特開 2024-105476 単一特異性及び二重特異性抗体抗－ＴＭＥＦＦ２抗体並びにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024105476

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】単一特異性及び二重特異性抗体抗－ＴＭＥＦＦ２抗体並びにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/22 20060101AFI20240730BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240730BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20240730BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20240730BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K16/22

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K1/14

C07K16/46

C12N15/62 Z

A61K39/395 D

A61K39/395 E

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K45/00

A61K47/55

A61K47/68

A61P35/00

A61P43/00 121

C07K16/28

C07K16/22 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024076617

(22)【出願日】2024-05-09

(62)【分割の表示】P 2020565399の分割

【原出願日】2019-05-21

(31)【優先権主張番号】62/675,957

(32)【優先日】2018-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(72)【発明者】

【氏名】クーパー，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】アーンスト，ロビン

(72)【発明者】

【氏名】ガネサン，ラジクマール

(72)【発明者】

【氏名】ケイン，コリーン

(72)【発明者】

【氏名】ラッセル，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】シンハ，サンジャヤ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェンカタラマニ，サチャデヴィ

(72)【発明者】

【氏名】ウ，シェン－ジウン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】単一特異性及び多重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに該抗体を産生及び使用する方法を提供する。
【解決手段】ＴＭＥＦＦ２の、特定の配列を有する膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が、二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体が、ＣＤ３、所望によりＣＤ３イプシロンに結合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗
体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記抗体又は前記その抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関し
て、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、
又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む参照抗体と競合する、請求項１に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその
抗原結合断片。

【請求項3】

前記抗体又は前記その抗原結合断片が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番
号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の
前記膜近位領域に結合する、請求項１又は２に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は
その抗原結合断片。

【請求項4】

ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領
域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１～３のいずれか一項
に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．４×１０^－９Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ
_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合し、前記Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０
の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される、請求項１～４のいずれか一
項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９
Ｍの前記Ｋ_ＤでＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項５に記載の単離された
抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

ＶＨ３＿３－２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１－６９（配列番号５４）に由来する
重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離
された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号５６）に由来す
る軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、請求項７に記載の単離された抗ＴＭＥＦ
Ｆ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

ａ）それぞれ配列番号５３のＶＨ３＿３－２３及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１、
ｂ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５６のＶＫＩＩＩ＿Ａ２７
、又は
ｃ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１
に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、請求項８に記載の単離
された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその
抗原結合断片。

【請求項11】

前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求
項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片
。

【請求項12】

ａ）配列番号３２の重鎖（ＨＣ）及び配列番号３５の軽鎖（ＬＣ）、
ｂ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
ｄ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
ｅ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、又は
ｆ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、請求項１１に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項13】

ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項14】

ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項15】

ａ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項16】

ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項17】

ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項18】

ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項19】

前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離され
た抗ＴＭＥＦＦ２抗体。

【請求項20】

前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離され
た抗ＴＭＥＦＦ２抗体。

【請求項21】

前記抗体が、ＣＤ３、所望によりＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１９又は２０に
記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片と、
医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項23】

１つ又は２つ以上の異種分子にコンジュゲートした、請求項１～２０のいずれか一項に
記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【請求項24】

ａ）請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断
片をコードし、
ｂ）配列番号２５、２６、２７、８７、若しくは８９の前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体ＶＨ、
及び／又は配列番号２８、２９、３０、３１、８８、若しくは９０のＶＬをコードし、
ｃ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、
５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１０２のポリ
ヌクレオチド配列を含む、
単離されたポリヌクレオチド。

【請求項25】

請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項26】

請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項27】

請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を
産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養
することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、方法。

【請求項28】

ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方
法であって、治療に有効な量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２２に記載の医薬組成物を、前記対
象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。

【請求項29】

前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの
任意の組み合わせである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与さ
れる、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又は
それらの任意の組み合わせである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。

【請求項34】

請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。

【請求項35】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項36】

前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の前記膜近位領域に結合する、請求項３５
に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項37】

前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関して、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、
又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、参照抗体と競合する、請求項３５又は３６に記載の単離された二重特異性抗Ｔ
ＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項38】

前記抗体が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧ
ＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する
、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗Ｃ
Ｄ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項39】

前記抗体が、約０．４×１０^－９Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近
位領域に結合し、前記Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモ
ン共鳴を使用して測定される、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の単離された二重
特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項40】

前記抗体が、約０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９Ｍの前記Ｋ_ＤでヒトＴＭＥ
ＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項３９に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥ
ＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項41】

前記第１のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／
抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項42】

前記第２のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５、又は
ｂ）それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含む、請求項４１に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその
抗原結合断片。

【請求項43】

前記第１のドメインが、
ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ
２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項44】

前記第２のドメインが、
ａ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｂ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬ、
を含む、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ
２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項45】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２
２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３２の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号
７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項46】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２
２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７
９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項47】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７
７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項48】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７
９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項49】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２
４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７
７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項50】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２
４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７
９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項51】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２
２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７
７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項52】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２
２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７
９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項53】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８
６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７
７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項54】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８
６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列
番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９の
ＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項55】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８
６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６
５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７
７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項56】

ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含
む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって
、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８
６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７
３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を
含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記
第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、
配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７
９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項57】

前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求
項３５～５６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗
体又はその抗原結合断片。

【請求項58】

前記抗体が、ＨＣ１、ＨＣ２、又はＨＣ１及びＨＣ２に、位置２３４でアラニン、位置
２３５でアラニン、又は位置２３４でアラニン及び位置２３５でアラニンを含み、残基の
付番が、ＥＵインデックスに従う、請求項３５～５７のいずれか一項に記載の単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項59】

前記抗体が、ＨＣ１及びＨＣ２に、位置２２８でプロリンを含み、残基の付番が、ＥＵ
インデックスに従う、請求項３５～５８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項60】

前記抗体が、ＨＣ１に位置４０５でフェニルアラニン及び位置４０９でアルギニン、並
びにＨＣ２に位置４０５でロイシン及び位置４０９でリジンを含む、請求項３５～５９の
いずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片。

【請求項61】

請求項３５～６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又
はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項62】

ａ）請求項４５～５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗
体若しくはその抗原結合断片をコードするか、又は
ｂ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、
５０、５１、５２、８０、８１、８２、８３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、
１０１、及び１０２のポリヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。

【請求項63】

請求項６２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項64】

請求項６３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項65】

二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であっ
て、前記抗体が発現する条件下で請求項６４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿
主細胞によって産生された前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又は前記その抗
原結合断片を回収及び精製することと、を含む、方法。

【請求項66】

請求項４５～５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又
はその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ）２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＴＭＥＦＦ２
抗体、並びに２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＣＤ３
抗体を約１：１の混合物のモル比で組み合わせることと、
ｂ）前記混合物に還元剤を導入することと、
ｃ）前記混合物を約９０分～約６時間インキュベートすることと、
ｄ）前記還元剤を除去することと、
ｅ）ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を含む前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗Ｃ
Ｄ３抗体又はその抗原結合断片を精製することと、
を含む、方法。

【請求項67】

前記還元剤が、２－メルカプトエタノールアミン（２－ＭＥＡ）である、請求項６６に
記載の方法。

【請求項68】

前記２－ＭＥＡが、約２５ｍＭ～約７５ｍＭの濃度で存在する、請求項６７に記載の方
法。

【請求項69】

前記インキュベートする工程が、約２５℃～約３７℃の温度で実施される、請求項６６
～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方
法であって、治療に有効な量の請求項４５～６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗Ｔ
ＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項６１に記載の医薬組成
物を、前記対象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。

【請求項71】

前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの
任意の組み合わせである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤
と組み合わせて投与される、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又は
それらの任意の組み合わせである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

請求項４５～５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又
はその抗原結合断片に結合する、抗イディオタイプ抗体。

【請求項76】

請求項４５～５６のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。

【請求項77】

療法に使用するための、請求項４５～５６のいずれか一項に記載の単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項78】

ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための、請求項４５～５６のいずれか一項に記載
の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。

【請求項79】

ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療用薬品の製造のための、請求項４５～６０のいずれか一項に
記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片の使用
。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により
本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１９年１月
３１日に作成され、ＪＢＩ５１６０ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、１４４，
１５６バイトのサイズである。

【0002】

（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、単一特異性及び多重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに
記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

前立腺癌は、世界中の男性において２番目に最も一般的な癌であり、癌関連死では６番
目に多い原因である。世界的には、およそ１，１００，０００人の新たな症例及び３００
，０００人の死亡例が毎年存在し、これは全癌死の４％を構成する。男性の６人に１人が
生涯のうちにこの疾患を有すると診断されるであろうと推定されている。前立腺癌リスク
は、年齢と強く相関している：約４分の３の症例が、６５歳を超える男性に生じ、７０～
７４歳の症例が最も多い。５０代の男性のうちの約半数及び８０歳の男性のうちの８０％
が、前立腺における癌の組織学的証拠を有することが、検死データから推定される。早期
のステージでは、５年生存率はほぼ１００％である。しかしながら、癌が転移すると、５
年生存率は２８％まで低下し、進行したステージの前立腺癌の有効な治療に対する必要性
が未だ存在する。

【0004】

精巣アンドロゲン遮断療法は、通常、（患者のうちの８０％に）疾患の安定化又は退行
を生じる。前立腺癌の現在の治療方法としては、手術、放射線療法、及びホルモン療法が
挙げられる。一般的には、癌ワクチンであるシプリューセルＴ（sipuleucel-T）、放射性
治療剤（塩化ラジウム２２３など）、二次ホルモン療法（アビラテロン又はエンザルタミ
ドなど）、及び／又は化学療法（ドセタキセル及びカバジタキセル）が、順番にホルモン
療法に加えられる。これらの治療の各々は、癌の成長を数ヶ月遅らせ、疾患により生じる
症状を和らげることができるが、最終的には転移性前立腺癌の進行は進む。ホルモン療法
によるテストステロンレベルの低下にもかかわらず前立腺癌が成長すると、治療選択肢が
限定される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、前立腺癌を治療するための更なる療法を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0007】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領
域への結合に関して、配列番号２５の重鎖可変領域（heavy chain variable region、Ｖ
Ｈ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）、配列番
号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配
列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ
、又は配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0008】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮ
ＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８
）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗
原結合断片を提供する。

【0009】

本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖及び軽鎖相補性決定領域配列を有する
、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。

【0010】

本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を有す
る、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。

【0011】

本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖及び軽鎖配列を有する、単離された抗
ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。

【0012】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びに／又は
配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0013】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びに／又は
配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0014】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びに／又は
配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0015】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びに／又は
配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0016】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びに／又は
配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0017】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２
、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びに／又は
配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体
又はその抗原結合断片を提供する。

【0018】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容さ
れる担体と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0019】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードする単離さ
れたポリヌクレオチドであって、配列番号２５、２６、２７、８７、若しくは８９の抗Ｔ
ＭＥＦＦ２抗体ＶＨ及び／若しくは配列番号２８、２９、３０、３１、８８、若しくは９
０のＶＬをコードするか、又は配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４
６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１
０１、又は１０２のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供す
る。

【0020】

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0021】

本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0022】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であ
って、抗体又は抗原結合断片が発現する条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、
宿主細胞によって産生された抗体又はその抗原結合断片を回収することと、を含む、方法
を提供する。

【0023】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性
癌を治療する方法であって、治療に有効な量の本発明の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体若
しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性
癌を治療することを含む、方法を提供する。

【0024】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を提供す
る。

【0025】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を含む、キットを提
供する。

【0026】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片を提供する。

【0027】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離
された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0028】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重
鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び
配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ
及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８
９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0029】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２上で配列番号５７又は配列番号５８のエピトープに
結合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を
提供する。

【0030】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
の第１の重鎖（first heavy chain、ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（first light
chain、ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（second heavy chain、ＨＣ２）、及び配
列番号７７の第２の軽鎖（second light chain、ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性
抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0031】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0032】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0033】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0034】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0035】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0036】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0037】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0038】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0039】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0040】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３
のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0041】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３
のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0042】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断
片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。

【0043】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断
片をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。

【0044】

本発明はまた、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を産生する方法であって、抗
体が発現する条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を回収及び精製すること
と、を含む、方法を提供する。

【0045】

本発明はまた、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生
する方法であって、
２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＴＭＥＦＦ２抗体
、並びに２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＣＤ３抗体
を約１：１の混合物のモル比で組み合わせることと、
混合物に還元剤を導入することと、
混合物を約９０分～約６時間インキュベートすることと、
還元剤を除去することと、
ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体
又はその抗原結合断片を精製することと、を含む、方法を提供する。

【0046】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性
癌を治療する方法であって、治療に有効な量の本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗Ｃ
Ｄ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を対象に投与して、ＴＭＥ
ＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。

【0047】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断
片に結合する、抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0048】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットを提
供する。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって同定される。

【図2】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって同定される。

【図3】選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体によって、カスパーゼ３／７活性を増加させることによって測定した、経時的なＬｎＣａＰ細胞の殺傷を示す。

【図4】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体による、腫瘍移植の経時的な平均腫瘍体積の低減を示す。

【図5A】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ９３で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。

【図5B】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。

【図6】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスの確立されたＬＮＣａＰ異種移植片における、ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６の有効性を示す。

【図7】ＴＭＣＢ１３２の投与に応答したＬｎＣａＰ前立腺癌細胞における、Ｔ細胞活性化を示す。

【図8】ＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介性細胞障害を示す。

【図9】Ｔ細胞ヒト化マウスにおけるＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全て
の刊行物は、完全に記載されているかのように参照により、本明細書に組み込まれる。

【0051】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を
意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用さ
れる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されて
いるものと同じ意味を有する。

【0052】

本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験
を実施するために使用することができるが、例示的な材料及び方法を本明細書に記載する
。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。

【0053】

本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、
及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の
指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又
は３つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。

【0054】

文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、明細書及び特許請求の範囲を通して、単
語「含む（comprise）」、「含む（comprising）」などは、排他的又は排外的な意味とは
対照的に、包括的な意味で、即ち、「～を含むがこれらに限定されない」という意味で解
釈されるべきである。

【0055】

「特異的結合」、「特異的に結合する」、又は「特異的な結合」、又は「結合する」と
は、抗体が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合
することを指す。典型的には、抗体は、約５×１０^－８Ｍ以下、例えば約１×１０^－９Ｍ
以下、約１×１０^－１０Ｍ以下、約１×１０^－１１Ｍ以下、又は約１×１０^－１２Ｍ以下
の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、非特異性抗原（例えば
、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関しては、典型的には、そのＫ_Ｄより少なくとも１００
倍小さいＫ_Ｄで結合する。解離定数は、本明細書に記載のプロトコルを使用して測定する
ことができる。しかしながら、抗原又は抗原内のエピトープに結合する抗体は、他の関連
抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニ
クイザル、ｃｙｎｏ）、又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍ
ｐ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。
単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに結合するが、二重特異性抗体は、
２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに結合する。

【0056】

「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗
体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性など
の多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並び
に必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された
形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互
接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例え
ばＩｇＭ）からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメイン
ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領
域及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域
は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity dete
rmining regions、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶ
Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２
、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ
セグメントで構成される。

【0057】

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体の領域である。ＣＤＲは、Ｋａ
ｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１３２：２１１－５０）（
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔ
ｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ
．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７），ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａ
ｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７
）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ Ｂｍｏｌ
Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５）などの、様々な記述を使用して定義することができる
。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ
ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏ
ｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０
９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭ
ＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉ
ｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを
描写することができる。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣ
ＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」とい
う用語は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、
ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のうちのいずれかによって定義されるＣＤＲを含む。

【0058】

免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、
即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇ
Ｇは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４
として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミ
ノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、即ち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）
のうちの一方に割り当てることができる。

【0059】

「抗原結合断片」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子の一部を意味する。抗原結
合断片は合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子操作された
ポリペプチドであってもよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ
ｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄ
Ａｂ）、サメ可変性ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－Ｆ
Ｒ４部分などの、抗体のＣＤＲを模倣したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤ
Ｒ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又は
ＬＣＤＲ３が挙げられる。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し
、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別
の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子
間で対合し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又
は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４０
０１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２
／０１０４７号に記載されている。

【0060】

「モノクローナル抗体」とは、抗体分子の実質的に均質な母集団（即ち、母集団を含む
個別の抗体が、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又は、アミノ酸異性化若しくはア
ミド分解、メチオニン酸化若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻
訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である）から入手される抗体を意味す
る。モノクローナル抗体は典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性
モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体
は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性
であってもよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってもよく、一価、二価、又は
多価であってもよい。

【0061】

「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムの他の成分から実
質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な母集団（例えば、合成ポリヌクレオ
チド又は抗体などのタンパク質）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供され
たタンパク質を指す。「単離抗体」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含
まない抗体を意味し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された抗体を包
含する。

【0062】

「ヒト化抗体」とは、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つの
フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フ
レームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロ
ブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。

【0063】

「ヒト抗体」とは、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適
化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。
ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部分を含む場合、定常領域もヒト免疫グロブリン配
列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編
成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来
する」重鎖及び軽鎖可変領域を含む。そのような例示的な系は、ファージ上に提示された
ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を担持するマウ
ス又はラットなどの、非ヒトトランスジェニック動物である。「ヒト抗体」は、典型的に
は、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン座位を得るために使用する系間の違い、フレームワ
ーク若しくはＣＤＲ、又はその両方への、体細胞変異の導入又は意図的な置換の導入に起
因する、ヒトで発現する免疫グロブリンと比較したときの、アミノ酸の違いを含む。典型
的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン
遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８
０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同
一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，
（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載のヒトフレームワーク配
列分析により誘導される、コンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、Ｓｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際公開
第２００９／０８５４６２号に記載の、ファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝
子ライブラリに組み込まれた、合成ＨＣＤＲ３を含み得る。

【0064】

少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれ
ない。

【0065】

「組み換え」は、異なる源からのセグメントを接合して組み換えＤＮＡ、抗体、又はタ
ンパク質を産生するときに、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたＤ
ＮＡ、抗体、及び他のタンパク質を指す。

【0066】

「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的に
は、アミノ酸又は多糖側鎖などの化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の
表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープ
は、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成
され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タ
ンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。

【0067】

「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特
異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサ
ル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、若しく
はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの他の種からの、同じ抗原（ホモログ）に対する
交差反応性を有し得るか、又は２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープ
に結合し得る。

【0068】

「多重特異性」とは、同じ抗原内の２つ又は３つ以上の異なる抗原、又は２つ又は３つ
以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を意味する。多重特異性抗体は、他の関
連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カ
ニクイザル、ｃｙｎｏ）、若しくはＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの他の種からの
、同じ抗原（ホモログ）に対する交差反応性を有し得るか、又は２つ又は３つ以上の異な
る抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。

【0069】

「変異体」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又
は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又は
ポリヌクレオチドを指す。

【0070】

「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる
、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製
することができる生物学的要素を利用して生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物
）及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機
能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含む。
ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれ
らのハイブリッドであり得る。

【0071】

「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコード
されるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利
用することができるベクターを指す。

【0072】

「ポリヌクレオチド」とは、糖－ホスフェート主鎖により共有結合した、又は他の等価
な共有化学反応により結合した、ヌクレオチド鎖を含む合成分子を意味する。ｃＤＮＡは
、例示的な合成ポリヌクレオチドである。

【0073】

「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチ
ドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸か
らなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。

【0074】

「ＴＭＥＦＦ２」は、ＥＧＦ様、及びトモレグリン２とも呼ばれる２つのフォリスタチ
ン様ドメイン２を有する、ヒト膜貫通タンパク質を指す。完全長ヒトＴＭＥＦＦ２のアミ
ノ酸配列は、配列番号１に示される。ＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメインは、配列番号２に示
され、これは全長ＴＭＥＦＦ２の残基４０～３７４に及ぶ。ＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン
は、３つの異なるサブドメイン、Ｋａｚａｌ様１（残基８５～１３７）、Ｋａｚａｌ様２
（残基１７６～２２９）、及びＥＧＦドメイン（残基２６１～３０１）を保有する。ＴＭ
ＥＦＦ２ ＥＧＦドメインは、配列番号３に示される。ＴＭＥＦＦ２「膜近位領域」は、
ＥＧＦドメイン及びＮ－Ｃ末端リンカー領域（例えば、配列番号１の全長ヒトＴＭＥＦＦ
２の残基２３０～３２０）を包含する、配列番号１１０のＴＭＥＦＦ２ ｒｅｑｉｏｎを
指す。本明細書のタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は
、非ヒト種からのものとして明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペ
プチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「
ＴＭＥＦＦ２」は、非ヒト種、例えば、「マウスＴＭＥＦＦ２」又は「サルＴＭＥＦＦ２
」などからのものとして指定されない限り、ヒトＴＭＥＦＦ２を意味する。

【0075】

配列番号１（完全長ヒトＴＭＥＦＦ２）
ＭＶＬＷＥＳＰＲＱＣＳＳＷＴＬＣＥＧＦＣＷＬＬＬＬＰＶＭＬＬＩＶＡＲＰＶＫＬＡ
ＡＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤ
ＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹ
ＶＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡ
ＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴ
ＳＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣ
ＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩ
ＥＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧ
ＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥ
ＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣ
ＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶＬ
ＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨ
ＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ

【0076】

配列番号２（ヒトＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメイン）
ＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥ
ＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹＶ
ＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡ
ＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴＳ
ＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧ
ＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩＥ
ＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲ
ＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭ ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱ
ＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶ
ＬＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ

【0077】

ＴＭＥＦＦ２ ＥＧＦドメイン 配列番号３
ＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨ
ＣＥ

【0078】

ＴＭＥＦＦ２膜近位領域 配列番号１１０
ＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨ
ＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ
ＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶ

【0079】

「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体の一部として
Ｔ細胞上で発現され、２つ又は４つの受容体鎖：ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ
３ゼータ、及びＣＤ３ガンマの会合から形成されたホモ二量体又はヘテロ二量体からなる
抗原を指す。ヒトＣＤ３イプシロンは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本明細書のタ
ンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種からのも
のとして明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパ
ク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＣＤ３」は、非ヒト
種、例えば、「マウスＣＤ３」「サルＣＤ３」などからのものとして指定されない限り、
ヒトＣＤ３を意味する。

【0080】

配列番号４（ヒトＣＤ３イプシロン）
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳ
ＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱ
ＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹ
ＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥ
ＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡ
ＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰ
ＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ

【0081】

配列番号５（ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメイン）
ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨ
ＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬ
ＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮ
ＣＭＥＭＤ

【0082】

「二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体」、ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３抗体、ＴＭＥＦ
Ｆ２ｘＣＤ３抗体などは、ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合する抗体を指す。

【0083】

「～と組み合わせて」とは、２つ又は３つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単
剤として同時に、又は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。

【0084】

「ＴＭＥＦＦ２陽性癌」は、ＴＭＥＦＦ２タンパク質の測定可能なレベルを示す癌組織
又は癌細胞を指す。ＴＭＥＦＦ２タンパク質のレベルは、生細胞又は溶解細胞で、例えば
ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、又は放射免疫アッセイを使用する周知
のアッセイを使用して、測定することができる。

【0085】

「サンプル」は、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体
内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。例示的なサンプルは、血液、血清及
び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織
及び器官の粘膜分泌液、膣分泌液、非固形腫瘍に関連するものなどの腹水、胸膜腔、心膜
腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄によって回収された流体、対象又は
生物源、例えば、細胞及び器官の培養培地（細胞又は器官の馴化培地を含む）、洗浄液な
どと接触した液体溶液、組織生検、穿刺吸引、又は外科的に切除された腫瘍組織のもので
ある。

【0086】

「癌細胞」又は「腫瘍細胞」とは、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかに
おいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換
細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。
形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核
酸の取り込みにより発生し得るが、自然に又は発癌物質に対する曝露に続いて発生し、そ
れにより内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／癌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖ
ｉｖｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、
病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウス
などの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉ
ｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。

【0087】

「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であるこ
とを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち測定システムの制限事項に
ある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細
書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う
１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれかのより高い範囲内であることを意味する。

【0088】

「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、例えば、非ヒト霊
長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び
非哺乳動物などの全ての脊椎動物を包含する。記載されている場合を除き、「患者」及び
「対象」という用語は、互換的に使用される。

【0089】

「治療する」、又は「治療」とは、治療的処置、及び予防的（prophylactic）若しくは
予防的（preventative）手段の両方を意味し、対象は、望ましくない生理学的変化又は疾
患を予防する、又は低減させる（少なくする）予定である。有益な又は所望の臨床結果と
しては、検出可能であろうと又は検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減
、安定した（即ち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善
又は緩和、及び寛解（部分的であろうと又は全体的であろうと）が挙げられる。「治療」
はまた、対象が治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延
長させることを意味し得る。治療を要する者には、既に状態若しくは疾患を有している者
、及び、状態若しくは疾患を有しやすい者、又は状態若しくは疾患を予防しようとする者
が含まれる。

【0090】

「治療に有効な量」とは、必要な用量及び期間で所望の治療結果を得るための有効量を
指す。治療に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体に
おいて所望の応答を引き出す１つの治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々で
あってもよい。有効な１つの治療薬、又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、
例えば、患者の改善された健康が挙げられる。

【0091】

本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に
指定されない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｕ
ｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）（１９９１）に記載のＥＵインデックス
に従う。

【0092】

従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを、表１に示すとおりに本明細書で使用する
。

【0093】

【表1】

【0094】

物質の組成
本発明は、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体の
抗原結合断片を含む多重特異性抗体、及び二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又は
その抗原結合断片を提供する。本発明は、本発明の抗体をコードするポリペプチド及びポ
リヌクレオチド、又はそれらの相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及
び使用する方法を提供する。

【0095】

抗ＴＭＥＦＦ２抗体
ＴＭＥＦＦ２発現は、他の正常組織と比較して、前立腺組織及び前立腺腺癌に著しく豊
富である。膜状ＴＭＥＦＦ２は、疾患進行全体を通じて保持され、抗腫瘍療法の可能な標
的として機能する。ＴＭＥＦＦ２は、プロテアーゼにより切断され、抗原の可溶性形態を
生じることが既知である。本発明では、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に導かれる抗体を生成
して、膜ＴＭＥＦＦ２への抗体結合を最大化し、得られた抗体の可溶性ＴＭＥＦＦ２形態
への結合を生じる可能性を最小限にした。

【0096】

本発明は、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する本
発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、細胞によって内在化されない。いかなる特定の理論にも束
縛されることを望むものではないが、非内在化抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、内在化抗ＴＭＥＦ
Ｆ２抗体と比較すると、ＴＭＥＦＦ２の内在化及び分解の欠如から生じる抗体エフェクタ
ー機能によって媒介される、発癌に対して改善された効果を有することを予想することが
できる。

【0097】

「膜近位領域に結合する」とは、水素／重水素交換（Ｈ／Ｄ交換）を使用して同定され
る抗体エピトープ残基の９０％が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域内に存在することを意味す
る。エピトープ残基は、Ｈ／Ｄ交換を通じた重水素化レベルの少なくとも５％の違いで、
試験抗体によって保護されるものである。例示的なそのような抗体は、本明細書に記載の
ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ５６５、ＴＭＥＢ７６２、
及びＴＭＥＢ７５７である。

【0098】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、残
基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹ
ＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。残基ＨＧＫＣＥＨＳ
ＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）内に結合する例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥ
Ｂ５７０である。残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内に結合す
る例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥＢ６７５である。ＴＭＥＢ６７５変異体ＴＭＥ
Ｂ７６２及びＴＭＥＢ７５７もまた、残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番
号５８）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合することが予想される。

【0099】

Ｈ／Ｄ交換アッセイでは、組み換えにより発現するＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤを、抗体の存
在又は非存在下の重水素化水中で所定の時間にわたってインキュベートし、抗体によって
保護されていない交換可能な水素原子での重水素組み込みが生じ、タンパク質のプロテア
ーゼ消化及びＬＣ－ＭＳを使用するペプチド断片の分析が続く。Ｈ／Ｄ交換アッセイは、
既知のプロトコルを使用して実施することができる。例示的なプロトコルを実施例５に記
載する。

【0100】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又
はその抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重
鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び
配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ
及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８
９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ
２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0101】

ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への試験抗体の結合に関する参照抗体との競合は、周知の方
法を使用してインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識参照抗体の存在下
での、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ－エステル標識試験抗体の、ＴＭＥＦＦ２
の膜近位領域への結合は、ＥＬＩＳＡによって評価することができるか、又はＢｉａｃｏ
ｒｅ分析若しくはフローサイトメトリーを使用して競合を実証することができる。試験抗
体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への参照抗体の結合を８５％以上、例えば、９０％以上
、又は９５％以上阻害すると、試験抗体は、ＴＭＥＦＦ２への結合に関して参照抗体と競
合する。

【0102】

本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、の重鎖相補性決定領域（
heavy chain complementarity determining region 1、ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣ
ＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region 1、Ｌ
ＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はそ
の抗原結合断片を提供する。

【0103】

いくつかの実施形態では、本発明の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断
片は、約０．４×１０^－９Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に
結合し、Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用
して測定される。

【0104】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約
０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９ＭのＫ_ＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合
する。

【0105】

ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を使用する実験
によって決定することができる。例示的な方法は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａ
ｃｏｒｅ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、若しくは当業者に既知の競合的結
合アッセイを利用する。抗体のＴＭＥＦＦ２に対する親和性についての測定値は、異なる
条件（例えば、容量オスモル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に変動し得る。したが
って、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ｏｎ、及びＫ_ｏｆｆ）の測定は
、典型的には、本明細書に記載の標準的な条件及び緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行
われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを使用した親和性測定での
内部エラー（標準偏差（standard deviation、ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に
、典型的な検出範囲内で測定した場合、５～３３％の範囲内であり得ることが当業者には
分かるであろう。したがって、Ｋ_Ｄ値を指すとき、「約」という用語は、アッセイにおけ
る典型的な標準偏差を反映する。例えば、Ｋ_Ｄが１×１０^－９Ｍの場合の典型的なＳＤは
、±０．３３×１０^－９Ｍ以下である。

【0106】

本発明はまた、ＶＨ３＿３－２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１－６９（配列番号５
４）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域
に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0107】

本発明はまた、ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号
５６）に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領
域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0108】

本発明はまた、配列番号５３のＶＨ３＿３－２３及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１に
それぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜
近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0109】

本発明はまた、配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５６のＶＫＩＩＩ＿Ａ２
７にそれぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２
の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供す
る。

【0110】

本発明はまた、配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１に
それぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜
近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0111】

特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗
体は、本明細書で述べるトランスジェニックマウス、ラット、若しくはニワトリから、又
はファージディスプレイライブラリからなどの、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使
用する系から得られる抗体を指す。生殖系列配列に由来する特定のフレームワークを含む
抗体は、例えば自然発生する体細胞変異又は意図的な置換に起因する、その由来である配
列と比較した際のアミノ酸の違いを含み得る。

【0112】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0113】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号４２のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0115】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４６のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号４９のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0117】

本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0118】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号４３のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0120】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＬＣは、配列番号５０のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0122】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0123】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４１のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号４４のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0125】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣを含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４８のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＬＣは、配列番号５１のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0127】

本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0128】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号４５のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0130】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣを含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＬＣは、配列番号５２のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0132】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0133】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号９５のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号９６のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0135】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣを含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号９７のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＬＣは、配列番号９８のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0137】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離さ
れた抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0138】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号９９のポリヌクレオチドによってコードさ
れ、ＶＬは、配列番号１００のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0140】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配
列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣを含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号１０１のポリヌクレオチドによってコード
され、ＬＣは、配列番号１０２のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0142】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、多
重特異性抗体である。

【0143】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、二
重特異性抗体である。

【0144】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合
断片は、Ｔ細胞抗原に結合する。

【0145】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合
断片は、ＣＤ３に結合する。

【0146】

いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合
断片は、ＣＤ３イプシロンに結合する。

【0147】

本発明の例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、ＨＣ、及び
ＬＣ配列は、表５～１２に示される。

【0148】

実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変ドメイ
ンの対を含むが、当業者であれば、代替的な実施形態が単一の重鎖又は軽鎖可変ドメイン
を含み得ることを認識するであろう。単一可変ドメインを使用して、ＴＭＥＦＦ２に結合
することができる２ドメイン特異性抗原結合断片を形成することができる可変ドメインに
ついて、スクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第１９
９２／０１０４７号に開示されている階層的二重コンビナトリアルアプローチ（hierarch
ical dual combinatorial approach）を使用したファージディスプレイスクリーニング法
によって行うことができる。このアプローチでは、ＶＨ鎖又はＶＬ鎖のいずれかのクロー
ンを含む個別のコロニーを使用して、他方の鎖（ＶＬ又はＶＨ）をコードしているクロー
ンの完全なライブラリに感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを既知の方法
及び本明細書に記載されるものを使用してファージディスプレイ技術に従って選択する。
したがって、個々のＶＨ及びＶＬポリペプチド鎖は、国際公開第１９９２／０１０４７号
に開示の方法を使用して、加えて抗ＴＭＥＦＦ２抗体を同定するのに有用である。

【0149】

相同抗体
表９に示されるＶＨ又はＶＬアミノ酸配列を含む本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその
抗原結合断片の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、変異体は、親抗体と比較する
と、相同抗体が、ＴＭＥＦＦ２への匹敵する結合又は改善された安定性などの機能特性を
保持しているか又は改善された機能特性を有する限り、ＶＨ及び／又はＶＬに１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換
を含み得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本発明のＶＨ又はＶＬアミノ酸配
列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％又は９９％であり得る。

【0150】

いくつかの実施形態では、本発明の相同抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、
約０．４×１０^－９Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し
、Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測
定される。

【0151】

いくつかの実施形態では、本発明の相同抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、
約０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９ＭのＫ_ＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結
合する。

【0152】

本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0153】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0154】

本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0155】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0156】

本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0157】

本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む、単離された抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、
所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は
１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提
供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。

【0158】

本発明はまた、配列番号２５、２６、２７、８７、又は８９のＶＨに少なくとも９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一
のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断
片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号からの配列の変異は全く存在しない
。

【0159】

本発明はまた、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、又は９０のＶＬに少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９
％同一のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原
結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号からの配列の変異は全く存在
しない。

【0160】

選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図１に示さ
れ、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図２に示
される。ＶＨ及びＶＬ鎖は、各行の先頭の配列番号によって同定される。抗体間で異なる
残基位置は、ＶＨ及び／又はＶＬにおいて置換可能な部位である。例えば、置換は、（配
列番号２５に基づく付番の）配列番号２５、２７、８７、及び８９のＶＨにおける残基位
置１４、２０、５４、５６、５９、７６、８２、８４、９３、１０７で行うことができる
。同様に、配列番号２８、３０、８８、及び９０のＶＬにおける残基位置１、９５、及び
１０７で置換を行ってもよい。行われ得る例示的な置換は、保存的アミノ酸置換、又は各
抗ＴＭＥＦＦ２抗体における対応する残基位置に存在するアミノ酸残基による置換である
。

【0161】

２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入す
る必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一
の位置の数の関数である（即ち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。

【0162】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．
０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍ
ｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４：１１－１７（１９８８））を使用して、ＰＡＭ１
２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して
決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソ
フトウェアパッケージ（ｗｗｗ．Ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み
込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））を使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリック
ス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップ重み（gap weight）１６、
１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み（length weight）１、２、３、４、
５、又は６を使用して、決定することができる。

【0163】

保存的修飾を有する抗体
本発明はまた、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列を含むＶＨと、ＬＣＤＲ
１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含むＶＬとを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗
体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ配列のうちの１つ又は２つ以上が、本明細書に
記載の抗体（例えば、表５～１２に示される抗体）に基づく特定のアミノ酸配列、又はそ
の保存的修飾を含み、抗体が、親抗体の所望の機能特性を保持している、単離された抗Ｔ
ＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0164】

いくつかの実施形態では、保存的修飾を有する抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断
片は、約０．４×１０^－９Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に
結合し、Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用
して測定される。

【0165】

いくつかの実施形態では、保存的修飾を有する抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断
片は、約０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９ＭのＫ_ＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領
域に結合する。

【0166】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれら
の保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。

【0167】

本発明はまた、それぞれ配列番号配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３の
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並び
にそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供す
る。

【0168】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれら
の保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。

【0169】

本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれら
の保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。

【0170】

本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれら
の保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。

【0171】

本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0172】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0173】

本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0174】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0175】

本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0176】

本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びにそれらの保存的修
飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0177】

「保存的修飾」とは、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも
変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び
欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基
に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に
定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例
えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロ
シン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒ
スチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、
β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイ
ン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング変異誘発につい
て以前に説明されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃ
ｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７、Ｓａｓａｋｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）、ポリペプチド
内のいずれの天然残基もアラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は
、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によ
って行うことができる。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン（Ｎ
ＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコ
ドン）を使用して生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性
に関して、本明細書に記載のアッセイを使用して試験することができる。

【0178】

免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
「免疫コンジュゲート」は、１つ又は２つ以上の異種分子（複数可）とコンジュゲート
させた本発明の抗体を指す。

【0179】

本発明はまた、異種分子とコンジュゲートした本発明の単離された抗体又はその抗原結
合断片を含む、免疫複合体を提供する。

【0180】

いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識である。

【0181】

検出可能な標識にコンジュゲートした本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は
、多様なサンプルにおけるＴＭＥＦＦ２の発現を評価するために使用することができる。
検出可能な標識としては、本発明の単離された抗体又はその抗原結合断にコンジュゲート
すると、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段を介してその後検
出可能になる組成物が挙げられる。

【0182】

例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド
粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される
）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオ
ロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート（scintillates）、アビ
ジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒス
チジン、Ｎｉ^２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ
、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、
及び比色基質が挙げられる。

【0183】

検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的に
シグナルを発し得る。他の場合では、検出可能な標識は、外場によって刺激された後、シ
グナルを放出する。

【0184】

例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジト
ロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、^３Ｈ、^１１Ｃ、
^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５５Ｃｏ、^５７Ｃｏ、^６０Ｃｏ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ
、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｓｒ、
^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^１１５Ｉｎ、^１２３１、^１２４１、^１２５Ｉ、^１３１１、^２１
１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２６Ｒａ、^２２５Ａｃ、及び^２２７Ａ
ｃが挙げられる。

【0185】

例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカ
ンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバ
ルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原
子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イ
ットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、
ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム
原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原
子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、
レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウ
ム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、
セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、
ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウ
ム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウ
ム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、
アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインス
タイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はロー
レンシウム原子である。

【0186】

好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６
８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの
任意の市販の色素が挙げられる。

【0187】

好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothioc
yante、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジン、ローダミン、テキサスレッド
、ＣｙＤｙｅｓ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（
例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）
、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシ
アニン及びアミノスチリル染料である。

【0188】

検出可能な標識とコンジュゲートした、本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片
は、造影剤として使用することができる。

【0189】

本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は、既知の方法を使用して検出可能な標
識とコンジュゲートさせることができる。

【0190】

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。

【0191】

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本発明の抗体又はその
抗原結合断片とコンジュゲートする。

【0192】

検出可能な標識は、既知の方法を使用して、本発明の抗体又はその抗原結合断に、直接
又は間接的に連結することができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であ
り、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘
導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１
，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の
誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシ
アナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ
）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四
酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プ
ロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体
（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジ
ルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例え
ば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例
えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート
（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば
、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げら
れる。好適なペプチドリンカーは周知である。

【0193】

二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片を提供する。

【0194】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された二重特異性
抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。いずれの特定の理論に
も束縛されることを望むものではないが、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する二重特異
性抗体は、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺傷の媒介に、より効果的であり得る。

【0195】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインとを含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重
鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び
配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ
及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８
９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0196】

いくつかの実施形態では、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はそ
の抗原結合断片は、約０．４×１０^－９Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＴＭＥＦＦ２の膜近
位領域に結合し、Ｋ_Ｄが、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共
鳴を使用して測定される。

【0197】

いくつかの実施形態では、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はそ
の抗原結合断片は、約０．１×１０^－１０Ｍ～約０．４×１０^－９ＭのＫ_ＤでＴＭＥＦＦ
２の膜近位領域に結合する。

【0198】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、第１のドメインが、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、ｏ
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ
２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0199】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、第２のドメインが、
それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５、又は
それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ
２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0200】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、第１のドメインが、
配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥ
ＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0201】

本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合
断片であって、第２のドメインが、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬ、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥ
ＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0202】

いくつかの実施形態では、第２のドメインは、配列番号５９のＶＨ及び配列番号１１１
のＶＬを含む。

【0203】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の
重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0204】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0205】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0206】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0207】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0208】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0209】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0210】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0211】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号９２の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の
重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0212】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0213】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３
の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号９４の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の
重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0214】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結
合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号９３のＨ
Ｃ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む
、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する
。

【0215】

操作及び修飾された抗体
本発明の抗体又はその抗原結合断片を更に操作して、親抗体と比較すると類似の又は変
化した特性を有する修飾抗体を生成することができる。本発明の抗体では、ＶＨ、ＶＬ、
ＶＨ及びＶＬ、定常領域、重鎖フレームワーク、軽鎖フレームワーク、又は６つのＣＤＲ
のうちのいずれか若しくは全てが操作されてもよい。

【0216】

本発明の抗体は、ＣＤＲグラフト化により操作されてもよい。本発明の抗体の１つ又は
２つ以上のＣＤＲ配列を、異なるフレームワーク配列にグラフト化してもよい。ＣＤＲグ
ラフト化は、既知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して行うことができる。

【0217】

使用され得るフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータ
ベース又は刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可
変ドメイン遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ及びコードタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録
商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．Ｉｍｇｔ．ｏｒｇに見出すことができる。
本発明の抗体の既存のフレームワーク配列を置き換えるために使用することができるフレ
ームワーク配列は、ＶＨ若しくはＶＬの全長、又はＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４
の長さにわたって親可変ドメインに対して最も高い同一性パーセント（％）を示すもので
あってもよい。更に、好適なフレームワークは、更に、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１及びＣＤ
Ｒ２の長さ、又は同一のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤ
Ｒ２の標準構造に基づいて選択され得る。好適なフレームワークは、既知の方法、例えば
、米国特許第８，７４８，３５６号に記載のヒトフレームワーク適応又は米国特許第７，
７０９，２２６号に記載の超ヒト化を使用して選択され得る。

【0218】

親抗体及び操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、例えば米国特許第６，１
８０，３７０号に記載のとおり、復帰突然変異によって更に修飾して、生成される抗体の
抗原への結合を回復及び／又は改善させることができる。親抗体又は操作を受けた抗体の
フレームワーク配列を、更に、フレームワーク領域内の（あるいは１つ又は２つ以上のＣ
ＤＲ領域内の）１つ又は２つ以上の残基を変異させることによって修飾して、Ｔ細胞エピ
トープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減することもできる。このアプ
ローチは「脱免疫」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００７００１４７９６号に更に詳
述されている。

【0219】

本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、ＴＭＥＦＦ２及び／又はＣＤ３に対する抗体
の親和性を調節することができる。

【0220】

本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、翻訳後修飾のリスクを最小化することができ
る。脱アミノ化（ＮＳ）、酸触媒加水分解（ＤＰ）、異性化（ＤＳ）、又は酸化（Ｗ）に
ついての推定モチーフのアミノ酸残基を天然のアミノ酸のいずれかで置換して、当該モチ
ーフの突然変異を誘発することができ、得られた抗体を、本明細書に記載の方法を使用し
て、その機能及び安定性について試験することができる。

【0221】

安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは
生物物理学的特性を改善するために修飾される本発明の抗体は、本発明の範囲内である。
抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及ぼ
す個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質／
タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯電
残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布、を含む
、多くの要因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ ３０５：９８９－１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、
抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することが
でき、また、抗体の安定性に対する残基の効果は、同定された残基において変異を保有す
る変異体を生成及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める
方法の１つには、示差走査熱量測定法（differential scanning calorimetry、ＤＳＣ）
によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔ_ｍ）を高くするというものがある。一般に、
タンパク質のＴ_ｍは、その安定性と相関しており、溶液中でのアンフォールディング及び
変性のしやすさ、並びにそのタンパク質がアンフォールディングする傾向に応じた分解プ
ロセスとは逆相関する（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ
１３：３６－４６）。多数の研究で、ＤＳＣによって熱安定性として測定された配合物
（formulations）の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定された物理的安定
性との間に相関が見出されている（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＡＡＰＳ
ＰｈａｒｍＳｃｉ ５Ｅ８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓ
ｃｉ ９３：３０７６－８９；Ｍａａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａ
ｒｍ １４０：１５５－６８；Ｂｅｄｕ－Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｈａ
ｒｍ Ｒｅｓ ２１：１３５３－６１；Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐ
ｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：２００－８）。配合物の研究により、ＦａｂのＴ_ｍは、対応す
るｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。

【0222】

Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、注入された抗体から、血流中の内因
性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１
１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特
許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ^２＋、ＥＤＴＡ、又
はＥＤＴＡ－Ｆｅ^３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に
制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、既知の方法を使用して測定することができ
る。

【0223】

本発明の抗体に対してＦｃ置換を行って、抗体エフェクター機能及び／又は薬物動態特
性を調節することができる。従来の免疫機能では、抗体－抗原複合体と免疫系の細胞との
相互作用の結果、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害、マスト細胞の脱顆粒
、及び食作用から免疫調整性シグナル、例えば、リンパ球の増殖及び抗体の分泌の制御に
及ぶ広範な応答が生じる。これら相互作用全てが、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの
、細胞上の特殊な細胞表面受容体への結合を通して開始される。抗体及び免疫複合体によ
って誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の異種性から
生じ、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、Ｆｃγ受容体
を活性化し（即ち、免疫系の増強）、一方、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害性Ｆ
ｃγ受容体である（即ち、免疫系の減弱）。ＦｃＲｎ受容体への結合は、抗体の半減期を
調節する。

【0224】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、又は１５個の置換を含む。

【0226】

抗体半減期を調節するために置換され得るＦｃ位置。抗体の半減期を延長するために行
うことができる例示的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ
２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ３０
７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。抗体の半減期を短縮するために行うことができる
例示的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３
７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、
Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒである。

【0227】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ
２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ａ
、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５
６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群か
ら選択される、少なくとも１つの置換をＦｃ領域に含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、抗体の活性化Ｆｃγ受容体（Fc recepter、ＦｃγＲ）への結合を低
減する及び／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞障害（complement dependent cytotoxicit
y、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞障害（antibody-dependent cell-mediated cyto
toxicity、ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocy
tosis、ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減する、少なくとも１つの置換をＦ
ｃ領域に含む。

【0229】

ＦｃγＲを活性化しその後エフェクター機能を低減するために、抗体の結合を低減する
ために置換され得るＦｃ位置は、ＩｇＧ１における置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ
２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ
／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２にお
けるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｉｇ
Ｇ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２
６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１
におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／
Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２
３８Ｓ、及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／
Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。

【0230】

ＩｇＧ４の安定性を高めるために、周知のＳ２２８Ｐ置換をＩｇＧ４抗体に行うことが
できる。

【0231】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。

【0232】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含み、
残基の付番はＥＵインデックスに従う。

【0233】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含み、残基の付番は
ＥＵインデックスに従う。

【0234】

相同抗体、保存的修飾を有する抗体、並びに操作及び修飾されている抗体の生成方法
親抗体と比較してアミノ酸配列が変化している本発明の抗体は、標準的なクローニング
及び発現技術を使用して生成され得る。例えば、部位特異的変異導入又はＰＣＲを介在さ
せることによる変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の所望の
特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書において実施例に記載されている方法を使
用して評価することができる。

【0235】

抗体のアイソタイプ及びアロタイプ
本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプであり得る。

【0236】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。

【0237】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。

【0238】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。

【0239】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。

【0240】

治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連してい
る（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０
２－０８）。宿主において治療用抗体が免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプに
よって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅ
ｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。抗体のアロタイプは、抗体の定
常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表２は、選択ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。

【0241】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ）アロタイプである。

【0242】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ－）アロタイプである。

【0243】

いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ
３抗体発明は、Ｇ２Ｍ（ｎ）／（ｎ－）アロタイプである。

【0244】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、ｎＧ４ｍ（ａ）アロタイプである。

【0245】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ１ｍ（１７）アロタイプである。

【0246】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプである。

【0247】

【表2】

【0248】

抗イディオタイプ抗体
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３
抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0249】

本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0250】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0251】

本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0252】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0253】

本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0254】

本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥ
ＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0255】

抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトー
プ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっ
ても、しないものであってもよい。抗原を遮断するＩｄを使用して、サンプル中の遊離抗
体（例えば、本明細書に記載の本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体）を検出することができる。
ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一
部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉ
ｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することがで
きる。

【0256】

また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆ
る抗－抗Ｉｄ抗体を産生することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元のｍＡｂ
とエピトープが同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗
体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定すること
が可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術
によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体変異体を産生する）、及び／又は誘導することが
できる。

【0257】

本発明の単一特異性抗体の生成
いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ヒトである。

【0258】

いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ヒト化されている。

【0259】

本発明の単一特異性抗体は、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋ
ｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５のハ
イブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマ
法では、マウス、又はハムスター、ラット、若しくはサルなどの他の宿主動物を、ＴＭＥ
ＦＦ２の膜近位ドメインなどのＴＭＥＦＦ２のヒト、チンパンジー、又はマカクのＴＭＥ
ＦＦ２又はＴＭＥＦＦ２の断片で免疫し、続いて標準的な方法を使用して、免疫した動物
の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個
の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又は
その欠如、及び抗原親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニング
する。

【0260】

様々な宿主動物を使用して、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体を産生することができる。例
えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス抗ヒトＴＭＥＦＦ２抗体を生成することが
できる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他の非ヒト動物において生成された抗体を、よりヒトに
近い配列を生成するための様々な技術を使用してヒト化することもできる。

【0261】

ヒトアクセプターフレームワークの選別を含む例示的なヒト化技術は既知であり、ＣＤ
Ｒグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，
８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開
第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３
５６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、
ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づ
いて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワー
クに親抗体のＣＤＲを移植する。

【0262】

ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号
に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレ
ームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰変異）、又は任意のＣＤＲに変異を導
入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又
は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。

【0263】

自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）遺伝子座を担持する、マ
ウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、標的タンパク質
に対するヒト抗体を生成することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８
４号、国際公開第９９／４５９６２号、国際公開第２００２／０６６６３０号、同第２０
０２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号
、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－９、Ｇｒｅ
ｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３－２１、Ｇｒｅｅｎ
＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－９５、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３
：６５－９３、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ ２１：１３２３－１３２６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５－８５１、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６－１５６、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１
９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１２３６－１２４３、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａ
ｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８：４
５５－４５８に記載されている。そのような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破
壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを使用して、導入染色体（transchrom
osome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的な
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｗ
ｗｗ．Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ．ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｗｗｗ
．Ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｗｗｗ．Ｏｍｔｉｎｃ．ｎｅｔ）、ＫｙＭ
ａｂ（ｗｗｗ．Ｋｙｍａｂ．ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｗｗｗ．Ｔｒｉａｎｎｉ．ｃｏ
ｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｗｗｗ．Ａｂｌｅｘｉｓ．ｃｏｍ）などの企業は、上記の技
術を使用して、選択された抗原に導かれるヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合が
ある。

【0264】

ヒト抗体はファージディスプレイライブラリから選択することができ、ここでファージ
は、ヒト免疫グロブリン、あるいはＦａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対合若しくは
対合抗体可変領域などのそれらの部分を発現するよう操作されている（Ｋｎａｐｐｉｋ
ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６、Ｋｒｅｂｓ
ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２５４：６７－８４、Ｖａ
ｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１４：３０９－３１４、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ
）９５：６１５７－６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９１
）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：３８１、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ
．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第０９／０
８５４６２号）に記載のバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質
として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離
され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＭＥＦＦ２又はＣＤ３のファー
ジ結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａ
ｂをクローンの溶解物から単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト
抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２
２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２
７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２
，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，
７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３
，０８１号に記載されている。

【0265】

免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の産生は、組み換えタンパク質産生などの
任意の好適な技術を使用して実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、
あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与
されてもよく、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードしている核酸から動物の体内で
新たに形成されてもよい。

【0266】

本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体の生成
本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、本明細書の単離されたＴＭＥＦ
Ｆ２結合ＶＨ／ＶＬドメインを、本明細書に記載のもの及び公に入手可能なものを含む任
意のＣＤ３結合ＶＨ／ＶＬドメインと、組み合わせることによって生成することができる
。使用され得る例示的なＣＤ３結合ＶＨ／ＶＬドメインは、本明細書に記載の抗体ＣＤ３
Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６のものである。使用され得る例示的なＴＭＥＦＦ２結合ＶＨ
／ＶＬドメインは、抗体ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ５
６５、ＴＭＥＢ７６２、及びＴＭＥＢ７５７の抗体である。生成された二重特異性抗ＴＭ
ＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３への結合について、並びにＴＭＥＦ
Ｆ２発現細胞（例えば、ＬＮＣａＰ）のＴ細胞媒介性殺傷などの所望の機能特性について
試験することができる。

【0267】

本発明の二重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交
換（又は半分子交換）を使用して、インビトロで、無細胞環境下又は共発現使用下のいず
れかで、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の、好ましくヘテロ二量体を形成する各
半分子の重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって生成することができる。Ｆａｂア
ーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果で
ある。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は低減する。親単一
特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシ
ステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、
解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形
成よりヘテロ二量体形成を好むように操作されてもよい。得られた産物は、各々異なるエ
ピトープ、即ち、ＴＭＥＦＦ２上のエピトープ及びＣＤ３上のエピトープに結合する、２
つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。例えば、本発明の二重特異
性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載のＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技
術を使用して生成することができる。ＩｇＧ１抗体の場合、一方の重鎖における変異Ｆ４
０５Ｌ及び他方の重鎖におけるＫ４０９Ｒを使用することができる。ＩｇＧ２抗体では、
Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ２及びＩｇＧ２抗体を使用してもよ
い。ＩｇＧ４抗体では、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ４及びＩｇ
Ｇ４抗体を使用してもよい。二重特異性抗体を生成するために、第１の単一特異性二価抗
体及び第２の単一特異性二価抗体を、Ｆｃ領域に前述の変異を有するように操作し、ヒン
ジ領域でシステインがジスルフィド結合異性化を受けることができる十分な還元条件下で
、抗体を一緒にインキュベートし、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体
が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得
る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ
）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioer
ythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris
(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノ
ールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存
在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐ
Ｈ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができ
る。

【0268】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ１アイ
ソタイプであり、配列番号８４の野生型ＩｇＧ１と比較すると、第１の重鎖（ＨＣ１）に
Ｆ４０５Ｌ置換及び第２の重鎖（ＨＣ２）にＫ４０９Ｒ置換を含む。

【0269】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイ
ソタイプであり、配列番号８５の野生型ＩｇＧ４と比較すると、ＨＣ２にＦ４０５Ｌ／Ｒ
４０９Ｋ置換を含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイ
ソタイプであり、配列番号８５の野生型ＩｇＧ４と比較すると、ＨＣ１にＳ２２８Ｐ、Ｆ
２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換、並びにＨＣ２にＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、
Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。

【0271】

配列番号８４ 野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ
ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ
ＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩ
ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ
ＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0272】

配列番号８５ 野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥ
ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶ
ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡ
ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ
ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ
ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0273】

配列番号１０３ ＩｇＧ１ Ｆ４０５Ｌ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ
ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ
ＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩ
ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ
ＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0274】

配列番号１０９ ＩｇＧ１ Ｋ４０９Ｒ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ
ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ
ＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩ
ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ
ＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0275】

配列番号１０４ ＩｇＧ４ Ｆ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥ
ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶ
ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡ
ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ
ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
ＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ
ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0276】

二重特異性抗体はまた、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓ
ｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ－ｍａｔ
ｃｈｅｄ）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、
ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、及び
Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）などのデザインを使用して生成することもできる。

【0277】

「ノブ－イン－ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照さ
れたい）において、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインの界面を形成する選択アミノ酸は、ヘテ
ロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置に変異を導
入され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する
抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的
に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホ
ール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成され
る。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３
６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／
Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３
６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修
飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。

【0278】

Ｆａｂアーム交換のプロモータへの「ノブ－イン－ホール」戦略の利用に加えて、Ｃｒ
ｏｓｓＭＡｂ技術は、半アームのうちの１つにＣＨ１／ＣＬドメイン交換を利用して、得
られる二重特異性抗体の正しい軽鎖の対合を保証する（例えば、米国特許第８，２４２，
２４７号を参照されたい）。

【0279】

他の交差法を使用して、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖の間又は重鎖内で、一方又は両方
のアームにおいて、可変又は定常、又は両ドメインを交換することによって、本発明の完
全長二重特異性抗体を生成してもよい。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第
２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８
６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ－ＣＨ１とＶＬ－ＣＬ、ＶＨ
とＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。

【0280】

米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１
８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第
２０１１／０１２３５３２号に記載されるような他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面にお
ける正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することに
よる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進を使用されてもよい。他の手法
では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許
出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されているように、以下の置換：Ｌ３５１
Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４
０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、
Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６
Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿
Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重
鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおけ
る修飾位置として表す）により促進することができる。

【0281】

ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、本発明の二重特異性抗体を生成してもよい。ＳＥＥ
Ｄｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許出願第２００７／０２８７１７
０号に記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択
ＩｇＧ残基を有する。

【0282】

変異は、通常、標準的な方法を使用して、抗体の定常ドメインなどの分子に対してＤＮ
Ａレベルで行われる。

【0283】

ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離
されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２
／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供
する。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な単離されたポリヌク
レオチドは、抗体又は抗原結合断片を産生する同一の又は異なるベクターに含まれてもよ
い。ポリヌクレオチドは、相補的デオキシ核酸（complementary deoxynucleic acid、ｃ
ＤＮＡ）であってもよく、好適な宿主において発現するためにコドン最適化されていても
よい。コドン最適化は、周知の技術である。

【0284】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（及びポリヌクレオチド
がコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリー
ダー配列を利用することができる。リーダー配列は、制限部位又は翻訳開始部位を含み得
る。

【0285】

本発明はまた、本発明の抗体のＶＨ、本発明の抗体のＶＬ、本発明の抗体の重鎖、又は
本発明の抗体の軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0286】

本発明はまた、配列番号２５、２６、２７、８７、又は８９のＶＨをコードする、単離
されたポリヌクレオチドを提供する。

【0287】

本発明はまた、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、又は９０のＶＬをコードする
、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0288】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体のＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、又
はＬＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0289】

本発明はまた、配列番号３２、３３、３４、９１、又は９３のＨＣ１をコードする、単
離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0290】

本発明はまた、配列番号３５、３６、３７、３８、９２、又は９４のＬＣ１をコードす
る、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0291】

本発明はまた、配列番号７６又は７８のＨＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオ
チドを提供する。

【0292】

本発明はまた、配列番号７７又は７９のＬＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオ
チドを提供する。

【0293】

本発明はまた、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１
０２のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0294】

本発明はまた、配列番号１０５、１０６、８０、８１、１０７、１０８、８２、及び８
３のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0295】

本発明の抗体のＶＨ若しくはＶＬ若しくはその抗原結合断片、又は本発明の抗体の重鎖
及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチ
ド配列の発現を可能にする、プロモータ又はエンハンサーなどの１つ又は２つ以上の制御
エレメントに作動可能に連結させることができる。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであっ
てもよい。

【0296】

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。そのようなベク
ターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、ト
ランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バック
グラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターで
あってもよい。例えば、所望により定常領域に連結されている本発明の抗体の軽鎖及び／
又は重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入する。軽鎖
及び／又は重鎖は、同じか又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブ
リン鎖をコードしているＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実
にする発現ベクター中のコントロール配列に操作可能に連結することができる。そのよう
なコントロール配列としては、シグナル配列、プロモータ（例えば、天然に付随する又は
異種のプロモータ）、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発
現するように選択された宿主細胞と適合するように選択される。ベクターを適切な宿主に
組み込み、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を高レベルで
発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。

【0297】

本説明の範囲内の組み換え発現ベクターは、好適な調節エレメントに操作可能に連結す
ることができる、抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、又はＬＣなどの少なくとも１つの組み換えタ
ンパク質をコードする合成又はｃＤＮＡ由来の核酸断片を含む。そのような調節エレメン
トには、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに
転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類
の発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発
現される遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フラ
ンキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んで
もよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。

【0298】

脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は
、ウイルス資源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａ
ｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載のように構
築することができる。

【0299】

いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片のコード配列は、強力な構成的プロモ
ータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxa
nthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン
酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンなど
のためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細
胞中で恒常的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。そのようなウイルス
プロモータには、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）中間初期プロモー
タ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（Mouse Mammary Tumor Vi
rus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human I
mmunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、
ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイル
スの長端末反復配列（long terminal repeats、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルス
のチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では
、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片のコード配列は、メタロチオネインプロモー
タ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータなどの誘導
性プロモータ、プロテインキナーゼＲ ２’，５’－オリゴアデニレート合成酵素、ＭＸ
遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（in
terferon-stimulated response elements、ＩＳＲＥ）を含むプロモータの制御下に置か
れる。

【0300】

本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（In
ternal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含んでもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター
内への包含は、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実
施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０
）を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。
ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適
な間隔を提供するように（即ち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入すること
により）配置されてもよいか、又は別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、
例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい
。

【0301】

ベクターは、当技術分野において周知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーに
は、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン
抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイク
リン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシク
ロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌
のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００）が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸
配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクロー
ニング部位の上流又は下流にあってもよい。

【0302】

使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ
１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，
ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及び
ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、真核生物：ｐＷＬ
ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳ
ＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏ
ｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。

【0303】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５のＶＨ及び／又は配列番号２８の
ＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0304】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３９のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号４２のポリヌクレオチドを含む。

【0305】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６のＶＨ、及び／又は配列番号２９
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0306】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４０のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号４３のポリヌクレオチドを含む。

【0307】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２７のＶＨ及び／又は配列番号３０の
ＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0308】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４１のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号４４のポリヌクレオチドを含む。

【0309】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６のＶＨ、及び／又は配列番号３１
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0310】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４０のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号４５のポリヌクレオチドを含む。

【0311】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８７のＶＨ、及び／又は配列番号８８
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９５のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号９６のポリヌクレオチドを含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８９のＶＨ、及び／又は配列番号９０
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0314】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９９のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号１００のポリヌクレオチドを含む。

【0315】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６６のＶＨ、及び／又は配列番号６７
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0316】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０５のポリヌクレオチド、及び／又
は配列番号１０６のポリヌクレオチドを含む。

【0317】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７４のＶＨ、及び／又は配列番号７５
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0318】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０７のポリヌクレオチド、及び／又
は配列番号１０８のポリヌクレオチドを含む。

【0319】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３２のＨＣ、及び／又は配列番号３５
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0320】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号４９のポリヌクレオチドを含む。

【0321】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３３のＨＣ、及び／又は配列番号３６
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0322】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４７のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号５０のポリヌクレオチドを含む。

【0323】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３４のＨＣ、及び／又は配列番号３７
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0324】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４８のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号５１のポリヌクレオチドを含む。

【0325】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３３のＨＣ、及び／又は配列番号３８
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0326】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４７のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号５２のポリヌクレオチドを含む。

【0327】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９１のＶＨ、及び／又は配列番号９２
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0328】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９７のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号９８のポリヌクレオチドを含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９３のＶＨ、及び／又は配列番号９４
のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0330】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０１のポリヌクレオチド、及び／又
は配列番号１０２のポリヌクレオチドを含む。

【0331】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７６のＨＣ、及び／又は配列番号７７
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0332】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８０のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号８１のポリヌクレオチドを含む。

【0333】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７８のＨＣ、及び／又は配列番号７９
のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８２のポリヌクレオチド、及び／又は
配列番号８３のポリヌクレオチドを含む。

【0335】

本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合断片をコード
する遺伝子により種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して
、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は抗原結合断片を産生する細胞を生成することができる。したが
って、本発明はまた、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む、宿主細胞を提供する
。

【0336】

外来遺伝子を細胞に導入する技術は既知であり、本発明の組み換え細胞を構築するため
に使用することができる。

【0337】

「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対
象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細
胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後
続世代においてある特定の修飾が生じ得るので、そのような後代は親細胞に同一ではない
場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然含まれる。

【0338】

そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよ
い。原核宿主細胞の例は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacill
us subtilis）などの桿菌、並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia
）、及び様々なシュードモナス属（Pseudomonas）の種などの他の腸内細菌科のものであ
る。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミ
セス属（Saccharomyces）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae））
及びピキア属（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の
動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブ
リドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５
８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ
Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は
、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するもの、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（
Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｐｏｔｅｌｌｉ
ｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ２ＳＶ（Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
－６１）、又はＤＧ４４が挙げられる。

【0339】

本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載され
た抗体又は抗原結合断片の組み換え発現について選択され、又はスクリーニングされても
よい。組み換え陽性細胞は、タンパク質修飾又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表
現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタ
ンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる
。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異によるものであり得る。
変異は、化学物質、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異源、ＤＮＡミスマッチ修復の
阻害、又はそのような方法の組み合わせの使用を通じて影響され得る。

【0340】

本発明はまた、本発明の抗体を産生する方法であって、抗体が発現する条件下で本発明
の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された抗体を回収することと、を含
む方法を提供する。抗体を作製し、それを精製する方法は、当該技術分野において周知で
ある。合成されたら（化学的に又は組み換えによって）、抗体全体、その二量体、個々の
軽鎖及び／若しくは重鎖、又はＶＨ及び／若しくはＶＬなどの他の抗体断片を、硫酸アン
モニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などの標準的な手順（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１
９８２）を参照）に従って精製することができる。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、
少なくとも純度約８０％～８５％、少なくとも純度約８５％～９０％、少なくとも純度約
９０％～９５％、又は少なくとも約９８％～９９％、又はそれを超える純度であり得、例
えば、対象抗体以外の細胞残屑、巨大分子などの夾雑物を含まない。

【0341】

本発明のポリヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学的方法を使用してベクターに組
み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を
使用して行われる。

【0342】

本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体を産生する方法であって、
当該抗体のＶＨをコードしている第１のポリヌクレオチド及び当該抗体のＶＬをコード
している第２のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を当該発現ベクターで形質転換することと、
当該ＶＬ及び当該ＶＨが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で当該宿主細胞
を培養することと、
当該宿主細胞又は当該培養培地から抗体を回収することと、
を含む、方法もまた提供する。

【0343】

医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体及び医薬的許容される担体を含む医薬組成物もまた提供する。
治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効な量の
抗体を含む医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一緒に
投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、水、
及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱
油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシ
ンを使用してもよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これら
は、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生
理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調
節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのような医薬製
剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、
最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される投与方法に従って、必要とさ
れる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（
ヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓ
ｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ
５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ６９１－１０９
２に記載され、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。

【0344】

本発明の抗体の投与方法は、当該技術分野において周知であるように、非経口投与、例
えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直
腸）、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であり得る。

【0345】

本発明の抗体はまた、癌などの疾患を発症するリスクを低減するために、予防的に投与
され得る。

【0346】

したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ
～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５
ｍｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体と、を含むように調製することができる。

【0347】

抗ＴＭＥＦＦ２抗体及び二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を使用する方法
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性
癌を治療する方法であって、治療に有効な量の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体
又はその抗原結合断片を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方
法を提供する。

【0348】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性
癌を治療する方法であって、治療に有効な量の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片
を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。

【0349】

前立腺癌の発症には、複数の遺伝子が関与している。前立腺癌の発症及び進行に関与し
、したがって新しい抗前立腺癌療法の有望な標的であるタンパク質のうちの１つは、ＥＧ
Ｆ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜タンパク質（ＴＭＥＦＦ２）である
。ＴＭＥＦＦ２は、２つのフォリスタチン様（follistatin-like、ＦＳ）ドメイン、ＥＧ
Ｆ様ドメイン、膜貫通（transmembrane、ＴＭ）ドメイン、及び短細胞質尾部で構成され
ているＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＭＥＦＦ２タンパク質の最も高い発現は、脳及び
前立腺の２つの器官で検出された（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｈｏｒｉｅ ｅ
ｔ ａｌ．２０００）。ＴＭＥＦＦ２の高い発現はまた、前立腺癌細胞株及び臨床サンプ
ルにも見出され（Ｇｌｙｎｎｅ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｇｅｒｙ ｅｔ
ａｌ．２００２、Ａｆａｒ ｅｔ ａｌ．２００４）、ＴＭＥＦＦ２が前立腺癌の進行に
おいて重要な役割を果たすことを示している。Ｔｍｅｆｆ２遺伝子の発現は、アンドロゲ
ン受容体の制御下にある。多数のアンドロゲン依存性癌患者は、高レベルのＴＭＥＦＦ２
ｍＲＮＡを呈した。

【0350】

したがって、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、前立腺癌の診断、予後、又は治療のための重要な
ツールになる可能性を有し得る。

【0351】

「癌」は、病理学的な種類又は侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌性成長又は発
癌プロセス、転移組織又は悪性腫瘍形質転換細胞、組織、又は器官を含むことを意味する
。例示的なＴＭＥＦＦ陽性癌としては、前立腺癌が挙げられる。

【0352】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、腺癌である。

【0353】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、転移性前立腺癌である。いくつかの実施形態で
は、前立腺癌は、直腸、リンパ節、若しくは骨、又はそれらの任意の組み合わせに転移し
ている。

【0354】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、再発性又は難治性前立腺癌である。

【0355】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌である。

【0356】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、アンドロゲン遮断療法に感応性である。

【0357】

いくつかの実施形態では、前立腺癌は、アンドロゲン遮断療法に感応性ではない。

【0358】

本発明はまた、治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0359】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための、単離された二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0360】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２前立腺癌の治療に使用するための、単離された二重特異性
抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0361】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療するための医薬品を製造するための、単離さ
れた二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0362】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の
重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異
性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0363】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２
のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0364】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0365】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0366】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0367】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４
のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0368】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0369】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３
のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0370】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0371】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１
のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0372】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３
のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0373】

本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗
ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合
する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第
２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ
１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメイ
ンが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３
のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を
含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供
する。

【0374】

本発明の抗体は、第２の治療剤と併用して投与され得る。

【0375】

いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法若
しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである。

【0376】

キット
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３
抗体を含む、キットを提供する。キットは、治療的使用のために、又は診断キットとして
使用することができる。キットを使用して、サンプル中でのＴＭＥＦＦ２、ＣＤ３、又は
ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３の存在を検出することができる。

【0377】

いくつかの実施形態では、キットは、本発明の抗体と、抗体を検出するための試薬とを
含む。キットは、使用説明書と、他の試薬、例えば、標識、治療剤、又は抗体を標識若し
くは治療剤、又は放射線防護組成物にキレート化する、ないしは別の方法でカップリング
するのに有用な剤と、投与するために抗体を調製するためのデバイス又は他の材料と、医
薬的に許容される担体と、対象に投与するためのデバイス又は他の材料とを含む、１つ又
は２つ以上の他の構成要素を含み得る。

【0378】

いくつかの実施形態では、キットは、容器内の本発明の抗体と、キットの使用説明書と
を含む。

【0379】

いくつかの実施形態では、キットにおける抗体は標識されている。

【0380】

本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0381】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0382】

本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0383】

本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0384】

本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0385】

本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体
を含む、キットを提供する。

【0386】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0387】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0388】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0389】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0390】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0391】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0392】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0393】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0394】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0395】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0396】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。

【0397】

本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のド
メインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第
１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが
、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。

【0398】

ＴＭＥＦＦ２又はＣＤ３を検出する方法
本発明はまた、サンプル中のＴＭＥＦＦ２を検出する方法であって、サンプルを得るこ
とと、サンプルを本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体と接触させることと、サンプル中のＴＭＥ
ＦＦ２に結合した抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。

【0399】

本発明はまた、サンプル中のＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３を検出する方法であって、サンプ
ルを得ることと、サンプルを、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合す
る第２のドメインとを含む、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体と接触さ
せることと、サンプル中のＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合した抗体を検出することと、を
含む、方法を提供する。

【0400】

いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞
、循環腫瘍細胞、組織に会合していない細胞（即ち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的
に切除された腫瘍組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る
。

【0401】

ＴＭＥＦＦ２、又はＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合した本明細書に記載の本発明の抗体
は、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは
化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗
体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させるこ
とが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１
Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、
アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染
料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。

【0402】

本発明の抗体を多様なアッセイに使用して、サンプル中のＴＭＥＦＦ２、又はＴＭＥＦ
Ｆ２及びＣＤ３を検出することができる。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析
、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化
学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍
光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳ
Ａアッセイである。

【0403】

次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。

【0404】

実施例１：抗原の生成
ヒト細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）ＴＭＥＦＦ２は、ＵｎｉＰｒｏ
ｔ受諾＃Ｑ９ＵＩＫ５配列に基づいて産生された。ＥＣＤ構築物は、Ｃ末端に６Ｘ Ｈｉ
ｓタグ及びＡｖｉタグ配列を有するように設計した（構築物ＴＭＥＷ１、配列番号６）。
ＦＳ２及びＥＧＦドメイン（アミノ酸１５１～３２０を含む構築物は、６Ｘ Ｈｉｓ－ｔ
ａｇ及びａｖｉｔａｇ配列を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合体として設計した
（構築物ＴＭＥＷ７、配列番号７）。ＴＭＥＦＦ２膜近位ドメイン（残基２３０～３２０
）を含む構築物は、６ｘＨｉｓタグを有する（構築物ＴＭＥＷ１９、配列番号８）か、又
はＨｉｓ－ｔａｇを有するラットＩｇＧ１ Ｆｃに融合させて（構築物ＴＭＥＷ２０、配
列番号９）設計した。ＴＭＥＦＦ２の残基２３０～３２０は、ＴＭＥＦＦ２の残基２６１
～３０１に及ぶＥＧＦドメインを含む。ヒトＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤ発現構築物を、製造業
者のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３由来細胞
、Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
に一過的にトランスフェクトした。採取前にオービタルシェーカーで、８％のＣＯ_２を用
いて３７℃で５日間細胞をインキュベートした。発現した細胞を遠心分離により除去し、
ｈｉｓタグを有する可溶性ＴＭＥＦＦ２タンパク質を、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属親和性ク
ロマトグラフィー、続いてＤｕｂｅｌｃｃｏのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２（１ｘＤＰＢＳ
）中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００分取サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion c
hromatography、ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、培地から精製し
た。生成した抗原のアミノ酸配列を、表３に示す。

【0405】

【表3】

【0406】

実施例２．抗ＴＭＥＦＦ２抗体の生成
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックラット（ＯｍｎｉＲａｔ（
登録商用））を使用する、抗体の生成ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、完全なヒトＩｇＬ
座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）を
一緒に有する、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣ_Ｈ遺伝子座に連結した、天
然形態の２２個のヒトＶ_Ｈ、全てのヒトＤ及びＪ_Ｈセグメントを含む）を含む。（例えば
、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０（４）：１４８
１－１４９０を参照されたい）。したがって、ラットは、ラット免疫グロブリンの低減し
た発現を呈し、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、免疫化に応答して、クラス
スイッチ及び体細胞変異を受けて、完全長ヒト可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラ
ットＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用
、並びにそのようなラットによって担持されるゲノム修飾は、ＷＯ１４／０９３９０８に
記載されている。

【0407】

ＯｍｎｉＲａｔｓをヒトＴＭＥＦＦ２構築物ＦＳ２－ＥＧＦ－Ｔｅｖ－ＨＳＡ（Ｃ３４
Ｓ）－Ｈｉｓ－Ａｖｉｔａｇ（ＴＭＥＷ７、配列番号７）で免疫し、構築物ｓｐＴＭＥＦ
Ｆ２（２３０～３２０）Ｇ３Ｓ－ｒａｔＩｇＧ１Ｆｃ（ＴＭＥＷ２０、配列番号９）でブ
ーストした。８９日の免疫レジメンに続いて、ラットからリンパ節を採取し、ハイブリド
ーマを生成するために使用し、ＥＬＩＳＡ及び／又はＳＰＡＲＣＬ（Ｓｐａｔｉａｌ Ｐ
ｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｎａｌｙｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ）によって、ヒトＴＭＥＦＦ２－ＦＦＬ ＥＣＤ－ＨＩＳ－Ａｖｉｔａｇ（Ｔ
ＭＥＷ１）タンパク質への結合について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。Ｔ
ＭＥＦＦ ＥＣＤ、ＦＳ２－ＥＧＦ、又はＥＧＦドメインのみのＴＭＥＦＦ２への結合の
、二次ＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣＬスクリーニングのために、いくつかの上清を選択した
。スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発
現させ、機能について特性評価した。

【0408】

ファージディスプレイライブラリからの抗体生成
標準的な方法を使用して、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３
８５－９６，２０１０、及びＷＯ２００９／０８５４６２）に記載の２セットの新たなｐ
ＩＸファージディスプレイライブラリから、ＴＭＥＦＦ２に結合するＦａｂを選択した。
簡潔に言えば、Ｖ３．０及びＶ５．０と呼ばれる２セットのライブラリは、ヒトスカフォ
ールドを多様化させることによって生成されたものであり、生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ
１－６９^＊０１、ＩＧＨＶ３－２３^＊０１及びＩＧＨＶ５－５１^＊０１を、Ｈ３ループを
介してヒトＩＧＨＪ－４ミニ遺伝子で組み換え（Ｖ５．０ではＩＧＨＪ－６ミニ遺伝子も
使用した）、そして、ヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１－３９^＊０１）
、Ｌ６（ＩＧＫＶ３－１１^＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３－２０^＊０１）及びＢ３（ＩＧ
ＫＶ４－１^＊０１）をＩＧＫＪ－１ミニ遺伝子で組み換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメイ
ンを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と頻繁に接触する、Ｈ１、
Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域における位置を選択した
。選択した位置における配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨ
Ｖ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいてそれぞれの位置に存在する残基に制限
した。Ｈ３ループにおける多様性は、Ｖ３．０ライブラリについては７～１４アミノ酸長
、Ｖ５．０ライブラリについては６～１９アミノ酸長の短鎖～中鎖の合成ループを使用し
て生成した。Ｈ３におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動
を模倣するよう設計された。ライブラリを生成するために利用したスカフォールドは、そ
のヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。Ｖ３．０及びＶ５．０のセ
ットの両方では、３つの重鎖ライブラリの各々を、４つの生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖
ライブラリと組み合わせて、選択実験に使用されるライブラリの各セットとして、１２と
おりの固有のＶＨ：ＶＬの組み合わせを生成した。

【0409】

Ｖ領域クローニング
ファージのハイブリドーマ細胞溶解物からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従っ
てＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。得られたＲＮＡを、
Ｄｒｏｐ Ｓｅｎｓｅを使用して定量化し、－８０℃で保存したか、又はＲＴ－ＰＣＲに
よるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎ
ｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ合
成に使用した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成は、それぞれ重鎖、カッパ鎖、及びラムダ鎖の定常
領域にアニーリングされた遺伝子特異的プライマーを使用して実行した。最大３μｇの精
製したＲＮＡ、遺伝子特異性プライマー、ｄＮＴＰミックス、反応緩衝液、２５ｍＭのＭ
ｇＣｌ_２、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎカタログ＃１８０８０－０５１）で構成されるＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を５０℃で
５０分間、及び８５℃で５分間インキュベートした。得られた一本鎖ｃＤＮＡを－２０℃
で保存するか、又はＰＣＲ増幅に直接使用した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘポリメラーゼ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を実行した。ｖ領域断片を、最適化した
ＰＣＲ条件を使用して、リーダー配列、並びに重鎖、カッパ及びラムダ鎖の定常領域に順
方向及び逆方向のプライマーアニーリングによって増幅させた。得られたＰＣＲ断片を配
列決定し、回収したｖ領域のアミノ酸配列をコドン最適化し、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、
及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ４定常領域を担持するｐＵｎｄｅｒ系発現ベクター（
ＩｇＧ４ＰＡＡアイソタイプ）にクローニングした。

【0410】

Ｅｘｐｉ２９３小規模トランスフェクション及び精製
免疫化キャンペーン又はファージディスプレイから同定した選択抗体をクローニングし
、ＩｇＧ１ＰＡＡとして発現させ、小さい２ｍｌスケールを介して精製した。Ｅｘｐｉ２
９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２
９３（商標）発現培地中１．２５×１０^５～２．２５×１０^５個の生存細胞／ｍＬ密度で
播種し、３７℃、７％ ＣＯ_２の１２５ｍＬ～２Ｌ振盪フラスコ内で培養した。密度が３
×１０^６～５×１０^６個の生存細胞／ｍＬで生存率が９８～９９％に対数増殖に達したと
きに、細胞を継代培養した。

【0411】

トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を決定した。製造業者のトラン
スフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号Ｍ
ＡＮ０００７８１４）に従って、３×１０^６個の生存細胞／ｍＬの密度で細胞をトランス
フェクトした。精製前に、８５０ｘＧで１５分間遠心分離することにより、トランスフェ
クション６日後に培養物を採取した。ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅ
ａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して清澄化した上清から抗体を精製し、ＰＢＳ中に透析した。
タンパク質濃度は、ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使
用して、濾液のＡ２８０測定によって測定した。

【0412】

実施例３．抗ＴＭＥＦＦ２抗体の特性評価
抗ＴＭＥＦＦ２抗体は高親和性でＴＭＥＦＦ２に結合する
ＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤ（ＴＭＥＷ１：ＴＭＥＦＦ２－ＦＬ ＥＣＤ－Ｈｉｓ－Ａｖｉｔ
ａｇ）及び／又は膜近位領域（ＴＭＥＷ１９：ｓｐＴＭＥＦＦ２（２３０－３２０）Ｇ３
Ｓ－Ｈ６）への選択ＩｇＧ４ＰＡＡ抗ＴＭＥＦＦ２抗体の結合は、タンパク質（ＴＭＥＢ
６７４、ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５６５、及びＴＭＥＢ５７０）又はＢｉａｃｏｒｅ
ＳＰＲ（ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ７５７）を使用して評価した。選択された抗体の結
合の動態パラメータを、表４に示す。抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ピコモル親和性でＴＭＥＦ
Ｆ２ ＥＣＤ及びＴＭＥＦＦ２膜近位領域の両方に結合することが見出された。

【0413】

【表4】

【0414】

ＰｒｏｔｅＯｎ ＳＰＲ
抗ＴＭＥＦＦ２ ｍＡｂのＥＣＤ及びヒトＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合は、Ｐｒ
ｏｔｅＯｎ ＳＰＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって測定した。（ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬの
最終濃度まで希釈した）精製ｍＡｂをアッセイのリガンドとして使用し、Ｆｃ捕捉を通じ
てヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ Ｆｃに固定化した。ＧＡＨ ＩｇＧ Ｆｃのアミンカッ
プリングのために、ＥＤＣ（４０ｍＭ）及びＮＨＳ（１０ｍＭ）の１：１混合物を注入直
前に混合して、チップ表面を活性化し、垂直方向に注入した。次いで、酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）中のＧＡＨ－Ｆｃ（３０μｇ／ｍｌ）抗体を、３０μｌ／分で３００秒間表面上
に垂直方向に流した。その後、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を同じ方向に注入す
ることによって、表面の任意の残りの反応性カルボキシル基を失活させた。固定化のため
に１μｇ／ｍｌの濃度で抗体を使用した。抗体は、表面上を水平方向に流した。３倍連続
希釈した５つの濃度（最高濃度範囲１００～６００ｎＭ）のヒトＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤ又
は膜近位領域を、検体として垂直方向に流して、捕捉された分子に結合させた。また、垂
直方向の６番目のチャネルに緩衝液サンプルを注入して、ベースラインシグナルの動向を
監視した。全ての濃度での会合及び解離相を、それぞれ１００μＬ／分の流速で３分間及
び３０（又は１５）分間にわたり監視した。次の相互作用サイクルのために、１８秒パル
スの０．８％リン酸を使用して、結合した抗原を除去するために結合表面を再生した。応
答データから２つのセットの参照データ：１）抗原と空のチップ表面との間での非特異的
相互作用を補正するためのスポット間シグナル、２）（チップ上にＰＢＳＴのみが流され
た場合）非特異的ベースラインドリフトを補正するための、空のチャネル信号、を減算す
ることによって未処理データを処理した。

【0415】

Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲ
ヒトＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤへの抗ＴＭＥＦＦ２ ｍＡｂの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８
Ｋ ＳＰＲによって測定した。アッセイのフォーマットは、高密度抗ヒトＦｃ表面を使用
してｍＡｂを捕捉し、次いで単一サイクル動態方法を使用してヒトＴＭＥＦＦ２濃度滴定
を注入するためのものである。ヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９－００５－０９８）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液中３０
μｇ／ｍＬのアミンカップリング、フローセル１及び２上、ＣＭ５センサ－チップ（ＧＥ
）上ｐＨ４．５、ＨＢＳＰ（ＧＥ）緩衝液中３０μＬ／分の流量を介して直接固定化した
。フローセル２上０．５μｇ／ｍＬ（約２００～３００ＲＵ）で、ｍＡｂを抗ヒトＦｃ
ＩｇＧ表面上に捕捉した。次いで、泳動用緩衝液をＨＢＳＰ＋１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
に変更した。単一サイクル動態方法を使用して、３倍連続希釈した３０ｎＭ濃度のＴＭＥ
ＦＦ２ ＥＣＤを、低濃度から高濃度で注入した。最後又は最高濃度の注入３０分後にオ
フレートを監視し、次いで０．８％リン酸（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して表面を再生した
。緩衝液ブランク試験、同じｍＡｂの捕捉、及び同じサンプル実験条件の使用も完了した
。未処理データは、応答データから２セットの参照データ：１）サンプルフローセル２か
ら減算した参照フローセル１、及び２）実験的試験からの緩衝液ブランク試験、を減算す
ることによって処理した。各ｍＡｂの全濃度での処理したデータを１：１の単純なラング
ミュア結合モデルに全体的に適合させて、およその動態性（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和
性（ＫＤ）定数を抽出した。

【0416】

抗ＴＭＥＦＦ２抗体の熱安定性
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）による、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２℃、及び第
１の熱転移（Ｔｍ１）＝６０．４℃によって、ＴＭＥＢ６７５は、通常の熱安定性プロフ
ァイルよりも低いことを示した。ＴＭＥＢ６７５の配列のより詳しい検査（実施例４を参
照されたい）は、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域内の体細胞超変異（Somatic HyperM
utation、ＳＨＭ）の存在を示した。いくつかの再操作された変異体をサブクローニング
し、発現させ、精製し、ＤＳＣによりプロファイルした。得られたｍＡｂ ＴＭＥＢ７６
２及びＴＭＥＦＢ７５７は、望ましい熱安定性プロファイル（それぞれ、Ｔｍ１＝６９．
４℃、及びＴｍ１＝６９．７℃）を示した。ＴＭＥＢ６７５と比較して、ＴＭＥＢ７６２
は、重鎖にＲ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ、及びＨ８１Ｑのアミノ酸修飾を有し、一方ＴＭＥＦＢ７
５７は、重鎖にＲ１４Ｐ及びＰ２０Ｌのアミノ酸修飾を有した。ＴＭＥＢ６７５と比較し
て、ＴＭＥＢ７６２は、軽鎖にＡ１Ｄ及びＡ９１Ｐのアミノ酸修飾を有し、一方ＴＭＥＦ
Ｂ７５７は、軽鎖にＡ９１Ｐの修飾を有した。残基の付番は、Ｋａｂａｔに従う。ＴＭＥ
Ｂ６７５、ＴＭＥＢ７６２のＴＭＥＦＦ２ ＥＣＤへの結合の動態パラメータを、表４に
示す。

【0417】

実施例４．ＴＭＥＦＦ２抗体の構造的特性評価
標準的な技術を使用して、抗体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチ
ド配列の決定後、発現をスケールアップするための標準的な方法を使用して、可変領域又
は完全長抗体をコードするいくつかの抗体ｃＤＮＡを、コドン最適化した。

【0418】

表５は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。

【0419】

表６は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。

【0420】

表７は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。

【0421】

表８は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。

【0422】

表９は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。

【0423】

表１０は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の重鎖及び軽鎖の配列番号を示す。

【0424】

表１１は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の重鎖アミノ酸配列を示す。

【0425】

表１２は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の軽鎖アミノ酸配列を示す。

【0426】

表１３は、様々な抗ＴＭＥＦＦ２抗体鎖をコードするポリヌクレオチドの配列番号を示
す。

【0427】

【表5】

【0428】

【表6】

【0429】

【表7】

【0430】

【表8】

【0431】

【表9-1】

【0432】

【表9-2】

【0433】

【表10】

【0434】

【表11】

【0435】

【表12】

【0436】

【表13】

【0437】

配列番号３９（ＴＭＥＢ６７５ ＶＨ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧ
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【0438】

配列番号４０（ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ５６５ ＶＨ ｃＤＮＡ）
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【0439】

配列番号４１（ＴＭＥＢ６７４ ＶＨ ｃＤＮＡ）
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【0440】

配列番号４２（ＴＭＥＢ６７５ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0441】

配列番号４３（ＴＭＥＢ５７０ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0442】

配列番号４４（ＴＭＥＢ６７４ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0443】

配列番号４５（ＴＭＥＢ５６５ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0444】

配列番号４６（ＴＭＥＢ６７５ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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【0445】

配列番号４７（ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ５６５ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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【0446】

配列番号４８（ＴＭＥＢ６７４ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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【0447】

配列番号４９（ＴＭＥＢ６７５ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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【0448】

配列番号５０（ＴＭＥＢ５７０ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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【0449】

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【0450】

配列番号５２（ＴＭＥＢ５６５ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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【0452】

配列番号９６（ＴＭＥＢ７６２ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0453】

配列番号９７（ＴＭＥＢ７６２ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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【0454】

配列番号９８（ＴＭＥＢ７６２ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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【0455】

配列番号９９（ＴＭＥＢ７５７ ＶＨ ｃＤＮＡ）
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【0456】

配列番号１００（ＴＭＥＢ７５７ ＶＬ ｃＤＮＡ）
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【0457】

配列番号１０１（ＴＭＥＢ７５７ ＨＣ ｃＤＮＡ）
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【0458】

配列番号１０２（ＴＭＥＢ７５７ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴ
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【0459】

選択された抗ＴＭＥＦＦ２抗体のフレームワークを、表１４に示す。

【0460】

【表14】

【0461】

配列番号５３（ＶＨ３＿３－２３フレームワーク）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬ
ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0462】

配列番号５４（ＶＨ１＿１－６９フレームワーク）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ ＳＹＡＩＳ ＷＶ
ＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ ＲＶＴＩＴＡＤＥＳ
ＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ

【0463】

配列番号５５（ＶＫＩ＿Ｌ１１フレームワーク）
ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫ
ＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧ ＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬ
ＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ ＬＱＤＹＮＹＰ

【0464】

配列番号５６（ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７フレームワーク）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱ
ＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ ＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲ
ＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ

【0465】

実施例５．抗ＴＭＥＦＦ２抗体のエピトープマッピング
Ｈ／Ｄ交換を使用して、ＴＭＥＢ５７０及びＴＭＥＢ６７５のエピトープマッピングを
行った。ＴＭＥＷ１（配列番号６）を、これらのアッセイでのＴＭＥＦＦ２の供給源とし
て使用した。

【0466】

１３０μＬの対照緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４
）中１０μｇのＴＭＥＷ１を、１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ
緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を添加し、混合物を３分間１０℃でインキュベ
ートすることによって、変性させた。次いで、社内で充填したペプシン／プロテアーゼＸ
ＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：１）カラム（２．１×３０ｍｍ）を使用して、混合物にオンカラム
ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を施した。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒ
ｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
（Ｔｈｅｒｍｏ）に結合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣで構成されるＵ
ＰＬＣ－ＭＳシステムを使用して、得られたペプチドを分析した。ペプチドを２～３４％
の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％ギ酸）から１６．５分の勾配で５０×１ｍｍのＣ
８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中０．２％のギ酸であった。注入バルブ、及びペプ
シン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム、及びそれらに関連する接続チューブは、１０℃に維
持した冷却ボックス内に保持した。第２のスイッチングバルブ、Ｃ８カラム、及びそれら
に関連するステンレス鋼接続チューブは、－６℃に維持した別の冷却循環ボックス内に置
いた。ペプチド同定は、ＴＭＥＷ１配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索
することを通じて行った。前駆体及び産生物イオンの質量許容差は、それぞれ７ｐｐｍ及
び０．０２Ｄａであった。

【0467】

１０μＬのＴＭＥＷ１（５μｇ）又は１０μＬのＴＭＥＷ１及びＴＭＥＢ５７０又はＴ
ＭＥＢ６７５混合物（５μｇ：１５μｇ）を、１２０μＬの酸化重水素標識緩衝液（ｐＨ
７．４で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム）と共に１０℃で
０秒、３０秒、３６０秒、３６００秒、及び１４４００秒間インキュベートした。各時点
での水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を、重複して実施した。１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジ
ン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を添加することによ
って水素／重水素交換物をクエンチした。その後、クエンチしたサンプルを、上記に記載
されるようにオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ－ＭＳ分析に供し
た。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。

【0468】

未処理ＭＳデータを、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータの分析のためのソフトウェア、ＨＤＸ Ｗ
ｏｒｋＢｅｎｃｈを使用して処理した（Ｐａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ
．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２－１５２１）。重水素
化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との平均質量差を使用して、重水素レベルを算出した
。タンパク質の約９７－９９％を特定のペプチドにマッピングすることができた。重水素
蓄積曲線は、ペプチドの交換時間にわたって、傾斜に著しい差を示した。

【0469】

ＴＭＥＢ５７０エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２３５～２４９（残基付番に従った配
列番号２）での重酸素取り込みにおいて緩やかな低減を示し、膜近位領域内の例えば、残
基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）は、ＴＭＥＢ５７０への結合時にＨ
／Ｄ交換から保護された。

【0470】

ＴＭＥＢ６７５エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２５２～２６８（残基付番に従った配
列番号２）での重酸素取り込みにおいて緩やかな低減を示し、膜近位領域内の例えば、残
基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）は、ＴＭＥＢ６７５への結合時
にＨ／Ｄ／交換から保護された。

【0471】

したがって、ＴＭＥＢ５７０ ＴＭＥＦＦ２エピトープ残基は、ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭ
ＱＥＰＳＣ（配列番号５７）を包含し、ＴＭＥＢ６７５エピトープ残基は、ＤＡＧＹＴＧ
ＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）を包含した。両方の抗体は、膜近位領域内でＴ
ＭＥＦＦ２に結合した。

【0472】

実施例６．抗ＣＤ３抗体の生成
抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ２１９は、ＵＳ９８５０３１０に記載されている。

【0473】

追加の抗ＣＤ３抗体は、ＯｍｎｉＲａｔｓ（ＯＭＴ（商標））を免疫することによって
生成した^。得られたハイブリドーマ上清を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３^＋Ｔリンパ球へ
の結合についてスクリーニングし、クローンを単離し、配列決定し、場合によっては更に
操作した。抗ＣＤ３抗体を、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を有するエフ
ェクターサイレントＩｇＧ４を含む様々なアイソタイプとして、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３
５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ変異を有する
ＩｇＧ１としてクローニングした。生成した２つの抗ＣＤ３抗体を、ＣＤ３Ｂ３７６及び
ＣＤ３Ｂ４５０と命名した。

【0474】

ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０のヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性を、抗
原特異性標的アームと交差させた後、フローサイトメトリーによって決定した。抗ＣＤ３
トレーサー分子の飽和結合定数（ＫｄＴ）を決定するために、ヒトＴ細胞について予備研
究を実行した。次いで、試験ｍＡの滴定濃度を使用する競合結合アッセイに、トレーサー
の固定濃度（［Ｔ］）を使用した。試験分子のＩＣ_５０（５０％阻害が達成される濃度）
値を使用する次の式：Ｋ_ｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］／Ｋ_ｄＴ））を使用して、結合親
和性（Ｋ_ｄ）を決定した。トレーサー、市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ ＳＰ３４－
２抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）（データは示さず）の飽和結合定数
（Ｋ_ｄＴ）を決定するために、５人のヒトドナーを使用した。

【0475】

トレーサーの飽和結合定数（Ｋ_ｄＴ）の決定
方法：使用まで、ヒトｐａｎ Ｔ細胞を窒素タンク内に低温保存した。Ｔ細胞を解凍し
、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁し、計数し（生存率に留意して）、０．
５×１０^６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＫＡ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｌ３４９７４）（
バイアル中５０μＬのＤＭＳＯを）を１×１０^６個の細胞当たり１μＬで添加し、ＦｃＲ
ブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０－０５９－９０１）（０．５×１
０^６個の細胞当たり１：２０希釈の１ｍＬ）を各々細胞に１０分間添加した。細胞を５０
，０００個の細胞／ウェルで播種し、洗浄した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ ＳＰ－３
４抗ＣＤ３の濃度を増加させて、４℃で２時間、Ｔ細胞に添加した。細胞を洗浄して非結
合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＦＡＣＳ染色緩衝液
中に再懸濁した。

【0476】

ｉＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を
測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生存細胞について細胞をゲーティングし
た（ＦＬ４）。各ウェルの染色の幾何平均（ＦＬ１）を決定した。

【0477】

取得した平均蛍光強度値を抗体分子濃度の関数としてプロットし、一部位結合分析（総
結合）にＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則
に従う受容体（ヒトＰａｎ Ｔ細胞上のＣＤ３）への抗体分子の結合を説明する、対応す
るＫ_ｄ値を計算する。式は以下のとおりであり、（Ｂ_ｍａｘ×Ｘ）／（Ｋ_ｄ＋Ｘ）、式中
、Ｂｍａｘが最大結合であり、Ｋ_ｄが、半最大結合に達するのに必要な配位子の濃度であ
る。

【0478】

結果：各ドナーについてＫ_ｄ値を導出し、平均値を得た。ヒトＴ細胞の飽和結合定数（
Ｋ_ｄＴ）を５．６±１．０ｎＭ（ｎ＝４）から導出し、前述の式に使用して、Ｋ_ｄ結合親
和性を決定した。

【0479】

競合アッセイによる抗ＣＤ３ｍＡの結合親和性の決定
ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０を使用して競合結合研究を実施した。ヒトパンＴ細
胞を使用して、ｍＡｂの結合親和性を決定した。使用したトレーサーは、市販のＡｌｅｘ
ａＦｌｕｏｒ４８８ ＳＰ－３４抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）であ
り、このトレーサーの飽和結合定数は上記されている。

【0480】

Ｔ細胞は、使用まで、窒素タンク内に低温保存した。Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し
、ＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁し、計数し生存率に留意して、０．５×１０^６個の細胞／
ｍＬで再懸濁した。Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，ＡＫＡ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｌ３４９７４）（バイアル中５０μＬの
ＤＭＳＯを）を１×１０^６個の細胞当たり１μＬで添加し、ＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０－０５９－９０１）（０．５×１０＾６個の細胞当たり
１：２０希釈の１ｍＬ）を各々細胞に１０分間添加した。細胞を５０，０００個の細胞／
ウェルで播種し、洗浄した。

【0481】

ｍＡｂ（及びアイソタイプ対照）を、開始濃度１０００又は２００μｇ／ｍＬ（２×）
から１：２で連続希釈し、固定濃度（５μｇ／ｍＬ ２×）のトレーサーを一緒に混合し
て、１×濃度を得た。したがって、トレーサーの最終濃度（１×）は、２．５μｇ／ｍＬ
＝１６．６ｎＭであった。混合物をＴ細胞に４℃で２時間添加した。次いで、細胞を洗浄
して非結合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＦＡＣＳ染
色緩衝液中に再懸濁した。

【0482】

ｉＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を
測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生存細胞（ＦＬ４）について細胞をゲー
ティングした。各ウェルの染色の幾何平均（ＦＬ１）を決定した。取得した平均蛍光強度
値を、ｌｏｇ抗体分子濃度（ｎＭに変換）の関数としてプロットし、ＥＣ５０／ＩＣ５０
値（ｎＭ単位）が由来するシグモイド用量応答（可変勾配）にＰｒｉｓｍソフトウェアを
使用して分析した。結合親和性（Ｋ_ｄ）は、以下の式：Ｋ_ｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］
／Ｋ_ｄＴ））を使用して導出した。式中、Ｋ_ｄが、競合物（非標識分子）の親和性であり
、試験化合物のｎＭ単位でのＩＣ５０、［Ｔ］が、トレーサーの濃度（１６．６ｎＭ）で
あり、Ｋ_ｄＴが、飽和結合によって決定されるトレーサーのＫ_ｄである（ヒトについては
５．６ｎＭ）。

【0483】

ＣＤ３Ｂ３７６結合部位は、二価及び一価の両方の形態でＣＤ３Ｂ４５０よりも緊密で
あった。

【0484】

【表15】

【0485】

ＣＤ３Ｂ２１９、ＣＤ３Ｂ３７６、及びＣＤ３Ｂ４５０のＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬアミ
ノ酸配列を、表１６に示す。

【0486】

【表16】

【0487】

配列番号７６ ＣＤ３Ｂ２１９ ＨＣ、（ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３
５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰ
ＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳ
ＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡ
ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱ
ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳ
ＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ
ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ
ＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0488】

配列番号７７ ＣＤ３Ｂ２１９ ＬＣ
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴ
ＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫ
ＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴ
ＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

【0489】

配列番号７８ ＣＤ３Ｂ３７６ ＨＣ（ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５
Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＲＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＦＮＮＮＡＡＷＳＷＩ
ＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳＲＩＴＶＮＰＤＴＳＲ
ＮＱＦＴＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＹＳＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ
ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫ
ＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳ
ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶ
ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ
ＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴ
ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
ＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ
ＳＬＳＬＳＬＧＫ

【0490】

配列番号７９ ＣＤ３Ｂ３７６ ＬＣ
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱ
ＱＨＰＤＫＡＰＫＶＬＬＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧ
ＬＱＡＥＤＱＡＤＹＨＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶ
ＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶ
ＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶ
ＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

【0491】

表１７は、抗ＣＤ３抗体鎖をコードするポリヌクレオチドの配列番号を示す。

【0492】

【表17】

【0493】

配列番号１０５ ＣＤ３Ｂ２１９ ＶＨ ｃＤＮＡ
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧ
ＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴ
ＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣ
ＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣ
ＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡ
ＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧ
ＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣ
ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡ
ＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴ
ＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣＴ

【0494】

配列番号１０６ ＣＤ３Ｂ２１９ ＶＬ ｃＤＮＡ
ＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴ
ＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧ
ＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡ
ＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣ
ＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴ
ＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＴ
ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧ
ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡ
ＣＡＧＴＧＣＴＧ

【0495】

配列番号８０ ＣＤ３Ｂ２１９ ＨＣ ｃＤＮＡ
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧ
ＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴ
ＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣ
ＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣ
ＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡ
ＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧ
ＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣ
ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡ
ＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴ
ＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣ
ＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡ
ＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡ
ＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣ
ＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣ
ＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧ
ＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧ
ＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴ
ＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧ
ＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧ
ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴ
ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧ
ＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧ
ＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡ
ＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣ
ＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣ
ＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡ
ＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧ
ＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ
ＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣ
ＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣ
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【0496】

配列番号８１ ＣＤ３Ｂ２１９ ＬＣ ｃＤＮＡ
ＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴ
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【0497】

配列番号１０７ ＣＤ３Ｂ３７６ ＶＨ ｃＤＮＡ
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【0498】

配列番号１０８ ＣＤ３Ｂ３７６ ＶＬ ｃＤＮＡ
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【0499】

配列番号８２ ＣＤ３Ｂ３７６ ＨＣ ｃＤＮＡ
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【0500】

配列番号８３ ＣＤ３Ｂ３７６ ＬＣ ｃＤＮＡ
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴ
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ＧＡＡＴＧＴＴＣＡ

【0501】

実施例７．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体の生成
選択単一特異性抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３抗体をＩｇＧ４／κとして表した。抗ＴＭ
ＥＦＦ２抗体が野生型ＩｇＧ４を有したままで、抗ＣＤ３抗体にＦ４０５Ｌ及びＲ４０９
Ｋ置換（ＥＵ付番）を行った。位置４０５及び４０９置換に加えて、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３
４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するように、ＩｇＧ４ ｍＡｂを操作した。

【0502】

プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム）を使用す
る標準的な方法を使用して、単一特異性抗体を発現及び精製した。溶出後、プールを、Ｄ
－ＰＢＳ、ｐＨ７．２の中に透析した。

【0503】

二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体を、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載
のインビトロでのＦａｂアーム交換において、単一特異性ＴＭＥＦＦ２ ｍＡｂと単一特
異性ＣＤ３ ｍＡｂとを組み合わせることにより生成した。簡潔に言えば、ｐＨ７～７．
４のＰＢＳ中モル比１：１で、約１～２０ｍｇ／ｍＬの各抗体と、７５ｍＭの２－メルカ
プトエタノールアミン（２－ＭＥＡ）とを一緒に混合し、２５～３７℃で２～６時間イン
キュベートし、続いで透析、透析濾過、クロスフロー濾過、及び／又は標準的な方法を使
用する細胞濾過物のスピンを介して２－ＭＥＡを除去した。

【0504】

疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するインビトロＦａｂアーム交換の後、二重
特異性抗体を更に精製して、標準的な方法を使用して残留親抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３
抗体を最小限にした。

【0505】

表１８及び表１９は、生成された二重特異性抗体を示す。

【0506】

【表18】

【0507】

【表19】

【0508】

実施例８．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体の特性評価
分析用超遠心分離（Analytical Ultra Centrifugation、ＡＵＣ）による純度分析
分析用超遠心分離（ＡＵＣ）は、溶液中の巨大分子のサイズ、形状、凝集状態、及び可
逆的相互作用の決定を可能にする。沈降速度（Sedimentation velocity、ＳＶ）は、遠心
分離スピンの際に、濃度勾配をサンプルホルダー（セル）の外半径に移動させる、ＡＵＣ
技術である。これにより、分子のサイズ及び形状の因子である沈降係数の決定が可能にな
り、これは各分子に固有である。この目的に、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＡＵＣ装
置を使用した。サンプルを、１．２ｃｍのＢｅｃｋｍａｎセンターピース（定格５０Ｋ
ｒｐｍ）及び石英窓を装備した遠心セルに充填した。細胞をアセンブルし、１３０ｌｂｓ
にトルクをかける。遠心セルを、Ａｎ－５０（８穴）又はＡｎ－６０（４穴）ローターに
置き、ＡＵＣチャンバ内に置いた。運転を開始する前に、ＡＵＣの温度を、チャンバ内の
ローターで少なくとも１時間、２０．５°に平衡化した。スキャンカウント（２５０スキ
ャン）、スキャン収集の頻度（９０秒）、データ解像度（１０μＭ）、２８０ｎｍの波長
、４０Ｋ ｒｐｍで、ｍＡｂサンプルについて実験を実施した。データは、直接境界適合
ソフトウェアＳＥＤＡＮＡＬを使用して分析した。二重特異性抗体ＴＭＣＢ１５０及びそ
の親ｍＡｂの純度を測定した。ＴＭＣＢ１５０は、９７．１％モノマー、２．８％二量体
モノマーを示し、更なる生物物理的特性評価のために一過性に発現させた研究材料が許容
可能な基準を満たすＡＵＣによって決定される、凝集を示さなかった。ＴＭＥＢ７６２は
、９５．５％モノマー、４．５％二量体を示し、凝集は示さなかったが、ＣＤ３Ｂ３７６
は、凝集を示さずに９７．７％モノマー及び２．２％二量体を示した。最小２工程精製分
子の＞５％の凝集体濃度は、生物活性、溶解性、安定性、及び貯蔵寿命に著しい影響を及
ぼし得る。

【0509】

ＤＳＣによる抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性の立体配座安定性
ＴＭＣＢ１５０熱的アンフォールディングは、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）によって決
定し、これは、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２．６℃、６１．８℃での第１の熱転
移（Ｔｍ１）、６７．６℃での第２の熱転移（Ｔｍ２）、及び７５．５℃での第３の熱転
移（Ｔｍ３）を示した。前述のＤＳＣによって評価した親抗体（抗ＴＭＥＦＦ２、ＴＭＥ
Ｂ７６２、及び抗ＣＤ３、ＣＤ３Ｂ３７６）熱転移プロファイルに基づいて、ＴＭＣＢ１
５０のＴｍ１は、ＣＤ３Ｂ３７６ ＦＡＢのアンフォールディングに対応し、ＴＭＣＢ１
５０のＴｍ３は、ＴＭＥＢ７６２ Ｆａｂのアンフォールディング転移に対応する。

【0510】

血清安定性
血清安定性アッセイは、ヒト血清成分に対する非特異的又はオフ標的結合のためのリー
ド候補の特性を評価するために開発されている。これにより、不十分な薬物動態及び生物
分布特性を予測することができる。ＴＭＣＢ１５０の結合及び安定性は、蛍光系クロマト
グラフィー法を使用して、緩衝液及びヒト血清の両方で評価する。二重特異性抗体は、Ａ
ｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート（製造業者の指示に従ったＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎキット）で標識し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液及びヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ
４５２２）中４℃及び３７℃で２日間インキュベートし、次いで蛍光検出器を備えたＡｇ
ｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムを使用するＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した。凝集率は、
各ピークの曲線下面積の積分から計算する。ＴＭＣＢ１５０は、時間０でＨｅｐｅｓ緩衝
液中２．４％の凝集を示し、それぞれ摂氏４°及び３７°で２日後に２．０％及び１．３
％の凝集を示した。ヒト血清において、ＴＭＣＢ１５０は、摂氏４°及び３７°の両方で
、時間０で１，７％の凝集及び２日後に１．１％の凝集を示した。

【0511】

非特異的結合
無関係な表面へのリード分子の非特異的結合は、バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ
８Ｋ）によって決定する。抗体を、無関係なタンパク質でコーティングしたＳＰＲ表面
上に通過させる。抗体が、これらの無関係な表面への著しい結合を示す場合、不十分なイ
ンビボ特性を有し、製造上問題を呈すると予測される。最終濃度１μＭでリード分子を試
験する。無関係な表面としては、負に帯電したタンパク質（Ｓｏｙ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ）、正に帯電したタンパク質（リゾチーム及びβ－ディフェンシン）、
疎水性（Ｒｈ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａ４ｂ７）、ヒトＩｇＧ粘着性タンパク質（Ｒｈ－Ｃ
Ｄ１９）が挙げられる。この実験では、適切な対照を使用する。一方はブランクであり、
他方は直接固定化された分子を有する２つの表面上に、リードを流す。応答単位（respon
se unit、ＲＵ）レベルは、試験表面ＲＵからブランクＲＵを減算することによって決定
する。ＴＭＣＢ１５０のＲＵ及び親ｍＡｂを、以下の表に示す。製造中に問題を生じ、か
つ不十分なＰＫ特性を意味する応答単位≧１００では、帯電／疎水性／ＩｇＧ表面への非
特異的結合の高いリスクが予測される。抗体のうちのいずれも、無関係な表面への非特異
的結合を示さない場合、製造及びインビボ挙動でのリスクが、低いか全くないことが予測
される。

【0512】

【表20】

【0513】

高濃度安定性
注入量を低減して皮下投与を容易にするために、多くのモノクローナル抗体は、高濃度
（≧１００ｍｇ／ｍｌ）で配合される。加えて、全てのモノクローナル抗体は、精製プロ
セス中に一過的に高濃度（≧５０ｍｇ／ｍｌ）に曝露される。したがって、高濃度安定性
は、これらの分子の重要な品質属性である。３０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を備える遠心限外濾
過デバイスを使用して濃縮を実施する。５．１～５．３ｍｇの各タンパク質を最初に同じ
開始濃度に希釈し、１５分間隔に４０００ｘｇで遠心分離した。各１５分の遠心分離工程
の終了時に、濃縮器を遠心分離器から取り出し、残りのサンプル体積の視覚的推定値を記
録する。濃度は、ＳｏｌｏＶＰＥ装置によって測定する。濃縮したサンプルを４Ｃ及び４
０Ｃで２週間インキュベートし、一定時間間隔でアリコートを引いて、分析ＳＥＣによっ
て一体性を確認した。ＴＭＣＢ１５０及び親ｍＡｂ（ＣＤ３Ｂ３７６及びＴＭＥＢ７６２
）を通常どおり濃縮した。ＴＭＣＢ１５０の最終濃度は９９．４ｍｇ／ｍＬであり、親ｍ
Ａｂの濃度は５２．２ｍｇ／ｍＬ（ＴＭＥＢ７６２）及び５２．６ｍｇ／ｍＬ（ＣＤ３Ｂ
３７６）であった。濃度は４Ｃ及び４０Ｃで２週間同じままであり、これは、分子が、凝
集又はエッペンドルフチューブへの吸着の可能性がない、良好な固有特性を有することを
示唆している。ＳＥＣピーク積分から測定した種％（Ａ：凝集、Ｍ：モノマー、Ｆ：断片
）を以下の表に提供する。高濃度では、分子は、４０Ｃで２週間保存した後、４～５％の
凝集及び≦０．３％の断片で無傷であり、良好な貯蔵寿命が予測される。

【0514】

【表21】

【0515】

動態排除アッセイ（kinetic exclusion assay、ＫｉｎＥｘＡ）による抗ＴＭＥＦＦ２
／ＣＤ３二重特異性抗体の親和性決定
ＫｉｎＥｘＡ３２００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）
を使用して、二重特異性ｍＡｂ ＴＭＣＢ１５０及びその２価ＴＭＥＦＦ２親ＴＭＥＢ７
６２ｍＡｂの、ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への溶液平衡親和性Ｋ_Ｄを測
定した。ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の連続希釈を、１０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ、１５０ｍＭのＮａＣＬ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、０．１％のＢＳ
Ａ、及び０．０２％のＮａＮ３中で一定濃度の抗ＴＭＥＦＦ２ｍＡｂを用いて調製した。
結合相互作用が平衡に達するまで、反応混合物を室温でインキュベートした。インキュベ
ーションの継続時間は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアシミュレーションを使用して決定され
た。ビス－アクリルアミド／アズラクトンコポリマー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で構成される活性化前ビーズ上でのアミン結合による、ＴＭＥＦ
Ｆ２－ＥＣＤの直接的共有結合固定によってビーズを調製した。インキュベーション後、
サンプルをＫｉｎＥｘＡ装置にかけて、ＴＭＥＦＦ２修飾ビーズに混合物を通過させ、蛍
光標識された二次抗体を使用して捕捉抗体を検出することによって、混合物中の遊離抗体
を評価した。データは、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、１：１結合モデ
ルと適合させた。

【0516】

【表22】

【0517】

抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＮ末端ＣＤ３εペプチドに対する結合親和性
の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び抗ヒトＦｃバイオセンサー
表面を使用して実施したＳＰＲによって、動態速度定数を測定した。抗ヒト免疫グロブリ
ン抗体は、ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に共有結合させ
た。対象の抗体を抗ヒト免疫グロブリンセンサーチップ上に捕捉し、続いて０．０５％界
面活性剤Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）及び１００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＥＰ
ＥＳ緩衝生理食塩水中様々な濃度でＮ末端ＣＤ３εペプチドを注入した。表面を、１００
μＬ／分で３０μＬの０．８％リン酸の２パルス注入で再生した。データは、捕捉抗体を
含む流動細胞と、捕捉抗体を含まない参照細胞との間のＳＰＲシグナルの差異を報告した
。基準－除算シグナル（reference-subtracted signal）からブランク注入のデータを除
算することによって、シグナルに対する追加的な装置の寄与を除去した。Ｂｉａｅｖａｌ
ｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、１：１結合モデル
における全ての濃度（グローバルフィット）での会合及び解離段階を適合することにより
、データを分析した。データは、反復数の９５％ ＣＩ^＊標準偏差／平方根のｔ値によっ
て計算される平均＋９５％ ＣＩ（信頼区間）として報告する。

【0518】

【表23】

表２３．

【0519】

実施例９．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体は、前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷
に有効である。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷。

【0520】

前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷を媒介する能力について、選択二重特異性ＴＭＥＦＦ
２ｘＣＤ３抗体を評価した。
活性カスパーゼ３／７による蛍光基質の切断を介した細胞殺傷を間接的に測定するカス
パーゼ細胞障害アッセイを使用して、ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介
性殺傷を測定した。基質の開裂により、蛍光ＤＮＡ染色が生じ、蛍光は細胞核に制限され
る。同じ座標でウェル（複数可）を正確に撮像することができる電動式１０Ｘ対物レンズ
を使用して、アッセイの過程を通して、各ウェルで複数回蛍光測定を行う。標的細胞集団
は、定義されたサイズ制限に基づいて、及び／又は二次標識の使用を通じて同定する。

【0521】

正常な健康ドナーからの陰性選択によって、凍結Ｐａｎ ＣＤ３^＋Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を単
離した。ＴＭＥＦＦ２（ＬＮＣａＰ－ＡＲ）を発現する前立腺癌細胞を、１０％のＨＩ
ＦＢＳ＋サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ １６４
０中で培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ＋１０％
のＦＢＳ及びサプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（選択試薬なし）中
３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で組み合わせ、０．６ｕＬのＮｕｃＶｉｅｗカ
スパーゼ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造業者のガイドラインに従っ
て各ｍＬの細胞に添加した。０．１ｍＬの細胞の総体積を、透明な９６ウェル平底プレー
ト（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）の適切なウェルに添加した。ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３二重特異性
抗体を、上に示すように調製したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ中２倍の最終濃度
で調製し、０．１ｍＬの化合物を各ウェルに添加した。ウェルの縁部での細胞凝集を最小
限にするために室温で３０分間インキュベートした後、３７℃、５％ＣＯ_２に保持したＺ
ｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にプレートを移し
た。

【0522】

Ｉｎｃｕｃｙｔｅ上の処理定義は、製造業者のガイドラインに従って、試験する各細胞
株に対して設計した。カスパーゼシグナルにプラトーが観察されるまで、６時間ごとに測
定を行い、続いて、最高濃度の試験化合物（複数可）を含むウェル（複数可）では最大シ
グナルから３回又は４回以上連続的に減少した。

【0523】

アッセイが完了した後、適切な処理定義を使用して各プレートを分析した。未加工の蛍
光データをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍソフトウェアからエクスポートし、ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ））に貼り付けた。カスパーゼ３／７活性は、ＧｒａｐｈＰａｄで、各ウェルの曲
線下（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。Ｌｏｇ１０ ｎＭ化合物の関数として
ＡＵＣ値をプロットした。各用量曲線のナノモル（ｎＭ）でのＥＣ５０は、非線形回帰分
析（４パラメータ適合、最小二乗回帰）に従って報告した。各アッセイは、最低３つの生
物学的複製物を含み、各細胞株は、５人の健康なドナーからのＴ細胞を使用して試験した
。非線形回帰モデルを使用して、非臨床統計によってデータを更に分析した。

【0524】

図３は、選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体のカスパーゼ３／７活性を増加さ
せて測定したときの、経時的なＬｎＣａＰ細胞の殺傷を示す。

【0525】

二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体は、インビボ前立腺癌腫瘍モデルにおいて有効で
ある。
選択二重特異性抗体を、雄ＮＳＧマウスにおけるエクスビボＬｎＣａＰ前立腺癌モデル
で試験した。研究のために、５０％ Ｃｕｌｔｒｅｘ中１０^６個のＬｎＣａＰ細胞を０．
２ｍＬ／動物で、０日目に右脇腹に皮下注射により投与した。腫瘍がおよそ約１００～１
５０ｍｍ^３の体積に達したときに動物を無作為化し、１５日目に２０^６個のＴ細胞／マウ
スを腹腔内に注入した。各群に１０匹の動物を使用した。抗体を用いる処置は、Ｔ細胞注
入の１～３日後に開始した。抗体を週に２回腹腔内投与した。投与前に、全ての動物は、
ＩＶＩＧ＋Ｆｃ遮断を受けた。腫瘍が約１２００ｍｍ^３に達するまで、腫瘍体積及び体重
を週２回評価した。治療群を表２４に示す。これらのアッセイにおいてＣＤ３Ｂ２１９
ＣＤ３結合アーム及びｎｕｌｌアーム結合ＨＩＶ ｇｐ１２０を有する陰性対照として、
ＣＤ３ｘＮｕｌｌ抗体を使用した。

【0526】

【表24】

【0527】

表２５は、腫瘍移植後の各群ごとの３８日目の腫瘍成長阻害率を示す。

【0528】

図４は、腫瘍移植後の経時的な平均腫瘍体積の低減を示す。図５Ａは、０．５ｍｇ／ｋ
ｇのＴＭＣＢ９３で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。図５Ｂは、０．５ｍ
ｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。

【0529】

【表25】

【0530】

また、ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６（ＴＭＣＢ１５０）の有効性を、２０ｅ６Ｔ細
胞でヒト化した雄ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ
（ＮＳＧ）マウスで確立されたＬＮＣａＰ異種移植片で評価した。腫瘍移植１３日後に平
均腫瘍体積によって、動物を、各１０匹の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び
０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６、又は０．５ｍｇ／ｋｇのｎｕｌ
ｌｘＣＤ３Ｂ３７６抗体対照を、５週間の間週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植３５日後に群
当たり少なくとも８匹の動物が残存した場合、腫瘍体積によって決定された腫瘍成長阻害
（tumor growth inhibition、ＴＧＩ％）を計算した。統計的に著しい腫瘍成長阻害は、
ｎｕｌｌｘＣＤ３対照と比較して、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ
３Ｂ３７６で観察されたが、０．０５ｍｇ／ｋｇでは観察されなかった（図６）。ｎｕｌ
ｌｘＣＤ３処置対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのＴＭＥＢ
７６２ｘＣＤＢ３７６では、それぞれ１１０％、８８％、及び２５％の腫瘍成長阻害が誘
導された。ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤＢ３７６治療により、それぞれ０．５及び０．１ｍｇ／
ｋｇで７及び３匹に完全応答を生じた。皮下ＬＮＣａＰ腫瘍を、週２回キャリパで測定し
、結果を平均腫瘍体積（ｍｍ^３）±ＳＥＭ（群当たり≧８匹のマウス）として提示した。

【0531】

ＴＭＣＢ１３２の投与に応答したＴ細胞活性化
ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴ細胞活性化を、フローサイトメトリーによって、具
体的には、ＴＭＣＢ１３２治療の７２時間後に６つの別個の正常な健康ドナー（９６４２
、９６７２、９７６２、９７７２、９８３２、９８５２）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ
細胞のＣＤ２５陽性を評価することによって測定した（図７）。３：１のエフェクター標
的比で添加したＣＤ３＋ｐａｎ－Ｔ細胞の活性化は、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴ
ＭＣＢ１３２の投与に応答して観察された。

【0532】

インビトロでのＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介性細胞障害性
Ｔ細胞媒介性細胞障害アッセイを使用して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプラットフォーム上でラ
イブタイムラスプイメージングを使用して、インビトロでのＴＭＣＢ１３２の細胞障害性
の可能性を評価した。健康なドナーから単離したｐａｎヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、
ＴＭＥＦＦ２陽性細胞株ＬｎＣａＰでのＴＭＣＢ１３２を３：１の（エフェクター：標的
）エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）で試験した。９６時間の期間にわたって活性カスパ
ーゼ３／７の蛍光シグナルを測定することによって、アポトーシスによる細胞死を監視し
た。ＴＭＣＢ１３２は、時間の増加とともに、生存ＬｎＣａＰ細胞の用量依存的な低減を
促進した。カスパーゼ３／７活性又は蛍光シグナルの用量依存的増加は、Ｔ細胞の存在下
でＬｎＣａＰ細胞における細胞死を示した（図８）。データは、ＴＭＣＢ１３２が、Ｌｎ
ＣａＰ腫瘍細胞においてＴ細胞媒介性死を誘導するのに有効であることを示唆している。

【0533】

Ｔ細胞ヒト化マウスで確立されたＳＣヒト前立腺異種移植片におけるＴＭＣＢ１３２の
有効性。
ＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を、２０ｅ^６Ｔ細胞でヒト化した雄Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^{ｓ
ｃｉｄ} Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））マウスで確立された皮下（subcutaneous
、ＳＣ）ヒト前立腺ＬＮＣａＰ異種移植片において評価した。ＮＳＧ雄。腫瘍移植１３日
後に平均腫瘍体積によって、動物を、各１０匹の動物群に無作為化した。０．５、０．１
、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２、又は０．５ｍｇ／ｋｇのｎｕｌｌｘＣＤ３
Ｂ２１９抗体対照を、４週間の間週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植４５日後に群当たり少な
くとも７匹の動物が残存した場合、腫瘍体積によって決定された腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％
）を計算した。統計的に著しい腫瘍成長阻害は、ｎｕｌｌｘＣＤ３対照と比較して、０．
５及び０．１ｍｇ／ｋｇ、並びに０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で観察された（図
９、ｐ≦０．０００１）。ｎｕｌｌｘＣＤ３処置対照と比較して、０．５、０．１、及び
０．０５ｍｇ／ｋｇでのＴＭＣＢ１３２では、それぞれ１０２％、１０９％、及び４７％
の腫瘍成長阻害が誘導された。ＴＭＣＢ１３２治療は、それぞれ０．５、０．１、及び０
．０５ｍｇ／ｋｇで３、２、及び１匹に完全応答を生じた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024105476000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-06-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０５３３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0533】

Ｔ細胞ヒト化マウスで確立されたＳＣヒト前立腺異種移植片におけるＴＭＣＢ１３２の有効性。
ＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を、２０ｅ^６Ｔ細胞でヒト化した雄Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））マウスで確立された皮下（subcutaneous、ＳＣ）ヒト前立腺ＬＮＣａＰ異種移植片において評価した。ＮＳＧ雄。腫瘍移植１３日後に平均腫瘍体積によって、動物を、各１０匹の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２、又は０．５ｍｇ／ｋｇのｎｕｌｌｘＣＤ３Ｂ２１９抗体対照を、４週間の間週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植４５日後に群当たり少なくとも７匹の動物が残存した場合、腫瘍体積によって決定された腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）を計算した。統計的に著しい腫瘍成長阻害は、ｎｕｌｌｘＣＤ３対照と比較して、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇ、並びに０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で観察された（図９、ｐ≦０．０００１）。ｎｕｌｌｘＣＤ３処置対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのＴＭＣＢ１３２では、それぞれ１０２％、１０９％、及び４７％の腫瘍成長阻害が誘導された。ＴＭＣＢ１３２治療は、それぞれ０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇで３、２、及び１匹に完全応答を生じた。

以下の態様を包含し得る。
［１］ ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［２］ 前記抗体又は前記その抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関して、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む参照抗体と競合する、上記［１］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［３］ 前記抗体又は前記その抗原結合断片が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、上記［１］又は［２］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［４］ ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［５］ 前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．４×１０ ^－９ Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ _Ｄ ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合し、前記Ｋ _Ｄ が、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［６］ 前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．１×１０ ^－１０ Ｍ～約０．４×１０ ^－９ Ｍの前記Ｋ _Ｄ でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、上記［５］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［７］ ＶＨ３＿３－２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１－６９（配列番号５４）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［８］ ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号５６）に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、上記［７］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［９］ ａ）それぞれ配列番号５３のＶＨ３＿３－２３及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１、
ｂ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５６のＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、又は
ｃ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１－６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１
に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、上記［８］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１０］ ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１１］ 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１２］ ａ）配列番号３２の重鎖（ＨＣ）及び配列番号３５の軽鎖（ＬＣ）、
ｂ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
ｄ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
ｅ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、又は
ｆ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、上記［１１］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１３］ ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１４］ ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１５］ ａ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１６］ ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１７］ ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１８］ ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［１９］ 前記抗体が、多重特異性抗体である、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
［２０］ 前記抗体が、二重特異性抗体である、上記［１］～［１９］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
［２１］ 前記抗体が、ＣＤ３、所望によりＣＤ３イプシロンに結合する、上記［１９］又は［２０］に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
［２２］ 上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
［２３］ １つ又は２つ以上の異種分子にコンジュゲートした、上記［１］～［２０］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
［２４］ ａ）上記［１３］～［１８］のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードし、
ｂ）配列番号２５、２６、２７、８７、若しくは８９の前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体ＶＨ、及び／又は配列番号２８、２９、３０、３１、８８、若しくは９０のＶＬをコードし、
ｃ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１０２のポリヌクレオチド配列を含む、
単離されたポリヌクレオチド。
［２５］ 上記［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［２６］ 上記［２５］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［２７］ 上記［１３］～［１８］のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で上記［２６］に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、方法。
［２８］ ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の上記［１］～［２１］のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体若しくはその抗原結合断片、又は上記［２２］に記載の医薬組成物を、前記対象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。
［２９］ 前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、上記［２８］に記載の方法。
［３０］ 前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの任意の組み合わせである、上記［２９］に記載の方法。
［３１］ 前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、上記［２８］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］ 前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、上記［３１］に記載の方法。
［３３］ 上記［１３］～［１８］のいずれか一項に記載の抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。
［３４］ 上記［１３］～［１８］のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。
［３５］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［３６］ 前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の前記膜近位領域に結合する、上記［３５］に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［３７］ 前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関して、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、参照抗体と競合する、上記［３５］又は［３６］に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［３８］ 前記抗体が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、上記［３５］～［３７］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［３９］ 前記抗体が、約０．４×１０ ^－９ Ｍ以下の解離定数（Ｋ _Ｄ ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合し、前記Ｋ _Ｄ が、室温でｐＨ４．５～５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される、上記［３５］～［３８］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４０］ 前記抗体が、約０．１×１０ ^－１０ Ｍ～約０．４×１０ ^－９ Ｍの前記Ｋ _Ｄ でヒトＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、上記［３９］に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４１］ 前記第１のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、上記［３５］～［４０］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４２］ 前記第２のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５、又は
ｂ）それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、上記［４１］に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４３］ 前記第１のドメインが、
ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、上記［３５］～［４２］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４４］ 前記第２のドメインが、
ａ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｂ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬ、
を含む、上記［３５］～［４３］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４５］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３２の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４６］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４７］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４８］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［４９］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５０］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５１］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５２］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５３］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５４］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５５］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５６］ ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５７］ 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、上記［３５］～［５６］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５８］ 前記抗体が、ＨＣ１、ＨＣ２、又はＨＣ１及びＨＣ２に、位置２３４でアラニン、位置２３５でアラニン、又は位置２３４でアラニン及び位置２３５でアラニンを含み、残基の付番が、ＥＵインデックスに従う、上記［３５］～［５７］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［５９］ 前記抗体が、ＨＣ１及びＨＣ２に、位置２２８でプロリンを含み、残基の付番が、ＥＵインデックスに従う、上記［３５］～［５８］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［６０］ 前記抗体が、ＨＣ１に位置４０５でフェニルアラニン及び位置４０９でアルギニン、並びにＨＣ２に位置４０５でロイシン及び位置４０９でリジンを含む、上記［３５］～［５９］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［６１］ 上記［３５］～［６０］のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
［６２］ ａ）上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片をコードするか、又は
ｂ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８０、８１、８２、８３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、及び１０２のポリヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
［６３］ 上記［６２］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［６４］ 上記［６３］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［６５］ 二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で上記［６４］に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又は前記その抗原結合断片を回収及び精製することと、を含む、方法。
［６６］ 上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ）２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＣＤ３抗体を約１：１の混合物のモル比で組み合わせることと、
ｂ）前記混合物に還元剤を導入することと、
ｃ）前記混合物を約９０分～約６時間インキュベートすることと、
ｄ）前記還元剤を除去することと、
ｅ）ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を含む前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を精製することと、
を含む、方法。
［６７］ 前記還元剤が、２－メルカプトエタノールアミン（２－ＭＥＡ）である、上記［６６］に記載の方法。
［６８］ 前記２－ＭＥＡが、約２５ｍＭ～約７５ｍＭの濃度で存在する、上記［６７］に記載の方法。
［６９］ 前記インキュベートする工程が、約２５℃～約３７℃の温度で実施される、上記［６６］～［６８］のいずれか一項に記載の方法。
［７０］ ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の上記［４５］～［６０］のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は上記［６１］に記載の医薬組成物を、前記対象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。
［７１］ 前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、上記［７０］に記載の方法。
［７２］ 前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの任意の組み合わせである、上記［７１］に記載の方法。
［７３］ 前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、上記［７０］～［７２］のいずれか一項に記載の方法。
［７４］ 前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、上記［７３］に記載の方法。
［７５］ 上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片に結合する、抗イディオタイプ抗体。
［７６］ 上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。
［７７］ 療法に使用するための、上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［７８］ ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための、上記［４５］～［５６］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
［７９］ ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療用薬品の製造のための、上記［４５］～［６０］のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片の使用。

【外国語明細書】