塩基長とする
ことができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。なお、プローブは、上述のように
、配列番号１０～１３の塩基配列における遺伝子変異を含む領域に基づいて設計した塩基
配列と、当該塩基配列における一方又は両方の末端に付加した塩基配列とを合計して、例
えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。
ことができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。なお、プローブは、上述のように
、配列番号１０～１３の塩基配列における遺伝子変異を含む領域に基づいて設計した塩基
配列と、当該塩基配列における一方又は両方の末端に付加した塩基配列とを合計して、例
えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。
【0046】
また、上述のように設計したプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNA
である。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。プローブは
、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合
成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ば
れる装置を使用することができる。
である。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。プローブは
、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合
成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ば
れる装置を使用することができる。
【0047】
上述のように設計したプローブは、その５’末端を担体上に固定化することにより、マ
イクロアレイ（一例としてDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイク
ロアレイは、上述した各遺伝子変異について、変異型プローブ及び野生型プローブを有す
ることが好ましい。各遺伝子変異について、変異型プローブと野生型プローブとを利用す
ることによって、変異の有無のみならず変異の割合を正確に判定することができる。ここ
で、変異型プローブと野生型プローブとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく
、長さが同じであることがより好ましい。
イクロアレイ（一例としてDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイク
ロアレイは、上述した各遺伝子変異について、変異型プローブ及び野生型プローブを有す
ることが好ましい。各遺伝子変異について、変異型プローブと野生型プローブとを利用す
ることによって、変異の有無のみならず変異の割合を正確に判定することができる。ここ
で、変異型プローブと野生型プローブとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく
、長さが同じであることがより好ましい。
【0048】
本発明に係るマイクロアレイは、上述したプローブを担体上に固定することで作製する
ことができる。
ことができる。
【0049】
担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば
、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化
合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導
電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ
素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表
されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セ
ラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、
ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート
、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸
ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニ
トリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹
脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、
アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリ
スルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは
平板状である。
、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化
合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導
電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ
素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表
されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セ
ラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、
ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート
、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸
ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニ
トリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹
脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、
アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリ
スルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは
平板状である。
【0050】
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する
担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボ
ン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を
有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特
に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボ
ン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を
有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特
に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
【0051】
本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用
いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1～75mm四方
のもの、好ましくは1～10mm四方のもの、より好ましくは3～5mm四方のものを用いる。微
細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板
を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学
修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶
軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での
乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1～75mm四方
のもの、好ましくは1～10mm四方のもの、より好ましくは3～5mm四方のものを用いる。微
細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板
を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学
修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶
軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での
乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【0052】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダ
イヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイ
ヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト
、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積
層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、
炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコ
ニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここ
で、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Ca
rbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称
し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその
後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分
析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収が
ないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電
可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着
が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用
いてもよい。
イヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイ
ヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト
、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積
層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、
炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコ
ニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここ
で、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Ca
rbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称
し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその
後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分
析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収が
ないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電
可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着
が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用
いてもよい。
【0053】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ
波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance ch
emical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法
、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸
着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance ch
emical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法
、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸
着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【0054】
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス
（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステ
ンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化
し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1～99体積％と残り
メタンガス99～1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成
してもよい。
（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステ
ンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化
し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1～99体積％と残り
メタンガス99～1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成
してもよい。
【0055】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間
に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラ
ズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に
向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラ
ズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に
向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【0056】
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット
板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形
成することができる。
板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形
成することができる。
【0057】
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層～100
μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚く
なると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm～1μm、より好ましくは5nm～500nmである
。
μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚く
なると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm～1μm、より好ましくは5nm～500nmである
。
【0058】
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレ
オチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適
宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポ
キシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
オチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適
宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポ
キシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
【0059】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによ
りまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫
外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施でき
る。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化
したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
りまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫
外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施でき
る。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化
したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【0060】
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合
物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合
物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10～12の2価
の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブ
ロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリ
ル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1～12の2価
の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、
マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸
、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素
原子または炭素数1～12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）
で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5
は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハ
ライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハ
ク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙
げられる。
物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合
物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10～12の2価
の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブ
ロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリ
ル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1～12の2価
の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、
マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸
、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素
原子または炭素数1～12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）
で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5
は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハ
ライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハ
ク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙
げられる。
【0061】
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポ
キシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素
＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては
、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げ
られる。
キシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素
＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては
、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げ
られる。
【0062】
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアル
デヒドを反応させることにより実施できる。
デヒドを反応させることにより実施できる。
【0063】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応さ
せることにより実施できる。
せることにより実施できる。
【0064】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求
核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステ
ル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエ
ステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応
性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-
ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステ
ル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知
られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、
N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン
-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ま
しく用いられる。
核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステ
ル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエ
ステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応
性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-
ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステ
ル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知
られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、
N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン
-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ま
しく用いられる。
【0065】
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミ
ドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミ
ド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化する
ことにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒ
ドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特
開2001-139532）。
ドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミ
ド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化する
ことにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒ
ドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特
開2001-139532）。
【0066】
プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、
これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装
置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマ
イクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッタ
ーにて手動でスポッティングしてもよい。
これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装
置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマ
イクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッタ
ーにて手動でスポッティングしてもよい。
【0067】
スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーシ
ョンを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常－20～100℃、好ましくは0～90
℃の温度で、通常0.5～16時間、好ましくは1～2時間にわたって行う。インキュベーショ
ンは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50～90％の条件で行うのが望ましい。インキュベ
ーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/
0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい
。
ョンを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常－20～100℃、好ましくは0～90
℃の温度で、通常0.5～16時間、好ましくは1～2時間にわたって行う。インキュベーショ
ンは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50～90％の条件で行うのが望ましい。インキュベ
ーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/
0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい
。
【0068】
以上のように構成されたマイクロアレイを用いることで、診断対象者における、JAK2、
CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異の有無を同時に
判定することができる。
CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異の有無を同時に
判定することができる。
【0069】
具体的に、JAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異の有無を判定する際には、診
断対象者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、JAK2における上
記遺伝子変異を含む領域（JAK2のV617F変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝
子変異を含む領域）、CALRにおける上記遺伝子変異を含む領域及びMPLにおける上記遺伝
子変異を含む領域をそれぞれ増幅する工程と、上述したマイクロアレイを用いて、増幅さ
れた核酸に含まれるJAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異の有無をそれぞれ検出
する工程とを含む。
断対象者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、JAK2における上
記遺伝子変異を含む領域（JAK2のV617F変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝
子変異を含む領域）、CALRにおける上記遺伝子変異を含む領域及びMPLにおける上記遺伝
子変異を含む領域をそれぞれ増幅する工程と、上述したマイクロアレイを用いて、増幅さ
れた核酸に含まれるJAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異の有無をそれぞれ検出
する工程とを含む。
【0070】
診断対象者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適
には東アジア人種、特に好適には日本人とする。また、診断対象者としては、骨髄増殖性
腫瘍が疑われる患者とすることができる。
には東アジア人種、特に好適には日本人とする。また、診断対象者としては、骨髄増殖性
腫瘍が疑われる患者とすることができる。
【0071】
診断対象者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿
など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げら
れる。
など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げら
れる。
【0072】
まず、診断対象者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定
されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなど
を用いたDNA抽出法を用いることができる。
されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなど
を用いたDNA抽出法を用いることができる。
【0073】
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、JAK2を含む領域（JAK2のV617F
変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝子変異を含む領域）、CALRを含む領域及
びMPLを含む領域を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（
Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-i
nitiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応に
おいては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、
増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用す
るプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレ
オチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されな
いが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有
機化合物などを使用することができる。
変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝子変異を含む領域）、CALRを含む領域及
びMPLを含む領域を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（
Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-i
nitiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応に
おいては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、
増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用す
るプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレ
オチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されな
いが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有
機化合物などを使用することができる。
【0074】
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領
域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加した
ヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系
である。
域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加した
ヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系
である。
【0075】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異
、タイプ４変異及びタイプ５変異を含む領域、すなわち、欠損位置（図１における矢印）
を含む領域を増幅するためのプライマーセットを含むことができる。ここで、プライマー
セットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一組のプライマーを
意味する。
、タイプ４変異及びタイプ５変異を含む領域、すなわち、欠損位置（図１における矢印）
を含む領域を増幅するためのプライマーセットを含むことができる。ここで、プライマー
セットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一組のプライマーを
意味する。
【0076】
プライマーセットを用いて増幅した欠損位置を含む領域は、上述したミスマッチを有す
るCARL変異型プローブ（例えば配列番号９５、５３、５４及び５５）により検出する。図
１に示したように、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異は、欠
損位置の３’側に野生型と同じ配列（図１中下線部）を有している。このため、仮に、タ
イプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異について、欠損位置を含んで
完全一致となるように設計したプローブを使用した場合、野生型の検体に対しても非特異
的にハイブリダイズする可能性がある。
るCARL変異型プローブ（例えば配列番号９５、５３、５４及び５５）により検出する。図
１に示したように、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異は、欠
損位置の３’側に野生型と同じ配列（図１中下線部）を有している。このため、仮に、タ
イプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異について、欠損位置を含んで
完全一致となるように設計したプローブを使用した場合、野生型の検体に対しても非特異
的にハイブリダイズする可能性がある。
【0077】
これに対して、上述のようにCARL変異型プローブ（例えば配列番号９５、５３、５４及
び５５）を使用した場合には、当該ミスマッチがあるため野生型との非特異的なハイブリ
ダイズの可能性を低減することができる。したがって、本発明に係る遺伝子変異評価用キ
ットを使用することによって、野生型検体とタイプ１変異を有する検体とを確実に区別し
て検出することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することに
よって、野生型検体とタイプ３変異を有する検体とを確実に区別して検出することができ
る。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体と
タイプ４変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。さらに、本発明に
係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ５変異を有す
る検体とを確実に区別して検出することができる。
び５５）を使用した場合には、当該ミスマッチがあるため野生型との非特異的なハイブリ
ダイズの可能性を低減することができる。したがって、本発明に係る遺伝子変異評価用キ
ットを使用することによって、野生型検体とタイプ１変異を有する検体とを確実に区別し
て検出することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することに
よって、野生型検体とタイプ３変異を有する検体とを確実に区別して検出することができ
る。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体と
タイプ４変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。さらに、本発明に
係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ５変異を有す
る検体とを確実に区別して検出することができる。
【0078】
以上の説明においては、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及
びタイプ５変異を検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブの設計について
説明したが、CALR遺伝子以外の他の変異についても同様に変異型プローブを設計すること
ができる。例えば、所定の長さを超える欠損変異であって、欠損変異後の配列が野生型配
列に類似する場合については、同様に変異型プローブを設計することができる。より具体
的には、５塩基長以上の欠損変異、好ましくは１０塩基以上の欠損変異、プローブとして
の好適な塩基長よりも長い欠損変異であって、野生型の塩基配列における欠損位置を含む
１０塩基以内に、欠損後の配列と２塩基長以上一致する配列がある場合には、一致する配
列の一部をミスマッチとするように変異型プローブを設計することができる。
びタイプ５変異を検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブの設計について
説明したが、CALR遺伝子以外の他の変異についても同様に変異型プローブを設計すること
ができる。例えば、所定の長さを超える欠損変異であって、欠損変異後の配列が野生型配
列に類似する場合については、同様に変異型プローブを設計することができる。より具体
的には、５塩基長以上の欠損変異、好ましくは１０塩基以上の欠損変異、プローブとして
の好適な塩基長よりも長い欠損変異であって、野生型の塩基配列における欠損位置を含む
１０塩基以内に、欠損後の配列と２塩基長以上一致する配列がある場合には、一致する配
列の一部をミスマッチとするように変異型プローブを設計することができる。
【0079】
なお、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異を
検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブでは、野生型の塩基配列における
欠損位置から５’側に、欠損後の配列と一致する配列があったため、欠損位置の３’側に
ミスマッチを有するような変異型プローブを設計した、逆に、野生型の塩基配列における
欠損位置から３’側に、欠損後の配列と一致する配列がある変異型の場合には、欠損位置
の５’側にミスマッチを設定して変異型プローブを設計することができる。
検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブでは、野生型の塩基配列における
欠損位置から５’側に、欠損後の配列と一致する配列があったため、欠損位置の３’側に
ミスマッチを有するような変異型プローブを設計した、逆に、野生型の塩基配列における
欠損位置から３’側に、欠損後の配列と一致する配列がある変異型の場合には、欠損位置
の５’側にミスマッチを設定して変異型プローブを設計することができる。
【0080】
ところで、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、JAK2における遺伝子変異を含む領
域を増幅するプライマーセットとして、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プラ
イマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエ
クソン12用プライマーセットを含んでいてもよい。
域を増幅するプライマーセットとして、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プラ
イマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエ
クソン12用プライマーセットを含んでいてもよい。
【0081】
V617F変異用プライマーセットとしては、野生型における617番目のバリンに相当するア
ミノ酸をコードする領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であ
れば適宜設計できる。例えば、
フォワードプライマーJAK2-F：5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'（配列番号２５）及び
リバースプライマーJAK2-R：5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3'（配列番号２６）から
なるセットが挙げられる。
ミノ酸をコードする領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であ
れば適宜設計できる。例えば、
フォワードプライマーJAK2-F：5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'（配列番号２５）及び
リバースプライマーJAK2-R：5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3'（配列番号２６）から
なるセットが挙げられる。
【0082】
ここで、V617F変異用プライマーセットを用いてV617F変異を含む領域を増幅する際には
、V617F変異用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍光標識を付した方のプラ
イマー（例えばフォワードプライマー）の濃度を1.0μＭ以上とすることが好ましい。当
該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存
在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお、当該プライマー濃度
の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度の上限値
（例えば10μＭ）とすることができる。
、V617F変異用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍光標識を付した方のプラ
イマー（例えばフォワードプライマー）の濃度を1.0μＭ以上とすることが好ましい。当
該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存
在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお、当該プライマー濃度
の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度の上限値
（例えば10μＭ）とすることができる。
【0083】
一方、エクソン12用プライマーセットとしては、上述したエクソン12に含まれる複数の
遺伝子変異の少なくとも２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、更に好ましくは５
個、最も好ましくは６個すべてを一括して増幅できるように設計することが好ましい。よ
り具体的に、エクソン12用プライマーセットとしては、図３に示すように、配列番号１に
示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプ
ライマーと、配列番号２に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有する
エクソン12用リバースプライマーとすることができる。ここで、配列番号１はエクソン12
をコードする塩基配列の178番目から228番目、配列番号２は399番目から435番目であり、
いずれも配列番号１２の中の部分配列であり、両者の間に上記した６個の遺伝子変異が全
て含まれている。
遺伝子変異の少なくとも２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、更に好ましくは５
個、最も好ましくは６個すべてを一括して増幅できるように設計することが好ましい。よ
り具体的に、エクソン12用プライマーセットとしては、図３に示すように、配列番号１に
示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプ
ライマーと、配列番号２に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有する
エクソン12用リバースプライマーとすることができる。ここで、配列番号１はエクソン12
をコードする塩基配列の178番目から228番目、配列番号２は399番目から435番目であり、
いずれも配列番号１２の中の部分配列であり、両者の間に上記した６個の遺伝子変異が全
て含まれている。
【0084】
さらに具体的に、エクソン12用フォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列か
らなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号４に示す塩基配列からなるエクソ
ン12用フォワードプライマーF3、配列番号５に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワ
ードプライマーF4及び配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライ
マーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
らなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号４に示す塩基配列からなるエクソ
ン12用フォワードプライマーF3、配列番号５に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワ
ードプライマーF4及び配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライ
マーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
【0085】
また、具体的に、エクソン12用リバースプライマーは、配列番号７に示す塩基配列から
なるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12
用リバースプライマーR2及び配列番号９に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプ
ライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
なるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12
用リバースプライマーR2及び配列番号９に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプ
ライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
【0086】
特に、エクソン12用プライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン
12用フォワードプライマーF5と、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバー
スプライマーR2の組み合わせとすることがより好ましい。
12用フォワードプライマーF5と、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバー
スプライマーR2の組み合わせとすることがより好ましい。
【0087】
なお、上記したフォワードプライマーF1，F3～F5、およびリバースプライマーR1～R3の
塩基配列は、エクソン12をコードする塩基配列上の対応する位置によって表している。そ
のため、プライマーセットを構成するフォワードあるいはリバースのいずれか一方のプラ
イマーは、配列番号で示した塩基配列の相補鎖となる。後述する実施例においてはすべて
、リバース側を相補鎖で作製している。
塩基配列は、エクソン12をコードする塩基配列上の対応する位置によって表している。そ
のため、プライマーセットを構成するフォワードあるいはリバースのいずれか一方のプラ
イマーは、配列番号で示した塩基配列の相補鎖となる。後述する実施例においてはすべて
、リバース側を相補鎖で作製している。
【0088】
ここで、エクソン12用プライマーセットを用いてエクソン12に含まれる遺伝子変異を含
む領域を増幅する際には、エクソン12用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍
光標識を付した方のプライマー（例えばリバースプライマー）の濃度を2.5μＭ以上とす
ることが好ましい。当該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領
域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお
、当該プライマー濃度の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプ
ライマー濃度の上限値（例えば10μＭ）とすることができる。
む領域を増幅する際には、エクソン12用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍
光標識を付した方のプライマー（例えばリバースプライマー）の濃度を2.5μＭ以上とす
ることが好ましい。当該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領
域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお
、当該プライマー濃度の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプ
ライマー濃度の上限値（例えば10μＭ）とすることができる。
【0089】
エクソン12用に限らないが、プライマーセットにおけるフォワードの濃度とリバースの
濃度は同一でもよいし、異なっていてもよい。異なる場合はいずれか一方が上記濃度条件
を満たせばよい。後述する実施例ではJAK2 V617F、エクソン12、CALR、MPLのいずれのプ
ライマーセットにおいても蛍光標識した側のプライマー濃度を高く設定している。
濃度は同一でもよいし、異なっていてもよい。異なる場合はいずれか一方が上記濃度条件
を満たせばよい。後述する実施例ではJAK2 V617F、エクソン12、CALR、MPLのいずれのプ
ライマーセットにおいても蛍光標識した側のプライマー濃度を高く設定している。
【0090】
また、V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プ
ライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマー濃度]
/[V617F変異用プライマー濃度]を1.0～5. 5とすることが好ましい。当該濃度比をこの範
囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域
を良好に増幅することができる。
ライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマー濃度]
/[V617F変異用プライマー濃度]を1.0～5. 5とすることが好ましい。当該濃度比をこの範
囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域
を良好に増幅することができる。
【0091】
CALRにおける上記遺伝子変異を含む領域の増幅反応に用いるプライマーは、上記遺伝子
変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜
設計できる。例えば、
プライマーCALR-F：5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'（配列番号２７）及びプライマーCALR
-R：5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3'（配列番号２８）からなるプライマーのセットが挙
げられる。
変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜
設計できる。例えば、
プライマーCALR-F：5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'（配列番号２７）及びプライマーCALR
-R：5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3'（配列番号２８）からなるプライマーのセットが挙
げられる。
【0092】
MPLにおける上記遺伝子変異を含む領域の増幅反応に用いるプライマーは、上記遺伝子
変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜
設計できる。例えば、
プライマーMPL-F：5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'（配列番号２９）及びプライマーMPL-R
：5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3'（配列番号３０）からなるプライマーのセットが
挙げられる。
変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜
設計できる。例えば、
プライマーMPL-F：5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'（配列番号２９）及びプライマーMPL-R
：5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3'（配列番号３０）からなるプライマーのセットが
挙げられる。
【0093】
また、プライマーにより増幅される核酸断片は、設計したプローブに対応する領域を含
んでいれば特に限定されず、例えば1kbp以下が好ましく、800bp以下がより好ましくは、5
00bp以下が更に好ましく、350bp以下が特に好ましい。
んでいれば特に限定されず、例えば1kbp以下が好ましく、800bp以下がより好ましくは、5
00bp以下が更に好ましく、350bp以下が特に好ましい。
【0094】
上記のようにして得られた増幅核酸と、担体に固定されたプローブとのハイブリダイゼ
ーション反応を行い、変異型プローブに対する増幅核酸のハイブリダイズを検出すること
で診断対象者における上記遺伝子変異の有無を評価することができる。すなわち、変異型
プローブに対して増幅核酸がハイブリダイズしたことを例えば標識を検出することにより
測定できる。
ーション反応を行い、変異型プローブに対する増幅核酸のハイブリダイズを検出すること
で診断対象者における上記遺伝子変異の有無を評価することができる。すなわち、変異型
プローブに対して増幅核酸がハイブリダイズしたことを例えば標識を検出することにより
測定できる。
【0095】
標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光
シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値
化することができる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条
件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反
応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条
件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、45～60
℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低く
することがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとする
ことがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり
、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまで
もない。
シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値
化することができる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条
件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反
応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条
件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、45～60
℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低く
することがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとする
ことがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり
、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまで
もない。
【0096】
また、上述した各遺伝子変異について変異型プローブと野生型プローブとを備えるマイ
クロアレイを使用した場合、これら変異型プローブ及び野生型プローブからのシグナル強
度を用いて上記遺伝子変異の有無を評価することができる。具体的には、野生型プローブ
におけるシグナル強度及び変異型プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、変異
型プローブに由来するシグナ強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例と
しては、例えば、式：[変異型プローブ由来のシグナル強度]/([野生型プローブ由来のシ
グナル強度]+[変異型プローブ由来シグナル強度])を使用する方法が挙げられる。
クロアレイを使用した場合、これら変異型プローブ及び野生型プローブからのシグナル強
度を用いて上記遺伝子変異の有無を評価することができる。具体的には、野生型プローブ
におけるシグナル強度及び変異型プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、変異
型プローブに由来するシグナ強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例と
しては、例えば、式：[変異型プローブ由来のシグナル強度]/([野生型プローブ由来のシ
グナル強度]+[変異型プローブ由来シグナル強度])を使用する方法が挙げられる。
【0097】
そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、
判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれると判断し、判定値が
閾値を下回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれないと判断する。このように判
定値を利用することで、上述したJAK2、CALR及びMPLにおける各遺伝子変異の有無を判定
することができる。
判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれると判断し、判定値が
閾値を下回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれないと判断する。このように判
定値を利用することで、上述したJAK2、CALR及びMPLにおける各遺伝子変異の有無を判定
することができる。
【0098】
ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、JAK2、CALR及びMPLに存在する
上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している検体を用いて上記式により算出
された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、JAK2、CALR及びMPLに
存在する上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している複数の検体を用いて複
数の判定値を算出し、その平均値+３σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる
。なお、平均値+２σや平均値+σの値を閾値とすることもできる。
上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している検体を用いて上記式により算出
された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、JAK2、CALR及びMPLに
存在する上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している複数の検体を用いて複
数の判定値を算出し、その平均値+３σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる
。なお、平均値+２σや平均値+σの値を閾値とすることもできる。
【0099】
以上のように、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同定するための変異型プ
ローブを備えるマイクロアレイを利用することで、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝
子変異を同時に同定することができる。JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異に関
する情報は、例えば、WHOによる分類（2016年度バージョン）における骨髄増殖性腫瘍の
診断に利用することができる。詳細には、WHOによる分類では、真性赤血球増加症又は真
性多血症（polycythemia vera：PV）の診断には、JAK2における上記遺伝子変異が存在す
ることが一つの要件となっている。また、WHOによる分類では、本態性血小板血症（essen
tial thrombocythemia：ET）の診断には、JAK2、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のい
ずれかが存在することが一つの要件となっている。さらに、WHOによる分類では、前線維
／早期の原発性骨髄線維症（prefibrotic/early primary myelofibrosis：prefibrotic/e
arly PMF）若しくは原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）の診断には、JAK2
、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のいずれかが存在することが一つの要件となってい
る。
ローブを備えるマイクロアレイを利用することで、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝
子変異を同時に同定することができる。JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異に関
する情報は、例えば、WHOによる分類（2016年度バージョン）における骨髄増殖性腫瘍の
診断に利用することができる。詳細には、WHOによる分類では、真性赤血球増加症又は真
性多血症（polycythemia vera：PV）の診断には、JAK2における上記遺伝子変異が存在す
ることが一つの要件となっている。また、WHOによる分類では、本態性血小板血症（essen
tial thrombocythemia：ET）の診断には、JAK2、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のい
ずれかが存在することが一つの要件となっている。さらに、WHOによる分類では、前線維
／早期の原発性骨髄線維症（prefibrotic/early primary myelofibrosis：prefibrotic/e
arly PMF）若しくは原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）の診断には、JAK2
、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のいずれかが存在することが一つの要件となってい
る。
【0100】
このように、例えばWHOによる分類（2016年度バージョン）を利用した骨髄増殖性腫瘍
の診断に、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同定するための変異型プローブ
を備えるマイクロアレイを利用することができる。
の診断に、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同定するための変異型プローブ
を備えるマイクロアレイを利用することができる。
【実施例0101】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定
されるものではない。
されるものではない。
【0102】
［実施例１］
１．サンプル調製
本実施例では、野生型検体として健常人末梢血由来ゲノムＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社
製）を用いた。
本実施例では、表１に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領
域（４箇所）をそれぞれ増幅した。
１．サンプル調製
本実施例では、野生型検体として健常人末梢血由来ゲノムＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社
製）を用いた。
本実施例では、表１に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領
域（４箇所）をそれぞれ増幅した。
【0103】
【表1】
【0104】
本実施例では、表１に示した４つの対象領域を増幅するため、表２に示したプライマー
を設計した。なお、exon12-FはF5であり、exon12-RはR2の相補鎖である。
を設計した。なお、exon12-FはF5であり、exon12-RはR2の相補鎖である。
【0105】
【表2】
【0106】
以上のように調製したDNAサンプルを用いて、JAK2遺伝子、CALR遺伝子及びMPL遺伝子に
ついて４つの対象領域をそれぞれPCRにより増幅した。なお、PCRでは鋳型となるゲノムDN
Aを8又は16ng/μLとした。反応液組成を表３に示した。
ついて４つの対象領域をそれぞれPCRにより増幅した。なお、PCRでは鋳型となるゲノムDN
Aを8又は16ng/μLとした。反応液組成を表３に示した。
【0107】
【表3】
【0108】
そして、PCRのサーマルサイクルを、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒、５９℃で
３０秒及び７２℃で４５秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０
分間とし、最終的に４℃を維持した。
３０秒及び７２℃で４５秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０
分間とし、最終的に４℃を維持した。
【0109】
２．マイクロアレイ
本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子
変異、CALR遺伝子におけるタイプ１変異～タイプ５変異及びMPL遺伝子におけるW515L/K変
異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの
塩基配列を表４にまとめて示した。
本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子
変異、CALR遺伝子におけるタイプ１変異～タイプ５変異及びMPL遺伝子におけるW515L/K変
異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの
塩基配列を表４にまとめて示した。
【0110】
【表4】
【0111】
３．遺伝子変異の同定
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規
定温度（52℃）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱
しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標
識オリゴDNA（ライフテクノロジーズジャパン社製））2μLを混合し、この溶液を3μLと
り、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、52℃に設定したハ
イブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑社製）で１時間反応させた。ハイブリダイズ反応
終了後、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットし、洗浄用ステンレスホル
ダーを0.1×SSC/0.1% SDS溶液に浸した。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を
検出するまでホルダーを1×SSC溶液（室温）に浸した。
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規
定温度（52℃）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱
しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標
識オリゴDNA（ライフテクノロジーズジャパン社製））2μLを混合し、この溶液を3μLと
り、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、52℃に設定したハ
イブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑社製）で１時間反応させた。ハイブリダイズ反応
終了後、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットし、洗浄用ステンレスホル
ダーを0.1×SSC/0.1% SDS溶液に浸した。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を
検出するまでホルダーを1×SSC溶液（室温）に浸した。
【0112】
検出直前にチップにカバーフィルムを被せ、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）でチップの蛍光強
度を検出した。以上のように測定した野生型プローブ及び変異型プローブにおける蛍光強
度を用い、JAK2の遺伝子変異（V617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異）
、CALRの遺伝子変異及びMPLの遺伝子変異について下記式によって判定値を算出した。
判定値＝[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの
蛍光強度])
度を検出した。以上のように測定した野生型プローブ及び変異型プローブにおける蛍光強
度を用い、JAK2の遺伝子変異（V617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異）
、CALRの遺伝子変異及びMPLの遺伝子変異について下記式によって判定値を算出した。
判定値＝[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの
蛍光強度])
【0113】
［実験例１－１］
本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異である、タイプ３変異、タイプ４変
異又はタイプ５変異を検出するためのCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すな
わち、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異のそれぞれについて、欠損位置（図
１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミスマッチ
を有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表５）。なお、実際に作製したプローブ
は、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したものである。
本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異である、タイプ３変異、タイプ４変
異又はタイプ５変異を検出するためのCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すな
わち、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異のそれぞれについて、欠損位置（図
１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミスマッチ
を有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表５）。なお、実際に作製したプローブ
は、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したものである。
【0114】
【表5】
【0115】
本実験例では、表５に示した各プローブを用いて、変異モデルサンプル(変異100%プラ
スミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を
測定した。その結果を表６に示した。なお、表６中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデル
サンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対
する蛍光強度である。
スミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を
測定した。その結果を表６に示した。なお、表６中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデル
サンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対
する蛍光強度である。
【0116】
【表6】
【0117】
表６に示したように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、特異的蛍
光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリ
ダイズできることが明らかとなった。表６に示したように、特異的蛍光強度*1が10000以
上であり、非特異的蛍光強度*2が1000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特
異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた。さらにまた、設計した変
異プローブのうち、特異的蛍光強度*1が15000以上、非特異的蛍光強度*2が500以下となる
ような、変異型サンプルに対して非常に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計す
ることができた（例えばtype3変異プローブ5、type4変異プローブ5、type4変異プローブ7
、type5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5）。なお、タイプ４変異を同定するための
プローブであるtype4変異プローブ5及びtype4変異プローブ7は、特異的蛍光強度*1の高さ
からtype4変異プローブ5がより好ましいと言える。また、タイプ５変異を同定するための
プローブであるtype5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5は、特異的蛍光強度*1の高さ
からtype5変異プローブ4がより好ましいと言える。
光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリ
ダイズできることが明らかとなった。表６に示したように、特異的蛍光強度*1が10000以
上であり、非特異的蛍光強度*2が1000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特
異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた。さらにまた、設計した変
異プローブのうち、特異的蛍光強度*1が15000以上、非特異的蛍光強度*2が500以下となる
ような、変異型サンプルに対して非常に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計す
ることができた（例えばtype3変異プローブ5、type4変異プローブ5、type4変異プローブ7
、type5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5）。なお、タイプ４変異を同定するための
プローブであるtype4変異プローブ5及びtype4変異プローブ7は、特異的蛍光強度*1の高さ
からtype4変異プローブ5がより好ましいと言える。また、タイプ５変異を同定するための
プローブであるtype5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5は、特異的蛍光強度*1の高さ
からtype5変異プローブ4がより好ましいと言える。
【0118】
また、表５に示した各プローブを用いて、各変異モデルサンプル(タイプ１変異モデル
プラスミド、タイプ２変異モデルプラスミド、タイプ３変異モデルプラスミド、タイプ４
変異モデルプラスミド及びタイプ５変異モデルプラスミド）に対する蛍光強度及び野生型
モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測定した。その結果を表７に示した。
プラスミド、タイプ２変異モデルプラスミド、タイプ３変異モデルプラスミド、タイプ４
変異モデルプラスミド及びタイプ５変異モデルプラスミド）に対する蛍光強度及び野生型
モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測定した。その結果を表７に示した。
【0119】
【表7】
【0120】
表７に示すように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、各変異タイ
プを特異的に検出できることが明らかとなった。表７に示した結果のうち、type3変異プ
ローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4を用いて測定した結果をまとめて
図２に示した。type3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4の実際
に作製したプローブ配列は、表４に示したとおりである。なお、図２には、後述する実験
例１－２に示した結果のうち、type1変異プローブ7（実際に作製したプローブ配列は表４
）を用いて測定した結果を併せて示した。
プを特異的に検出できることが明らかとなった。表７に示した結果のうち、type3変異プ
ローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4を用いて測定した結果をまとめて
図２に示した。type3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4の実際
に作製したプローブ配列は、表４に示したとおりである。なお、図２には、後述する実験
例１－２に示した結果のうち、type1変異プローブ7（実際に作製したプローブ配列は表４
）を用いて測定した結果を併せて示した。
【0121】
［実験例１－２］
本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異であるタイプ１変異を検出するため
のCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すなわち、タイプ１変異について、欠損
位置（図１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミ
スマッチを有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表８）。なお、実際に作製した
プローブは、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したもの
である。
本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異であるタイプ１変異を検出するため
のCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すなわち、タイプ１変異について、欠損
位置（図１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミ
スマッチを有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表８）。なお、実際に作製した
プローブは、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したもの
である。
【0122】
【表8】
【0123】
本実験例では、表８に示した各プローブを用いて、変異モデルサンプル(変異5%プラス
ミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測
定した。その結果を表９に示した。なお、表９中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデルサ
ンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対す
る蛍光強度である。
ミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測
定した。その結果を表９に示した。なお、表９中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデルサ
ンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対す
る蛍光強度である。
【0124】
【表9】
【0125】
表９に示したように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、特異的蛍
光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリ
ダイズできることが明らかとなった。表９に示したように、特異的蛍光強度*1が15000以
上であり、非特異的蛍光強度*2が3000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特
異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた（type1変異プローブ7）。
光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリ
ダイズできることが明らかとなった。表９に示したように、特異的蛍光強度*1が15000以
上であり、非特異的蛍光強度*2が3000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特
異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた（type1変異プローブ7）。
【0126】
［実験例２］
本実験例では、JAK2のエクソン12に含まれる６つの遺伝子変異を含む領域を増幅するた
めのプライマーセットを複数設計し、評価した。設計したプライマーセットは、図３に示
した通りである。本実施例では、下記表１０に示すプライマーセットについて評価した。
表１０におけるF1～F5及びR1～R3は図１に対応している。図３に示すように、フォワード
プライマーF1、F3～F5は、配列番号１に示した塩基配列の範囲に含まれ、フォワードプラ
イマーF2は当該範囲から外れる位置に設計した（配列番号５２）。なお、実験例１及び後
述する実験例２では検体として野生型である健常人由来末梢血ゲノムＤＮＡを使用し、野
生型プローブの蛍光強度で評価した。
本実験例では、JAK2のエクソン12に含まれる６つの遺伝子変異を含む領域を増幅するた
めのプライマーセットを複数設計し、評価した。設計したプライマーセットは、図３に示
した通りである。本実施例では、下記表１０に示すプライマーセットについて評価した。
表１０におけるF1～F5及びR1～R3は図１に対応している。図３に示すように、フォワード
プライマーF1、F3～F5は、配列番号１に示した塩基配列の範囲に含まれ、フォワードプラ
イマーF2は当該範囲から外れる位置に設計した（配列番号５２）。なお、実験例１及び後
述する実験例２では検体として野生型である健常人由来末梢血ゲノムＤＮＡを使用し、野
生型プローブの蛍光強度で評価した。
【0127】
【表10】
【0128】
結果を図４に示した。図４から判るように、本実施例で設計したプライマーセットのう
ち、F2を使用したプライマーセット２以外のプライマーセットを使用した場合に、全ての
増幅断片について優れた蛍光強度を達成できることが明らかとなった。これらのセットの
うち、全体的に蛍光強度が高いプライマーセット１、４及び５が好ましいと言え、また各
解析対象領域間の強度差が比較的小さいプライマーセット１及び５がより好ましいと言え
る。以下の評価では、表２に示したとおりプライマーセット５（F5とR2の組合せ）を採用
した。
ち、F2を使用したプライマーセット２以外のプライマーセットを使用した場合に、全ての
増幅断片について優れた蛍光強度を達成できることが明らかとなった。これらのセットの
うち、全体的に蛍光強度が高いプライマーセット１、４及び５が好ましいと言え、また各
解析対象領域間の強度差が比較的小さいプライマーセット１及び５がより好ましいと言え
る。以下の評価では、表２に示したとおりプライマーセット５（F5とR2の組合せ）を採用
した。
【0129】
［実験例３］
図５及び６にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、V61
7F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワー
ドプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした
特性図を示した。また、図７及び８にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおける
プライマーの濃度、JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライ
マー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度
を縦軸とした特性図を示した。
図５及び６にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、V61
7F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワー
ドプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした
特性図を示した。また、図７及び８にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおける
プライマーの濃度、JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライ
マー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度
を縦軸とした特性図を示した。
【0130】
図５から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標
識された一方のプライマー濃度0.5μMのとき、蛍光強度12000以上を達成できなかった。
また、図６から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのう
ち標識された一方のプライマー濃度が2.5μMであっても、エクソン12を増幅するプライマ
ーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.0μMのとき、蛍光強度12000以上を
達成できなかった。
識された一方のプライマー濃度0.5μMのとき、蛍光強度12000以上を達成できなかった。
また、図６から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのう
ち標識された一方のプライマー濃度が2.5μMであっても、エクソン12を増幅するプライマ
ーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.0μMのとき、蛍光強度12000以上を
達成できなかった。
【0131】
一方、図７から判るように、エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された
一方のプライマー濃度が3.0～4.0μMであっても、V617F変異部位を含む領域を増幅するプ
ライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が0.5μMのとき、蛍光強度12000
以上を達成できなかった。また、図８から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅
するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が1.0μM以上であって、エ
クソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.5μM以
上の条件で蛍光強度12000以上を達成できた。
一方のプライマー濃度が3.0～4.0μMであっても、V617F変異部位を含む領域を増幅するプ
ライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が0.5μMのとき、蛍光強度12000
以上を達成できなかった。また、図８から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅
するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が1.0μM以上であって、エ
クソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.5μM以
上の条件で蛍光強度12000以上を達成できた。
【0132】
図９にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、エクソン1
2を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）とV617F
変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識されたプライマー（フォワー
ドプライマー）との濃度比を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸と
した特性図を示した。図９から判るように、上記濃度比が1.0～5.5の範囲にある場合には
全ての増幅断片について蛍光強度12000以上を達成できた。
2を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）とV617F
変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識されたプライマー（フォワー
ドプライマー）との濃度比を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸と
した特性図を示した。図９から判るように、上記濃度比が1.0～5.5の範囲にある場合には
全ての増幅断片について蛍光強度12000以上を達成できた。
【0133】
［実施例２］
本実施例では、変異モデル検体には、遺伝子解析対象領域の野生型又は変異型配列を搭
載した人工遺伝子（プラスミド）を構築し、野生型人工遺伝子と変異型人工遺伝子を任意
で混合したものを用い、表１１に示した反応液組成で変異検出のためのPCRを行った。
本実施例では、変異モデル検体には、遺伝子解析対象領域の野生型又は変異型配列を搭
載した人工遺伝子（プラスミド）を構築し、野生型人工遺伝子と変異型人工遺伝子を任意
で混合したものを用い、表１１に示した反応液組成で変異検出のためのPCRを行った。
【0134】
【表11】
【0135】
また、本実施例では、PCRの反応液に表１２に示したブロッカーオリゴDNAを添加した。
ブロッカーは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるよ
うに、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加
されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計されてい
る。
ブロッカーは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるよ
うに、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加
されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計されてい
る。
【0136】
【表12】
【0137】
なお、本実施例では、全ての解析対象遺伝子領域が野生型である野生型検体（n=9）と
、解析対象領域の一部が変異型である変異モデル検体（n=3）を使用し、変異体モデル検
体の割合を1%又は5%とした。結果を図１０に示した。なお、図１０におけるエラーバーは
5σである。
、解析対象領域の一部が変異型である変異モデル検体（n=3）を使用し、変異体モデル検
体の割合を1%又は5%とした。結果を図１０に示した。なお、図１０におけるエラーバーは
5σである。
【0138】
図１０に示したように、1%又は5%の遺伝子変異について全て識別できることが明らかと
なった。
なった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
5塩基長以上の欠損変異を特異的に検出する変異型プローブであって、
前記欠損変異を有する遺伝子において、欠損位置を含む周辺領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含み、
前記ハイブリダイズする塩基配列は、前記周辺領域において欠損位置を含む10塩基以内の塩基配列が、その欠損変異を有さない遺伝子における対応する領域の塩基配列と2塩基以上同一の場合に、前記同一の塩基配列の一部と人為的欠損によるミスマッチを有するように設計されている
前記変異型プローブ。
前記欠損変異を有する遺伝子において、欠損位置を含む周辺領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含み、
前記ハイブリダイズする塩基配列は、前記周辺領域において欠損位置を含む10塩基以内の塩基配列が、その欠損変異を有さない遺伝子における対応する領域の塩基配列と2塩基以上同一の場合に、前記同一の塩基配列の一部と人為的欠損によるミスマッチを有するように設計されている
前記変異型プローブ。
【請求項2】
前記ミスマッチする位置が前記欠損変異を有する遺伝子において欠損位置より5'末端側又は3'末端側に設計されている、請求項１に記載の変異型プローブ。
【請求項3】
前記一部が1～5塩基である、請求項１に記載の変異型プローブ。
【請求項4】
プローブ塩基長が10～30塩基である、請求項１に記載の変異型プローブ。
【請求項5】
前記欠損変異を有さない遺伝子が野生型遺伝子である、請求項１に記載の変異型プローブ。
【請求項6】
前記欠損変異を有する遺伝子が疾患に関連する遺伝子である、請求項１に記載の変異型プローブ。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の変異型プローブを担体上に固定化したマイクロアレイ。
【請求項8】
前記欠損変異を有さない遺伝子が野生型遺伝子であり、前記野生型遺伝子を特異的に検出する野生型プローブを担体上に固定化した、請求項７に記載のマイクロアレイ。