特開 2024-103632 Ｃ／ＥＢＰアルファｓａＲＮＡを含む併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024103632

(43)【公開日】2024-08-01

(54)【発明の名称】Ｃ／ＥＢＰアルファｓａＲＮＡを含む併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/713 20060101AFI20240725BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240725BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240725BHJP

【ＦＩ】

A61K31/713

A61K39/395 U

A61K48/00

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P1/16

A61K31/713 ZNA

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 Z

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024087660

(22)【出願日】2024-05-30

(62)【分割の表示】P 2020570030の分割

【原出願日】2019-06-14

(31)【優先権主張番号】62/685,627

(32)【優先日】2018-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/731,532

(32)【優先日】2018-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/821,533

(32)【優先日】2019-03-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】512325200

【氏名又は名称】ミナ セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ライトフット、ヘレン エル．

(72)【発明者】

【氏名】リーバイ、ヴィカシュ

(72)【発明者】

【氏名】セトロム、ポール

(72)【発明者】

【氏名】ブレイキー、デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】タン、チュン ピン

(57)【要約】

【課題】Ｃ／ＥＢＰαを標的とするｓａＲＮＡおよび少なくとも１つの追加の活性剤を含む医薬組成物を提供すること。
【解決手段】対象の癌を治療するための医薬組成物は、単離された合成ｓａＲＮＡと少なくとも１つの追加の活性剤とを含み、前記ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートし、前記ｓａＲＮＡは配列番号１（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含む鎖を含み、前記追加の活性剤はペンブロリズマブ、トレメリムマブ、デュルバルマブ、またはニボルマブである。
【選択図】 図７Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする対象の癌を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、単離された合成ｓａＲＮＡと少なくとも１つの追加の活性剤とを含み、前記医薬組成物は前記対象に投与されるものであり、
前記ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートし、前記ｓａＲＮＡが配列番号１（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含む鎖を含み、
前記追加の活性剤がペンブロリズマブ、トレメリムマブ、デュルバルマブ、またはニボルマブである、医薬組成物。

【請求項2】

前記Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現が、少なくとも２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍アップレギュレートされる、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ｓａＲＮＡが二本鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含み、前記ｓａＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ｓａＲＮＡがＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとして投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ｓａＲＮＡは、前記追加の活性剤と同時にまたは順次に投与されるものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記追加の活性剤が、ペンブロリズマブである、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記対象がさらに高周波アブレーション（ＲＦＡ）治療を受ける、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記対象がｓａＲＮＡ治療の前にＲＦＡ治療を受ける、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）、大腸癌、胃癌、皮膚癌、膵臓癌、頭頸部癌、子宮頸癌、および前立腺癌から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）または大腸癌である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリヌクレオチド、特にｓａＲＮＡと、Ｃ／ＥＢＰαおよびＣ／ＥＢＰα経路をモジュレートするための組成物、ならびに代謝障害、癌を含む過剰増殖性疾患を治療することおよび幹細胞系統をレギュレートすることのような治療用途で同組成物を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃｓ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰＡ、またはＣＥＢＰＡ）は、ヒトおよびラットにわたり保存されるロイシンジッパータンパク質である。この核転写因子は、肝細胞、骨髄単球、脂肪細胞、並びに他のタイプの乳腺上皮細胞に豊富に存在している［非特許文献１］。それは、Ｎ末端部分の２つのトランス活性化ドメインと、Ｃ末端部分の他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーとの二量化を媒介するロイシンジッパー領域およびＤＮＡ結合ドメインとで構成される。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持および傷害への反応に関与する多くの遺伝子のプロモータ領域に存在する。Ｃ／ＥＢＰαは、免疫および炎症反応、発生、細胞増殖、抗アポトーシス、ならびにいくつかの代謝経路に関与するいくつかの肝臓特異的遺伝子の転写において多面発現効果を有する［非特許文献２］。それは肝細胞の分化状態の維持に不可欠である。それはアルブミン転写を活性化すると共に、尿素産生に関与する複数のオルニチン回路酵素をコードする遺伝子の発現を調整し、したがって正常な肝機能に重要な役割を果たしている。

【0003】

成体肝臓において、Ｃ／ＥＢＰαは、最終分化肝細胞で機能することが明らかにされているが、一方で、急速増殖肝腫細胞はＣ／ＥＢＰαの一部のみを発現する［非特許文献３］。Ｃ／ＥＢＰαは、レチノブラストーマのアップレギュレーションとＣｄｋ２およびＣｄｋ４の阻害とを介する細胞増殖の強い阻害剤であるｐ２１をアップレギュレートすることが知られている［非特許文献４、非特許文献５］。肝細胞癌（ＨＣＣ）において、Ｃ／ＥＢＰαは、抗増殖特性を有する腫瘍サプレッサーとして機能する［非特許文献６］。

【0004】

Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレーションを研究するためにさまざまなアプローチが行われている。Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、翻訳後のリン酸化およびＳＵＭＯ化によりレギュレートされることが知られている。たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤および細胞外シグナル調節キナーゼ１および／または２（ＥＲＫ１／２）は、Ｃ／ＥＢＰαのセリン２１リン酸化を阻止し、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質の顆粒球分化能を増加させる［非特許文献７、非特許文献８］。加えて、２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）によりＣ／ＥＢＰα翻訳を効率的に誘導可能であり、それにより、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質アイソフォームの比がｐ３０形よりも全長ｐ４２形が有利になるように変化するために顆粒球分化が誘導される［非特許文献９］。

【0005】

Ｃ／ＥＢＰα遺伝子は、染色体１９ｑ１３．１に位置するイントロンのない遺伝子である。ほとんどの真核細胞は、遺伝子発現をレギュレートするための機序としてＲＮＡ相補性を使用する。一例は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡを用いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）により遺伝子発現をノックダウンするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）経路である。現在では、低分子二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子のプロモータ領域を標的としてこれらの遺伝子の転写活性化を媒介する能力を有することが確立されており、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ：ＲＮＡ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）、または低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と呼ばれてきた［非特許文献１０］。遺伝子のｓａＲＮＡ誘導活性化は、マウス、ラット、および非ヒト霊長類を含む他の哺乳動物種で保存されており、遺伝子の内因性アップレギュレーションの影響を研究するための一般的な方法に急速になりつつある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】レクストロム－ハイムズ（Ｌｅｋｓｔｒｏｍ－Ｈｉｍｅｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第２７３巻、ｐ．２８５４５～２８５４８

【非特許文献2】ダーリントン（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９５年、第５巻、第５号、ｐ．５６５～５７０

【非特許文献3】ウメク（Ｕｍｅｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、第２５１巻、ｐ．２８８～２９２

【非特許文献4】ティムケンコ（Ｔｉｍｃｈｅｎｋｏ）ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９６年、第１０巻、ｐ．８０４～８１５

【非特許文献5】ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２００１年、第８巻、ｐ．８１７～８２８

【非特許文献6】イアコバ（Ｉａｋｏｖａ）ら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年、第２１巻、第１号、ｐ．２８～３４

【非特許文献7】ラドムスカ（Ｒａｄｏｍｓｋａ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６年、第２０３巻、第２号、ｐ．３７１～３８１

【非特許文献8】ロス（Ｒｏｓｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年、第２４巻、第２号、ｐ．６７５～６８６

【非特許文献9】コシュミーダ（Ｋｏｓｃｈｍｉｅｄｅｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年、第１１０巻、第１０号、ｐ．３６９５～３７０５

【非特許文献10】リー（Ｌｉ）ら、ＰＮＡＳ、２００６年、第１０３巻、ｐ．１７３３７～１７３４２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、ｓａＲＮＡを用いて治療目的にてＣ／ＥＢＰαの標的化モジュレーションを行う必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ分子および少なくとも１つの追加の活性剤を含む併用療法を提供する。併用療法を調製および使用する方法も提供される。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ分子および少なくとも１つの追加の活性剤を含む医薬組成物が提供できた。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明のｓａＲＮＡの機能に関与する核酸部分間の関係を示す概略図である。

【図2】実施例４の研究デザインのタイムラインである。

【図3】実施例４で考察した腫瘍浸潤ヘルパーＴリンパ球の変化を示す。

【図4】実施例４で考察した腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔリンパ球の変化を示す。

【図5】実施例４で考察したＲＦＡ処置を行わない場合の腫瘍浸潤ナチュラルキラーＴ細胞の変化を示す。

【図6】実施例４で考察したＲＦＡ処置を行う場合の腫瘍浸潤ナチュラルキラーＴ細胞の変化を示す。

【図7A】実施例５で考察した腫瘍体積の変化を示す。

【図7B】実施例５で考察したＡＦＰの変化を示す。

【図8A】研究期間にわたる群内の各動物のＣＴ２６腫瘍サイズ、ならびに実施例７で考察した研究における１８、２１および２３日目の散布図を示す。

【図8B】研究期間にわたる群内の各動物のＣＴ２６腫瘍サイズ、ならびに実施例７で考察した研究における１８、２１および２３日目の散布図を示す。

【図8C】研究期間にわたる群内の各動物のＣＴ２６腫瘍サイズ、ならびに実施例７で考察した研究における１８、２１および２３日目の散布図を示す。

【図8D】研究期間にわたる群内の各動物のＣＴ２６腫瘍サイズ、ならびに実施例７で考察した研究における１８、２１および２３日目の散布図を示す。

【図9A】ＭＴＬ－ＣＥＢＡ＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（左パネル）およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋抗ＰＤ１（右パネル）処置動物の第３週の腫瘍重量を示す。

【図9B-1】ＭＴＬ－ＣＥＢＡ＋抗ＰＤ１（上部パネル）およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（下部パネル）処置動物の第３週の腫瘍体積を示す。

【図9B-2】ＭＴＬ－ＣＥＢＡ＋抗ＰＤ１（上部パネル）およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（下部パネル）処置動物の第３週の腫瘍体積を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、治療目的のためにＣ／ＥＢＰα遺伝子発現および／または機能をモジュレートするための組成物、方法、およびキットを提供する。これらの組成物、方法およびキットは、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築物を含む。

【0012】

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、代謝プロセスおよび細胞増殖のクリティカルなレギュレータとして知られる。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子をモジュレートすることは、治療目的で大きい可能性を有する。本発明は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築物を提供することにより、こうした必要性に取り組むものであり、ここで、核酸構築物は、修飾されている、もしくは修飾されていない、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。

【0013】

本明細書で用いられるＣ／ＥＢＰα遺伝子は、コード鎖と鋳型鎖とを含む二本鎖ＤＮＡである。それはまた、本出願において標的遺伝子と称され得る。
文脈における「Ｃ／ＥＢＰα転写物」、「Ｃ／ＥＢＰα標的転写物」、または「標的転写物」という用語は、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質をコードするＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡでありうる。Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡはＣ／ＥＢＰα遺伝子の鋳型鎖から転写され、ミトコンドリアに存在しうる。

【0014】

Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖から転写されるＣ／ＥＢＰα遺伝子のアンチセンスＲＮＡは、本明細書において、以降は標的アンチセンスＲＮＡ転写物と称される。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、長い非コードアンチセンスＲＮＡ転写物であり得る。

【0015】

本発明の文脈における「低分子活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）」、「低分子活性化ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）」または「ｓａＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現をアップレギュレートするまたはそれに対する正の作用を有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡを意味する。ｓａＲＮＡは、１４～３０ヌクレオチドの一本鎖であり得る。ｓａＲＮＡは、各々の鎖が１４～３０ヌクレオチドを含む二本鎖であり得る。この遺伝子は、ｓａＲＮＡの標的遺伝子と呼ばれる。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートするｓａＲＮＡは「Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ」と称され、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子はＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの標的遺伝子である。

【0016】

文脈における「標的」または「標的化」という用語は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子に対する作用を有することを意味する。作用は直接的または間接的であり得る。直接的な作用は、Ｃ／ＥＢＰα標的アンチセンスＲＮＡ転写物との完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションにより引き起こされ得る。間接的な作用は、上流または下流であり得る。

【0017】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、生物学的プロセスまたは活性に対する下流作用を有し得る。そのような実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、第２の非標的転写物に対する作用（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか）を有し得る。

【0018】

文脈における「遺伝子発現」という用語は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子からＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡを生成する転写工程またはＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡからＣ／ＥＢＰαタンパク質を生成する翻訳工程を含み得る。Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡの増加およびＣ／ＥＢＰαタンパク質の増加はいずれも、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現の増加または正の作用の指標となる。

【0019】

遺伝子の「アップレギュレーション」または「活性化」とは、遺伝子の発現レベル、遺伝子によりコードされるポリペプチドのレベルもしくはその活性、または遺伝子の鋳型鎖から転写されるＲＮＡ転写物のレベルが本発明のｓａＲＮＡの不在下で観測されるよりも増加することを意味する。本発明のｓａＲＮＡは、標的遺伝子の発現に対する直接的または間接的なアップレギュレート作用を有し得る。

【0020】

一実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、増殖細胞で効力を示し得る。細胞に関して本明細書で使用される場合、「増殖する（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）」とは、急速に成長および／または複製する細胞を意味する。

【0021】

Ｉ．本発明の組成物
本発明の一態様は、ＣＥＢＰＡ遺伝子をアップレギュレートするｓａＲＮＡ、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。このようなｓａＲＮＡは、以下において、「Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ」または「本発明のｓａＲＮＡ」と称され、本出願において交換可能に使用される。

【0022】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは１４～３０ヌクレオチドを有し、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の鋳型鎖上の標的配列に少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的である配列を含む。標的配列は、ｓａＲＮＡおよび／またはｓａＲＮＡの逆相補体と同じ長さ、すなわち同じ数のヌクレオチドを有していてもよい。ｓａＲＮＡ、標的遺伝子、標的遺伝子のコード鎖、標的遺伝子の鋳型鎖、標的配列／標的部位、および転写開始部位（ＴＳＳ）の関係を図１に示す。

【0023】

いくつかの実施形態において、標的配列は、少なくとも１４ヌクレオチドかつ３０ヌクレオチド未満を含む。
いくつかの実施形態において、標的配列は１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドを有する。

【0024】

いくつかの実施形態において、標的配列の位置は、鋳型鎖のプロモータ領域内に位置する。
いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの標的配列は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の鋳型鎖のＴＳＳ（転写開始部位）コア内に位置する。本明細書で使用される「ＴＳＳコア」または「ＴＳＳコア配列」は、ＴＳＳ（転写開始部位）の２０００ヌクレオチド上流と２０００ヌクレオチド下流との間の領域を指す。したがって、ＴＳＳコアは４００１ヌクレオチドを含み、ＴＳＳはＴＳＳコア配列の５’末端から位置２００１に位置する。ＣＥＢＰＡ ＴＳＳコア配列を以下の表に示す。

【0025】

【表1】

【0026】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳの１０００ヌクレオチド上流と１０００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳの５００ヌクレオチド上流と５００ヌクレオチド下流との間に位置する。いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳの２５０ヌクレオチド上流と２５０ヌクレオチド下流との間に位置する。

【0027】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳの１００ヌクレオチド上流と１００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、標的配列はＴＳＳコア内のＴＳＳの上流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの上流の２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満であり得る。

【0028】

いくつかの実施形態において、標的配列はＴＳＳコア内のＴＳＳの下流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの下流の２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満であり得る。

【0029】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳの周囲の＋／－５０ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳに実質的に重複する。いくつかの実施形態において、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳで開始もしくは終了する。いくつかの実施形態において、標的配列は、上流方向または下流方向のいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９ヌクレオチドがＴＳＳコアのＴＳＳに重複する。

【0030】

鋳型鎖の標的配列の位置は、標的配列の５’末端の位置により定義される。標的配列の５’末端は、ＴＳＳコアの任意の位置にあってもよく、標的配列はＴＳＳコアの位置１～位置４００１まで選択された任意の位置から開始してもよい。本明細書での参照のために、標的配列の最も５’側の末端がＴＳＳコアの位置１～位置２０００にある場合、標的配列はＴＳＳの上流にあると見なされ、標的配列の最も５’側の末端が位置２００２～４００１にある場合、標的配列はＴＳＳの下流にあると見なされる。標的配列の５’末端がヌクレオチド２００１にある場合、標的配列はＴＳＳ中心配列であると見なされ、ＴＳＳの上流でも下流でもない。

【0031】

さらなる参考のために、例えば、標的配列の５’末端がＴＳＳコアの位置１６００にある場合、すなわち、ＴＳＳコアの１６００番目のヌクレオチドである場合、標的配列はＴＳＳコアの位置１６００から開始し、ＴＳＳの上流にあると見なされる。

【0032】

一実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは二本鎖を形成する２つの鎖を有し、一方の鎖はガイド鎖である。ｓａＲＮＡ二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）は二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓａＲＮＡとも称される。本明細書で用いられる二本鎖ｓａＲＮＡまたはｓａＲＮＡ二本鎖は、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成可能な２本以上の、好ましくは２本の鎖を含むｓａＲＮＡである。二本鎖ｓａＲＮＡの２つの鎖は、アンチセンス鎖またはガイド鎖、およびセンス鎖またはパッセンジャー鎖と称される。

【0033】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ミナ セラピューティクス リミテッド（ＭｉＮＡ Ｔｈｅｒａｐｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）への国際公開第ＷＯ２０１５／０７５５５７号または第ＷＯ２０１６／１７０３４９号（両文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡから構成されていてもよく、例えば、それぞれ、国際公開第ＷＯ２０１６／１７０３４９号に開示されている表１、表１Ａ、表３－１および表３－２のｓａＲＮＡ、ＡＷ５１およびＣＥＢＰＡ－５１である。

【0034】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＢＰα－ｓａＲＮＡは改変されていてもよく、そしてミナ セラピューティクス リミテッドへの国際公開第ＷＯ２０１６／１７０３４９号に開示された任意の改変を含み得る。

【0035】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰαをアップレギュレートするｓａＲＮＡ二本鎖であるＣＥＢＰＡ－５１（またはＣＥＢＰＡ５１）である。その設計、配列、および組成物／製剤は、ミナ セラピューティクス リミテッドへの国際公開第ＷＯ２０１６／１７０３４９号の詳細な説明および実施例に開示されている。ＣＥＢＰＡ－５１のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を表１に示す。

【0036】

【表2】

【0037】

鎖のアライメントを表２に示す。

【0038】

【表3】

【0039】

ＣＥＢＰＡ－５１をリポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社所有のＮＯＶ３４０ ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）技術）にカプセル化してＭＴＬ－ＣＥＢＰＡを作製する。ＮＯＶ３４０ ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）の脂質成分は、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル－ヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および４－（２－アミノエチル）－モルホリノ－コレステロールヘミサクシネート（ＭＯＣＨＯＬ）から構成されている。ＮＯＶ３４０ ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は６：２４：２３：４７のモル比でのＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳおよびＭＯＣＨＯＬからなる。これらのナノ粒子は生理学的ｐＨでアニオン性であり、それらの特定の脂質比はリポソームに「ｐＨ調整可能」な特性と電荷を与え、これは微小環境の周囲のｐＨに応じて変化し、生理学的膜を通過する移動を促進する。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）ナノ粒子は、約５０～１５０ｎｍ、または約１００～１２０ｎｍの平均直径を有し、広範な即時の肝隔離を避けるための大きさになっており、静脈注射後の長時間の全身分布と血清安定性の向上を促進し、肝臓、脾臓、骨髄における高レベルの広い組織分布につながることが報告されている。

【0040】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡはまた、ショ糖やリン酸塩などの緩衝液形成賦形剤も含む。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの定性および定量組成（２．５ｍｇ／ｍＬ）を表３に示す。

【0041】

【表4】

【0042】

投与
ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物は、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与することができる。投与経路としては、限定されるものではないが、以下のものが含まれる；腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、上皮（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚の下に）経鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈に）、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管内に）、腹腔内（腹膜への注入又は注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通して）、海綿体内注射（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚を通しての拡散）、径粘膜（粘膜からの拡散）、吹送（強く息を吐く）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上に）または点耳。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与され得る。２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第ＷＯ２０１３／０９０６４８号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示された投与経路は、本発明のｓａＲＮＡを投与するために使用され得る。

【0043】

投薬
いくつかの実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物は、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回または４日に１回、投与される。

【0044】

いくつかの実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物の少なくとも２用量が、対象に投与される。対象は、肝臓癌、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪症、肝障害、肝不全、または肝線維症などの肝疾患に罹患している可能性がある。投与間隔は７日未満である。一実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、２４時間ごとに投与される。一実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、４８時間ごとに投与される。

【0045】

いくつかの実施形態において、患者は、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物の少なくとも２用量、例えば、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量、または１０用量、を受ける。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物は、少なくとも２日間、例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、８日間、９日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間、投与される。

【0047】

一実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、２４時間ごとに、少なくとも２日間、例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、８日間、９日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間、投与される。

【0048】

一実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、４８時間ごとに、少なくとも２日間、例えば、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、８日間、９日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間、投与される。

【0049】

いくつかの実施形態において、ＣＥＢＰＡ－５１および／またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡなどのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物は、６０分にわたる静脈内注入を介して投与される。用量は約２０～約１６０ｍｇ／ｍ^２である。

【0050】

本出願に開示される投薬レジメンは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡまたはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ組成物で治療することができる任意の適応症または障害に適用することができる。

【0051】

ＩＩ．使用方法
本発明の一態様は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、並びにＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を使用するための方法を提供する。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはＣ／ＥＢＰα遺伝子発現をモジュレートする。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ増加する。さらに好ましい実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する。

【0052】

一実施形態において、本明細書に記載のｓａＲＮＡの遺伝子発現の増加は増殖細胞で示される。
代謝調節
肝細胞は一般に、いくつかの重要な機能の維持に重要であると認識されている。たとえば、肝細胞は、炭水化物と脂質の代謝、および外因性および内因性の化合物の解毒を調節することができる。Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪細胞、ＩＩ型肺胞細胞、および肝細胞を含む、多くの細胞型の分化に重要な役割を果たすさまざまな組織で発現される。マウスでは、Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪組織、肝組織および肺組織に最も豊富に見いだされる。Ｃ／ＥＢＰαの機能的役割には、限定されるものではないが、α－１－アンチトリプシン、トランスサイレチンおよびアルブミンのレギュレーションが挙げられる。さらに、肝細胞系（ＨｅｐＧ２）におけるＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、内因性基質の代謝に関与すると共に主要な生体異物の解毒および代謝活性化に重要な役割を果たすモノオキシゲナーゼのスーパーファミリーであるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）のレベルの増加をもたらす［ジョウバー（Ｊｏｖｅｒ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９８年、第４３１巻、第２号、ｐ．２２７～２３０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。

【0053】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、世界的に主要な健康問題であり、米国では３人に１人が罹患している。ＮＡＦＬＤは、過度のアルコール摂取によって引き起こされるものではない、肝細胞内の余分な脂肪（脂質）の蓄積である。肝臓の重量の５％～１０％超が脂肪である場合、脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる。ＮＡＦＬＤは、脂肪性肝炎、肝硬変、および肝臓癌に進行する可能性がある。メタボリック症候群、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満などの代謝障害に関連している。治療方法としては、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルの低下、インスリン感受性の向上、代謝リスク因子の治療、体重減少などが挙げられる［アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、第８２巻、ｐ．３１５～３２２、ムッソ（Ｍｕｓｓｏ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、２０１１年、第２２巻、第６号、ｐ．４８９～４９６（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。

【0054】

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、肝機能および代謝の調節に重要な役割を果たす。肝臓へのＣ／ＥＢＰαの一次作用は図１に示され、ＣＤ３６タンパク質レベルの低下による脂肪酸取込みの減少、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）、および脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）タンパク質のレベルの低下によるｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の減少、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターアルファ（ＰＰＡＲα）ならびにペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマコアクチベータ１－アルファおよび－ベータ（ＰＧＣ－１αおよびβ）のタンパク質レベルの増加によるβ酸化の増加、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）および低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質のレベルの低下による肝脂質過負荷の減少、ＰＧＣ－１βタンパク質レベルの増加による線維症への進行の減少、ならびにペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲγ）タンパク質レベルの増加によるインスリン抵抗性の減少が含まれる。さらに、Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪組織への二次作用を有する。白色脂肪組織（ＷＡＴ）は、脂質生成組織および脂肪貯蔵組織であるだけでなく、エネルギーホメオスタシス、脂質代謝、食欲、妊性、ならびに免疫反応およびストレス反応を調節する重要な内分泌器官でもある。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、ＷＡＴと比較して多数のより小さい脂質小滴およびかなりより多くの鉄含有ミトコンドリアを含有する。それは栄養エネルギー、エネルギーバランスおよび体重において重要な役割を果たす。ＢＡＴの萎縮が肥満に関連しているというエビデンスが存在する。特に、ＢＡＴにおける熱発生の障害は齧歯動物の肥満の病因に重要なことが研究から示唆された［トレイハーン Ｐ．（Ｔｒａｙｈｕｒｎ Ｐ．）、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１９９３年、第１８巻、第２号、ｐ．１６１～１７３］。Ｃ／ＥＢＰαは、肝脂肪症およびインスリン抵抗性を減少させると共にＰＧＣ－１αタンパク質レベルを増加させ、続いてＷＡＴの褐変、ＷＡＴからＢＡＴへの変換、次いでＢＡＴの活性化を引き起こし、それにより体脂肪および体重を低減する。したがって、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝機能の調節、脂肪症の低減、血清脂質の低減、ＮＡＦＬＤの治療、インスリン抵抗性の治療、エネルギー消費の増加、および肥満の治療に使用することができる。

【0055】

一実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することによりインビトロおよびインビボで肝代謝遺伝子をレギュレートする方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでの治療によりインビトロおよびインビボでＮＡＦＬＤに関与する肝遺伝子をレギュレートする方法も提供される。遺伝子には、限定されるものではないが、ステロール調節エレメント結合因子１（ＳＲＥＢＦ－１またはＳＲＥＢＦ）、分化クラスター３６（ＣＤ３６）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＡＣＢ）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）、ペルオキシソームプロリフェレータ－活性化レセプターガンマコアクチベータ１アルファ（ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１αまたはＰＰＡＲＧＣ１Ａ）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ペルオキシソームプロリフェレータ－活性化レセプターガンマコアクチベータ１ベータ（ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１βまたはＰＥＲＣ）、ペルオキシソームプロリフェレータ－活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲγ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＡＣＡ）、炭水化物－応答エレメント－結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰまたはＭＬＸ１ＰＬ）、ペルオキシソームプロリフェレータ－活性化レセプターアルファ（ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲＡ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ－２（ＤＧＡＴ２）および哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）が含まれる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＳＲＥＢＦ－１遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＭＴＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＰＰＡＲγ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＰＰＡＲα遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＭＬＸＩＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞におけるＤＧＡＴ２遺伝子の発現を少なくとも１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％だけ減少させる。

【0056】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはまた、ＢＡＴ細胞において上記に開示される肝代謝遺伝子の発現をモジュレートする。別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＬＤＬＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＡＰＯＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＰＥＲＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＭＬＸＰ１遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＭＴＯＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＰＰＡＲＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞におけるＤＧＡＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。

【0057】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはまた、ＷＡＴ細胞において上記に開示される肝代謝遺伝子の発現をモジュレートする。別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＬＤＬＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＭＴＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０倍、より好ましくは少なくとも５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０倍だけ増加させる。一実施形態において、一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＡＰＯＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＰＥＲＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、９５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＭＬＸ１ＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＭＴＯＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも５％、１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％だけ減少させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞におけるＤＧＡＴ遺伝子の発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、より好ましくは４０％、５０％だけ減少させる。

【0058】

別の実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、それを必要とする患者に投与することにより、インスリン抵抗性（ＩＲ）を低下させるか、またはインスリン感受性を高める方法が提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することによりＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、および脂肪症を治療する方法が提供される。肝細胞がインスリン抵抗性であり、インスリンを効果的に使用できない場合、高血糖症が発症する。その後、膵臓のベータ細胞はインスリンの産生を増加させ、高インスリン血症およびＩＩ型糖尿病を引き起こす。多くのレギュレータは、肝細胞のインスリン抵抗性に影響を及ぼす。たとえば、ステロール調節エレメント－結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ１またはＳＲＥＢＰ）は、コレステロールのマスターレギュレータであり、かつインスリン抵抗性の増加に関連している。コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）のアップレギュレーションは、インスリン抵抗性の増加に関連している。肝脂肪酸トランスロカーゼ／分化クラスター３６（ＦＡＴ／ＣＤ３６）のアップレギュレーションは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の患者においてインスリン抵抗性、高インスリン血症、脂肪症の増加に関連している。リポタンパク質リパーゼ遺伝子（ＬＰＬ）の肝特異的過剰発現は、肝特異的インスリン抵抗性を引き起こす。肝Ｘレセプター遺伝子（ＬＸＲ）は、肝臓においてステロール調節エレメント－結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）－１ｃ－誘導脂肪酸合成のインスリン媒介活性化に中心的役割を果たしている。他の因子には、トリグリセリド合成をレギュレートするジグリセリドアシルトランスフェラーゼ－２（ＤＧＡＴ２）および脂肪酸生合成をレギュレートする脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）が含まれる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞におけるＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは９０％だけ低減する。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞におけるＬＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０、３０、４０％、好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、より好ましくは少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、および４００％だけ増加させる。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞におけるＬＸＲ遺伝子の発現を少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、より好ましくは少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０および４００％、さらにより好ましくは少なくとも４５０、５００、５５０、６００％だけ増加させる。別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはＳＲＥＢＰ１遺伝子の発現を減少させる。別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはＤＧＡＴ２遺伝子の発現を減少させる。別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはＣＥＴＰ遺伝子の発現を減少させる。さらに別の実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡはＦＡＳＮ遺伝子の発現を減少させる。

【0059】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでモジュレートされ得るＮＡＦＬＤおよびＩＲ遺伝子の要約を表４に示す。表４における略語：ＮＡＦＬＤ：非アルコール性脂肪肝疾患、ＩＲ：インスリン抵抗性、ＤＮＬ：ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成、ＦＡ：脂肪酸、ＴＧ：トリグリセリド、ＬＰＬ：リポタンパク質リパーゼ、ＨＰ：肝リパーゼ、ＣＨＯＬ：コレステロール。

【0060】

【表5-1】

【0061】

【表5-2】

【0062】

【表6】

【0063】

本発明の一実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでの治療によりインビトロで血清コレステロールレベルを低減する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを用いると血清コレステロールレベルは、無治療の血清コレステロールレベルと比較して少なくとも２５％、好ましくは５０％、より好ましくは７５％だけ低減する。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することによりインビボで肝細胞におけるＬＤＬレベルおよびトリグリセリドレベルを低減する、およびＬＤＬの循環レベルを増加させる方法も提供される。循環ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での循環ＬＤＬレベルと比較して、少なくとも２倍、好ましくは３倍、好ましくは４倍、好ましくは５倍、好ましくは１０倍、好ましくは１５倍だけ増加しうる。肝トリグリセリドレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での肝トリグリセリドレベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ低減しうる。肝ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での肝ＬＤＬレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ低減しうる。

【0064】

本発明の一実施形態において、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することによりＮＡＦＬＤを治療する、および脂肪肝サイズを低減する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療された患者の脂肪肝のサイズは、無治療の患者と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％だけ低減される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより体重を低減する、および肥満を治療する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療された患者の体重は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ治療を受けない患者の体重よりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ減少する。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、１回、２回、３回、またはそれを超えて投与することができる。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより遊離脂肪酸の肝取り込みを減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより白色脂肪組織（ＷＡＴ）の炎症を低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することによりｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓におけるベータ酸化を増加させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓における褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を増加させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより肝脂質取込みを低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することによりＷＡＴにおける脂質生成を減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓における脂質貯蔵を減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓における脂質過負荷を低減する方法も提供される。

【0065】

別の実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは肝機能を向上させるために使用される。１つの非限定的な例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、アルブミン遺伝子発現を増加させることにより血清アルブミンレベルおよび非コンジュゲートビリルビンレベルを増加させる。アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ増加しうる。さらに好ましい実施形態において、アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する。別の非限定的な例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルファフェクトプロテイン（ＡＦＰ）、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の量を減少させる。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、またはＨＧＦの量は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、またはＨＧＦのいずれかの量と比較して、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ減少しうる。

【0066】

別の実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバーのレベルを調節するために投与される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの用量に依存して、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、およびＣ／ＥＢＰζの発現を増加させる。さらに別の実施形態において、細胞内のＣ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰβタンパク質アイソフォームの比率は、前記細胞と本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡとを接触させることにより調節される。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰαの４２ＫＤａアイソフォームが増加する。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰβの３０ｋＤａアイソフォームが増加する。

【0067】

外科ケア
肝切除、肝臓または肝組織の外科的切除は、肝不全、アルブミンおよび凝固因子の産生の低減を引き起こす可能性がある。肝切除後の適切な外科ケア（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｃａｒｅ）が必要とされる。いくつかの実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝再生の促進および生存率の増加のために肝切除後の外科ケアに使用される。

【0068】

過増殖障害
本発明の一実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、過増殖細胞の細胞増殖を低減するために使用される。過剰増殖性細胞の例には、癌性細胞、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、および芽細胞腫が含まれる。そのような癌性細胞は良性または悪性であり得る。過増殖細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、または乾癬などの自己免疫状態に起因する可能性がある。過増殖細胞はまた、過敏免疫系を有する患者がアレルゲンに接触することにより生じる可能性がある。過敏免疫系が関与するそのような状態には、限定されるものではないが、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、およびアレルギー性アナフィラキシーなどのアレルギー反応が含まれる。一実施形態において、腫瘍細胞の発達および／または成長が阻害される。好ましい実施形態において、固形腫瘍細胞の増殖が阻害される。別の好ましい実施形態において、腫瘍細胞の転移が防止される。別の好ましい例において、未分化腫瘍細胞の増殖が阻害される。

【0069】

細胞増殖の阻害または増殖の減少は、増殖が減少するか、または完全に停止することを意味する。したがって、「増殖の低減」は、「増殖の阻害」の実施形態である。細胞の増殖は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡで治療する前の前記細胞の増殖と比較して、または均等な未治療細胞の増殖と比較して、少なくとも２０％、３０％、もしくは４０％、または好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０、９０、もしくは９５％だけ低減される。細胞増殖が過増殖細胞において阻害される実施形態において、「均等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」な細胞は過増殖細胞でもある。好ましい実施形態において、増殖は、均等の健常な（非過増殖）細胞の増殖速度に匹敵する速度に低減される。別の見方をすると、「細胞増殖の阻害」の好ましい実施形態は、増殖の正常な健常レベルを達成するべく、過増殖を阻害することまたは細胞増殖をモジュレートすることである。

【0070】

非限定的な一例ではあるが、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、白血病細胞およびリンパ腫細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ジャーカット細胞（急性Ｔ細胞リンパ腫細胞系）、Ｋ５６２細胞（赤白血病細胞系）、Ｕ３７３細胞（神経膠芽細胞腫細胞系）および３２Ｄｐ２１０細胞（骨髄性白血病細胞系株）を含む。

【0071】

別の非限定的な例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、卵巣癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、ラット肝癌細胞、およびインスリノーマ細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ＰＥＯ１およびＰＥＯ４（卵巣癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌細胞系）、Ｐａｎｃ１（ヒト膵癌細胞系）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌細胞系）、ＤＵ１４５（ヒト転移前立腺癌細胞系）、ラット肝癌細胞、ならびにＭＩＮ６（ラットインスリノーマ細胞系）を含む。

【0072】

別の非限定的な例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、腫瘍細胞増殖を低減するためにＣ／ＥＢＰβ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて使用される。腫瘍細胞は、ＨｅｐＧ２細胞などの肝細胞癌細胞およびＭＣＦ７細胞などの乳癌細胞を含み得る。

【0073】

一実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、過増殖障害を治療するために使用される。腫瘍および癌は、特に興味深い過増殖障害であり、すべてのタイプの腫瘍および癌、たとえば、固形腫瘍および血液癌が含まれる。癌の例には、限定されるものではないが、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、胆嚢癌、肝癌、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、胃腸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（たとえば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病）、脳腫瘍（たとえば、星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫）、神経芽腫、肉腫、結腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、黒色腫、および他の皮膚癌が含まれる。肝癌には、限定されるものではないが、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、または肝細胞癌（ＨＣＣ）が含まれる。ＨＣＣは特に興味深い。

【0074】

原発性肝癌は、全世界で５番目に多い癌であり、癌関連死亡の３番目に多い原因である。ＨＣＣは原発性肝癌の大多数を占める［エル－セラグ（Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００７年、第１３２巻、第７号、ｐ．２５５７～２５７６（その内容はその全体が本明細書に開示される）］。ＨＣＣは、癌細胞生物学、免疫系、およびさまざまな病因（ウイルス、毒物、および一般物）を含むいくつかの因子の相互作用による影響を受ける。ＨＣＣ患者の大多数は、肝硬変を経て悪性腫瘍を発症する。現在、ほとんどの患者は進行した段階で診断されるので、ＨＣＣ患者の大多数の５年生存率は依然として悲惨である。外科的切除、局所切除、および肝移植は、現在、ＨＣＣが治癒する可能性を有する唯一の治療選択肢である。しかしながら、個別の肝機能および腫瘍負荷の評価に基づいて、患者の約５～１５％のみが外科的介入の対象となる。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持および傷害への反応に関与する多くの遺伝子のプロモータ領域に存在する（アルブミン、インターロイキン６反応、エネルギー恒常性、オルニチン回路調節、および血清アミロイドＡ発現を含む）。本発明は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をモジュレートするためにならびに肝硬変およびＨＣＣを治療するためにＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを利用する。

【0075】

本発明の方法は、腫瘍体積を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％だけ低減しうる。好ましくは、１つ以上の新しい腫瘍の発生が阻害され、例えば、本発明に従って治療された対象は、より少ないおよび／またはより小さい腫瘍を発生する。より少ない腫瘍とは、設定期間にわたり均等な対象よりも少ない数の腫瘍を発生することを意味する。たとえば、均等な対照（未治療）対象よりも少なくとも１、２、３、４、または５少ない腫瘍を発生する。より小さい腫瘍とは、腫瘍が均等な対象の腫瘍よりも重量および／または体積で少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、また９０％小さいことを意味する。本発明の方法は、腫瘍負荷を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％だけ低減する。

【0076】

設定された期間は、任意の適切な期間であり得る。たとえば、月数または年数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
１つの非限定的な例において、細胞、組織、器官、または対象と、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと、を接触させる工程を含む、未分化腫瘍の治療方法が提供される。未分化腫瘍は一般に、分化腫瘍と比較して予後が不良である。腫瘍の分化の程度は予後に関係しているので、分化生物学的因子の使用は有益な抗増殖薬剤でありうるという仮説が立てられる。Ｃ／ＥＢＰαは、骨髄分化を回復して急性骨髄性白血病の造血細胞の過増殖を予防することが知られている。好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療しうる未分化腫瘍としては、未分化小細胞肺癌腫、未分化膵腺癌、未分化ヒト膵癌、未分化ヒト転移前立腺癌、および未分化ヒト乳癌が含まれる。

【0077】

１つの非限定的な例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、標的化インビボ送達のためのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡデンドリマーと称されるＰＡＭＡＭデンドリマー中に複合体化される。静脈内注射されるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡデンドリマーの治療効果は、実施例１に示されるように臨床的に妥当なラット肝腫瘍モデルにて実証される。４８時間間隔で尾静脈注射により３回投与後、治療された肝硬変ラットは、１週間以内に血清アルブミンレベルの有意な増加を示した。肝腫瘍負荷は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡデンドリマー治療群で有意に減少した。活性化ＲＮＡ低分子による遺伝子標的化を全身静脈内投与で用いてＨＣＣ肝硬変ラットの肝機能の改善および腫瘍負荷の低減を同時に行えることが、この研究から初めて実証される。

【0078】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子をレギュレートするために使用される。好ましくは、癌遺伝子の発現はダウンレギュレートされ得る。癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％だけ低減する。さらなる好ましい実施形態において、癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ、低減される。好ましくは、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は阻害され得る。腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、さらにより好ましくは少なくとも１００％だけ増加する。さらなる好ましい実施形態において、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加される。癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の例としては、限定されるものではないが、Ｂｃｌ－２－関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、ディセーブルホモログ２－相互作用タンパク質（ＤＡＢ２１Ｐ）、肝癌欠失１（ＤＬＣ１）、Ｆａｓ表面デスレセプター（ＦＡＳ）、脆弱ヒスチジントライアド（ＦＨＩＴ）、成長停止・ＤＮＡ損傷－誘導ベータ（ＧＡＤＤ４５Ｂ）、ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ＨＨＩＰ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、リンパエンハンサー－結合因子１（ＬＥＦ１）、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、タンパク質チロシンキナーゼ２（ＰＴＫ２）、レチノブラストーマ１（ＲＢ１）、ｒｕｎｔ関連転写因子３（ＲＵＮＸ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、サイトカインシグナリングサプレッサー（３ＳＯＣＳ３）、トランスフォーミング成長因子ベータレセプターＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１０（ＴＮＦＳＦ１０）、ｐ５３、ディスインテグリン・メタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７（ＡＤＡＭ１７）、ｖ－ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１（ＡＫＴ１）、アンギオポイエチン２（ＡＮＧＰＴ２）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）、ＢＣＬ２様１（ＢＣＬ２Ｌ１）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有２（ＢＩＲＣ２）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５（ＢＩＲＣ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、サイクリンＤ２（ＣＣＮＤ２）、カドヘリン（ＣＤＨ１）、カドヘリン１３（ＣＤＨ１３）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、ＣＡＳＰ８・ＦＡＤＤ様アポトーシスレギュレータ（ＣＦＬＡＲ）、カテニン（カドヘリン関連タンパク質）ベータ１（ＣＴＮＮＢ１）、ケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ＥＰ３００）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）関連ビアデスドメイン（ＦＡＤＤ）、ｆｍ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）、フリズルドファミリーレセプター７（ＦＺＤ７）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼパイ１（ＧＳＴＰ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリンレセプター基質１（ＩＲＳ１）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）、キナーゼインサートドメインレセプター（ＫＤＲ）、骨髄細胞白血病配列１（ＭＣＬ１）、ｍｅｔ癌原遺伝子（ＭＥＴ）、ｍｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ｍｕｔＳホモログ３（ＭＳＨ３）、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＭＹＣ）、Ｂ細胞カッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー核因子１（ＮＦＫＢ１）、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ－ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子様（ＯＰＣＭＬ）、血小板由来成長因子レセプター、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ、ＮＩＭＡ相互作用１（ＰＩＮ１）、プロスタグランジンエンドペルオキサイドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、ＰＹＤ・ＣＡＲＤドメイン含有（ＰＹＣＡＲＤ）、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ＲＡＣ１）、Ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ－６）ドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）、リーリン（ＲＥＬＮ）、ｒａｓホモログファミリーメンバーＡ（ＲＨＯＡ）、分泌フリズルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー７（ＳＭＡＤ７）、サイトカインシグナリングサプレッサー１（ＳＯＣＳ１）、シグナルトランスデューサ・転写アクチベータ３（ＳＴＡＴ３）、転写因子４（ＴＣＦ４）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦＡ）、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、アポトーシスＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）、およびＹｅｓ関連タンパク質１（ＹＡＰ１）が含まれる。

【0079】

一実施形態において、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより白血球数を増加させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを患者に投与することにより、敗血症または慢性炎症疾患（たとえば、肝炎および肝硬変）を有する患者および免疫無防備患者（たとえば、化学療法を受けている患者）の白血球減少を治療する方法も提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、白血病およびリンパ腫を含むプレＢ細胞およびＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法も提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、白血球、造血幹細胞、または間葉幹細胞を動員する方法も提供される。一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療された患者の白血球数は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ治療なしと比較して、少なくとも５０％、７５％、１００％、より好ましくは少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５倍、より好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０倍だけ増加する。

【0080】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞癌の治療においてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）をレギュレートするために使用される。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現をレギュレートする低分子非コードＲＮＡである。それらは重要な生理学的機能に関与しており、発癌のそれぞれの工程に関与し得る。それらは典型的には２１ヌクレオチドを有し、前記ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによりｍＲＮＡ翻訳の遮断またはｍＲＮＡ分解の誘導を介して転写後レベルで遺伝子発現をレギュレートする。

【0081】

腫瘍において、ｍｉＲＮＡ発現のレギュレーションは腫瘍発生に影響を及ぼす。ＨＣＣでは、他の癌の場合と同様に、ｍｉＲＮＡは、細胞の成長および増殖、細胞の代謝および分化、アポトーシス、血管新生、転移、および最終的には予後に影響を及ぼす癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子のいずれかとして機能する。［リン（Ｌｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００８年、第３７５巻、ｐ．３１５～３２０、クタイ（Ｋｕｔａｙ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年、第９９巻、ｐ．６７１～６７８、メング（Ｍｅｎｇ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００７年、第１３３巻、第２号、ｐ．６４７～６５８（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現および／または機能をモジュレートするとともにＨＣＣ細胞でｍｉＲＮＡレベルをレギュレートする。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによりレギュレートしうるｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２－５ｐが含まれる。

【0082】

１つの非限定的な例において、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡであり、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下ではＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下と比較して、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、２．５、および３だけダウンレギュレートされる。別の非限定的な例において、ｍｉＲＮＡは腫瘍抑制ｍｉＲＮＡであり、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下ではＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの不在下と比較して、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１倍、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけアップレギュレートされる。

【0083】

他の治療法との組み合わせ
本発明のｓａＲＮＡは、考慮されている特定の方法に有効であることが知られている追加の活性剤または治療法との組み合わせで提供することもできる。例えば、ｓａＲＮＡと、追加の活性剤または治療法と、を含む併用療法は、代謝調節、外科ケア、過増殖性障害、および／または幹細胞調節を含む、本明細書に記載される任意の障害を治療するために、それを必要とする任意の患者に与えられ得る。

【0084】

追加の活性剤は、ｓａＲＮＡと同時にまたは順次に投与されてもよい。追加の活性剤は、ｓａＲＮＡとの混合物で投与されてもよいし、またはｓａＲＮＡとは別に投与されてもよい。

【0085】

本明細書で使用される「同時に投与される」という用語は、特に限定されず、併用療法の成分、すなわち、本発明のｓａＲＮＡおよび追加の活性剤が、実質的に同時に、例えば混合物として、あるいは直後の続く順序で、投与されることを意味する。

【0086】

本明細書で使用される「順次に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、特に限定されず、併用療法の成分、すなわち、本発明のｓａＲＮＡおよび追加の活性剤が、同時に投与されるのではなく、次々と、または群において、投与と投与との間の特定の時間間隔で投与されることを意味する。時間間隔は、併用療法の成分のそれぞれの投与間で同じであってもまたは異なっていてもよく、例えば、２分～９６時間、１～７日または１、２または３週間の範囲から選択することができる。一般に、投与と投与との間の時間間隔は、数分から数時間の範囲、例えば、２分～７２時間、３０分～２４時間、または１～１２時間の範囲であり得る。さらなる例には、２４～９６時間、１２～３６時間、８～２４時間、および６～１２時間の範囲の時間間隔が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、追加の活性剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、追加の活性剤は、本発明のｓａＲＮＡの前に投与される。

【0087】

本発明のｓａＲＮＡおよび追加の活性剤のモル比は、特に制限されない。例えば、２つの成分が組成物中に組み合わされる場合、２つの成分間のモル比は、１：５００～５００：１、または１：１００～１００：１、または１：５０～５０：１、または１：２０～２０：１、または１：５～５：１、または１：１、の範囲であり得る。組成物に３つ以上の成分を組み合わせる場合も同様のモル比が適用される。各成分は、それぞれ、組成物の約１％～１０％、又は約１０％～約２０％、又は約２０％～約３０％、又は約３０％～４０％、又は約４０％～５０％、又は約５０％～６０％、又は約６０％～７０％、又は約７０％～８０％、又は約８０％～９０％、又は約９０％～９９％の所定のモル重量パーセントを含み得る。

【0088】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、異なる標的遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡとともに投与される。非限定的な例には、アルブミン、インスリン、またはＨＮＦ４Ａ遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡが含まれる。任意の遺伝子をモジュレートすることは、単一のｓａＲＮＡまたは２つ以上の異なるｓａＲＮＡの組み合わせを使用して達成することができる。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと共に投与することができるｓａＲＮＡの非限定的な例としては、以下のものが含まれる：２０１２年６月２０日に出願された国際公開第ＷＯ２０１２／１７５９５８号に開示されている、アルブミン又はＨＮＦ４ＡをモジュレートするｓａＲＮＡ、両方とも２０１１年１０月１０日に出願された国際公開第ＷＯ２０１２／０４６０８４号及び第ＷＯ２０１２／０４６０８５号に開示されている、インスリンをモジュレートするｓａＲＮＡ、２００６年１１月１３日に出願された米国特許第７，７０９，４５６号明細書、及び２０１０年４月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号明細書に開示されている、ヒトプロゲステロンレセプター、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ｈＭＶＰ）、Ｅ－カドヘリン遺伝子、ｐ５３遺伝子、またはＰＴＥＮ遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡ、および２００６年４月１１日に出願された国際公開第ＷＯ２００６／１１３２４６号に開示されている、ｐ２１遺伝子を標的とするｓａＲＮＡ（これらに文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0089】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子、すなわちＣ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとともに投与される。

【0090】

一実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、代謝、特に肝機能をレギュレートする１つまたは複数の薬物とともに投与される。非限定的な例において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、スタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、クロフィブレート、フェノフィブリン、トコトリエノール、植物ステロール、胆汁酸捕捉剤、プロブコール、またはそれらの組み合わせのような、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール値を減少させる薬物とともに投与される。また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、オリビグ（Ｏｒｖｉｇ）らの米国特許第６２８７５８６号明細書に開示されているバナジウムビグアニド複合体とともに投与されてもよい。別の例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）らの国際公開第ＷＯ２０１１０２８３８号（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されている組成物とともに投与して、血清コレステロールを低下させることができる。この組成物は、ＰＣＳＫ９タンパク質に選択的に結合および阻害する抗原結合タンパク質；および細胞でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するＲＮＡエフェクター剤を含む。さらに別の例において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ブルックス－ウィルソン（Ｂｒｏｏｋｓ－Ｗｉｌｓｏｎ）らの欧州特許第１８５４８８０号明細書（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に記載の、コレステロールレベルをモジュレートする、ＡＢＣ１生物活性を有するＡＢＣ１ポリペプチド、またはＡＢＣ１活性を有するＡＢＣ１ポリペプチドをコードする核酸とともに投与されてもよい。

【0091】

別の実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、メトホルミン、スルホニル尿素、非スルホニル尿素分泌促進剤、αグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グルカゴン様ペプチド－１類似体およびジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤、またはそれらの組み合わせ等の、インスリン感受性を増加させるか又はＩＩ型糖尿病を治療する薬物と共に投与される。本発明のｓａＲＮＡと組み合わせて投与することができる他の肝保護剤は、アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、８２巻、３１５～３２２頁（２００６年）（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されている。

【0092】

ＦＧＦＲ４阻害剤
線維芽細胞成長因子レセプター４（ＦＧＦＲ４）遺伝子は、線維芽細胞成長因子に対するチロシンキナーゼおよび細胞表面レセプターであるＦＧＦＲ４タンパク質をコードする。ＦＧＦＲ４タンパク質は、細胞増殖、分化、および遊走；脂質代謝；胆汁酸生合成；グルコース取り込み；およびリン酸のホメオスタシス、に関与する経路をレギュレートする。線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）／ＦＧＦＲ４シグナル伝達複合体を介した異常なシグナル伝達は、マウスにおいて肝細胞癌（ＨＣＣ）に関わることが示されており、ヒトで同様の役割をする可能性がある。

【0093】

本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＦＧＦＲ４レベルをダウンレギュレートするか、またはＦＧＦＲ４レセプターシグナル伝達を阻害する１つまたは複数の治療薬と組み合わせて使用することができる。これらの併用は、限定されるものではないが、ＨＣＣなどの任意の癌の予防および／または治療に相乗効果を有する可能性がある。ＦＧＦＲ４レベルをダウンレギュレートするか、またはＦＧＦＲ４シグナル伝達を阻害する治療剤は、ＦＧＦＲ４阻害剤であり得る。

【0094】

いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ４阻害剤は、ＦＧＦＲ４遺伝子の発現を低減させる低分子阻害ＲＮＡ（ＦＧＦＲ４－ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。ＦＧＦＲ４－ｓｉＲＮＡの非限定的な例には、ｓｉＲＮＡ ｓ５１７６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。

【0095】

いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ４阻害剤は、ＦＧＦＲ４アンタゴニスト抗体である。ＦＧＦＲ４抗体の非限定的な例には、Ｕ３－１７８４が含まれる。
いくつかの実施形態において、ＦＧＦＲ４阻害剤は、低分子阻害剤である。低分子ＦＧＦＲ４阻害剤の非限定的な例には、ＢＧＪ３９８（ノバルティス）、Ｈ３Ｂ－６５２７（Ｈ３ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ＢＬＵ－９９３１（ＢｌｕｅＰｒｉｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）、およびＢＬＵ－５５４（ＢｌｕｅＰｒｉｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）が含まれる。

【0096】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと少なくとも１つのＦＧＦＲ４阻害剤との併用療法を受けている患者は、ＨＣＣを有し得る。患者は最初にＦＧＦＲ４阻害剤で治療され、その後Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療されるか；最初にＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療され、その後ＦＧＦＲ４阻害剤で治療されるか；またはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡとＦＧＦＲ４阻害剤の両方を含む組成物で治療され得る。

【0097】

Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤
Ｃ／ＥＢＰβ（またはＣＥＢＰＢ）は、サイトカインとケモカインをコードする遺伝子の発現をモジュレートし、細胞周期進行とアポトーシスをレギュレートすることにより腫瘍形成を促進する。Ｃ／ＥＢＰβノックダウンは、転写因子ペルオキシソーム増殖因子－活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の発現を刺激し、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）をＣＥＢＰＡプロモータから除去することにより、ＣＥＢＰＡ発現を活性化することが以前に示されている（Ｚｕｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．２８１：７９６０（２００６））。肝再生時にはＣ／ＥＢＰαとＣ／ＥＢＰβとの間に動的相互作用がある。Ｃ／ＥＢＰαのＣ／ＥＢＰβに対する比率が高いと、細胞周期および急性期応答遺伝子を抑制し、代謝遺伝子を活性化することによって細胞増殖が抑制されるが、Ｃ／ＥＢＰαのＣ／ＥＢＰβに対する比率が低いと逆の効果がある。しかしながら、肝腫瘍発生をレギュレートする潜在的ツールとしてのこれらの転写因子の役割は依然として不明である。

【0098】

本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰβレベルをダウンレギュレートする１以上の治療剤と組み合わせて使用することができる。これらの併用は、限定されるものではないが、ＨＣＣなどの任意の癌の予防および／または治療に相乗効果を有する可能性がある。Ｃ／ＥＢＰβレベルをダウンレギュレートする治療剤は、Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤であり得る。

【0099】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤は、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の発現を低下させる低分子阻害ＲＮＡ（Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。

【0100】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤は、Ｃ／ＥＢＰβアンタゴニスト抗体である。
いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤は、低分子阻害剤である。

【0101】

いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと少なくとも１つのＣ／ＥＢＰβ阻害剤との併用療法を受けている患者はＨＣＣを有する可能性がある。患者は最初にＣ／ＥＢＰβ阻害剤で治療され、その後Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療されるか；最初にＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療され、その後Ｃ／ＥＢＰβ阻害剤で治療されるか；またはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡとＣ／ＥＢＰβ阻害剤の両方を含む組成物で治療され得る。

【0102】

免疫療法
いくつかの実施形態において、本出願のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡおよび／または組成物は、外科的治療、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法などの別の療法、および／または他の任意の抗腫瘍治療法と組み合わせることができる。

【0103】

本明細書で使用される場合、「免疫療法」という用語は、対象の腫瘍細胞を破壊するために免疫応答を誘発および／または増強することができる任意の治療法を指す。
いくつかの実施形態において、本出願のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡおよび／または組成物は、癌ワクチンおよび／または免疫チェックポイント阻害剤などの補完的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）免疫療法剤と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、疾患の予防および／または治療のための免疫を生成するための組成物を指す。

【0104】

いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４に対するアンタゴニスト剤、例えば抗体、抗体の機能的フラグメント、ポリペプチド、またはポリペプチドの機能的フラグメント、またはＣＴＬＡ－４に高親和性で結合することができ、かつＢ７－１／２（ＣＤ８０／８６）とＣＴＬＡ－４との相互作用を妨げるペプチドであり得る。一例において、ＣＴＬＡ－４アンタゴニストは、アンタゴニスト抗体、またはその機能的フラグメントである。適切な抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体には、限定されるものではないが、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ－４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ）、トレメリムマブ（完全にヒト化）、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ－４アドネクチン、抗ＣＴＬＡ－４ドメイン抗体、一本鎖抗ＣＴＬＡ－４抗体フラグメント、重鎖抗ＣＴＬＡ－４フラグメント、軽鎖抗ＣＴＬＡ－４フラグメント、および米国特許第８７４８８１５号明細書；米国特許第８５２９９０２号明細書；米国特許第８３１８９１６号明細書；米国特許第８０１７１１４号明細書；米国特許第７７４４８７５号明細書；米国特許第７６０５２３８号明細書；米国特許第７４６５４４６号明細書；米国特許第７１０９００３号明細書；米国特許第７１３２２８１号明細書；米国特許第６９８４７２０号明細書；米国特許第６６８２７３６号明細書；米国特許第６２０７１５６号明細書；米国特許第５９７７３１８号明細書；欧州特許第ＥＰ１２１２４２２Ｂ１号明細書；および米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号明細書および米国特許出願公開第２００２／０８６０１４号明細書；およびハービッツ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、第９５巻、第１７号、１００６７－１００７１頁に開示されている抗体が含まれる（これらの刊行物のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0105】

さらなる抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト剤には、限定されるものではないが、リガンドＣＤ８０／８６に結合するＣＴＬＡ－４の能力を破壊することができる任意の阻害剤が含まれる。

【0106】

いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１経路を遮断するために使用される薬剤であって、拮抗ペプチド／抗体および可溶性ＰＤ－Ｌ１リガンドを含み得る（表５を参照のこと）。

【0107】

【表7】

【0108】

いくつかの実施形態において、本願のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡおよび／または組成物は、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）療法などの遺伝子療法と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ療法は、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む任意の治療を指す。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、１つ以上の免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）剤と組み合わせて使用され得る。これらの併用は、限定されるものではないが、ＨＣＣなどの任意の癌の予防および／または治療に相乗効果を有する可能性がある。

【0110】

いくつかの実施形態において、ＩＣＢは低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。
いくつかの実施形態において、ＩＣＢは抗体である。

【0111】

いくつかの実施形態において、ＩＣＢは低分子である。
いくつかの実施形態において、ＩＣＢは表５のチェックポイント阻害剤中の任意の薬剤である。

【0112】

いくつかの実施形態において、ＩＣＢはペンブロルジマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｕｚｉｍａｂ）、トレメリムマブ、デュルバルマブまたはニボルマブである。
いくつかの実施形態において、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと少なくとも１つのＩＣＢの併用療法を受けている患者は、ＨＣＣを有し得る。患者は最初にＩＣＢで治療され、その後Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療されるか；最初にＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療され、その後ＩＣＢで治療されるか；またはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡとＩＣＢの両方を含む組成物で治療され得る。

【0113】

高周波アブレーション（ＲＦＡ）
高周波アブレーション（ＲＦＡ）は、高周波交流によって生成され、電極チップを通して適用される熱を用いて腫瘍が破壊されるプロセスである。ＲＦＡは臨床診療におけるＨＣＣの標準治療選択肢の１つであり、有意な生存利益と関連する。ＲＦＡ後、腫瘍の局所凝固壊死は体内に残り、炎症誘発性シグナルを提供して、腫瘍に対する宿主適応免疫応答を誘発する可能性のある腫瘍抗原の供給源となる大量の細胞デブリの放出を誘導する。エビデンスは、腫瘍の熱によるアブレーションが自然免疫系および適応免疫系の両方のモジュレーションを誘導し、樹状細胞の効率的な負荷、増強された抗原提示および増幅された腫瘍特異的Ｔ細胞応答を介して抗腫瘍免疫応答を誘導することを示唆している。

【0114】

いくつかの実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＲＦＡプロセスと組み合わせて使用され得る。患者は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでの治療前、治療中、または治療後にＲＦＡを受けることができる。患者はさらに、ＰＤ－１阻害剤治療などの免疫療法を受けることができる。

【0115】

チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、Ｃ／ＥＢＰ－αの機能の喪失は、腫瘍免疫微小環境において骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増加をもたらし、その結果、マウスの癌モデルにおいて腫瘍増殖が増大した。ＭＤＳＣは、ＭＤＳＣが癌治療に対して腫瘍耐性を提供する可能性がある癌におけるものを含め、様々な疾患の促進において重要な役割を果たすものとして同定されている。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）などの様々な癌治療の有効性を改善するために使用され得る。

【0116】

いくつかの実施形態において、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、１つ以上のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用され得る。ＴＫＩは、さまざまな悪性腫瘍の標的治療に効果的である。チロシンキナーゼ阻害剤の非限定的な例には、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、およびレンバチニブが含まれる。

【0117】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴＫＩは、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでの治療後に投与される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴＫＩは、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと同時に投与される。

【0118】

ＩＩＩ．キットおよびデバイス
キット
本発明は、本発明の方法を便利におよび／または効果的に実行するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を実行すること、および／または複数の実験を実行することを可能にするのに十分な量および／または数の成分を含むであろう。

【0119】

一実施形態において、本明細書に記載のｓａＲＮＡを含むキットは、増殖細胞と共に使用して効力を示しうる。
一実施形態において、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、またはＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、他の遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡの組合せを含む、インビトロまたはインビボで遺伝子の発現をレギュレートするためのキットを提供する。キットは、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含み得る。送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイド、デンドリマー、または本明細書に開示される任意の送達剤を含み得る。遺伝子の非限定的な例としては、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバー、アルブミン遺伝子、アルファフェクトプロテイン遺伝子、肝特異的因子遺伝子、成長因子、核因子遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、多能性因子遺伝子が含まれる。

【0120】

１つの非限定的な例において、緩衝液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および／またはＥＤＴＡを含み得る。別の非限定的な例において、緩衝液は、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムとマンノースとを含む塩化ナトリウム（米国特許出願公開第２０１２／０２５８０４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を含み得る。さらに別の非限定的な例において、緩衝液を沈殿させるか、または凍結乾燥することができる。各成分の量は、一貫性して再現性のある高濃度の生理食塩水または単純な緩衝液処方物が得られるように変更することができる。成分はまた、ある期間にわたりおよび／またはさまざまな条件下で緩衝溶液中のｓａＲＮＡの安定性を増加させるために変更することができる。

【0121】

別の実施形態において、本発明は、細胞に導入したときに細胞増殖を阻害するのに有効な量で提供される本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと、任意選択的に標的細胞の増殖をさらにレギュレートするためのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡと、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞増殖をレギュレートするためのキットを提供する。

【0122】

別の実施形態において、本発明は、本発明のｓａＲＮＡ分子と、任意選択的にＬＤＬ低減薬剤と、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞のＬＤＬレベルを低減するためのキットを提供する。

【0123】

別の実施形態において、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと、任意選択的にｓｉＲＮＡ、ｅＲＮＡ、およびｌｎｃＲＮＡと、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞のｍｉＲＮＡ発現レベルをレギュレートするためのキットを提供する。

【0124】

別の実施形態において、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡおよび少なくとも１つの他の活性成分または治療法を含む併用療法のためのキットを提供する。
デバイス
本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、必要とする対象、たとえばヒト患者に即時に送達するために利用可能な安定な製剤を含有する。そのような対象の非限定的な例としては、過増殖障害、たとえば、癌、腫瘍、または肝硬変、および代謝障害（たとえば、ＮＡＦＬＤ、肥満、高ＬＤＬコレステロール、またはＩＩ型糖尿病）を有する対象が含まれる。

【0125】

いくつかの実施形態において、デバイスは、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡおよび少なくとも１つの他の活性成分または治療法を含む併用療法の成分を含む。
デバイスの非限定的な例には、ポンプ、カテーテル、針、経真皮パッチ、加圧経鼻送達デバイス、イオントフォレーシスデバイス、多層マイクロ流体デバイスが含まれる。デバイスは、単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを送達するために使用することができる。デバイスは、生体組織を横切って、真皮内に、皮下に、または筋肉内に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを送達するために使用することができる。オリゴヌクレオチドの送達に好適なデバイスのより多くの例は、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第ＷＯ２０１３／０９０６４８号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0126】

定義
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の使用と本節に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、この節の定義を優先するものとする。

【0127】

約：本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載された値の＋／－１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で使用される場合、「組み合わせて投与される」または「組み合わせ投与」という用語は、２つ以上の薬剤、例えばｓａＲＮＡを対象に同時にまたは患者に対する各薬剤の作用がオーバーラップしうるインターバル内で投与することを意味する。いくつかの実施形態において、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、組み合わせ（例えば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に接近した時間で行われる。

【0128】

アミノ酸：本明細書で使用される場合、１つまたは複数の「アミノ酸」という用語は、すべての天然に存在するＬ－アルファ－アミノ酸を指す。アミノ酸は、次のように一文字または三文字の表記により同定される：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リシン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、ここでは最初にアミノ酸、続いてカッコ内にそれぞれ三文字コードおよび一文字コードが列記される。

【0129】

動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発生段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発生段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物は、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および虫を含む。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子工学操作動物、またはクローンである。

【0130】

およそ：本明細書で使用される場合、「おおよそ」または「約」という用語は、関心のある１つまたは複数の値に適用される場合、記載された参照値と同様の値を指す。特定の実施形態において、「おおよそ」または「約」という用語は、特に明記されていない限りまたは特に文脈から自明でない限り、明記された参照値のいずれの方向にも（それよりも大きい方向にも小さい方向にも）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも少ない範囲内に入る値の範囲を指す（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

【0131】

会合：本明細書で用いられる場合、「会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」、「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」、「結合（ｌｉｎｋｅｄ）」、「装着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、および「テザー連結（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」という用語は、２つ以上の部分に対して用いられる場合、直接にまたはリンク剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または接続されて、構造が用いられる条件下で、たとえば、生理学的条件下で、これらの部分が、物理的に会合された状態を維持するように、十分に安定な構造を形成することを意味する。「会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、厳密に直接の共有化学結合を介する必要はない。それは、イオン結合、水素結合、または「会合」要素が物理的会合を維持するように十分に安定なハイブリダイゼーションに基づく結合をも示唆しうる。

【0132】

二機能性：本明細書で使用される場合、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能が可能であるか、またはそれを維持する任意の物質、分子または部分を指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与える可能性がある。機能を生成する構造は同じでも異なっていてもよい。

【0133】

生体適合性：本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、生細胞、組織、傷害のリスクをほとんどまたはまったく示さない器官もしくは系、毒性、または免疫系による拒絶に適合しうることを意味する。

【0134】

生分解性：本明細書で使用される場合、「生分解性」という用語は、生物の作用によって無害な産物に分解することができることを意味する。
生物学的活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という句は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されたときにその生物に生物学的影響を与える物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡの一部であっても生物学的に活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると見なされ得る。

【0135】

癌：本明細書で使用される場合、個体における「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞に典型的な特性、たとえば、無制御な増殖、不死、転移能、速い成長および増殖の速度、ならびに特徴的なモルフォロジー特性を有する細胞の存在を指す。多くの場合、癌細胞は腫瘍の形態であるが、そのような細胞は個体内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞などの独立した細胞として血流を循環する場合もある。

【0136】

細胞成長：本明細書で使用される場合、「細胞成長」という用語は、細胞複製（すなわち増殖）により生じる細胞数の増大に主に関連付けられ、その速度は細胞死（たとえば、アポトーシスまたは壊死による）の速度よりも大きく、細胞集団のサイズの増加をもたらすが、特定の状況下では、その成長のごく一部は、個別細胞の細胞サイズまたは細胞質体積の増加にも起因する。したがって、細胞増殖を阻害する薬剤は、増殖を阻害するか、細胞死を刺激するか、またはその両方によってそのようにすることができ、その結果、これらの２つの対立するプロセス間の平衡が変化する。

【0137】

細胞型：本明細書で使用される場合、「細胞型」という用語は、所与の起源（たとえば、組織、器官）の細胞、または所与の分化状態の細胞、または所与の病理もしくは遺伝子構成に関連付けられる細胞を意味する。

【0138】

染色体：本明細書で使用される場合、「染色体」という用語は、細胞に見られるＤＮＡおよびタンパク質の組織化された構造を指す。
相補的：本明細書で使用される場合、核酸に関する「相補的」という用語は、ヌクレオチド間または核酸間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合を意味し、たとえば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間またはオリゴヌクレオチドプローブと標的との間などは相補的である。

【0139】

状態：本明細書で使用される場合、「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、任意の細胞、器官、器官系または生物の状態を指す。状態は、疾患の状態、または単にエンティティの生理学的症状または状況を反映している場合がある。状態は、疾患の肉眼的提示などの表現型状態、または状態に関連する基礎となる遺伝子またはタンパク質発現プロファイルなどの遺伝子型状態として特徴付けられ得る。状態は良性または悪性であり得る。

【0140】

制御放出：本明細書で使用される場合、「制御放出」という用語は、治療結果をもたらすために特定の放出パターンに一致する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。

【0141】

細胞静止：本明細書で使用される場合、「細胞静止」は、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せの成長、分裂、または増殖の阻害、低減、抑制を指す。

【0142】

細胞傷害性：本明細書で使用される場合、「細胞傷害性」は、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを死滅させることまたはそれらに有害作用、毒性作用、もしくは致命的作用を引き起こすことを指す。

【0143】

送達：本明細書で使用される場合、「送達」は、化合物、物質、エンティティ、部分、カーゴ（ｃａｒｇｏ）またはペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を送達する行為または方法を指す。

【0144】

送達剤：本明細書で使用される場合、「送達剤」は、標的細胞への本発明のｓａＲＮＡのインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用される場合、「不安定」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発点、野生型または天然型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。

【0145】

検出可能な標識：本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で知られている方法によって容易に検出される別のエンティティへの付着、組み込み、または会合が行われる１つまたは複数のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、染料、金属イオン、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびハプテン）、量子ドットなどが含まれる。検出可能な標識は、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド、たとえば、本明細書に開示されるｓａＲＮＡの任意の位置に配置できる。それらは、場合によっては、Ｎ末端もしくはＣ末端または５’末端もしくは３’末端に位置するアミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド中に存在し得る。

【0146】

カプセル化：本明細書で使用される場合、「カプセル化する」という用語は、密封、包囲、または収容を意味する。
工学操作：本明細書で使用される場合、本発明の実施形態は、構造的か化学的かにかかわらず、出発点、野生型、または天然型の分子と異なる特徴または性質を有するように設計される場合、「工学操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」される。

【0147】

均等な対象：本明細書で使用される場合、「均等な対象（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、たとえば、類似の年齢、性別、および健康の対象、たとえば、肝臓の健康もしくは癌の病期の対象、または本発明に係る治療を行う前の同一の対象であり得る。均等な対象は、本発明によるｓａＲＮＡによる治療を受けないという点で「未治療」である。しかしながら、本発明のｓａＲＮＡで治療される対象が同一のまたは均等な従来の抗癌治療を受けるのであれば、従来の抗癌治療を受けてもよい。

【0148】

エキソソーム：本明細書で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞によって分泌されるベシクルである。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベントのうちの１つまたは複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（たとえば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（たとえば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。

【0149】

特徴：本明細書で使用される場合、「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」は、特性、性質、または特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくとも本発明のｓａＲＮＡおよび送達剤を含む。

【0150】

フラグメント：本明細書で使用される「フラグメント」は、一部を指す。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。

【0151】

機能性：本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴づけられる性質および／または活性を示す形態の生体分子である。
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体を産生するために必要な制御配列と、ほとんどの場合コード配列と、を含む核酸配列を指す。しかしながら、遺伝子は翻訳されなくてもよく、代わりに調節または構造ＲＮＡ分子をコードする場合がある。

【0152】

遺伝子は、植物、菌類、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核、核、もしくはプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学合成ＤＮＡを含めて、全体または一部が当技術分野で公知の任意の起源に由来し得る。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、または発現制御の方法に影響を及ぼし得る１つ以上の修飾をコード領域または非翻訳領域のいずれかに含有しうる。このような修飾には、限定されるものではないが、１つまたは複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換が含まれる。遺伝子は非中断コード配列を構成しうるか、または適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含み得る。

【0153】

遺伝子発現：本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、核酸配列が転写に成功し、ほとんどの場合、翻訳されてタンパク質またはペプチドを生成するプロセスを指す。明確にするために、「遺伝子発現」の測定に言及する場合、測定は転写の核酸産物、たとえばＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは翻訳のアミノ酸産物、たとえばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味すると理解すべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定する方法は、当技術分野において周知である。

【0154】

ゲノム：「ゲノム」という用語は、核ＤＮＡ成分、染色体または染色体外のＤＮＡ、ならびに細胞質ドメイン（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含む、生物の全ＤＮＡ補体を含むことを意図している。

【0155】

相同性：本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、さらには９９％であれば、相同であると見なされる。いくつかの実施形態において、相同ポリヌクレオチド配列は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸のストレッチをコードする能力により決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一であれば、相同であると見なされる。

【0156】

「過増殖細胞」という用語は、均等な健常細胞（「対照」と称されることがある）の増殖速度と比較して異常に高い速度で増殖している任意の細胞を指し得る。「均等な健常」細胞とは、細胞の正常な健常カウンターパートである。したがって、それは、同一のタイプの細胞、たとえば、コンパレータ細胞と同一の機能を行う、同一の器官由来の細胞である。たとえば、過増殖肝細胞の増殖は健常肝細胞を基準にして評価されるべきであり、一方、過増殖前立腺細胞の増殖は健常前立腺細胞を基準にして評価されるべきである。

【0157】

増殖の「異常に高い」速度とは、過増殖細胞の増殖速度が均等な健常（非過増殖）細胞の増殖速度と比較して、少なくとも２０、３０、４０％、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、または少なくとも８０％だけ増加することを意味する。増殖の「異常に高い」速度とはまた、均等な健常細胞の増殖速度と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する速度を意味する。

【0158】

本明細書で使用される「過増殖細胞」という用語は、ほとんどの細胞と比較してより高速で自然に増殖するが、健康な細胞である細胞を指すものではない。生涯を通じて絶えず分裂することが知られている細胞の例は、皮膚細胞、胃腸管の細胞、血液細胞、骨髄細胞である。しかしながら、そのような細胞がそれらのカウンターパートよりも速い速度で増殖する場合、それらは過増殖である。

【0159】

過増殖障害：本明細書で使用される場合、「過増殖障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、上記で定義された過増殖細胞が関与する任意の障害であり得る。過増殖障害の例としては、新生物障害（たとえば癌）、乾癬性関節炎、関節リウマチ、胃過増殖障害（たとえば炎症性腸疾患）、皮膚障害（たとえば乾癬、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、および角化障害の過増殖異型障害）が含まれる。

【0160】

当業者は、過増殖細胞を同定する方法を完全に熟知している。動物内の過増殖細胞の存在は、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャンなどのスキャンを用いて同定することができる。ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳまたはＷＳＴ－１アッセイなどの細胞増殖アッセイを使用してインビトロでサンプルを培養することにより、過増殖細胞を同定することもでき、または細胞の増殖をアッセイすることもできる。インビトロでの細胞増殖は、フローサイトメトリーを使用して決定することもできる。

【0161】

同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。たとえば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適比較目的で２つの配列をアライメントすることにより、行うことが可能である（たとえば、最適アライメントになるように第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較目的では異なる配列を無視することが可能である）。特定の実施形態において、比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置でヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列が最適アライメントになるように導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、バイオコンピューティング：インフォマティクスとゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年、フォン・ヘインジ，Ｇ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ）著、分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第Ｉ部、フマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージ、１９９４年、ならびにグリプスコウ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｍストックトン・プレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年（それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような方法を用いて決定可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤー（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、第４巻、ｐ．１１～１７）により、決定可能である。代替的に、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムにより、決定可能である。配列間の同一性パーセントを決定するのに一般に利用される方法は、限定されるものではないが、カリロ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、１９８８年、第４８巻、ｐ．１０７３（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含む。同一性を決定するための技術は、公的に入手可能なコンピュータプログラムの形態で体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的コンピュータソフトウェアは、限定されるものではないが、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、「ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＣＧ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年、第１２巻、第１号、ｐ．３８７、アルツシュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、「ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ」、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３を含む。

【0162】

遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現を阻害する」という表現は、遺伝子の発現産物の量の減少を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を使用して決定することができる。

【0163】

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境下、たとえば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こるイベントを意味する。

【0164】

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物、あるいはそれらの細胞またはそれらの組織）内で発生するイベントを指す。

【0165】

単離された：本明細書で使用される場合、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、一体化された成分（自然環境または実験現場のいずれであるかにかかわらず）の少なくとも一部から分離された物質または要素を指す。単離された物質は、一体化されていた物質に対してさまざまなレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはより多くから分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書で使用される場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まないのであれば、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、たとえば、本開示の化合物が富化された組成物を含み得る。実質的な分離は、本開示に係る化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含み得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野では慣用されているものである。

【0166】

標識：「標識」という用語は、物質、化合物、または対象物が検出可能であるように、対象物に組み込まれる物質または化合物を指す。
リンカー：本明細書で使用される場合、リンカーとは原子団（たとえば、１０～１，０００原子）を指し、限定されるものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、イミンなどの原子または基で構成可能である。リンカーは、第１の末端を修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドの核酸塩基または糖部分に、かつ第２の末端を検出可能剤または治療剤などのペイロードに装着可能である。リンカーは、核酸配列への組み込みを妨害しない十分な長さであり得る。リンカーは、本明細書に記載されるように、ｓａＲＨＡコンジュゲートを形成するため、ならびにペイロードを投与するためなど、任意の有用な目的のために使用することができる。リンカーに組込み可能な化学基の例としては、限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが含まれ、それらは、それぞれ本明細書に記載されるように任意選択的に置換可能である。リンカーの例には、限定されるものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（たとえば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、たとえば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマー、ならびにそれらの誘導体が含まれる。他の例は、限定されるものではないが、たとえばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などの切断可能な部分をリンカー中に含んで還元剤または光分解を用いて切断可能である。選択的に切断可能な結合の非限定的な例には、たとえばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤および／または光分解を用いて切断可能なアミド結合、さらにはたとえば酸加水分解もしくは塩基加水分解により切断可能なエステル結合が含まれる。

【0167】

転移：本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、癌が原発腫瘍として最初に発生した場所から体内の離れた位置に広がるプロセスを意味する。転移はまた、原発腫瘍の拡大に起因する癌も指す。たとえば、乳癌に罹患した人は、自身のリンパ系、肝臓、骨、または肺に転移を示すことがある。

【0168】

修飾：本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含む多くの方法で修飾することができる。一実施形態において、本発明のｓａＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。

【0169】

天然に存在する：本明細書で使用される場合、「天然に存在する」とは、人為的な支援を受けることなく天然に存在することを意味する。
核酸：本明細書で使用される「核酸」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方から構成される分子を指す。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合、５’→３’結合を介して結合一体化される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドポリマーは、一本鎖または二本鎖であり得る。しかしながら、結合は当技術分野で公知の結合のいずれかを含むことができ、たとえば、核酸は５’→３’結合を含む。ヌクレオチドは、天然に存在する場合もあれば、天然に存在する塩基対と塩基対関係を形成することができる合成的に生成された類似体であり得る。塩基対合関係を形成可能な天然に存在しない塩基の例は、限定されるものではないが、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素原子および窒素原子の１つ以上がヘテロ原子、たとえば、酸素、硫黄、セレン、リンなどにより置換された他のヘテロ環塩基アナログを含み得る。

【0170】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を求めているかまたは必要とする可能性がある、治療を必要とする、治療を受けている、治療を受ける予定である対象、または特定の疾患または状態について訓練を受けた専門家の管理下にある対象を指す。

【0171】

ペプチド：本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。

【0172】

薬学的に許容可能：「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書においては、妥当な便益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を意味する。

【0173】

薬学的に許容可能な賦形剤：本明細書で使用される「薬学的に許容可能な賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外で患者において実質的に非毒性かつ非炎症性の性質を有する任意の成分を意味する（たとえば、活性化合物の懸濁または溶解が可能なビヒクル）。賦形剤としては、たとえば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤またはコーティング剤、フレーバー、香料、滑剤（流動促進剤）、滑沢剤、保存剤、印刷用インク、収着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味剤、および水和水が含まれる。例示的な賦形剤には、限定されるものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（２塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリコール酸デンプン、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトール、が含まれる。

【0174】

薬学的に許容可能な塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」は、既存の酸部分または塩基部分をその塩形に変換することにより（たとえば、遊離塩基基と好適な有機酸とを反応させることにより）親化合物が修飾された開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例には、限定されるものではないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸性塩、カルボン酸などの酸残基のアルカリ塩または有機塩などが含まれる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオン、たとえば、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが含まれる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、親化合物の従来型の非毒性塩、たとえば、非毒性の無機酸または有機酸から生成されたものを含む。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基部分または酸部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成可能である。一般に、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離の酸形または塩基形と化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより、調製可能であり、一般的には、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルバニア州イーストン、１９８５年、ｐ．１４１８、Ｐ．Ｈ．スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワーマス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ、ワイリー－ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８年、ならびにベルジェ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７年、第６６巻、ｐ．１～１９（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。

【0175】

薬学的に許容可能な溶媒和物：本明細書で使用される「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される投与量で生理学的に許容できる。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿により調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（たとえば、一、二、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、エチルアセテート、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、ベンジルベンゾエートなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。

【0176】

薬理学的効果：本明細書で使用される場合、「薬理学的効果」は、生物または系が外因性薬剤と接触または曝露された後に発生する、生物または系における測定可能な生物学的現象である。薬理学的効果は、治療上有効なアウトカム、たとえば、１つ以上の症状の治療や改善、疾患、障害、病態、または感染の診断、予防、およびそれらの発症の遅延をもたらしうる。このような生物学的現象の測定は、定量的、定性的、または他の生物学的現象に対して相対的であり得る。定量的測定は統計的に有意であり得る。定性的測定は、程度または種類であり得るとともに、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えて異なり得る。それらは、存在するまたは不在である、より良好であるかまたはより悪い、より多いかまたはより少ない、として観測可能である。外因性薬剤は、薬理学的効果に言及する場合、全体的または部分的に、生物または系に対して外来性である薬剤である。たとえば、野生型のバイオ分子への修飾は、構造的であろうと化学的であろうと、外因性の薬剤を生成するであろう。同様に、生物または系では天然に見いだされない化合物、分子、または物質への野生型分子の組込みまたはそれらと野生型分子との組合せも外因性薬剤を生じるであろう。本発明のｓａＲＮＡは外因性薬剤を含む。薬理学的効果の例としては、限定されるものではないが、細胞数の変化、たとえば、好中球、網状赤血球、顆粒球、赤血球（赤血球）、巨核球、血小板、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、または網状赤血球の増加または減少が含まれる。薬理学的効果にはまた、血液化学、ｐＨ、ヘモグロビン、ヘマトクリットの変化、酵素、たとえば限定されるものではないが肝酵素ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルの変化、脂質プロファイル、電解質、代謝マーカー、ホルモン、または当業者に公知の他のマーカーもしくはプロファイルの変化が含まれる。

【0177】

物理化学的：本明細書で使用される場合、「物理化学的」とは、物理的および／または化学的な性質の、またはそれに関連することを意味する。
予防：本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、および／もしくは病態の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは臨床病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、感染、特定の疾患、障害、および／もしくは病態からの進行を部分的にもしくは完全に遅延すること、ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病理発生のリスクを減少させることを意味する。

【0178】

プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを含む。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、物質、分子、または要素が化学的または物理的な変化を受けたときに治療剤として作用すると見なされる形態をとる任意の物質、分子、または要素を指す。プロドラッグは、共有結合されていても、何らかの方法で捕獲されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後、活性薬剤部分を放出するかまたはそれに変換される。プロドラッグは、慣例的な操作によりまたはインビボで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより、調製することができる。プロドラッグには、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与されたときにそれぞれ遊離のヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基を生成するように切断される任意の基に結合されている化合物が含まれる。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、第１４巻、ならびにエドワードＢ．ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびパーガモンプレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。

【0179】

予後予測：本明細書で使用される場合、「予後予測（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」という用語は、特定の生物学的イベントが将来起こるであろうことまたは起こる可能性が非常に高いことの陳述または主張を意味する。

【0180】

進行：本明細書で使用される場合、「進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」または「癌の進行」という用語は、疾患もしくは病態のまたはそれらに向かう促進もしくは悪化を意味する。

【0181】

増殖：本明細書で使用される場合、「増殖する」という用語は、成長、拡大または増加すること、または急速に成長、拡大または増加させることを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖」とは、増殖性に対向する、または不敵である性質を有することを意味する。

【0182】

タンパク質：「タンパク質」は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。本明細書で使用されるこの用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。しかしながら、通常、タンパク質は少なくとも５０アミノ酸長であろう。場合によっては、コードされたタンパク質は約５０アミノ酸よりも小さい。この場合、ポリペプチドはペプチドと称される。タンパク質が短いペプチドの場合、少なくとも約１０アミノ酸残基長であろう。タンパク質は、天然に存在するもの、組換えられたもの、合成されたもの、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはペプチドのフラグメントを含む場合もある。タンパク質は、単一分子であっても、多分子複合体であってもよい。タンパク質という用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。

【0183】

タンパク質発現：「タンパク質発現」という用語は、検出可能なレベルのアミノ酸配列またはタンパク質が発現されるように、核酸配列が翻訳を受けるプロセスを指す。
精製された：本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製された」、「精製」は、望ましくない成分、材料汚染、混合または不完全性から実質的に純粋または清澄にすることを意味する。

【0184】

退縮：本明細書で使用される場合、「退縮（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）」または「退縮の程度」という用語は、表現型または遺伝子型のいずれかでの、癌の進行の逆転を指す。癌の進行の遅延または停止は、退縮と見なされ得る。

【0185】

サンプル：本明細書で使用される場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、その組織、細胞、または構成部分（たとえば、限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液、および精液を含む体液）の一部を意味する。サンプルは、たとえば、限定されるものではないが、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、外側皮膚切片、呼吸管、腸管、および泌尿生殖管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含む、全生物体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは一部分から調製されるホモジネート、ライセート、または抽出物をさらに含みうる。サンプルはさらに、タンパク質分子または核酸分子のような細胞成分を含有している可能性がある媒体、たとえば、栄養ブロスまたはゲルを指す。

【0186】

シグナル配列：本明細書で使用される場合、「シグナル配列」という句は、タンパク質の輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
単回ユニット用量：本明細書で使用される場合、「単回ユニット用量（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）」は、１回の用量／一度に／単一の経路／単一の接触点、すなわち単回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。

【0187】

類似性：本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互のパーセント類似性の計算は、パーセント同一性の計算と同じ方法で実行することができるが、例外としてパーセント類似性の計算は、当技術分野で理解されているように保存的置換を考慮に入れる。

【0188】

分割用量：本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単回ユニット用量または全一日用量を２つ以上に分割した用量のことである。
安定：本明細書で使用される場合、「安定」は、反応混合物から有用な純度への単離に耐えるのに十分なロバスト性のある、好ましくは、有効な治療剤への製剤化が可能である化合物を指す。

【0189】

安定化された：本明細書で使用される場合、「安定化する」「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすることまたは安定になることを意味する。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、たとえば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で、本発明に係る組成物が投与されうる任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、ヒトなど哺乳動物）および／または植物が含まれる。

【0190】

実質的に：本明細書で使用する場合、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、対象の特徴または性質の全体またはほぼ全体の範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学の分野の当業者は、生物学的および化学的な現象が、最終状態に達することおよび／または完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あっても稀であるものと理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象に固有の完全性の欠如の可能性を取り込むように本明細書において用いられる。

【0191】

実質的に等しい：用量間の時間差に関連して本明細書で使用される場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：複数の用量に関連して本明細書で使用される場合、この用語は、２秒以内を意味する。

【0192】

に罹患している：疾患、障害、および／または病態に「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または病態と診断されているまたはそれらの１つ以上の症状を呈する。
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または病態「に罹患しやすい（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ）」個体は、疾患、障害、および／または病態の症状で診断されていないか、かつ／またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または病態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または病態に関連付けられるタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低減、（４）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる習性および／または生活習慣、（５）疾患、障害、および／または病態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる微生物への暴露および／またはその感染。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または病態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生するであろう。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または病態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生しないであろう。

【0193】

持続放出：本明細書で使用される場合、「持続放出」という用語は、特定の期間にわたり放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：「合成」という用語は、人間の手によって製造、準備、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。

【0194】

標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、目的の任意の１つまたは複数の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官に見出され得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、そして最も好ましくは患者であり得る。

【0195】

治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療効果、診断効果、および／または予防効果を有し、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。

【0196】

治療上有効量：本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に投与したとき、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発生を診断、予防、および／または遅延するのに十分である送達されるべき薬剤（たとえば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。

【0197】

治療上有効な結果：本明細書で使用される場合、「治療上有効な結果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ）」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発症を診断、予防、および／または遅延するのに十分な結果を意味する。

【0198】

全一日用量：本明細書で使用される場合、「全一日用量」は、２４時間の期間に与えられるかまたは処方される量である。それは、単回ユニット用量として投与され得る。
転写因子：本明細書で使用される場合、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写のみの調節を行うが、他のものは、他のタンパク質と協奏的に作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行うことが可能である。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域の特定のコンセンサス配列に高度に類似した１つもしくは複数の特異的標的配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、または他の分子との複合体で調節し得る。

【0199】

治療：本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／または病態を部分的にまたは完全に緩和、寛解、改善、軽減したり、その発症を遅延したり、その進行を阻害したり、その重症度を低減したり、かつ／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の出現を低減したりすることを指す。例えば、癌の「治療」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡大を阻害することを指す場合がある。治療は、疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病変を発生するリスクを低減する目的で、疾患、障害、および／もしくは病態の早期徴候を呈する対象に施すことが可能である。

【0200】

「治療方法」なる語句またはその均等語は、例えば、癌に適用される場合、個体において癌細胞の数を低減、排除、もしくは予防するようにまたは癌の症状を軽減するように設計された手順または行動方針を意味する。癌または他の増殖性障害を「治療する方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際上完全に排除されること、細胞数もしくは障害が実際上低減されること、または癌もしくは他の障害の症状が実際上軽減されることを必ずしも意味するとは限らない。多くの場合、癌を治療する方法は、成功の可能性が低い場合でも実施されるが、個体の病歴と推定平均余命を考慮して、それでも全体的に有益な行動方針と見なされる。

【0201】

腫瘍成長：本明細書で使用される場合、「腫瘍成長」または「腫瘍転移成長」という用語は、特に明記しない限り、腫瘍学で一般的に使用されるように使用され、この用語は、主に腫瘍細胞成長の結果としての腫瘍または腫瘍転移の増加量または増加体積に主に関連付けられる。

【0202】

腫瘍負荷：本明細書で使用される場合、「腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）」という用語は、対象が有する直径が３ｍｍを超えるすべての腫瘍結節の総腫瘍体積を指す。
腫瘍体積：本明細書で使用される場合、「腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）」という用語は、腫瘍のサイズを指す。ｍｍ^３単位の腫瘍体積は、式：体積＝（幅）^２×長さ／２により計算される。

【0203】

非修飾：本明細書で使用される場合、「非修飾」とは、何らかの方法で変更される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾は、常にというわけではないが、野生型または天然型の生体分子を指す場合がある。分子は一連の修飾を受ける可能性があり、それにより、修飾された各分子は、それに続く修飾のための「非修飾」出発分子として役立ち得る。

【0204】

均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。

【0205】

特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」のような冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、そうでなければ関連する場合、満たされると考えられる。本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、そうでなければ関連する、実施形態を含む。本発明は、グループのメンバーの２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、利用されるか、そうでなければ関連する、実施形態を含む。

【0206】

また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンであることが意図され、追加の要素またはステップの組込みを許容することにも留意されたい。
範囲が指定されている場合、端点（ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）が含まれる。さらに、特に指定がない限り、または文脈および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、本発明の異なる実施形態における記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、その範囲の下限の単位の１０分の１単位まで想定できることを理解されたい。

【0207】

さらに、先行技術に包含される本発明の特定の実施形態はいずれも請求項の任意の１項以上から明示的に除外されうると理解されるべきである。そのような実施形態は当業者に公知であると見なされるので、除外が本明細書で明示的に示されていない場合でも、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（たとえば、任意の核酸、それによりコードされたタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）はいずれも、先行技術の存在の有無にかかわらず、任意の理由で任意の１つまたは複数の請求項から除外され得る。

【0208】

引用された全ての出典、たとえば、本明細書に引用された参考文献、刊行物、データベース、データベース項目、および技術はすべて、たとえ引用に明確に記載されていないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典と本出願の記述が矛盾する場合は、本出願の記述を優先するものとする。

【0209】

本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。

【実施例0210】

実施例１．ＣＥＢＰＡ－５１およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの調製
ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを調製するための材料と手順は、国際公開第ＷＯ２０１５／０７５５５７号および国際公開第ＷＯ２０１６／１７０３４９号（ミナ セラピューティクス リミテッド（ＭｉＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ））に開示されている。ＣＥＢＰＡ－５１およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの調製は、国際公開第ＷＯ２０１６／１７０３４９号の実施例に開示されている。

【0211】

簡単に言えば、ホスホロアミダイトモノマーを逐次的にカップリングさせることによりＣＥＢＰＡ－５１の各鎖を固体担体上に合成した。合成は、自動シンセサイザー、たとえば、アクタ・オリゴパイロット１００（Ａｋｔａ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））および固体担体が充填された合成反応器（カラムタイプ）に対して特定の体積の試薬および溶媒の送入／送出を行うテクニクロム（Ｔｅｃｈｎｉｋｒｏｍ）シンセサイザー（アサヒ・カセイ・バイオ（Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ Ｂｉｏ））を用いて実施した。このプロセスは、反応器に接続された指定のリザーバに試薬を充填し、適切な固体支持体で反応槽に充填することから始めた。試薬と溶媒の流れは、流量および圧力を自動的に記録する一連のコンピュータ制御のバルブとポンプによって調整した。固相法は、合成の各ステップで溶液相中の試薬から反応生成物が固相に結合されるので、固体担体を溶媒で洗浄することにより反応生成物を効率的に分離することが可能であった。

【0212】

ＣＥＢＰＡ－５１を周囲温度で酢酸ナトリウム／スクロース緩衝液ｐＨ４．０に溶解し、脂質を５５℃の無水エタノールに溶解した。リポソームは、クロスフローエタノール注入技術によって調製した。リポソーム形成直後に、懸濁液をｐＨ９．０の塩化ナトリウム／リン酸緩衝液で希釈した。捕集した中間生成物を０．２μｍの細孔サイズのポリカーボネート膜に通して押し出した。限外濾過により目標ｓａＲＮＡ濃度を達成した。ｐＨ７．５のスクロース／リン酸緩衝液を用いて後続の透析濾過により非カプセル化薬剤物質および残留エタノールを除去した。その後、濃縮リポソーム懸濁液を０．２μｍ濾過し、５±３℃で貯蔵した。最後に、バルク生成物を製剤化し、０．２μｍで濾過し、２０ｍｌバイアル中に充填した。

【0213】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、注入用の濃縮液として提示した。各バイアルは、約７．５のｐＨの２０ｍｌのスクロース／リン酸緩衝液中に５０ｍｇのＣＥＢＰＡ－５１（ｓａＲＮＡ）を含有する。

【0214】

実施例２．ＦＧＦＲ４阻害剤と組み合わせたＣＥＢＰＡ－５１
ＦＧＦＲ４－ｓｉＲＮＡ
方法
細胞培養
一般
ＨｅｐＢ３細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ－グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中５％ＣＯ２インキュベータで増殖させた。トランスフェクションは、２μＬのリポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））／ウェルを２４ウェルプレート中で使用して実施した。

【0215】

ＳｉＦＧＦＲ４
使用したオリゴは以下のとおりであった：ｓｉＦＧＦＲ４（ｓ５１７６、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、陰性対照オリゴヌクレオチドおよびＣＥＰＢＡ－５１。ＨｅｐＢ３細胞を１×１０^５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。播種時に細胞をオリゴ（ｏｌｉｇｏ）で逆トランスフェクトし、２４時間後に順方向トランスフェクトし、播種後７２時間にＲＮＡを収集した。

【0216】

【表8】

【0217】

ＨｅｐＢ３細胞を１×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、播種時にオリゴで逆トランスフェクトし、２４時間後に順方向トランスフェクトした。ＷＳＴ細胞生存率アッセイは、製造業者の指示書に従って実施した（２４時間のＷＳＴインキュベーションを使用）。ＷＳＴ単独シグナルは、セル－ＷＳＴシグナルから差し引かれている。

【0218】

ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ－ＰＣＴ
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアーゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用いて培養細胞からＲＮＡを単離した。ＲＮＡはＱｉａｘｐｅｒｔ（登録商標）（キアーゲン）を使用して定量し、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（キアーゲン）を使用して逆転写した。Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５（キアーゲン）でＱｕａｎｔｉｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアーゲン）を用いたｑＰＣＲにより相対発現レベルを測定した。以下のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマーアッセイ（キアーゲン）を使用した：ＣＥＢＰＡ＿１＿ＳＧ、ＦＧＦＲ４＿１＿ＳＧおよびＧＡＰＤＨ＿１＿ＳＧ。相対発現は、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化されたＤＤＣｔ法によって決定した。

【0219】

結果
ｍＲＮＡレベルに対する単一または併用治療（ｓｉＦＧＦＲ４およびＣＥＢＰＡ－５１）の効果をｑＲＴ－ＰＣＲによってモニターした。ＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡでＨｅｐ３Ｂ細胞を処理すると、ＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡレベルが有意に低下した。しかしながら、ＣＥＢＰＡ－５１による処理は、ＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡレベルに有意な影響を及ぼさなかった（表６Ａを参照）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞をＣＥＰＢＡ－５１またはｓｉＦＧＦＲ４で処理すると、ＣＥＰＢＡ ｍＲＮＡレベルが増加した。併用治療（混合物中のｓｉＦＧＦＲ４およびＣＥＰＢＡ－５１）は、ＣＥＰＢＡレベルを、ｓｉＦＧＦＲ４またはＣＥＰＢＡ－５１単独で観察されたレベルを超えてさらに増加させた（表６Ｂを参照）。ＮＣ：負の対照オリゴヌクレオチド。

【0220】

【表9】

【0221】

【表10】

【0222】

ＦＧＦＲ４ ｍＲＮＡまたはＣＥＰＢＡ－５１を標的とするｓｉＲＮＡでＨｅｐ３Ｂ細胞を処理すると、細胞生存率が低下した。ｓｉＦＧＦＲ４およびＣＥＰＢＡ－５１の両方の併用による処理は、ＷＳＴ１増殖アッセイでモニターした場合、細胞生存率がさらに低下した（表７Ａ、９６時間、表７Ｂ、１２０時間）。

【0223】

【表11】

【0224】

【表12】

【0225】

結論
ｓｉＦＧＦＲ４とＣＥＰＢＡ－５１との併用による処理は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＣＥＰＢＡ－ｍＲＮＡレベルを増加させ、結果として細胞生存性を低下させることにおいてより効果的である。全体として、これらのデータは、ＦＧＦＲ４阻害剤とＣＥＰＢＡ－５１との併用治療が肝臓癌の実行可能な治療戦略である可能性があることを示唆するものである。

【0226】

２．ＦＧＦＲ４阻害抗体
別の研究では、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、１．０×１０^５細胞／ウェルで、２４ウェルプレート中で、３０ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＦＧＦＲ４治療用抗体（ＸＰＡ．４８．０５６；クリエイティブ・バイオラブス（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ））の存在下で、適宜播種した。細胞を、播種時に１０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－５１ ｓａＲＮＡ、１０ｎＭ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｌｉｇｏ（ＮＣ）またはトランスフェクション剤単独（モック）のいずれかでトランスフェクトし、これを播種後２４時間で繰り返し、培地を４８時間で交換した。ＦＧＦＲ抗体処理は実験を通して維持された。細胞を、播種後７２時間でＲＮＡ収集のために回収し、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。

【0227】

表６に示すように、ＣＥＢＰＡ－５１とＦＧＦＲ抗体との組み合わせは、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現の最大の増加をもたらした。

【0228】

【表13】

【0229】

Ｈｅｐ３Ｂ細胞をＦＧＦＲ４抗体で処理すると、細胞生存率が低下した。ＦＧＦＲ４抗体およびＣＥＰＢＡ－５１の両方の併用による処理は、ＷＳＴ１増殖アッセイでモニターした場合、細胞生存率がさらに低下した（表９Ａ、９６時間、表９Ｂ、１２０時間）。

【0230】

【表14】

【0231】

【表15】

【0232】

実施例３．ＣＥＢＰＢ阻害剤と組み合わせたＣＥＢＰＡ－５１
ＣＥＢＰＡ活性化またはＣＥＢＰＢ抑制はＨＣＣ細胞遊走を阻害する。
細胞遊走（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、腫瘍細胞の浸潤および転移を含む、細胞過程において重要な役割を果たす。Ｈｅｐ３Ｂ細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）能力はＨｅｐＧ２細胞のそれよりはるかに高いので、細胞遊走に対するＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡおよびＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡの効果を調べ、これら２つの処理のいずれかがＨｅｐ３Ｂ細胞の遊走を減少させるかどうかを決定した。処理された細胞の移動を測定するために、トランスウェル移動アッセイを実施した。１０倍顕微鏡下でランダムに選択した９視野から計数した相対的細胞移動を記録した。トランスフェクトされていないＨｅｐ３Ｂ細胞と比較して、ＣＥＢＰＡ活性化またはＣＥＢＰＢ抑制は細胞遊走の有意な減少をもたらした（それぞれ０．８倍、または０．６倍）。

【0233】

【表16】

【0234】

ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡおよびＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡの相乗作用。
ＨＣＣにおけるＣＥＢＰＡとその下流標的ＣＥＢＰＢおよびｐ２１との相乗活性を調べるために、その下流標的に対するｓｉＲＮＡまたはｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのコトランスフェクションをＨｅｐＧ２細胞で行った。ＣＤＫＮ１Ａ－ｓａＲＮＡがコトランスフェクションにより誘導されるｐ２１活性化に影響するかどうかを同定するために、ＣＤＫＮ１Ａ－ｓａＲＮＡのトランスフェクションも含めた。

【0235】

対照群の細胞は、トランスフェクトされていないか、２０ｎＭまたは５０ｎＭのスクランブルされた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓａＲＮＡ、１０ｎＭのスクランブルされたｓｉＲＮＡ＋２０ｎＭのスクランブルされたｓａＲＮＡ、１０ｎＭのスクランブルされたｓｉＲＮＡ＋５０ｎＭのスクランブルされたｓａＲＮＡ、または１０ｎＭのスクランブルされたｓｉＲＮＡ＋７０ｎＭのスクランブルされたｓａＲＮＡでトランスフェクトした。単回処理した細胞を、２０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡまたは５０ｎＭ ＣＥＫＮ１Ａ－ｓａＲＮＡでトランスフェクトした。２つの組み合わせ（ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｍｂｏ）で処理する細胞をＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋ＣＤＫＮ１Ａ－ｓａＲＮＡ（５０ｎＭ）またはＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）でトランスフェクトした。３つの組み合わせ（ｔｒｉｐｌｅ ｃｏｍｂｏ）で処理する細胞をＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋ＣＤＫＮ１Ａ－ｓａＲＮＡ（５０ｎＭ）またはＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）でトランスフェクトした。

【0236】

トランスフェクションされていない細胞と比較して、ＣＥＢＰＡ発現の増加（２倍以上）とＣＥＢＰＢ発現の減少（０．４倍以上）が、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡとＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡとをコトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞で観察された。驚くべきことに、他の処理（単回、ダブルまたはトリプルトランスフェクション）と比較して、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡとＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡとのコトランスフェクションは、ＣＥＢＰＡ、ｐ２１（５．５倍）およびアルブミン（２．５倍）の発現を増加させ、トランスフェクションされていない対照に対して最も大きかった（ｔｈｅ ｍｏｓｔ）。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの存在下でのＣＥＢＰＢ阻害は、ＨＣＣ細胞において他の処理（単回、ダブルまたはトリプルトランスフェクション）よりもＣＥＢＰＡとｐ２１の両方のより大きな活性化を有するため、より良好な抗増殖反応を有すると推定された。

【0237】

ＨＣＣ細胞数および増殖に対するＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡと組み合わせたＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの効果を、ＨＣＣ細胞におけるＳＲＢおよびＷＳＴ－１アッセイを用いて検討した。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞を、標準９６ウェルプレート中で増殖させ、２０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ、１０ｎＭ ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ、２０ｎＭスクランブルｓｉＲＮＡ、２０ｎＭスクランブルｓａＲＮＡ、スクランブルｓａＲＮＡ（１０ｎＭ）＋スクランブルｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、またはスクランブルｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋スクランブルｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）でトランスフェクトした。細胞はまた、潜在的な相乗効果を調べるために、ｓａＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのさまざまな組み合わせでトランスフェクトした：ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（１０ｎＭ）＋ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）；またはＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）。細胞傷害性は、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して測定した。各処理後のＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３ＢおよびＰＬＦ／ＰＲＣ／５細胞の絶対細胞数を、吸光分光分析プレートリーダーで測定したＯＤ値に基づいて確立した滴定曲線を用いて計算した。ＷＳＴ－１アッセイを使用して細胞増殖を評価し、ＯＤ値を１０分間隔で測定した。

【0238】

２０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡおよび１０ｎＭ ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡはいずれも、細胞数および細胞増殖を減少させた。２０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡはＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞において１０ｎＭ ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡよりもはるかに良好に作用したが、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞においてはわずかに良好であった。すべての細胞において、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）およびＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）とのコトランスフェクション後に、細胞数および細胞増殖の最大の減少が観察された。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）＋ＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の組み合わせによるトランスフェクション後の細胞数の減少は、分化したＨｅｐＧ２（０．７倍）およびＨｅｐ３Ｂ（０．８倍）細胞のみならず、驚くべきことに、未分化のＰＬＣ／ＰＲＦ／５（０．６５倍）細胞においても観察された。さらに、トランスフェクションされていない細胞と比較して、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（２０ｎＭ）およびＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）の組み合わせは、すべての細胞型で相対的な細胞増殖を最も減少させた。未分化のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の細胞増殖は、分化したＨｅｐＧ２細胞（０．８倍／８０％減少）およびＨｅｐ３Ｂ細胞（０．７５倍／７５％減少）と同様に０．７倍（７０％減少）に減少した。これらの結果から、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡにあまり応答しない未分化のＨＣＣは、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡおよびＣＥＢＰＢ－ｓｉＲＮＡの機能的な共処理によってＣＥＢＰＡのＣＥＢＰＢに対する比を高めることで反応性を逆転させることが可能であることが示唆された。ＣＥＢＰＢノックダウンは、分化したＨＣＣのバランスを高度に増殖する表現型にシフトさせた可能性がある。

【0239】

実施例４．ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ併用療法は、前臨床ＨＣＣモデルにおける高周波アブレーションおよびＰＤ－１阻害の免疫学的抗腫瘍応答を向上させる
腫瘍細胞に対するＴ細胞の活性化および細胞性免疫応答を引き起こすＰＤ－１阻害剤であるニボルマブは、ＣＨＥＣＫＭＡＴＥ－０４０試験のサブグループに基づき、ＨＣＣの二次治療に対するＦＤＡの迅速承認を得た。ニボルマブで治療した患者の全奏効率は１４．３％（９５％信頼区間：９．２、２０．８）で、完全奏効３例、部分奏効１９例であった。奏効期間は３．２か月～３８．２＋か月であった；奏効例の９１％は６か月以上持続する奏効を示し、５５％は１２か月以上持続する奏効を示した。

【0240】

高周波アブレーション（ＲＦＡ）は、高周波交流によって生成され、電極チップを通して適用される熱を用いて腫瘍が破壊されるプロセスである。ＲＦＡは臨床診療におけるＨＣＣの標準治療選択肢の１つであり、有意な生存利益と関連する。ＲＦＡ後、腫瘍の局所凝固壊死は体内に残り、炎症誘発性シグナルを提供して、腫瘍に対する宿主適応免疫応答を誘発する可能性のある腫瘍抗原の供給源となる大量の細胞デブリの放出を誘導する。エビデンスは、腫瘍の熱によるアブレーションが自然免疫系および適応免疫系の両方のモジュレーションを誘導し、樹状細胞の効率的な負荷、増強された抗原提示および増幅された腫瘍特異的Ｔ細胞応答を介して抗腫瘍免疫応答を誘導することを示唆している。

【0241】

この研究では、ＨＣＣに対するＭＴＬ－ＣＥＢＰａの腫瘍学的有効性が、前臨床モデルにおける免疫調節応答における相乗作用を介してＰＤ－１阻害とＲＦＡとの併用治療によって増強されるかどうかを評価した。この研究の目的は、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ、抗ＰＤ－１およびＲＦＡの併用療法の臨床応答を評価し、治療後の脾臓細胞と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の変化を特徴づけることであった。

【0242】

方法
ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡのＲＦＡおよび免疫チェックポイント阻害との相乗効果を調べるために、同系ＢＮＬ肝細胞癌腫瘍細胞を免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群ｎ＝８）の２つの反対側腹に注射した逆翻訳実験を行った。肝細胞癌を担持するマウスの処置には以下が含まれる：１）一方の側腹（ｏｎｅ ｆｌａｎｋ）にＲＦＡ（０日目）；２）免疫療法（ＰＤ－１阻害、ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（米国ニューハンプシャー州ウエストレバノン（ＷｅｓｔＬｅｂａｎｏｎ）、２００μｇＩＶ／マウス／用量、０、２および５日目）；および３）ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ（３ｍｇ／ｋｇＩＶ／マウス／用量、０、２および５日目）、ならびに、３つの全ての介入の組み合わせ。

【0243】

材料および方法
マウスＢＡＬＢ／ｃマウスは、バイオラスコ コーポレーション（ＢｉｏＬａｓｃｏ Ｃｏ．）（台湾、台北）から購入した。動物実験は、国立台湾大学医学部の施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認に従って実施した。マウスは、従来の特定病原体を含まない施設で飼育した。

【0244】

腫瘍細胞系
ＢＡＬＢ／ｃ由来マウス肝細胞癌細胞系ＢＮＬ １ＭＥ Ａ．７Ｒ．１（ビーエヌエル（ＢＮＬ）；米国バージニア州マナサスのＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質（ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、およびアムホテリシン２５μｇ／ｍＬ）（米国、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は５％ＣＯ_２加湿インキュベータ内にて３７℃で増殖させた。

【0245】

動物モデル
６４匹の雄のＢＡＢＬ／ｃマウス（６週齢；バイオラスコ コーポレーション、台湾）を、５×１０^５個の細胞を含む５０μＬのＢＮＬ細胞懸濁液の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、両側腹部に異種移植した。

【0246】

実験群
マウスは、以下の８つの実験群（８匹の動物／群）の１つにランダムに割り当てた。
１．対照群
２．ＲＦＡ群（Ｒ）：ＲＦＡのみで処置
３．抗－ＰＤ１群（Ｐ）：抗ＰＤ１のみで処置
４．ＣＥＢＰａ群（Ｃ）：ＣＥＢＰａのみで処置
５．抗ＰＤ１＋ＣＥＢＰａ群（Ｐ＋Ｃ）：ＣＥＢＰａおよび抗ＰＤ１で処置
６．ＲＦＡ＋抗ＰＤ１群（Ｒ＋Ｐ）：ＲＦＡおよび抗ＰＤ１で処置
７．ＲＦＡ＋ＣＥＢＰａ群（Ｒ＋Ｃ）：ＲＦＡおよびＣＥＢＰａで処置
８．ＲＦＡ＋抗ＰＤ１＋ＣＥＢＰａ群（Ｒ＋Ｐ＋Ｃ）：ＲＦＡ、ＣＥＢＰａおよび抗ＰＤ１で処置
処置スケジュール
癌細胞注入から４週間後、腫瘍が約１．５×１．５ｃｍの直径に達したとき、両側の腫瘍のうちの１つを０日目としてＲＦＡで処置した。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ（３ｍｇ／ｋｇ）は、ＲＦＡ処置後０、２および５日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって投与された。抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（米国ニューハンプシャー州ウエストレバノン（ＷｅｓｔＬｅｂａｎｏｎ））を、２００μｇ／マウス／用量で、ＲＦＡ処置後０、２および５日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。腫瘍の大きさはマイクロキャリパーを用いて評価し、腫瘍体積を次の式を用いて計算した：体積＝長さ×（幅）^２×０．５。７日目にマウスをと殺した。研究デザインのタイムラインを図２に示す（７日目に動物をと殺した場合）。

【0247】

高周波アブレーション（ＲＦＡ）処置
動物をケタミン／キシラジン溶液の腹腔内注射で麻酔し、腹臥位にした。患部を剃毛後、４ｍｍの活性先端電極を有する２２ゲージ針とＥＵＳ－ラジオ波（ＲＦ）アブレーションシステム（Ｒｉｔａ）を使用して、右側腹部腫瘍に挿入してエネルギー送達した。１０Ｗの出力を維持するために５００－ＫＨｚのＲＦ発生器を使用した。処置は腫瘍の体積に応じて１分～３分、変更した。ＲＦＡの７日後、マウスをと殺し（ｓｃａｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ）、さらなる分析のために、腫瘍浸潤リンパ球と脾臓細胞を調製するために、左側腹部（ｆｒａｎｋ）腫瘍および脾臓を収集した。末梢血サンプルは、処置前と処置後にヘパリン含有チューブで採取した。

【0248】

脾臓細胞および腫瘍浸潤リンパ球の単離
マウス脾臓細胞を単離するために、脾臓を取り出し、４０μｍメッシュのナイロンセルストレーナーを通して圧搾し、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カリフォルニア州サンディエゴ）で溶解した。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するために、腫瘍を採取して約５ｍｍの断片に切り分けた後、ＲＰＭＩ培地中の０．０５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉで３７℃にて４０分間撹拌した。腫瘍を細かく切り刻み、７０μｍおよび４０μｍのナイロンメッシュでろ過してデブリを除去した。次に、細胞をフィコール－ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配で分離し、さらなる分析に使用した。

【0249】

フローサイトメトリー
脾臓および腫瘍組織を処理し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の単細胞懸濁液とし、４℃で３０分間染色した。細胞表面マーカーは、蛍光標識抗体：ビーディ・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州、サンノゼ））のＦＩＴＣ－ＣＤ４５、ＰＥ－ＣＤ８、ＰｅｒＣＰ－ＣＤ３、ＣＤ４９ｂ、およびＡＰＣ．Ｃｙ７－ＣＤ４、で染色した。次に、細胞を２回洗浄し、緩衝液（ビーディ・バイオサイエンシーズ、カリフォルニア州サンノゼ）で固定した。個々の白血球サブセットの総数は、１２３カウントのｅＢｅａｄｓカウントビーズ（イーバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して決定した。フローサイトメトリーをＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州マウンテンビュー）によって行い、データをＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（オレゴン州アシュランド）を用いて処理した。

【0250】

統計的分析
データは平均±ＳＤとして表した。統計的有意性は、両側スチューデントのｔ検定によって評価した。ｐ値が０．０５未満の場合、差は有意であるとみなした。分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。

【0251】

結果
表１１に見られるように、ＲＦＡとの併用処置は、すべての処置とそれらの組み合わせに対する治療応答を改善するようであり、最良の応答は、群８において見られ、２／８の動物が完全な応答を示し、５／８の動物が部分的な応答を示した。

【0252】

【表17】

【0253】

すべての動物は、指定された処置配分を完了した。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡで処置したマウスは、未処置の対照と比較して腫瘍の増殖を遅延させた（ｐ＜０．０１）が、抗ＰＤ－１単独では、腫瘍増殖に対する有意ではないわずかな影響が認められた。対照的に、ＣＥＢＰａと抗ＰＤ－１との併用は、対照群と比較して有意な抗腫瘍効果をもたらし、ＲＦＡ（表１２）を加えることでさらに増強された。

【0254】

【表18】

【0255】

ＲＦＡ処置は、割り当てられた全ての側腹部腫瘍のアブレーションに成功したが、ＲＦＡ単独処置群では、対側の非ＲＦＡ処置腫瘍の増殖には有意な影響がみられなかった。ＲＦＡ処置群では、ＣＥＢＰＡの腫瘍応答は抗ＰＤ－１よりも有意に良好であった。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡと抗ＰＤ－１処置群との併用は、７／８のツアー（ｔｏｕｒ）応答（ＣＲおよびＰＲ）を生じ、２つのＣＲを含み、腫瘍体積と関係した処置応答は群を抜いて最良であった。この３つの組み合わせは、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独と比較して腫瘍増殖の適度な減少率も示した。

【0256】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、腫瘍に浸潤するＣＤ８＋およびＮＫＴ細胞を増強する
免疫応答が潜在的な抗腫瘍効果に寄与するかどうかをさらに調査するために、ＲＦＡおよび／または薬物処置群後のマウスからの脾臓細胞および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をフローサイトメトリーで測定した。表３から分かるように、抗ＰＤ－１処置と組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、脾臓細胞においてＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の有意な増加を誘導したが、ＴＩＬにおいては誘導しなかった。ＲＦＡの誘導後、ＣＤ８＋腫瘍浸潤は、３つの組み合わせで処置した動物（群８）で有意に増加した。

【0257】

【表19】

【0258】

【表20】

【0259】

腫瘍浸潤ヘルパーＴリンパ球の変化を図３に示す。腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔリンパ球の変化を図４に示す。ＲＦＡ処置を伴わない腫瘍浸潤ナチュラルキラーＴ細胞の変化を図５に示す。ＲＦＡ処置による腫瘍浸潤ナチュラルキラーＴ細胞の変化を図６に示す。

【0260】

脾臓および腫瘍におけるＮＫおよびＮＫＴリンパ球数は、ＲＦＡ処置なしの処置群間で有意差はなかったが、ＲＦＡを伴うＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ、抗ＰＤ－１併用処置群において、ＴＩＬおよび脾臓細胞におけるＮＫＴリンパ球の増加が観察された。

【0261】

考察
ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡで治療したＨＣＣ患者の機構的評価から、それは末梢顆粒球の顕著な可逆的で反復可能な増加を誘導することが観察された。これらの細胞のｑＰＣＲ分析は、ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルの増加とＰＤ－Ｌ１、アデノシンデアミナーゼとＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションを示し、腫瘍免疫微小環境（ＴＩＭＥ）における免疫調節効果の可能性を示唆した。この観察結果は、腫瘍に対する免疫応答を増強するためにＴＩＭＥに相乗的に影響を与える治療法によって臨床効果がさらに増強される可能性があるという仮説を導いた。

【0262】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ処置は、ＲＦＡとの併用処置の有無にかかわらず、対照と比較してマウスＨＣＣ側腹部腫瘍の増殖を減少させた。しかしながら、最大の治療応答はＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ、ＰＤ－１阻害剤およびＲＦＡの併用で処置した群で見られた。これはまた、動物の一部が処置に対して完全な応答を示した唯一の群であった。ＲＦＡで処置した動物の腫瘍評価はすべて対側であったことから、これはＲＦＡ処置がアブソパル効果、すなわちＴ細胞応答の誘導による遠隔腫瘍部位の退縮をもたらしたことを示唆している。ＰＤ－１阻害は、それ自体で、またはＲＦＡと組み合わせて、この研究における対照と比較して腫瘍増殖を有意に減少させなかった。

【0263】

この研究では、ＣＥＢＰＡおよびＰＤ－１阻害と組み合わせたＲＦＡ処置後の対側腫瘍における腫瘍関連細胞傷害性およびナチュラルキラーＴリンパ球の有意な増加が観察された。この研究では、ＰＤ－１阻害に対する有意な治療応答（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は検出されなかった。しかしながら、これをＣＥＢＰａおよびＲＦＡと併用した場合には明らかな増加効果（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ）が認められた。

【0264】

要約すると、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの併用処置は、前臨床ＨＣＣモデルにおいて高周波アブレーションおよびＰＤ－１阻害の免疫学的抗腫瘍応答を増強することが観察された。これらのデータは、免疫腫瘍応答の相乗的プライミングを介したチェックポイント遮断、ＲＦＡおよびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡによる併用治療についての臨床的役割を示唆し、ＲＦＡがアブソパル効果を有することを可能にする。

【0265】

実施例５．進行肝癌の治療におけるソラフェニブと組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ
ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））は、ＲａｆキナーゼならびにＶＥＧＦＲ－２／－３、ＰＤＧＦＲ－ベータ、Ｆｌｔ－３（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３）およびｃ－Ｋｉｔを標的とするマルチキナーゼ阻害剤であり、進行肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の治療に対してＦＤＡおよびＥＭＥＡの承認を受けている。しかしながら、この単剤療法に関連する低い腫瘍応答率と副作用は、他の新しい治療オプションを調査する必要があることを示すものである。

【0266】

材料および方法
動物モデルおよび処置
７週齢雄のウィスターラット（１５０～１８０ｇ）は、国立台湾大学の動物センターから入手した。ラットは標準状態で飼育し、すべての実験は国立台湾大学の施設内動物管理使用委員会が作成した「実験動物の管理と使用に関するガイド」に従って実施した。ラットに毎日ＤＥＮ溶液（ミズーリ州セントルイス、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）を唯一の飲料水供給源として６週間与え、続いて通常の水を３週間与えた。ＤＥＮ溶液の供給は、最初の週に１００ｐｐｍで開始した。動物の平均体重（ＢＷ）を５匹のラットの群につき週１回測定し、飲料水中のＤＥＮ濃度を最初の週のそれと比較して毎週ＢＷに比例して調整した。例えば、ＤＥＮ投与の１、２および３週目の平均ＢＷ値がそれぞれ１５０、２００（１．３倍）および２５０ｇ（１．６６倍）である場合、飲料水中のＤＥＮ濃度はそれぞれ１００、１３３および１６６ｐｐｍに設定した。ＤＥＮ投与の６週間後、腫瘍の進行に十分な時間を与えるために、動物にさらに３週間通常の水を与え、観察した。ラットを１０匹／群の５群にランダムに分けた：
１．対照群：ＰＢＳのみで処置、２週間の間、３回／週の静注（１、３、５および８、１０、１２日目）
２．ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ群：ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡにて処置、１週間の間、３回／週の静注（１、３、５日目）
３．ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ×２群：ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡにて処置、２週間の間、３回／週の静注（１、３、５および８、１０、１２日目）
４．ソラフェニブ群：ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）、バイエル（Ｂａｙｅｒ）、１０ｍｇ／ｋｇを経口投与、２週間の間、３回／週（１、３、５および８、１０、１２日目）
５．ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋ソラフェニブ群：ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡにて処置、１週間の間、３回／週の静注（１、３、５日目）そしてソラフェニブ、経口投与、１０ｍｇ／ｋｇ、１週間の間、３回／週（８、１０、１２日目）
処置後１５日目に動物をと殺し、腫瘍サイズと腫瘍／肝臓重量を測定した。体重、肝臓、肺、脾臓の重量を量り、すべての臓器の様相（ａｓｐｅｃｔｓ）を記録した。動物をと殺後、すべての肝葉を迅速に取り出して秤量し、肝臓表面および５ｍｍのスライス切片で肉眼で見えるすべての結節の直径を測定した。腫瘍負荷は、肝臓重量／ＢＷ比および直径＞３ｍｍの全ての腫瘍結節の総体積の２つの基準で決定した。

【0267】

血清プロファイル
ＡＬＴ、ＡＳＴ及び総ビリルビンの血清レベルは、ＶＩＴＲＯＳ（登録商標）５．１ ＦＳ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（オーソクリニカル・ダイアグノスティックス社（Ｏｒｔｈｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．））を用いて測定した。ラットα－フェトプロテインの血清中濃度は、抗ラットＡＦＰ ＥＬＩＳＡキット（ＵＳＣＮライフカンパニー（ＵＳＣＮ ｌｉｆｅ ｃｏｍｐａｎｙ）／中国）を用いて、製造業者の指示に従って評価した。

【0268】

統計的分析
データは平均±ＳＤとして表した。統計的有意性は、両側スチューデントのｔ検定によって評価した。ｐ値が０．０５未満の場合、差は有意であるとみなした。これらの分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。

【0269】

結果
肝臓および血清分析のための研究の終わりに、すべての動物を終了させた。肝葉を切除して重量を測定し、肝臓表面および５ｍｍのスライス切片の肉眼的に見える全ての結節の直径を測定した。腫瘍体積は、以下の２つの基準で決定した：即ち、肝臓重量／ＢＷ比、および直径＞３ｍｍの全ての腫瘍結節の総体積。

【0270】

ＰＢＳ対照群の腫瘍サイズは平均６４４．７ｍｍ^３であったが、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡで１週間処置した動物の腫瘍サイズは平均３２６ｍｍ^３であった。ＭＴＬＣＥＢＰＡで２週間処置した動物の腫瘍サイズは、平均１９９．７ｍｍ^３であった。ソラフェニブで２週間処置した動物の腫瘍サイズは平均２９９．５ｍｍ^３であったが、一方、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡおよびソラフェニブで処置した動物の腫瘍サイズは平均１０１．３ｍｍ^３であった（図７Ａ）および表１５。

【0271】

【表21】

【0272】

アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血清レベルを処置前に測定し、処置後の測定値と比較して、「ＡＦＰ変化」（ｍｇ／ｄｌ）として表した。血清のＡＦＰ変化は各群で測定した。値は、処置前の測定値から処置後の測定値を差し引いたものを表している。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ処置、ソラフェニブ処置、または両方の組み合わせでの処置後に値が有意に減少し、すべての処置動物にわたって有意なＡＦＰ変化が観察された（図７Ｂ）。観察された最も劇的な減少は、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡで２週間、またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとソラフェニブの併用で処置された動物で認められた（図７Ｂ）および表１６。

【0273】

【表22】

【0274】

血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）と総ビリルビンは、２週間の処置の過程で悪化しなかったことから、併用処置は動物で肝毒性作用を仲介することなく、インビボで腫瘍負荷を低下させる利点を増強することさえも示唆される。

【0275】

考察
ＨＣＣは、世界で２番目に多い癌による死亡であり、疾患のすべてのステージで５年生存率は１２％と推定されている。限定された疾患と肝硬変の背景を有する少数の患者が肝移植に適している。治癒的肝切除が可能なのは２０％未満の患者のみであり、全身療法は通常、高周波アブレーションや経動脈的化学塞栓療法などの局所療法が適さない患者、または同局所療法で進行した患者にのみ用いる。

【0276】

ソラフェニブは進行ＨＣＣ患者の死亡リスクを３１％低下させ、生存期間中央値は１０．７ヵ月であったのに対し、プラセボは７．９ヵ月であったことから、この十年間はソラフェニブが進行ＨＣＣに対する唯一の全身療法であった。この１０年間に他の全身薬は承認されなかったが、約２年前にＦＤＡがＨＣＣに対する複数の薬物としてレバンチニブ、レゴラフェニブなどを承認した。２０１７年９月、ブリストルマイヤーズスクイブ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ）のニボルマブは、以前にソラフェニブで治療された患者に対してＦＤＡから迅速承認を受けた。これはＣＨＥＣＫＭＡＴＥ－０４０試験の１５４名の患者サブグループに基づくもので、全奏効率は１４．３％（９５％信頼区間：９．２、２０．８）、完全奏効３例、部分奏効１９例であった。奏効期間は３．２か月～３８．２か月＋であった；奏効例の９１％は６か月以上持続する奏効を示し、５５％は１２か月以上持続する奏効を示した。

【0277】

何年にもわたって、複数の研究者がソラフェニブを他の薬剤と組み合わせることによってソラフェニブの有効性を改善しようとした。この研究では、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡがＨＣＣラットＤＥＮモデルにおいてソラフェニブの有効性を改善できることが示された。

【0278】

実施例６．進行したＨＣＣ患者の治療におけるＣＥＢＰＡ－５１併用療法
ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの最初の臨床試験では、合計２０名の進行したＨＣＣ患者を３つの群に階層化した。最初の群（Ｉ群）は３名の患者で、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ投与前にＦＧＦＲ４阻害剤（Ｕ３－１７８４、ＢＬＵ－５５４）を投与されていた。２番目の群（ＩＩ群）は９名の患者で、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ投与前にＩＣＢ（ペンブロルジマブ、トレメリムマブ、デュルバルマブ、またはニボルマブ）を投与されていた。３番目の群（ＩＩＩ群）は８名の患者で、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ投与前にＴＫＩ療法（７／８がソラフェニブ、そして１／８がソラフェニブ＋レンバチニブ）を受けていた。

【0279】

Ｉ群の１名の患者は部分奏効（ＰＲ）を示した。Ｉ群の他の２名の患者は、６か月以上、長期の安定した疾患（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＳＤ）を示した。ＩＩ群では、７名の患者がＳＤを示し、これらの患者のうち５名が４か月以上ＳＤを示したのに対し、２か月目のＭＲＩスキャンで進行性疾患（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）を示したのは２名のみであった。ＩＩＩ群では、２か月を超えてＳＤである患者はおらず、４名の患者が２か月の間ＳＤを示し、４名の患者が２か月目のＭＲＩスキャンでＰＤを示した。すべての応答は、固形腫瘍の応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）に従って分類されている。ＰＲ＝腫瘍病変の少なくとも３０％の減少；；ＳＤ＝ＰＲの判定を得るのに十分な収縮もなく、ＰＤの判定を得るのに十分な増加もない；ＰＤ＝腫瘍病変の少なくとも２０％の増加。

【0280】

したがって、ＦＧＦＲ４阻害剤またはＩＣＢ剤による事前の治療は、標準治療であるＴＫＩ治療のみと比較して有益性を示した。
別の臨床研究では、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡによる治療後、３名の患者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与した。ソラフェニブを投与された２名の患者は、アルファ－フェトプロテイン腫瘍マーカーの著しい減少とともに、確認された完全な腫瘍応答を経験した。最初の患者は肝硬変を伴うＨＣＣおよびＨｅｐＣである。研究の前に、同患者は２０１４～２０１７年に複数の経動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）治療を受け、２０１７年６月～２０１７年８月にデュルバルマブを受け、疾患が進行した。同患者は９８ｍｇ／ｍ^２ ＱＷ×６のＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ治療を２０１７年９月～２０１７年１１月まで受け；また、肝動脈塞栓療法（以下、「ＴＡＥ」）を２０１７年１１に、ソラフェニブを２０１８年１月～２０１８年５月まで受けた。２０１８年３月に部分奏効、２０１８年５月に完全奏効、２０１８年７月に完全奏効を得た。同患者はＨＣＣと肺および腹膜転移の解消を経験した。２番目の患者は肝硬変を伴うＨＣＣおよびＨｅｐＢである。本試験に先立ち、２０１４～２０１７年にアブレーション、２０１６～２０１７年にＴＡＣＥ／ドキソルビシン（難治性）を受けた。同患者は１３０ｍｇ／ｍ^２ ＱＷ×６のＭＴＬ－ＣＥＢＰＡを２０１７年１１月～２０１８年１月まで、ＴＡＣＥを２０１８年４月に、ソラフェニブを２０１８年４月から（継続中）投与された。同患者は２０１８年５月および２０１８年８月の時点で完全奏効であった。さらに３名の患者がＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの後にソラフェニブも投与された。１名は完全奏効（肝臓と肺の転移）、１名は部分奏効、もう１名は進行性疾患であった。完全奏効または部分奏効が見られたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ治療とソラファニブ治療との間隔は０～３か月の範囲であった。

【0281】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡによる治療後にレンバチニブを投与された１名の患者は、部分的な腫瘍応答を経験した。
以前に発表された単剤の第ＩＩＩ相試験では、ソラフェニブで治療された患者の０％に完全奏効が認められ、ソラフェニブで治療された患者の２％およびレンバチニブで治療された患者の２４％に部分奏効が認められた。治療後のソラフェニブによる５名中３名の完全奏効（６０％）および５名中４名の完全奏効および部分奏効（８０％）は、ソラフェニブ単独によるそれぞれ０％および２％という過去のデータと比較して、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡがＴＫＩを含む他の癌治療の利益を高める大きな可能性を有することを示している。

【0282】

実施例７．同系ＣＴ２６大腸癌モデルにおけるＰＤ－１抗体と組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの活性を評価する研究
本研究では、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡが一般的に使用されるマウス同系モデルＣＴ２６においてＰＤ－１チェックポイント抗体の活性を増強できるかどうかを検討した。

【0283】

簡単な方法
雌ＢＡＬＢ／ｃ（６週齢）を、マウス１匹あたり５×１０^５細胞で０．１ｍｌのマウス大腸癌細胞系ＣＴ２６．ＷＴ（ＣＲＬ－２６３８）を皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。ＣＴ２６．ＷＴ細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地で１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを添加し、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させた。細胞移植の順序はボックスごとにランダム化した。投与は細胞移植後１日目に開始し、動物は合計７回の投与を受けた：
１）ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）をｄ１およびｄ３のスケジュールで投与した；
２）．ＰＤ－１ ＲＭＰ１－１４抗体単独（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）をｄ１およびｄ４のスケジュールで投与；
３）上記と同じ用量およびスケジュールでＰＤ－１抗体と組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ；または
４）併用療法群と同じ用量およびスケジュールでのＰＢＳ単独。

【0284】

腫瘍はキャリパーで週３回測定し、腫瘍の体積は、楕円式（π／６×幅×幅×長さ）を用いて算出した。試験終了時に、瞬間冷凍（ｆｌａｓｈ ｆｒｏｚｅｎ）腫瘍サンプル（十分な腫瘍がある場合はＦＦＰＥ固定サンプル）を最終投与の２４時間後に採取した。血清サンプルも採取し、瞬間冷凍した。動物を早期に終了させた場合には、可能な場合には、分析のために腫瘍サンプルおよび血清も得た。

【0285】

ナノストリング（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）解析のために、瞬間冷凍したサンプルからＲＮＡを単離した。組織サンプルをＱＩＡｚｏｌ（登録商標）溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ）でホモジナイズし、１－ブロモ－３－クロロプロパン（Ｓｉｇｍａ）を各サンプルに添加し、ボルテックスした後、＋４℃で予冷した遠心機で遠心分離した。次いで、水性の上相を、エタノールを含むウルトラ回収管（Ｓｔａｒｌａｂ Ｉ１４２０－２６００）に移し、サンプルを穏やかなピペッティングで混合した。次いで、サンプルをＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ ７４１０６）に移し、キットの指示に従ってＲＮＡ抽出を行い、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステムを用いてＲＮＡを定量した。

【0286】

ナノストリング解析は、ナノストリングマシンを用いて、ナノストリングマウス（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ）３６０ＩＯコードセット－ＬＢＬ－１０５４５－０１とマウスミエロイドイネイトイミュニティコードセット－ＬＢＬ－１０３９８－０２のチップを用いて実施した。

【0287】

研究の主な結果：
ＰＢＳ、ＰＤ－１単独、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独、およびＰＤ－１＋ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡについての１８日目、２１日目および２３日目における個々の腫瘍プロットおよび散布図を、図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄに示す。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独群の腫瘍の大きさは、１８日目、２１日目、２３日目のいずれにおいてもＰＢＳ群と有意差はなかった。ＰＤ１抗体単独群では、１８日目のみで平均腫瘍サイズはＰＢＳ群よりも有意に小さかった。対照的に、１８日目、２１日目および２３日目において、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡおよびＰＤ－１抗体の組み合わせ群は、ＰＢＳよりも有意に小さかった（Ｐ＜０．０５－Ｗｅｌｃｈの補正を伴う不対のｔ検定）。２１日目と２３日目には、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとＰＤ－１抗体の組み合わせ群の腫瘍は、ＰＤ１抗体またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独群のいずれかよりも有意に（Ｐ＜０．０５）小さくなっており、組み合わせの抗腫瘍増強を示す。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡおよびＰＤ－１抗体の組み合わせ群では２３日目の時点で、残りの腫瘍のうち３／６のみが２１日目の測定から大きさが増加し始めていたのに対し、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとＰＤ－１抗体の単独群ではいずれも２１日目から２３日目までの間にすべての腫瘍の大きさが増大していた。

【0288】

骨髄チップ（Ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｈｉｐ）上のＣＥＢＰＡプローブを用いた２３日目の腫瘍のナノストリング解析では、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独群ではＣＥＢＰＡｍＲＮＡが約１．７倍（Ｐ＜０．００１、対ＰＢＳ群）増加していることが明らかになった。対照的に、ＰＤ－１抗体で処理された腫瘍のＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのレベルは変化しなかった（１．０９；Ｐ＝０．７０５、対ＰＢＳ群）。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとＰＤ－１抗体との組み合わせ群では、全体的にＣＥＢＰＡｍＲＮＡの平均増加は５．１２倍であった；成長し始めた３つの腫瘍では、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡの平均増加は１．５６（Ｐ＝０．２８３、対ＰＢＳ群）であり、サイズがまだ減少している３つの腫瘍では、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのレベルは８．６９（Ｐ＜０．００１、対ＰＢＳ群）であった（表１７）。ＣＤ８Ｔ細胞マーカーＣＤ８ａ（ＩＯチップ）に関しては、組み合わせ群のみが全体的に有意な増加を示し（３．７倍、Ｐ＜０．０２）、その増加は３つの退行性腫瘍で最も顕著であった（５．０５倍、Ｐ＜０．０２、対ＰＢＳ）。ＰＤ１抗体単独群（１．２９倍）およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ群（１．２２倍）ではＣＤ８ａ ｍＲＮＡがわずかに増加したが、それらはＰＢＳ対照群と比較して統計的に有意ではなかった（表１７）。活性化ＣＤ８＋ｖｅを示すグランザイムＡ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ）ｍＲＮＡ（骨髄チップ）レベルを見ると、ＰＤ－１抗体単独群（１．３８倍）およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独群（１．１４倍）でわずかに増加したが、どちらも有意ではなかったが、組み合わせ群では全体で２．３９倍の増加（Ｐ＝０．０５、対ＰＢＳ）が見られ、これは３つの退行性腫瘍で最も顕著であった（３．２２倍－ｐ＜０．０５）。

【0289】

【表23】

【0290】

結論
全体として、データは、この免疫応答性マウスＣＴ２６大腸癌モデルにおけるＰＤ－１抗体とＭＴＬ－ＣＥＢＰＡを組み合わせることの抗腫瘍活性の面での利点を示している。活性は、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ（ＣＴ２６腫瘍細胞は内因性ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡの非常に低いレベルを持っているので、おそらく間質細胞で）の発現の増加を伴っており、ＣＤ８ａとグランザイムＡ ｍＲＮＡの発現の増加は、ＰＤ－１抗体またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ治療単独のいずれかと比較して、組み合わせ群の活性化ＣＤ８Ｔ細胞のレベルの増加と一致していた。

【0291】

実施例８．ソラフェニブ耐性腫瘍マウスにおけるＭＬＴ－ＣＥＢＰＡおよび併用療法
本試験は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの肝細胞癌腺癌（ＢＮＬ）皮下異種移植モデルにおいて、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡの抗ＰＤ１またはＮｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）との併用療法におけるｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価することを目的としたものである。

【0292】

材料および方法
細胞培養：マウス肝細胞癌細胞系ＢＮＬを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））中に２５０ｎｇ／ｍＬのＧ４１８（メルク社、ドイツ国）、１％抗生物質抗真菌薬（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧｉｂｃｏ）および１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））と共に維持し、加湿雰囲気中、３７℃で培養した。

【0293】

腫瘍接種と実験計画：各ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹に、０．０５ｍｌのＰＢＳ中の３×１０^５個のＢＮＬ－Ｌｕｃ細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）した。接種の３週間後、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）を２週間毎日経口投与した（３０ｍｇ／ｋｇ／日）。

【0294】

目に見える腫瘍結節が対照と比較して測定可能な寸法の２０％の増加を示した「難治性動物（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ）」を選択した。選択された動物は、７つの処置群に無作為に割り付けられた（表１８）。

【0295】

化合物：
ＰＢＳ：ＵｎｉＲｅｇｉｏｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ．Ｃａｔ：ＵＲ－ＰＢＳ００１－５Ｌ
ＭＴＬＣＥＢＰＡ：ＭＩＮＡ ｔｘ：ＭＩＴ０６１５Ａ
Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）：Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
抗ＰＤ－１：ＩｎＶｉｖｏ ＭＡｂ抗マウスＰＤ－１：ＢｉｏＸＣｅｌｌ．、カタログ番号：ＢｉｏＸＣｅｌｌ ＢＥ０１４６／７１７９１８Ｏ１
併用試験の群と処置
６０匹のマウスを、０．５ｍＬのＰＢＳ混合液中の３×１０^５個のＢＮＬ－Ｌｕｃ細胞を注入した。３週間後、マウスにソラフェニブ３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）を２週間毎日投与した。腫瘍体積の２０％の増加を示した４２匹のマウスを選択し、各群に６匹のマウスを配置したランダム化ブロックデザインを用いて７つの群に割り付けた。７群は、対照群としてのＰＢＳ［ＰＢＳ］；ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ［Ｃ］（４．２ｍｇ／ｍｌ、静注、ｄ１、ｄ３、ｄ５）；抗－ＰＤ１抗体［Ｐ］（２５０ｕｇ、Ｉ．Ｐ．、ｄ１、ｄ３、ｄ５）；Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）［Ｎ］（３０ｍｇ／ｋｇ、経口、毎日）；ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋抗ＰＤ１［Ｃ＋Ｐ］；ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）［Ｃ＋Ｎ］；およびＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋抗－ＰＤ１＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）［Ｃ＋Ｐ＋Ｎ］、であった。

【0296】

【表24】

【0297】

結果および考察
まず、チロシンキナーゼ阻害剤Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）、免疫チェックポイント遮断剤（ｂｌｏｃｋａｄｅ）（抗ＰＤ－１抗体）、またはＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ単独での単剤処置が、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）耐性ＢＮＬ異種移植マウスの腫瘍縮小をもたらすかどうかを検討した。

【0298】

ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡのみで処置されたマウスは、３週間の処置後に腫瘍重量の有意な４９％の減少（ｐ＝０．０１）（図９Ａ）および腫瘍体積の３７％の減少（図９Ｂ）を示した。抗ＰＤ１処置単独またはＮｅｘａｖａｒ（登録商標）処置単独では、腫瘍の体積または重量に影響は見られなかった（図９Ａおよび図９Ｂ）。

【0299】

Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）または抗ＰＤ１のいずれかとＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとの併用処置を受けた動物群では、腫瘍の体積と重量の劇的かつ有意な減少が観察された。抗ＰＤ１と組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、腫瘍体積の７４％の減少（ｐ＜０．００４）（図９Ｂ）および腫瘍重量の８３％の減少（ｐ＜０．００２）（図９Ａ）を示した。Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）と組み合わせたＭＴＬ－ＣＥＢＰＡは、腫瘍体積の６６％の減少（ｐ＜０．００６）（図９Ｂ）および腫瘍重量の８０％の減少（ｐ＝０．００１）（図９Ａ）を示した。ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡ＋Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）＋抗ＰＤ１で処置された動物は、腫瘍体積の７７％の減少と腫瘍重量の８７％の減少を示し、この活性は二種類の組み合わせのいずれかよりも大きかった。

【0300】

試験化合物の相乗効果があったかどうかを評価するために、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡを抗ＰＤ１およびＮｅｘａｖａｒ（登録商標）と並行して組み合わせた。３週間の処置後、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡと抗ＰＤ１とを組み合わせた場合の抗腫瘍応答は、腫瘍増殖率の６５％の減少を示した。Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）と組み合わせたＭＬＴ－ＣＥＢＰＡは、腫瘍増殖率の６２％の減少を示した。３つの化合物すべてを同時に投与した場合、未処置の動物と比較して、腫瘍増殖率が７６％減少した（ｐ＝０．００３）。

【0301】

結論
標準的な治療の抗腫瘍化合物であるＮｅｘａｖａｒ（登録商標）および／または抗ＰＤ１と組み合わせた場合、ＭＴＬ－ＣＥＢＰＡによるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションが、強力かつ一貫した抗腫瘍応答を促進することが、強力な証拠として実証されている。ｓａＲＮＡが誘導する腫瘍抑制因子ＣＥＢＰＡ遺伝子のアップレギュレーションは、標準的な化学療法剤の抗腫瘍能力を有意に改善する。

【0302】

均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。

【0303】

特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」のような冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、そうでなければ関連する場合、満たされると考えられる。本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、そうでなければ関連する、実施形態を含む。本発明は、グループのメンバーの２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、利用されるか、そうでなければ関連する、実施形態を含む。

【0304】

また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、制約がなく（ｏｐｅｎ）許容することを意図しているが、追加の要素またはステップを含める必要はないことにも留意されたい。したがって、本明細書で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も包含され、開示される。

【0305】

範囲が指定されている場合、端点（ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）が含まれる。さらに、特に指定がない限り、または文脈および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、本発明の異なる実施形態における記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、その範囲の下限の単位の１０分の１単位まで想定できることを理解されたい。

【0306】

さらに、先行技術に包含される本発明の特定の実施形態はいずれも請求項の任意の１項以上から明示的に除外されうると理解されるべきである。そのような実施形態は当業者に公知であると見なされるので、除外が本明細書で明示的に示されていない場合でも、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（たとえば、任意の抗生物質、治療成分または活性成分；任意の製造方法；任意の使用方法など）はいずれも、先行技術の存在の有無にかかわらず、任意の理由で任意の１つまたは複数の請求項から除外され得る。

【0307】

使用されている単語は限定ではなく説明の単語であり、本発明のより広い態様における真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更を加えることができることを理解されたい。

【0308】

本発明は、記載されたいくつかの実施形態に関して、ある程度の長さとある程度の特殊性をもって説明されてきたが、そのような特殊性または実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることは意図されていないが、先行技術の観点から見て、そのような請求項の最も広い可能な解釈を提供するように、そしてそれゆえに、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきものである。

【0309】

以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
［付記１］
それを必要とする対象の癌を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、単離された合成ｓａＲＮＡと少なくとも１つの追加の活性剤とを含み、前記医薬組成物は前記対象に投与されるものであり、前記ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートし、前記ｓａＲＮＡが配列番号３の領域に対して少なくとも９０％相補的である鎖を含み、前記鎖が１４～３０ヌクレオチドを有し、かつ前記追加の活性剤がチェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント遮断剤である医薬組成物。

【0310】

［付記２］
前記Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現が、少なくとも２０％、５０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍アップレギュレートされる、付記１に記載の医薬組成物。

【0311】

［付記３］
前記ｓａＲＮＡが二本鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む、付記１または付記２に記載の医薬組成物。

【0312】

［付記４］
前記ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含む、付記３に記載の医薬組成物。

【0313】

［付記５］
前記ｓａＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２（ＣＥＢＰＡ－５１）の配列を含む、付記３または付記４に記載の医薬組成物。

【0314】

［付記６］
前記ｓａＲＮＡがＭＴＬ－ＣＥＢＰＡとして投与される、付記１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0315】

［付記７］
前記ｓａＲＮＡは、前記追加の活性剤と同時にまたは順次に投与されるものである、付記１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0316】

［付記８］
前記追加の活性剤がＣＴＬＡ４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤である、付記１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0317】

［付記９］
前記追加の活性剤がＰＤ－１抗体である、付記１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0318】

［付記１０］
前記追加の活性剤が、ペンブロリズマブである、付記１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0319】

［付記１１］
前記対象がさらに高周波アブレーション（ＲＦＡ）治療を受ける、付記１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0320】

［付記１２］
前記対象がｓａＲＮＡ治療の前にＲＦＡ治療を受ける、付記１１に記載の医薬組成物。
［付記１３］
前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）、大腸癌、胃癌、皮膚癌、膵臓癌、頭頸部癌、子宮頸癌、および前立腺癌から選択される、付記１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0321】

［付記１４］
前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）または大腸癌である、付記１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0322】

［付記１５］
前記癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）である、付記１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B-1】

【図9B-2】

【配列表】

2024103632000001.xml