特開 2024-104828 自己抗体の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024104828

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】自己抗体の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240730BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023009208

(22)【出願日】2023-01-25

(71)【出願人】

【識別番号】502437894

【氏名又は名称】学校法人大阪医科薬科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】福森 亮雄

(72)【発明者】

【氏名】岡田 健

(72)【発明者】

【氏名】柳田 寛太

(72)【発明者】

【氏名】北岡 京花

(72)【発明者】

【氏名】田口 和美

(57)【要約】

【課題】検査対象における既知の自己抗体のみならず、全く未知の抗原に対する自己抗体の存在を高精度且つ簡便に検出できるようにする。
【解決手段】自己抗体の検出方法は、動物の脳の粗抽出液を準備するステップと、前記粗抽出液を非変性ブルーネイティブ電気泳動にかけるステップと、前記電気泳動後のゲルに対して、対象の体液を１次抗体として用いるウエスタンブロット法を行うステップと、を含むことを特徴とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

動物の脳の粗抽出液を準備するステップと、
前記粗抽出液を非変性ブルーネイティブ電気泳動にかけるステップと、
前記電気泳動後のゲルに対して、対象の体液を１次抗体として用いるウエスタンブロット法を行うステップと、を含む自己抗体の検出方法。

【請求項2】

前記対象の体液は、脳脊髄液、血清又は血漿である、請求項１に記載の自己抗体の検出方法。

【請求項3】

前記自己抗体は、自己免疫性脳炎に関連する自己抗体である、請求項１又は２に記載の自己抗体の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、自己抗体の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体脳炎に代表される自己免疫性脳炎は、脳神経細胞のシナプスに発現するイオンチャネル受容体等を特異的に標的とする自己抗体によって、異常行動やてんかん、その他重篤な精神・神経症状が引き起こされることが近年明らかにされてきている。そのような状況から、現在、ＮＭＤＡ受容体、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メソオキサゾール－４－プロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、及びγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体等の周知の受容体に対する自己抗体の検出方法について多くの研究がなされている。例えば特許文献１には、ＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体を検出する方法が提示されている。具体的に、特許文献１では、ＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体を含む疑いのある試料を、人工的に構築したＮＭＤＡ受容体タンパク質コンストラクトと接触させて、それらの結合体を検出することによって自己抗体を検出する方法が提示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０２２－５４０９１３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

現在、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、及びＧＡＢＡ受容体等の周知の受容体に対する自己抗体の検出方法は確立されつつあり、例えば上記特許文献１のような方法によって、ＮＭＤＡ受容体に対する自己抗体の検出が可能ではある。しかしながら、特許文献１の方法では、ＮＭＤＡ受容体タンパク質コンストラクトを準備する必要があって、必ずしも簡便ではなく、ＮＭＤＡ受容体タンパク質に対する自己抗体しか検出することができない。従って、他のＡＭＰＡ受容体やＧＡＢＡ受容体等に対する自己抗体を検出したい場合は、それらのタンパク質コンストラクトを準備する必要がある。また、特許文献１の方法では、全く未知の抗原に対する自己抗体の存在を高精度に検出することはできず、また、そのような方法は今のところ存在しないと考えられる。

【0005】

本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、検査対象における既知の自己抗体のみならず、全く未知の抗原に対する自己抗体の存在を高精度且つ簡便に検出できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、非変性ブルーネイティブ電気泳動を利用することにより高精度に自己抗体の存在を検出できることを見出して本発明を完成した。

【0007】

具体的に、本発明に係る自己抗体の検出方法は、動物の脳の粗抽出液を準備するステップと、前記粗抽出液を非変性ブルーネイティブ電気泳動にかけるステップと、前記電気泳動後のゲルに対して、対象の体液を１次抗体として用いるウエスタンブロット法を行うステップと、を含むことを特徴とする。

【0008】

本発明に係る自己抗体の検出方法において、前記対象の体液は、脳脊髄液、血清又は血漿であることが好ましい。

【0009】

本発明に係る自己抗体の検出方法において、前記自己抗体は、自己免疫性脳炎に関連する自己抗体であることが好ましい。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係る自己抗体の検出方法によると、検査対象における既知の自己抗体のみならず、全く未知の抗原に対する自己抗体の存在を高精度且つ簡便に検出できる。このため、自己抗体の存在が病因となる疾患の診断への利用可能性もあり、極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、実施例にて行ったＮＭＤＡ受容体の検出のためのウエスタンブロットの結果を示す写真である。

【図2】図２は、実施例にて行ったＡＭＰＡ受容体の検出のためのウエスタンブロットの結果を示す写真である。

【図3】図３は、比較例にて行った非変性ブルーネイティブ電気泳動の代わりにＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いたウエスタンブロットの結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0013】

本発明の一実施形態は、対象における自己抗体を検出するための方法であって、動物の脳の粗抽出液を準備するステップと、前記粗抽出液を非変性ブルーネイティブ電気泳動にかけるステップと、前記電気泳動後のゲルに対して、対象の体液を１次抗体として用いるウエスタンブロット法を行うステップと、を含むことを特徴とするものである。

【0014】

本実施形態において、対象とは、自己抗体の存在について試験される検査対象であり、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

【0015】

本実施形態における動物の脳の粗抽出液を準備するステップにおいて、動物とは、例えば哺乳動物であり、上記対象と同一の動物であることが好ましいが、対象において中枢神経系に多く存在する受容体タンパク質と類似性が高い受容体タンパク質を有する動物であることが好ましい。ここで言う中枢神経系に多く存在する受容体タンパク質は、例えばＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、ＧＡＢＡ受容体等のタンパク質が挙げられるが、これらに限られない。また、ここで言う類似性が高いとは、一方の動物のタンパク質を認識する抗体が他方の動物のタンパク質も認識する程度の類似性を有する場合をいう。この場合、例えば一方のタンパク質のアミノ酸配列と他方のタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。対象がヒトである場合、例えばマウス、ラット、ブタ、サル等を用いることができる。

【0016】

上記動物の脳の粗抽出液を準備するステップは、脳のタンパク質を含む粗抽出液を得ることができれば、その方法は限定されない。例えば、動物の頭部から脳を摘出し、脳のうち所望の部位を切り取って所定の緩衝液に浸し、それをホモジナイズして得られた溶液を遠心処理等を施し、脳神経細胞膜を得た後、常法によって細胞膜を可溶化することで脳の粗抽出液を得ることができる。

【0017】

本実施形態において、非変性ブルーネイティブ電気泳動は、従来から用いられている電気泳動の一種であり、タンパク質複合体を非変性条件で分離するための電気泳動であり、特にタンパク質を含むサンプルにクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を添加した後に電気泳動を行うものである。本発明では、非変性ブルーネイティブ電気泳動を利用することが重要である。例えば、大脳及び海馬のＮＭＤＡ受容体は、ＧｌｕＮ１サブユニット及びＧｌｕＮ２サブユニット等で構成されており、天然コアＮＭＤＡ受容体は、ＧｌｕＮ１二量体とＧｌｕＮ２二量体とで構成されている。なお、ＧｌｕＮ２には、ＧｌｕＮ２Ａ及びＧｌｕＮ２Ｂ等の種類があることも知られている。自己抗体は、生体内におけるこれらのサブユニットが結合した天然状態のＮＭＤＡ受容体を認識して結合するため、分離・変性された単独のサブユニット自体を認識しない。このため、後の実施例でも説明するが、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ等のサンプル内のタンパク質を変性させて行う方法では、ＮＭＤＡ受容体がそれぞれのサブユニットに分離され３Ｄ構造（立体構造）が壊れるため、生体内のＮＭＤＡ受容体自体を認識する自己抗体によって電気泳動後のタンパク質を検出できない場合がある。一方、非変性ブルーネイティブ電気泳動を用いる場合、サンプル内のタンパク質を変性させずに、天然状態のままで電気泳動を行うため、ＮＭＤＡ受容体が各サブユニットに分離されずに天然状態の３Ｄ構造を保っているため、生体内の自己抗体によって電気泳動後のタンパク質を検出することができる。以上のことは、ＮＭＤＡ受容体タンパク質に限らず、他のタンパク質であっても同様である。

【0018】

本実施形態において、上記電気泳動後のゲルに対して、対象の体液を１次抗体として用いてウエスタンブロット法を行うが、対象の体液としては、自己抗体を含み得る体液であれば特に限定されないが、例えば脳脊髄液、血清又は血漿等が用いられ得る。ウエスタンブロット法は、周知の方法であり、上記電気泳動後のゲルを所定のメンブレンに転写した後に、１次抗体としての上記対象の体液を用いて染色される。２次抗体としては、１次抗体である体液を得た対象の動物種の抗体に結合可能な抗体であって、例えばＨＲＰがコンジュゲートされた抗体が用いられ得る。その後、メンブレンの洗浄を経て、常法によりバンドの検出がなされる。

【0019】

本実施形態に係る対象における自己抗体を検出するための方法によると、動物から得られた脳の粗抽出液を変性させずにそのままサンプルとして用いるため、生体内の各種タンパク質が元の構造のままで電気泳動にかけられる。そして、当該電気泳動後のゲルに対して、検査対象における自己抗体を含み得る体液を１次抗体とするウエスタンブロットを行うため、検査対象の体液中における既知の自己抗体のみならず、全く未知の抗原に対する自己抗体の存在を高精度且つ簡便に検出できる。このため、本方法は、自己抗体の存在が病因となる疾患の診断への利用可能性もあり極めて有用である。そのような疾患として、例えば自己免疫性脳炎が挙げられる。この場合、自己抗体は、自己免疫性脳炎に関連する自己抗体であることが好ましい。自己免疫性脳炎に関連する自己抗体としては、抗ＮＭＤＡ受容体抗体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体及び抗ＧＡＢＡ受容体抗体等が知られているが、これらに限られない。

【実施例0020】

以下に、本発明に係る自己抗体の検出方法について詳細に説明するための実施例を示す。

【0021】

（脳神経細胞膜からのＮＭＤＡ受容体等の受容体タンパク質の可溶化）
まず、マウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６ｊマウスの８週齢の雄）に三種混合麻酔（ドミトール、ドルミカム及びベトルファール）を１５０μＬ腹腔に注射し、さらにセボフルランを嗅がせて麻酔を深くかけた。麻酔がかかったのを確認した後、マウスに対して頚椎脱臼し、外科剪刀で頸部から切断した。氷でよく冷やしたバッファー１（５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３２０ｍＭのスクロース）を氷上の金属製のトレーに入れ、マウスの頭部を浸けた。その後、あらかじめ氷で冷やしたハサミとピンセット使い、上記マウスの頭部から脳を取りだし、すぐに氷上のビーカーに入ったバッファー１中に入れて、脳をよく冷やした。

【0022】

続いて、解剖顕微鏡下で、氷の上に置いたアルミブロックにペーパータオルを敷き、バッファー１を少量かけて湿らせた後、その上に取り出した脳をのせた。剃刀の刃（フェザー剃刀ＦＡ－１０）を使い、脳を半分に切断し、片方は、バッファー１中に入れ冷やした。ピンセットを使い大脳（海馬）以外の領域（小脳や脳幹部）を取り外した。氷でよく冷やした４ｍＬのバッファー１をダウンス型ホモジナイザー（Ｄｏｕｎｃｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ、ＷＨＥＡＴＯＮ ３５７５４２）に入れ、そこに取り出した前脳（大脳・海馬）を入れ、氷上で、ルーズ（隙間が緩いペストル）で１０回、タイト（隙間が狭いペストル）で１０回上下して、ホモジナイズした。

【0023】

ホモジナイズした溶液を、１．５ｍＬチューブに５００μＬずつ８本に分注し、８００×ｇで１５分遠心し、核分画を沈殿させた。上清を１．５ｍＬチューブに移し、２００００×ｇで１５分遠心した後、上清を除去し、沈殿（神経細胞膜画分：１チューブ当たり約２０～４０ｍｇになる）を回収した。沈殿物の入ったチューブに５００μＬの５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を入れてピペッティングした後、５分インキュベートし、２００００×ｇで１５分遠心し沈殿（脳神経細胞膜）を回収した。なお、この操作をもう１回繰り返した。

【0024】

５００μＬに対してデオキシコール酸が１％、ヘミコハク酸コレステリルが２ｍＭになるように、それらを別の２本の１．５ｍＬチューブに量り取り（それぞれ０．００５ｇ及び０．０００５ｇ）、チューブ１本に５００μＬのバッファー２（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．００２％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）、５μＬプロテアーゼ（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ：Ｒｏｃｈｅ １１８３６１７０００１）及びホスフォターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ＩＩ（ａｂ２０１１１３））阻害剤（１００倍希釈）を加えてピペッティングして２本のチューブを溶解させた。その溶液を上記脳神経細胞膜の沈殿の入った１．５ｍＬチューブに加え、１ｍＬチップでピペッティングして細胞膜を可溶化させた。

【0025】

上記可溶化した脳神経細胞膜を２００００×ｇで１５分遠心した後の上清をサンプルとして用いて、下記に示すような非変性ブルーネイティブ電気泳動を行った。

【0026】

（非変性ブルーネイティブ電気泳動）
可溶化した脳神経細胞膜であるサンプルに、５％クマシーＧ－２５０（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ ５％ Ｇ２５０ ｓａｍｐｌｅ ａｄｄｉｔｉｖｅ、ＢＮ２００４）とサンプル処理バッファー（Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（×４）、ＢＮ２００３）、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．００２％ ＤＤＭ）を加え、好みの希釈倍率で希釈後（約２～３倍）、泳動サンプルにした。なお、Ｇ－２５０の量は、サンプルに含まれる界面活性剤の量に応じて決め、界面活性剤の約１／４量で調整した。ここでは、サンプルを４０μＬ、サンプル処理バッファーを２０μＬ、５％クマシーＧ－２５０を２μＬ、緩衝液を１８μＬとした。

【0027】

プレキャストゲル－ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ ３－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓを下端のビニールテープをはがしてからＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（ＥＩ０００１）にセットした。２０×ストックバッファー（ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＮ２００１）、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｃａｔｈｏｄｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ａｄｄｉｔｉｖｅ（ＢＮ２００２））を推奨プロトコールに従い希釈し、２００ｍＬの１×Ｒｕｎｎｉｎｇ＆Ｃａｔｈｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒ及び、４００ｍＬの１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを調製する。ゲルをセットしたＭｉｎｉ－Ｃｅｌｌの奥側の槽に、１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをいれ、ゲルの切れ目部分が十分につかる量をいれる。２ｍＬの１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを使いゲルの各ウエルを満たす。そこに上述の通り調整したサンプル１０μＬを、ローディングチップ（Ｂｉｏ－Ｂｉｋ １０３４－８００）を使ってロードした。手前の槽に２００ｍＬの１×Ｒｕｎｎｉｎｇ＆Ｃａｔｈｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒを静かに注ぎ、ゲルの上部が浸かる量を入れた。その後、上部の電極部分を静かにセットし、１５０Ｖで泳動した。

【0028】

開始から１５分後、泳動を一時停止し、手前の槽の１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＆Ｃａｔｈｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒをすべて取り除いた。取り除いた１０ｍＬの１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＆Ｃａｔｈｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒを１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２０倍に希釈し２００ｍＬ調製した。希釈したＲｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＆Ｃａｔｈｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒを再度、手前の槽にゲルの上部がつかる量を満たし、再度泳動を始めた。その１時間３０分後、泳動を止め、硬いへらなどを使いゲル板を分解後、１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れたプラスチックトレイなどにゲルを入れた。この時、ゲルのテールエンドは、カッターの刃などを使い切り取っておいた。

【0029】

（ＮＭＤＡ受容体の検出のためのウエスタンブロット）
１００ｍＬのＴＢＳ－Ｔ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）に溶かした３％のｉＢｌｏｃｋ（Ｉ－Ｂｌｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔ２０１５））をいれ、５０℃で温めながらスターラーを使い混ぜて完全に溶かした。ＰＶＤＦメンブレンをゲルの大きさに合わせてカットし、１００％の２－プロパノールに１分間浸けてから、転写バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、２５０ｍＭのグリシン）に浸した。ゲルが浸している１×Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを捨て、転写バッファーに交換した。バイオラドのウエット式転写装置（ミニトランスブロット セル：１７０３９３０ＪＡ）に、ミニトランスブロットゲルホルダーカセットとミニトランスブロットファイバーパッド、１枚のフィルター（ろ紙）を置き、転写バッファーに漬けて湿らせた。ＰＶＤＦメンブレンをフィルターの上に乗せ、転写バッファーに漬けた。その上にゲルを静かに置き、転写バッファーに漬け、８枚のフィルター（ろ紙）を最上部に置き、転写バッファーに漬けて湿らした後、ミニトランスブロットゲルホルダーカセットにセットした。ミニトランスブロットセルにセットして、凍らせたミニプロティアンＴｅｔｒａバイオアイスクーリングユニットをセットした後、転写バッファーで満たした。その後、４００ｍＡの一定電流で１時間転写した。転写したＰＶＤＦを好みの大きさにカットしてから、マルチウエスタンボックス（Ｂｉｏ－Ｂｉｋ ＭＷＢ－０６）にカットしたＰＶＤＦメンブレンを入れ、１００％メタノールに浸けて、脱色した。完全に脱色出来たらメタノールを捨て、ＴＢＳ－Ｔでリンスした。上記ＴＢＳ－Ｔに溶かした３％ｉＢｌｏｃｋを振とうできる十分量入れた（半分量程度）。３０分間シェーカーで振とうさせＰＶＤＦ膜をブロッキングした。マルチウエスタンボックスを傾けて、ｉＢｌｏｃｋを捨てた。ＴＢＳ－Ｔを少量入れ、手で振り混ぜながら余分なｉＢｌｏｃｋを取り除いた（２～３回）。

【0030】

続いて、１ウェルにつき１ｍＬのｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ ＮＫＢ－２０１）に１μＬ（×１０００）の市販の各種１次抗体（抗ＧｌｕＮ２Ａ抗体：Ａｎｔｉ－ＮＭＤＡＲ２Ａ Ｃｌｏｎｅ５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６１２２８６）、抗ＧｌｕＮ２Ｂ抗体：Ａｎｔｉ－ＮＭＤＡＲ２Ｂ Ｃｌｏｎｅ１３（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６１０４１６）、及び抗ＧｌｕＮ１抗体：Ａｎｔｉ－ＮＭＤＡＲ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｌｏｎｅ５４．１（Ｍｅｒｃｋ ＭＡＢ３６３））、又は自己抗体脳炎患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）１０μＬ（×１００）を入れ、マルチボックスの各ウェルに入れ、１時間振とうした。なお、ＣＳＦは、地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪急性期・総合医療センター（臨床研究支援センター）精神科の臨床研究によって収集された脳脊髄液を匿名化されたサンプルとして分与を受けたものである。１時間の振とう後、抗体溶液を捨て、ＴＢＳ－Ｔを入れてよく洗い捨て、余分な抗体溶液を取り除いた。この操作を３回繰り返した後、半分量のＴＢＳ－Ｔを入れ、５分振とう後に取り除いた。次に、１ウェルにつき１ｍＬのｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ ＮＫＢ－３０１）に１μＬ（×１０００）の２次抗体（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ（又はｍｏｕｓｅ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９－０３５－０８８又は１１１－０３６－０４５））を各ウェルに入れ、１時間振とうした。１時間後、抗体溶液を捨て、ＴＢＳ－Ｔを入れてマルチウエスタンボックスをよく混ぜて洗浄し、余分な抗体溶液を取り除いた。この操作を３回繰り返した。さらに半分量のＴＢＳ－Ｔを入れ、５分振とう後に捨てた。この操作を計３回繰り返した。

【0031】

続いて、１ｍＬのＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと１ｍＬのＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｐｉｃｏ：３４５７９）をプラスチックケースに入れ、キムワイプを用いて余分なＴＢＳ－Ｔを除去したＰＶＤＦメンブレンを浸した。メンブレンの大きさに合わせて切ったクリアポケット（クリアファイル用高透明タイプ）にＰＶＤＦメンブレンを挟み、余分なＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌをキムワイプで取り除いた。ブラックトレイをセットしたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００にメンブレンを置き、オートモードで撮影した。その結果を図１に示す。

【0032】

図１に示すように、市販の抗ＮＭＤＡ受容体抗体であって、それぞれ特にＧｌｕＮ１、ＧｌｕＮ２Ａ及びＧｌｕＮ２Ｂを認識する抗体を１次抗体として用いた場合、７２０～１０４８ｋＤａの間と１２３６ｋＤａ付近に２つバンドが検出された。従って、これらのバンドが、大脳や海馬に存在するＮＭＤＡ受容体タンパク質であり、７２０～１０４８ｋＤａはヘテロ4量体のシナプス外ＮＭＤＡ受容体であり、１２３６ｋＤａ付近のＮＭＤＡ受容体は、ＰＳＤ９５タンパク質との複合体でシナプス後肥厚部に存在するＮＭＤＡ受容体を示す。また、ＣＳＦを用いた場合、ＧｌｕＮ１、ＧｌｕＮ２Ａ及びＧｌｕＮ２Ｂを認識する抗体を用いた場合に得られたバンドと同様の位置にバンドが検出された。用いたＣＳＦは、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎患者から得たものであり、抗ＮＭＤＡ受容体の自己抗体を有すると考えられるが、この結果から、確かに抗ＮＭＤＡ受容体の自己抗体を有することが確認できた。また、上記方法により、脳脊髄液をそのままサンプルとして用いても、自己抗体を検出できることも確認できた。

【0033】

（ＡＭＰＡ受容体の検出のためのウエスタンブロット）
１ウェルにつき１ｍＬのｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ ＮＫＢ－２０１）に１μＬ（×１０００）の市販の１次抗体（Ａｎｔｉ－Ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ (ＡＭＰＡ ｓｕｂｔｙｐｅ) 抗体 [ＥＰＲ１９５２２] (ａｂ１８３７９７)ａｂｃａｍ）、又は自己抗体脳炎患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）１０μＬ（×１００）を入れ、マルチボックスの各ウェルに入れ、１時間振とうした。なお、ＣＳＦは、地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪急性期・総合医療センター（臨床研究支援センター）精神科の臨床研究によって収集された脳脊髄液を匿名化されたサンプルとして分与を受けたものである。１時間の振とう後、抗体溶液を捨て、ＴＢＳ－Ｔを入れてよく洗い捨て、余分な抗体溶液を取り除いた。この操作を３回繰り返した後、半分量のＴＢＳ－Ｔを入れ、５分振とう後に取り除いた。次に、１ウェルにつき１ｍＬのｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ ＮＫＢ－３０１）に１μＬ（×１０００）の２次抗体（Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ（又ｈｕｍａｎ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ７１１－０３５－１５２（又１０９－０３５－０８８）））を各ウェルに入れ、１時間振とうした。１時間後、抗体溶液を捨て、ＴＢＳ－Ｔを入れてマルチウエスタンボックスをよく混ぜて洗浄し、余分な抗体溶液を取り除いた。この操作を３回繰り返した。さらに半分量のＴＢＳ－Ｔを入れ、５分振とう後に捨てた。この操作を計３回繰り返した。

【0034】

続いて、１ｍＬのＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと１ｍＬのＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｐｉｃｏ：３４５７９）をプラスチックケースに入れ、キムワイプを用いて余分なＴＢＳ－Ｔを除去したＰＶＤＦメンブレンを浸した。メンブレンの大きさに合わせて切ったクリアポケット（クリアファイル用高透明タイプ）にＰＶＤＦメンブレンを挟み、余分なＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌをキムワイプで取り除いた。ブラックトレイをセットしたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００にメンブレンを置き、オートモードで撮影した。その結果を図２に示す。

【0035】

図２に示すように、市販の抗ＡＭＰＡ受容体抗体を１次抗体として用いた場合、７２０～１０４８ｋＤａの間にバンドが検出された。従って、このバンドが、大脳や海馬に存在するＡＭＰＡ受容体タンパク質を示す。また、ＣＳＦを用いた場合、抗ＡＭＰＡ受容体抗体を用いた場合に得られたバンドと同様の位置にバンドが検出された。用いたＣＳＦは、自己抗体脳炎患者から得たものであり、抗ＡＭＰＡ受容体の自己抗体を有すると考えられるが、この結果から、確かに抗ＡＭＰＡ受容体の自己抗体を有することが確認できた。また、図１の結果と同様に、上記方法により、脳脊髄液をそのままサンプルとして用いても、自己抗体を検出できることも確認できた。

【0036】

（比較例）
図１の試験で用いた脳神経細胞膜と同じ可溶化した脳神経細胞膜１５μＬに５μＬの４×ＳＤＳサンプルバッファーを加えてよく混ぜ変性させ、７及び１０μＬを泳動サンプルとした。ＳＤＳ電気泳動は、ＮｕＰＡＧＥ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ＮＰ０３１６ＢＯＸ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（ＥＩ０００１）にセットし、１×ＭＯＰＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ Ｂａｓｅ、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、（ｐＨ７．７））で満たし、１４０Ｖ ６０分泳動した。泳動後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、図１と同じ市販の抗ＧｌｕＮ１、ＧｌｕＮ２Ａ又はＧｌｕＮ２Ｂ抗体とＣＳＦを使い上記と同じ方法でウェスタンブロットを行った。その結果を図３に示す。

【0037】

図３に示すように、市販の抗ＧｌｕＮ１、ＧｌｕＮ２Ａ又はＧｌｕＮ２Ｂ抗体を用いた場合は、いずれもバンドが検出された。なお、各抗体の結果を示す写真のうち左側が７μＬ、右側が１０μＬの泳動サンプルを用いたバンドである。一方、ＣＳＦを用いた場合はバンドが検出されなかった。市販の抗体でバンドが検出されていることから、ＮＭＤＡ受容体が存在していることは確かではあるが、この比較例ではサンプルを変性させているため、ＮＭＤＡ受容体が各サブユニットに分離されているので、ＣＳＦでは検出できなかったと考えられる。

【0038】

以上の実施例及び比較例に示す通り、本発明に係る自己抗体の検出方法によると、非変性ブルーネイティブ電気泳動を利用することによって、簡便且つ高精度に自己抗体の存在を検出できる。

【図1】

【図2】

【図3】