特開 2024-105244 ポンペ病の処置のための高濃度α－グルコシダーゼ組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024105244

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ポンペ病の処置のための高濃度α－グルコシダーゼ組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/47 20060101AFI20240730BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

A61K38/47

A61K47/22

A61K9/08

A61K47/10

A61K47/18

A61K47/40

A61P21/00

C12N9/26

C12N15/56

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024061569

(22)【出願日】2024-04-05

(62)【分割の表示】P 2021158067の分割

【原出願日】2013-03-07

(31)【優先権主張番号】61/607,920

(32)【優先日】2012-03-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/750,718

(32)【優先日】2013-01-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＮＯＮＩＤＥＴ

３．ＢＲＩＪ

４．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

５．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507170099

【氏名又は名称】アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】バレンザーノ， ケニス ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】クラウリー， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】カンナ， リッチ

(72)【発明者】

【氏名】フラナガン， ジョン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ポンペ病処置のための新規組成物、およびそれらの組成物を対象に投与する方法を提供する。
【解決手段】高濃度の酸α－グルコシダーゼを、酸α－グルコシダーゼのための活性部位特異的シャペロンと組み合わせて含む組成物と、処置を必要とする対象におけるポンペ病の処置方法であって、それらの組成物を対象に投与する方法を含む、方法とを提供する。本願はまた、酸α－グルコシダーゼ酵素製剤のインビトロ及びインビボでの安定性を増大させる方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

酸α－グルコシダーゼと、１－デオキシノジリマイシン及びｎ－ブチルデオキシノジリマイシンからなる群から選択される活性部位特異的シャペロンとを含む組成物であって、前記酸α－グルコシダーゼが、約５ｍｇ／ｍＬを超える量で存在する、組成物。

【請求項2】

前記酸α－グルコシダーゼ酵素が、組み換えヒト野生型酸α－グルコシダーゼである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記活性部位特異的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記活性部位特異的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシンの塩酸塩である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記活性部位特異的シャペロンが、ｎ－ブチル－デオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記酸α－グルコシダーゼが、約５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記酸α－グルコシダーゼが、約２５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約１１５ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ及び約２４０ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される量で存在する、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記活性部位特異的シャペロンが、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記活性部位特異的シャペロンが、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が、対象に皮下投与するために処方されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記組成物が、対象に静脈内投与するために処方されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液、リン酸緩衝液及びこれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝液を更に含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

ポリエチルグリコール４００、アルギニン、グルタミン酸、プロリン、γ－シクロデキストリン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される賦形剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

対象におけるポンペ病の処置方法であって、酸α－グルコシダーゼと、１－デオキシノジリマイシン及びｎ－ブチルデオキシノジリマイシンからなる群から選択される活性部位特異的シャペロンとを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記酸α－グルコシダーゼが約５ｍｇ／ｍＬを超える量で存在する、方法。

【請求項15】

前記活性部位特異的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記酸α－グルコシダーゼが、約５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記活性部位特異的シャペロンが、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記活性部位特異的シャペロンが、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

前記活性部位特異的シャペロンが、ｎ－ブチルデオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記組成物が皮下投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

前記組成物が、前記用量の前記投与から約１０時間～約５０時間以内に、前記対象の筋組織内で酸α－グルコシダーゼのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項22】

前記組成物が、前記用量の前記投与から約２４時間以内に、前記対象の筋組織内で酸α－グルコシダーゼのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項23】

前記組成物が単一用量製剤である、請求項１４に記載の方法。

【請求項24】

前記組成物が多用量製剤である、請求項１４に記載の方法。

【請求項25】

前記組成物が、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、又は７日に１回投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項26】

前記組成物が、週に２回投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項27】

対象に皮下投与するための製剤中の酸α－グルコシダーゼの安定性を増大させる方法であって、前記酸α－グルコシダーゼを、１－デオキシノジリマイシン及びｎ－ブチル－デオキシノジリマイシンからなる群から選択される活性部位特異的シャペロンと組み合わせることを含み、前記酸α－グルコシダーゼが約５ｍｇ／ｍＬを超える量で存在する、方法。

【請求項28】

前記活性部位特異的シャペロンが１－デオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記酸α－グルコシダーゼが、約５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記活性部位特異的シャペロンが、約０．５～約２０ｍＭの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記活性部位特異的シャペロンが、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在する１－デオキシノジリマイシンである、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

前記活性部位特異的シャペロンが、ｎ－ブチル－デオキシノジリマイシン又はその薬学的に許容され得る塩である、請求項２７に記載の方法。

【請求項33】

前記酸α－グルコシダーゼが、前記製剤中で前記酸α－グルコシダーゼの凝集を低減するのに有効な量の前記活性部位特異的シャペロンと組み合わされる、請求項２７に記載の方法。

【請求項34】

前記酸α－グルコシダーゼが、インビトロで安定化される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記酸α－グルコシダーゼが、インビボで安定化される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、各々優先権が主張され、また各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年３月７日出願の米国仮特許出願第６１／６０７，９２０号明細書、及び２０１３年１月９日出願の米国仮特許出願第６１／７５０，７１８号明細書による利益を主張する。

【0002】

１．序文
本発明は、ポンペ病を処置し、予防し及び／又は回復させる方法に関する。本発明は、ポンペ病の処置における使用に標識され得る組成物及び薬物にも関する。

【背景技術】

【0003】

２．背景技術
ポンペ病（酸マルターゼ欠損）は酵素酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠乏により生じる。ＧＡＡは、エネルギーに使用される糖の貯蔵形態であるグリコーゲンをグルコースに代謝する。グリコーゲンの蓄積は、全身に進行性の筋疾患をもたらし、これは様々な身体組織、特に心臓、骨格筋、肝臓及び神経系を冒す。国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）によれば、ポンペ病は４０，０００人の出生中約１人に発生すると推定されている。

【0004】

ポンペ病の認識された３つの型－乳児、若年及び成人発症型が存在する（例えば、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ ａｎｄ Ｒｅｕｓｅｒ，Ｉｎ：Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＲ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ，Ｓｌｙ Ｗ，Ｖａｌｌｅ Ｄ，編集者；Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ；２００１．ｐ．３３８９－４２０．，２００１：３３８９－３４２０参照）。乳児発症型ポンペ病は最も重篤であり、筋緊張の重篤な欠乏、脱力、拡大肝臓及び心臓、並びに心筋症を含む症状を呈する。嚥下が困難となり得、舌が突出し、拡大する場合がある。殆どの子供は、２才以前に呼吸器又は心臓合併症により死亡するが、乳児発症型患者のサブセットは、より長期間生存する（非古典型乳児患者）。若年発症型ポンペ病は、最初に、小児の早期～後期に見出され、体幹内の呼吸筋、横隔膜及び下肢の進行性脱力、並びに運動不耐性を含む。殆どの若年発症型ポンペ患者は、人生の２０年又は３０年を超えて生存しない。成人発症型症状は、全身性の筋力低下、並びに体幹内の呼吸筋、下肢及び横隔膜の衰弱を含む。ある成人患者は、主な症状又は運動限界を有しない。

【0005】

出生前スクリーニング中に同定されない限り、ポンペ病の診断は困難である。成人発症型ポンペの診断は、患者が経験する症状の数、重篤さ及びタイプが非常に様々であるため、更により困難であり、筋ジストロフィー等のより一般的な疾患を示唆する場合がある。診断は、α－グルコシダーゼ活性を測定し、及び／又は、生物学的サンプルからグリコーゲンの病理学的レベルを検出することにより裏付けられる。現在認可されている唯一の治療法は、組み換えα－グルコシダーゼを用いた酵素補充療法である。

【0006】

ポンペ病は、グリコーゲン病態のいくつかの症状の１つである。他には、脱分枝酵素欠損症（Ｃｏｒｉ’ｓ－Ｆｏｒｂｅｓ病；糖原病ＩＩＩ型）；分枝酵素欠損症（糖原病ＩＶ型；アンダーソン病）；筋ホスホリラーゼ（マッカードル病、グリコーゲン貯蔵病Ｖ型）；ホスホフルクトキナーゼ欠損－Ｍアイソフォーム（タウリ病（Ｔａｕｒｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）；糖原病ＶＩＩ型）；ホスホリラーゼｂキナーゼ欠損症（糖原病ＶＩＩＩ型）；ホスホグリセリン酸キナーゼＡ－アイソフォーム欠損症（糖原病ＩＸ）；ホスホグリセリン酸Ｍ－ムターゼ欠損症（糖原病Ｘ型）が挙げられる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

３．課題を解決するための手段
本発明は、ポンペ病（例えば、乳児発症型ポンペ病）の処置のための方法に関し、このような方法は、そのような処置を必要とする個人に、酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素、（例えば、組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ））を、ＧＡＡ酵素（例えば、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ、１－ＤＮＪ））のための活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）と組み合わせて投与することによる。

【0008】

本発明は更に、適切な立体構造にあるＧＡＡ酵素のインビボ及びインビトロでの安定性を増大させる方法を提供する。一実施形態において、酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素（例えば、組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ））とＧＡＡ酵素（例えば、１－デオキシノジリマイシン又は１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ）のためのＡＳＳＣとの組み合わせは、そのような処置を必要とする個人に投与される。ＧＡＡ酵素は、ＡＳＳＣと組み合わされた際、立体構造的に安定化され、例えば熱及びｐＨチャレンジに耐えるのに非常に適している。

【0009】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素は、高濃度で、例えば濃度約５～約２５０ｍｇ／ｍＬでＡＳＳＣと組み合わされる。

【0010】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素は、高濃度で、例えば約２５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約１１５ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ及び約２４０ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される濃度でＡＳＳＣと組み合わされる。

【0011】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素はＡＳＳＣと組み合わされ、ＡＳＳＣは濃度約５ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬで存在する。

【0012】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素はＡＳＳＣと組み合わされ、ＡＳＳＣは、約３２ｍｇ／ｍＬ及び約１６０ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される濃度で存在する。

【0013】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素はＡＳＳＣと組み合わされ、ＡＳＳＣは濃度約０．５ｍＭ～約２０ｍＭで存在する。

【0014】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素は、共製剤として、ＡＳＳＣと組み合わされる。

【0015】

所定の実施形態では、ＧＡＡ酵素は、共製剤中でＡＳＳＣと組み合わされ、共製剤は更に賦形剤を含む。所定の実施形態では、賦形剤は、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－４００、アルギニン、アルギニン及びグルタミン酸、プロリン、γ－シクロデキストリン、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0016】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、タンパク質が高濃度であるにも係わらず、長期間に亘って物理的及び化学的安定性を維持し、また皮下投与に好適な粘度を有する。本発明の製剤は、少なくとも一部は、ＡＳＳＣと組み合わせたＧＡＡ酵素が高濃度（例えば２５ｍｇ／ｍＬ）で可溶性を維持し得、注射（例えば皮下投与）に好適な粘度を維持すると共に、凝集しない状態のままであるという驚くべき発見に基づいて確立されている。

【0017】

所定の実施形態では、本発明の組成物は、約５ｍｇ／ｍＬを超えるＧＡＡ酵素を含む。

【0018】

所定の実施形態では、本発明の組成物は、約２５ｍｇ／ｍＬのＧＡＡ酵素及び約１０ｍＭのＤＮＪを含む。

【0019】

所定の実施形態では、本発明の組成物は、約２５ｍｇ／ｍＬのＧＡＡ酵素及び約１ｍＭのＤＮＪを含む。

【0020】

本発明の製剤の利点は、通常、タンパク質濃度が増大すると起こるタンパク質凝集を増大させることなく、高濃度のタンパク質を提供することである。一実施形態において、本発明の製剤は、約１％未満の凝集体タンパク質を有する。

【0021】

本発明の一態様によれば、ポンペ病を有する個人の組織、例えば筋組織へのＧＡＡの送達を向上させる方法を提供する。本方法は、ＧＡＡをＡＳＳＣと組み合わせて、個人に皮下投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡとＡＳＳＣとの組み合わせは、用量の投与から２４時間以内に、対象の組織内でＧＡＡのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される。所定の実施形態では、ＧＡＡとＡＳＳＣとの組み合わせは、用量の投与から約１０～約５０時間、又は約４５、４０、３５、３０、２５、又はそれ未満の時間以内に、対象の組織内でＧＡＡのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は、個人の肝臓内で毒性レベルのＧＡＡをもたらさない。

【0022】

非限定的な様々な実施形態では、ＧＡＡ酵素のためのＡＳＳＣは、ＧＡＡ酵素の可逆的かつ競合的な阻害剤を含む、ＧＡＡ酵素の小分子阻害剤である。

【0023】

一実施形態において、ＡＳＳＣは、式：

（式中、Ｒ_１は、Ｈ又は１～１２個の炭素原子を含む直鎖若しくは分岐鎖のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキル若しくはアミノアルキルであり、これらは任意選択で－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－Ｃｌ、－Ｆ、－ＣＦ_３、－ＯＣＦ_３、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ－（アルキル）_２で置換され；Ｒ_２は、Ｈ又は１～９個の炭素原子を含む直鎖若しくは分岐鎖のアルキル、シクロアルキル若しくはアルコキシルアルキルである）により表され；その薬学的に許容され得る塩、エステル及びプロドラッグを含む。一実施形態において、ＡＳＳＣは、上記に定義した通りであり、Ｒ_１はＨである。別の実施形態では、ＡＳＳＣは、上記に定義した通りであり、Ｒ_２はＨである。

【0024】

非限定的な特定の一実施形態では、ＡＳＳＣは以下の式：

により表される１－デオキシノジリマイシン（１－ＤＮＪ）、又は１－デオキシノジリマイシンの薬学的に許容され得る塩、エステル若しくはプロドラッグである。一実施形態において、塩は、塩酸塩（即ち、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ）である。

【0025】

特定の非限定的な一実施形態において、ＡＳＳＣは、以下の式：

により表されるＮ－ブチル－デオキシノジリマイシン（ＮＢ－ＤＮＪ；Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）、Ａｃｔｅｌｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＮＢ－ＤＮＪの薬学的に許容され得る塩、エステル若しくはプロドラッグである。

【0026】

非限定的な特定の一実施形態では、ＡＳＳＣは、以下の式：

により表されるＣ_１０Ｈ_１９ＮＯ_４、又はＣ_１０Ｈ_１９ＮＯ_４の薬学的に許容され得る塩、エステル若しくはプロドラッグである。一実施形態において、塩は、塩酸塩である。

【0027】

非限定的な特定の一実施形態では、ＡＳＳＣは、以下の式：

により表されるＣ_１２Ｈ_２３ＮＯ_４、又はＣ_１２Ｈ_２３ＮＯ_４の薬学的に許容され得る塩、エステル若しくはプロドラッグである。一実施形態において、塩は、塩酸塩である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】熱安定性アッセイにて決定した、１００μＭの１－デオキシノジリマイシン塩酸塩（１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）の存在下又は不在下における、ＥＲｐＨ（７．４）又はリソソームｐＨ（５．２）での組み換えヒトＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）の安定性を示す。熱安定性アッセイは、タンパク質変性を誘導するのに熱を利用し、このような変性は、疎水性アミノ酸（折り畳まれたタンパク質内では曝露されていない）に結合した後、蛍光を発するＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ染料を使用して監視される。変性により多くの熱を必要とするタンパク質構造は、定義によれば、より安定である。上記に示したように、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、通常、ＥＲｐＨ（７．４）と比較してリソソームｐＨ（５．２）にて遙かに、より安定である。しかしながら、ｐＨ７．４における酵素安定性は、１００μＭの１－デオキシノジリマイシンの添加後、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独と比較して有意に増大する。

【図2A】３７℃における、血漿ｐＨ（７．４）又はリソソームｐＨ（５．２）での組み換えヒトＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）酵素活性に対する１－ＤＮＪ－ＨＣｌの効果を示す。ＧＡＡ活性を評価して、ＧＡＡのＡＳＳＣがある時間に亘りｒｈＧＡＡの活性を延長する能力を評価した。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（４５ｎＭ）を、ｐＨ７．４又はｐＨ５．２緩衝液中で、５０μＭの１－ＤＮＪを有し又は有さずに３７℃で２４時間に亘ってインキュベートした。サンプルを、０、３、６及び２４時間にて、４－ＭＵ－α－グルコースを使用してＧＡＡ酵素活性に関してアッセイし、残留ＧＡＡ活性を初期活性の％として表した。これらの結果は、１－ＤＮＪが血漿ｐＨ（７．４）にてＧＡＡ酵素活性の損失を回復することを示す。

【図2B】図２Ａに示した、ＥＲｐＨ（７．４）における酵素活性の損失、特にＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）活性の損失が、タンパク質アンフォールディング及び変性と相関するか否かを決定する、並行ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱安定性実験を示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（０．９μＭ）を、ｐＨ７．４又はｐＨ５．２緩衝液中で、１００μＭの１－ＤＮＪ－ＨＣｌを有し又は有さずに３７℃でインキュベートし、タンパク質折り畳みを２４時間に亘って毎時監視した。図２Ａ及び２Ｂは、ＧＡＡ変性が酵素活性の損失と相関することを示す（２つの図にて、曲線を菱形曲線と比較されたい）。より重要なことには、これらの結果は、１－ＤＮＪが血漿ｐＨにおいてＧＡＡ変性を防止し、酵素活性の損失を防止できることを示す。

【図3】１－ＤＮＪ－ＨＣｌの同時の経口投与を有し及び有さずに、ＥＲＴを受容したＧＡＡ ＫＯマウスに関するＧＡＡ活性試験の結果を示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、単独で、又は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）投与の３０分前と、８、１６及び２４時間後の１０、１００若しくは１０００ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌとの組み合わせで、用量１０ｍｇ／ｋｇで、週に１回、３週間迄、ＩＶ注入を介して投与された。これらの結果は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）組織取り込み（ＧＡＡ活性の尺度としての）が、注射から７日後に低下したことを示す。１－ＤＮＪ－ＨＣｌとＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）との共投与は、注射から７日後迄の間、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）取り込みの用量依存的増大を促進する。１－ＤＮＪ－ＨＣｌの効果は、週に１、２又は３回のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の注入のいずれも、注射から４及び７日後において、より明白かつ有意であった（ｐ＜０．０５ｔ検定、対Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独）。

【図4】１－ＤＮＪ－ＨＣｌが約１μＭのＩＣ_５０によりＧＡＡを阻害することを示す。

【図5】タンパク質変性を誘導するのに熱を利用する熱安定性アッセイの結果を示し、このような変性は、疎水性アミノ酸（折り畳まれたタンパク質内では曝露されていない）に結合した後、蛍光を発するＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ染料を使用して監視される。ＧＡＡの融解温度が用量依存的に増大することから明かなように、１－ＤＮＪ－ＨＣｌはＧＡＡ熱安定性を増大させる。

【図6】経口投与された３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌを有し及び有しない、１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ又は生理食塩水のＩＶ投与から２４時間に亘る、ラットにおけるＧＡＡ活性の結果を示す。ｒｈＧＡＡ又は生理食塩水を、１－ＤＮＪ－ＨＣｌ投与の３０分後に投与した。この実施例では、１－ＤＮＪ－ＨＣｌは、投与後の酵素活性の損失を抑制し、それによりｒｈＧＡＡのインビボでの半減期を延長した。ｒｈＧＡＡのインビボでの半減期は、１．４±０．２時間（０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）から２．１±０．２時間（３ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）及び３．０±０．４時間（３０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）に延長した。

【図7】ＧＡＡ ＫＯマウスに投与した際の、ＥＲＴ単独療法及びＥＲＴ／ＡＳＳＣ併用療法（ｒｈＧＡＡ＋１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）に関する心臓及び横隔膜組織内のＧＡＡ活性を示す。心臓及び横隔膜内でのｒｈＧＡＡ取り込みは、１－ＤＮＪ－ＨＣｌと共投与された際に増大する。

【図8】１－ＤＮＪ－ＨＣｌが血中でｒｈＧＡＡ酵素不活性化を防止することを示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（０．５μＭ）を、５０μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌの存在下又は不在下、クエン酸塩で抗凝固処理した全血中にて３７℃でインキュベートした。アリコートを０、２、４、８及び２４時間にて収集し、遠心分離して血漿を得た。次いで、これらの血漿サンプルを酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で希釈し、４－メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ）－α－グルコース（４－ＭＵＧ）蛍光発生基質を使用して、ＧＡＡ活性に関してアッセイした。各時点における測定した個人サンプルに関するＧＡＡ活性を、０時間に対して正規化し、初期活性の％として表した。４つの独立実験からのデータを分析して平均（及び標準偏差）を得、時間に対してプロットして、この時間経過に亘る酵素活性の損失を評価した。

【図9】低い１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度が、血中でｒｈＧＡＡ酵素不活性化を防止することを示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（０．５μＭ）を、様々な１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度（０～１００μＭ）と共に、クエン酸塩で抗凝固剤処理した全血中にて３７℃でインキュベートした。アリコートを０、３及び６時間にて収集し、遠心分離して血漿を得た。次いで、これらの血漿サンプルを酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中で希釈し、４－メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ）－α－グルコース（４－ＭＵＧ）蛍光発生基質を使用して、ＧＡＡ活性に関してアッセイした。各時点における測定した個人サンプルに関するＧＡＡ活性を、０時間に対して正規化し、初期活性の％として表した。残留ＧＡＡ酵素活性を時間に対してプロットして、この時間経過に亘る１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度に関連した酵素活性の損失を評価した。

【図10】実施例９に関する実験設計を示す。

【図11】１－ＤＮＪ－ＨＣｌと共投与したＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）が、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独と比較して、ＧＡＡ ＫＯマウスにおいて有意により高い組織グリコーゲン低下をもたらしたことを示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独によるグリコーゲン低下は、未処置マウスに対して、心臓、横隔膜、ヒラメ筋及び四頭筋内で各々９３±１％、４１±４％、６９±３％及び１８±４％であった。１－ＤＮＪ－ＨＣｌと共投与したＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）によるグリコーゲン低下は、各々９６±０．６％、６６±５％、８２±３％及び２３±３％であった。

【図12】１ｍＭ ＤＮＪを２５ｍｇ／ｍＬ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）と組み合わせることにより、中性ｐＨ７．４及び３７℃でＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の凝集が低減されることを示す。凝集は、４週間のインキュベーション期間後に評価した。

【図13】１０ｍｇ／ｋｇ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）と等価な量で共処方された３０ｍｇ／ｋｇ ＤＮＪを、尾静脈注射を介して投与することにより、四頭筋内においてＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の循環血漿半減期及び組織取り込みが増大したことを示す。

【図14】２０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）と共処方されたＤＮＪの皮下投与が、ＤＮＪを有しない２０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の投与と比較して、ｒｈＧＡＡの循環レベルを増大させたことを示す。

【図15】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、注射部位における皮膚内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図16A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、腹側皮膚内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図16B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、腹側皮膚内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図17A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、心臓内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図17B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、心臓内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図18A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、舌内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図18B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、舌内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図19A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、横隔膜内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図19B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、横隔膜内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図20A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、二頭筋内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図20B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、二頭筋内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図21A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、三頭筋内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図21B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、三頭筋内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図22A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、腓腹筋内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図22B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、腓腹筋内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図23A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、四頭筋内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図23B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から１４日後の、四頭筋内でのグリコーゲンレベルを示す。

【図24】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、ヒラメ筋内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図25】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後の、肝臓内でのｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図26】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から３日後に試験した、様々な組織内でのｒｈＧＡＡ活性の比較を示す。

【図27A】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から２時間（Ａ）後の血漿ｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図27B】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から４時間（Ｂ）後の血漿ｒｈＧＡＡ活性を示す。

【図28】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から２時間後の血漿ｒｈＧＡＡ活性及び血漿ＧＡＡタンパク質レベル（ウェスタンブロットにより測定して）を示す。

【図29】実施例１３に記載した、ｒｈＧＡＡ又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤のマウスへの最終皮下投与から４時間後の血漿ｒｈＧＡＡ活性及び血漿ＧＡＡタンパク質レベル（ウェスタンブロットにより測定して）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

５．発明を実施するための形態
本発明は、少なくとも一部は、酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素（例えば、組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ））をＧＡＡ酵素（例えば１－デオキシノジリマイシン）のためのＡＳＳＣと組み合わせることにより、いずれかの処置単独と比較して、インビボでのＧＡＡ活性の驚くほどの増大がもたらされるという発見に基づいている。本発明はまた、少なくとも一部は、ＧＡＡ酵素（例えばｒｈＧＡＡ）が－インビトロ及びインビボの両方で－ＧＡＡ酵素のためのＡＳＳＣの添加後、適切な立体構造を安定化させるという発見に基づいている。本発明はまた、少なくとも一部は、ＡＳＳＣを高濃度のＧＡＡと組み合わせることにより、高いＧＡＡ濃度で通常生じるＧＡＡ凝集が低減されるという発見に基づいている。

【0030】

明確さのために、また限定する目的ではなく、この詳細な記載は、以下のサブ部分に分割される。
（ｉ）定義；
（ｉｉ）ポンペ病；
（ｉｉｉ）ＧＡＡ及びＡＳＳＣの獲得；
（ｉｖ）ＥＲＴ及びＡＳＳＣを用いたポンペ病の処置；
（ｖ）医薬組成物；
（ｖｉ）インビトロでの安定性；並びに
（ｖｉｉ）インビボでの安定性。

【0031】

５．１ 定義
本明細書で一般的に使用される用語は、本発明の状況、及び各用語が使用される特定の状況において、当技術分野にて通常の意味を有する。所定の用語は、本発明の組成物及び方法、並びにそれらの作製及び使用方法の説明において更なるガイダンスを実践者に提供するために、下記又は本明細書の他の箇所に論じられる。

【0032】

本発明によれば、「対象」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト動物である。動物対象はヒトが好ましいが、本発明の化合物及び組成物は、例えばイヌ、ネコ、及び様々な他のペット等の飼い慣らされた種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜種；例えば、野生又は動物園内の野生動物；並びにニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、鳴鳥類等の鳥類の処置のための獣医学においても用途を有する。

【0033】

用語「酵素補充療法」又は「ＥＲＴ」は、非天然の、精製された酵素を、それらの酵素が欠損した個人内に導入することを指す。投与される酵素は、天然源から又は組み換え発現により得ることができる。この用語はまた、精製酵素を、別様に精製酵素の投与を必要とする又はこのような投与から利益を得る、例えばタンパク質不全症に苦しむ個人に導入することを指す。導入酵素は、インビトロで生成された、精製された組み換え酵素であってもよく、又は単離された組織若しくは流体、例えば胎盤若しくは畜乳、若しくは植物から精製された酵素であってもよい。

【0034】

用語「適切な立体構造を安定化させる」は、野生型又は突然変異体タンパク質の構造がその天然の形態又は適切な形態として維持され得るように、化合物若しくはペプチド若しくは他の分子が野生型タンパク質、又は、このような野生型タンパク質の野生型機能をインビトロ及びインビボで行うことができる突然変異体タンパク質と関連する能力を指す。この効果は、（ｉ）タンパク質の有効期間の延長；又は（ｉｉ）タンパク質の単位／量当たりの活性の向上；又は（ｉｉｉ）インビボでの効力の向上のうちの１つ以上を介して実践的に現れ得る。これは、発現中、ＥＲからの収量の増大；又は温度上昇に起因するアンフォールディングに対する耐性の増大（例えば、熱安定性アッセイにて決定して）、又はカオトロピック剤の存在を介して実験的に、及び類似した手段により観察することができる。

【0035】

本明細書で使用される用語「活性部位」は、ある特定の生物学的活性を有するタンパク質の領域を指す。例えば、活性部位は、基質又は他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成及び切断に直接参加するアミノ酸残基に寄与する部位であってもよい。本発明における活性部位は、酵素の触媒部位、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合ドメイン、制御因子の結合ドメイン、又は分泌タンパク質の受容体結合ドメインを包含してもよい。活性部位はまた、トランス活性化、タンパク質－タンパク質相互作用、又は転写因子及び制御因子のＤＮＡ結合ドメインも包含し得る。

【0036】

本明細書で使用される用語「活性部位特異的シャペロン」は、タンパク質の活性部位と特異的に可逆的に相互作用して、安定な分子立体構造の形成を向上させる、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物等を含む任意の分子を指す。本明細書で使用される「活性部位特異的シャペロン」は、Ｂｉｐ、カルネキシン若しくはカルレティキュリン等の、細胞のＥＲ内に存在する内因性の一般的シャペロン、又は、重水、ＤＭＳＯ若しくはＴＭＡＯ等の一般的な非特異的化学シャペロンを含まない。

【0037】

本明細書で使用される用語「精製された」は、そこから材料が得られた天然材料を含む無関連材料、即ち汚染物質の存在を低減又は排除する条件下で単離されている材料を指す。例えば、精製タンパク質は、細胞内で関連している他のタンパク質又は核酸を実質的に含まないことが好ましく；精製核酸分子は、細胞内でこのような核酸分子と共に見出され得るタンパク質又は他の無関連核酸分子を実質的に含まないことが好ましい。本明細書で使用される用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の状況下で操作的に使用される。汚染物質を実質的に含まない精製材料は、少なくとも９５％純粋；より好ましくは少なくとも９７％純粋、尚より好ましくは少なくとも９９％純粋であることが好ましい。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成物分析、生物学的アッセイ、及び当技術分野にて既知の他の方法により評価することができる。特定の実施形態では、精製された、は、汚染物質のレベルが、ヒト又は非ヒト動物に対する安全な投与のために、規制当局により許容可能なレベルを下回ることを意味する。

【0038】

本明細書で使用される用語「突然変異体」及び「突然変異」は、遺伝子材料、例えばＤＮＡにおける任意の検出可能な変化、又はそのような変化の任意のプロセス、機構若しくは結果を意味する。突然変異体及び突然変異は、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変更された遺伝子突然変異、任意の突然変異プロセスにより生じた任意の遺伝子又はＤＮＡ、及び改変遺伝子又はＤＮＡ配列により発現される任意の発現生成物（例えばＲＮＡ、タンパク質又は酵素）を含む。

【0039】

本明細書で使用される用語「突然変異体タンパク質」は、タンパク質配列の変更をもたらす遺伝子突然変異を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質を指す。特定の実施形態では、そのような突然変異により、タンパク質は、ＥＲ内に通常存在する条件下で、その天然の立体構造を達成することが不可能となる。この立体構造の達成の障害により、これらのタンパク質は、タンパク質輸送システムにおける通常の経路を介して細胞内の適切な位置へ輸送されるのではなく、分解されることになる。他の突然変異は、活性の低下、又はより急速な代謝回転をもたらし得る。

【0040】

本明細書で使用される用語「野生型遺伝子」は、インビボで通常の生物学的機能活性を有することが可能なタンパク質をコードする核酸配列を指す。野生型核酸配列は、生物活性に殆ど又は全く影響しないアミノ酸置換をもたらす限り、公表されている既知の配列とは異なるヌクレオチド変化を含んでもよい。用語、野生型はまた、内因性又は天然タンパク質に対して増大又は向上された活性が可能なタンパク質をコードするように操作された核酸配列も含み得る。

【0041】

本明細書で使用される用語「野生型タンパク質」は、インビボで発現又は導入された際に機能的な生物学的活性を有することが可能な、野生型遺伝子によりコードされた任意のタンパク質を指す。用語「通常の野生型活性」は、細胞内でのタンパク質の通常の生理学的機能を指す。そのような機能性は、タンパク質の機能性を確立するのに既知の、任意の手段により試験することができる。

【0042】

用語「遺伝子改変された」は、遺伝子生成物をコードするコード配列を、そのコード配列の発現を制御する制御要素と共に含む核酸の導入後、特定の遺伝子生成物を発現する細胞を指す。核酸の導入は、遺伝子ターゲティング及び相同組み換えを含む、当技術分野にて既知の任意の方法により達成することができる。本明細書で使用されるように、この用語はまた、例えば遺伝子活性化技術によって、それらの細胞により通常発現されない内因性遺伝子又は遺伝子生成物を発現又は過剰発現するように操作されている細胞を含む。

【0043】

「薬学的に許容され得る」というフレーズは、本発明の医薬組成物に関連して使用されているかいないかに係わらず、生理学的に容認でき、典型的にはヒトに投与された際に望ましくない反応を生じない分子存在物及び組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される用語「薬学的に許容され得る」は、動物、及びより詳細にはヒトでの使用のために、連邦若しくは州政府の規制当局により認可され、又は米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）若しくは他の一般に認識されている薬局方にリストされていることを意味する。用語「担体」は、化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水及び油等の無菌液体であってもよい。水又は水溶液生理食塩水溶液、並びにデキストロース及びグリセロール水溶液は、担体、特に注射用溶液として使用するのに好ましい。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，第１８版による「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0044】

用語「治療的に有効な用量」及び「有効な量」は、治療的応答をもたらすのに十分な化合物の量を指す。ＡＳＳＣ及びＧＡＡが複合体として投与される実施形態では、用語「治療的に有効な用量」及び「有効な量」は、治療的応答をもたらすのに十分な複合体の量を指し得る。治療的応答は、使用者（例えば、臨床医）が、治療法に対する有効な応答と認識するであろう任意の応答であってもよい。それ故、治療的応答は、一般に、疾病又は疾患の１つ以上の症状又は徴候の回復であろう。

【0045】

精製された治療的タンパク質のインビトロでの生成、輸送又は保管中に阻害的であるＡＳＳＣの濃度は、インビボでの投与後の、ＡＳＳＣの希釈（及び結果としての、平衡の変化による結合のシフト）、生物学的利用能及び代謝により本発明の目的のための「有効な量」を尚構成し得ることに留意するべきである。

【0046】

用語「アルキル」は、不飽和を含まず、単一結合によって分子の残りの部分に結合している炭素及び水素原子のみからなる直鎖又は分岐鎖の炭化水素、例えばメチル、エチル、Ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソプロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）を指す。

【0047】

用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含み、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ_２～Ｃ_２０脂肪族炭化水素基、例えばエテニル、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、イソプロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニルを指す。

【0048】

用語「シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等の、不飽和の非芳香族単環式－又は多環式炭化水素環系を示す。多環式シクロアルキル基の例としては、ペルヒドロナフチル、アダマンチル及びノルボルニル基の架橋環式基、又はスピロ二環式基、例えばスピロ（４，４）ノナ－２－イルが挙げられる。

【0049】

用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル等の、約６～約１４個の範囲内の炭素原子を有する芳香族ラジカルを指す。

【0050】

用語「複素環式」は、炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される１～５個のヘテロ原子とからなる、安定な３～１５員環ラジカルを指す。本発明の目的のために、複素環ラジカルは、単環式又は二環式の環系であってもよく、これらは縮合又は架橋環系を含んでもよく、また、複素環ラジカル内の窒素、炭素、酸素又は硫黄原子は、任意選択で様々な酸化状態に酸化されてもよい。加えて、存在する場合、窒素原子は、任意選択で第四級化されてもよく；また環ラジカルは、部分的又は完全に飽和されていてもよい（即ち、複素環式芳香族又はヘテロアリール芳香族）。

【0051】

複素環ラジカルは、安定な構造の形成をもたらすように、いずれかのへテロ原子又は炭素原子にて主構造に結合し得る。

【0052】

用語「ヘテロアリール」は、環が芳香族である複素環を指す。

【0053】

「置換アルキル」、「置換アルケニル」、「置換シクロアルキル」、「置換アリール」及び「置換ヘテロアリール」における置換基は、同一でも又は異なっていてもよく、１つ以上は、水素、ハロゲン、アセチル、ニトロ、カルボキシル、オキソ（＝Ｏ）、ＣＦ_３、－ＯＣＦ_３、ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）－アルキル_２、ＯＣＨ_３、又は任意選択で、アルキル、アルコキシ及びアリールから選択される置換された基の群から選択される。

【0054】

用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素のラジカルを指す。

【0055】

５．２ ポンペ病
ポンペ病は、リソソームグリコーゲン代謝を損なう、欠損した酸αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性により特徴付けられる、常染色体劣性ＬＳＤである。酵素欠損は、リソソームグリコーゲン蓄積に繋がり、進行性の骨格筋脱力、心機能の低下、呼吸不全、及び／又は、疾病の後期におけるＣＮＳ障害をもたらす。ＧＡＡ遺伝子における遺伝子突然変異は、酵素の発現の低下、又は、安定性及び／若しくは生物学的活性が変更された酵素の突然変異体形態の生成をもたらし、最終的に疾病に繋がる（一般に、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ Ｒ，１９９５，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ：Ａｃｉｄ α－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，編，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第７版，ｐｐ．２４４３－２４６４を参照されたい）。ポンペ病の認識された３つの臨床形態（乳児、若年及び成人）は、残留α－グルコシダーゼ活性のレベルと相関する（Ｒｅｕｓｅｒ Ａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＩＩ（Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ），Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３，Ｓ６１－Ｓ６９）。ＡＳＳＣ（他の箇所で「薬理学的シャペロン」とも称される）は、リソソーム貯蔵疾患（例えばポンペ病）等の遺伝子疾病の処置のための見込みのある新しい治療的アプローチとなる。

【0056】

乳児型ポンペ病（Ｉ型又はＡ型）は、最も一般的かつ最も重篤であり、人生の２年以内での成長の不全、全身性緊張低下、心臓肥大症及び心呼吸系不全症により特徴付けられる。若年型ポンペ病（ＩＩ型又はＢ型）は、中間の重症度であり、心拡大を有しない筋症状の優勢により特徴付けられる。若年型ポンペの個人は、通常、呼吸不全により、２０歳に達する前に死亡する。成人型ポンペ病（ＩＩＩ型又はＣ型）は、多くの場合、１０代、又は６０代という遅くに、緩徐進行性のミオパシーとして呈される（Ｆｅｌｉｃｅ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ａｄｕｌｔ－Ｏｎｓｅｔ Ａｃｉｄ Ｍａｌｔａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ａｆｆｅｃｔｅｄ Ｓｉｂｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７４，１３１－１３５）。

【0057】

ポンペでは、α－グルコシダーゼがグリコシル化、リン酸化、及びタンパク質分解工程により翻訳後に広範に改変されることが示されている。最適なグリコーゲン触媒作用には、リソソーム内でのタンパク質分解によって１１０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体を７６及び７０ｋＤａの成熟形態に変換することが必要である。

【0058】

本明細書で使用される用語「ポンペ病」は、全部の型のポンペ病を指す。本願に開示した製剤及び投与計画は、例えばＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型ポンペ病の処置に使用することができる。

【0059】

５．３ ＧＡＡ及びＡＳＳＣの獲得
ＧＡＡは、ＧＡＡを内因的に発現する細胞から得ることができ、又はＧＡＡは、本明細書に記載した組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）であってもよい。非限定的な一実施形態において、ｒｈＧＡＡは、完全長野生型ＧＡＡである。別の非限定的な実施形態では、ｒｈＧＡＡは、野生型ＧＡＡ内に存在するアミノ酸残基のサブセットを含み、このようなサブセットは、基質結合及び／又は基質還元のための活性部位を形成する、野生型ＧＡＡのアミノ酸残基を含む。従って、本発明は、基質結合及び／又は基質還元のための野生型ＧＡＡ活性部位と、野生型ＧＡＡ内に存在し得る又はし得ない他のアミノ酸残基とを含む融合タンパク質であるｒｈＧＡＡを想定する。

【0060】

ＧＡＡは、商業的供給源から得ることでき、又は当業者に既知の合成技術により得ることができる。野生型酵素は、組み換え細胞発現系（例えば、哺乳類細胞又は昆虫細胞－一般に、Ｄｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，５８０，７５７号明細書；Ｓｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，３９５，８８４号明細書及び米国特許第６，４５８，５７４号明細書；Ｃａｌｈｏｕｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，４６１，６０９号明細書；Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，２１０，６６６号明細書；Ｓｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，０８３，７２５号明細書；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，４５１，６００号明細書；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，２３６，８３８号明細書；並びにＧｉｎｎｓ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，８７９，６８０号明細書を参照されたい）、ヒト胎盤、又は畜乳（Ｒｅｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，１８８，０４５号明細書を参照）から精製することができる。注入後、外因性酵素は、非特異的又は受容体特異的機構を介して組織によって取り込まれると予想される。一般に、取り込み効率（ＡＳＳＣを使用せずに）は高くなく、また外因性タンパク質の循環時間は短い（Ｉｏａｎｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；６８：１４－２５）。加えて、外因性タンパク質は不安定であり、インビトロで急速な細胞内分解に供される。

【0061】

医薬に好適なＧＡＡを獲得する他の合成技術は、例えばＬｅｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第７，５６０，４２４号明細書及び米国特許第７，３９６，８１１号明細書、Ｌｅｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００９／０２０３５７５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００２９４６７号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２９９６４０号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２４１１１８号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１２１０１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０２４４４００号明細書、米国特許第７，４２３，１３５号明細書、米国特許第６，５３４，３００号明細書及び米国特許第６，５３７，７８５号明細書；国際公開第２００５／０７７０９３号パンフレット及び米国特許出願公開第２００７／０２８０９２５号明細書、並びに米国特許出願公開第２００４／００２９７７９号明細書に見出すことができる。これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0062】

一実施形態において、ＧＡＡは、ヒト酵素酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）からなるアルグルコシダーゼαであり、これは、この遺伝子の観察された９つのハプロタイプの最も優勢なものによりコードされ、チャイニーズハムスター卵巣細胞株内にて組み換えＤＮＡ技術により生成される。アルグルコシダーゼαは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）及びＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）としてＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能である。

【0063】

ＡＳＳＣは、当業者に既知の合成技術を用いて得ることができる。例えば、本願に使用され得る、１－ＤＮＪ等のＡＳＳＣは、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２７４，５９７号明細書及び米国特許第６，５８３，１５８号明細書、並びに米国特許出願公開第２００６／０２６４４６７号明細書に記載されているように調製することができる。

【0064】

本願の一実施形態において、ＡＳＳＣは、α－ホモノジリマイシンであり、ＧＡＡは、ｈｒＧＡＡ（例えばＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）又はＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））である。代替的な実施形態では、ＡＳＳＣは、カスタノスペルミンであり、ＧＡＡは、ｈｒＧＡＡ（例えばＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）又はＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））である。ＡＳＳＣ（例えばα－ホモノジリマイシン及びカスタノスペルミン）は、本発明に従った潜在的なＡＳＳＣの供給源を提供する合成ライブラリーから得ることができる（例えばＮｅｅｄｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：１０７００－４；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：１０９２２－１０９２６；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９２／００２５２号パンフレット；Ｋｏｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９４／２８０２８号パンフレット参照）。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，Ｎ．Ｈ．）及びＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。レアケミカルライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能である。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、例えばＰａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）若しくはＭｙｃｏ Ｓｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能であり、又は容易に生成することができる。加えて、天然及び合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、Ｒｅｓ．１９８６；１５５：１１９－２９により容易に修飾される。

【0065】

一実施形態において、本発明に有用なＡＳＳＣ’ｓは、リソソーム酵素の阻害剤であり、Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４；３７：３７０１－０６；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８５；２４：３５３０－３９；Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９６；５９：１１３７－４２；Ｌｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９８６；１５５：１１９－２９に記載されているようなグルコース及びガラクトースイミノ糖誘導体を含む。それらの誘導体は、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｙｏｒｋ，Ｏｎ．Ｃａｎａｄａ）及びＳｉｇｍａ等の商業的供給源から購入できるものを含む。

【0066】

５．４ ＥＲＴ及びＡＳＳＣを用いたポンペ病の処置
本発明によれば、ＧＡＡ（例えばｒｈＧＡＡ）を、ＧＡＡのためのＡＳＳＣと組み合わせて使用する方法が提供される。本発明の一実施形態は、ＧＡＡ（例えばｈｒＧＡＡ ＥＲＴ）及びＡＳＳＣの組み合わせ療法を提供する。例えば、ＡＳＳＣシャペロン１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌは、突然変異体ＧＡＡに結合し、ＧＡＡが適切な立体構造へと安定化する能力を増大させる。

【0067】

本発明の一実施形態は、ＡＳＳＣ及びｈｒＧＡＡ酵素補充療法を用いて、ＩＶＳ １（－１３Ｔ＞Ｇ）スプライシング欠損を有するポンペサブセット患者を処置する方法を提供する。この共通のスプライシング突然変異を有する遅発型ポンペ患者に由来する細胞株において、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌは、単独で及びｈｒＧＡＡとの組み合わせでＧＡＡレベルを増大させた。

【0068】

本発明の非限定的な一実施形態では、本発明は、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ、又はその薬学的に許容され得る塩を、ＧＡＡの投与前、又は投与と同時に、又は投与後に、用量約１０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇで対象に投与し、好ましくは経口的に投与し得る。非限定的な一実施形態では、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ及び組み換えヒトＧＡＡは、細胞酵素活性、グリコーゲン低下及びポンペ病の処置に対して驚くべき効力を示す。ラットでは、組み換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）の血漿半減期は、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）がｒｈＧＡＡ注射の３０分前の投与を含む投与計画にて投与された際、２倍に延長した。ＧＡＡ ＫＯマウスでは、ｒｈＧＡＡの取り込みは、１－デオキシノジリマイシン－ＨＣｌ（１００ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）が、ｒｈＧＡＡ注射の前の投与を含む投与計画にて投与された際、心臓及び横隔膜にておよそ２倍増大した。これらの結果は、ＡＳＳＣとｒｈＧＡＡとの共投与が、インビボでの酵素の曝露及び組織取り込みを、驚くべき量で増大させることを示す。

【0069】

例えば、本発明の一実施形態は、ポンペ病の処置方法を提供し、このような方法は、ＧＡＡ注入前、及びＧＡＡ注入後の規則的な間隔での、約１～約５０００ｍｇ／ｋｇのＡＳＳＣ（例えば１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）と組み合わせた、ＧＡＡ（例えばｒｈＧＡＡ）の週に２回、週に１回、又は２週間に１回、約１０週間迄の投与を含む。例えば、ＡＳＳＣは、注入の２時間以内に投与された後、注入後、２４時間以内に１回、２回、３回、４回、５回又は６回、規則的な間隔で投与されてもよい。

【0070】

特定の一実施形態では、ＧＡＡはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）であり、注入を介して週に１回投与され、ＡＳＳＣ（例えば１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）は、注入の３０分前に１０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ又は１０００ｍｇ／ｋｇで投与された後、各Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注入から８、１６及び２４時間後に投与される。

【0071】

別の特定の実施形態では、ＧＡＡはＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）であり、注入を介して週に１回投与され、ＡＳＳＣ（例えば１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）は、注入の３０分前に１０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ又は１０００ｍｇ／ｋｇで投与された後、各Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）注入から８、１６及び２４時間後に投与される。

【0072】

任意の特定の理論に束縛されるものではないが、酸α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、リソソームグリコーゲンから末端グルコース残基を除去するように機能すると考えられる。いくつかの遺伝子突然変異は、ＧＡＡ輸送及び成熟を低減する。薬理学的シャペロン１－ＤＮＪは、酵素に選択的に結合して適切な立体構造とし、このような酵素を安定化させることによりＧＡＡレベルを増大させ、このことはリソソームへの適切なタンパク質輸送を再建する。

【0073】

代替的な実施形態では、ＡＳＳＣは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１３４６２８号パンフレットに記載されているように投与される。

【0074】

いくつかの実施形態では、投与経路は、皮下である。他の投与経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、眼内、筋肉内、頬側、直腸内、腟内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、脊髄内、心室内、くも膜下腔内、大槽内、嚢内、肺内、鼻孔内、経粘膜、経皮、又は吸入を介して、を含む経口又は非経口であってもよい。肺内送達方法、機器及び薬物調製物は、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８５，０４９号明細書、米国特許第５，７８０，０１９号明細書及び米国特許第５，７７５，３２０号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、皮内送達の方法は、パッチを介したイオン泳動的送達によるものであり；そのような送達の一例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４３，０１５号明細書に教示されている。

【0075】

投与は、調製物のボーラスの周期的注射によるもの、又は長期間に亘る持続放出剤形として、又は、例えば、外部（例えばＩＶバッグ）若しくは内部（例えば、生体浸食性インプラント、バイオ人工臓器、又は移植されたＧＡＡ生成細胞の集団）であるリザーバからの静脈内若しくは腹腔内投与によるものであってもよい。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４０７，９５７号明細書及び米国特許第５，７９８，１１３号明細書を参照されたい。肺内送達方法及び機器は、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５４，００７号明細書、米国特許第５，７８０，０１４号明細書及び米国特許第５，８１４，６０７号明細書に記載されている。他の有用な非経口送達システムとしては、エチレン－ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達注射、無針注射、ネブライザー、エアロゾライザー（ａｅｏｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）、電気穿孔法及び経皮パッチが挙げられる。無針注射器装置は、その明細書が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７９，３２７号明細書；米国特許第５，５２０，６３９号明細書；米国特許第５，８４６，２３３号明細書及び米国特許第５，７０４，９１１号明細書に記載されている。本明細書に記載した任意のＧＡＡ調製物を、これらの方法で投与することができる。

【0076】

製剤の送達は、数時間、１～数週間、１～数ヶ月の範囲、又は１年以上迄の所定の投与期間に亘って連続的であってもよい。所定の実施形態では、剤形は、長期間に亘るＧＡＡの送達に適合されたものである。そのような送達装置は、ＧＡＡの数時間（例えば２時間、１２時間、又は２４時間～４８時間以上）、～数日間（例えば２～５日間以上、約１００日間以上）、～数ヶ月又は数年の投与に適合され得る。これらの実施形態のいくつかでは、装置は、約１ヶ月～約１２ヶ月以上の範囲の期間の送達に適合されている。ＧＡＡ送達装置は、ＧＡＡを、例えば約２時間～約７２時間、約４時間～約３６時間、約１２時間～約２４時間；約２日間～約３０日間、約５日間～約２０日間、約７日間～約１００日間以上、約１０日間～約５０日間；約１週間～約４週間；約１ヶ月～約２４ヶ月以上、約２ヶ月～約１２ヶ月、約３ヶ月～約９ヶ月；又は、必要に応じてこれらの範囲内の増分範囲（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｒａｎｇｅ）を含む他の時間範囲、個人に投与するように適合されているものであってもよい。

【0077】

所定の実施形態では、本発明の方法は、用量約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇのＧＡＡを個人に投与、例えば皮下投与することを含み、用量は、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、又は６日に１回投与される。所定の実施形態では、本願の製剤は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、又は週に７回投与される。

【0078】

所定の実施形態では、本願の方法は、ＧＡＡ及びＡＳＳＣを含む共製剤を個人に投与することを含み、共製剤は、皮下投与される。所定の実施形態では、共製剤中のＧＡＡの用量は約０．１～約５０００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０～約４０００ｍｇ／ｋｇ、又は約２５～約３０００ｍｇ／ｋｇ、又は約５０～約２０００ｍｇ／ｋｇ、又は約１００～約１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約２００～約５００ｍｇ／ｋｇである。

【0079】

所定の実施形態では、共製剤中のＧＡＡの用量は、約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約１～約８０ｍｇ／ｋｇ、又は約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５～約２５ｍｇ／ｋｇである。

【0080】

所定の実施形態では、共製剤中のｒｈＧＡＡの用量は、約２０ｍｇ／ｋｇである。

【0081】

所定の実施形態では、共製剤中のＡＳＳＣの用量は、約０．１～約５０００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０～約４０００ｍｇ／ｋｇ、又は約２５～約３０００ｍｇ／ｋｇ、又は約５０～約２０００ｍｇ／ｋｇ、又は約１００～約１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約２００～約５００ｍｇ／ｋｇである。

【0082】

所定の実施形態では、共製剤中のＡＳＳＣの用量は、約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約１～約８０ｍｇ／ｋｇ、又は約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５～約２５ｍｇ／ｋｇである。

【0083】

所定の実施形態では、共製剤中のＡＳＳＣの用量は、約３０ｍｇ／ｋｇである。

【0084】

所定の実施形態では、用量は、個人の肝臓内で毒性レベルのＧＡＡをもたらさない。いくつかの実施形態では、ＧＡＡは、用量の投与から約２４時間以内に、対象の組織、例えば筋組織内でＧＡＡのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される。所定の実施形態では、ＧＡＡは、用量の投与から約１０～約５０時間、又は約４５、４０、３５、３０、２５、又はそれより短い時間以内に、対象の組織内でＧＡＡのピーク濃度をもたらすのに十分な用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＡＡの製剤は、単一用量製剤である。いくつかの実施形態では、ＧＡＡの製剤は、多用量製剤である。

【0085】

本発明のＧＡＡ調製物は、必要な総用量が１ミリリットル以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ミリリットル以上の単一皮下注射にて投与され得るように処方されてもよい。調製物は、数個の異なる注射部位にて皮下投与されるよう処方されてもよい。１又は２ミリリットルの注射容積を可能にするために、本発明のＧＡＡ調製物は、好ましい用量が１～２ミリリットルの容積で送達される濃度で処方されてもよい。ＧＡＡ調製物の皮下注射は、特に自己投与を可能にすることにより患者に都合がよいという利点を有し、一方、例えば静脈内投与と比較して長い血漿半減期ももたらす。血漿半減期の延長は、より長時間に亘る有効な血漿ＧＡＡレベルの維持をもたらし、その利益は、注射されたＧＡＡに対する臨床的に罹患した組織の曝露を増大させる結果、それらの組織内へのＧＡＡの取り込みを増大させ得ることである。これにより、患者に対するより有益な効果及び／又は投与頻度の低減が可能となる。更に、本明細書に述べるように、再充填可能な注射ペン及び無針注射装置等の、患者の利便性のために設計された多様な装置を、本発明のＧＡＡ調製物と共に使用することができる。ＡＳＳＣと共処方されたＧＡＡは、室温で長期間安定であるため、調製物は患者の身体の傍らでカートリッジ内に保持することができ、低用量投与の反復、又は連続的な低容量投与を可能にして、酵素投与の定常状態を提供する。そのような投与は、静脈内注入中に投与される高用量の酵素補充療法（ＥＲＴ）の潜在的な副作用を回避し得る。

【0086】

５．５ 医薬組成物
本発明の化合物及び組成物は、薬学的に許容され得る担体又は賦形剤との混合物により医薬組成物として処方され得る。

【0087】

一実施形態において、ＡＳＳＣ及びＧＡＡは、単一組成物（即ち、共製剤）に処方される。そのような組成物は保管中（即ち、インビトロで）及びインビボで対象に投与した後の両方でＧＡＡの安定性を向上させることによって、循環半減期、組織取り込みを増大させ、ＧＡＡの治療効力の増大をもたらす。製剤は、静脈内、皮下及び腹腔内投与を含む非経口投与に好適であることが好ましいが、経口、鼻孔内、又は経皮等の他の投与経路に好適な製剤も想定される。

【0088】

本発明は、当技術分野にて承認されている製剤と比較して、改善された特性を有する液体医薬製剤（例えばＧＡＡ及びＡＳＳＣを含む製剤）に関する。本発明は、ＡＳＳＣをＧＡＡと組み合わせることにより、製剤中のＧＡＡの濃度を、ＡＳＳＣが存在しない場合にＧＡＡ凝集体の形成を通常もたらす量に増大させることができるという、驚くべき発見に基づいている。高濃度のＧＡＡにも係わらず、本発明の製剤は、例えば製造、保管及び／若しくは反復した凍結／解凍処理ステップ、又は、増大された空気－液体界面に対する長期間の曝露中、ＧＡＡの溶解度及び安定性を維持することが可能である。加えて、本発明の製剤は、高濃度のＧＡＡを有するにも係わらず、低いレベルのタンパク質凝集（例えば約５％、４％、３％、２％未満、又は約１％未満）を維持する。本発明の製剤はまた、驚くべきことに、高濃度のＧＡＡを有するにも係わらず、皮下注射に好適な範囲内の低粘度を維持する。

【0089】

本発明はまた、ＧＡＡをＡＳＳＣと組み合わせることにより、小さい容積中でのＧＡＡの可溶化を達成できる、非常に強力かつ濃縮されたＧＡＡ製剤を提供する。本発明の製剤は、送達装置が比較的小さく（例えば、移植可能なシステム）、比較的長い持続時間の送達が必要である場合、又は所望の治療効果を達成するためにＧＡＡの高い有効用量が必要な場合に、特に有用である。それ故、送達装置を再充填又は代替する必要なく、長期間（例えば日間、週間、ヶ月等）に亘る一貫した量のＧＡＡの送達が可能となり、それにより感染及び組織損傷の危険性が低減し、患者のコンプライアンスが向上し、一貫した正確な投与が達成される。

【0090】

本発明の所定の実施形態では、治療量のＧＡＡ（高い用量であっても）は、非常に小さい容積のＧＡＡのみ（例えば、１日にマイクロリットル又はナノリットルのオーダーで）を使用することによって、対象に投与することができる。所定の身体組織、例えば皮下空間内では、小容積の送達は、局所組織によるＧＡＡのより良好な吸収を促進し、また局所組織障害、外傷、又は浮腫を最小限にする。

【0091】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、液体製剤が有意な乳光、凝集、又は沈殿を示さないように、高濃度のＧＡＡを含む。

【0092】

別の実施形態では、本発明の製剤は、有意な痛み感覚（ｆｅｌｔ ｐａｉｎ）（例えば、視覚的評価スケール（ＶＡＳ）スコアにより決定して）を有しない、例えば皮下投与に好適であるように、高濃度のＧＡＡを含む。

【0093】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、例えば約２５ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約８０ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約１１５ｍｇ／ｍＬ、又は約１５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１６０ｍｇ／ｍＬ又は約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約２４０ｍｇ／ｍＬ、又は約２５０ｍｇ／ｍＬのＧＡＡ濃度を含む、高いＧＡＡ濃度を含む。例えば、下記の実施例１０に記載するように、本発明の一態様では、液体医薬製剤は、約２５ｍｇ／ｍＬのヒト組み換え野生型ＧＡＡ濃度を含む。本発明の製剤は、約１ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、又は約５ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、又は約５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ～約６０ｍｇ／ｍＬのＧＡＡ濃度を含み得ることも想定される。上記に引用した濃度の中間の濃度及び範囲も、本発明の一部であると意図される（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は２００ｍｇ／ｍＬ）。

【0094】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、５ｍｇ／ｍＬを超える濃度でＧＡＡを含む。

【0095】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、製剤中でＧＡＡの凝集を低減又は阻害するのに有効な量で、ＡＳＳＣを含む。そのようなＡＳＳＣの量としては、例えば約０．００５ｍＭ～１００ｍＭ、又は約０．０５ｍＭ～約９０ｍＭ、又は約０．１ｍＭ～約８０ｍＭ、又は約０．５ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約１ｍＭ～約６０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約５０ｍＭ、又は約３ｍＭ～約４０ｍＭ、又は約４ｍＭ～約３０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２０ｍＭが挙げられる。所定の実施形態では、ＡＳＳＣは、約０．５～約２０ｍＭの濃度で、本発明の製剤中に存在する。所定の実施形態では、ＡＳＳＣは、約１ｍＭの濃度で、本発明の製剤中に存在する。所定の実施形態では、ＡＳＳＣは、約１０ｍＭの濃度で、本発明の製剤中に存在する。

【0096】

所定の実施形態では、本発明の製剤は、製剤中でＧＡＡの凝集を低減又は阻害するのに有効な量で、ＡＳＳＣを含む。そのようなＡＳＳＣの量としては、例えば約５～約５００ｍｇ／ｍＬ、又は約１０～約２５０ｍｇ／ｍＬ、又は約２０～約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約３０～約１５０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０～約１００ｍｇ／ｍＬ、又は約５０～約７５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。所定の実施形態では、ＡＳＳＣは、約５～約２００ｍｇ／ｍＬの量で存在する。

【0097】

所定の実施形態では、ＡＳＳＣは、約３２ｍｇ／ｍＬ又は約１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤中に存在する。

【0098】

本発明の所定の実施形態では、ＤＮＪ及びＧＡＡを含む液体製剤は、ＤＮＪを水に溶解して、濃度１０ｍＭ ＤＮＪを達成することにより調製される。ＧＡＡは１．８ｍｌの水中で再構成され、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で一晩透析されてもよい。次いで、ＧＡＡの濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、４．４マイクロリットルのＤＮＪ（１０ｍＭ）を４００マイクロリットルのＧＡＡに加えてもよい。

【0099】

別の実施形態では、ＧＡＡ及びＡＳＳＣは、別個の組成物に処方される。この実施形態では、シャペロン及び補充タンパク質は、同じ経路、例えば点滴静注によって投与され、又は異なる経路、例えば補充タンパク質は点滴静注、ＡＳＳＣは経口投与によって投与されてもよい。

【0100】

注射用の使用に好適な医薬製剤としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び、無菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌である必要があり、注射容易性が存在する程度に流体である必要がある。製剤は、製造及び保管の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対抗して保存される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチルグリコール等）、これらの好適な混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、石炭酸塩、ベンジルアルコール、ソルビン酸等の様々な抗菌及び抗真菌剤によりもたらされ得る。

【0101】

多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによりもたらされ得る。無菌注射用溶液は、必要な量のＧＡＡ及びＡＳＳＣを、適した溶媒中で、必要に応じて、上記に列挙した様々な他の成分と共に組み込んだ後、濾過又は最終滅菌することにより調製されてもよい。一般に、分散液は、基礎分散媒、及び、上記に列挙した必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に、様々な滅菌活性成分を組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これは活性成分及び以前無菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を提供する。

【0102】

製剤は、一種以上の賦形剤を含み得ることが好ましい。製剤中に含まれ得る薬学的に許容され得る賦形剤は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液（例えばリン酸一ナトリウム、リン酸水素ナトリウム及びこれらの組み合わせ等）、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液等の緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質；血清アルブミン、コラーゲン及びゼラチン等のタンパク質；ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ及び塩化ナトリウム等の塩；リポソーム；ポリビニルピロリドン；デキストラン、マニトール、ソルビトール及びグリセロール等の糖；プロピレングリコール及びポリエチルグリコール（例えばＰＥＧ－４０００、ＰＥＧ－６０００）；グリセロール；グリシン又は他のアミノ酸；並びに脂質である。製剤により使用される緩衝液系としては、クエン酸；酢酸；重炭酸；及びリン酸緩衝液が挙げられる。

【0103】

所定の実施形態では、本願の製剤は、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－４００、アルギニン、アルギニン及びグルタミン酸、プロリン、γ－シクロデキストリン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される賦形剤を更に含む。

【0104】

所定の実施形態では、緩衝液及び／又は賦形剤は、約１～約５０％重量／体積（ｗ／ｖ）、又は約２～約４０％ｗ／ｖ、又は約３～約３０％ｗ／ｖ、又は約４～約２０％ｗ／ｖ、又は約５～約１０％ｗ／ｖの濃度で製剤中に存在する。

【0105】

所定の実施形態では、緩衝液及び／又は賦形剤は、約１～約５００ｍＭ、又は約１０～約４００ｍＭ、又は約２０～約３００ｍＭ、又は約３０～約２５０ｍＭ、又は約４０～約２００ｍＭ、又は約５０～約１５０ｍＭ、又は約６０～約１００ｍＭの濃度で製剤中に存在する。

【0106】

所定の実施形態では、製剤は、約２６ｍＭの濃度で存在するリン酸緩衝液を含む。

【0107】

所定の実施形態では、製剤は、約１５０ｍＭの濃度で存在するクエン酸緩衝液を含む。

【0108】

所定の実施形態では、製剤は、約５％ｗ／ｖの濃度で存在するＰＥＧ－４００を含む。

【0109】

所定の実施形態では、製剤は、約１００ｍＭの濃度で存在するアルギニンを含む。

【0110】

所定の実施形態では、製剤は、約５０ｍＭの濃度のアルギニンと、約５０ｍＭの濃度で存在するグルタミン酸とを含む。

【0111】

所定の実施形態では、製剤は、約２５０ｍＭの濃度で存在するプロリンを含む。

【0112】

所定の実施形態では、製剤は、約１０％ｗ／ｖの濃度で存在するγ－シクロデキストリンを含む。

【0113】

製剤は、非イオン性洗剤も含み得る。好ましい非イオン性洗剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、オクチルα－グリコシド、オクチルβ－グリコシド、Ｂｒｉｊ ３５、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ及びＴｗｅｅｎ２０が挙げられる。

【0114】

タンパク質及びシャペロン調製物の凍結乾燥のために、タンパク質濃度は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。グリシン、マンニトール、アルブミン及びデキストラン等の充填剤を、凍結乾燥混合物に添加してもよい。加えて、二糖類、アミノ酸及びＰＥＧ等の可能な凍結保護物質を、凍結乾燥混合物に添加してもよい。上記にリストした任意の緩衝液、賦形剤及び洗剤を添加することができる。

【0115】

投与経路は、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼内、筋肉内、頬側、直腸内、腟内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、脊髄内、心室内、くも膜下腔内、大槽内、嚢内、肺内、鼻孔内、経粘膜、経皮、又は吸入を介して、を含む経口又は非経口であってもよい。

【0116】

上述した非経口製剤の投与は、調製物のボーラスの周期的注射であってもよく、又は、外部（例えばｉ．ｖ．バッグ）若しくは内部（例えば、生体浸食性インプラント、バイオ人工臓器、又は補充タンパク質を生成する移植細胞の集団）であるリザーバからの静脈内若しくは腹腔内投与により投与されてもよい。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４０７，９５７号明細書及び米国特許第５，７９８，１１３号明細書を参照されたい。肺内送達方法及び機器は、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５４，００７号明細書、米国特許第５，７８０，０１４号明細書及び米国特許第５，８１４，６０７号明細書に記載されている。他の有用な非経口送達システムとしては、エチレン－ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達注射、無針注射、ネブライザー、エアロゾライザー、電気穿孔法及び経皮パッチが挙げられる。無針注射器装置は、その明細書が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７９，３２７号明細書；米国特許第５，５２０，６３９号明細書；米国特許第５，８４６，２３３号明細書及び米国特許第５，７０４，９１１号明細書に記載されている。上述した製剤のいずれも、これらの方法で投与することができる。

【0117】

５．６ インビトロでの安定性
ＧＡＡ製剤の有効期間中にこのような製剤の安定性を確実にすることは、大きな課題である。例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）及びＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の患者説明書は、バイアルが単回使用のみのためであり、また不使用の製品は廃棄する必要があることを注意する。説明書は更に、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）及びＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）が医療専門家により再構成され、希釈され、投与される必要があり、また投与は遅延なく行う必要があることを示す。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）及びＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）は、２～８℃で保管する必要があり、また製品はこれらの温度で２４時間までのみ安定である。

【0118】

ＡＳＳＣ及びＧＡＡが同じ組成物中に存在する場合、本発明の処方された組成物は、より安定な組成物を提供する。ＡＳＳＣは、投与されたタンパク質をインビボで安定化することに加えて、インビトロでＧＡＡに可逆的に結合し、ＧＡＡの立体構造を安定化させることにより、凝集及び分解を防止し、製剤の有効期間を延長する。ＡＳＳＣ／補充タンパク質相互作用の分析は、例えば示差走査熱量計、又は円偏光二色性等の当技術分野にて既知の技術を用いて評価することができる。

【0119】

例えば、組成物の水性注射用製剤が、針及び注射器を使用して内容物を引き抜くのに好適な栓付きバイアル内に供給される場合、ＡＳＳＣの存在は、ＧＡＡの凝集を阻害する。バイアルは、単回使用又は多回使用用のいずれであってもよい。製剤はまた、プレフィルド注射器、ペン型注射器、又は無針投与装置として供給されてもよい。別の実施形態では、製剤は、乾燥又は凍結乾燥状態にあり、これは規格の又は供給された生理学的希釈剤を用いて液体状態に再構成する必要があるであろう。この場合、ＡＳＳＣの存在は、ＧＡＡ再構成中及び再構成後にＧＡＡを安定化させて、凝集を防止する。製剤が静脈内投与用の液体、例えば静脈内投与ライン又はカテーテルに接続される無菌バッグ内に存在する実施形態では、ＡＳＳＣの存在は、同じ利益を付与する。

【0120】

投与される補充タンパク質を安定化させることに加えて、ＡＳＳＣの存在は、ＧＡＡ製剤が約７．０～７．５の中性ｐＨで保管されることを可能にする。このことは、安定性を保つために、通常、より低いｐＨで保管される必要があるタンパク質に利益を付与する。例えば、ＧＡＡ等のリソソーム酵素は、典型的には、低いｐＨ（例えば５．０以下）で安定な立体構造を維持する。しかしながら、低いｐＨでの補充酵素の長期保管は、酵素及び／又は製剤の分解を促進し得る。

【0121】

上述したように、本発明の液体製剤は、有利な安定性及び保管特性を有する。液体製剤の安定性は保管の形態に依存せず、凍結、凍結乾燥、噴霧乾燥された製剤、又はその中に活性成分が懸濁している製剤を含むがこれらに限定されない。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定されてもよい。本発明の一態様では、液体製剤中のタンパク質は、液体形態で少なくとも約１週間；少なくとも約２週間；少なくとも約３週間；少なくとも約１ヶ月；少なくとも約２ヶ月；少なくとも約３ヶ月；少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月；少なくとも約６ヶ月；少なくとも約１２ヶ月；少なくとも約１８ヶ月安定である。上記に引用した期間の中間の値及び範囲、例えば約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は約２４ヶ月も、本発明の一部であることが意図される。加えて、上限及び／又は下限としての、上記に引用した値の任意の組み合わせを使用した値の範囲が含まれることが意図される。所定の実施形態では、製剤は、室温（約３０℃）、若しくは約３７℃、若しくは約４０℃、若しくは約４５℃で少なくとも約１ヶ月安定であり、及び／又は約２～８℃で少なくとも約１年間安定であり、又はより好ましくは約２～８℃で少なくとも約２年間安定である。更に、製剤は、このような製剤の冷凍（例えば－８０℃に）及び解凍後に安定であることが好ましく、以後これを「凍結／解凍サイクル」と称する。

【0122】

液体製剤中のタンパク質の安定性（例えば、タンパク質の安定性及び／又は汚染の低減）はまた、製剤中のタンパク質のモノマー、凝集体、若しくは断片、又はこれらの組み合わせの百分率として定義されてもよい。タンパク質は、このようなタンパク質が色及び／若しくは清澄性の視認検査により、又はＵＶ光散乱により測定して、又はサイズ排除クロマトグラフィー、非変性ＰＡＧＥ、若しくはサイズを決定する他の方法等により、凝集、沈殿及び／又は変性の徴候を実質的に示さない場合、製剤中で「その物理的安定性を維持する」。本発明の一態様では、安定な液体製剤は、製剤中に約１０％未満、又は約５％未満、又は約１％未満のタンパク質が凝集体として存在する製剤である。

【0123】

一実施形態において、液体製剤の物理的安定性は、撹拌ストレスアッセイ、例えば２４時間又は４８時間の撹拌ストレスアッセイ後に製剤の濁度を測定することにより決定される。例えば、撹拌ストレスアッセイは、好適な容積の液体製剤をマグネチックスターラー、例えば（マルチポイントＨＰ、５５０ｒｐｍ）を有するビーカー内に配置し、アリコートを任意の好適な時間、例えばＴ０～Ｔ４８（時間）にて除去し、所望によりアリコートに関して好適なアッセイを行うことにより、行ってもよい。同じ条件下で、撹拌を有さなかった製剤のサンプルは、対照として機能する。

【0124】

濁度測定は、Ｈａｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）製の実験室濁度測定システムを使用して行うことができ、濁度単位（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｕｎｉｔ）（ＮＴＵ）として報告される。

【0125】

組成物の安定性（例えば、タンパク質の安定性及び／又は汚染物質の低減）はまた、例えばタンパク質分解又は汚染物質の増殖若しくは存在を測定することにより測定されてもよい。タンパク質分解は、例えば逆相ＨＰＬＣ、非変性ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ペプチドマッピング、又は同様の方法により決定され得る。

【0126】

本明細書に記載した濃度での、ＡＳＳＣの存在下でのＧＡＡの安定性は、例えば所定時間におけるパーセント凝集又は分解として測定され、１つ以上の基準と比較されてもよい。例えば、好適な基準は、ＧＡＡがＡＳＳＣと接触されないこと以外は試験条件と同様である組成物である。一濃度におけるＧＡＡの安定性を比較する。好適性は、ＡＳＳＣの不在下と同等の又はより高い安定性を有する、特定の濃度のＧＡＡとＡＳＳＣとの組み合わせにより示すことができる。

【0127】

５．７ インビボでの安定性
インビトロでの製剤に関して上述したように、ＧＡＡのためのＡＳＳＣの存在は、外因性ＧＡＡの血漿半減期を延長することによって、有効な補充タンパク質レベルをより長期間に亘って維持し、ＧＡＡに対する臨床的に罹患した組織の曝露の増大と、ひいては組織中へのタンパク質の取り込みの増大とをもたらす利点を有する。このことは、安心感の向上、投与頻度の低下、及び／又は投与量の低減等の有益な効果を患者に与える。このことはまた、処置費用を低下させるであろう。

【0128】

ＡＳＳＣはまた、野生型補充ＧＡＡを安定化させることに加えて、ポンペ病等の立体構造疾患（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）におけるような、ＥＲ内での適切な折り畳み及び処理を阻止する突然変異の結果として欠損した内因性突然変異体ＧＡＡの発現を安定化及び向上させるであろう。

【0129】

本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態及び以下の実施例による範囲内に限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、前述の記載並びに添付の実施例及び図面から本発明の様々な修正形態が当業者に明かとなろう。それらの修正形態は、付随する特許請求の範囲内に含まれるものとする。

【実施例0130】

実施例１：ｒｈＧＡＡ及び１００μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌのインビトロでの熱安定性
１００μＭのＡＳＳＣ １－デオキシノジリマイシン塩酸塩（１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）を有する及び有しない組み換えヒトＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）の安定性を、タンパク質変性を誘導するのに熱を使用する熱安定性アッセイにより決定した。変性は、疎水性アミノ酸（折り畳まれたタンパク質内では曝露されていない）に結合した後、蛍光を発するＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ染料を使用して監視される。

【0131】

熱安定性は、２つの製剤に関して、ＥＲのｐＨと一致するｐＨ７．４で行った。図１に示すように、７．４ｐＨで１００μＭの１－ＤＮＪ－ＨＣｌを含む製剤は、７．４ｐＨでＡＳＳＣを有しない製剤と比較して、変性するのに有意により多くの熱を必要とし、従ってより安定である。

【0132】

実施例２：ｒｈＧＡＡ及び５０μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌのＧＡＡ残留活性及び熱安定性
残留ＧＡＡ活性を４つの製剤に関して決定した：
（１）ｐＨ７．４でのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独；
（２）ｐＨ７．４でのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）＋５０μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（３）ｐＨ５．２でのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独；
（４）ｐＨ５．２でのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）＋５０μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌ。

【0133】

初期活性（ｔ＝０）の％に基づいて、活性を２４時間に亘って測定した。サンプルのＧＡＡ酵素活性を、蛍光発生基質４－ＭＵ－α－グルコースの加水分解に基づいて、０、３、６及び２４時間にてアッセイした。ＧＡＡ活性を、初期活性の％、即ち残留活性として表した。

【0134】

図２Ａに示すように、上記の製剤（１）（ＡＳＳＣなし）は、時間と共に活性を損失し、投与から２４時間後、その初期活性の約２０％のみを有した。対照的に、製剤（２）は、その初期活性の全部ではないが殆どを２４時間に亘って維持した。ｐｈ５．２での両方の製剤（上記の製剤（３）及び（４））は、それらの初期活性の殆どを２４時間に亘って維持した。

【0135】

初期酵素活性の損失が、適切な立体構造の維持の不足と相関するか否かを決定するために、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ熱安定性実験を実施例１に概略したように、上記のサンプルに関して行った。しかしながら、この熱安定性実験では、１－ＤＮＪ－ＨＣｌの濃度は製剤（２）及び（４）中で１００μＭに増大された。この実験に基づいて、折り畳まれたＧＡＡの％を概算し、図２Ｂにプロットした。図２Ｂの製剤（１）に関する２４時間に亘る折り畳まれたＧＡＡの量の低下は、この一般的製剤に関して図２Ａに示した活性の損失と相関する。

【0136】

実施例３：１－ＤＮＪ－ＨＣｌの経口投与を有し及び有しないＧＡＡ ＫＯマウスにおけるインビボでのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）取り込み
５グループのＧＡＡ ＫＯマウスに、以下の製剤の１つを投与した：
（１）未処理対照；
（２）１０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）ＩＶを週に１回、３週間迄
（３）（２）と同様のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注入、＋１０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（４）（２）と同様のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注入、＋１００ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（５）（２）と同様のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注入、＋１０００ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
分析用に組織ホモジネートを生成した。酵素活性を４－ＭＵＧ蛍光発生基質アッセイにより決定した。結果を図３に示す。

【0137】

これらの結果は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）組織取り込み（ＧＡＡ活性の尺度）が、全ブループに関して、注射から７日後に低下したことを示す。１－ＤＮＪ－ＨＣｌとＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）との共投与は、注射から７日後迄の間、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）取り込みの用量依存的増大を促進した。１－ＤＮＪ－ＨＣｌの効果は、１、２又は３用量のいずれの注射後も、４及び７日目において、より明白かつ有意であった（ｐ＜０．０５ ｔ検定、対Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独）。

【0138】

実施例４：１－ＤＮＪ－ＨＣｌの経口投与を有し及び有しないＧＡＡ ＫＯマウスにおけるインビボでのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）取り込み
概して実施例１に記載した熱安定性実験を、４つの組成物に関して行った：
（１）Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）のみの組成物；
（２）Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）＋１μＭの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（３）Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）＋１０μＭの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（４）Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）＋１００μＭの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ；
図５に示すように、ＧＡＡの融解温度が用量依存的に増大することから明かなように、ＤＮＪ－ＨＣｌはＧＡＡ熱安定性を増大させる。

【0139】

実施例５：単独療法として投与された場合、又は１－ＤＮＪ－ＨＣｌと組み合わされた場合の、ラットにおけるｒｈＧＡＡのインビボでの半減期
４グループのラットに、以下の投与計画の１つを投与した。
（１）生理食塩水＋水；
（２）１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ＋水；
（３）１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ＋３ｍｇ／ｋｇの１ＤＮＪ－ＨＣｌ；
（４）１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ＋３０ｍｇ／ｋｇの１ＤＮＪ－ＨＣｌ；
ｒｈＧＡＡ又は生理食塩水を１－ＤＮＪ－ＨＣｌ投与の３０分後に投与した。概して実施例３に記載したようにＧＡＡ活性を決定した。２４時間に亘る結果を、図６に示す。１－ＤＮＪ－ＨＣｌは、投与後の酵素活性の損失を抑制し、それによりｒｈＧＡＡのインビボでの半減期を延長した。ｒｈＧＡＡのインビボ半減期は、１．４±０．２時間（０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）から２．１±０．２時間（３ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）及び３．０±０．４時間（３０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ）に延長した。

【0140】

実施例６：ＧＡＡ ＫＯマウスにおけるＧＡＡ酵素活性
３グループのＧＡＡ ＫＯマウスに、以下の製剤の１つを投与した：
（１）対照（処置なし）；
（２）１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡ；
（３）１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＡＡと、ｒｈＧＡＡ注入の３０分前、及び注入後８時間毎に４８時間の１００ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌ。

【0141】

心臓及び横隔膜組織ホモジネートを回収し、ｒｈＧＡＡ活性を蛍光発生基質（４－ＭＵＧ）により測定した。結果を図７に示す。

【0142】

実施例７：１－ＤＮＪ－ＨＣｌはｒｈＧＡＡを安定化させ、血液中での酵素不活性化を防止する
１－ＤＮＪ－ＨＣｌを、全（クエン酸ナトリウム抗凝固）血中にて３７℃でｒｈＧＡＡ（例えばＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標））を安定化させるその能力に関して評価して、数時間の注入中にＥＲＴが曝露された環境を模倣した。結果は、図８に示すように、ｒｈＧＡＡが、およそ４０％の酵素が４時間迄に、約７０％が８時間迄に、及びほぼ１００％が２４時間迄に不活性化されたように、これらの条件下で不安定であることを示す。（赤い菱形の線のプロット）。これらの結果は、有意な割合のｒｈＧＡＡ用量が、これらの注入が典型的には６時間を超え、場合によっては１２時間を超えるため、不活性となる可能性があることを示唆する。更に、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は長い血漿半減期（３時間を超えると報告）を有するため、注入後、かなりの量の酵素が何時間も循環中に残留する高い可能性があり、このような酵素はまた不活性化を受けやすい。一方、ｒｈＧＡＡが同一の実験条件下で５０μＭ １－ＤＮＪ－ＨＣｌと共にインキュベートされた際、酵素は、試験全体中ずっと完全に活性なままであった（青い正方形の線のプロット）。これらの結果は、１－ＤＮＪ－ＨＣｌがｒｈＧＡＡを安定化させ、全血中での酵素不活性化を防止したことを示す。重要なことには、これらのデータはまた、血液中に存在する血漿タンパク質がｒｈＧＡＡ酵素活性の損失を防止するのに十分ではない一方、１－ＤＮＪ－ＨＣｌのような薬理学的シャペロンは、酵素不活性化を防止できることを示す。

【0143】

実施例８：１－ＤＮＪ－ＨＣｌはｒｈＧＡＡを安定化させ、血液中での酵素不活性化を防止する
ｒｈＧＡＡを全血中で様々な濃度の１－ＤＮＪ－ＨＣｌ（０～１００μＭ）を用いて測定して、ｒｈＧＡＡ酵素不活性化を防止する１－ＤＮＪ－ＨＣｌの最低限の濃度を決定した（図９）。予想したように、高い１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度（５０及び１００μＭ）は、ｒｈＧＡＡを安定化させ、酵素不活性化を防止するのに最良であった。しかしながら、低い１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度（２．５μＭもの低さ）も６時間の時間経過に亘って約２０％の損失によりｒｈＧＡＡ活性を維持したことは興味深い。これらの結果は、中程度の１－ＤＮＪ－ＨＣｌ濃度（例えば１０～２５μＭ）が、注入中、血液中でｒｈＧＡＡを安定化させるのに十分であり得ることを示唆する。ヒト血漿ＰＫデータに基づいて、これらの濃度は、診療所内で容易に得ることができる。

【0144】

実施例９：１－ＤＮＪ－ＨＣｌと共投与したＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独と比較して、ＧＡＡ ＫＯマウスにおいて有意により高い組織グリコーゲン低下をもたらした
１２週齢の雄のＧＡＡ ＫＯマウスに単一用量のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（４０ｍｇ／ｋｇ）を、ボーラス尾静脈注射を介して８週間の間１週間置きに投与した。アナフィラキシーを防ぐために、第３及び第４のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注射前に、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）注射の１０分前にジフェンヒドラミン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を投与した。加えて、マウスはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）投与の３０分前に、強制経口投与（ｏｒａｌ ｇａｖａｇｅ）を介して水又は３０ｍｇ／ｋｇの１－ＤＮＪ－ＨＣｌのいずれかを受容した。マウスを最終Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）投与から１４日後に安楽死させた。実験計画を図１０に示す。

【0145】

次いで、心臓、横隔膜、ヒラメ筋及び四頭筋内のグリコーゲンレベルを測定した。１－ＤＮＪ－ＨＣｌと共投与したＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）は、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）単独と比較して、ＧＡＡ ＫＯマウスにおいて有意により高い組織グリコーゲン低下をもたらした（図１１）。手短には、約５０ｍｇの組織を、マイクロホモジナイザーを用いて、氷上で２００μＬの脱イオン水中で３～５秒間ホモジナイズすることによりホモジネートを調製した。上清を熱変性（９９℃で１０分間）させて、内因性アミログルコシダーゼ活性を除去した。次いで、１０μＬの８００Ｕ／ｍＬアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を有し及び有さずに、３６μＬ水を加え、５０℃で１時間インキュベートすることによって、変性ライセート（４μＬ）を二重に分析した。１００℃で１０分間の不活性化によって反応を停止させた。最後に、２００μＬのグルコース試薬（Ｓｉｇｍａ）を加え、吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ上にて３４０ｎＭで読み取った。５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの範囲のＩＩＩ型ウサギ肝臓グリコーゲン（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線を毎日作成して、吸光度を絶対グリコーゲン単位に変換した。同時に、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、製造業者の指示書に従って組織ホモジネート中のタンパク質の量を決定した。各サンプルのグリコーゲン含有量をタンパク質に対して正規化し、データを最終的に、タンパク質のミリグラム当たりのグリコーゲンのミリグラム（μｇ／ｍｇタンパク質）として表した。

【0146】

実施例１０：ＤＮＪは、高濃度のＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）を含む組成物中で、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の凝集を低減する
ＤＮＪ及びＧＡＡを含む液体製剤を、ＤＮＪを水に溶解して濃度１０ｍＭ ＤＮＪを達成することにより調製した。ＧＡＡを１．８ｍｌの水中で再構成し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で一晩透析した。次いで、ＧＡＡの濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、４．４マイクロリットルのＤＮＪ（１０ｍＭ）を４００マイクロリットルのＧＡＡに加えた。

【0147】

２５ｍｇ／ｍＬ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）を、１ｍＭ ＤＮＪと伴に又は伴わずに、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートした。３７℃で４週間インキュベートした後、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の凝集を評価した。図１２に示すように、１ｍＭ ＤＮＪを２５ｍｇ／ｍＬ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）を組み合わせると、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の凝集が低下した。

【0148】

実施例１１：ＤＮＪは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の循環半減期及び組織取り込みを増大させる
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに１０ｍｇ／ｋｇ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、又は１０ｍｇ／ｋｇ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）と混合した３０ｍｇ／ｋｇ ＤＮＪを、尾静脈を介して投与した。ＧＡＡ活性を血漿及び四頭筋組織内で測定した。ＧＡＡ又はＤＮＪ及びＧＡＡ投与後の測定されたＧＡＡから、四頭筋内のベースラインＧＡＡ活性を減算した（約１６ｎＭｏｌ／ｍｇタンパク質／時間）。

【0149】

図１３に示すように、３０ｍｇ／ｋｇ ＤＮＪを１０ｍｇ／ｋｇ Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）と共に尾静脈を介して投与することにより、四頭筋内においてＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の循環血漿半減期及び組織取り込みが増大した。

【0150】

実施例１２：１－ＤＮＪ存在下でのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の溶解度
１－ＤＮＪ及び異なる賦形剤の存在下でのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼα）の溶解度を検査した。

【0151】

方法
５２．５ｍｇタンパク質、２１０ｍｇマンニトール、０．５ｍｇポリソルベート８０、９．９ｍｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ７Ｈ_２０、及び３１．２ｍｇ ＮａＨ_２ＰＯ_４ｘＨ_２Ｏを含むＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のバイアルを、最少容積の水（１ｍＬ添加）に溶解して、１．２ｍＬのタンパク質溶液を提供した。５個の２４０μＬアリコート（各々、１０．５ｍｇタンパク質を含む）をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３０ｋＤａカットオフ遠心フィルター装置に移し、エッペンドルフ遠心管内にて１４，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、約５０μＬの残基（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を得た。

【0152】

組成物中に存在する元の賦形剤、即ちマンニトール及びポリソルベート８０を新たな賦形剤と交換して、タンパク質溶解度を試験した（同一の緩衝条件を保持）。元のリン酸緩衝液を使用して、交換のための以下の賦形剤溶液を調製した：
１． ＰＥＧ４００（５％ｗ／ｖ）
２． アルギニン（１００ｍＭ）
３． アルギニン（５０ｍＭ）＋グルタミン酸（５０ｍＭ）
４． プロリン（２５０ｍＭ）
５． γ－シクロデキストリン（１０％）
サンプル２（１００ｍＭアルギニン）を除いた全サンプルが、小分子リガンド１－デオキシノジリマイシン塩酸塩（１－ＤＮＪ－ＨＣｌ、ＡＴ２２２０ ＨＣｌ、２２２０ ＨＣｌ）を、リガンドとタンパク質との比１：１（ｗ／ｗ）で含み、サンプル２はリガンドを、低いリガンドとタンパク質との比１：５（ｗ／ｗ）で含んでいた。

【0153】

賦形剤を交換するために、５．２ｍｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４及び２７．１ｍｇ ＮａＨ_２ＰＯ_４を１０．３ｍＬ水に溶解して、およそ２６ｍＭの洗浄／賦形剤交換リン酸緩衝液を調製した。賦形剤交換用の容積８ｍＬの緩衝液を１６０ｍｇ／ｍＬの小分子リガンドで補充して（賦形剤１、３、４及び５溶液を調製し）、一方、賦形剤２（１００ｍＭアルギニン）のために２ｍＬを３２ｍｇ／ｍＬリガンドで補充した。賦形剤の各々を２ｍＬのこの緩衝液に、上記にリストした濃度にて溶解した。

【0154】

賦形剤溶液を別個の各フィルター装置に加えて、総容積０．５ｍＬを達成した。各フィルター装置を卓上エッペンドルフ遠心管内にて１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、およそ２５μＬを維持した。ユニットを同一の賦形剤溶液で０．５ｍＬに再充填し、再度遠心分離した（このプロセスを２回反復した）。この手順は、マンニトール及びポリソルベート８０を、上述した賦形剤で効率的に代替し、元の成分を約１：１０００にて希釈した。各賦形剤に関する全濾液を収集し、フィルターを通った任意のタンパク質漏出に関して検査した。

【0155】

各遠心分離フィルター装置を清浄なチューブ内に反転し、１０００ｘｇで２分間遠心分離することにより濃縮タンパク質溶液を各フィルター装置から収集した。各サンプルの容積を決定し（６６μＬ、標的タンパク質濃度１６０ｍｇ／ｍＬに対応）、各サンプル中、可視の沈殿が観察できないことを確認した。サンプルをそれらの各々のフィルター装置に移し戻し、更に５分間遠心分離した。次いで、フィルターを清浄なチューブ内に反転することによりサンプルを収集し、１０００ｘｇで２分間遠心分離して、約３７μＬの残基（１０．５ｍｇタンパク質の総初期濃度に基づいて、＞２８０ｍｇ／ｍＬタンパク質に対応）を提供した。

【0156】

サンプルを渦撹拌し、室温で１時間インキュベートして液相及び固相を平衡化した後、１４，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。再度、可視の沈殿は観察されなかった。２～３個の１０μＬアリコートを各サンプルの上清から取り（液相の利用可能な容積に応じて）、２ステップで１：１０００に希釈した。タンパク質濃度を２８０ｎＭでのＵＶ吸光度により測定し、高い再現性を有する較正曲線に従って最大タンパク質溶解度を計算した。６．８ｍｇのＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼα）凍結乾燥粉末（１．１６ｍｇタンパク質を含む）を１．１６ｍＬの水に溶解した後、脱イオン水中で連続希釈することにより較正曲線を準備した。０．５ｍＬアリコートを使用して、吸光度を１ｃｍ光透過石英セミマイクロキュベット（ｌｉｇｈｔ－ｐａｓｓ ｑｕａｒｔｚ ｓｅｍｉ－ｍｉｃｒｏ ｃｕｖｅｔｔｅ）内にて２８０ｎＭで測定した。

【0157】

結果：
表１に示すように、この研究にて試験した賦形剤は、小分子リガンド、１－ＤＮＪ－ＨＣｌの存在下で、タンパク質の溶解度を増大させた。観察された最大値は、アルギニン及びグルタミン酸（２４２ｍｇ／ｍＬ）の混合物に関してであり、最小値は、γ－シクロデキストリン（１１４ｍｇ／ｍＬ）に関してであった。賦形剤を添加しなかったタンパク質の溶解度は、約８０ｍｇ／ｍＬと決定された。いずれの理論にも束縛されるものではないが、溶解度の増大は、タンパク質表面の疎水性及び親水性部位とのアミノ酸賦形剤の効率的な相互作用に起因する可能性があり、このような相互作用は、タンパク質－タンパク質会合を競合的に妨害する。

【0158】

【0159】

実施例１３：ＧＡＡ ＫＯマウスにおける組織取り込み及びグリコーゲン低下に対する、共処方ｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの反復皮下投与の効果
本研究は、ＧＡＡノックアウトマウス（ＧＡＡ ＫＯ）がｒｈＧＡＡ、又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤の反復皮下（ＳＱ）注射に耐えるか否か、ｒｒｈＧＡＡの反復ＳＱ注射がＧＡＡ ＫＯマウスにおいてｒｈＧＡＡの組織取り込みを増大させ、グリコーゲンレベルを低下させるか否か、並びに、ｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤の反復ＳＱ注射が、ｒｈＧＡＡ単独のＳＱ注射と比較して、ｒｈＧＡＡの組織取り込みを増大させ、グリコーゲンレベルを低下させるか否かを検査した。

【0160】

方法
本研究では、７グループの１２週齢の雄のＧＡＡ ＫＯマウスを使用した。マウスの各グループに、以下の処置の１つを投与した：
（１）生理食塩水のみ（薬物対照なし）；
（２）皮下送達（ＳＱ）したＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）単独（２０ｍｇ／ｋｇ）；又は
（３）共処方したＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（２０ｍｇ／ｋｇ）及び１－ＤＮＪ（３０ｍｇ／ｋｇ）ＳＱ。

【0161】

処置の各々を、それらの対応する処置グループに２週間の間投与した。処置を各週の月曜日及び木曜日に投与した。処置を受けている各マウスの肩甲骨間にＳＱ注射を投与した。合計４用量を各研究動物に投与した。第３及び第４の用量の前に、ジフェンヒドラミンを腹腔内（ＩＰ）投与した。

【0162】

以下のサンプリングプロトコルに従ってｒｈＧＡＡ及びグリコーゲンレベルを決定した。血漿薬物動態分析のために、第４の用量後に各研究動物から血液を採取した。最終ＳＱ用量から２及び４時間後に採取した血漿サンプルに関して、ＧＡＡ活性、ウェスタンブロット、及び１－ＤＮＪレベルを決定した。

【0163】

この研究の最終用量から３日後（即ち、用量４の３日後）、組織サンプルを収集してｒｈＧＡＡ取り込みを決定した。組織サンプルは、ＳＱ注射部位からの、心臓、横隔膜、舌、脳、脾臓、肝臓、二頭筋、三頭筋、四頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋、腹側皮膚及び背側皮膚を含んでいた。研究の最終用量から１４日後（即ち、用量４の１４日後）にも組織サンプルを収集して、グリコーゲン濃度を決定した。試験対象に投与した処置、及びサンプル収集のタイミングの概要を表２に示す。

【0164】

【0165】

結果
組織ｒｈＧＡＡ及びグリコーゲン
図１５～２５は、３つの処置のうちの１つを受けていた動物から採取した組織サンプルにおける、最終処置用量から３日後のＧＡＡ活性、及び最終処置用量から１４日後のグリコーゲンレベルを示す。試験した組織の殆どに関して、１－ＤＮＪとのｒｈＧＡＡの共処方は、ｒｈＧＡＡ単独の投与と比較して、試験組織内のｒｈＧＡＡ取り込み及び活性を有意に増大させた。加えて、ｒｈＧＡＡ、又はｒｈＧＡＡ及び１－ＤＮＪの共製剤を用いた処置後、最終処置用量から３日後に、ｒｈＧＡＡ活性は腹側皮膚内及び前肢筋内のＳＱ注射の部位にて高かった。ｒｈＧＡＡ活性は、前肢を除いて、試験した全筋肉内よりも肝臓内でより高かった。

【0166】

更に、表３に記載したように、ＳＱで投与された１－ＤＮＪ及びｒｈＧＡＡ（Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））の共製剤を用いて達成されたｒｈＧＡＡレベルは、静脈内で投与されたｈＧＡＡ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標））単独で達成されたレベルと比較して、同一又はより高かった（大部分の組織内で）。

【0167】

【0168】

組織サンプル中で検出されたグリコーゲンレベルに関して、グリコーゲン低下の大きさは、いくつかの組織内でｒｈＧＡＡ取り込みと相関した。心臓、舌及び腹側皮膚は、ｒｈＧＡＡ＋１－ＤＮＪ共製剤により、ｒｈＧＡＡの取り込みの改善とグリコーゲン低下の改善との間に、ｒｈＧＡＡ単独を超える相関を示した。いずれの理論にも束縛されるものではないが、いくつかの組織ライセート中の高いｒｈＧＡＡ酵素活性は、組織（例えば脂肪、リンパ、血管）内に存在するが、未だ細胞及びリソソーム内に取り込まれていない酵素に由来する可能性がある。加えて、いずれの理論にも束縛されるものではないが、リソソーム酵素が役立たないが、検出可能な大量の細胞質グリコーゲンが全細胞ライセート中に存在する可能性がある。

【0169】

血漿ｒｈＧＡＡ
共製剤で処置した動物からの血漿サンプル中に存在する１－ＤＮＪが、サンプル中のｒｈＧＡＡを阻害したか否かを決定するために、血漿サンプルからのｒｈＧＡＡをＧＡＡ基質と共に１時間インキュベートし、基質代謝に基づく酵素活性を決定することによってｒｈＧＡＡ活性を決定した。次いで、サンプルを基質と共に３時間インキュベートしてこのようなサンプルを１－ＤＮＪを酵素から解離させることによって、１－ＤＮＪにより生じた任意の酵素阻害を逆行させて再分析した。２つのアッセイ形式の結果の間に、実質的な変化は見られなかった。

【0170】

図２６～２８は、最終処置用量から２及び４時間後に収集したサンプル中の血漿ｒｈＧＡＡ活性及びタンパク質濃度を示す。最終ＳＱ処置用量から２時間後、１－ＤＮＪが共製剤中でｒｈＧＡＡと共に投与された場合、ｒｈＧＡＡが単独で投与された場合よりも高いｒｈＧＡＡ活性及びタンパク質濃度を血漿中で検出することができた（即ち、各々、活性アッセイ及びウェスタンブロット）。最終ＳＱ処置用量から４時間後、血漿ｒｈＧＡＡレベルは、共製剤により処置されたマウスにおいて高いままであった一方、ｒｈＧＡＡ単独で処置されたマウスからの血漿ｒｈＧＡＡレベルは、２時間におけるサンプルのレベルと比較して増大した。

【0171】

本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、前述の記載及び添付の図面から本発明の様々な修正形態が当業者に明かとなろう。それらの修正形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

【0172】

特許、特許出願、文献、製品の説明、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号、及びプロトコルが本願全体を通して引用され、これらの開示全体は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載の一の発明。

【外国語明細書】