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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024102381
(43)【公開日】2024-07-31
(54)【発明の名称】変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/40 20060101AFI20240724BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240724BHJP
【ＦＩ】
C12N15/40 ZNA
C12Q1/6888 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021084043
(22)【出願日】2021-05-18
(71)【出願人】
【識別番号】302019245
【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】秋友 美和
(72)【発明者】
【氏名】相良 武宏
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 憲介
(72)【発明者】
【氏名】上森 隆司
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ52
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS34
(57)【要約】
【課題】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しかった。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【解決手段】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築した。
【選択図】 なし
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しかった。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【解決手段】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築した。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号４、８、１２、１４、１６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号２４、２７、３０、３２、３４、３７、４４、４５、４６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
蛍光物質及び消光物質で標識されている請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
副溝結合剤（ＭＧＢ）が付加されている請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）請求項１から請求項６いずれか記載のオリゴヌクレオチドを使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）請求項１から請求項６いずれか記載のオリゴヌクレオチドを使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
【請求項8】
工程（１）が、合成されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む請求項７記載の方法。
【請求項9】
工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、請求項７記載の方法。
【請求項10】
工程（２）において、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
を使用して変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、請求項７記載の方法。
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
を使用して変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、請求項７記載の方法。
【請求項11】
試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）請求項１～請求項６いずれか記載のオリゴヌクレオチド、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
（１）請求項１～請求項６いずれか記載のオリゴヌクレオチド、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
【請求項12】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片を増幅する試薬をさらに含む請求項１１記載のキット。
【請求項13】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片の増幅に使用されるプライマー対を含む請求項１２のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法ならびに当該検出方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
細菌やウイルスによりヒトに引き起こされる感染症の中には、もっぱら局地的な感染にとどまるもの、地理的条件とはかかわりなく広く蔓延する可能性のあるものが存在する。ヒト－ヒト間で感染が成立する感染症は後者に該当し、その感染力や感染患者が呈する症状の重篤度によっては社会問題化することもある。天然痘、ペスト、インフルエンザ（スペイン風邪）等、大規模な流行を起こしてその後の歴史に影響を与えた感染症も少なくない。
【0003】
多くの感染症について治療や予防の方法が開発された現代でも、引き続き注意を要する感染症が残されているのに加え、さらに新興感染症のリスクが存在している。２００３年に発見されたＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は重篤な呼吸器疾患を引き起こすウイルスであることが明らかとされた。さらに、２０１９年には新たなコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が出現し、２０２０年には世界的に蔓延している。
【0004】
感染症への対応手段としては治療薬等の開発と普及、ならびに衛生面での環境整備が挙げられる。加えて、病原体の存在や感染者を特定して早期に隔離措置を講じ、感染経路を遮断することは、感染症の蔓延防止において極めて重要である。上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法としては、ウイルスＲＮＡを標的とする核酸検査法（例えば非特許文献１）、ウイルスタンパク質を標的とする抗原検査法、感染が疑われるヒトの血液を試料とする抗体検査法等がすでに開発されている。現在は、主に検出感度の観点から核酸検査法がウイルス検査の主流となっている。一方、当該ウイルスからは複数の変異ウイルス（変異株）が発生しており、これらは元のウイルスとは異なる性質を持つと報告されている（例えば非特許文献２、非特許文献３）。
【0005】
これらの変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しく、ウイルスの変異を疫学的に検討する上では問題を有している。さらに、変異株は変異前のウイルスの情報に基づいて構築されたウイルス検出系では検出できない、もしくは検出感度が低下する可能性がある。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。
【0006】
以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２０２０）、７３（４）、３０４－３０７
【非特許文献2】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）、３７２（６５３８）、ｅａｂｇ３０５５
【非特許文献3】Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２１）、１８（４）、１０５８－１０６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多くはスパイクタンパク質に多重変異が生じている。代表的なものとして、発生国を基に３系統〔英国ＶＯＣ－２０２０１２／０１（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ５０１Ｙ．Ｖ２（Ｂ．１．３５１）、ブラジル５０１Ｙ．Ｖ３（Ｐ．１）〕が報告されている。変異株については感染伝播力の上昇およびワクチン効果を減弱させる免疫逃避の可能性が指摘されている。これら変異株のスパイクタンパク質に生じている変異に関する、国立感染症研究所の報告（２０２１年４月７日付）に記載された情報を表１に示す。
【0009】
【表1】
【0010】
スパイクタンパク質において、受容体との結合に関与するといわれるＮ５０１、実用化されたワクチンで得られる中和抗体の中心エピトープに位置しているＥ４８４が変異している変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、その伝播の状況を把握することが特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築し、本発明を完成させた。
【0012】
本発明は以下に概説するとおりである。
［１］変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
［２］配列番号４、８、１２、１４、１６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号２４、２７、３０、３２、３４、３７、４４、４５、４６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［４］蛍光物質及び消光物質で標識されている［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［５］副溝結合剤（ＭＧＢ）が付加されている［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［６］ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［７］試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）［１］から［６］いずれか記載のオリゴヌクレオチドを使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
［８］工程（１）が、合成されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む［７］記載の方法。
［９］工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、［７］記載の方法。
［１０］工程（２）において、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
を使用して変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、［７］記載の方法。
［１１］試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）［１］から［６］いずれか記載のオリゴヌクレオチド、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬を含むキット。
［１２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片を増幅する試薬をさらに含む［１１］記載のキット。
［１３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片の増幅に使用されるプライマー対を含む［１２］のキット。
［１］変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
［２］配列番号４、８、１２、１４、１６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号２４、２７、３０、３２、３４、３７、４４、４５、４６から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［４］蛍光物質及び消光物質で標識されている［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［５］副溝結合剤（ＭＧＢ）が付加されている［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［６］ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［７］試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）［１］から［６］いずれか記載のオリゴヌクレオチドを使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
［８］工程（１）が、合成されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む［７］記載の方法。
［９］工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、［７］記載の方法。
［１０］工程（２）において、
（ａ）配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
を使用して変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、［７］記載の方法。
［１１］試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）［１］から［６］いずれか記載のオリゴヌクレオチド、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬を含むキット。
［１２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片を増幅する試薬をさらに含む［１１］記載のキット。
［１３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ断片の増幅に使用されるプライマー対を含む［１２］のキット。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、スパイクタンパク質においてＮ５０１ＹまたはＥ４８４Ｋの変異を生じた変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、核酸増幅法を利用して短時間に検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
「本発明のオリゴヌクレオチド」
【0016】
本発明は、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質においてＮ５０１ＹまたはＥ４８４Ｋの変異を有する変異株ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供する。
本明細書において、Ｎ５０１Ｙ変異とは、ＧｅｎｅＢａｎｋにＮＣ＿０４５５１２．２のアクセッション番号で公開されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列（ＹＰ＿００９７２４３９０．１）中、５０１番目のアスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に置換されていることを指す。ここで、この変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のＮに対応するコドンであるＡＡＴがＴＡＴに変化していることに起因する、したがって、前記トリプレットの最初の塩基がＡからＴに変化している塩基配列を検出することにより、Ｎ５０１Ｙ変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、Ｎ５０１Ｙ変異とは、ＧｅｎｅＢａｎｋにＮＣ＿０４５５１２．２のアクセッション番号で公開されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列（ＹＰ＿００９７２４３９０．１）中、５０１番目のアスパラギン（Ｎ）がチロシン（Ｙ）に置換されていることを指す。ここで、この変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のＮに対応するコドンであるＡＡＴがＴＡＴに変化していることに起因する、したがって、前記トリプレットの最初の塩基がＡからＴに変化している塩基配列を検出することにより、Ｎ５０１Ｙ変異を有する変異株を検出することができる。
【0017】
また、Ｅ４８４Ｋ変異とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の上記スパイクタンパク質のアミノ酸配列中、４８４番目のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換されていることを指す。ここで、この変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のＥに対応するコドンであるＧＡＡがＡＡＡに変化していることに起因する、したがって、前記トリプレットの最初の塩基がＧからＡに変化している塩基配列を検出することにより、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異株を検出することができる。
【0018】
本発明の、Ｎ５０１Ｙ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出可能なオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域中の、Ｎ５０１位に該当するコドンがチロシンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号３５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては１５塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下である。
【0019】
また、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異株を検出可能なオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域中の、Ｅ４８４位に該当するコドンがリジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号３６に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては１３塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下である。
【0020】
当然のことながら、本発明のオリゴヌクレオチドは変異株のゲノムＲＮＡ由来の核酸と特異的にハイブリダイズする。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが、親株（野生型）のゲノムＲＮＡ由来の核酸とはハイブリダイズしない条件において変異株のゲノムＲＮＡ由来の核酸とハイブリダイズすることができ、変異株由来の核酸と親株由来の核酸とを区別することができることを意味する。
【0021】
本発明のオリゴヌクレオチドは、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸、例えば変異株のゲノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはその断片を検出するプローブとして使用することができる。したがって、変異株の検出に使用される検出方法に応じてオリゴヌクレオチドの鎖長や塩基配列、付加する標識を適宜選択することにより、効率よく変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出可能なプローブを設計することができる。
【0022】
標的核酸をプローブにより検出する技術としては、古典的なハイブリダイゼーション手法に加え、ＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等、種々の方法が知られている。ＴａｑＭａｎ法はＰＣＲによる核酸増幅と並行して標的核酸とハイブリダイズしたプローブを分解する方法であり、核酸増幅に５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする。サイクリングプローブ法に使用されるプローブは分子内にＲＮＡを含有しており、標的核酸とハイブリダイズした場合にはリボヌクレアーゼＨにより切断される。モレキュラービーコン法に使用されるプローブは分子内で二本鎖を形成しており、標的核酸とハイブリダイズすると分子内二本鎖構造が解消される。これらのプローブは、適切な標識を施すことにより、いずれも標識由来のシグナル（例えば蛍光）の発生を指標とした標的核酸の検出に使用することができる。
【0023】
以下、ＴａｑＭａｎプローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドを例にとって説明する。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該方法に好適に使用でき、その配列や鎖長は適宜調整することができる。特に本発明を限定するものではないが、配列番号４、８、１２、１４、１６から選択される塩基配列を有する、Ｎ５０１Ｙ変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド、２４、２７、３０、３２、３４、３７、４４、４５、４６から選択される塩基配列を有する、Ｅ４８４Ｋ変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチドは、本発明の好適な態様である。さらに、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドの３’末端は、このオリゴデオキシヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を防止するための修飾を施されていてもよい。前記修飾としては、例えば蛍光物質や消光物質による標識が例示される。
【0024】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明を特に限定するものではないが、通常、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）で構成され、当業者に周知の方法で合成することができる。なお、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸とハイブリダイズする性質を失わない範囲で、本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ以外のヌクレオチド、例えばＲＮＡ、非天然型の塩基（例えばデオキシウリジン、イノシン、７－デアザグアノシン、７－デアザアデノシン等）を有するヌクレオチド、架橋構造を有するリボースを含むヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ；ＢＮＡ）を含んでいてもよい。ＢＮＡはリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間が架橋された構造を持つＲＮＡアナログで、２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ）、３’－ａｍｉｎｏ－２’，４’－ＢＮＡ等が知られている。ＤＮＡ以外のヌクレオチドの含量には特に限定はなく、ハイブリダイゼーションの安定性や特異性を考慮して適宜設定すればよい。例えば、全ヌクレオチドの半数程度までをこのようなヌクレオチドとすることができる。
【0025】
標的核酸（変異株ゲノムＲＮＡ由来の核酸）とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するため、本発明のオリゴヌクレオチドは適切な標識を付加されていてもよい。蛍光物質および消光物質の両方で、両者の間に適切な距離を保って標識されたオリゴヌクレオチドは、そのままでは蛍光を発することはないが、オリゴヌクレオチドの分解、切断等によって蛍光物質と消光物質の距離が増加すると蛍光が発せられるようになる。使用する蛍光物質、消光物質には特に限定はないが、蛍光物質としては６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、消光物質としてはＤＡＢＣＹＬ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（登録商標、ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）等が挙げられる。これらを適宜組み合わせて、二重標識された本発明のオリゴヌクレオチドを作製することができる。蛍光物質および消光物質を付加する位置は、両者が適切な距離を保つ限りにおいて特に限定はない。例えば、蛍光物質および消光物質は本発明のオリゴヌクレオチドの両端に付加してもよく、そのいずれか一方もしくは両方を末端以外の位置に付加してもよい。
【0026】
本発明のオリゴヌクレオチドには副溝結合剤（マイナー・グルーブ・バインダー：ＭＧＢ）が付加されていてもよい。ＭＧＢは二本鎖ＤＮＡの副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏＶｅ）に入り込む性質を有する物質であり、ＭＧＢが付加されたオリゴヌクレオチドは、ＭＧＢを付加されていない場合に比べ、相補的な配列を有する核酸との間で形成した二本鎖核酸のＴｍ値が上がる（例えば、特表平１１－５０４６２６）。ＭＧＢ修飾されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズする核酸の１塩基の違いによりＴｍ値により大きな差が生じることから、バックグラウンドを低減して標的核酸を検出することができる。一般的に、ＭＧＢは三日月型の三次元構造と約１５０～約２０００ダルトンの分子量を有する。ＭＧＢの例として、ネトロプシン、ジスタマイシン、ジスタマイシンＡ、レキシトロプシン、ミトラマイシン、クロモマイシンＡ３、オリボマイシン、アントラマイシン、シビロマイシン、ペンタミジン、スチルバミジン、ブレニル、ＣＣ－１０６５、ヘキスト３３２５８、４’－６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰ１）、ＣＤＰＩ３およびそれらの誘導体が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいてＭＧＢを付加する位置には特に限定はないが、例えば３’末端や５’末端が挙げられる。
【0027】
「本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出方法」
【0028】
本発明は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドを使用して試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供する。
【0029】
本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法は、スパイクタンパク質においてＮ５０１ＹまたはＥ４８４Ｋの変異を有する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法である。具体的には、試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたは相補的なＤＮＡの断片を合成し、次いでこれと本発明のオリゴヌクレオチドとを接触させる。変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むＤＮＡは本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするため、こうして試料中に変異株が存在するかどうかを判断することができる。
【0030】
なお、本発明の方法は、少なくともＮ５０１Ｙ変異またはＥ４８４Ｋ変異を有する変異株であれば、さらに他の変異が生じている変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であっても検出することが可能である。
【0031】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＲＮＡウイルスであり、ウイルス粒子はＲＮＡゲノムを保持している。ＲＮＡゲノムに相補的な配列を有するＤＮＡ、すなわちｃＤＮＡまたはその断片は、ゲノムＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により合成される。逆転写反応は逆転写酵素と適切なプライマーを含む、逆転写反応において一般的に使用される反応液を使用して実施することができる。この工程により合成されたｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片は当業者に周知の方法で二本鎖ＤＮＡに変換されてもよい。
【0032】
逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素またはその変異体、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素またはその変異体、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）またはその変異体が使用できるが、これらに限定されるものではない。前記の変異体としては、耐熱性の向上した変異体、ヌクレアーゼ活性（リボヌクレアーゼＨ活性等）が低下または消失した変異体等が例示される。
【0033】
逆転写反応に使用するプライマーはウイルスゲノム上の特定の配列に相補的なもの、ランダムな配列を持つもの、のいずれも本発明に使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、ウイルスゲノム上の、スパイクタンパク質をコードする領域に対応する、好ましくはＮ５０１またはＥ４８４のコドンを含む領域に対応するｃＤＮＡが合成されるように設計されたプライマーを好適に使用することができる。
【0034】
本発明の好適な態様においては、ウイルスの検出感度を向上させる観点から、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むｃＤＮＡ断片の増幅が実施される。当該工程に使用される核酸増幅法には限定はなく、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法をはじめとする公知の方法を使用することができる。前記の核酸増幅法は、ウイルスゲノムＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を鋳型として実施され、増幅産物として変異箇所を含む核酸（ＤＮＡ）断片を生成する。
【0035】
本発明の好適な態様においては、核酸増幅法としてＰＣＲ法が使用される。ＰＣＲ法は１以上のプライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを主な構成要素とする反応液を温度サイクル装置で処理する核酸検出技術として広く普及している。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼやそれらの変異体、好熱性古細菌由来のＰｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼやそれらの変異体が例示される。複数種のＤＮＡポリメラーゼを混合してＰＣＲを行うこともできる。ＰＣＲに適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
【0036】
ｃＤＮＡ断片の合成とその増幅は一連の反応で行うことができる。本発明を限定するものではないが、逆転写とＰＣＲを一つの反応容器中で実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲは本発明の方法に好適な態様である。ＲＴ－ＰＣＲ反応液は使用する酵素が異なるなど種々のものが知られており、また、キットの形態で市販されているものも多い。本発明の方法を１ステップのＲＴ－ＰＣＲで実施する場合、逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含むものを使用してもよく、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）を単独で含む反応液を使用してもよい。
【0037】
本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むｃＤＮＡ断片を増幅できる１対のプライマーを１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加することにより、その一方のプライマーはｃＤＮＡ合成のプライマーを兼ねることができる。本発明では、ＰＣＲに使用されるプライマーは、増幅することが望まれるｃＤＮＡ断片に対応するウイルスゲノムＲＮＡ上の領域において存在する可能性のある変異を考慮して設計される。特に本発明を限定するものではないが、Ｎ５０１Ｙ変異を有する変異株の検出には配列番号１、５、９、１７、１９から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号２、６、１０、１８、２０から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異株の検出には配列番号２１、２８、９、１７から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号２２、２５、６、１０、１８から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、それぞれ好適である。
【0038】
さらに、適切に修飾した本発明のオリゴヌクレオチドを共存させてＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、標的核酸、すなわち変異株のゲノム由来のｃＤＮＡ断片をＤＮＡの増幅と並行して検出することができる。前記のＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等に適したデザインとした本発明のオリゴヌクレオチドを作製し、かつ反応液組成を検出手段に適したものとすることにより、経時的、光学的に標的核酸の増幅をモニターする定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施することができる。
【0039】
本発明の好適な態様では、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をリアルタイムに検出する方法が提供される。当該方法では、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（もしくは逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、少なくとも１つのプライマー対、ｄＮＴＰ、蛍光物質および消光物質で標識された本発明のオリゴヌクレオチドならびにＲＴ－ＰＣＲに必要なその他の成分を含む反応液が調製され、さらに試料が添加される。この反応液は逆転写反応に適した温度で保温された後、そのまま温度サイクル反応に移行してｃＤＮＡ断片が増幅される。温度サイクル反応中にｃＤＮＡ断片の増幅量に応じた蛍光が反応液より発せられるため、それを指標として試料中に変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在することが確認できる。
【0040】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有している複数の変異を１回のＲＴ－ＰＣＲで検出することができる。このような反応系（マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ）は当業者に周知である。検出しようとする変異に対応する本発明のオリゴヌクレオチドのそれぞれを極大蛍光波長が異なる蛍光物質で標識しておくことにより、反応液が発する蛍光の波長に基づいて、試料中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に生じている変異の種類を知ることができる。Ｎ５０１Ｙ変異検出用オリゴヌクレオチドとＥ４８４Ｋ変異検出用オリゴヌクレオチドの両方を含むＲＴ－ＰＣＲ反応液を使用した場合、試料中のＮ５０１Ｙ変異を有する変異株、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異株、ならびにＮ５０１Ｙ変異とＥ４８４Ｋ変異の両方を有する変異株を一度に検出することができる。下記実施例に示されるように、Ｎ５０１Ｙ変異検出用、Ｅ４８４変異検出用の２種類のプローブを含む複数のプローブを含むＲＴ－ＰＣＲ反応液は、一度の反応で前記の２つの変異を検出することが可能である。さらに、Ｎ５０１Ｙ変異またはＥ４８４Ｋ変異とそれ以外の変異を検出するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ系、Ｎ５０１Ｙ変異およびＥ４８４Ｋ変異に加えてそれ以外の変異を検出するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ系、等も本発明により提供される。
【0041】
マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲによる本発明の検出方法は、複数の本発明のオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドに対応する変異位置を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム由来のｃＤＮＡ断片を生成、増幅するための逆転写用プライマーおよび増幅用プライマー対、を含む反応液を使用して実施される。逆転写用プライマーと増幅用プライマー対の組合せは検出しようとする変異ごとに複数の組合せが使用されてもよく、複数の変異箇所を含むｃＤＮＡ断片を生成・増幅することができる１種の組合せであってもよい。前記のとおり、逆転写用プライマーは増幅用プライマー対の一方が兼ねていてもよい。
【0042】
ＰＣＲを利用する本発明の検出方法においては、試料中のＰＣＲ阻害物質等の影響を調べるため、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に存在する、検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子など）由来の核酸であってもよい。試料中に存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマー対と検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料にあらかじめ添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ塩基配列を有する核酸あるいはこれらとは異なる塩基配列の核酸であってもよい。人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、その塩基配列に応じて、標的核酸及び非標的核酸の増幅に使用されるプライマー対を使用して増幅してもよく、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なるプライマーセットを使用してもよい。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
【0043】
さらに、本発明の検出方法はＰＣＲに有用な公知の成分を含む反応液を使用して実施してもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質（ウシ血清アルブミン、ゼラチン等）、両性物質（ベタイン等）、酸性高分子物質、ＰＣＮＡ等が挙げられる。
【0044】
１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応、ＰＣＲの条件（反応温度、保持時間、熱サイクルの回数等）は適宜設定すればよい。例えば、市販のＲＴ－ＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット等）で推奨されている条件や、それを改変した条件で反応を実施してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列や鎖長、使用するプライマーの塩基配列や鎖長を考慮して反応条件を設定すべきことは、当業者には周知である。
【0045】
並行して複数のＰＣＲ試験を実施する場合、反応後に生成した増幅ＤＮＡ断片が反応前の他の反応液へ混入すると誤った試験結果を生み出す。このような反応液の汚染を防止する方法が知られている。鎖中にウラシル（Ｕ）が取り込まれているＤＮＡにウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を作用させると、このＤＮＡはウラシルの位置で切断される。ｄＵＴＰと易熱性のＵＮＧを含有するＰＣＲ反応液を用いて増幅されたＤＮＡ断片はウラシルを含有することとなる。この増幅ＤＮＡ断片が反応実施前の他の反応液（ｄＵＴＰと易熱性ＵＮＧを含有する反応液）に混入した場合には、反応開始前に反応液をＵＮＧの作用する温度に保温することで、混入ＤＮＡを分解して鋳型としての機能を失わせることができる。続いて行われるＰＣＲの温度サイクルでＵＮＧは失活するため、増幅時にはＵを取り込んだＤＮＡの分解は起こらない。本発明の検出方法においても、ｄＵＴＰと易熱性のＵＮＧを含む反応液を使用して相互汚染を防ぐことができる。
【0046】
本発明の方法が適用される試料には特に限定はない。変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在していると疑われるすべての試料、例えば生体由来試料が本発明の方法の対象となる。前記の生体由来試料は特に限定はされないが、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、各種の体液（唾液、血液、脳脊髄液、汗）、組織、尿または便懸濁液が例示される。また前記試料以外にもＲＮＡウイルスの存在が疑われる環境由来試料として、環境水（海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等）、スワブなどによる物体表面の拭取り操作で得られた採取物や空気中からの捕集物の懸濁液が挙げられる。これら試料はそのまま本発明の方法に供してもよいが、簡易的な処理（熱処理、希釈、濃縮、不溶物除去、可溶化処理、細胞溶解処理、夾雑タンパク質の変性または分解等）あるいは核酸の精製を行った後に使用することもできる。処理の方法は、試料中に含まれる核酸量や夾雑物の性質および量を考慮して選択される。前記の試料は、それぞれを個別に本発明の検出方法に供してもよく、複数の試料を混合したうえで本発明の検出方法に供してもよい。
【0047】
「本発明のキット」
【0048】
本発明は、本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法に使用されるキットを提供する。
【0049】
本発明のキットは、前記の本発明のオリゴヌクレオチドと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡを合成するための試薬を含むことを特徴とする。
【0050】
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡを合成するための試薬」としては、逆転写酵素とｃＤＮＡ合成用プライマーが挙げられる。さらに、逆転写反応液の調製に使用されるその他の成分（例えば緩衝成分、２価金属塩、ｄＮＴＰ等）を含んでいてもよい。これらはそれぞれ、本発明の検出方法において説明されたものを使用することができる。
【0051】
さらに、本発明のキットはｃＤＮＡを増幅するための試薬を含むことができる。特に本発明を限定するものではないが、例えばＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅するための試薬、すなわち耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスゲノム上の、スパイクタンパク質をコードする領域相当するｃＤＮＡを増幅できるように設計されたプライマー対、ＰＣＲ用の反応液を調製するための各種の成分を含むことができる。
【0052】
本発明の好適な態様においては、１ステップのＲＴ－ＰＣＲによってウイルスゲノムからのｃＤＮＡ断片の合成、ｃＤＮＡ断片の増幅、標的核酸の検出、を一つの反応容器で実施するための各種試薬を含むキットが提供される。当該キットは、標的核酸を光学的に検出できるよう設計、標識された本発明のオリゴヌクレオチド、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（もしくは逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、少なくとも１対のプライマー、ＲＴ－ＰＣＲ用の反応液を調製するための各種成分（緩衝成分、２価金属塩、ｄＮＴＰ、等）を含む。さらに、複数種の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットや、本発明のオリゴヌクレオチドと他の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドとを含むキットとしてもよい。本発明の一つの態様としては、Ｎ５０１Ｙ変異とＥ４８４Ｋ変異の両方を検出可能なマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ用のキットが例示される。
【0053】
前記の各種成分は、それぞれ別の容器に収納され、用時にＲＴ－ＰＣＲ用の反応液を調製するように構成されていてもよく、複数の成分からなる混合物としてキットに含まれていてもよい。試料以外の反応に必要な成分のすべてを含み、適切に処理および／または希釈した試料と混合するだけで反応液を調製できるプレミックス形態の試薬を含むキットも本発明に包含される。さらに、本発明のキットは、試料の処理や試料からの核酸精製に使用される試薬や器具、反応阻害物質の存在を判断するための指標となる陽性対照と陽性対照増幅・検出用のプライマー、プローブ等を含んでもよい。
【0054】
本発明のキットはＰＣＲに有用な公知の成分を含んでいてもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質（ウシ血清アルブミン、ゼラチン等）、両性物質（ベタイン等）、酸性高分子物質、ＰＣＮＡ等が挙げられる。
【0055】
以下に本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例0056】
実施例１
Ｎ５０１Ｙ変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるＮ５０１Ｙ変異株の検出について検討した。まず、表２に記載したフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の２種）で構成される＃１～８のセットをそれぞれ構築した。プローブの３’末端にはＭＧＢを付加するとともに、その５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。
Ｎ５０１Ｙ変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるＮ５０１Ｙ変異株の検出について検討した。まず、表２に記載したフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の２種）で構成される＃１～８のセットをそれぞれ構築した。プローブの３’末端にはＭＧＢを付加するとともに、その５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。
【0057】
また試験用の検体として、野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの配列を有する合成一本鎖ＲＮＡ（製品名 Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２ （ＭＮ９０８９４７．３）、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と、変異型（Ｎ５０１Ｙ変異及びＥ４８４Ｋ変異を含む）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの配列を有する合成一本鎖ＲＮＡ（製品名 Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ １６ （Ｂ．１．３５１，ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿６７８５９７）、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用意した。この二つの合成ＲＮＡを本明細書中ではそれぞれ野生型ＲＮＡ、変異型ＲＮＡと記載する。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
【0058】
【表2】
【0059】
１．ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに終濃度が５０００コピー／μｌとなるように野生型ＲＮＡと変異型ＲＮＡをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品＃ＲＣ３００Ａ）のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液１μｌと酵素・基質等を含むＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １５μｌ、フォワードプライマー（最終濃度０．２μＭ）及びリバースプライマー（最終濃度０．２μＭ）、プローブ（最終濃度０．２μＭ；野生型ＲＮＡ検出用または変異型ＲＮＡ検出用のいずれか）を混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏで、最終容量３０μｌの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。キットに付属する試薬Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａは未精製試料前処理試薬のため本試験では使用しなかった。
【0060】
２．表１記載の各セットで調製した反応液を作製し、実験精度を高めるため２連で試験を実施した。
【0061】
サーマルサイクラーは、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩＩ（Ｃｙ５） ｗｉｔｈ ＰＣ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ条件は、５２℃５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。その結果を表３及び図１（各反応の増幅曲線）に示した。
【0062】
【表3】
【0063】
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特にセット＃２及び＃５の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｎ５０１における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特にセット＃２及び＃５の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｎ５０１における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
【0064】
実施例２
Ｅ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブ
実施例１と同様に５セットのプライマー・プローブ、＃９、＃１０，＃１１、＃１２、＃１３を合成し、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異型ＲＮＡ検出について試験を行った。このうち、他のセットに比べて良好な性能を有すると判断された＃１０、＃１１、＃１２のセットに含まれるプライマー・プローブの組み合わせを変更し、新たに＃１４、＃１５のプライマー・プローブセットを構築した。この２つのセットについて実施例１同様の操作で反応確認を行った。以上の試験に使用されたプライマー・プローブセットに含まれるフォワードプライマー、リバースプライマー、３’末端ＭＧＢ標識プローブの塩基配列を表４に示した。なお、両セットに含まれる、野生型ＲＮＡ検出用プローブは５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識し、野生型ＲＮＡ検出用プローブは５’末端をＶＩＣ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。試験検体としては、野生型ＲＮＡと変異型ＲＮＡには実施例１と同じＲＮＡを使用し、それぞれＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに終濃度が５０００コピー／μｌ、５００コピー／μｌ、５０コピー／μｌ、となるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
Ｅ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブ
実施例１と同様に５セットのプライマー・プローブ、＃９、＃１０，＃１１、＃１２、＃１３を合成し、Ｅ４８４Ｋ変異を有する変異型ＲＮＡ検出について試験を行った。このうち、他のセットに比べて良好な性能を有すると判断された＃１０、＃１１、＃１２のセットに含まれるプライマー・プローブの組み合わせを変更し、新たに＃１４、＃１５のプライマー・プローブセットを構築した。この２つのセットについて実施例１同様の操作で反応確認を行った。以上の試験に使用されたプライマー・プローブセットに含まれるフォワードプライマー、リバースプライマー、３’末端ＭＧＢ標識プローブの塩基配列を表４に示した。なお、両セットに含まれる、野生型ＲＮＡ検出用プローブは５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識し、野生型ＲＮＡ検出用プローブは５’末端をＶＩＣ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。試験検体としては、野生型ＲＮＡと変異型ＲＮＡには実施例１と同じＲＮＡを使用し、それぞれＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに終濃度が５０００コピー／μｌ、５００コピー／μｌ、５０コピー／μｌ、となるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
【0065】
【表4】
【0066】
実施例１と同様に、各検体を含有する１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。また、サーマルサイクラーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５２℃ ５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。その結果を表５及び図２（各反応の増幅曲線）に示した。
【0067】
【表5】
【0068】
結果
検討の結果、両方のセットにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に＃１５の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｅ４８４Ｋにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、両方のセットにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に＃１５の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｅ４８４Ｋにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
【0069】
実施例３
ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）技術を用いたＥ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブによる検出を検討した。まず、表６に示されるフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の２種）で構成される＃１６、＃１７、＃１８、＃１９、＃２０、＃２１、＃２２のセットをそれぞれ構築した。またプローブの一部のヌクレオチドをＬＮＡに置き換えた。野生型を検出するためのプローブはその５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。変異型を検出するためのプローブはその５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識した。
ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）技術を用いたＥ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブによる検出を検討した。まず、表６に示されるフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用の２種）で構成される＃１６、＃１７、＃１８、＃１９、＃２０、＃２１、＃２２のセットをそれぞれ構築した。またプローブの一部のヌクレオチドをＬＮＡに置き換えた。野生型を検出するためのプローブはその５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。変異型を検出するためのプローブはその５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識した。
【0070】
また試験用の検体及び試薬は実施例１と同様に用意した。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
【0071】
【表6】
【0072】
実施例２と同様に、各検体を含有する１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。また、サーマルサイクラーは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ５ リアタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５２℃ ５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。その結果を表７、表８及び図３、図４（各反応の増幅曲線）に示した。
【0073】
【表7】
【0074】
【表8】
【0075】
結果
検討の結果、すべてのセットにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に＃１８の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｅ４８４Ｋにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべてのセットにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に＃１８の反応は野生型ＲＮＡ検出、変異型ＲＮＡ検出ともにＣｔ値は小さく、ＳＮ比は高く、Ｅ４８４Ｋにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
【0076】
実施例４
Ｎ５０１Ｙ変異検出用プライマー・プローブとＥ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブによるマルチプレックスＰＣＲ検出を検討した。まず、表９、表１０に示されるフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、野生型）で構成される＃２２、＃２３、＃２４、＃２５のセットをそれぞれ構築した。すべてのセットはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡを検出するためのプライマー・プローブセットであるＮ１、Ｎ２、ならびにＮ５０１、Ｅ４８４に対応する領域を含むｃＤＮＡを合成、増幅するためのプライマー対である配列番号３、２１のオリゴヌクレオチドを含む。また、Ｅ４８４Ｋ変異型を検出するためのプローブの５’末端はＣｙ５、３’末端はＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識し、いくつかのプローブについてはその一部のヌクレオチドをＬＮＡに置き換えた。Ｎ５０１Ｙ変異型を検出するためのプローブはその５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識し，さらに３’末端にＭＧＢを付加した。Ｎ１、Ｎ２を検出すためのプローブは５’末端をＨＥＸ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。
Ｎ５０１Ｙ変異検出用プライマー・プローブとＥ４８４Ｋ変異株検出用プライマー・プローブによるマルチプレックスＰＣＲ検出を検討した。まず、表９、表１０に示されるフォワードプライマー（名称中にＦを含むもの）、リバースプライマー（名称中にＲを含むもの）、プローブ（野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用、野生型）で構成される＃２２、＃２３、＃２４、＃２５のセットをそれぞれ構築した。すべてのセットはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡを検出するためのプライマー・プローブセットであるＮ１、Ｎ２、ならびにＮ５０１、Ｅ４８４に対応する領域を含むｃＤＮＡを合成、増幅するためのプライマー対である配列番号３、２１のオリゴヌクレオチドを含む。また、Ｅ４８４Ｋ変異型を検出するためのプローブの５’末端はＣｙ５、３’末端はＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識し、いくつかのプローブについてはその一部のヌクレオチドをＬＮＡに置き換えた。Ｎ５０１Ｙ変異型を検出するためのプローブはその５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識し，さらに３’末端にＭＧＢを付加した。Ｎ１、Ｎ２を検出すためのプローブは５’末端をＨＥＸ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。
【0077】
野生型ＲＮＡと変異型ＲＮＡの両方が終濃度５０００コピー／μｌ、５００コピー／μｌ、５０コピー／μｌ、で含まれる系列希釈液をＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用いて調製し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品＃ＲＣ３００Ａ）のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液１μｌと酵素・基質等を含むＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １５μｌ、最終濃度０．２μＭの各プライマー、最終濃度０．２μＭの各プローブを混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏで、最終容量３０μｌの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。キットに付属する試薬Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａは未精製試料前処理試薬のため本試験では使用しなかった。
【0078】
こうして調製された反応液を１ステップＲＴ－ＰＣＲに供した。サーマルサイクラーは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）５ リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。反応条件は、５２℃ ５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、５８℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。その結果を表１１及び図５（各反応の増幅曲線）に示した。
【0079】
【表9】
【0080】
【表10】
【0081】
【表11】
【0082】
表９、表１０、表１１、図５に示されるように、すべてのセットで野生型、Ｎ５０１Ｙ変異型、Ｅ４８４Ｋ変異型のＲＮＡが検出された。セットごとのＣｔ値には大きな差異は見られず、またＳＮ比も高いことから、いずれのセットも変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0083】
本発明の変異型遺伝子を特異的に増幅し、高感度に検出することができる技術を用いて変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが出来る。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0084】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１：Ｎ５０１Ｙ＿１ＦＶ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２：Ｎ５０１Ｙ＿１Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：Ｎ５０１－１ｃ－ＭＧＢ （ＷＴ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４：５０１Ｙ－１ｃ－ＭＧＢ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｆ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｒ１－Ｅ４８４Ｋ－３Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｆ２－Ｅ４８４Ｋ－４Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｒ２－２－Ｅ４８４Ｋ－４Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ３ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ４ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｆ１－Ｅ４８４Ｋ－５Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｒ１－Ｅ４８４Ｋ－５Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｆ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｒ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１：Ｅ４８４Ｋ－１Ｆ－Ｅ４８４Ｋ－２Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２：Ｅ４８４Ｋ－１Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５：Ｅ４８４Ｋ－２Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２６：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８：Ｅ４８４Ｋ－３Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３０：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３３：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３４：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ＿１２＿ＢＡＳＥ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３６：Ｅ４８４Ｋ－ＭＧＢ－Ｐ＿１３＿ＢＡＳＥ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７：ＴＢＤ－ＬＮＡ－ｍｕｔ－４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３８：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ１（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３９：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ２（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ３（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４１：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ４（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ５（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ６（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４：Ｅ４８４Ｋ＿ＭＧＢ＿３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５：Ｅ４８４Ｋ（ｍｕｔ）＿ＬＮＡ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６：ＴＢＤ－ＬＮＡ－ｍｕｔ－３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４７：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４９：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｐ＿ＨＥＸ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５０：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５１：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５２：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｐ＿ＨＥＸ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２：Ｎ５０１Ｙ＿１Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：Ｎ５０１－１ｃ－ＭＧＢ （ＷＴ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４：５０１Ｙ－１ｃ－ＭＧＢ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｆ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｒ１－Ｅ４８４Ｋ－３Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｆ２－Ｅ４８４Ｋ－４Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｒ２－２－Ｅ４８４Ｋ－４Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ３ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｗｉｌｄ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ－ｍｕｔ４ （ＦＡＭ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｆ１－Ｅ４８４Ｋ－５Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｒ１－Ｅ４８４Ｋ－５Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｆ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０：ＪＰ－ＭＧＢ－Ｒ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１：Ｅ４８４Ｋ－１Ｆ－Ｅ４８４Ｋ－２Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２：Ｅ４８４Ｋ－１Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５：Ｅ４８４Ｋ－２Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２６：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８：Ｅ４８４Ｋ－３Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３０：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３３：Ｅ４８４＿ＦＡＭ－ＭＧＢ５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３４：４８４Ｋ＿ＶＩＣ－ＭＧＢ５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３５：Ｎ５０１Ｙ－ＭＧＢ－Ｐ＿１２＿ＢＡＳＥ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３６：Ｅ４８４Ｋ－ＭＧＢ－Ｐ＿１３＿ＢＡＳＥ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７：ＴＢＤ－ＬＮＡ－ｍｕｔ－４
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３８：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ１（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３９：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ２（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ３（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４１：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ４（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ５（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３：Ｅ４８４Ｋ－ＬＮＡ－Ｗ６（ＴＢＤ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４：Ｅ４８４Ｋ＿ＭＧＢ＿３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５：Ｅ４８４Ｋ（ｍｕｔ）＿ＬＮＡ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６：ＴＢＤ－ＬＮＡ－ｍｕｔ－３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４７：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４９：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ１－Ｐ＿ＨＥＸ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５０：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｆ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５１：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５２：２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ２－Ｐ＿ＨＥＸ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】