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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024105346
(43)【公開日】2024-08-06
(54)【発明の名称】Ｔ細胞、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20240730BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240730BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240730BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240730BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240730BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240730BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240730BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240730BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240730BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
A61P29/00
A61P31/00
A61P35/00
A61P31/10
A61P31/12
A61P31/04
A61P35/02
C12N15/09 110
C12N15/113 Z
【審査請求】有
【請求項の数】22
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024071037
(22)【出願日】2024-04-25
(62)【分割の表示】P 2022570128の分割
【原出願日】2020-05-15
(71)【出願人】
【識別番号】522446661
【氏名又は名称】博迪賀康（北京）生物技術有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】石彦
(72)【発明者】
【氏名】蒙俊辰
(72)【発明者】
【氏名】王暁博
(72)【発明者】
【氏名】耿爽
(57)【要約】 （修正有）
【課題】感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製におけるＴ細胞の有用な使用を提供する。
【解決手段】Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又はＲｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用であって、好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用が提供される。
【選択図】図５
【解決手段】Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又はＲｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用であって、好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用が提供される。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｒｙｒ２遺伝子が欠損されていることを特徴とするＴ細胞。
【請求項2】
Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソンが欠損されていることを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項3】
少なくともＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列が欠損されており、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあることを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項4】
前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とする請求項３に記載のＴ細胞。
【請求項5】
前記Ｔ細胞は、Ｔｃｏｎｖ細胞であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項6】
前記調製方法は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ技術又はホーミングエンドヌクレアーゼから選ばれることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞の調製方法。
【請求項7】
前記ｓｈＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６に示されることを特徴とする請求項６に記載の調製方法。
【請求項8】
Ｔ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウンすることにより、Ｔ細胞Ｃａ２＋基礎振動を低下させ、ｍ－カルパイン活性を低下させ、ＤＣ細胞との結合強度を向上させ、免疫抑制細胞の機能を有する、又は感染性疾患、炎症若しくは腫瘍を治療する機能を有することを特徴とするｓｈＲＮＡ。
【請求項9】
前記ｓｈＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６であることを特徴とする請求項８に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項10】
Ｒｙｒ２が過剰発現されていることを特徴とするＴ細胞。
【請求項11】
前記Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とする請求項１０に記載のＴ細胞。
【請求項12】
Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又は請求項１～５及び１０～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用。
【請求項13】
Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又は請求項１～５及び１０～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍の治療における使用。
【請求項14】
Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬、ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬又は請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞の、感染性疾患又は炎症を治療する医薬品の調製における使用。
【請求項15】
Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬、ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬又は請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞の、感染性疾患又は炎症の治療における使用。
【請求項16】
Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬、ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬又は請求項１０～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞の、腫瘍治療薬の調製における使用。
【請求項17】
Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬、ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬又は請求項１０～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞の、腫瘍の治療における使用。
【請求項18】
前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスであることを特徴とする請求項１２～１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項19】
前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれることを特徴とする請求項１２～１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項20】
前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれることを特徴とする請求項１２～１３及び１６～１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項21】
Ｒｙｒ２発現調整の、Ｃａ２＋基礎振動調整、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度向上における使用。
【請求項22】
Ｃａ２＋基礎振動調整の、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用。
【請求項23】
ｍ－カルパイン活性調整の、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用。
【請求項24】
前記調整は低下又は向上であることを特徴とする請求項２１～２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項25】
Ｒｙｒ２拮抗剤であって、前記拮抗剤は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソン又はＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列を標的とし、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とするＲｙｒ２拮抗剤。
【請求項26】
Ｒｙｒ２発現を調整することを含むことを特徴とする、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する方法。
【請求項27】
前記調整は、低下又は向上であり、好ましくは、前記Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる方法は、Ｒｙｒ２発現を向上させることを含み、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる方法は、Ｒｙｒ２発現を低下させることを含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含み、Ｒｙｒ２発現を向上させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含み、前記Ｒｙｒ２阻害剤は、請求項２５に記載のＲｙｒ２拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれ、前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含み、好ましくは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトし、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、最も好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンを欠損させることを含むことを特徴とする請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項31】
Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を低下させる、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる、ｍ－カルパイン活性を低下させる方法であって、前記方法は、
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させる、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させる、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
【請求項32】
Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を向上させる、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる、ｍ－カルパイン活性を向上させる方法であって、前記方法は、
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
【請求項33】
Ｔｃｏｎｖ細胞をＴｒｅｇ細胞と類似した機能を有するものに転化する方法であって、前記方法は、
Ｔｃｏｎｖ細胞のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＴｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含むことを特徴とする方法。
Ｔｃｏｎｖ細胞のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＴｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項34】
Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトすることを含み、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記方法は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトすることを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞の有効量を対象に投与することを含むことを特徴とする感染性疾患又は炎症の治療方法。
【請求項37】
対象のＴ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させること、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を低下させること、Ｃａ２＋基礎振動を低下させること、ｍ－カルパイン活性を低下させること、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させること、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することから選ばれることを特徴とする感染性疾患又は炎症の治療方法。
【請求項38】
前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスであり、前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれることを特徴とする請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項39】
請求項１０～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞の有効量を対象に投与することを含むことを特徴とする腫瘍治療方法。
【請求項40】
対象Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させること、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を向上させること、Ｃａ２＋基礎振動を向上させること、ｍ－カルパイン活性を向上させること、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させること、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することから選ばれることを特徴とする腫瘍治療方法。
【請求項41】
前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれることを特徴とする請求項３８又は３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物の技術分野に関し、具体的には、Ｔ細胞、その調製方法及び使用、並びにＲｙｒ２発現を調整する試薬、調整Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は抑制性Ｔ細胞の機能亜群であり、天然のＴｒｅｇ細胞は１９９５年にＳａｋａｇｕｃｈｉらによって初めて報告され、それらは末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞数の約５％～１０％を占め、ＦｏｘＰ３は天然のＴｒｅｇの標識である。制御性Ｔ細胞は、天然Ｔｒｅｇ（ｎ Ｔｒｅｇ）と獲得Ｔｒｅｇ（ａ Ｔｒｅｇ）の２種類に分類される。
【0003】
Ｔｒｅｇ細胞の抑制機序は研究の焦点である。参照文献：Past, Present, and Future of Regulatory T Cell Therapy in Transplantation and Autoimmunity（Romano et al.，Frontiers in Immunology，2019）で開示されている機序には、Ｔ細胞の溶解、表面タンパク質の抽出、アデノシンの局所生成などが含まれるが、これらのいずれにもＴｒｅｇ結合が必要である。近年、一連の研究報告は樹状細胞の直接抑制に研究の重点を移している。主な理由は以下の通りである。まず、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数ではＴｒｅｇ細胞が樹状細胞をはるかに上回っているが、Ｔｒｅｇ細胞は樹状細胞に比べて数的に優位であり、体内での割合は約２：１であり、抑制能のより合理的で公正な使用の可能性が推察される。次に、ＤＣ／Ｔｒｅｇの直接結合は体内と体外でよく見られる。このような制約はＤＣを抑圧するものと考えられるが、適切な運用方法についてはまだ意見が一致していない。参照文献：Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cell-extrinsic function of CTLA-4（Qureshi et al.，Science 332，2011）においてＳａｋａｇｕｃｈｉのチームは、これは主にＣＴＬＡ－４がＴｒｅｇ上で発現するサイトーシス作用によって実現されることを提案した。Ｓｈｅｖａｃｈは最近の論文で、ＭＨＣ クラスＩＩ抽出が抗原提示におけるＤＣの抑制に重要な役割を果たすことを提案している。
【0004】
しかし、本願の発明者らは、ＴｒｅｇとＤＣとの結合はＬＦＡ－１とＩＣＡＭ－１を介して媒介されており、結合自体が非常に強く、ＤＣ細胞の骨格が大きく歪んでしまい、他のＴ細胞への抗原提示をサポートできないと考えている（参照文献：Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy（Chen et al.，The Journal of experimental medicine，2017））。時間の経過とともに、これらの違いが解消され、Ｔｒｅｇが接触によってＤＣをどのように抑制するかについて、より正確で包括的な画像が得られるかもしれない。しかし、議論を続けるためには、なぜＴｒｅｇがＤＣをこれほど強力な力で結びつけているのか、その過剰な力がＤＣにどのように影響を与えているのか、という基本的な問いに答えなければならない。
【0005】
Ｒｙｒ２は小胞体／筋小胞体（ＥＲ／ＳＲ）のカルシウム放出チャネルであり、以下の従来技術では、Ｒｙｒ２遺伝子が心原性突然死、不整脈、冠状動脈性硬化症に関連することが開示されている。例えば、
非特許文献：Ｒｙｒ２遺伝子の新たな突然変異による心原性突然死の家族研究（申童ら、中国医学と西洋医学を統合した心血管病雑誌、２０１９．０２）は、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異ｃ．Ｇ４１０７Ｃを有すれば、労作性呼吸困難、胸痛などの症状が存在し、すなわち、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異が心原性突然死と関連する可能性があることを開示した。
非特許文献：Ｒｙｒ２遺伝子の新たな突然変異による心原性突然死の家族研究（申童ら、中国医学と西洋医学を統合した心血管病雑誌、２０１９．０２）は、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異ｃ．Ｇ４１０７Ｃを有すれば、労作性呼吸困難、胸痛などの症状が存在し、すなわち、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異が心原性突然死と関連する可能性があることを開示した。
【0006】
非特許文献：ＣＡＳＱ２とＲｙｒ２のジアモルフィンによる心筋細胞リズム異常における作用（胡夏韻ら、新疆医科大学学報、２０１９．０３）は、Ｒｙｒ２とカルシウムチャンネルの関係を開示し、Ｒｙｒ２が心筋細胞カルシウムチャンネル異常と不整脈に関与する過程を明らかにした。
【0007】
非特許文献：Ｒｙｒ２遺伝子発現と冠状動脈性硬化症の心気虚証の発病との関連性に関する理論的検討（馬月香ら、中医薬情報、２０１２）は、Ｒｙｒ２機能失調が心機能低下を招くことがあり、心が主に血脈に作用し、心気が血液運行を推進する基本動力であり、心気虚損が心機能低下を招くという中医学に合致することを開示し、Ｒｙｒ２遺伝子の発現から心気虚証の証候の実質をさらに明らかにすることができる。
【0008】
非特許文献：カルベジロールのＲｙｒ２媒介自発性カルシウム振動に対する抑制作用（肖建民ら、中国病理生理雑誌、２０１３）は、カルベジロールがＲｙｒ２媒介自発性カルシウム振動を抑制できることを開示し、そして、カルベジロールが心不全死亡率を下げる面で他のβ受容体ブロッカーより優れていることを明らかにした。
【0009】
しかし、上記従来技術では、Ｒｙｒ２とＴ細胞及び感染性疾患、炎症や腫瘍との関連性は開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、従来技術の空白を埋めるために、Ｔｒｅｇ細胞機能の調整スイッチであるＲｙｒ２を発見し、ＦｏｘＰ３過剰発現によりＲｙｒ２の発現を低下させる技術を取得し、しかも、標的位置を特定する。また、Ｔ細胞中のＲｙｒ２をノックダウン又はノックアウトすることによりＣＤ４＋Ｔ細胞プールが免疫抑制細胞になり、得られたＴ細胞はＴｒｅｇ細胞と類似した機能を持つことは多くの試験を通じて確認される。さらに、Ｒｙｒ２の調整は、ウイルス感染、喘息、アレルギー、結腸炎や腫瘍のいずれの治療においても優れた効果が得られ、皮癬罹患マウスの関連する系の自己免疫を回復する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
具体的には、本発明の第１態様は、Ｒｙｒ２遺伝子が欠損されているか、又はＦｏｘＰ３が過剰発現されたＴ細胞を提供する。
【0012】
好ましくは、前記Ｔ細胞において、少なくともＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンが欠損されている。
【0013】
好ましくは、前記Ｔ細胞において、少なくともＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列が欠損されている。
【0014】
好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにある。
【0015】
好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、少なくとも４つのグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列である。さらに好ましくは、少なくとも４～２０個のグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチドである。
【0016】
本発明の１つの特定実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個などを含む。
【0017】
好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含む。
【0018】
好ましくは、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御/抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はメモリーＴ細胞から選ばれる。
【0019】
本発明の１つの特定実施形態では、前記Ｔ細胞はＴｃｏｎｖ細胞である。
【0020】
本発明の第２態様は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ技術又はホーミングエンドヌクレアーゼを用いる本発明の前記Ｔ細胞の調製方法を提供する。
【0021】
好ましくは、前記ｓｈＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６である。
【0022】
本発明の第３態様は、細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウンすることにより、Ｔ細胞Ｃａ２＋基礎振動を低下させ、ｍ－カルパイン（ｍ－カルパイン）活性を低下させ、ＤＣ細胞との結合強度を向上させ、免疫抑制細胞の機能又は感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する機能を有するｓｈＲＮＡを提供する。
【0023】
好ましくは、前記ｓｈＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６である。
【0024】
本発明の第４態様は、Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞を提供する。
【0025】
好ましくは、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御/抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はメモリーＴ細胞から選ばれる。
【0026】
本発明の１つの特定実施形態では、前記Ｔ細胞はＴｒｅｇ細胞である。
【0027】
本発明の第５態様は、ＦｏｘＰ３発現を調整する試薬、Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用を提供する。
【0028】
好ましくは、前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ－１、ＥＢＶ）、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスである。
【0029】
好ましくは、前記炎症は任意の組織に現れる炎症であってもよく、前記組織は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含むが、これらに限定されるものではない。さらに好ましくは、前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー（例えばアレルギー鼻炎）、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれる。
【0030】
好ましくは、前記腫瘍は、任意の望ましくない細胞増殖（又は自体が望ましくない細胞増殖を示す任意の疾患）、新生物、又は望ましくない細胞増殖、新生物や腫瘍の傾向もしくはリスク増加であってもよい。良性又は悪性のものであってもよいし、原発性又は続発性（転移性）のものであってもよい。新生物は細胞の任意の異常な成長又は増殖であってもよく、また、任意の組織にあってもよい。組織の例は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含む。さらに好ましくは、前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ（例えば神経膠腫）、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫（例えば神経線維肉腫）、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれる。
【0031】
本発明の第６態様は、ＦｏｘＰ３発現を調整する試薬、Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又は本発明の前記Ｔ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍の治療における使用を提供する。
【0032】
本発明の第７態様は、ＦｏｘＰ３発現を調整する試薬、Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又は本発明の前記Ｔ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用を提供する。
【0033】
本発明の第８態様は、ＦｏｘＰ３発現調整、Ｒｙｒ２発現調整、Ｃａ２＋基礎振動調整、ｍ－カルパイン活性調整、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整又は本発明に記載のＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍の治療又は感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用を提供する。
【0034】
好ましくは、前記感染性疾患は細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ－１、ＥＢＶ）、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスである。
【0035】
好ましくは、前記炎症は任意の組織に現れる炎症であってもよく、前記組織は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含むが、これらに限定されるものではない。さらに好ましくは、前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー（例えばアレルギー鼻炎）、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれる。
【0036】
好ましくは、前記腫瘍は任意の望ましくない細胞増殖（又は自体が望ましくない細胞増殖を示す任意の疾患）、新生物、又は望ましくない細胞増殖、新生物や腫瘍の傾向もしくはリスク増加であってもよい。良性又は悪性のものであってもよいし、原発性又は続発性（転移性）のものであってもよい。新生物は細胞の任意の異常な成長又は増殖であってもよく、また任意の組織にあってもよい。組織の例は副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含む。さらに好ましくは、前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ（例えば神経膠腫）、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫（例えば神経線維肉腫）、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれる。
【0037】
本発明の第９態様は、ＦｏｘＰ３発現を向上させる試薬、Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬、ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬又は上記Ｒｙｒ２遺伝子欠損Ｔ細胞の、感染性疾患又は炎症を治療する医薬品の調製における使用を提供する。
【0038】
本発明の第１０態様は、ＦｏｘＰ３発現を向上させる試薬、Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬、ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬又は上記Ｒｙｒ２遺伝子欠損Ｔ細胞の、感染性疾患又は炎症の治療における使用を提供する。
【0039】
本発明の第１１態様は、ＦｏｘＰ３発現向上、Ｒｙｒ２発現低下、Ｃａ２＋基礎振動低下、ｍ－カルパイン活性低下又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度向上の、感染性疾患、炎症治療又は感染性疾患、炎症を治療する医薬品の調製における使用を提供する。
【0040】
好ましくは、前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ－１、ＥＢＶ）、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスである。
【0041】
好ましくは、前記炎症は任意の組織に現れる炎症であってもよく、前記組織は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含むが、これらに限定されるものではない。さらに好ましくは、前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー（例えばアレルギー鼻炎）、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれる。
【0042】
本発明の第１２態様は、ＦｏｘＰ３発現を低下させる試薬、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬、ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬又は上記Ｒｙｒ２を過剰発現させたＴ細胞の、腫瘍治療薬の調製における使用を提供する。
【0043】
本発明の第１３態様は、ＦｏｘＰ３発現を低下させる試薬、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬、ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬又は上記Ｒｙｒ２を過剰発現させたＴ細胞の、腫瘍の治療における使用を提供する。
【0044】
本発明の第１４態様は、ＦｏｘＰ３発現低下、Ｒｙｒ２発現向上、Ｃａ２＋基礎振動向上、ｍ－カルパイン活性向上、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度低下の、腫瘍治療又は腫瘍治療薬の調製における使用を提供する。
【0045】
好ましくは、前記腫瘍は任意の望ましくない細胞増殖（又はそれ自体が望ましくない細胞増殖を示す任意の疾患）、新生物、又は望ましくない細胞増殖、新生物や腫瘍の傾向もしくはリスク増加であってもよい。それは良性又は悪性のものであってもよいし、原発性又は続発性（転移性）のものであってもよい。新生物は細胞の任意の異常な成長又は増殖であってもよく、また任意の組織にあってもよい。組織の例は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含む。さらに好ましくは、前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ（例えば神経膠腫）、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫（例えば神経線維肉腫）、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれる。
【0046】
本発明の第１５態様は、ＦｏｘＰ３発現向上の、Ｒｙｒ２発現低下、Ｃａ２＋基礎振動低下、ｍ－カルパイン活性低下又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度向上における使用を提供する。
【0047】
本発明の第１６態様は、Ｒｙｒ２発現調整の、Ｃａ２＋基礎振動調整、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度向上における使用を提供する。好ましくは、前記調整は低下又は向上である。
【0048】
本発明の第１７態様は、Ｃａ２＋基礎振動調整の、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用を提供する。好ましくは、前記調整は低下又は向上である。
【0049】
本発明の第１８態様は、ｍ－カルパイン活性調整の、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用を提供する。好ましくは、前記調整は低下又は向上である。
【0050】
本発明の第１９態様は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソン又はＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列を標的とするＲｙｒ２拮抗剤を提供する。好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＲｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにある。さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＧＣＡＧＧＧＧを含む。
【0051】
本発明の第２０態様は、Ｒｙｒ２発現を調整することを含むＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する方法を提供する。
【0052】
好ましくは、前記調整は低下又は向上である。前記Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる方法は、Ｒｙｒ２発現を向上させることを含み、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる方法は、Ｒｙｒ２発現を低下させることを含む。
【0053】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含む。さらに好ましくは、前記Ｒｙｒ２阻害剤は、本発明の前記拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれる。
【0054】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２発現を向上させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含む。さらに好ましくは、前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれる。
【0055】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２発現を低下させることは、前記Ｔ細胞中Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソンを欠損させることを含む。
【0056】
本発明の１つの特定実施形態では、ｓｈＲＮＡを採用してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６のためにＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトする。
【0057】
好ましくは、Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含む。さらに好ましくは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトする。よりさらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＲｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにある。最も好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＧＣＡＧＧＧＧを含む。
【0058】
好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は少なくとも４つのグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列である。さらに好ましくは、少なくとも４～１０個のグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列である。
【0059】
本発明の１つの特定実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個などを含む。
【0060】
本発明の第２１態様は、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を低下させる、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる、ｍ－カルパイン活性を低下させる方法であって、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させる、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含む方法を提供する。
【0061】
好ましくは、少なくともＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトする。
【0062】
本発明の１つの特定実施形態では、ｓｈＲＮＡを採用してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６のためにＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトする。
【0063】
好ましくは、前記方法は、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含む。さらに好ましくは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトする。よりさらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＲｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにある。最も好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＧＣＡＧＧＧＧを含む。
【0064】
好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は少なくとも４つのグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列である。さらに好ましくは、少なくとも４～１０個のグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド配列である。
【0065】
本発明の１つの特定実施形態では、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個などを含む。
【0066】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２阻害剤は、本発明の前記拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれる。
【0067】
本発明の第２２態様は、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を向上させる、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる、ｍ－カルパイン活性を向上させる方法であって、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含む方法を提供する。
【0068】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれる。
【0069】
本発明の第２３態様は、Ｔｃｏｎｖ細胞をＴｒｅｇ細胞と類似した機能を有するものに転化する方法であって、Ｔｃｏｎｖ細胞のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＴｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含む方法を提供する。
【0070】
好ましくは、前記方法は、少なくともＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックダウン又はノックアウトすることを含む。
【0071】
本発明の１つの特定実施形態では、ｓｈＲＮＡを採用してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６のためにＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトする。
【0072】
好ましくは、前記方法は、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトすることを含む。さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＲｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにある。よりさらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列はＧＣＡＧＧＧＧを含む。
【0073】
本発明の１つの特定実施形態では、Ｒｙｒ２遺伝子のプロモータ領域の１．５ｋｂ又は４０ｋｂ長さのヌクレオチド配列をノックダウン又はノックアウトする。
【0074】
好ましくは、前記Ｔｒｅｇ細胞と類似した機能は、ＤＣ細胞との結合強度、関連する表面マーカー（例えばＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３９、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３）の発現量、Ｃａ２＋レベルが低いこと、Ｃａ２＋基礎振動が低いこと、ＣＭＡＣ消化が低いこと、ｔａｌｉｎ消化が低下したこと、及び免疫過多が低減したことを含むが、これらに限定されるものではない。
【0075】
本発明の第２４態様は、本発明の前記Ｒｙｒ２遺伝子欠損Ｔ細胞の有効量を対象に投与することを含む、感染性疾患又は炎症の治療方法を提供する。
【0076】
本発明の第２５態様は、対象のＴ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させること、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を低下させること、Ｃａ２＋基礎振動を低下させること、ｍ－カルパイン活性を低下させること、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させること、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することから選ばれる、感染性疾患又は炎症の治療方法を提供する。
【0077】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２阻害剤は本発明の前記拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれる。
【0078】
好ましくは、前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ－１、ＥＢＶ）、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスである。
【0079】
好ましくは、前記炎症は任意の組織に現れる炎症であってもよく、前記組織は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含むが、これらに限定されるものではない。さらに好ましくは、前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー（例えばアレルギー鼻炎）、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれる。
【0080】
本発明の第２６態様は、本発明の前記Ｒｙｒ２を過剰発現させたＴ細胞の有効量を対象に投与することを含む、腫瘍治療方法を提供する。
【0081】
本発明の第２７態様は、対象のＴ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させること、Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を向上させること、Ｃａ２＋基礎振動を向上させること、ｍ－カルパイン活性を向上させること、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させること、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することから選ばれる腫瘍治療方法を提供する。
【0082】
好ましくは、前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれる。
【0083】
好ましくは、前記腫瘍は、任意の望ましくない細胞増殖（又は自体が望ましくない細胞増殖を示す任意の疾患）、新生物、又は望ましくない細胞増殖、新生物や腫瘍の傾向もしくはリスク増加であってもよい。良性又は悪性のものであってもよいし、原発性又は続発性（転移性）のものであってもよい。新生物は細胞の任意の異常な成長又は増殖であってもよく、また任意の組織にあってもよい。組織の例は、副腎、副腎髓質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、又は除く）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ母細胞、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網膜、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、気管、子宮、外陰、白血球を含む。さらに好ましくは、前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ（例えば神経膠腫）、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫（例えば神経線維肉腫）、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれる。
【0084】
本発明の前記「調整」とは、アップレギュレーション（向上）又はダウンレギュレーション（低下）を含む。例えば、前記「ＦｏｘＰ３発現を調整する試薬」は、ＦｏｘＰ３発現を向上させる試薬又はＦｏｘＰ３発現を低下させる試薬を含み、前記「Ｒｙｒ２発現を調整する試薬」は、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬又はＲｙｒ２発現を低下させる試薬を含む。
【0085】
本発明の前記「治療」は、１つの徴候、症状、障害、病症又は疾患の進行又は重篤度の遅延、中断、阻止、制御、停止、軽減、又は逆転を含むが、これらに限定されるものではなく、疾患に関連する全ての徴候、症状、病症、又は障害を完全に解消するわけではない。
【0086】
本発明の前記「試薬」は、対応する機能を発生させたり特定の目的を達成させたりするために使用される汎用試薬、高純度試薬、解析用試薬、器具解析用試薬、臨床診断試薬、生物化学的試薬、無機イオン発色剤試薬又は装置やデバイスを表し得る。例えば、前記「ＦｏｘＰ３発現を向上させる試薬」は、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３発現を向上させ得る任意の試薬、例えばＴ細胞にＦｏｘＰ３遺伝子を導入する試薬、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３遺伝子の転写又は発現を向上させる試薬などを含む。前記「ＦｏｘＰ３発現を低下させる試薬」は、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３発現を低下させ得る任意の試薬、例えばＴ細胞中のＦｏｘＰ３遺伝子をノックアウト又はノックダウンする試薬、ＦｏｘＰ３遺伝子の転写又は発現を抑制する試薬などを含む。前記「Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬」は、Ｒｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするのに必要な試薬、ＦｏｘＰ３発現を向上させる試薬、又はＲｙｒ２転写又は発現を低下させる試薬；例えば本発明の前記拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９などを含むが、これらに限定されるものではない。前記「Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬」は、Ｔ細胞にＲｙｒ２遺伝子を導入する試薬、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の転写又は発現を向上させる試薬又はＴ細胞中のＦｏｘＰ３発現を低下させる試薬などを含むが、これらに限定されるものではない。前記「Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。前記「Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。前記「ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。前記「ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。前記「Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。前記「Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬」は、Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬を含むが、これらに限定されるものではない。
【0087】
本発明の前記「対象」は、非ヒト哺乳類又はヒトを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記非ヒト哺乳類は、サル、イヌ、マウスやラットなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【0088】
本発明の前記「有効量」とは、単一又は複数の用量で対象又は器官に投与した後に期待される治療を提供する本発明の前記試薬又は医薬品の量又は用量である。
【0089】
本発明の前記「ＣＭＡＣ」は青色蛍光染料であり、化学名が７－アミノ－４－クロロメチルクマリンである。
【図面の簡単な説明】
【0090】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例を詳細に説明する。
【図1】野生型マウスから単離されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞中のｍ－カルパインのタンパク質発現の解析であり、このうち、図Ａ、図Ｃはｍ－カルパインのｍＲＮＡレベルであり、図１Ｂはｍ－カルパインのタンパク質レベルであり、全ての値は平均値＋ＳＥＭである。
【図2】休止状態でのＣａ２＋の単一Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞における基礎振動であり、検出系は、２ｍＭ Ｃａ２＋のＨＢＳＳにＣａ２＋プローブＦｌｕｏ ４－ＡＭを加えたものであり、ここで、各ラインは１つの細胞を表し、ｎは１群のデータ点における生物学的繰り返し回数であり、ｎ＝２０である。
【図3】休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるＣａ２＋振動の平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞についてＦｌｕｏ ４－ＡＭにより染色してＭＦＩを解析する。
【図5】ＧＥＯデータベースによりＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのカルシウムイオン調節関連タンパク質のレベルを解析し、違いによって並べ替えられる。
【図6】精製されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるＲｙｒ２ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ解析である。
【図7】カルパイン基質ＣＭＡＣで消化し、Ｒｙｒ活性化（４－ＣＭＣ処理）後のＴｃｏｎｖ（左）及びＴｒｅｇ（右）細胞のカルパイン活性を測定する。
【図8】５ｍＭ ＪＴＶ５１９阻害剤を用いてＲｙｒ２を抑制したＴｃｏｎｖ細胞（中央の図）、野生型Ｔｃｏｎｖ細胞（左の図）及びＴｒｅｇ細胞（右の図）のカルシウムイオン基礎振動である。
【図9】５ｍＭ ＪＴＶ５１９阻害剤を用いてＲｙｒ２を抑制したＴｃｏｎｖ細胞、野生型Ｔｃｏｎｖ細胞及びＴｒｅｇ細胞中のカルシウムイオン基礎振動の標準偏差である。
【図10】ＷＴマウスから単離されたＴｃｏｎｖ細胞及びｓｈＲＮＡからＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞のｍＲＮＡ転写レベルをｑＰＣＲにより解析する。
【図11】ｓｈＲＮＡを採用してＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞と野生型Ｔｃｏｎｖ細胞とのＣａ２＋基礎振動の比較である。
【図12】ｓｈＲＮＡを採用してＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞と野生型Ｔｃｏｎｖ細胞とのＣａ２＋基礎振動の標準偏差である。
【図13】ＪＴＶ５１９処理Ｔｃｏｎｖ（左）、ＪＴＶ５１９処理Ｔｒｅｇ（中）及びＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ（右）におけるカルパイン活性である。
【図14】Ｔ細胞のＤＣ２．４への接着の接着力を検出する。左図は未処理Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ及びＪＴＶ５１９処理Ｔｃｏｎｖの平均接着力であり、右図は空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）とＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖの平均接着力である。
【図15】ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞とＯＶＡを提示したＤＣ２．４細胞との間の接着力の測定であり、図Ａは３つの細胞のＡＦＭ解析の模式図を示し、図ＢはＷ／Ｏ細胞（無細胞群）、空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｅｇの抑制細胞としての平均接着力を示す。
【図16】抑制ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞の分裂のテスト結果であり、図Ａは無Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ、空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞の抑制ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞の分裂のＦＡＣＳ図であり、図ＢはＴｒｅｇ（１００％抑制として定義）及び無Ｔｒｅｇ（０％抑制として定義）で標準化された空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞の抑制効率であり、ここで、＊、Ｐ ＜０．０５、＊＊、Ｐ ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ ＜０．０００１である。
【図17】ＷＴマウスから単離されたＴｃｏｎｖ細胞中のＩｔｐｒ１、Ｃａｃｎｂ１、Ｔｒｐｍ１、Ｔｒｐｍ４、Ｔｒｐｖ２、Ｏｒａｉ１及びＯｒａｉ３遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウン効率をｑＰＣＲにより解析する。
【図18】未処理Ｔｒｅｇ細胞、空白干渉対照Ｔｃｏｎｖ（ｓｈＣｔｒｌ）、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｉｔｐｒ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｃａｃｎｂ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｍ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｍ４ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｖ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｏｒａｉ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、及びＯｒａｉ３ノックダウンＴｃｏｎｖの平均接着力である。
【図19】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。具体的には、ＦｏｘＰ３過剰発現Ｔｃｏｎｖ、Ａ２０、３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞中のＲｙｒ２ ｍＲＮＡレベルである。
【図20】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。Ｆｏｘｐ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、トランスフェクションＦｏｘｐ３（上）又はＦｏｘｐ３（下）未トランスフェクションＴｃｏｎｖである。矢印はＲｙｒ２遺伝子のＴＳＳ部位を示す。三角はＣｈＩＰ－ｓｅｑにより認識された有意差がある結合ピークであり、この位置は主にこの遺伝子のプロモータ領域（ブロック）と重なる。
【図21】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。上図はＲｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの構築の概略図、ＴＳＳ、転写開始部位である。下図はＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３又はＲｅｎｃａ細胞においてＲｙｒ２プロモータにより駆動される転写レベルである。
【図22】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。図Ａは配列において配列セグメントを削除した結果、即ち、Ｒｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの切断ベクターの概略図であり、図ＢはＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３においてＲｙｒ２プロモータにより駆動される転写レベルである。
【図23】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。図ＡはＲｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの２つの切断ベクター及びノックアウト戦略の概略図であり、図ＢはＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３細胞における異なる切断ベクター又はＦｏｘＰ３結合配列を発現させたＲｙｒ２プロモータにより駆動される転写レベルであり、Ｎ．Ｓ．は、統計学的有意差無しである。
【図24】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。カルシウムイオンを含まないＨＢＳＳにおいて、４－ＣｍＣはＦｏｘＰ３過剰発現Ａ２０又は３Ｔ３細胞を刺激し、カルシウムイオンが経時的に変化する平均軌跡（Ｎ＝３）であり、独立の実験ごとに、１回の測定は少なくとも３０個の細胞を解析用に集める。
【図25】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図ＡはＷＴ及びＰＢＳ注射後のマウスの生存率であり、図Ｂは、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋（Ｆｏｘｐ３－）Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射したマウスのそれぞれの生存率である。
【図26】Ｒｙｒ２遺伝子においてＣｒｅは第７番エクソンをノックダウンする条件に依存してマウスをノックダウンして構築される。
【図27】Ｒｙｒ２＋／＋（Ｒｙｒ２未ノックアウト野生型）マウス、ＣＤ４－Ｃｒｅ／Ｒｙｒ２ｆｌ／＋マウス、及びＣＤ４－Ｃｒｅ／Ｒｙｒ２－／－マウスの脾臓及び胸腺におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の分布のフローサイトメトリー検出である。
【図28】マウスのＦｏｘＰ３＋／ＣＤ４＋脾臓細胞の割合である。
【図29】ＷＴＴｃｏｎｖ（Ｒｙｒ２＋／＋）、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ中のＴｒｅｇ機能関連表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３９、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３を含む）のフローサイトメトリー分析、及び２４ｈ抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激後、上清中のＩＬ－１０及びＴＧＦ－βレベルのＥＬＩＳＡ検出である。
【図30】Ｒｙｒ２ノックダウンＴ細胞がインビトロで細胞接触による抑制機能を有する。ＷＴ（図Ａ）又はＣＤ４－Ｃｒｅ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ（Ｒｙｒ２－／－）（図Ｂ）マウスから単離されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇを比較し（図Ｃ）、２ｍＭ Ｃａ２＋のＨＢＳＳにおいてカルシウムイオンの振動レベル及びその標準偏差を検出する（図Ｄ）。
【図31】ＣＭＡＣ基質分解によりＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞中のカルパイン活性を検出する。
【図32】Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの３種類の細胞におけるインビボ基質Ｔａｌｉｎの分解結果をウェスタンブロットによって示す。
【図33】Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖがインビトロで細胞接触による抑制機能を有する。４つの個別のＤＣ－Ｔ細胞対由来の全てのデータ点（図Ａ、図Ｂにおける点）を各条件で同じ日に収集し、図Ｃの棒グラフの生成に用いられ、Ｔ－ＤＣ対ごとに、少なくとも１５個の接着力の読み取り値が収集され、具体的には、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ（図Ａ）及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞（図Ｂ）対ＤＣ２．４の接着力、及び平均接着力（図Ｃ）である。
【図34】ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞とＯＶＡを提示したＤＣ２．４細胞との間の接着の実験であり、ＤＣ上の抑制細胞はＴｒｅｇ、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞であり、図Ａは３つの細胞のＡＦＭ測定装置を示し、図ＢはＴｒｅｇ、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの抑制細胞としての平均ＯＴ－ＩＩ－ＤＣ接着力である。
【図35】無Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの相対抑制効率であり、このうち、無Ｔｒｅｇは０％、Ｔｒｅｇは１００％とする。
【図36】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、図は細胞養子移入後の足底組織におけるＨＳＶ－１力価の解析であり、ＨＳＶ－１、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖは、それぞれＰＢＳ、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを養子移入したものである。
【図37】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、図は細胞養子移入と紫外線不活化によるＨＳＶ－１抗原再攻撃後の遅発型過敏症（ＤＴＨ）であり、抗原再攻撃を行わなかった足底の厚さは１００％とした。
【図38】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、上図はＤＴＨ解析における試験案であり、下図は代表的な足底腫脹である。
【図39】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス喘息モデルの免疫抑制を誘導し、図ＡはＢＡＬＦの総浸潤であり、図Ｂはリンパ細胞浸潤であり、図Ｃは好酸球浸潤である。測定結果としての数値は全て３回の試験の平均値であり、空白は空白対照群を表し、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、それぞれ、喘息モデルにＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを等量で注射したものである。
【図40】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス喘息モデルの免疫抑制を誘導し、図Ａは喘息モデルの感受性手段であり、図Ｂは代表的な肺Ｈ＆Ｅ組織切片であり、縮尺は２００μｍを表し、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、それぞれ、喘息モデルにＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを等量で注射したものである。
【図41】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸炎（ＩＢＤ）モデルの免疫抑制を誘導し、空白は空白対照群、ＤＳＳは水処理を表す。
【図42】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸炎（ＩＢＤ）モデルの免疫抑制を誘導し、図ＡはＤＳＳ誘導結腸炎モデルの誘導方法であり、図Ｂは代表的な結腸画像であり、図Ｃは結腸切片の顕微鏡写真であり、縮尺は２００μｍを表す。
【図43】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸癌モデルの免疫抑制を誘導し、各群のマウスの腫瘍体積成長曲線をそれぞれ測定する。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖである。
【図44】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図はマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線であり、図ＡはＷＴ及びＰＢＳ注射後のマウスの生存率であり、図Ｂは、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋（Ｆｏｘｐ３－）Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖをそれぞれ注射したマウスの生存率である。
【図45】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図ＡはＳｃｕｒｆｙマウスの身体症状及び治療であり、図Ｂは各器官（胸腺、脾臓、肺、耳、肝、膵臓、小腸、結腸）の代表的なＨ＆Ｅ染色であり、ＰＢＳ注射モデルマウス、ＷＴマウスは、３週目にサンプルを採取し、Ｔｒｅｇ細胞、Ｆｏｘｐ３－（Ｒｙｒ２＋／＋） Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを養子移入したマウスは８～１２週目に採取する。
【図46】Ｆｏｘｐ３を過剰発現させＲｙｒ２を抑制することはＴ細胞の免疫抑制作用の重要な効果機序であり、左図はＦｏｘｐ３を過剰発現させＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の作用機序であり、右図は野生型Ｔ細胞の作用機序である。
【発明を実施するための形態】
【0091】
以下、本発明の実施例の図面を参照して、本発明の実施例の技術的解決手段を明確かつ完全に説明するが、説明する実施例は本発明の実施例の一部に過ぎず、全部の実施例ではないことは明らかである。当業者が本発明の実施例に基づいて創造的な努力を必要とせずに得る他の全ての実施例は本発明の特許範囲に属する。
【0092】
実施例に使用される試験動物、試薬及び装置の由来
マウス
マウスは全てＣ５７ＢＬ／６背景である。Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌマウス及びＣＡＧ－ＬＳＬ－Ｒｙｒ２－ｆｌａｇトランスジェニックマウスはＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄによって生産されたものであり、遺伝子型同定された。ＯＴ－ＩＩトランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎ実験室から購入する。野生型、Ｆｏｘｐ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ、Ｒｙｒ２トランスジェニック、ＯＴ－ＩＩトランスジェニック、ＣＤ４－Ｃｒｅ及びＦｏｘｐ３－Ｃｒｅ－ＹＦＰ、雌Ｆｏｘｐ３ ＋／－マウスは清華大学動物センタで飼育される。マウスは全て特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下で飼育する。全ての動物実験は動物福祉ガイドラインに合致し、清華大学動物実験倫理委員会ＩＡＣＵＣにより承認された。
マウス
マウスは全てＣ５７ＢＬ／６背景である。Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌマウス及びＣＡＧ－ＬＳＬ－Ｒｙｒ２－ｆｌａｇトランスジェニックマウスはＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄによって生産されたものであり、遺伝子型同定された。ＯＴ－ＩＩトランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎ実験室から購入する。野生型、Ｆｏｘｐ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ、Ｒｙｒ２トランスジェニック、ＯＴ－ＩＩトランスジェニック、ＣＤ４－Ｃｒｅ及びＦｏｘｐ３－Ｃｒｅ－ＹＦＰ、雌Ｆｏｘｐ３ ＋／－マウスは清華大学動物センタで飼育される。マウスは全て特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下で飼育する。全ての動物実験は動物福祉ガイドラインに合致し、清華大学動物実験倫理委員会ＩＡＣＵＣにより承認された。
【0093】
細胞株及び初代細胞の培養
ＤＣ２．４細胞はＫｅｎ Ｒｏｃｋ ＵＭａｓｓ医学院から贈られた。Ｖｅｒｏ細胞は清華大学薬学院の譚旭博士より提供された。Ｒｅｎｃａ細胞は北京朝陽病院の安広宇医師より提供された。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は清華大学医学院の郭偉博士から贈られた。ＭＣ３８細胞は米国典型培養物保蔵センタ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＣ３８、Ｒｅｎｃａ、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞及びＶｅｒｏ細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭにて培養される。他の細胞は全て、５０μＭβ－メルカプトエタノールを含む同量のＲＰＭＩ－１６４０にて成長する。ＰＣＲ解析により全ての細胞株に対してマイコプラズマ汚染がテストされる。マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖは、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９８５２）及びマウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ細胞陽性選択キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１８７８２）を用いて脾臓から単離される。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞は、場合によっては、ＦＡＣＳによってＦｏｘｐ３－ＩＥＲＳ－ＧＦＰマウスＣＤ４＋脾臓細胞から選別される。マウスＤＣはマウスＣＤ１１ｃ選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、２８００７）を用いて脾臓から単離される。ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞は、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１９８５２）を用いてＯＴ－ＩＩ脾臓細胞から単離され、場合によっては、ＦＡＣＳによりＴＣＲＶα２抗体を用いて選別される。
ＤＣ２．４細胞はＫｅｎ Ｒｏｃｋ ＵＭａｓｓ医学院から贈られた。Ｖｅｒｏ細胞は清華大学薬学院の譚旭博士より提供された。Ｒｅｎｃａ細胞は北京朝陽病院の安広宇医師より提供された。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は清華大学医学院の郭偉博士から贈られた。ＭＣ３８細胞は米国典型培養物保蔵センタ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＣ３８、Ｒｅｎｃａ、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞及びＶｅｒｏ細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭにて培養される。他の細胞は全て、５０μＭβ－メルカプトエタノールを含む同量のＲＰＭＩ－１６４０にて成長する。ＰＣＲ解析により全ての細胞株に対してマイコプラズマ汚染がテストされる。マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖは、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９８５２）及びマウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ細胞陽性選択キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１８７８２）を用いて脾臓から単離される。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞は、場合によっては、ＦＡＣＳによってＦｏｘｐ３－ＩＥＲＳ－ＧＦＰマウスＣＤ４＋脾臓細胞から選別される。マウスＤＣはマウスＣＤ１１ｃ選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、２８００７）を用いて脾臓から単離される。ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞は、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１９８５２）を用いてＯＴ－ＩＩ脾臓細胞から単離され、場合によっては、ＦＡＣＳによりＴＣＲＶα２抗体を用いて選別される。
【0094】
抗体及び試薬
全ての初代細胞単離キットはＳｔｅｍＣｅｌｌからのものである。組換えヒトＩＬ－２はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのものである。抗マウスＣＤ３ｅモノクローナル抗体、抗マウスＣＤ２８及び抗マウスＴＣＲＶα２－ＰＥ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものである。フローサイトメトリー抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものであり、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗Ｔｉｍ－３及び抗ＬＡＧ３抗体を含む。抗ＦｏｘＰ３抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものである。抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ８、抗マウスＧＩＴＲ、抗マウスＣＤ２５、抗マウスＰＤ－１、抗マウス／ラットＣＴＬＡ－４、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗マウス／ヒトＴｉｍ－３、抗マウスＬＡＧ３、抗マウスＰＤ－１（Ｊ４３．１）、抗マウスＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、抗マウスＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）のクローンが使用される。ウェスタンブロット解析に用いられる抗体はｍ－カルパイン大サブユニット（Ｍ型）抗体と抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを連結した抗体はＣＳＴからのものである。抗ｔａｌｉｎ抗体（８Ｄ４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入された。
全ての初代細胞単離キットはＳｔｅｍＣｅｌｌからのものである。組換えヒトＩＬ－２はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのものである。抗マウスＣＤ３ｅモノクローナル抗体、抗マウスＣＤ２８及び抗マウスＴＣＲＶα２－ＰＥ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものである。フローサイトメトリー抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものであり、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗Ｔｉｍ－３及び抗ＬＡＧ３抗体を含む。抗ＦｏｘＰ３抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものである。抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ８、抗マウスＧＩＴＲ、抗マウスＣＤ２５、抗マウスＰＤ－１、抗マウス／ラットＣＴＬＡ－４、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗マウス／ヒトＴｉｍ－３、抗マウスＬＡＧ３、抗マウスＰＤ－１（Ｊ４３．１）、抗マウスＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、抗マウスＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）のクローンが使用される。ウェスタンブロット解析に用いられる抗体はｍ－カルパイン大サブユニット（Ｍ型）抗体と抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを連結した抗体はＣＳＴからのものである。抗ｔａｌｉｎ抗体（８Ｄ４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入された。
【0095】
清華大学生物医学解析センタのｓｈＲＮＡライブラリプラットフォームから購入されたｐＬＫＯ．１ベクターは全ての遺伝子ノックダウン実験に用いられる。予め設計された全てのｓｈＲＮＡ配列はＲｕｉｂｏｘｉｎｇｋｅ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成される。
【0096】
ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙベクターは清華大学医学院の沈暁華博士から贈られた。
【0097】
実施例１：Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン又はＦｏｘＰ３過剰発現Ｔ細胞の調製
１、Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン試験のステップ
レンチウイルスによるｓｈＲＮＡをＲｙｒ２遺伝子ノックダウンに用い、具体的には、予め合成されたｓｈＲＮＡ配列をｐＬＫＯ．１ベクターに挿入した。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＭｉｄｉキット（ＣＷＢＩＯ、ＣＷ２１０５Ｓ）を用いて、形質転換大腸菌からｓｈＲＮＡを含むプラスミド及びパッケージング構築体（ｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２）を精製した。製造元による取扱書に従ってレンチウイルスパッケージングを行った。簡単に言えば、皿の６０～８０％が覆われるまで、２９３ＦＴ細胞を１０ｃｍ皿で培養した。ＤＮＡトランスフェクション２時間前に培地を交換した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（Ｎｅｏｆｅｃｔ）を用いて、パッケージングベクターｐＭＤ２．Ｇ ２．５μｇとｐｓＰＡＸ２ ２．５μｇ、ｐＬＫＯ．１ベクター５μｇ（挿入されたｓｈＲＮＡ付き）を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、レンチウイルスを得て、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（終濃度８μｇ／ｍＬ）でＴ細胞を感染した。ウイルス感染４８時間後、Ａｒｉａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を選別した。リアルタイム定量ＰＣＲによりノックダウン効率を検証した。ｓｈＲＮＡ配列は以下に示される。
１、Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン試験のステップ
レンチウイルスによるｓｈＲＮＡをＲｙｒ２遺伝子ノックダウンに用い、具体的には、予め合成されたｓｈＲＮＡ配列をｐＬＫＯ．１ベクターに挿入した。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＭｉｄｉキット（ＣＷＢＩＯ、ＣＷ２１０５Ｓ）を用いて、形質転換大腸菌からｓｈＲＮＡを含むプラスミド及びパッケージング構築体（ｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２）を精製した。製造元による取扱書に従ってレンチウイルスパッケージングを行った。簡単に言えば、皿の６０～８０％が覆われるまで、２９３ＦＴ細胞を１０ｃｍ皿で培養した。ＤＮＡトランスフェクション２時間前に培地を交換した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（Ｎｅｏｆｅｃｔ）を用いて、パッケージングベクターｐＭＤ２．Ｇ ２．５μｇとｐｓＰＡＸ２ ２．５μｇ、ｐＬＫＯ．１ベクター５μｇ（挿入されたｓｈＲＮＡ付き）を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、レンチウイルスを得て、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（終濃度８μｇ／ｍＬ）でＴ細胞を感染した。ウイルス感染４８時間後、Ａｒｉａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を選別した。リアルタイム定量ＰＣＲによりノックダウン効率を検証した。ｓｈＲＮＡ配列は以下に示される。
【0098】
対照-shRNA:5'-CCGGcaacaagatgaagagcaccaaCTCGAGttggtgctcttcatcttgttgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:3)と5’-AATTCAAAAAcaacaagatgaagagcaccaaCTCGAGttggtgctcttcatcttgttgg-3’(SEQ ID NO:4);Ryr2-shRNA:5'-CCGGccgctaatgaagccatataaaCTCGAGTTTATATGGCTTCATTAGCGGTTTTTG-3'(SEQ ID NO:5)と5’-AATTCAAAAAccgctaatgaagccatataaaCTCGAGTTTATATGGCTTCATTAGCGG-3’(SEQ ID NO:6);Itpr1-shRNA:5'-CCGGgcagtaggtaagaagttattaCTCGAGtaataacttcttacctactgcTTTTTG-3'(SEQ ID NO:7)と5'-AATTCAAAAAgcagtaggtaagaagttattaCTCGAGtaataacttcttacctactgc-3'(SEQ ID NO:8);
Orai1-shRNA:5'-CCGGcacaaccaccaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:9)と'-AATTCAAAAAcacaacctcaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtg-3'(SEQ ID NO:10);Orai3-shRNA:5'-CCGGgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggcTTTTTTGG-3'(SEQ ID NO:11)と5'-AATTCAAAAAAgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggc-3'(SEQ ID NO:12); Trpm1-shRNA:5'-CCGGcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:13)と5'-AATTCAAAAAcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccg-3'(SEQ ID NO:14);Trpm4-shRNA:5'-CCGGgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtggttTTTG-3'(SEQ ID NO:15)と5'-AATTCAAAAAgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtgc-3'(SEQ ID NO:16);Trpv2-shRNA:5'-CCGGccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaagttccttggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:17)と5'-AATTCAAAAAccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaaagagctccttgg-3'(SEQ ID NO:18);Cacnb1-shRNA:5'-CCGGtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatatccattgcgttcctaTTTTTG-3'(SEQ ID NO:19)と5'-AATTCAAAAAtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatattccattgcgttccta-3'(SEQ ID NO:20)。
Orai1-shRNA:5'-CCGGcacaaccaccaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:9)と'-AATTCAAAAAcacaacctcaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtg-3'(SEQ ID NO:10);Orai3-shRNA:5'-CCGGgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggcTTTTTTGG-3'(SEQ ID NO:11)と5'-AATTCAAAAAAgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggc-3'(SEQ ID NO:12); Trpm1-shRNA:5'-CCGGcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:13)と5'-AATTCAAAAAcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccg-3'(SEQ ID NO:14);Trpm4-shRNA:5'-CCGGgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtggttTTTG-3'(SEQ ID NO:15)と5'-AATTCAAAAAgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtgc-3'(SEQ ID NO:16);Trpv2-shRNA:5'-CCGGccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaagttccttggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:17)と5'-AATTCAAAAAccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaaagagctccttgg-3'(SEQ ID NO:18);Cacnb1-shRNA:5'-CCGGtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatatccattgcgttcctaTTTTTG-3'(SEQ ID NO:19)と5'-AATTCAAAAAtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatattccattgcgttccta-3'(SEQ ID NO:20)。
【0099】
２、ノックダウン効率はリアルタイム定量ＰＣＲにより検証された。具体的なステップは以下に示される。
【0100】
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、係る細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素Ｍ－ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏ Ｒｏｘ）（Ｙｅａｓｅｎ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ ＲＮＡを標準化対照に用いた。プライマー配列は以下に示される。
【0101】
マウスGAPDH、5'-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3'(SEQ ID NO:21)と5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’(SEQ ID NO:22);マウス18S RNA、5'-CGGACAGGATTGACAGATTG-3'(SEQ ID NO:23)と5’-CGGACAGGATTGACAGATTG-3’(SEQ ID NO:24);マウスRyr2、5’-ATGGCTTTAAGGCACAGCG-3’(SEQ ID NO:25)と5’-CAGAGCCCGAATCATCCAGC-3’(SEQ ID NO:26);マウスFoxP3、5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3'(SEQ ID NO:27)と5'-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3'(SEQ ID NO:28);マウスｍ－カルハイン、5'-3'と5'-3';マウスItpr1、5'-CGTTTTGAGTTTGAAGGCGTTT-3'(SEQ ID NO:29)と5'-CATCTTGCGCCAATTCCCG-3'(SEQ ID NO:30);マウスOrai1、5'-GATCGGCCAGAGTTACTCCG-3'(SEQ ID NO:31)と5'-TGGGTAGTCATGGTCTGTGTC-3'(SEQ ID NO:32);マウスOrai3、5’-GGCTACCTGGACCTTATGGG-3'(SEQ ID NO:33)と5'-GCAGGCACTAAATGTGACC-3'(SEQ ID NO:34);マウスTrpm1、5'-ATCCGAGTCTCCTACGACACC-3'(SEQ ID NO:35)と5'-CAGTTTGGACTGCATCTCGAA-3’(SEQ ID NO:36);マウスTrpm4、5'-GGACTGCACACAGGCATTG-3'(SEQ ID NO:37)と5'-GTACCTTGCGGGGAATGAGC-3’(SEQ ID NO:38);マウスTrpv2、5'-TGCTGAGGTGAACAAAGGAAAG-3'(SEQ ID NO:39)と5'-TCAAACCGATTTGGGTCCTGT-3'(SEQ ID NO:40);マウスCacnb1、5′-GGCAGCAAGTTATCTCCCAG-3'(SEQ ID NO:41)と5'-CCACAGGATGATTGGCGTCTT-3'(SEQ ID NO:42); HSV-1 gB、5’-AACGCGACGCACATCAAG-3'(SEQ ID NO:43)と5'-CTGGTACGCGATCAGAAAGC-3'(SEQ ID NO:44); HSV-1 LAT、5'-GGGTGGGCTCGTGTTACAG-3'(SEQ ID NO:45)と5'-GGACGGGTAAGTAACAGAGTCTCTA-3’(SEQ ID NO:46)。
【0102】
３、ＦｏｘＰ３過剰発現試験のステップ
ベクターを構築し、Ｔｒｅｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマー５’－ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）と逆方向プライマー５’－ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）のプライマーを用いて、ＦｏｘＰ３をＰＣＲ増幅した。増幅した断片をゲルで精製し、消化（ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ）し、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙプラスミドにクローニングし、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙ構築体を得た。上記ノックダウン方法に従って、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙを持つ細胞株とＦｏｘＰ３－過剰発現細胞株で生成されるレンチウイルスを産生した。ＲＴ－ＰＣＲによりＦｏｘＰ３発現を検証した。
ベクターを構築し、Ｔｒｅｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマー５’－ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）と逆方向プライマー５’－ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）のプライマーを用いて、ＦｏｘＰ３をＰＣＲ増幅した。増幅した断片をゲルで精製し、消化（ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ）し、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙプラスミドにクローニングし、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙ構築体を得た。上記ノックダウン方法に従って、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙを持つ細胞株とＦｏｘＰ３－過剰発現細胞株で生成されるレンチウイルスを産生した。ＲＴ－ＰＣＲによりＦｏｘＰ３発現を検証した。
【0103】
４、フローサイトメトリー法検出のステップ
細胞とＦｃブロッカー（ＣＤ１６／３２抗体；２．４Ｇ２）を５分間インキュベートした後、表面抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３）とともに室温で遮光下１５分間放置した。ＦｏｘＰ３細胞を染色し、表面が染色された細胞をＦｏｘＰ３／転写因子固定／透過緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに３０分間インキュベートし、次に、抗体とともに２時間インキュベートした。染色した細胞を直接解析するか、又はたまにＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定化してから解析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによってデータを解析した。
細胞とＦｃブロッカー（ＣＤ１６／３２抗体；２．４Ｇ２）を５分間インキュベートした後、表面抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３）とともに室温で遮光下１５分間放置した。ＦｏｘＰ３細胞を染色し、表面が染色された細胞をＦｏｘＰ３／転写因子固定／透過緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに３０分間インキュベートし、次に、抗体とともに２時間インキュベートした。染色した細胞を直接解析するか、又はたまにＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定化してから解析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによってデータを解析した。
【0104】
５、ＥＬＩＳＡ検出ステップ
ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βを検出するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で１０６個の精製Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを刺激した。７２時間後、上清を収集した。結合力の高い９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩放置し、抗マウスＩＬ－１０及び抗マウスＴＧＦ－β捕捉抗体を塗布した。乾燥後、プレートをＰＢＳ中の２％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックした。洗浄後、３部分に分けられるウェルに希釈細胞上清を１００μＬ加え、その後、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中）で洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩＬ－１０及びＴＧＦ－β検出抗体とともに室温で０．５時間インキュベートした。ＴＭＢ（１００ｍＬ／ウェル）を加えて、プレートを暗所で１０分間室温でインキュベートし、その後、ウェルあたりＨ２ＳＯ４（５０μＬ、１Ｍ）を加えて反応を停止した。停止直後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、４５０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取った。
ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βを検出するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で１０６個の精製Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを刺激した。７２時間後、上清を収集した。結合力の高い９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩放置し、抗マウスＩＬ－１０及び抗マウスＴＧＦ－β捕捉抗体を塗布した。乾燥後、プレートをＰＢＳ中の２％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックした。洗浄後、３部分に分けられるウェルに希釈細胞上清を１００μＬ加え、その後、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中）で洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩＬ－１０及びＴＧＦ－β検出抗体とともに室温で０．５時間インキュベートした。ＴＭＢ（１００ｍＬ／ウェル）を加えて、プレートを暗所で１０分間室温でインキュベートし、その後、ウェルあたりＨ２ＳＯ４（５０μＬ、１Ｍ）を加えて反応を停止した。停止直後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、４５０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取った。
【0105】
６、カルシウムイメージング
非接着細胞について、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖとＡ２０細胞をＨＢＳＳ－ＨＥＰＳ（１０ ｍＭ）緩衝液中の２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。洗浄後、室温でサンドイッチのような自作室に取り付けられたポリ－Ｌ－リジンコーティング（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）付き円形ガラス板に細胞を接着させた。１５分間後、緩衝液で余分な非接着細胞を流し落とした。接着細胞について、ガラス板に接着したＮＩＨ－３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞をＨＢＳＳ－ＨＥＰＳ（１０ｍＭ）緩衝液中の２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。その後、２０倍（開口数：０．８）又は４０倍（開口数：１．２）Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－７３顕微鏡に測定室を載せた。特に断らない限り、６ｓの間隔でＣａ２＋振動を２０分間記録した。抑制実験においては、Ｆｌｕｏ－４標識細胞を暗所でＪＴＶ５１９（Ｓｉｇｍａ）により３０分間室温処理し、その後、画像を取得した。刺激性実験では、１ｓの間隔でＣａ２＋振動を５分間記録した。画像を取得し始め、５０～８０ｓ後、４－ＣｍＣ（Ｓｉｇｍａ）緩衝液を加えて細胞内カルシウムの放出を誘導した。Ｃａ２＋含有又は不含のフェノールレッドフリーＨＢＳＳ培地で実験を行った。電荷結合素子カメラ（ＯＲＣＡ－ＡＧ、浜松社製）を用いて４８８ｎｍレーザにより励起された４６８～５５０ｎｍの放射シグナルを記録した。データ収集はＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ３．０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により制御された。ＩｍａｇｅＪを用いて単一細胞の平均蛍光強度の経時的変化を記録し、１フレーム目の蛍光強度に従って標準化した（Ｆｌｕｏ－４ Ｆ ／ Ｆ０）。単一細胞のＣａ２＋振動ピーク値を表示し、Ｃａ２＋振動強度の標準偏差をＭｅａｎ±ＳＤとして算出した。
非接着細胞について、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖとＡ２０細胞をＨＢＳＳ－ＨＥＰＳ（１０ ｍＭ）緩衝液中の２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。洗浄後、室温でサンドイッチのような自作室に取り付けられたポリ－Ｌ－リジンコーティング（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）付き円形ガラス板に細胞を接着させた。１５分間後、緩衝液で余分な非接着細胞を流し落とした。接着細胞について、ガラス板に接着したＮＩＨ－３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞をＨＢＳＳ－ＨＥＰＳ（１０ｍＭ）緩衝液中の２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。その後、２０倍（開口数：０．８）又は４０倍（開口数：１．２）Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－７３顕微鏡に測定室を載せた。特に断らない限り、６ｓの間隔でＣａ２＋振動を２０分間記録した。抑制実験においては、Ｆｌｕｏ－４標識細胞を暗所でＪＴＶ５１９（Ｓｉｇｍａ）により３０分間室温処理し、その後、画像を取得した。刺激性実験では、１ｓの間隔でＣａ２＋振動を５分間記録した。画像を取得し始め、５０～８０ｓ後、４－ＣｍＣ（Ｓｉｇｍａ）緩衝液を加えて細胞内カルシウムの放出を誘導した。Ｃａ２＋含有又は不含のフェノールレッドフリーＨＢＳＳ培地で実験を行った。電荷結合素子カメラ（ＯＲＣＡ－ＡＧ、浜松社製）を用いて４８８ｎｍレーザにより励起された４６８～５５０ｎｍの放射シグナルを記録した。データ収集はＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ３．０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により制御された。ＩｍａｇｅＪを用いて単一細胞の平均蛍光強度の経時的変化を記録し、１フレーム目の蛍光強度に従って標準化した（Ｆｌｕｏ－４ Ｆ ／ Ｆ０）。単一細胞のＣａ２＋振動ピーク値を表示し、Ｃａ２＋振動強度の標準偏差をＭｅａｎ±ＳＤとして算出した。
【0106】
７、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）測定ステップ
細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１３Ｂ）で溶解した。細胞溶解液を遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１２）を用いて総タンパク質を定量した。３ＸＳＤＳ注入緩衝液と混合して５分間沸騰した後、７．５％ＰＡＧＥゲル（ＥｐｉＺｙｍｅ，ＰＧ１１１）にタンパク質を注入した。次に、タンパク質をＮＣ膜に転写し、示した１次抗体と２次抗体を用いてイムノブロットを行った。最後に、Ｓｕｐｅｒ ＥＣＬ検出試薬（Ｙｅａｓｅｎ，３６２０８ＥＳ７６）を用いて免疫染色のバンドを検出した。
細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１３Ｂ）で溶解した。細胞溶解液を遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１２）を用いて総タンパク質を定量した。３ＸＳＤＳ注入緩衝液と混合して５分間沸騰した後、７．５％ＰＡＧＥゲル（ＥｐｉＺｙｍｅ，ＰＧ１１１）にタンパク質を注入した。次に、タンパク質をＮＣ膜に転写し、示した１次抗体と２次抗体を用いてイムノブロットを行った。最後に、Ｓｕｐｅｒ ＥＣＬ検出試薬（Ｙｅａｓｅｎ，３６２０８ＥＳ７６）を用いて免疫染色のバンドを検出した。
【0107】
８、試験結果
ＣＤ４－ｃｒｅのＴｃｏｎｖでは、Ｒｙｒ２をノックダウンすることができる（図２６）。また、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞は、マウスの体重や発育速度を含め、その基礎機能が影響を受けなかった。さらに、胸腺細胞と末梢血のＣＤ４＋、ＣＤ８＋マーカーの分布はＷＴマウスとほぼ同じであった（フローサイトメトリー検出結果は図２７参照）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合も一定に維持された（図２８）。Ｔｒｅｇ機能に関連する可能性のある表面マーカーも、ＷＴ Ｔｃｏｎｖと比較して変化しなかった（フローサイトメトリー検出及びＥＬＩＳＡ検出の結果は図２９を参照）。Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖは基礎Ｃａ２＋レベルが低下し、振動強度が低下している（カルシウムイメージング結果は図３０を参照）。Ｒｙｒ２－／－ＴｃｏｎｖにおけるＣＭＡＣ消化は、未処理Ｔｃｏｎｖと比較して、Ｔｒｅｇと同様のレベルまで低減されている（図３１）。Ｔｒｅｇと同様に、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖでは、ｔａｌｉｎ消化が大量に欠損している（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果は図３２を参照）。
ＣＤ４－ｃｒｅのＴｃｏｎｖでは、Ｒｙｒ２をノックダウンすることができる（図２６）。また、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞は、マウスの体重や発育速度を含め、その基礎機能が影響を受けなかった。さらに、胸腺細胞と末梢血のＣＤ４＋、ＣＤ８＋マーカーの分布はＷＴマウスとほぼ同じであった（フローサイトメトリー検出結果は図２７参照）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合も一定に維持された（図２８）。Ｔｒｅｇ機能に関連する可能性のある表面マーカーも、ＷＴ Ｔｃｏｎｖと比較して変化しなかった（フローサイトメトリー検出及びＥＬＩＳＡ検出の結果は図２９を参照）。Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖは基礎Ｃａ２＋レベルが低下し、振動強度が低下している（カルシウムイメージング結果は図３０を参照）。Ｒｙｒ２－／－ＴｃｏｎｖにおけるＣＭＡＣ消化は、未処理Ｔｃｏｎｖと比較して、Ｔｒｅｇと同様のレベルまで低減されている（図３１）。Ｔｒｅｇと同様に、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖでは、ｔａｌｉｎ消化が大量に欠損している（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果は図３２を参照）。
【0108】
実施例２：ＦｏｘＰ３発現によるＲｙｒ２遺伝子への影響の検証及び標的位置の決定
本実施例では、Ｒｙｒ２遺伝子調節の特異性を決定するために、Ｒｙｒ２遺伝子調節をＦｏｘＰ３発現と関連させ、標的位置を決定した。
本実施例では、Ｒｙｒ２遺伝子調節の特異性を決定するために、Ｒｙｒ２遺伝子調節をＦｏｘＰ３発現と関連させ、標的位置を決定した。
【0109】
まず、Ｔ細胞、Ｂ細胞（Ａ２０）、３Ｔ３及びＲｅｎｃａ腫瘍系のいずれにもＦｏｘＰ３が過剰発現された（実施例１の方法を採用）。これら４つのケースでは、ＦｏｘＰ３の過剰発現がＲｙｒ２遺伝子の転写を有意にブロックしており、ＦｏｘＰ３が自発的にＲｙｒ２を標的としていることが示唆された（図１９）。
【0110】
次に、遺伝子発現分析用の全ゲノムＣｈｉｐ－ｓｅｑデータセットを作成し、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータはＧＥＯデータセットからダウンロードし、ＧＥＯ ＩＤはＴｃｏｎｖ ＧＳＭ９８９０３６中のＦｏｘｐ３であり、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＦｏｘＰ３は発現マーカー－Ｆｏｘｐ３ ＧＳＭ９８９０３４として形質導入された。ＩＧＶ（ｖ２．４．１４）はマウス参照ゲノムｍｍ８を用いてＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの可視化を促進した。特定の遺伝子座でのスクリーンショットに示す通りである。ＩＧＶプログラムを使用してこのデータセットをＲｙｒ２遺伝子の周囲の４０ｋｂ領域に集中させると、トランスフェクションされていない対照群で１．５ｋｂプロモータ領域の強いシグナルが検出された（図２０）。
【0111】
さらに、ＦｏｘＰ３過剰発現群とＦｏｘＰ３未過剰発現群を含め、上記領域をクローニングし、このプロモータの制御下で、３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞を発現するためのルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現ベクターを構築した。図２１より、ＦｏｘＰ３の過剰発現がルシフェラーゼ活性を低下させていることが分かった。その後、配列において配列セグメントを削除した（図２２Ａ参照）。一連の実験では、Ｒｙｒ２開始コドン（図２２Ｂ）より前の２００ｂｐになるように、ＴＳＳ部位の後～３００ｂｐ～５００ｂｐの所定領域まで抑制活性を段階的に縮小した。
【0112】
最後に、ＦｏｘＰ３結合部位を２回繰り返し出現したＧＣＡＧＧＧＧ配列に決定した。これら２つの部位に突然変異が生じた場合、ＦｏｘＰ３の過剰発現はルシフェラーゼを抑制する能力を失い、これら２つの部位がプロモータのＦｏｘＰ３の結合部位であることが示された（図２３）。また、ルシフェラーゼ活性抑制がＲｙｒ２活性と関連していることをさらに確認するために、本実施例では、ＦｏｘＰ３過剰発現群とＦｏｘＰ３未過剰発現群を含め、Ｒｙｒ２媒介３Ｔ３及びＡ２０細胞のＣａ２＋流束がトリガーされた。図２４は、ＦｏｘＰ３トランスフェクション細胞においてＦｏｘＰ３の作用により４－ＣｍＣが駆動するＣａ２＋シグナルははるかに小さいことを示している。Ｒｙｒ２は確かにＦｏｘＰ３の直接制御を受け、Ｔ細胞の活性を抑制する重要なチャネルであることを示した。
【0113】
ここでは、本実施例に係るデュアルルシフェラーゼレポータアッセイのステップは文献Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3（Sethら，Cell 122，669-682，2005）とLFA-1-mediated adhesion is regulated by cytoskeletal restraint and by a Ca2+-dependent protease, calpain（Stewartら，J Cell Biol 140，699-707，1998）を参照する。Ｒｙｒ２プロモータ１５００ｂｐをルシフェラーゼ発現ｐＧＬ３ベクターにサブクローニングすることにより、マウスＲｙｒ２レポータプラスミドを構築した。完全なプロモータ配列と切断されたプロモータを合成し、配列決定によりプラスミドが正しいことを確認した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（ＫＳ２０００）を用いて、１．２５×１０５ ＦｏｘＰ３過剰発現－３Ｔ３、ＦｏｘＰ３過剰発現Ｒｅｎｃａ又はＦｏｘＰ３過剰発現Ａ２０細胞を３００ｎｇ Ｒｙｒ２レポータ遺伝子及び海腎ルシフェラーゼレポータ遺伝子プラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション３６時間後、細胞溶解物を調製し、デュアルルシフェラーゼレポータアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて解析した。
【0114】
実施例３：Ｔ細胞におけるＣａ２＋レベルに対するＲｙｒ２抑制の影響
１、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインの違い、及びＤＣ結合能力
Ｔｒｅｇにおけるｍ－カルパイン活性は低いので、本実施例では、その発現レベルが低いか否かを事前に判定した。また、ｍ－カルパインは細胞内のＣａ２＋の可用性により調整されるので、休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇのＣ２＋シグナルを検出した。
１、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインの違い、及びＤＣ結合能力
Ｔｒｅｇにおけるｍ－カルパイン活性は低いので、本実施例では、その発現レベルが低いか否かを事前に判定した。また、ｍ－カルパインは細胞内のＣａ２＋の可用性により調整されるので、休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇのＣ２＋シグナルを検出した。
【0115】
その結果、図１Ａ、Ｂ、Ｃに示すように、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインはタンパク質又はｍＲＮＡレベルのいずれにも違いがなかった。そして、基礎Ｃａ２＋振動はＴｃｏｎｖを含む多くの免疫細胞に共通の特徴であるが、この活性はＴｒｅｇにはほとんど存在しない。すなわち、個々のＴｒｅｇはＣａ２＋振動のピーク値を示さない（図２及び図３）。Ｃａ２＋振動強度の標準偏差は、Ｔｒｅｇでは、Ｔｃｏｎｖよりも有意に小さくなった（図４）。すなわち、ｍ－カルパイン活性はＴｒｅｇでブロックされ、これにより、ＴｒｅｇはＬＦＡ－１／ｉｃａｍ－１に基づく非常に強いＤＣ結合能力を有する。
【0116】
２、Ｃａ２＋レベルに影響する要素の決定
Ｔ細胞が活性化すると、Ｃａ２＋シグナルはＩＰ３Ｒチャネルに由来するが、これは免疫チロシンによるシグナルがカスケードして二次性Ｃａ２＋増幅イベントに拡大した結果であり、この活性化誘導シグナルは休止細胞には存在しない。本実施例では、データベースＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（参照文献：A mechanism for expansion of regulatory T-cell repertoire and its role in self-tolerance（Feng et al.，Nature，2015））に含まれるいくつかのＣａ２＋シグナル調節に影響する要素のデータ（具体的には図５に示される）を使用して、Ｔｒｅｇにおける基礎Ｃａ２＋レベルが低い理由を検証し、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの発現の違いの度合いによってランク付けした。その結果、図５に示すように、Ｒｙｒ２の違いが最も大きく、Ｔｃｏｎｖの発現レベルはＴｒｅｇより５倍ｌｏｇ２以上高く（３２倍線形）、ｐ値は２．５７×１０－１４であった。ｑＰＣＲを用いてさらに解析し、この結論を確認した（図６参照）。
Ｔ細胞が活性化すると、Ｃａ２＋シグナルはＩＰ３Ｒチャネルに由来するが、これは免疫チロシンによるシグナルがカスケードして二次性Ｃａ２＋増幅イベントに拡大した結果であり、この活性化誘導シグナルは休止細胞には存在しない。本実施例では、データベースＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（参照文献：A mechanism for expansion of regulatory T-cell repertoire and its role in self-tolerance（Feng et al.，Nature，2015））に含まれるいくつかのＣａ２＋シグナル調節に影響する要素のデータ（具体的には図５に示される）を使用して、Ｔｒｅｇにおける基礎Ｃａ２＋レベルが低い理由を検証し、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの発現の違いの度合いによってランク付けした。その結果、図５に示すように、Ｒｙｒ２の違いが最も大きく、Ｔｃｏｎｖの発現レベルはＴｒｅｇより５倍ｌｏｇ２以上高く（３２倍線形）、ｐ値は２．５７×１０－１４であった。ｑＰＣＲを用いてさらに解析し、この結論を確認した（図６参照）。
【0117】
ここで、ＧＥＯデータベース解析は以下の通りである。ＮＣＢＩ ＧＥＯデータベース（ＧＳＥ７１１６２）に発表されている３つのＲＮＡ－Ｓｅｑ研究に基づき、タンパク質を発現レベルによって分類した。カルシウム関連タンパク質をＧＯ解析によりランク付けした。これらのタンパク質の機能はＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）に基づいて注釈されている。タンパク質をＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの発現の違いの度合いによってランク付けした。
【0118】
Ｒｙｒ受容体はｅｒ膜（Ｒｙｒ１、２及び３）上に位置し、ヒトＰＢＭＣにおいて、Ｒｙｒ１はＣＤ１９＋集団で、Ｒｙｒ２はＣＤ３＋部分で発現する。ＴｒｅｇにおけるＲｙｒ２の発現量が低いことを確認するために、刺激因子４－ＣＭＣを用いてＣＭＡＣ（カルパイン基質）の消化率を観察した。その結果、図７に示すように、４－ＣＭＣはカルパイン活性を完全に誘導することができる一方、Ｔｒｅｇはこの処理に敏感ではなく、ＴｒｅｇではＲｙｒ２の発現が低下していることが確認された。
【0119】
３、Ｔｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２抑制によるＣａ２＋レベル及び基礎振動の低下
本実施例では、Ｒｙｒ２抑制後のＣａ２＋シグナルの変化をさらに検証し、その結果、図８、図９に示すように、ピーク値もＣａ２＋シグナルの標準偏差も、Ｒｙｒ２抑制Ｔｃｏｎｖ細胞では、Ｔｒｅｇの効果に近く、Ｒｙｒ２を抑制していないＴｃｏｎｖ細胞と比較して、カルシウムイオンレベルは有意に低下した。
本実施例では、Ｒｙｒ２抑制後のＣａ２＋シグナルの変化をさらに検証し、その結果、図８、図９に示すように、ピーク値もＣａ２＋シグナルの標準偏差も、Ｒｙｒ２抑制Ｔｃｏｎｖ細胞では、Ｔｒｅｇの効果に近く、Ｒｙｒ２を抑制していないＴｃｏｎｖ細胞と比較して、カルシウムイオンレベルは有意に低下した。
【0120】
以上より、Ｔ細胞亜群のＣａ２＋レベル低下は、基本的にＲｙｒ２の転写抑制により制御される。
【0121】
実施例４：Ｒｙｒ２ブロックによるＴ細胞とＤＣとの結合増強
１、Ｒｙｒ２をノックダウンしたＴｃｏｎｖによって、Ｃａ２＋レベルを低下させることができる。
１、Ｒｙｒ２をノックダウンしたＴｃｏｎｖによって、Ｃａ２＋レベルを低下させることができる。
【0122】
Ｒｙｒ２抑制がＴｃｏｎｖにおけるＣａ２＋レベル低下の原因であることを遺伝学的に確認するために、本実施例では、ｓｈＲＮＡ干渉によるＲｙｒ２ノックダウンを行った。Ｒｙｒ２特異的ｓｈＲＮＡノックダウンＲｙｒ２の転写ｍＲＮＡレベルとノックダウンされていないＲｙｒ２の転写ｍＲＮＡレベルとを比較した（図１０）。Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖでは、対照群に比べ、細胞基礎Ｃａ２＋レベルは著しく低下している（図１１及び図１２）。ノックダウン後、Ｃａ２＋ピーク値が低下し、Ｃａ２＋変化の標準偏差も低くなった。低ｍ－カルパイン基質消化処理の結果、例えばＪＴＶ５１９処理によるＲｙｒ２抑制と一致した（図１３）。
【0123】
ここで、カルパイン活性を測定した。カルパイン活性を測定するために、２０μＭカルパイン基質ＣＭＡＣ（ｔ－ＢＯＣ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む２００μＬの培地で、１０５個のＴ細胞を暗所で室温インキュベートした。５分間のインキュベーション後、１％ＰＦＡ（Ｂｉｏｓｈａｒｐ）で反応を停止し、細胞を直ちに氷上に置いた。ＦｏｒｔｅｃｈフローサイトメータによりＨｏｅｃｈｓｔブルーチャネルを介して消化した基質から発せられる蛍光シグナルをカルパイン活性とした。いずれの実験においても、阻害剤ＪＴＶ５１９を実験３０分前に添加し、同時に活性化剤４－ＣｍＣとＣＭＡＣを添加した。
【0124】
２、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２の欠損によるＴ細胞とＤＣとの結合への影響
Ｒｙｒ２の減少とｍ－カルパイン活性の喪失がＴ細胞とＤＣとの結合に及ぼす影響を検証するために、本実施例では、ｓｈＲＮＡ及びＪＴＶ５１９を用いて、ＴｃｏｎｖにおいてＲｙｒ２をブロックした。その結果、２種の処理のいずれもＴｒｅｇよりも高い強度で樹状細胞との強い接触を誘導することが示された（図１４）。
Ｒｙｒ２の減少とｍ－カルパイン活性の喪失がＴ細胞とＤＣとの結合に及ぼす影響を検証するために、本実施例では、ｓｈＲＮＡ及びＪＴＶ５１９を用いて、ＴｃｏｎｖにおいてＲｙｒ２をブロックした。その結果、２種の処理のいずれもＴｒｅｇよりも高い強度で樹状細胞との強い接触を誘導することが示された（図１４）。
【0125】
さらに、処理ＴｃｏｎｖとＤＣの結合向上により抗原特異的Ｔｃｏｎｖが同じＤＣと安定的に結合することを確認するために、三重細胞結合力解析を行った（参照文献：Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy（Chen et al.，The Journal of experimental medicine，2017））。その結果、Ｔｒｅｇ媒介ブロックにより、Ｒｙｒ２が低下したＴｃｏｎｖは、ＯＴＩＩとＯＶＡを担持したＤＣとの結合強度を有意に抑制することが示された（図１５）。したがって、単細胞レベルでは、Ｒｙｒ２活性が低下したＴｃｏｎｖは、ＴｃｏｎｖとＤＣとの相互作用を阻止する能力がＴｒｅｇ機能と同等であることが確認された。次に、典型的なＤＣ媒介抗原提示試験において、ｓｈＲＮＡ処理ＴｃｏｎｖのＯＴＩＩ活性化抑制能力をテストした。その結果、図１６に示すように、これらの細胞はＯＴＩＩの分裂減少においてはＴｒｅｇのような方式を示した。Ｒｙｒ２と同様に作用する可能性のある他の潜在的なＣａ２＋チャネル活動の調査では、ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞でのこれらの活性を低下させるｓｈＲＮＡが産生され、ＳＣＦＳにより、これらのｓｈＲＮＡとＤＣとの結合がテストされた。その結果、図１７、図１８に示すように、Ｒｙｒ２以外のノックダウンは処理Ｔ細胞とＤＣとの結合を向上させず、Ｒｙｒ２の特別な関与が確認された。
【0126】
ここで、インビトロ抑制機能がある。精製ＯＴＩＩ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）で染色した。脾臓細胞に由来する１０４個の精製ＤＣ、２×１０４個のＯＴＩＩ Ｔ細胞、２×１０－Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、及び２μＭ ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを混合して、９６ウェルＵ底プレートの各ウェルで培養し、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータを用いてＣＦＳＥ希釈によりＯＴＩＩ Ｔ細胞の増殖を評価した。（１－増殖％）から抑制パーセンテージを計算し、無Ｔｒｅｇ群を０％抑制、Ｔｒｅｇ群を１００％抑制とすることでデータの正規化を行った。
【0127】
３、フォーススペクトルによるＲｙｒ２欠損時のＤＣとの結合状況の確認
同様に、Ｒｙｒ２が欠損するとＤＣとの結合が増加することが、フォーススペクトルからも示された（図３３）。また、３細胞力解析では、ＤＣとＴ細胞との接触を干渉する能力も増強された（図３４）。さらに重要なこととして、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖは、抗原陽性樹状細胞刺激によるＯＴＩＩ増幅を抑制する能力がＴｒｅｇと類似している（図３５）。したがって、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２を制限するだけで、インビトロでＤＣ媒介性Ｔ細胞の活性化を抑制する能力を得ることができる。図４６はＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の免疫抑制作用を示している。
同様に、Ｒｙｒ２が欠損するとＤＣとの結合が増加することが、フォーススペクトルからも示された（図３３）。また、３細胞力解析では、ＤＣとＴ細胞との接触を干渉する能力も増強された（図３４）。さらに重要なこととして、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖは、抗原陽性樹状細胞刺激によるＯＴＩＩ増幅を抑制する能力がＴｒｅｇと類似している（図３５）。したがって、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２を制限するだけで、インビトロでＤＣ媒介性Ｔ細胞の活性化を抑制する能力を得ることができる。図４６はＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の免疫抑制作用を示している。
【0128】
ここで、原子間力顕微鏡による単細胞フォーススペクトルのステップは前述した通りであり、ＪＰＫ ＣｅｌｌＨｅｓｉｏｎ装置を用いて実験した（参照文献：Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity（Flachら，Nat Med 17，479-487，2011）と文献：Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy（Chenら，The Journal of experimental medicine，2017））。簡単に言えば、２細胞系におけるＴ－ＤＣ接着力を測定するために、ＤＣ２．４細胞を未処理ガラスディスクで培養した。Ｔ細胞を２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２で一晩処理した。ディスクをＡＦＭと互換性があるチャンバに移し、マシンテーブルに取り付けた。クリーンなカンチレバーをＣｅｌｌＴａｋ（ＢＤ）でコーティングし、ディスク上の個々のＴ細胞に貼り付けた。単一のＴ細胞を担持したＡＦＭカンチレバーを降下させ、単一のＤＣと接触させ、１５ｓ相互作用させた後、２つの細胞が完全に分離するまで上に移動させた。これにより、力曲線を取得した。その後、このプロセスを繰り返した。３細胞系では、実験前に、ガラスディスク上で培養したＤＣ２．４細胞を１００μｇ／ｍＬの可溶性ＯＶＡタンパク質で４ｈ処理した。ＩＬ－２処理Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ細胞を１０μＭ ＣＦＳＥで染色し、ＤＣ２．４細胞をこれらの蛍光標識Ｔｒｅｇ又はＴｃｏｎｖ細胞と約２０分間インキュベートした後、標識していないＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞を加えた。次に、ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞を有するカンチレバー先端を、紫外線フラッシュランプで認識したＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ細胞－ＤＣ対にアプローチした。Ｔｒｅｇ／Ｔ形質転換媒介ＯＴ－ＩＩ－ＤＣ接着抑制を解析した。各サイクルで、単一のＴ細胞を担持したＡＦＭカンチレバーは、最初の力曲線が生成されるまで０．５～２μｍ分降下した。その後、カンチレバー上のＴ細胞をＤＣと１５ｓ相互作用させ、２つの細胞が完全に分離するまでカンチレバーを上に移動させた。機械を入れたインキュベータを３７℃、５％ＣＯ２の条件に置いた。全ての実験で、少なくとも１４個の力曲線がさらなる解析のために収集された。ＪＰＫ画像処理ソフトウェアを使用して力曲線を処理した。円形で頑丈な細胞のみを選択してＡＦＭ接合を行った。各ＳＣＦＳ実験では、１つのＴ－ＤＣ対を使用して、数分以内に上下サイクルごとの力の読み取り値を生成した。各条件には、少なくとも３対のデータが使用された。
【0129】
実施例５：ＨＳＶ－１感染におけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、ヘルペス感染モデルの作製及び試験ステップ
１０６ ｐｆｕ ＨＳＶ－１（Ｆ株）を用いてＰＢＳ ２０μＬ中の後足底で引き起こした。３ｄｐｉでは、細胞を２×１０５個の細胞／２０μＬ ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを足底に養子移入した。７ｄｐｉでは、ホモジネートした足底組織を用いてウイルス力価をテストした。１群あたり４～６匹のマウスとし、試験を３回繰り返した。
１、ヘルペス感染モデルの作製及び試験ステップ
１０６ ｐｆｕ ＨＳＶ－１（Ｆ株）を用いてＰＢＳ ２０μＬ中の後足底で引き起こした。３ｄｐｉでは、細胞を２×１０５個の細胞／２０μＬ ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを足底に養子移入した。７ｄｐｉでは、ホモジネートした足底組織を用いてウイルス力価をテストした。１群あたり４～６匹のマウスとし、試験を３回繰り返した。
【0130】
ＤＴＨに対しては、６ｄｐｉでは、紫外線不活化ＨＳＶ－１（１０６ ｐｆｕ／２０μＬ ＰＢＳ）で右足底を再活性化した後、７ｄｐｉでは、左足底を対照として足底腫脹を測定した。１群あたり１６～２１匹のマウスとした。
【0131】
２、試験結果
ヘルペス感染モデルでは、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ １ ｌｏｇを注射すると、ＨＳＶ－１ ｐｆｕカウントが増加し始めた。Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖの輸注は、ウイルス（ＰＢＳ）単独接種と比較して増加しなかった（図３６参照）。次に、同じモデルをＤＴＨ応答の検出に使用した。ＨＳＶ－１を２回接種した後、感作させた足底は腫脹したが、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した足底の厚さの増加はいずれも減少したが、対照群では、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖとウイルス単独接種（ＰＢＳ）はいずれも厚さを減少しなかった（図３７、図３８）。
ヘルペス感染モデルでは、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ １ ｌｏｇを注射すると、ＨＳＶ－１ ｐｆｕカウントが増加し始めた。Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖの輸注は、ウイルス（ＰＢＳ）単独接種と比較して増加しなかった（図３６参照）。次に、同じモデルをＤＴＨ応答の検出に使用した。ＨＳＶ－１を２回接種した後、感作させた足底は腫脹したが、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した足底の厚さの増加はいずれも減少したが、対照群では、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖとウイルス単独接種（ＰＢＳ）はいずれも厚さを減少しなかった（図３７、図３８）。
【0132】
実施例６：マウス喘息モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、喘息モデルの作製及び試験ステップ
オボアルブミン（ＯＶＡ）で気道炎症を誘発した。０日目と１４日目に、ＯＶＡとミョウバンのアジュバント（１００μｇ＋４ｍｇ）を２回ｉ．ｐ注射し、マウスを感作させた。２１、２３、及び２５日目に、舌後部に気管内ＯＶＡショックを繰り返した。１０６個のＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＰＢＳをｉ．ｖ養子移入した。３２日目に、ＢＡＬＦ浸潤と組織学を解析した。
１、喘息モデルの作製及び試験ステップ
オボアルブミン（ＯＶＡ）で気道炎症を誘発した。０日目と１４日目に、ＯＶＡとミョウバンのアジュバント（１００μｇ＋４ｍｇ）を２回ｉ．ｐ注射し、マウスを感作させた。２１、２３、及び２５日目に、舌後部に気管内ＯＶＡショックを繰り返した。１０６個のＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＰＢＳをｉ．ｖ養子移入した。３２日目に、ＢＡＬＦ浸潤と組織学を解析した。
【0133】
２、Ｈ＆Ｅ組織学的ステップ
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【0134】
３、試験結果
図４０Ａの感作スケジュールに従って作製したＯＶＡ感作喘息モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの輸注はＢＡＬＦ細胞数の制限に同等の効果を示し、リンパ球と好酸球の減少度も同様であった（図３９）。組織学的検査を図４０Ｂに示す。
図４０Ａの感作スケジュールに従って作製したＯＶＡ感作喘息モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの輸注はＢＡＬＦ細胞数の制限に同等の効果を示し、リンパ球と好酸球の減少度も同様であった（図３９）。組織学的検査を図４０Ｂに示す。
【0135】
実施例７：マウス結腸炎モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、ＤＳＳ誘導結腸炎（ＩＢＤ）モデルの作製及び試験ステップ
ＤＳＳ誘導マウス実験性結腸炎モデルは、文献Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell Expansion in the Intestine（Tangら，Cell Host Microbe 18，183-197，2015）とMyeloid-Derived Suppressor Cells Are Controlled by Regulatory T Cells via TGF-beta during Murine Colitis（Leeら，Cell Rep 17，3219-3232，2016）を参照することができる。簡単に言えば、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３×１０６個のＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、野生型Ｔｃｏｎｖ又はＴｒｅｇをｉ．ｖ養子移入した。翌日、４％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）を７日間経口投与して結腸炎（Ｙｅａｓｏｎ，ＭＷ＝３６,０００～５０,０００ Ｄａ）を誘導した後、通常の飲み水を与えた。正常対照マウスにＰＢＳを投与し、通常の飲料水を与えた。１０日目にマウスを殺し、結腸を解剖して結腸の長さを測定した。その後、結腸を４％ＰＦＡにて４℃で４８時間固定化し、その後のＨ＆Ｅ染色に用いた。３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＳＣＡＮ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）にて結腸切片を観察した。１群あたり１１～１８匹のマウスとした。
１、ＤＳＳ誘導結腸炎（ＩＢＤ）モデルの作製及び試験ステップ
ＤＳＳ誘導マウス実験性結腸炎モデルは、文献Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell Expansion in the Intestine（Tangら，Cell Host Microbe 18，183-197，2015）とMyeloid-Derived Suppressor Cells Are Controlled by Regulatory T Cells via TGF-beta during Murine Colitis（Leeら，Cell Rep 17，3219-3232，2016）を参照することができる。簡単に言えば、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３×１０６個のＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、野生型Ｔｃｏｎｖ又はＴｒｅｇをｉ．ｖ養子移入した。翌日、４％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）を７日間経口投与して結腸炎（Ｙｅａｓｏｎ，ＭＷ＝３６,０００～５０,０００ Ｄａ）を誘導した後、通常の飲み水を与えた。正常対照マウスにＰＢＳを投与し、通常の飲料水を与えた。１０日目にマウスを殺し、結腸を解剖して結腸の長さを測定した。その後、結腸を４％ＰＦＡにて４℃で４８時間固定化し、その後のＨ＆Ｅ染色に用いた。３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＳＣＡＮ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）にて結腸切片を観察した。１群あたり１１～１８匹のマウスとした。
【0136】
２、Ｈ＆Ｅ組織学的ステップ
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【0137】
３、試験結果
図４２Ａの誘導スケジュールに従って作製した結腸炎モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した群では、結腸の長さが短縮した。Ｔｒｅｇ群とＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、いずれもＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ群と比較して結腸損傷を軽減することができた（図４１、図４２）。
図４２Ａの誘導スケジュールに従って作製した結腸炎モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した群では、結腸の長さが短縮した。Ｔｒｅｇ群とＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、いずれもＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ群と比較して結腸損傷を軽減することができた（図４１、図４２）。
【0138】
実施例８：マウス結腸癌モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、結腸癌腫瘍モデルの作製及び試験ステップ
文献Oxidative stress controls regulatory T cell apoptosis and suppressor activity and PD-L1-blockade resistance in tumor（Majら，Nat Immunol 18，1332-1341，2017））を参照して移植した腫瘍マウスモデルを作製した。簡単に言えば、ＭＣ３８結腸癌細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、２００μＬのＰＢＳで５×１０５個のＭＣ３８細胞と１０６個のＴ細胞を６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部皮下に皮下注射した。腫瘍注射後７日目から４～５日毎にノギスを用いて腫瘍の成長をモニタリングした。体積は（長さ×幅×幅）／２として計算される。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ。１群あたり１０匹のマウスとした。
１、結腸癌腫瘍モデルの作製及び試験ステップ
文献Oxidative stress controls regulatory T cell apoptosis and suppressor activity and PD-L1-blockade resistance in tumor（Majら，Nat Immunol 18，1332-1341，2017））を参照して移植した腫瘍マウスモデルを作製した。簡単に言えば、ＭＣ３８結腸癌細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、２００μＬのＰＢＳで５×１０５個のＭＣ３８細胞と１０６個のＴ細胞を６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部皮下に皮下注射した。腫瘍注射後７日目から４～５日毎にノギスを用いて腫瘍の成長をモニタリングした。体積は（長さ×幅×幅）／２として計算される。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ。１群あたり１０匹のマウスとした。
【0139】
２、試験結果
ＭＣ３８腫瘍モデルでは、Ｔｒｅｇ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの注入は腫瘍の成長を促進したが、ＰＢＳ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群には有意な効果は認められなかった（図４３）。
ＭＣ３８腫瘍モデルでは、Ｔｒｅｇ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの注入は腫瘍の成長を促進したが、ＰＢＳ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群には有意な効果は認められなかった（図４３）。
【0140】
実施例９：マウス皮癬モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の免疫恒常性回復作用
本実施例では、多臓器自己免疫による一般的な炎症におけるＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞の作用が最も有意であることから、Ｆｏｘｐ３欠損マウスモデルを構築し、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞の調節下におけるＦｏｘｐ３欠損の免疫欠損マウスの免疫恒常性回復を検証した。
本実施例では、多臓器自己免疫による一般的な炎症におけるＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞の作用が最も有意であることから、Ｆｏｘｐ３欠損マウスモデルを構築し、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞の調節下におけるＦｏｘｐ３欠損の免疫欠損マウスの免疫恒常性回復を検証した。
【0141】
１、皮癬罹患マウス（Ｓｃｕｒｆｙ）モデル
文献A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity（Haribhaiら，Immunity 35，109-122，2011）とTGF-beta-induced Foxp3+ regulatory T cells rescue scurfy mice（Huter等，Eur J Immunol 38，1814-1821，2008）を参照して、Ｆｏｘｐ３欠損マウスの皮癬モデルを作製した。５×１０６個の精製Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳに重懸濁させ、腹膜内注射した。新生相同皮癬罹患マウスの生後２日目又は３日目に注射した。最初の２週間は、３～４日ごとにＴ細胞養子移入を行い、その後、２週間ごとに１回行った。養子移入時、皮癬モデルと雄ＷＴ同窩仔の体重を記録し、生存率をモニタリングした。全てのマウスを出産当日にサンプリングし、ＰＣＲによりｓｆ変異遺伝子についてジェノタイピングを行い、配列決定により遺伝子型を検証した。ＦｏｘＰ３ ＰＣＲのプライマーは５’－ＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と５’－ＡＣＴＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＧＴＣＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。組織学的には、ＰＢＳを注入したマウスを３週目に、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを養子移入したマウスを８～１２週目に解析した。
文献A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity（Haribhaiら，Immunity 35，109-122，2011）とTGF-beta-induced Foxp3+ regulatory T cells rescue scurfy mice（Huter等，Eur J Immunol 38，1814-1821，2008）を参照して、Ｆｏｘｐ３欠損マウスの皮癬モデルを作製した。５×１０６個の精製Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳに重懸濁させ、腹膜内注射した。新生相同皮癬罹患マウスの生後２日目又は３日目に注射した。最初の２週間は、３～４日ごとにＴ細胞養子移入を行い、その後、２週間ごとに１回行った。養子移入時、皮癬モデルと雄ＷＴ同窩仔の体重を記録し、生存率をモニタリングした。全てのマウスを出産当日にサンプリングし、ＰＣＲによりｓｆ変異遺伝子についてジェノタイピングを行い、配列決定により遺伝子型を検証した。ＦｏｘＰ３ ＰＣＲのプライマーは５’－ＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と５’－ＡＣＴＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＧＴＣＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。組織学的には、ＰＢＳを注入したマウスを３週目に、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを養子移入したマウスを８～１２週目に解析した。
【0142】
２、Ｈ＆Ｅ組織学的ステップ
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％の神経緩衝性ホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍのスライドガラスに切った。全てのガラスはヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【0143】
３、試験結果
皮癬罹患マウス（ＦｏｘＰ３－／－、Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを生後２～３日に注射した。予想された通り、ＰＢＳ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは、生後２～４週間で全て死亡した。一方、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した全てのマウスは少なくとも２０週間生存した（図４４、図２５）。また、６カ月経過観察後も、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した皮癬罹患マウスの死亡や明らかな異常は認められなかった。
皮癬罹患マウス（ＦｏｘＰ３－／－、Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを生後２～３日に注射した。予想された通り、ＰＢＳ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは、生後２～４週間で全て死亡した。一方、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した全てのマウスは少なくとも２０週間生存した（図４４、図２５）。また、６カ月経過観察後も、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した皮癬罹患マウスの死亡や明らかな異常は認められなかった。
【0144】
組織学的結果を図４５に示す。予想された通り、ＰＢＳ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは、重症の甲状腺炎、脾臓炎、肺炎、皮膚炎、肝炎、膵炎、胃炎や結腸炎を示した。一方、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは全てこれらの疾患を完治し、すなわちＦｏｘＰ３欠損マウスの総合効果機能欠損は回復され、Ｒｙｒ２がＴ細胞の免疫機能を調節することを示唆した。
【0145】
以上より、Ｒｙｒ２－／－Ｔ及びＴｒｅｇ細胞は、マウスヘルペス感染モデル、喘息モデル、結腸炎モデル及び結腸癌モデルでは、機能的に同じ効果を示し、しかも、免疫不全マウスでも免疫機能を回復させることができた。つまり、Ｔｒｅｇが免疫調節作用を有することが知られているいくつかの疾患では、Ｒｙｒ２－／－Ｔは同等の作用を果たすことが示されている。
【0146】
以上は本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明は上記実施形態の詳細に限定されるものではなく、本発明の技術的構想を逸脱することなく、本発明の技術的解決手段について様々な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本発明の特許範囲に属する。
【0147】
なお、上記の具体的な実施形態に記載の各特定技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方式で組み合わせられてもよく、不要な重複を回避するように、本発明は各種の可能な組み合わせの形態については、再度説明しない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｒｙｒ２発現を調整する試薬、Ｃａ２＋基礎振動を調整する試薬、ｍ－カルパイン活性を調整する試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する試薬又はＲｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞の、感染性疾患、炎症又は腫瘍を治療する医薬品の調製における使用であって、
好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用。
好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用。
【請求項2】
Ｒｙｒ２発現を低下させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を低下させる試薬、ｍ－カルパイン活性を低下させる試薬、又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる試薬の、感染性疾患又は炎症を治療する医薬品の調製における使用。
【請求項3】
Ｒｙｒ２発現を向上させる試薬、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる試薬、ｍ－カルパイン活性を向上させる試薬、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる試薬又はＲｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞の、腫瘍治療薬の調製における使用であって、
好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用。
好ましくは、前記Ｒｙｒ２が過剰発現されているＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である、使用。
【請求項4】
前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染から選ばれ、さらに好ましくはウイルス感染、感染性ショックを伴う肺炎、腹膜炎、菌血症、膿敗血症又は敗血症であり、前記ウイルス感染は、急性ウイルス感染又は慢性ウイルス感染から選ばれ、好ましくはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、水疱口炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス又はヒトパピローマウイルスであることを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項5】
前記炎症は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強皮症、喘息、アトピー性皮膚炎、臓器特異的炎症性疾患、アレルギー、毛包炎、扁桃炎、肺炎、肝炎、腎炎、ざ瘡、自己免疫疾患、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、結腸炎、炎症性腸疾患、骨盤炎、再灌流損傷、移植拒絶反応、血管炎又は間質性膀胱炎から選ばれることを特徴とする請求項１～２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項6】
前記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、グリオーマ、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、横紋筋癌、舌扁平上皮癌、鼻咽頭頭癌、卵巣癌、胎盤絨毛癌、リンパ腫、白血病、直腸腺癌、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、星細胞腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、表皮癌、結腸癌、胸腺癌、血液癌、頭頸部癌又は中咽頭癌から選ばれることを特徴とする請求項１又は３に記載の使用。
【請求項7】
Ｔ細胞中Ｒｙｒ２発現調整の、Ｃａ２＋基礎振動調整、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度向上における使用。
【請求項8】
Ｃａ２＋基礎振動調整の、ｍ－カルパイン活性調整又はＴ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用。
【請求項9】
ｍ－カルパイン活性調整の、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度調整における使用。
【請求項10】
調整は低下又は向上であることを特徴とする請求項７～９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項11】
Ｒｙｒ２発現を調整することを含むことを特徴とする、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を調整する方法。
【請求項12】
調整は、低下又は向上であり、好ましくは、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を低下させる方法は、Ｒｙｒ２発現を向上させることを含み、Ｔ細胞とＤＣ細胞との結合強度を向上させる方法は、Ｒｙｒ２発現を低下させることを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させるか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含み、Ｒｙｒ２発現を向上させることは、Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含み、
前記Ｒｙｒ２阻害剤は、Ｒｙｒ２拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれ、前記Ｒｙｒ２拮抗剤は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソン又はＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列を標的とし、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含み、好ましくは、前記Ｒｙｒ２阻害剤は、ｓｈＲＮＡを含み、前記ｓｈＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６に示され、
前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
前記Ｒｙｒ２阻害剤は、Ｒｙｒ２拮抗剤、リアノジン、ダントロレン又はＪＴＶ５１９から選ばれ、前記Ｒｙｒ２拮抗剤は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソン又はＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列を標的とし、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含み、好ましくは、前記Ｒｙｒ２阻害剤は、ｓｈＲＮＡを含み、前記ｓｈＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６に示され、
前記Ｒｙｒ２駆動剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、カフェイン、４－クロロ－ｍ－クレゾール、リアノジン、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、Ｂ型アドレナリン、４－クロロ－３－メチルフェノール、シアントラニリプロール、シクラニリプロール、環状アデノシン二リン酸リボース、スラミンナトリウム、テトラニリプロール又はトリフルオペラジンから選ばれることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含み、好ましくは、前記Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックダウン又はノックアウトすることを含み、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６であるｓｈＲＮＡを用いてＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトすることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記Ｒｙｒ２発現を低下させることは、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列を欠損させることを含み、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、最も好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項16】
Ｃａ２＋基礎振動を低下させる、ｍ－カルパイン活性を低下させる方法であって、前記方法は、
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させる、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３を過剰発現させる、Ｔ細胞中のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトするか、又はＲｙｒ２阻害剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
【請求項17】
Ｔ細胞中のＲｙｒ２発現を向上させる、Ｃａ２＋基礎振動を向上させる、ｍ－カルパイン活性を向上させる方法であって、前記方法は、
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３の発現を低下させるか、又はＲｙｒ２駆動剤を添加することを含むことを特徴とする方法。
【請求項18】
Ｔｃｏｎｖ細胞をＴｒｅｇ細胞と類似した機能を有するものに転化する方法であって、前記方法は、
Ｔｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含むことを特徴とする方法。
Ｔｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項19】
Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２遺伝子の１セグメントのグアニンリッチ配列をノックダウン又はノックアウトすることを含み、好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、Ｒｙｒ２遺伝子の開始コドンの最初の２００ｂｐにあり、さらに好ましくは、前記１セグメントのグアニンリッチ配列は、ＧＣＡＧＧＧＧを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記方法は、Ｒｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックアウトすることを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
Ｒｙｒ２が過剰発現されていることを特徴とするＴ細胞。
【請求項22】
前記Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とする請求項２１に記載のＴ細胞。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0005】
Ｒｙｒ２は小胞体／筋小胞体（ＥＲ／ＳＲ）のカルシウム放出チャネルであり、以下の従来技術では、Ｒｙｒ２遺伝子が心原性突然死、不整脈、冠状動脈性硬化症に関連することが開示されている。例えば、
非特許文献：Ｒｙｒ２遺伝子の新たな突然変異による心原性突然死の家族研究（申童ら、中国医学と西洋医学を統合した心血管病雑誌、２０１９．０２）は、Ｒｙｒ２遺伝子ミスセンス突然変異ｃ．Ｇ４１０７Ｃを有する者には、労作性呼吸困難、胸痛などの症状が存在し、すなわち、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異が心原性突然死と関連する可能性があることを開示した。
非特許文献：Ｒｙｒ２遺伝子の新たな突然変異による心原性突然死の家族研究（申童ら、中国医学と西洋医学を統合した心血管病雑誌、２０１９．０２）は、Ｒｙｒ２遺伝子ミスセンス突然変異ｃ．Ｇ４１０７Ｃを有する者には、労作性呼吸困難、胸痛などの症状が存在し、すなわち、Ｒｙｒ２遺伝子上のミスセンス突然変異が心原性突然死と関連する可能性があることを開示した。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0010】
本発明は、従来技術の空白を埋めるために、Ｔｒｅｇ細胞機能の調整スイッチであるＲｙｒ２を発見し、ＦｏｘＰ３過剰発現によりＲｙｒ２の発現を低下させる技術を取得し、しかも、標的位置を特定する。また、Ｔ細胞中のＲｙｒ２をノックダウン又はノックアウトすることによりＣＤ４＋Ｔ細胞プールが免疫抑制細胞になり、得られたＴ細胞はＴｒｅｇ細胞と類似した機能を持つことは多くの実験を通じて確認される。さらに、Ｒｙｒ２の調整は、ウイルス感染、喘息、アレルギー、結腸炎や腫瘍のいずれの治療においても優れた効果が得られ、皮癬罹患マウスの関連する系の自己免疫を回復する。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0056】
本発明の１つの特定実施形態では、ｓｈＲＮＡを採用してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６のためにＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックダウンする。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0061】
好ましくは、少なくともＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックダウンする。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0070】
好ましくは、前記方法は、少なくともＲｙｒ２遺伝子の７番エクソンをノックダウン又はノックダウンすることを含む。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0090】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例を詳細に説明する。
【図1】野生型マウスから単離されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞中のｍ－カルパインのタンパク質発現の解析であり、このうち、図Ａ、図Ｂはｍ－カルパインのタンパク質レベルであり、図Ｃはｍ－カルパインのｍＲＮＡレベルであり、全ての値は平均値＋ＳＥＭである。
【図2】休止状態でのＣａ２＋の単一Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞における基礎振動であり、検出系は、２ｍＭ Ｃａ２＋のＨＢＳＳにＣａ２＋プローブＦｌｕｏ ４－ＡＭを加えたものであり、ここで、各ラインは１つの細胞を表し、ｎは１群のデータ点における生物学的繰り返し回数であり、ｎ＝２０である。
【図3】休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるＣａ２＋
シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇ細胞についてＦｌｕｏ ４－ＡＭにより染色してＭＦＩを解析する。
【図5】ＧＥＯデータベースによりＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのカルシウムイオン調節関連タンパク質のレベルを解析し、違いによって並べ替えられる。
【図6】精製されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるＲｙｒ２ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ解析である。
【図7】カルパイン基質ＣＭＡＣで消化し、Ｒｙｒ活性化（４－ＣＭＣ処理）後のＴｃｏｎｖ（左）及びＴｒｅｇ（右）細胞のカルパイン活性を測定する。
【図8】５ｍＭ ＪＴＶ５１９阻害剤を用いてＲｙｒ２を抑制したＴｃｏｎｖ細胞（中央の図）、野生型Ｔｃｏｎｖ細胞（左の図）及びＴｒｅｇ細胞（右の図）のカルシウムイオン基礎振動である。
【図9】５ｍＭ ＪＴＶ５１９阻害剤を用いてＲｙｒ２を抑制したＴｃｏｎｖ細胞、野生型Ｔｃｏｎｖ細胞及びＴｒｅｇ細胞中のカルシウムイオン基礎振動の標準偏差である。
【図10】ＷＴマウスから単離されたＴｃｏｎｖ細胞及びｓｈＲＮＡからＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞のＲｙｒ２ｍＲＮＡ転写レベルをｑＰＣＲにより解析する。
【図11】ｓｈＲＮＡを採用してＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞と野生型Ｔｃｏｎｖ細胞とのＣａ２＋基礎振動の比較である。
【図12】ｓｈＲＮＡを採用してＲｙｒ２遺伝子をノックダウンしたＴｃｏｎｖ細胞と野生型Ｔｃｏｎｖ細胞とのＣａ２＋基礎振動の標準偏差である。
【図13】ＪＴＶ５１９処理Ｔｃｏｎｖ（左）、ＪＴＶ５１９処理Ｔｒｅｇ（中）及びＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ（右）におけるカルパイン活性である。
【図14】Ｔ細胞のＤＣ２．４への接着の接着力を検出する。左図は未処理Ｔｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ及びＪＴＶ５１９処理Ｔｃｏｎｖの平均接着力であり、右図は空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）とＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖの平均接着力である。
【図15】ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞とＯＶＡを提示したＤＣ２．４細胞との間の接着力の測定であり、図Ａは３つの細胞のＡＦＭ解析の模式図を示し、図ＢはＷ／Ｏ細胞（無細胞群）、空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｅｇの抑制細胞としての平均接着力を示す。
【図16】抑制ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞の分裂のテスト結果であり、図Ａは無Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ、空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞の抑制ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞の分裂のＦＡＣＳ図であり、図ＢはＴｒｅｇ（１００％抑制として定義）及び無Ｔｒｅｇ（０％抑制として定義）で標準化された空白干渉対照（ｓｈＣｔｒｌ）又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞の抑制効率であり、ここで、＊、Ｐ ＜０．０５、＊＊、Ｐ ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ ＜０．０００１である。
【図17】ＷＴマウスから単離されたＴｃｏｎｖ細胞中のＩｔｐｒ１、Ｃａｃｎｂ１、Ｔｒｐｍ１、Ｔｒｐｍ４、Ｔｒｐｖ２、Ｏｒａｉ１及びＯｒａｉ３遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウン効率をｑＰＣＲにより解析する。
【図18】未処理Ｔｒｅｇ細胞、空白干渉対照Ｔｃｏｎｖ（ｓｈＣｔｒｌ）、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｉｔｐｒ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｃａｃｎｂ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｍ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｍ４ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｔｒｐｖ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、Ｏｒａｉ１ノックダウンＴｃｏｎｖ、及びＯｒａｉ３ノックダウンＴｃｏｎｖの平均接着力である。
【図19】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。具体的には、ＦｏｘＰ３過剰発現Ｔｃｏｎｖ、Ａ２０、３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞中のＲｙｒ２ ｍＲＮＡレベルである。
【図20】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。Ｆｏｘｐ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、トランスフェクションＦｏｘｐ３（上）又はＦｏｘｐ３（下）未トランスフェクションＴｃｏｎｖである。矢印はＲｙｒ２遺伝子のＴＳＳ部位を示す。三角はＣｈＩＰ－ｓｅｑにより認識された有意差がある結合ピークであり、この位置は主にこの遺伝子のプロモータ領域（ブロック）と重なる。
【図21】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。上図はＲｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの構築の概略図、ＴＳＳ、転写開始部位である。下図はＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３又はＲｅｎｃａ細胞においてＲｙｒ２プロモータにより駆動されるデュアルルシフェラーゼの発現レベルである。
【図22】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。図Ａは配列において配列セグメントを削除した結果、即ち、Ｒｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの切断ベクターの概略図であり、図Ｂは図ＡにおいてそれぞれがＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３においてＲｙｒ２プロモータにより駆動されるデュアルルシフェラーゼの発現レベルである。
【図23】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。図ＡはＲｙｒ２プロモータ－ルシフェラーゼレポータベクターの２つの切断ベクター及びノックアウト戦略の概略図であり、図ＢはＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３細胞における異なる切断ベクター又はＦｏｘＰ３結合配列を発現させたＲｙｒ２プロモータにより駆動されるデュアルルシフェラーゼの発現レベルであり、Ｎ．Ｓ．は、統計学的有意差無しである。
【図24】ＦｏｘＰ３を過剰発現させ、Ｒｙｒ２遺伝子転写をサイレンシングする。カルシウムイオンを含まないＨＢＳＳにおいて、４－ＣｍＣはＦｏｘＰ３過剰発現Ａ２０又は３Ｔ３細胞を刺激し、カルシウムイオンが経時的に変化する平均軌跡（Ｎ＝３）であり、独立の実験ごとに、１回の測定は少なくとも３０個の細胞を解析用に集める。
【図25】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図ＡはＷＴ及びＰＢＳ注射後のマウスの体重変化であり、図Ｂは、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋（Ｆｏｘｐ３－）Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射したマウスのそれぞれの体重変化である。
【図26】Ｒｙｒ２遺伝子においてＣｒｅは第７番エクソンをノックダウンする条件に依存してマウスをノックダウンして構築される。
【図27】Ｒｙｒ２＋／＋（Ｒｙｒ２未ノックアウト野生型）マウス、ＣＤ４－Ｃｒｅ／Ｒｙｒ２ｆｌ／＋マウス、及びＣＤ４－Ｃｒｅ／Ｒｙｒ２ｆｌ－／ｆｌ－マウスの脾臓及び胸腺におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の分布のフローサイトメトリー検出である。
【図28】マウスのＦｏｘＰ３＋／ＣＤ４＋脾臓細胞の割合である。
【図29】ＷＴＴｃｏｎｖ（Ｒｙｒ２＋／＋）、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ中のＴｒｅｇ機能関連表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３９、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３を含む）のフローサイトメトリー分析、及び２４ｈ抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激後、上清中のＩＬ－１０及びＴＧＦ－βレベルのＥＬＩＳＡ検出である。
【図30】
インビトロでＲｙｒ２ノックダウンＴ細胞の基礎振動を検出した図である。ＷＴ（図Ａ）又はＣＤ４－Ｃｒｅ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ（Ｒｙｒ２－／－）（図Ｂ）マウスから単離されたＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇを比較し（図Ｃ）、２ｍＭ Ｃａ２＋のＨＢＳＳにおいてカルシウムイオンの振動レベル及びその標準偏差を検出する（図Ｄ）。
【図31】ＣＭＡＣ基質分解によりＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞中のカルパイン活性を検出する。
【図32】Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの３種類の細胞におけるインビボ基質Ｔａｌｉｎの分解結果をウェスタンブロットによって示す。
【図33】Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖがインビトロでより強い接着能力を有する。４つの個別のＤＣ－Ｔ細胞対由来の全てのデータ点（図Ａ、図Ｂにおける点）を各条件で同じ日に収集し、図Ｃの棒グラフの生成に用いられ、Ｔ－ＤＣ対ごとに、少なくとも１５個の接着力の読み取り値が収集され、具体的には、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ（図Ａ）及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞（図Ｂ）対ＤＣ２．４の接着力、及び平均接着力（図Ｃ）である。
【図34】ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞とＯＶＡを提示したＤＣ２．４細胞との間の接着の実験であり、ＤＣ上の抑制細胞はＴｒｅｇ、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ細胞であり、図Ａは３つの細胞のＡＦＭ測定装置を示し、図ＢはＴｒｅｇ、ＷＴ Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの抑制細胞としての平均ＯＴ－ＩＩ－ＤＣ接着力である。
【図35】無Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの相対抑制効率であり、このうち、無Ｔｒｅｇは０％、Ｔｒｅｇは１００％とする。
【図36】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、図は細胞養子移入後の足底組織におけるＨＳＶ－１力価の解析であり、ＨＳＶ－１、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖは、それぞれＰＢＳ、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを養子移入したものである。
【図37】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、図は細胞養子移入と紫外線不活化によるＨＳＶ－１抗原再攻撃後の遅発型過敏症（ＤＴＨ）であり、抗原再攻撃を行わなかった足底の厚さは１００％とした。
【図38】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でヘルペス感染マウスモデルの免疫抑制を誘導し、上図はＤＴＨ解析における試験案であり、下図は代表的な足底腫脹である。
【図39】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス喘息モデルの免疫抑制を誘導し、図ＡはＢＡＬＦの総浸潤であり、図Ｂはリンパ細胞浸潤であり、図Ｃは好酸球浸潤である。測定結果としての数値は全て３回の実験の平均値であり、空白は空白対照群を表し、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、それぞれ、喘息モデルにＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを等量で注射したものである。
【図40】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス喘息モデルの免疫抑制を誘導し、図Ａは喘息モデルの感受性手段であり、図Ｂは代表的な肺Ｈ＆Ｅ組織切片であり、縮尺は２００μｍを表し、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群は、それぞれ、喘息モデルにＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを等量で注射したものである。
【図41】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸炎（ＩＢＤ）モデルの免疫抑制を誘導し、空白は空白対照群、ＤＳＳはＤＳＳ水処理群を表す。
【図42】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸炎（ＩＢＤ）モデルの免疫抑制を誘導し、図ＡはＤＳＳ誘導結腸炎モデルの誘導方法であり、図Ｂは代表的な結腸画像であり、図Ｃは結腸切片の顕微鏡写真であり、縮尺は２００μｍを表す。
【図43】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス結腸癌モデルの免疫抑制を誘導し、各群のマウスの腫瘍体積成長曲線をそれぞれ測定する。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖである。
【図44】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図はマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線であり、図ＡはＷＴ及びＰＢＳ注射後のマウスの生存率であり、図Ｂは、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋（Ｆｏｘｐ３－）Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖをそれぞれ注射したマウスの生存率である。
【図45】Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウンＴ細胞（Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ）でマウス皮癬（Ｓｃｕｒｆｙ）モデルの免疫抑制を誘導し、Ｓｃｕｒｆｙマウスの免疫恒常性を回復し、図ＡはＳｃｕｒｆｙマウスの身体症状及び治療であり、図Ｂは各器官（胸腺、脾臓、肺、耳、肝、膵臓、小腸、結腸）の代表的なＨ＆Ｅ染色であり、ＰＢＳ注射モデルマウス、ＷＴマウスは、３週目にサンプルを採取し、Ｔｒｅｇ細胞、Ｆｏｘｐ３－（Ｒｙｒ２＋／＋） Ｔｃｏｎｖ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを養子移入したマウスは８～１２週目に採取する。
【図46】Ｆｏｘｐ３を過剰発現させＲｙｒ２を抑制することはＴ細胞の免疫抑制作用の重要な効果機序であり、左図はＦｏｘｐ３を過剰発現させＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の作用機序であり、右図は野生型Ｔ細胞の作用機序である。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0092】
実施例に使用される実験動物、試薬及び装置の由来
マウス
マウスは全てＣ５７ＢＬ／６背景である。Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌマウスはＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄによって生産されたものであり、ＰＣＲにより、遺伝子型が同定された。ＯＴ－ＩＩトランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎ実験室から購入する。野生型、Ｆｏｘｐ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ、Ｒｙｒ２トランスジェニック、ＯＴ－ＩＩトランスジェニック、ＣＤ４－Ｃｒｅ及びＦｏｘｐ３－Ｃｒｅ－ＹＦＰ、雌Ｆｏｘｐ３ ＋／－マウスは清華大学動物センタで飼育される。マウスは全て特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下で飼育する。全ての動物実験は動物福祉ガイドラインに合致し、清華大学動物実験倫理委員会ＩＡＣＵＣにより承認された。
マウス
マウスは全てＣ５７ＢＬ／６背景である。Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌマウスはＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄによって生産されたものであり、ＰＣＲにより、遺伝子型が同定された。ＯＴ－ＩＩトランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎ実験室から購入する。野生型、Ｆｏｘｐ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、Ｒｙｒ２ｆｌ／ｆｌ、Ｒｙｒ２トランスジェニック、ＯＴ－ＩＩトランスジェニック、ＣＤ４－Ｃｒｅ及びＦｏｘｐ３－Ｃｒｅ－ＹＦＰ、雌Ｆｏｘｐ３ ＋／－マウスは清華大学動物センタで飼育される。マウスは全て特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下で飼育する。全ての動物実験は動物福祉ガイドラインに合致し、清華大学動物実験倫理委員会ＩＡＣＵＣにより承認された。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
細胞株及び初代細胞の培養
ＤＣ２．４細胞はＵＭａｓｓ医学院のＫｅｎ Ｒｏｃｋ教授から贈られた。Ｖｅｒｏ細胞は清華大学薬学院の譚旭博士より提供された。Ｒｅｎｃａ細胞は北京朝陽病院の安広宇医師より提供された。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は清華大学医学院の郭偉博士から贈られた。ＭＣ３８細胞は米国典型培養物保蔵センタ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＣ３８、Ｒｅｎｃａ、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞及びＶｅｒｏ細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭにて培養される。他の細胞は全て、５０μＭβ－メルカプトエタノールを含む同量のＲＰＭＩ－１６４０にて成長する。ＰＣＲ解析により全ての細胞株に対してマイコプラズマ汚染がテストされる。マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖは、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９８５２）及びマウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ細胞陽性選択キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１８７８２）を用いて脾臓から単離される。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞は、場合によっては、ＦＡＣＳによってＦｏｘｐ３－ＩＥＲＳ－ＧＦＰマウスＣＤ４＋脾臓細胞から選別される。マウスＤＣはマウスＣＤ１１ｃ選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、２８００７）を用いて脾臓から単離される。ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞は、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１９８５２）を用いてＯＴ－ＩＩ脾臓細胞から単離され、場合によっては、ＦＡＣＳによりＴＣＲＶα２抗体を用いて選別される。
ＤＣ２．４細胞はＵＭａｓｓ医学院のＫｅｎ Ｒｏｃｋ教授から贈られた。Ｖｅｒｏ細胞は清華大学薬学院の譚旭博士より提供された。Ｒｅｎｃａ細胞は北京朝陽病院の安広宇医師より提供された。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は清華大学医学院の郭偉博士から贈られた。ＭＣ３８細胞は米国典型培養物保蔵センタ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＣ３８、Ｒｅｎｃａ、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞及びＶｅｒｏ細胞は１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭにて培養される。他の細胞は全て、５０μＭβ－メルカプトエタノールを含む同量のＲＰＭＩ－１６４０にて成長する。ＰＣＲ解析により全ての細胞株に対してマイコプラズマ汚染がテストされる。マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖは、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１９８５２）及びマウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ細胞陽性選択キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１８７８２）を用いて脾臓から単離される。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞は、場合によっては、ＦＡＣＳによってＦｏｘｐ３－ＩＥＲＳ－ＧＦＰマウスＣＤ４＋脾臓細胞から選別される。マウスＤＣはマウスＣＤ１１ｃ選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、２８００７）を用いて脾臓から単離される。ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞は、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、１９８５２）を用いてＯＴ－ＩＩ脾臓細胞から単離され、場合によっては、ＦＡＣＳによりＴＣＲＶα２抗体を用いて選別される。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0094】
抗体及び試薬
全ての初代細胞単離キットはＳｔｅｍＣｅｌｌからのものである。組換えヒトＩＬ－２はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのものである。抗マウスＣＤ３ｅモノクローナル抗体、抗マウスＣＤ２８及び抗マウスＴＣＲＶα２－ＰＥ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものである。フローサイトメトリー抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものであり、さらに抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗Ｔｉｍ－３及び抗ＬＡＧ３抗体を含む。抗ＦｏｘＰ３抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものである。抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ８、抗マウスＧＩＴＲ、抗マウスＣＤ２５、抗マウスＰＤ－１、抗マウス／ラットＣＴＬＡ－４、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗マウス／ヒトＴｉｍ－３、抗マウスＬＡＧ３、抗マウスＰＤ－１（Ｊ４３．１）、抗マウスＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、抗マウスＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）のクローンが使用される。ウェスタンブロット解析に用いられる抗体はｍ－カルパイン大サブユニット（Ｍ型）抗体と抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを連結した抗体はＣＳＴからのものである。抗ｔａｌｉｎ抗体（８Ｄ４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入された。
全ての初代細胞単離キットはＳｔｅｍＣｅｌｌからのものである。組換えヒトＩＬ－２はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのものである。抗マウスＣＤ３ｅモノクローナル抗体、抗マウスＣＤ２８及び抗マウスＴＣＲＶα２－ＰＥ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものである。フローサイトメトリー抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのものであり、さらに抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２５、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４、抗Ｔｉｍ－３及び抗ＬＡＧ３抗体を含む。抗ＦｏｘＰ３抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものである。抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ８、抗マウスＧＩＴＲ、抗マウスＣＤ２５、抗マウスＰＤ－１、抗マウス／ラットＣＴＬＡ－４、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗マウス／ヒトＴｉｍ－３、抗マウスＬＡＧ３、抗マウスＰＤ－１（Ｊ４３．１）、抗マウスＣＴＬＡ４（ＵＣ１０－４Ｂ９）、抗マウスＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）のクローンが使用される。ウェスタンブロット解析に用いられる抗体はｍ－カルパイン大サブユニット（Ｍ型）抗体と抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを連結した抗体はＣＳＴからのものである。抗ｔａｌｉｎ抗体（８Ｄ４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入された。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0097】
実施例１：Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン又はＦｏｘＰ３過剰発現型の調製及び実験検証
１、Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン実験のステップ
レンチウイルスによるｓｈＲＮＡをＲｙｒ２遺伝子ノックダウンに用い、具体的には、予め合成されたｓｈＲＮＡ配列をｐＬＫＯ．１ベクターに挿入した。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＭｉｄｉキット（ＣＷＢＩＯ、ＣＷ２１０５Ｓ）を用いて、形質転換大腸菌からｓｈＲＮＡを含むプラスミド及びパッケージングプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２）を精製した。試薬取扱書に従ってレンチウイルスパッケージングを行った。簡単に言えば、皿の６０～８０％のカバー度まで、２９３ＦＴ細胞を１０ｃｍ皿で培養した。ＤＮＡトランスフェクション２時間前に培地を交換した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（Ｎｅｏｆｅｃｔ）を用いて、パッケージングベクターｐＭＤ２．Ｇ ２．５μｇとｐｓＰＡＸ２ ２．５μｇ、ｐＬＫＯ．１ベクター５μｇ（挿入されたｓｈＲＮＡ付き）を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、レンチウイルスを得て、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（終濃度８μｇ／ｍＬ）でＴ細胞を感染した。ウイルス感染４８時間後、Ａｒｉａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を選別した。リアルタイム定量ＰＣＲによりノックダウン効率を検証した。ｓｈＲＮＡ配列は以下に示される。
１、Ｒｙｒ２遺伝子ノックダウン実験のステップ
レンチウイルスによるｓｈＲＮＡをＲｙｒ２遺伝子ノックダウンに用い、具体的には、予め合成されたｓｈＲＮＡ配列をｐＬＫＯ．１ベクターに挿入した。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＭｉｄｉキット（ＣＷＢＩＯ、ＣＷ２１０５Ｓ）を用いて、形質転換大腸菌からｓｈＲＮＡを含むプラスミド及びパッケージングプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ及びｐｓＰＡＸ２）を精製した。試薬取扱書に従ってレンチウイルスパッケージングを行った。簡単に言えば、皿の６０～８０％のカバー度まで、２９３ＦＴ細胞を１０ｃｍ皿で培養した。ＤＮＡトランスフェクション２時間前に培地を交換した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（Ｎｅｏｆｅｃｔ）を用いて、パッケージングベクターｐＭＤ２．Ｇ ２．５μｇとｐｓＰＡＸ２ ２．５μｇ、ｐＬＫＯ．１ベクター５μｇ（挿入されたｓｈＲＮＡ付き）を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、レンチウイルスを得て、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（終濃度８μｇ／ｍＬ）でＴ細胞を感染した。ウイルス感染４８時間後、Ａｒｉａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を選別した。リアルタイム定量ＰＣＲによりノックダウン効率を検証した。ｓｈＲＮＡ配列は以下に示される。
【手続補正12】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0098】
対照-shRNA:5'-CCGGcaacaagatgaagagcaccaaCTCGAGttggtgctcttcatcttgttgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:3)と5’-AATTCAAAAAcaacaagatgaagagcaccaaCTCGAGttggtgctcttcatcttgttgg-3’(SEQ ID NO:4);Ryr2-shRNA:5'-CCGGccgctaatgaagccatataaaCTCGAGTTTATATGGCTTCATTAGCGGTTTTTG-3'(SEQ ID NO:5)と5’-AATTCAAAAAccgctaatgaagccatataaaCTCGAGTTTATATGGCTTCATTAGCGG-3’(SEQ ID NO:6);Itpr1-shRNA:5'-CCGGgcagtaggtaagaagttattaCTCGAGtaataacttcttacctactgcTTTTTG-3'(SEQ ID NO:7)と5'-AATTCAAAAAgcagtaggtaagaagttattaCTCGAGtaataacttcttacctactgc-3'(SEQ ID NO:8);
Orai1-shRNA:5'-CCGGcacaaccaccaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:9)と'-AATTCAAAAAcacaacctcaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtg-3'(SEQ ID NO:10);Orai3-shRNA:5'-CCGGgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggcTTTTTTGG-3'(SEQ ID NO:11)と5'-AATTCAAAAAAgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggc-3'(SEQ ID NO:12); Trpm1-shRNA:5'-CCGGcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:13)と5'-AATTCAAAAAcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccg-3'(SEQ ID NO:14);Trpm4-shRNA:5'-CCGGgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:15)と5'-AATTCAAAAAgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtgc-3'(SEQ ID NO:16);Trpv2-shRNA:5'-CCGGccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaagttccttggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:17)と5'-AATTCAAAAAccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaaagagctccttgg-3'(SEQ ID NO:18);Cacnb1-shRNA:5'-CCGGtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatatccattgcgttcctaTTTTTG-3'(SEQ ID NO:19)と5'-AATTCAAAAAtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatattccattgcgttccta-3'(SEQ ID NO:20)。
Orai1-shRNA:5'-CCGGcacaaccaccaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:9)と'-AATTCAAAAAcacaacctcaactcggtcaaaCTCGAGtttgaccgagttgaggttgtg-3'(SEQ ID NO:10);Orai3-shRNA:5'-CCGGgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggcTTTTTTGG-3'(SEQ ID NO:11)と5'-AATTCAAAAAAgcccttgcttatctgtataatCTCGAGattatacagataagcaagggc-3'(SEQ ID NO:12); Trpm1-shRNA:5'-CCGGcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccgTTTTTG-3'(SEQ ID NO:13)と5'-AATTCAAAAAcggagtgaacatgcagcatttCTCGAGaaatgctgcatgttcactccg-3'(SEQ ID NO:14);Trpm4-shRNA:5'-CCGGgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:15)と5'-AATTCAAAAAgcacatcttcacggtgaacaaCTCGAGttgttcaccgtgaagatgtgc-3'(SEQ ID NO:16);Trpv2-shRNA:5'-CCGGccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaagttccttggTTTTTG-3'(SEQ ID NO:17)と5'-AATTCAAAAAccaaggaacttgtttctatttCTCGAGaaatagaaacaaagagctccttgg-3'(SEQ ID NO:18);Cacnb1-shRNA:5'-CCGGtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatatccattgcgttcctaTTTTTG-3'(SEQ ID NO:19)と5'-AATTCAAAAAtaggaacgcaatggatattaaCTCGAGttaatattccattgcgttccta-3'(SEQ ID NO:20)。
【手続補正13】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0100】
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、指定の細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素Ｍ－ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏ Ｒｏｘ）（Ｙｅａｓｅｎ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ ＲＮＡを標準化対照に用いた。プライマー配列は以下に示される。
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0101】
マウスGAPDH、5'-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3'(SEQ ID NO:21)と5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’(SEQ ID NO:22);マウス18S RNA、5'-CGGACAGGATTGACAGATTG-3'(SEQ ID NO:23)と5’-CAAATCGCTCCACCAACTAA-3’(SEQ ID NO:24);マウスRyr2、5’-ATGGCTTTAAGGCACAGCG-3’(SEQ ID NO:25)と5’-CAGAGCCCGAATCATCCAGC-3’(SEQ ID NO:26);マウスFoxP3、5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3'(SEQ ID NO:27)と5'-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3'(SEQ ID NO:28);マウスｍ－カルハイン、5'-GGTCGCATGAGAGAGCCATC-3'（SEQ ID NO：49）と5'-CCCCGAGTTTTGCTGGAGTA -3'（SEQ ID NO：50）;マウスItpr1、5'-CGTTTTGAGTTTGAAGGCGTTT-3'(SEQ ID NO:29)と5'-CATCTTGCGCCAATTCCCG-3'(SEQ ID NO:30);マウスOrai1、5'-GATCGGCCAGAGTTACTCCG-3'(SEQ ID NO:31)と5'-TGGGTAGTCATGGTCTGTGTC-3'(SEQ ID NO:32);マウスOrai3、5’-GGCTACCTGGACCTTATGGG-3'(SEQ ID NO:33)と5'-GCAGGCACTAAATGTGACC-3'(SEQ ID NO:34);マウスTrpm15'-ATCCGAGTCTCCTACGACACC-3'(SEQ ID NO:35)と5'-CAGTTTGGACTGCATCTCGAA-3’(SEQ ID NO:36);マウスTrpm4、5'-GGACTGCACACAGGCATTG-3'(SEQ ID NO:37)と5'-GTACCTTGCGGGGAATGAGC-3’(SEQ ID NO:38);マウスTrpv2、5'-TGCTGAGGTGAACAAAGGAAAG-3'(SEQ ID NO:39)と5'-TCAAACCGATTTGGGTCCTGT-3'(SEQ ID NO:40);マウスCacnb1、5′-GGCAGCAAGTTATCTCCCAG-3'(SEQ ID NO:41)と5'-CCACAGGATGATTGGCGTCTT-3'(SEQ ID NO:42); HSV-1 gB、5’-AACGCGACGCACATCAAG-3'(SEQ ID NO:43)と5'-CTGGTACGCGATCAGAAAGC-3'(SEQ ID NO:44); HSV-1 LAT、5'-GGGTGGGCTCGTGTTACAG-3'(SEQ ID NO:45)と5'-GGACGGGTAAGTAACAGAGTCTCTA-3’(SEQ ID NO:46)。
【手続補正15】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0102】
３、ＦｏｘＰ３過剰発現実験のステップ
ベクターを構築し、Ｔｒｅｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマー５’－ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）と逆方向プライマー５’－ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）のプライマーを用いて、ＦｏｘＰ３をＰＣＲ増幅した。増幅した断片をゲルで精製し、消化（ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ）し、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙプラスミドにクローニングし、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙ構築体を得た。上記ノックダウン方法に従って、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙレンチウイルスの生産とＦｏｘＰ３過剰発現細胞株の精製を行った。ＲＴ－ＰＣＲによりＦｏｘＰ３発現を検証した。
ベクターを構築し、Ｔｒｅｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマー５’－ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）と逆方向プライマー５’－ＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）のプライマーを用いて、ＦｏｘＰ３をＰＣＲ増幅した。増幅した断片をゲルで精製し、消化（ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ）し、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙプラスミドにクローニングし、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙ構築体を得た。上記ノックダウン方法に従って、ｐＬＶＸ－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ｍｃｈｅｒｒｙレンチウイルスの生産とＦｏｘＰ３過剰発現細胞株の精製を行った。ＲＴ－ＰＣＲによりＦｏｘＰ３発現を検証した。
【手続補正16】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
４、フローサイトメトリー法検出のステップ
細胞とＦｃブロッカー（ＣＤ１６／３２抗体；２．４Ｇ２）を５分間インキュベートした後、表面抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３）とともに室温で遮光下１５分間放置した。ＦｏｘＰ３細胞を染色し、表面が染色された細胞をＦｏｘＰ３／転写因子固定／透過緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに３０分間インキュベートし、次に、抗体とともに２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアで制御されたＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりサンプルを解析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによってデータを解析した。
細胞とＦｃブロッカー（ＣＤ１６／３２抗体；２．４Ｇ２）を５分間インキュベートした後、表面抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３）とともに室温で遮光下１５分間放置した。ＦｏｘＰ３細胞を染色し、表面が染色された細胞をＦｏｘＰ３／転写因子固定／透過緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに３０分間インキュベートし、次に、抗体とともに２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアで制御されたＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりサンプルを解析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアによってデータを解析した。
【手続補正17】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0104】
５、ＥＬＩＳＡ検出ステップ
ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βを検出するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で１０６個の精製Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを刺激した。７２時間後、上清を収集した。結合力の高い９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩インキュベートした。乾燥後、２％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックした。洗浄後、ウェル毎に希釈細胞上清を１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。再度ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中）で洗浄し、その後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩＬ－１０及びＴＧＦ－β検出抗体により室温で０．５時間インキュベートした。ＴＭＢ（１００ｍＬ／ウェル）を加えて、１０分間室温で、暗所でインキュベートし、その後、ウェルあたりＨ２ＳＯ４（５０μＬ、１Ｍ）を加えて反応を停止した。停止直後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、４５０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取った。
ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βを検出するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で１０６個の精製Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを刺激した。７２時間後、上清を収集した。結合力の高い９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩インキュベートした。乾燥後、２％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックした。洗浄後、ウェル毎に希釈細胞上清を１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。再度ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＢＳ中）で洗浄し、その後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩＬ－１０及びＴＧＦ－β検出抗体により室温で０．５時間インキュベートした。ＴＭＢ（１００ｍＬ／ウェル）を加えて、１０分間室温で、暗所でインキュベートし、その後、ウェルあたりＨ２ＳＯ４（５０μＬ、１Ｍ）を加えて反応を停止した。停止直後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、４５０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を読み取った。
【手続補正18】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0105】
６、カルシウムイメージング
非接着細胞について、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖとＡ２０細胞を２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。洗浄後、室温でサンドイッチのような自作室に取り付けられたポリ－Ｌ－リジンコーティング（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理された円形ガラス板に細胞を接着させた。１５分間後、緩衝液で余分な非接着細胞を流し落とした。接着細胞について、ガラス板に成長したＮＩＨ－３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞を２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。その後、２０倍（開口数：０．８）又は４０倍（開口数：１．２）Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－７３顕微鏡に測定室を載せた。特に断らない限り、６ｓの間隔でＣａ２＋振動を２０分間記録した。抑制実験においては、Ｆｌｕｏ－４標識細胞を暗所でＪＴＶ５１９（Ｓｉｇｍａ）により３０分間室温処理し、その後、画像を取得した。刺激性実験では、１ｓの間隔でＣａ２＋振動を５分間記録した。画像を取得し始め、５０～８０ｓ後、４－ＣｍＣ（Ｓｉｇｍａ）緩衝液を加えて細胞内カルシウムの放出を誘導した。Ｃａ２＋含有又は不含のフェノールレッドフリーＨＢＳＳ培地で実験を行った。電荷結合素子カメラ（ＯＲＣＡ－ＡＧ、浜松社製）を用いて４８８ｎｍレーザにより励起された４６８～５５０ｎｍの放射シグナルを記録した。データ収集はＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ３．０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により制御された。ＩｍａｇｅＪを用いて単一細胞の平均蛍光強度の経時的変化を記録し、１フレーム目の蛍光強度に従って標準化した（Ｆｌｕｏ－４ Ｆ ／ Ｆ０）。単一細胞のＣａ２＋振動ピーク値を表示し、Ｃａ２＋振動強度の標準偏差をＭｅａｎ±ＳＥＭとして算出した。
非接着細胞について、Ｔｒｅｇ、ＴｃｏｎｖとＡ２０細胞を２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。洗浄後、室温でサンドイッチのような自作室に取り付けられたポリ－Ｌ－リジンコーティング（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理された円形ガラス板に細胞を接着させた。１５分間後、緩衝液で余分な非接着細胞を流し落とした。接着細胞について、ガラス板に成長したＮＩＨ－３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞を２ｍＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により３７℃で１時間染色した。その後、２０倍（開口数：０．８）又は４０倍（開口数：１．２）Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－７３顕微鏡に測定室を載せた。特に断らない限り、６ｓの間隔でＣａ２＋振動を２０分間記録した。抑制実験においては、Ｆｌｕｏ－４標識細胞を暗所でＪＴＶ５１９（Ｓｉｇｍａ）により３０分間室温処理し、その後、画像を取得した。刺激性実験では、１ｓの間隔でＣａ２＋振動を５分間記録した。画像を取得し始め、５０～８０ｓ後、４－ＣｍＣ（Ｓｉｇｍａ）緩衝液を加えて細胞内カルシウムの放出を誘導した。Ｃａ２＋含有又は不含のフェノールレッドフリーＨＢＳＳ培地で実験を行った。電荷結合素子カメラ（ＯＲＣＡ－ＡＧ、浜松社製）を用いて４８８ｎｍレーザにより励起された４６８～５５０ｎｍの放射シグナルを記録した。データ収集はＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ３．０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により制御された。ＩｍａｇｅＪを用いて単一細胞の平均蛍光強度の経時的変化を記録し、１フレーム目の蛍光強度に従って標準化した（Ｆｌｕｏ－４ Ｆ ／ Ｆ０）。単一細胞のＣａ２＋振動ピーク値を表示し、Ｃａ２＋振動強度の標準偏差をＭｅａｎ±ＳＥＭとして算出した。
【手続補正19】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0106】
７、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）ステップ
細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１３Ｂ）で溶解した。細胞溶解液を遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１２）を用いて総タンパク質を定量した。３ＸＳＤＳ注入緩衝液と混合して５分間沸騰した後、７．５％ＰＡＧＥゲル（ＥｐｉＺｙｍｅ，ＰＧ１１１）にタンパク質を注入して分離した。次に、タンパク質をＮＣ膜に転写し、示した１次抗体と２次抗体を用いてイムノブロットを行った。最後に、Ｓｕｐｅｒ ＥＣＬ検出試薬（Ｙｅａｓｅｎ，３６２０８ＥＳ７６）を用いて免疫染色のバンドを検出した。
細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１３Ｂ）で溶解した。細胞溶解液を遠心分離し、上清を収集した。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｐ００１２）を用いて総タンパク質を定量した。３ＸＳＤＳ注入緩衝液と混合して５分間沸騰した後、７．５％ＰＡＧＥゲル（ＥｐｉＺｙｍｅ，ＰＧ１１１）にタンパク質を注入して分離した。次に、タンパク質をＮＣ膜に転写し、示した１次抗体と２次抗体を用いてイムノブロットを行った。最後に、Ｓｕｐｅｒ ＥＣＬ検出試薬（Ｙｅａｓｅｎ，３６２０８ＥＳ７６）を用いて免疫染色のバンドを検出した。
【手続補正20】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0107】
８、実験結果
ＣＤ４－ｃｒｅのＴｃｏｎｖでは、Ｒｙｒ２をノックダウンすることができる（図２６）。また、Ｔｃｏｎｖ細胞Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞は、マウスの体重や発育速度を含め、その基礎機能が影響を受けなかった。さらに、胸腺細胞と末梢血のＣＤ４＋、ＣＤ８＋マーカー細胞の分布はＷＴマウスとほぼ同じであった（フローサイトメトリー検出結果は図２７参照）。脾臓においてＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合も一定に維持された（図２８）。Ｔｒｅｇ機能に関連する可能性のある表面マーカーも、ＷＴ Ｔｃｏｎｖと比較して変化しなかった（フローサイトメトリー検出及びＥＬＩＳＡ検出の結果は図２９を参照）。Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖは基礎Ｃａ２＋レベルが低下し、振動強度が低下している（カルシウムイメージング結果は図１１及び図３０を参照）。Ｒｙｒ２－／－ＴｃｏｎｖにおけるＣＭＡＣ消化は、未処理Ｔｃｏｎｖと比較して、Ｔｒｅｇと同様のレベルまで低減されている（図３１）。Ｔｒｅｇと同様に、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖでは、ｔａｌｉｎ消化が大量に欠損している（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果は図３２を参照）。
ＣＤ４－ｃｒｅのＴｃｏｎｖでは、Ｒｙｒ２をノックダウンすることができる（図２６）。また、Ｔｃｏｎｖ細胞Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ細胞は、マウスの体重や発育速度を含め、その基礎機能が影響を受けなかった。さらに、胸腺細胞と末梢血のＣＤ４＋、ＣＤ８＋マーカー細胞の分布はＷＴマウスとほぼ同じであった（フローサイトメトリー検出結果は図２７参照）。脾臓においてＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合も一定に維持された（図２８）。Ｔｒｅｇ機能に関連する可能性のある表面マーカーも、ＷＴ Ｔｃｏｎｖと比較して変化しなかった（フローサイトメトリー検出及びＥＬＩＳＡ検出の結果は図２９を参照）。Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖは基礎Ｃａ２＋レベルが低下し、振動強度が低下している（カルシウムイメージング結果は図１１及び図３０を参照）。Ｒｙｒ２－／－ＴｃｏｎｖにおけるＣＭＡＣ消化は、未処理Ｔｃｏｎｖと比較して、Ｔｒｅｇと同様のレベルまで低減されている（図３１）。Ｔｒｅｇと同様に、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖでは、ｔａｌｉｎ消化が大量に欠損している（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果は図３２を参照）。
【手続補正21】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0111】
さらに、ＦｏｘＰ３過剰発現群とＦｏｘＰ３未過剰発現群を含め、上記領域をクローニングし、このプロモータの制御下で、３Ｔ３及びＲｅｎｃａ細胞に発現するルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現ベクターを構築した。図２１より、ＦｏｘＰ３の過剰発現がルシフェラーゼ活性を低下させていることが分かった。一連の切断実験では、Ｒｙｒ２プロモーターのＴＳＳ部位の後～３００ｂｐ～５００ｂｐの所定領域までＦｏｘｐ３抑制活性を段階的に縮小した。
【手続補正22】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0112】
最後に、ＦｏｘＰ３結合部位を２回繰り返し出現したＧＣＡＧＧＧＧ配列に決定した。これら２つの部位に突然変異が生じた場合、ＦｏｘＰ３の過剰発現はルシフェラーゼを抑制する能力を失い、これら２つの部位がプロモータのＦｏｘＰ３の結合部位であることが示された（図２３）。また、ルシフェラーゼ活性抑制がＲｙｒ２が媒介するＣａ
２＋
活性と関連していることをさらに確認するために、本実施例では、４－ＣｍＣ誘導ＦｏｘＰ３過剰発現群とＦｏｘＰ３未過剰発現群における３Ｔ３及びＡ２０細胞のカルシウムシグナルを検出した。図２４は、ＦｏｘＰ３トランスフェクション細胞においてＦｏｘＰ３の作用により４－ＣｍＣが駆動するＣａ２＋シグナルははるかに小さいことを示している。Ｒｙｒ２は確かにＦｏｘＰ３の直接制御を受け、Ｔ細胞の活性を抑制する重要なチャネルであることを示した。
【手続補正23】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0113】
ここでは、本実施例に係るデュアルルシフェラーゼレポータアッセイのステップは文献Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3（Sethら，Cell 122，669-682，2005）とLFA-1-mediated adhesion is regulated by cytoskeletal restraint and by a Ca2+-dependent protease, calpain（Stewartら，J Cell Biol 140，699-707，1998）を参照する。簡便に、合成された１５００ｂｐの完全なプロモーター配列と切断された各プロモーター配列をそれぞれルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３にサブクローニングして、各マウスＲｙｒ２レポータプラスミドを構築した。配列決定によりプラスミドが正しいことを確認した。Ｎｅｏｆｅｃｔ（ＫＳ２０００）を用いて、３００ｎｇ Ｒｙｒ２レポータ遺伝子及び海腎ルシフェラーゼレポータ遺伝子プラスミドを１．２５×１０５ ＦｏｘＰ３過剰発現３Ｔ３、ＦｏｘＰ３過剰発現Ｒｅｎｃａ又はＦｏｘＰ３過剰発現Ａ２０細胞に共トランスフェクションした。トランスフェクション３６時間後、細胞溶解物を調製し、デュアルルシフェラーゼレポータアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて解析した。
【手続補正24】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0114】
実施例３：Ｔ細胞におけるＣａ２＋レベルに対するＲｙｒ２抑制の影響
１、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインの違い及びＤＣ結合能力
Ｔｒｅｇにおけるｍ－カルパイン活性は低いので、本実施例では、その発現レベルが低いか否かを判定しようとした。また、ｍ－カルパインは細胞内のＣａ２＋の可用性により調整されるので、休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇのＣ２＋シグナルを検出した。
１、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインの違い及びＤＣ結合能力
Ｔｒｅｇにおけるｍ－カルパイン活性は低いので、本実施例では、その発現レベルが低いか否かを判定しようとした。また、ｍ－カルパインは細胞内のＣａ２＋の可用性により調整されるので、休止状態でのＴｃｏｎｖ及びＴｒｅｇのＣ２＋シグナルを検出した。
【手続補正25】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0115】
その結果、図１Ａ、Ｂ、Ｃに示すように、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇにおけるｍ－カルパインはタンパク質又はｍＲＮＡレベルのいずれにも違いがなかった。基礎Ｃａ２＋振動はＴｃｏｎｖを含む多くの免疫細胞に共通の特徴であるが、この活性はＴｒｅｇにはほとんど存在しない。すなわち、個々のＴｒｅｇはＣａ２＋振動のピーク値を示さない（図２及び図３）。Ｃａ２＋振動強度の標準偏差は、Ｔｒｅｇでは、Ｔｃｏｎｖよりも有意に小さくなった（図４）。すなわち、ｍ－カルパイン活性はＴｒｅｇでブロックされ、これにより、ＴｒｅｇはＬＦＡ－１／ｉｃａｍ－１に基づく非常に強いＤＣ結合能力を有する。
【手続補正26】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0117】
ここで、ＧＥＯデータベース解析ステップは以下の通りである。ＮＣＢＩ ＧＥＯデータベース（ＧＳＥ７１１６２）に発表されている３つのＲＮＡ－Ｓｅｑ研究に基づき、タンパク質を発現レベルによって分類した。カルシウム関連タンパク質をＧＯ解析によりランク付けした。これらのタンパク質の機能はＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）に基づいて注釈されている。タンパク質をＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの発現の違いの度合いによってランク付けした。
【手続補正27】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0118】
Ｒｙｒ受容体はＥＲ膜（Ｒｙｒ１、２及び３）上に位置し、ヒトＰＢＭＣにおいて、Ｒｙｒ１はＣＤ１９＋集団で、Ｒｙｒ２はＣＤ３＋部分で発現する。ＴｒｅｇにおけるＲｙｒ２の発現量が低いことを確認するために、刺激因子４－ＣＭＣを用いてＣＭＡＣ（カルパイン基質）の消化率を観察した。その結果、図７に示すように、４－ＣＭＣはカルパイン活性を完全に誘導することができる一方、Ｔｒｅｇはこの処理に敏感ではなく、ＴｒｅｇではＲｙｒ２の発現が低下していることが確認された。
【手続補正28】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0122】
Ｒｙｒ２抑制がＴｃｏｎｖにおけるＣａ２＋レベル低下の原因であることを遺伝学的に確認するために、本実施例では、ｓｈＲＮＡ干渉によるＲｙｒ２ノックダウンを行った。Ｒｙｒ２特異的ｓｈＲＮＡノックダウンＲｙｒ２の転写ｍＲＮＡレベルとノックダウンされていないＲｙｒ２の転写ｍＲＮＡレベルとを比較した（図１０）ところ、Ｒｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖでは、対照群に比べ、細胞基礎Ｃａ２＋レベルは著しく低下し、Ｃａ２＋ピーク値が低下し、Ｃａ２＋変化の標準偏差も低くなった（図１１及び図１２）。ＪＴＶ５１９処理されたＲｙｒ２抑制による低ｍ－カルパイン基質消化処理の結果と一致した（図１３）。
【手続補正29】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0123】
ここで、カルパイン活性の測定ステップ。カルパイン活性を測定するために、２０μＭカルパイン基質ＣＭＡＣ（ｔ－ＢＯＣ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む２００μＬの培地で、１０５個のＴ細胞を暗所で室温インキュベートした。５分間のインキュベーション後、１％ＰＦＡ（Ｂｉｏｓｈａｒｐ）で反応を停止し、細胞を直ちに氷上に置いた。ＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータによりＨｏｅｃｈｓｔブルーチャネルを介して消化した基質から発せられる蛍光シグナルをカルパイン活性とした。いずれの実験においても、阻害剤ＪＴＶ５１９を実験３０分前に添加し、活性化剤４－ＣｍＣはＣＭＡＣと同時に添加した。
【手続補正30】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0125】
さらに、処理ＴｃｏｎｖとＤＣの結合向上により抗原特異的Ｔｃｏｎｖが同じＤＣと安定的に結合できないことを確認するために、３細胞結合力解析を行った（参照文献：Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy（Chen et al.，The Journal of experimental medicine，2017））。その結果、Ｔｒｅｇ及びＲｙｒ２がノックダウンしたＴｃｏｎｖは、ＯＴＩＩとＯＶＡを担持したＤＣとの結合強度を有意に抑制することが示された（図１５）。したがって、単細胞レベルでは、Ｒｙｒ２活性が低下したＴｃｏｎｖは、ＴｃｏｎｖとＤＣとの相互作用を阻止する能力がＴｒｅｇ機能と同等であることが確認された。次に、典型的なＤＣ媒介抗原提示実験において、ｓｈＲＮＡ処理ＴｃｏｎｖのＯＴＩＩ分裂抑制能力をテストした。その結果、図１６に示すように、これらの細胞はＯＴＩＩの分裂減少においてはＴｒｅｇのような能力を示した。Ｒｙｒ２と同様に作用する可能性のある他の潜在的なＣａ２＋チャネル活動の調査では、ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞でのこれらの活性を低下させるｓｈＲＮＡが産生され、ＳＣＦＳにより、これらのｓｈＲＮＡとＤＣとの結合がテストされた。その結果、図１７、図１８に示すように、Ｒｙｒ２以外のノックダウンは処理Ｔ細胞とＤＣとの結合を向上させず、Ｒｙｒ２の特別な関与が確認された。
【手続補正31】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0126】
ここで、インビトロ抑制実験ステップ：精製ＯＴＩＩ Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）で染色した。１０４個の脾臓細胞に由来する精製ＤＣ、２×１０４個のＯＴＩＩ Ｔ細胞、２×１０Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ又はＲｙｒ２ノックダウンＴｃｏｎｖ、及び２μＭ ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドを混合して、９６ウェルＵ底プレートで培養し、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータを用いてＣＦＳＥの希釈を検出してＯＴＩＩ Ｔ細胞の増殖を評価した。（１－増殖％）から抑制パーセンテージを計算し、無Ｔｒｅｇ群を０％抑制、Ｔｒｅｇ群を１００％抑制とすることでデータの正規化を行った。
【手続補正32】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0127】
３、フォーススペクトルによるＲｙｒ２欠損時のＤＣとの結合状況の確認
同様に、Ｒｙｒ２が欠損するとＤＣとの結合が増加することが、フォーススペクトルからも示された（図３３）。また、３細胞力学解析では、ＤＣとＴ細胞との接触を干渉する能力も増強された（図３４）。さらに重要なこととして、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖは、抗原陽性樹状細胞刺激によるＯＴＩＩ増幅を抑制する能力がＴｒｅｇと類似している（図３５）。したがって、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２を制限するだけで、インビトロでＤＣ媒介性Ｔ細胞の活性化を抑制する能力を得ることができる。図４６はＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の免疫抑制作用を示している。
同様に、Ｒｙｒ２が欠損するとＤＣとの結合が増加することが、フォーススペクトルからも示された（図３３）。また、３細胞力学解析では、ＤＣとＴ細胞との接触を干渉する能力も増強された（図３４）。さらに重要なこととして、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖは、抗原陽性樹状細胞刺激によるＯＴＩＩ増幅を抑制する能力がＴｒｅｇと類似している（図３５）。したがって、Ｔｃｏｎｖ細胞中のＲｙｒ２を制限するだけで、インビトロでＤＣ媒介性Ｔ細胞の活性化を抑制する能力を得ることができる。図４６はＲｙｒ２を抑制したＴ細胞の免疫抑制作用を示している。
【手続補正33】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0128】
ここで、原子間力顕微鏡による単細胞フォーススペクトルの検出ステップは前述した通りである。ＪＰＫ ＣｅｌｌＨｅｓｉｏｎ装置を用いて実験した（参照文献：Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity（Flachら，Nat Med 17，479-487，2011）と文献：Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy（Chenら，The Journal of experimental medicine，2017））。簡単に言えば、２細胞系におけるＴ－ＤＣ接着力を測定するために、ＤＣ２．４細胞を未処理ガラスシートで培養した。Ｔ細胞を２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２で一晩処理した。ガラスシートをＡＦＭと互換性があるチャンバに移し、マシンテーブルに取り付けた。クリーンなカンチレバーをＣｅｌｌＴａｋ（ＢＤ）でコーティングし、単一のＴ細胞をカンチレバー先端に貼り付けた。単一のＴ細胞を担持したＡＦＭカンチレバーを降下させ、単一のＤＣと接触させ、１５ｓ相互作用させた後、２つの細胞が完全に分離するまで上に移動させた。これにより、フォーススペクトル曲線を取得した。その後、このプロセスを繰り返した。３細胞系では、実験前に、ガラスシート上で培養したＤＣ２．４細胞を１００μｇ／ｍＬの可溶性ＯＶＡタンパク質で４ｈ処理した。ＩＬ－２処理Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ細胞を１０μＭ ＣＦＳＥで染色し、ＤＣ２．４細胞をこれらの蛍光標識Ｔｒｅｇ又はＴｃｏｎｖ細胞と約２０分間インキュベートした後、標識していないＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞を加えた。次に、ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞を有するカンチレバー先端を、紫外フラッシュランプで認識したＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ細胞－ＤＣ対にアプローチした。Ｔｒｅｇ／ＴＴｃｏｎｖ接触媒介ＯＴ－ＩＩ－ＤＣ接着抑制を解析した。各サイクルで、単一のＴ細胞を担持したＡＦＭカンチレバーは、最初の力曲線が生成されるまで０．５～２μｍ分降下した。その後、カンチレバー上のＴ細胞をＤＣと１５ｓ相互作用させ、２つの細胞が完全に分離するまでカンチレバーを上に移動させた。機械を入れたインキュベータを３７℃、５％ＣＯ２の条件に置いた。全ての実験で、少なくとも１４個の力曲線がさらなる解析のために収集された。ＪＰＫ画像処理ソフトウェアを使用して力曲線を処理した。円形で飽満な細胞のみを選択してＡＦＭ検出を行った。各ＳＣＦＳ実験では、１つのＴ－ＤＣ対を使用して、数分以内に上下サイクルごとの力の読み取り値を生成した。各条件には、少なくとも３対のデータが使用された。
【手続補正34】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0131】
２、結果
ヘルペス感染モデルでは、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射すると、ＨＳＶ－１の増幅を促進し、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖの輸注は、ウイルス（ＰＢＳ）単独接種と比較してＨＳＶ－１のｐｆｕが増加しなかった（図３６参照）。次に、同じモデルをＤＴＨ応答の検出に使用した。ＨＳＶ－１を第２回接種した後、感作させた足底は腫脹したが、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した足底の厚さの増加はいずれも減少したが、対照群では、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖとウイルス単独接種（ＰＢＳ）はいずれも厚さを減少しなかった（図３７、図３８）。
ヘルペス感染モデルでは、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射すると、ＨＳＶ－１の増幅を促進し、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖの輸注は、ウイルス（ＰＢＳ）単独接種と比較してＨＳＶ－１のｐｆｕが増加しなかった（図３６参照）。次に、同じモデルをＤＴＨ応答の検出に使用した。ＨＳＶ－１を第２回接種した後、感作させた足底は腫脹したが、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した足底の厚さの増加はいずれも減少したが、対照群では、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖとウイルス単独接種（ＰＢＳ）はいずれも厚さを減少しなかった（図３７、図３８）。
【手続補正35】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0132】
実施例６：マウス喘息モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、喘息モデルの作製及び実験ステップ
オボアルブミン（ＯＶＡ）で気道炎症を誘発した。０日目と１４日目に、ＯＶＡとミョウバンのアジュバント（１００μｇ＋４ｍｇ）を２回ｉ．ｐ注射し、マウスを感作させた。２１、２３、及び２５日目に、舌後部に気管内ＯＶＡショックを繰り返した。１０６個のＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＰＢＳをｉ．ｖ養子移入した。３２日目に、安楽死マウスの気管支肺胞洗液における免疫細胞浸潤の分析と肺組織の病理解析を行った。
１、喘息モデルの作製及び実験ステップ
オボアルブミン（ＯＶＡ）で気道炎症を誘発した。０日目と１４日目に、ＯＶＡとミョウバンのアジュバント（１００μｇ＋４ｍｇ）を２回ｉ．ｐ注射し、マウスを感作させた。２１、２３、及び２５日目に、舌後部に気管内ＯＶＡショックを繰り返した。１０６個のＴｒｅｇ、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＰＢＳをｉ．ｖ養子移入した。３２日目に、安楽死マウスの気管支肺胞洗液における免疫細胞浸潤の分析と肺組織の病理解析を行った。
【手続補正36】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0133】
２、Ｈ＆Ｅ染色ステップ
肺組織を全て４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
肺組織を全て４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【手続補正37】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0134】
３、実験結果
図４０Ａの感作スケジュールに従って作製したＯＶＡ感作喘息モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの輸注はＢＡＬＦ細胞数の制限に同等の効果を示し、リンパ球と好酸球の減少度も同様であった（図３９）。組織学的検査を図４０Ｂに示す。
図４０Ａの感作スケジュールに従って作製したＯＶＡ感作喘息モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの輸注はＢＡＬＦ細胞数の制限に同等の効果を示し、リンパ球と好酸球の減少度も同様であった（図３９）。組織学的検査を図４０Ｂに示す。
【手続補正38】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0135】
実施例７：マウス結腸炎モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、ＤＳＳ誘導結腸炎（ＩＢＤ）モデルの作製及び実験ステップ
ＤＳＳ誘導マウス実験性結腸炎モデルは、文献Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell Expansion in the Intestine（Tangら，Cell Host Microbe 18，183-197，2015）とMyeloid-Derived Suppressor Cells Are Controlled by Regulatory T Cells via TGF-beta during Murine Colitis（Leeら，Cell Rep 17，3219-3232，2016）を参照することができる。簡単に言えば、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３×１０６個のＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、野生型Ｔｃｏｎｖ又はＴｒｅｇをｉ．ｖ養子移入した。翌日、４％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）水を７日間投与して結腸炎（Ｙｅａｓｏｎ，ＭＷ＝３６,０００～５０,０００ Ｄａ）を誘導した後、通常の飲み水に変えて飼育を続けた。正常対照マウスにＰＢＳを投与し、通常の飲料水を与えた。１０日目にマウスを殺し、結腸を解剖して結腸の長さを測定した。その後、結腸を４％ＰＦＡにて４℃で４８時間固定化し、その後のＨ＆Ｅ染色に用いた。３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＳＣＡＮ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）にて結腸切片を観察した。１群あたり１１～１８匹のマウスとした。
１、ＤＳＳ誘導結腸炎（ＩＢＤ）モデルの作製及び実験ステップ
ＤＳＳ誘導マウス実験性結腸炎モデルは、文献Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell Expansion in the Intestine（Tangら，Cell Host Microbe 18，183-197，2015）とMyeloid-Derived Suppressor Cells Are Controlled by Regulatory T Cells via TGF-beta during Murine Colitis（Leeら，Cell Rep 17，3219-3232，2016）を参照することができる。簡単に言えば、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３×１０６個のＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ、野生型Ｔｃｏｎｖ又はＴｒｅｇをｉ．ｖ養子移入した。翌日、４％ＤＳＳ（ｗ／ｖ）水を７日間投与して結腸炎（Ｙｅａｓｏｎ，ＭＷ＝３６,０００～５０,０００ Ｄａ）を誘導した後、通常の飲み水に変えて飼育を続けた。正常対照マウスにＰＢＳを投与し、通常の飲料水を与えた。１０日目にマウスを殺し、結腸を解剖して結腸の長さを測定した。その後、結腸を４％ＰＦＡにて４℃で４８時間固定化し、その後のＨ＆Ｅ染色に用いた。３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ＳＣＡＮ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）にて結腸切片を観察した。１群あたり１１～１８匹のマウスとした。
【手続補正39】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0136】
２、Ｈ＆Ｅ組織学的ステップ
結腸組織を４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
結腸組織を４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【手続補正40】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0137】
３、実験結果
図４２Ａの誘導スケジュールに従って作製した結腸炎モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した群では、結腸の長さが短縮した。Ｔｒｅｇ群とＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖは、いずれもＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖと比較して結腸損傷を軽減することができた（図４１、図４２）。
図４２Ａの誘導スケジュールに従って作製した結腸炎モデルでは、ＴｒｅｇとＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した群では、結腸の長さが短縮した。Ｔｒｅｇ群とＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖは、いずれもＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖと比較して結腸損傷を軽減することができた（図４１、図４２）。
【手続補正41】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0138】
実施例８：マウス結腸癌モデルにおけるＲｙｒ２－／－Ｔ細胞の作用
１、結腸癌腫瘍モデルの作製及び実験ステップ
文献Oxidative stress controls regulatory T cell apoptosis and suppressor activity and PD-L1-blockade resistance in tumor（Majら，Nat Immunol 18，1332-1341，2017））を参照して移植した腫瘍マウスモデルを作製した。簡単に言えば、ＭＣ３８結腸癌細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、５×１０５個のＭＣ３８細胞と１０６個のＴ細胞を混合した後、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部皮下に注射した。腫瘍接種後７日目から４～５日毎にノギスを用いて腫瘍の大きさを計量した。体積は（長さ×幅×幅）／２として計算される。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ。１群あたり１０匹のマウスとした。
１、結腸癌腫瘍モデルの作製及び実験ステップ
文献Oxidative stress controls regulatory T cell apoptosis and suppressor activity and PD-L1-blockade resistance in tumor（Majら，Nat Immunol 18，1332-1341，2017））を参照して移植した腫瘍マウスモデルを作製した。簡単に言えば、ＭＣ３８結腸癌細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、５×１０５個のＭＣ３８細胞と１０６個のＴ細胞を混合した後、６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部皮下に注射した。腫瘍接種後７日目から４～５日毎にノギスを用いて腫瘍の大きさを計量した。体積は（長さ×幅×幅）／２として計算される。第１群：ＭＣ３８＋ＰＢＳ、第２群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、第３群：ＭＣ３８＋Ｔｒｅｇ、第４群：ＭＣ３８＋Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖ。１群あたり１０匹のマウスとした。
【手続補正42】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0139】
２、実験結果
ＭＣ３８腫瘍モデルでは、Ｔｒｅｇ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの注入は腫瘍の成長を促進したが、ＰＢＳ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群には有意な効果は認められなかった（図４３）。
ＭＣ３８腫瘍モデルでは、Ｔｒｅｇ及びＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖの注入は腫瘍の成長を促進したが、ＰＢＳ及びＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ群には有意な効果は認められなかった（図４３）。
【手続補正43】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0142】
２、Ｈ＆Ｅ組織学的ステップ
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
皮膚、耳、肝臓やその他の組織を全て４℃で４％のホルマリン中に固定化した。その後、パラフィンにサンプルを包埋した。厚さ５～６μｍの薄片に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【手続補正44】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0143】
３、実験結果
皮癬罹患マウス（ＦｏｘＰ３－／－、Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを生後２～３日に注射した。予想された通り、ＰＢＳ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは、生後２～４週間で全て死亡した。一方、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した全てのマウスは少なくとも２０週間生存した（図４４、図２５）。また、６カ月経過観察後も、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した皮癬罹患マウスの死亡や明らかな異常は認められなかった。
皮癬罹患マウス（ＦｏｘＰ３－／－、Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＰＢＳ、Ｔｒｅｇ、Ｒｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖ、又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを生後２～３日に注射した。予想された通り、ＰＢＳ又はＲｙｒ２＋／＋Ｔｃｏｎｖを注射したマウスは、生後２～４週間で全て死亡した。一方、Ｔｒｅｇ又はＲｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した全てのマウスは少なくとも２０週間生存した（図４４、図２５）。また、６カ月経過観察後も、Ｒｙｒ２－／－Ｔｃｏｎｖを注射した皮癬罹患マウスの死亡や明らかな異常は認められなかった。
【手続補正45】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0145】
以上より、Ｒｙｒ２－／－Ｔ及びＴｒｅｇ細胞は、マウスヘルペス感染モデル、喘息モデル、結腸炎モデル及び結腸癌モデルでは、機能的に同じ効果を示し、しかも、皮癬マウスでも免疫機能を回復させることができた。つまり、Ｔｒｅｇが免疫調節作用を有することが知られているいくつかの疾患では、Ｒｙｒ２－／－Ｔは同等の作用を果たすことが示されている。
【手続補正46】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【手続補正47】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図31】
【手続補正48】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図32】
【外国語明細書】