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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024102716
(43)【公開日】2024-07-31
(54)【発明の名称】ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20240724BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240724BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240724BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240724BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12N15/10 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023006792
(22)【出願日】2023-01-19
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(71)【出願人】
【識別番号】317006683
【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】相澤 康則
(72)【発明者】
【氏名】金子 真也
(72)【発明者】
【氏名】倉澤 光
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA15X
4B065AA15Y
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、簡便に大量のウイルスのゲノムＤＮＡを製造する方法を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明の（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明の（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法によって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び
（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、
を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法。
（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、
を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法。
【請求項2】
前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、請求項１に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法。
【請求項3】
前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製される、請求項１又は２に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法。
【請求項4】
前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、請求項１又は２に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法。
【請求項5】
ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを含む枯草菌。
【請求項6】
前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、請求項５に記載の枯草菌。
【請求項7】
前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製された、請求項５又は６に記載の枯草菌。
【請求項8】
前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、請求項５又は６に記載の枯草菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法に関する。本発明によれば、大量のウイルスゲノムを容易に取得することができる。
【背景技術】
【0002】
ウイルスには、ヒト及び動物などの疾患を引き起こすものがあり、世界中でそれらのウイルスの研究が進められている。例えばコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などはヒトの呼吸器に感染し、肺炎などを引き起こし、致死的な経過をたどることもある。従って、コロナウイルスの感染機構の解明及び感染対策の研究が全世界で進められている。（非特許文献１及び２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」２０２０（英国）第５８２巻、ｐ５６１－５６５
【非特許文献2】「セル・リポーツ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ）」２０２１（米国）Ａｐｒｉｌ；ｐ２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ウイルスの感染機構の解明及び感染対策の研究のためには、ウイルスゲノムを用いた研究が必要である。本発明者らは、大腸菌に対する形質転換法を用いて、例えばコロナウイルスのＤＮＡ断片の取得を行った。しかしながら、大腸菌では、得られるＤＮＡに変異が入りやすく、更に大腸菌の生育が悪く、大量のＤＮＡを取得することが困難であった。
従って、本発明の目的は、簡便に大量のウイルスのゲノムＤＮＡを製造する方法を提供することである。
従って、本発明の目的は、簡便に大量のウイルスのゲノムＤＮＡを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、簡便に大量のウイルスのゲノムＤＮＡを製造する方法ついて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、枯草菌を用いることにより、クローン化した変異のない安定なウイルスゲノムを大量に取得できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［２］前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、［１］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［３］前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製される、［１］又は［２］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［４］前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、［１］又は［２］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［５］ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを含む枯草菌、
［６］前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、［５］に記載の枯草菌、
［７］前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製された、［５］又は［６］に記載の枯草菌、及び
［８］前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、［５］又は［６］に記載の枯草菌、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、を含む、ウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［２］前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、［１］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［３］前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製される、［１］又は［２］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［４］前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、［１］又は［２］に記載のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、
［５］ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを含む枯草菌、
［６］前記ウイルスがオルトコロナウイルス亜科に属するアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスである、［５］に記載の枯草菌、
［７］前記ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作製された、［５］又は［６］に記載の枯草菌、及び
［８］前記ベクターが、Θ型複製起点を有し、枯草菌で複製できるプラスミドである、［５］又は［６］に記載の枯草菌、
に関する。
【発明の効果】
【0006】
本発明のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法によれば、クローン化し変異のない安定なウイルスゲノムＤＮＡを容易に、かつ大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ギャップ・リペアー・クローニング法によるコロナウイルスゲノムＤＮＡの作製を模式的に示した図である。
【図2】ギャップ・リペアー・クローニング法に用いる、フラグメント１+、フラグメント２+、フラグメント３+、フラグメントＤ+、フラグメント４+、フラグメント５+、フラグメント６+、フラグメント７+、フラグメント８+、フラグメント９+、及びフラグメント１０+の構築方法を示した図である。
【図3】複数のDNA断片を出芽酵母で繋ぎ合わせて作成して得られたコロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを、直接出芽酵母から回収した結果を示す図である。
【図4】複数のDNA断片を出芽酵母で繋ぎ合わせて作成して得られたコロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを、大腸菌から回収した結果を示す図である。
【図5】コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターの大腸菌又は枯草菌から大量精製を比較した図である。
【図6】本発明の製造方法に用いるシャトルベクターの構造を示した図である。
【図7】コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターの大腸菌又は枯草菌から大量精製を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明のウイルスゲノムＤＮＡの製造方法は、（ａ）ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する工程、及び（ｂ）前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する工程、を含む。また、本発明の枯草菌は、ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを含む。
【0009】
《ウイルスゲノムＤＮＡ》
本発明に用いられるウイルスゲノムＤＮＡは、ウイルスゲノムの全長のゲノムＤＮＡ、又はウイルスゲノムのＤＮＡ断片を含む限りにおいて、特に限定されるものではない。
ウイルスゲノムＤＮＡ（例えば、コロナウイルスゲノムＤＮＡ及びその断片）を含むベクターは、実施例に示すように大腸菌に導入することによって、容易に変異が起こる。また、ウイルスゲノムＤＮＡ（例えば、１０００ｂｐ以上のコロナウイルスゲノムＤＮＡ）を含むベクターは、大腸菌に導入することによって、大腸菌の生育を阻害し、従ってベクターを回収することが困難である。
本発明に用いられるウイルスゲノムＤＮＡは、ウイルスゲノムの全長のゲノムＤＮＡ、又はウイルスゲノムのＤＮＡ断片を含む限りにおいて、特に限定されるものではない。
ウイルスゲノムＤＮＡ（例えば、コロナウイルスゲノムＤＮＡ及びその断片）を含むベクターは、実施例に示すように大腸菌に導入することによって、容易に変異が起こる。また、ウイルスゲノムＤＮＡ（例えば、１０００ｂｐ以上のコロナウイルスゲノムＤＮＡ）を含むベクターは、大腸菌に導入することによって、大腸菌の生育を阻害し、従ってベクターを回収することが困難である。
【0010】
ウイルスとしては、ＤＮＡウイルスであってよく、ＲＮＡウイルスであってもよい。
ｄｓＤＮＡウイルスとしては、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、アロヘルペスウイルス科（Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、マラコヘルペスウイルス科（Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、アムプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、アスコウイルス科（Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、アスファウイルス科（Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、ヒトロサウイルス科（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、マルセイユウイルス科（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ）、ミミウイルス科（Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、ニマウイルス科（Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）、パンドラウイルス科（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、スファエロリポウイルス科（Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
ｄｓＤＮＡウイルスとしては、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、アロヘルペスウイルス科（Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、マラコヘルペスウイルス科（Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、アムプラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、アスコウイルス科（Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、アスファウイルス科（Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、ヒトロサウイルス科（Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、マルセイユウイルス科（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ）、ミミウイルス科（Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、ニマウイルス科（Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）、パンドラウイルス科（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、スファエロリポウイルス科（Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
【0011】
ｓｓＤＮＡウイルスとしては、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、バシラリオドナウイルス科（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ビドナウイルス科（Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ナノウイルス科（Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びスピラウイルス科（Ｓｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
【0012】
ｄｓＲＮＡウイルスとしては、ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、クリソウイルス科（Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、エンドルナウイルス科（Ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ハイポウイルス科（Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ）、メガビルナウイルス科（Ｍｅｇａｖｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パルティティウイルス科（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコビルナウイルス科（Ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ロタウイルス科（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）及びトティウイルス科（Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
【0013】
プラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスとしては、アルファフレキシウイルス科（Ａｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、アルファテトラウイルス科（Ａｌｐｈａｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、アルベルナウイルス科（Ａｌｖｅｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バルナウイルス科（Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ベータフレキシウイルス科（Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、プロモウイルス科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、カリチウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、カルモテトラウイルス科（Ｃａｒｍｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、クロステロウイルス科（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ジシストロウイルス科（Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ガンマフレキシウイルス科（Ｇａｍｍａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、イフラウイルス科（Ｉｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）、レヴィウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ルテオウイルス科（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、マルナウイルス科（Ｍａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、メソニウイルス科（Ｍｅｓｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、ナルナウイルス科（Ｎａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ノダウイルス科（Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）、ペルムトテトラウイルス科（Ｐｅｒｍｕｔｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポチウイルス科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、ロニウイルス科（Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、セコウイルス科（Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、トンブスウイルス科（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）、ティモウイルス科（Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びビルガウイルス科（Ｖｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
【0014】
マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルスとしては、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニアミウイルス科（Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、オフィオウイルス科（Ｏｐｈｉｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びオルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスが挙げられる。
【0015】
（コロナウイルス）
コロナウイルスは、ニドウイルス目のコロナウイルス科に属するウイルスである。コロナウイルス科は、コロナウイルス亜科及びトロウイルス亜科に分類されるが、本明細書において、「コロナウイルス」は、コロナウイルス科に含まれるウイルスを意味する。
また、コロナウイルスは、遺伝子的にアルファ（α）コロナウイルス、ベータ（β）コロナウイルス、ガンマ（γ）コロナウイルス、及びデルタ（δ）コロナウイルスに分類される。アルファ（α）コロナウイルスとしては、例えば猫コロナウイルス（猫伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ））、犬コロナウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、又はヒトコロナウイルスＮＬ６３が挙げられる。ベータ（β）コロナウイルスとしては、例えばヒトコロナウイルスＭＡＲＳ－ＣｏＶ、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、牛コロナウイルス、馬コロナウイルス、又はマウスコロナウイルス（マウス肝炎ウイルス）が挙げられる。ガンマ（γ）コロナウイルスとしては、例えば鳥コロナウイルス（鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、七面鳥コロナウイルスなど）、又はシロナガスクジラウイルスが挙げられる。
コロナウイルスは、ニドウイルス目のコロナウイルス科に属するウイルスである。コロナウイルス科は、コロナウイルス亜科及びトロウイルス亜科に分類されるが、本明細書において、「コロナウイルス」は、コロナウイルス科に含まれるウイルスを意味する。
また、コロナウイルスは、遺伝子的にアルファ（α）コロナウイルス、ベータ（β）コロナウイルス、ガンマ（γ）コロナウイルス、及びデルタ（δ）コロナウイルスに分類される。アルファ（α）コロナウイルスとしては、例えば猫コロナウイルス（猫伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ））、犬コロナウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、又はヒトコロナウイルスＮＬ６３が挙げられる。ベータ（β）コロナウイルスとしては、例えばヒトコロナウイルスＭＡＲＳ－ＣｏＶ、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、牛コロナウイルス、馬コロナウイルス、又はマウスコロナウイルス（マウス肝炎ウイルス）が挙げられる。ガンマ（γ）コロナウイルスとしては、例えば鳥コロナウイルス（鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、七面鳥コロナウイルスなど）、又はシロナガスクジラウイルスが挙げられる。
【0016】
コロナウイルスゲノムは、図２に示すように、約３０ｋｂの遺伝子であり、５´ＵＴＲから２つのオープンリーディングフレーム（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において、ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂ）を有し、その後ろにＳタンパク質、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質、及びＮタンパク質などをコードする遺伝子が存在する。ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂには、非構造タンパク質がコードされており、長いポリプロテインとして翻訳され、ウイルス由来のプロテアーゼなどでｎｓｐ１～ｎｓｐ１６の非構造タンパク質に切断される。ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂの後ろのゲノム遺伝子から、複数のｎｅｓｔｅｄ構造のサブジェノミックｍＲＮＡが作成され、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質、及びＮタンパク質などの構造タンパク質が翻訳される。
【0017】
《枯草菌》
本発明に用いる枯草菌は、本分野で使用される枯草菌である限りにおいて、特に限定せずに使用することができる。具体的には、１６８ＴｒｐＣ２株、ＲＭ１２５株、ＲＭ１２５（ＲｅｃＡα）株、ＭＴ－２株、ＢＵＳＹ９７９７株、ＢＥＳＴ３１０株、ＢＥＳＴ７００３株など、が挙げられる。なお、ＲＭ１２５株は、１６８ＴｒｐＣ２系統株で制限修飾系酵素の欠損株である。また、ＲＭ１２５（ＲｅｃＡα）株は、ＲＭ１２５由来の枯草菌であり、ゲノム中の相同組換え酵素のＲｅｃＡがキシロース誘導型プロモーターを有したＲｅｃＡに置き換えた株である。キシロースの誘導によってＲｅｃＡが発現し、相同組み換えが起きる。
本発明に用いる枯草菌は、本分野で使用される枯草菌である限りにおいて、特に限定せずに使用することができる。具体的には、１６８ＴｒｐＣ２株、ＲＭ１２５株、ＲＭ１２５（ＲｅｃＡα）株、ＭＴ－２株、ＢＵＳＹ９７９７株、ＢＥＳＴ３１０株、ＢＥＳＴ７００３株など、が挙げられる。なお、ＲＭ１２５株は、１６８ＴｒｐＣ２系統株で制限修飾系酵素の欠損株である。また、ＲＭ１２５（ＲｅｃＡα）株は、ＲＭ１２５由来の枯草菌であり、ゲノム中の相同組換え酵素のＲｅｃＡがキシロース誘導型プロモーターを有したＲｅｃＡに置き換えた株である。キシロースの誘導によってＲｅｃＡが発現し、相同組み換えが起きる。
【0018】
《ベクター》
本発明に用いるベクターは、枯草菌で複製できるベクターである限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばｐＹＥＢ１０１、ｐＨＴ２５３ベクター、ｐＨＴ２５５ベクター、ｐＨＴ０１ベクター、ｐＨＴ８ベクター、ｐＨＴ０９ベクター、ｐＨＴ１０ベクター、又はｐＨＴ４３ベクター、が挙げられる。
また、本発明に用いるベクターは、好ましくは、Θ型複製起点を有する枯草菌で複製できるベクターである。この複製様式を有することにより枯草菌において、効率的にベクターを複製することができる。ｒｅｐＡは、特に限定されるものではないが、例えばサーモフィリック・バシリ由来(配列番号１３)で表されるｒｅｐＡが挙げられる。また、配列番号１３で表されるｒｅｐＡと９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上）の塩基配列を有し、且つｒｅｐＡを含まないオリジナルのベクターと比較して枯草菌における複製効率を増加させることができるｒｅｐＡでもよい。
複製効率の増加は、例えば、コロニー数の増加、又は回収ベクターＤＮＡの増加などで、確認することができる。
本発明に用いるベクターは、枯草菌で複製できるベクターである限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばｐＹＥＢ１０１、ｐＨＴ２５３ベクター、ｐＨＴ２５５ベクター、ｐＨＴ０１ベクター、ｐＨＴ８ベクター、ｐＨＴ０９ベクター、ｐＨＴ１０ベクター、又はｐＨＴ４３ベクター、が挙げられる。
また、本発明に用いるベクターは、好ましくは、Θ型複製起点を有する枯草菌で複製できるベクターである。この複製様式を有することにより枯草菌において、効率的にベクターを複製することができる。ｒｅｐＡは、特に限定されるものではないが、例えばサーモフィリック・バシリ由来(配列番号１３)で表されるｒｅｐＡが挙げられる。また、配列番号１３で表されるｒｅｐＡと９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上）の塩基配列を有し、且つｒｅｐＡを含まないオリジナルのベクターと比較して枯草菌における複製効率を増加させることができるｒｅｐＡでもよい。
複製効率の増加は、例えば、コロニー数の増加、又は回収ベクターＤＮＡの増加などで、確認することができる。
【0019】
《工程ａ》
前記工程ａにおいては、ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する。本工程におけるウイルスゲノムＤＮＡの取得方法は、特に限定されるものではなく、例えばウイルスが感染した患者からウイルス粒子を取得し、ウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、取得することができる。この場合、例えば、得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅することができる。
また、プラスミドベクター等に、一旦クローニングされたＤＮＡから取得することもできる。例えば、制限酵素によって、プラスミドベクター等から二本鎖ＤＮＡを切り出し、枯草菌で複製可能なベクターに組み込むことができる。また、前記プラスミドベクターを鋳型として、ＰＣＲによりウイルスゲノムＤＮＡを増幅し、枯草菌で複製可能なベクターに組み込んでもよい。
例えば、ウイルスゲノムの全長、又は比較的長いＤＮＡ断片（例えば１０ｋｂ以上のＤＮＡ断片）を取得する場合、１回のＰＣＲにより取得することもできるが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて取得することもできる。
前記工程ａにおいては、ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを枯草菌に導入する。本工程におけるウイルスゲノムＤＮＡの取得方法は、特に限定されるものではなく、例えばウイルスが感染した患者からウイルス粒子を取得し、ウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、取得することができる。この場合、例えば、得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅することができる。
また、プラスミドベクター等に、一旦クローニングされたＤＮＡから取得することもできる。例えば、制限酵素によって、プラスミドベクター等から二本鎖ＤＮＡを切り出し、枯草菌で複製可能なベクターに組み込むことができる。また、前記プラスミドベクターを鋳型として、ＰＣＲによりウイルスゲノムＤＮＡを増幅し、枯草菌で複製可能なベクターに組み込んでもよい。
例えば、ウイルスゲノムの全長、又は比較的長いＤＮＡ断片（例えば１０ｋｂ以上のＤＮＡ断片）を取得する場合、１回のＰＣＲにより取得することもできるが、複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて取得することもできる。
【0020】
（複数のＤＮＡ断片を繋ぎ合わせて作成する方法）
複数のＤＮＡ断片をつなぎ合わせる方法として、出芽酵母の細胞内において相同組換えを利用して作成する方法がある。出芽酵母の細胞内では相同組み換えの活性が非常に高いため、２５ｂｐ程度の相同領域があれば相同組み換えがおきる。この性質を利用して、酵母細胞内でＤＮＡのコンストラクトを構築することができる。また、試験管中で複数の断片を混ぜて、例えばCircular polymerase extension reaction（CPER）法などによって作成することもできる。
本発明に用いるウイルスゲノムＤＮＡは、例えば図１に示す出芽酵母を用いた方法によって取得することができる。具体的には、約３０ｋｂのウイルスゲノムから、例えば１１のＤＮＡ断片を取得する。この１１のＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを用いて、出芽酵母を形質転換する。前記ＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡは、出芽酵母の細胞内で相同組換えを起こし、目的のＤＮＡを含むベクターを取得することができる。この方法においては、制限酵素を用いることなく、複数のＤＮＡ断片を一度に結合させ、目的のＤＮＡ断片をクローニングすることができる。
酵母からのベクターの取得は、特に限定されるものではなく、例えば、アルカリ－ＳＤＳ法、除タンパク及びエタノール又はイソプロパノールによってＤＮＡを沈殿させて生成することもできる。
複数のＤＮＡ断片をつなぎ合わせる方法として、出芽酵母の細胞内において相同組換えを利用して作成する方法がある。出芽酵母の細胞内では相同組み換えの活性が非常に高いため、２５ｂｐ程度の相同領域があれば相同組み換えがおきる。この性質を利用して、酵母細胞内でＤＮＡのコンストラクトを構築することができる。また、試験管中で複数の断片を混ぜて、例えばCircular polymerase extension reaction（CPER）法などによって作成することもできる。
本発明に用いるウイルスゲノムＤＮＡは、例えば図１に示す出芽酵母を用いた方法によって取得することができる。具体的には、約３０ｋｂのウイルスゲノムから、例えば１１のＤＮＡ断片を取得する。この１１のＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを用いて、出芽酵母を形質転換する。前記ＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡは、出芽酵母の細胞内で相同組換えを起こし、目的のＤＮＡを含むベクターを取得することができる。この方法においては、制限酵素を用いることなく、複数のＤＮＡ断片を一度に結合させ、目的のＤＮＡ断片をクローニングすることができる。
酵母からのベクターの取得は、特に限定されるものではなく、例えば、アルカリ－ＳＤＳ法、除タンパク及びエタノール又はイソプロパノールによってＤＮＡを沈殿させて生成することもできる。
【0021】
ウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターの枯草菌の導入方法は、特に限定されるものではなく、例えば形質転換法（例えば、自然形質転換法）、トランスフェクト法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、又はプロトプラスト法が挙げられる。
自然形質転換法とは、枯草菌を貧栄養培地で培養すると、枯草菌の細胞膜上にコンピテントマシナリーと呼ばれる膜貫通複合体が形成され、ＡＴＰを用いて外来のＤＮＡを一本鎖として、能動的に細胞中に取り込む現象を利用する形質転換法である。
自然形質転換法とは、枯草菌を貧栄養培地で培養すると、枯草菌の細胞膜上にコンピテントマシナリーと呼ばれる膜貫通複合体が形成され、ＡＴＰを用いて外来のＤＮＡを一本鎖として、能動的に細胞中に取り込む現象を利用する形質転換法である。
【0022】
《工程ｂ》
工程ｂにおいては、前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する。枯草菌の培養は、特に限定されるものではなく、本分野で用いられている培養方法を、用いることができる。枯草菌の培地としては、例えば、ＬＢ培地、Antibiotic Medium 3（Penassay Broth）培地、又はSuper broth培地などを用いることができる。
ベクターＤＮＡの回収方法も、本分野で通常用いられている方法（例えば、リゾチウムを用いたアルカリ－ＳＤＳ法や、超遠心法など）を、限定することなく用いることができる。
工程ｂにおいては、前記枯草菌を培養し、そしてベクターを回収する。枯草菌の培養は、特に限定されるものではなく、本分野で用いられている培養方法を、用いることができる。枯草菌の培地としては、例えば、ＬＢ培地、Antibiotic Medium 3（Penassay Broth）培地、又はSuper broth培地などを用いることができる。
ベクターＤＮＡの回収方法も、本分野で通常用いられている方法（例えば、リゾチウムを用いたアルカリ－ＳＤＳ法や、超遠心法など）を、限定することなく用いることができる。
【実施例0023】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0024】
《比較例１》
本比較例では、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲにより当該配列を増幅し、配列番号１を参照して修復及び追加配列の付加を施す事で図１に記載のフラグメント１+（配列番号２）、フラグメント２+（配列番号３）、フラグメント３+（配列番号４）、フラグメントＤ+（配列番号５）、フラグメント４+（配列番号６）、フラグメント５+（配列番号７）、フラグメント６+（配列番号８）、フラグメント７+（配列番号９）、フラグメント８+（配列番号１０）、フラグメント９+（配列番号１１）、及びフラグメント１０+（配列番号１２）を構築した。
より具体的には以下の通りである。
ＲＮＡｓｅｑに用いたｃＤＮＡライブラリーをテンプレート（鋳型）にして、まず、３００～９５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片が増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを行った。その後、オーバーラップＰＣＲによって１～２ｋｂのＤＮＡ断片を作成した後、更にオーバーラップＰＣＲによって２～３ｋｂのＤＮＡ断片を作成した。この段階で一度大腸菌のプラスミドベクターにクローニングして塩基配列の確認を行った（フラグメント１～フラグメント１０）。
本比較例では、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲにより当該配列を増幅し、配列番号１を参照して修復及び追加配列の付加を施す事で図１に記載のフラグメント１+（配列番号２）、フラグメント２+（配列番号３）、フラグメント３+（配列番号４）、フラグメントＤ+（配列番号５）、フラグメント４+（配列番号６）、フラグメント５+（配列番号７）、フラグメント６+（配列番号８）、フラグメント７+（配列番号９）、フラグメント８+（配列番号１０）、フラグメント９+（配列番号１１）、及びフラグメント１０+（配列番号１２）を構築した。
より具体的には以下の通りである。
ＲＮＡｓｅｑに用いたｃＤＮＡライブラリーをテンプレート（鋳型）にして、まず、３００～９５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片が増幅できるプライマーを用いてＰＣＲを行った。その後、オーバーラップＰＣＲによって１～２ｋｂのＤＮＡ断片を作成した後、更にオーバーラップＰＣＲによって２～３ｋｂのＤＮＡ断片を作成した。この段階で一度大腸菌のプラスミドベクターにクローニングして塩基配列の確認を行った（フラグメント１～フラグメント１０）。
【0025】
フラグメントＤは、Bluescript SK+ではベクターＤＮＡが十分に取得できなかったため、ｐＢＲ３２２を用いてベクターＤＮＡを取得した。また、図２に示すように、フラグメント１に３箇所、フラグメント２に２箇所、フラグメント３に４箇所、フラグメントＤに２箇所、フラグメント４に７箇所、フラグメント５に５箇所、フラグメント６に３箇所、フラグメント７に７箇所、フラグメント８に２箇所、フラグメント９に１箇所、及びフラグメント１０に１箇所の変異が発生した。フラグメント４及び７の変異発生率が高かった。これらの変異を以下の方法で修正した。
塩基配列の確認の結果、判明した変異箇所（アスタリスク）は、正常な配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーを作成し、ＰＣＲを用いながら全ての配列の変異の修正を行った。また隣接するフラグメントと重複するように両端にオーバーラップ配列（３００－７００ｂｐ）を付加した。（ＧＦＰやＣＭＶプロモーターなどもこの時に付加した）こうしてフラグメント１+（配列番号２）、フラグメント２+（配列番号３）、フラグメント３+（配列番号４）、フラグメントＤ+（配列番号５）、フラグメント４+（配列番号６）、フラグメント５+（配列番号７）、フラグメント６+（配列番号８）、フラグメント７+（配列番号９）、フラグメント８+（配列番号１０）、フラグメント９+（配列番号１１）、及びフラグメント１０+（配列番号１２）を構築した。
塩基配列の確認の結果、判明した変異箇所（アスタリスク）は、正常な配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーを作成し、ＰＣＲを用いながら全ての配列の変異の修正を行った。また隣接するフラグメントと重複するように両端にオーバーラップ配列（３００－７００ｂｐ）を付加した。（ＧＦＰやＣＭＶプロモーターなどもこの時に付加した）こうしてフラグメント１+（配列番号２）、フラグメント２+（配列番号３）、フラグメント３+（配列番号４）、フラグメントＤ+（配列番号５）、フラグメント４+（配列番号６）、フラグメント５+（配列番号７）、フラグメント６+（配列番号８）、フラグメント７+（配列番号９）、フラグメント８+（配列番号１０）、フラグメント９+（配列番号１１）、及びフラグメント１０+（配列番号１２）を構築した。
【0026】
《参考例１》
本参考例では、比較例１で得られたフラグメントを出芽酵母に導入し、酵母細胞中で相同組換えによってフラグメント同士を連結させ、約３０ｋｂのコロナウイルスゲノムＤＮＡ含むベクターを構築した。
各大腸菌プラスミドからフラグメント１+～１０+のＤＮＡ断片を精製し、これら１１の各ＤＮＡフラグメントと直鎖化したＹＡＣ－ＢＡＣ－枯草菌シャトルベクター（pYEP101）を同時に用いて出芽酵母へ導入した。出芽酵母の形質転換法は、通常行われている陽イオンリチウム法（酢酸リチウム法）で実施した。各フラグメントとベクターの両端には３００ｂｐ～７００ｂｐのオーバーラップ領域が付加されており、酵母細胞に導入されると相同組み換えによって全てのフラグメントとベクターが一度に繋がり、約２７．５ｋｂのコロナゲノムを持つ、環状のプラスミドが構築できた。その後、同プラスミドを持つ酵母株を培養して、同酵母株からコロナゲノムを有するベクターの精製を試みた。精製法は、一般的なプロトコルに従い、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅを用いたアルカリ－ＳＤＳ法又はＺｙｍｏｌｙａｓｅを用いたＳＤＳ法である。しかしながら精製溶液を適当な制限酵素で切断して、電気泳動によってバンドパターンを確認したところ、予想されるバンドを確認することができなかった。培養条件、培地の量など変えて何度か精製を試みたが、同様に綺麗に精製することはできず、予想されるバンドパターンを電気泳動で確認することはできなかった。原因として、今回用いているpYEP101のコピー数が少ないことと、酵母細胞に含まれるゲノムＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡが阻害している可能性が考えられる。
本参考例では、比較例１で得られたフラグメントを出芽酵母に導入し、酵母細胞中で相同組換えによってフラグメント同士を連結させ、約３０ｋｂのコロナウイルスゲノムＤＮＡ含むベクターを構築した。
各大腸菌プラスミドからフラグメント１+～１０+のＤＮＡ断片を精製し、これら１１の各ＤＮＡフラグメントと直鎖化したＹＡＣ－ＢＡＣ－枯草菌シャトルベクター（pYEP101）を同時に用いて出芽酵母へ導入した。出芽酵母の形質転換法は、通常行われている陽イオンリチウム法（酢酸リチウム法）で実施した。各フラグメントとベクターの両端には３００ｂｐ～７００ｂｐのオーバーラップ領域が付加されており、酵母細胞に導入されると相同組み換えによって全てのフラグメントとベクターが一度に繋がり、約２７．５ｋｂのコロナゲノムを持つ、環状のプラスミドが構築できた。その後、同プラスミドを持つ酵母株を培養して、同酵母株からコロナゲノムを有するベクターの精製を試みた。精製法は、一般的なプロトコルに従い、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅを用いたアルカリ－ＳＤＳ法又はＺｙｍｏｌｙａｓｅを用いたＳＤＳ法である。しかしながら精製溶液を適当な制限酵素で切断して、電気泳動によってバンドパターンを確認したところ、予想されるバンドを確認することができなかった。培養条件、培地の量など変えて何度か精製を試みたが、同様に綺麗に精製することはできず、予想されるバンドパターンを電気泳動で確認することはできなかった。原因として、今回用いているpYEP101のコピー数が少ないことと、酵母細胞に含まれるゲノムＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡが阻害している可能性が考えられる。
【0027】
《比較例２》
本比較例では、出芽酵母の相同組換えによるＤＮＡ断片集積法で取得したコロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを用いて、大腸菌によるベクターの調製を試みた。
コロニーＰＣＲによって予想されるバンドを検出できた大腸菌株（DH10B株、BL21株、HB101株）について大腸菌からの同プラスミドの精製を試みた。精製法は一般に用いられているアルカリ－ＳＤＳ法で、１００ｋｂ以上サイズも精製可能な精製キットを使用した。回収後、適当な制限酵素で切断して電気泳動によってバンドパターンを確認したが、予想されるバンドを確認することができなかった。
本比較例では、出芽酵母の相同組換えによるＤＮＡ断片集積法で取得したコロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを用いて、大腸菌によるベクターの調製を試みた。
コロニーＰＣＲによって予想されるバンドを検出できた大腸菌株（DH10B株、BL21株、HB101株）について大腸菌からの同プラスミドの精製を試みた。精製法は一般に用いられているアルカリ－ＳＤＳ法で、１００ｋｂ以上サイズも精製可能な精製キットを使用した。回収後、適当な制限酵素で切断して電気泳動によってバンドパターンを確認したが、予想されるバンドを確認することができなかった。
【0028】
《実施例１～３及び比較例３～９》
本実施例及び比較例では、前記コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを用いて、３種の枯草菌（実施例１～３）及び７種の大腸菌（比較例３～９）を形質転換し、効率を検討した。
今回構築したコロナゲノムを有するベクターは、出芽酵母、大腸菌、枯草菌で複製可能である。
コロニーＰＣＲによって全断片を保持しているベクターを酵母株から、上記同様にＺｙｍｏｌｙａｓｅを用いて抽出・精製し、枯草菌（３株）と大腸菌（７株）に形質転換法によって導入した。枯草菌の形質転換は、一般的に行われている自然形質転換法を用いた。大腸菌の形質転換法は、エレクトロポレーション法によって行った。その結果、枯草菌では通常通り一晩でコロニーが得られたが、大腸菌は１晩ではコロニーがほとんど得られず、株によって２晩（HB101株）、あるいは３日以降でやっとコロニーが形成された（DH5α株、DH10B株、BL21株、JA221株）。しかしながらこれらのコロニーを新しい抗生物質入りのプレートにストリークしたところ、DH5α株では全く生育が確認できなかった。新しいプレートで生育が確認されたコロニーに関して、コロニーＰＣＲによってコロナゲノムを正しく有しているか確認したところ、DH10B株、BL21株、HB101株でのみ候補株が得られた。これらの形質転換体（大腸菌）に関して、コロナゲノムを有するベクターを精製して適当な制限酵素によって切断して電気泳動でバンドパターンを確認したところ、図７で示したように正しいコロナゲノムを有するクローンは得られなかった。一方、枯草菌の得られた形質転換体は、新しいプレートでも問題なく全コロニーが生育し、コロニーＰＣＲ、及び精製後の制限酵素による電気泳動の確認でも予想されるバンドパターンを確認することができた。また、生育速度も遅くなることはなく、問題なくコロナゲノムを有するベクターを精製することができた。精製後、次世代シーケンサーiSeqTM100 system（illumine, U.S.A.）を用いて全塩基配列を確認したところ、変異は検出されなかった。
本実施例及び比較例では、前記コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターを用いて、３種の枯草菌（実施例１～３）及び７種の大腸菌（比較例３～９）を形質転換し、効率を検討した。
今回構築したコロナゲノムを有するベクターは、出芽酵母、大腸菌、枯草菌で複製可能である。
コロニーＰＣＲによって全断片を保持しているベクターを酵母株から、上記同様にＺｙｍｏｌｙａｓｅを用いて抽出・精製し、枯草菌（３株）と大腸菌（７株）に形質転換法によって導入した。枯草菌の形質転換は、一般的に行われている自然形質転換法を用いた。大腸菌の形質転換法は、エレクトロポレーション法によって行った。その結果、枯草菌では通常通り一晩でコロニーが得られたが、大腸菌は１晩ではコロニーがほとんど得られず、株によって２晩（HB101株）、あるいは３日以降でやっとコロニーが形成された（DH5α株、DH10B株、BL21株、JA221株）。しかしながらこれらのコロニーを新しい抗生物質入りのプレートにストリークしたところ、DH5α株では全く生育が確認できなかった。新しいプレートで生育が確認されたコロニーに関して、コロニーＰＣＲによってコロナゲノムを正しく有しているか確認したところ、DH10B株、BL21株、HB101株でのみ候補株が得られた。これらの形質転換体（大腸菌）に関して、コロナゲノムを有するベクターを精製して適当な制限酵素によって切断して電気泳動でバンドパターンを確認したところ、図７で示したように正しいコロナゲノムを有するクローンは得られなかった。一方、枯草菌の得られた形質転換体は、新しいプレートでも問題なく全コロニーが生育し、コロニーＰＣＲ、及び精製後の制限酵素による電気泳動の確認でも予想されるバンドパターンを確認することができた。また、生育速度も遅くなることはなく、問題なくコロナゲノムを有するベクターを精製することができた。精製後、次世代シーケンサーiSeqTM100 system（illumine, U.S.A.）を用いて全塩基配列を確認したところ、変異は検出されなかった。
【0029】
【表1】
【0030】
表１に示すように大腸菌では１晩の培養によってほとんどコロニーが得られなかった。これに対して枯草菌では、１晩の培養で、多数のコロニーを得ることができた。
【0031】
《比較例１０及び実施例４》
本比較例及び実施例では、前記コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターにより、大腸菌及び枯草菌を形質転換し、コロナウイルスゲノムを含むベクターの大量精製を試みた。
新しい抗生物質入りのプレートで生育できた大腸菌及び枯草菌の形質転換体についてコロニーＰＣＲで問題のなかったクローンについて、コロナウイルスゲノムを含むベクターを精製して、適当な制限酵素で切断して、電気泳動を行った結果を図７に示した。枯草菌では予想されるバンドパターンが確認できたが、大腸菌ではイレギュラーなバンドが出現してしまい、正しいコロナウイルスゲノムを有するクローンは得られなかった。枯草菌においては、ＲＭ１２５株、ＲＭ１２５ＲｅｃＡα株において期待されるバンドが確認でき、特にＲＭ１２５ＲｅｃＡα株では、より綺麗に精製できることが示された。
本比較例及び実施例では、前記コロナウイルスゲノムＤＮＡを含むベクターにより、大腸菌及び枯草菌を形質転換し、コロナウイルスゲノムを含むベクターの大量精製を試みた。
新しい抗生物質入りのプレートで生育できた大腸菌及び枯草菌の形質転換体についてコロニーＰＣＲで問題のなかったクローンについて、コロナウイルスゲノムを含むベクターを精製して、適当な制限酵素で切断して、電気泳動を行った結果を図７に示した。枯草菌では予想されるバンドパターンが確認できたが、大腸菌ではイレギュラーなバンドが出現してしまい、正しいコロナウイルスゲノムを有するクローンは得られなかった。枯草菌においては、ＲＭ１２５株、ＲＭ１２５ＲｅｃＡα株において期待されるバンドが確認でき、特にＲＭ１２５ＲｅｃＡα株では、より綺麗に精製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0032】
本発明のコロナウイルスゲノムＤＮＡの製造方法、及びコロナウイルスゲノムＤＮＡを含む枯草菌によれば、効率的にコロナウイルスゲノムＤＮＡを取得及び製造することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】