特開 2024-105479 ＣＤ３３標的剤と共に使用するためのＣＤ３３エクソン２欠損型ドナー幹細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024105479

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ＣＤ３３標的剤と共に使用するためのＣＤ３３エクソン２欠損型ドナー幹細胞

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240730BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240730BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240730BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240730BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240730BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240730BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240730BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240730BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20240730BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240730BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240730BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240730BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H ZNA

A61K39/395 N

A61K35/17

A61K35/28

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K39/00 H

C12N15/09 110

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N5/10

C12N5/0789

C12N5/0783

C07K19/00

C07K14/705

C07K16/28

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024076658

(22)【出願日】2024-05-09

(62)【分割の表示】P 2020511435の分割

【原出願日】2018-08-28

(31)【優先権主張番号】62/551,075

(32)【優先日】2017-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】306018457

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ムケルジー，シッドハルシャ

(72)【発明者】

【氏名】アリ，アブドゥラー，マフムード

(72)【発明者】

【氏名】ボロット，フローレンス

(57)【要約】      （修正有）

【課題】系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤および前記抗原を欠損している造血細胞集団による、血液学的悪性疾患の免疫療法を提供する。
【解決手段】造血器悪性疾患を処置する方法であって、（ｉ）ＣＤ３３を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤がＣＤ３３を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞集団、を投与する工程を含む、方法とする。前述の薬剤は、抗原結合断片を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書または図面に実質的に記載された発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月２８日出願の米国特許仮出願第６２／５５１，０７５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。

【0002】

配列表の参照による援用
ＡＳＣＩＩテキストファイル「０１００１＿００６１３９＿ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（ファイルサイズ７３，７２８キロバイト）として提出された配列表は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

【背景技術】

【0003】

開示の背景
数十年にわたる努力にも関わらず、抗体またはＴ細胞（Ｔ細胞受容体を介する）のいずれかによる抗原認識能力を基本原理とする治効ある免疫学的がん治療は、その達成が非常に困難である（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：１４３２）。抗体に基づいた免疫療法は、標的抗原（例えば、Ｈｅｒ－２増幅乳癌におけるＨｅｒ－２）が腫瘍細胞中で正常細胞と比較して上方制御される症例、または腫瘍細胞が抗体または抗体－毒素抱合体（例えば、ＣＤ２０に対するリツキシマブ）によって認識され得る抗原を発現する症例（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００１）１２：Ｓ３５）における癌に対して広く使用されている。抗体に基づいた免疫療法を使用した臨床試験では、限られた数のがん型で患者の生存が改善されている（通常は標準的な化学療法と併用した場合）が、これらの効果は、しばしば、重大な安全性および有効性の懸念を伴う（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：１４３２）。

【0004】

有効ながんＴ細胞治療を臨床的に達成することはさらにより困難である（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）２０（１１）：１２４０）。有効ながんＴ細胞治療は、癌細胞上の抗原に指向される高親和性を有するＴ細胞に依存する。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、高い親和性および特異性で、かつペプチドを「提示する」ためのＨＬＡ抗原などのアクセサリー認識分子を必要とすることなく細胞上の抗原を認識するために広範に使用されている。ＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、抗原結合性の重鎖および軽鎖と「取り替えられ」、それにより、ＨＬＡアクセサリー分子を不要にする。組換えＣＡＲ Ｔ受容体がシグナル伝達ドメインに融合され、それにより標的抗原へのＣＡＲ Ｔ受容体の結合の際にＴ細胞が活性化する。

【0005】

ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床での使用は範囲の狭い細胞表面抗原の標的に制限されており、がん処置における改良された新規のアプローチの必要性をさらに裏付ける。

【0006】

特に、強化化学療法（現在の標準的ケア）を受けることができない高齢の患者における予後が依然として非常に不良である（生存期間の中央値がわずか５～１０ヶ月間）急性骨髄球性白血病（新）（ＡＭＬ）（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１５）３７３：１１３６）などの疾患に対する新規のアプローチが必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

開示の概要
本開示は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に以下の：（ｉ）ＣＤ３３を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤がＣＤ３３を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞集団、を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0008】

本開示は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に以下の：（ｉ）ＣＤ３３を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤がＣＤ３３を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量、および（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含むように遺伝子操作されている造血細胞集団、を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0009】

造血細胞は、同種または自家であり得る。

【0010】

造血細胞は造血幹細胞であり得る。造血幹細胞はＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－であり得る。造血幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来し得る。

【0011】

１つの実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９を含む。

【0012】

造血細胞は、遺伝子操作され得る。

【0013】

造血細胞は、エクソン２を欠くＣＤ３３の成熟転写物を含み得る。造血細胞は、変異型エクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含み得る。

【0014】

１つの実施形態では、造血細胞は、ＩｇＶドメインを欠損しているＣＤ３３を含む。別の実施形態では、造血細胞は、ＩｇＶドメインを欠くＣＤ３３を含む。さらに別の実施形態では、造血細胞は、変異型ＩｇＶドメインを有するＣＤ３３を含む。

【0015】

造血細胞は、ＣＤ３３を標的にする薬剤によって認識されないＣＤ３３を含み得る。

【0016】

造血細胞を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって操作できる。遺伝子操作された造血細胞を、ＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失されるようにＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を編集することによって調製できる。

【0017】

１つの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＳＲＳＦ２に対するエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉しＣＤ３３の成熟転写物からのエクソン２の喪失をもたらす変異が作出される。

【0018】

薬剤は、抗原結合断片を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞であり得る。免疫細胞はＴ細胞であり得る。

【0019】

キメラ受容体は、以下の：
（ａ）ヒンジドメイン、
（ｂ）膜貫通ドメイン、
（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、
（ｄ）細胞質シグナル伝達ドメイン、または
（ｅ）これらの組み合わせ
をさらに含み得る。

【0020】

キメラ受容体は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、およびＩＣＯＳからなる群から選択される共刺激受容体に由来する、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0021】

被験体は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、および／または多発性骨髄腫を有し得る。

【0022】

被験体は、急性骨髄球性白血病（新）、慢性骨髄性白血病（新）、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である白血病を有し得る。

【0023】

本開示は、少なくとも一部が、系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤（例えば、ＣＤ３３を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞）が、系譜特異的細胞表面抗原を発現する細胞の細胞死を選択的に引き起こすのに対して、前述の抗原を欠損する細胞（例えば、遺伝子操作された造血細胞）は抗原によって引き起こされる細胞死を回避するという発見に基づく。かかる所見に基づいて、系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤（例えば、ＣＤ３３を標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞）と、系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を欠損する造血細胞との組み合わせを含む免疫療法が造血器悪性疾患の有効な処置方法を提供すると予想されるであろう。

【0024】

一定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）を示すドナーＨＳＣの利用に関する。例えば、ＣがＴに変化したＳＮＰｒｓ１２４５９４１９（ｃｈｒ１９：５１，２２５，２２１；ｈｇ３８）は、ＳＲＳＦ２に対するエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それは、成熟転写物からのエクソン２の喪失をもたらす。エクソン２によってコードされる領域は、ＣＤ３３の細胞外領域であり、この領域は、ＣＤ３３を標的にするモノクローナル抗体の大部分の結合部位である。したがって、このＳＮＰ（またはＣＤ３３成熟転写物においてエクソン２を喪失させるか、欠損型エクソン２を生じる任意のＳＮＰ）を有するＨＳＣの利用は、系譜特異的細胞表面抗原が欠損または変異された造血細胞集団を提供し、それ故に、抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復できる標的化方法である。

【0025】

別の実施形態では、ゲノム操作方法（ゲノム操作を含む）が、ドナー細胞がＳＮＰｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示すかどうかと無関係に、ドナー細胞中のＥＳＥ部位を破壊するために使用され、それ故に、ＣＤ３３成熟転写物中のＣＤ３３エクソン２の喪失または変異を保証する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮ、ＺｎＦタンパク質、および／または修正ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９塩基編集システムを使用して、ドナー細胞におけるエクソン２スプライシングを破壊することができる（例えば、ＥＳＥ部位を破壊し、かつ／またはスプライスアクセプターを操作する）。ドナー細胞由来のＥＳＥ部位を破壊するためのこのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、系譜特異的細胞表面抗原が欠損または変異された造血細胞集団を提供するための代替方法であり、それ故に、抗原特異的処置後に正常な造血細胞に回復できる。したがって、この実施形態は、ＣＤ３３標的剤で処置された患者に対しＨＳＣを回復する方法である。

【0026】

したがって、本開示の実施形態は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および
（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を含む。

【0027】

さらなる実施形態では、造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示す。

【0028】

なおさらなる実施形態では、ＳＮＰがＳＲＳＦ２に対するエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失される。

【0029】

さらなる実施形態では、本開示は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量および
（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含むように遺伝子操作されている造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0030】

さらなる実施形態では、ＣＤ３３遺伝子は、造血細胞中でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって操作される。

【0031】

さらなる実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を、ＣＤ３３の発現を消失させるか、ＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失されるように編集することによって調製される。

【0032】

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＳＲＳＦ２に対するエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉しそれによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失される変異が作出される。

【0033】

なおさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＣＤ３３を標的にする薬剤によって認識されないＣＤ３３が得られる。

【0034】

ある実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を、ＣＤ３３の発現を消失させるか減少させるように編集することによって調製される。

【0035】

さらなる実施形態では、内因性遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって編集される。

【0036】

本開示の別の態様は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および（ｉｉ）系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞集団、を投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞、造血細胞、またはこれらの両方は、同種または自家である。いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から得ることができる。

【0037】

いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、タイプ２系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）である系譜特異的細胞表面抗原を結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、タイプ１系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ１９）である系譜特異的細胞表面抗原を結合する。

【0038】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合断片は、ヒトＣＤ３３またはＣＤ１９などのヒトタンパク質であり得る系譜特異的細胞表面抗原を特異的に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトＣＤ３３に結合し、かつ配列番号１２中の相補性決定部（ＣＤＲ）と同一のＣＤＲを有する重鎖可変領域および配列番号１３中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む。一例を挙げれば、ｓｃＦｖは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0039】

キメラ受容体は、（ａ）ヒンジドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、（ｄ）細胞質シグナル伝達ドメイン、または（ｅ）これらの組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、またはこれらの組み合わせの共刺激受容体に由来し得る少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むハイブリッド共刺激ドメインである。一例を挙げれば、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来し、キメラ受容体は４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第２の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８αまたはＣＤ２８α由来のヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳ由来である、膜貫通ドメインを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ由来の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメイン；（ｉｉ）系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジドメイン、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメイン；または（ｉｉｉ）系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジドメイン、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来の第１の共刺激ドメイン、４－１ＢＢ由来の第２の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメイン、を含む。

【0042】

本明細書中に記載のいずれかの方法では、被験体は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有し得る。いくつかの例では、被験体は、急性骨髄球性白血病（新）、慢性骨髄性白血病（新）、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である、白血病を有する。

【0043】

別の態様では、本開示は、本明細書中に記載の任意のキメラ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。キメラ受容体は、ＣＤ３３に結合する抗原結合断片、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメインなど）を含み得る。抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ断片）は、配列番号１２中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する重鎖可変領域および配列番号１３中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0044】

本開示の他の態様は、本明細書中に提供される任意の核酸を含むベクターを提供する。本明細書中に記載の核酸によってコードされるキメラ受容体およびかかるキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）も本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、造血器悪性疾患を有する患者から得ることができる。

【0045】

本開示は、変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。本開示は、エクソン２を欠くか、変異型エクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、少なくとも１つのｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子を保有し得る。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子（例えば、ｒｓ１２４５９４１９－ＣＴ）についてホモ接合性であり得るか、ｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子についてヘテロ接合性であり得る。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ＣＤ３３成熟転写物においてエクソン２の欠失または変異型エクソン２を生じる少なくとも１つの対立遺伝子を保有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３成熟転写物中のＣＤ３３のエクソン２の全体または一部は、欠失しているか、変異している。ゲノム編集または遺伝子操作（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが含まれる）を使用して、変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を操作することができる。

【0046】

本開示は、ＣＤ３３のＩｇＶドメインを欠損している造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。造血細胞（例えば、ＨＳＣ）は、ＩｇＶドメインを欠くＣＤ３３、および／または変異型ＩｇＶドメインを有するＣＤ３３を含み得る。造血細胞（例えば、ＨＳＣ）は、シアル酸を結合する能力を欠くか、野生型ＩｇＶドメインを有するＣＤ３３を有する造血細胞と比較して低下されたシアル酸結合能力を有し得る。

【0047】

配列番号５２～５８（表５～７）から選択される１つまたは複数のガイド配列と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用することによって調製される造血細胞（例えば、ＨＳＣ）も本開示に含まれる。

【0048】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－細胞）である。

【0049】

本開示の別の態様は、遺伝子操作前に造血細胞上に存在する系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１９）を欠損している、遺伝子操作された造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。いくつかの実施形態では、系譜特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子の全体または一部が、例えば、ゲノム編集（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む）によって欠失されている。いくつかの実施形態では、系譜特異的細胞表面抗原はＣＤ３３であり、ＣＤ３３の免疫グロブリン定常（ＩｇＣ）ドメインの一部が欠失されている。いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－細胞）である。

【0050】

いくつかの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から得ることができる。

【0051】

本明細書中に記載の系譜特異的細胞表面抗原を欠失している細胞を産生する方法も本明細書中に提供される。本方法は、細胞を準備する工程、および（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１９）をコードするヌクレオチド配列の一部とハイブリッド形成するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のヌクレオチド配列を含む核酸、および（ｉｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を細胞に導入する工程を含む。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼのヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、同一の核酸上または異なる核酸上にコードされ得るか、予め形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、それに対しｇＲＮＡがハイブリッド形成するヌクレオチド配列部分は、１８～２２ヌクレオチドからなる。いくつかの例では、ｇＲＮＡは、配列番号１１または２８～３１のヌクレオチド配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋）などの造血細胞である。

【0053】

（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤；および（ｉｉ）系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞（例えば、造血幹細胞）の集団を含むキットも本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤は、系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。

【0054】

さらに、本開示は、造血器悪性疾患の処置で用いる系譜特異的細胞表面抗原を標的にする任意の免疫細胞および／または系譜特異的細胞表面抗原を欠損している任意の造血細胞を含む医薬組成物；ならびに造血器悪性疾患の処置で用いる医薬の製造のための免疫細胞および造血細胞の使用を提供する。

【0055】

本開示の１つまたは複数の実施形態を、以下の説明で詳述する。本開示の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。

【0056】

図面の簡単な説明
包袋は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写物は、請求および必要な料金の支払いによって、特許庁より提供されるであろう。

【0057】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の一定の態様をさらに実証するために含まれており、本明細書中に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することにより、より深く理解できる。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１は、タイプ０、タイプ１、タイプ２、およびタイプ３の系譜特異的抗原の例示的な図を示す。

【図2】図２は、タイプ０系譜特異的細胞表面抗原ＣＤ３０７を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞を示す略図である。ＣＤ３０７を発現する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞およびＣＤ３０７を発現する他の細胞（形質細胞など）は、抗ＣＤ３０７キメラ受容体を発現する免疫細胞の標的にされる。

【図3】図３は、タイプ２系譜特異的細胞表面抗原ＣＤ３３を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞を示す略図である。ＣＤ３３を発現する急性骨髄球性白血病（新）（ＡＭＬ）細胞。ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３３を欠失するように遺伝子操作されており、したがって、抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞によって認識されない。ＨＳＣは、骨髄性細胞を生じることができる。

【図4】図４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するゲノム編集を示す略図である。ｓｇＲＮＡは、系譜特異的細胞表面抗原のエクソンの一部とハイブリッド形成し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（５’－ＮＧＧ－３’）の上流を切断する。配列は、上から下に、配列番号４５および４６に対応する。

【図5】図５は、ＣＤ３３を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するゲノム編集ストラテジーを示す略図である。Ｃａｓ９タンパク質およびＣＤ３３を標的にするガイドＲＮＡをコードするＰＸ４５８ベクターを、Ｋ－５６２細胞（ヒト白血病細胞株）にヌクレオフェクトした。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの細胞への送達前（上のプロット）および後（下のプロット）に抗ＣＤ３３抗体を使用して前述の細胞集団に対してフローサイトメトリーを行った。ゲノム編集により、遺伝子のコード領域が欠失し、細胞表面由来のＣＤ３３が有意に減少した。

【図6】図６は、ＣＤ４５ＲＡを破壊するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するゲノム編集ストラテジーを示す略図である。Ｃａｓ９タンパク質およびＣＤ４５ＲＡを標的にするガイドＲＮＡをコードするＰＸ４５８ベクターを、ＴＩＢ－６７細網肉腫マウスマクロファージ様細胞にヌクレオフェクトした。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの細胞への送達前（上のプロット）および後（下のプロット）に抗ＣＤ４５ＲＡを使用して前述の細胞集団に対してフローサイトメトリーを行った。ゲノム編集により、遺伝子のコード領域が欠失し、細胞表面由来のＣＤ４５ＲＡが有意に減少した。

【図7A】図７Ａ～７Ｄは、ＣＤ３３を標的にする抗原結合断片を含む例示的なキメラ受容体の略図を示す。図７Ａ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含むＣＤ３３を標的にする一般的なキメラ受容体。

【図7B】図７Ａ～７Ｄは、ＣＤ３３を標的にする抗原結合断片を含む例示的なキメラ受容体の略図を示す。図７Ｂ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含むＣＤ３３を標的にするキメラ受容体。

【図7C】図７Ａ～７Ｄは、ＣＤ３３を標的にする抗原結合断片を含む例示的なキメラ受容体の略図を示す。図７Ｃ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＩＣＯＳ（またはＣＤ２７、４－１ＢＢ、もしくはＯＸ－４０）およびＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含むＣＤ３３を標的にするキメラ受容体。

【図7D】図７Ａ～７Ｄは、ＣＤ３３を標的にする抗原結合断片を含む例示的なキメラ受容体の略図を示す。図７Ｄ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２８、およびＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含むＣＤ３３を標的にするキメラ受容体。

【図8】図８は、免疫毒素の略図である。

【図9A】図９Ａ～９Ｂは、空のベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターで形質導入したＫ５６２細胞で発現された抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す。図９Ａ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を使用するウェスタンブロット。表は、試験した各キメラ受容体の推定分子量を示す。

【図9B】図９Ａ～９Ｂは、空のベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターで形質導入したＫ５６２細胞で発現された抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す。図９Ｂ：抗ＣＤ３３キメラ受容体に対して陽性染色される細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｃは、抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１０Ａ：ポンソー染色したタンパク質ゲル。レーン１，３，５：ＣＤ３３分子。レーン２，４，６：ＣＤ３３ｍｏｌ＋ＡＰＣ抱合体。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｃは、抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１０Ｂ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を使用するウェスタンブロット。レーン１、３、および５は、ＣＤ３３分子と同時インキュベートしたキメラ受容体を含み、レーン２、４、および６は、ＣＤ３３－ＡＰＣ抱合体と同時インキュベートしたキメラ受容体を含む。

【図10C】図１０Ａ～１０Ｃは、抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１０Ｃ：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現し、ＣＤ３３に結合する細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｂは、表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。図１１Ａ：空のＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ２。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｂは、表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。図１１Ｂ：空のＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ３。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｂは、表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞の細胞傷害性（ｙ軸に細胞傷害率として示す）を示す。図１２Ａ：ＣＤ３３標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬で予め処置した未選別のＫ５６２細胞集団。

【図12B】図１２Ａ～１２Ｂは、表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞の細胞傷害性（ｙ軸に細胞傷害率として示す）を示す。図１２Ｂ：ＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞の単一クローン。カラムは、左から右に、空のＨＩＶｚｓＧベクター、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、およびＣＡＲＴ３に対応している。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、初代Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１３Ａ：Ｔ細胞マーカーＣ４^＋、ＣＤ８^＋、または両方ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋の発現に基づいた細胞選別。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｂは、初代Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す。図１３Ｂ：表示の初代Ｔ細胞集団におけるＣＤ３３の相対発現。

【図14A】図１４Ａ～１４Ｂは、表示のキメラ受容体を発現する初代Ｔ細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。図１４Ａ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞。

【図14B】図１４Ａ～１４Ｂは、表示のキメラ受容体を発現する初代Ｔ細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。図１４Ｂ：ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋（ＣＤ４／８）およびＣＤ８^＋（ＣＤ８）。

【図15】図１５は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２つの異なるｇＲＮＡ（Ｃｒｉｓｐｒ３（右上のパネル）およびＣｒｉｓｐｒ５（右下のパネル））を使用するＫ５６２細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す。

【図16A】図１６Ａ～１６Ｃは、ＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞が正常な細胞増殖および赤血球生成性分化（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を示すことを示す。図１６Ａ：１日目＋５０μＭヘミンでの表示の細胞集団のフローサイトメトリー分析。

【図16B】図１６Ａ～１６Ｃは、ＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞が正常な細胞増殖および赤血球生成性分化（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を示すことを示す。図１６Ｂ：９日目の表示の細胞集団のフローサイトメトリー分析。

【図16C】図１６Ａ～１６Ｃは、ＣＤ３３を欠損しているＫ５６２細胞が正常な細胞増殖および赤血球生成性分化（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を示すことを示す。図１６Ｃ：ＭＴＴ細胞増殖アッセイ。

【図17A】図１７Ａ～１７Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２つの異なるｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ３（左下のパネル）およびｃｒｉｓｐｒ５（右下のパネル））を使用するヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す。図１７Ａ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析。

【図17B】図１７Ａ～１７Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２つの異なるｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ３（左下のパネル）およびｃｒｉｓｐｒ５（右下のパネル））を使用するヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す。図１７Ｂ：ｃｒｉｓｐｒ３。

【図17C】図１７Ａ～１７Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび２つの異なるｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ３（左下のパネル）およびｃｒｉｓｐｒ５（右下のパネル））を使用するヒトＣＤ３４^＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す。図１７Ｃ：ｃｒｉｓｐｒ５。

【図18】図１８は、ヒトＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^＋細胞と比較したヒトＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－細胞のコロニー形成を示す。カラムは、左から右に、レンチウイルス感染なし、空のベクターコントロール、ｃｒｉｓｐｒ１、ｃｒｉｓｐｒ３、およびｃｒｉｓｐｒ５に対応している。

【図19】図１９は、ＣＤ３３のエクソン２をコードする１９番染色体の重要な領域、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法のためのＰＡＭ配列を有するガイドおよびニッカーゼスキームの概要である。ガイド配列：ＡＧＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣ（配列番号５９）、ＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣ（配列番号６０）、ＧＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣ（配列番号６１）。

【図20】図２０は、ＣＤ３３遺伝子遺伝子座のゲノム編集を用いた場合と用いない場合の仮説上のスプライシングのシナリオを示す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

開示の詳細な説明
癌細胞表面上に存在する抗原を標的にするがん免疫療法は、標的抗原が被験体の発生および／または生存に必要とされるか非常に関与する正常な非癌細胞の表面上にも存在する場合に、特に困難である。これらの抗原を標的にすることは、癌細胞に加えてかかる細胞に対しても免疫療法の細胞傷害効果が及ぶので、被験体に悪影響をもたらし得る。

【0060】

本明細書中に記載の方法、核酸、および細胞は、癌細胞上だけでなく、被験体の発生および／または生存に極めて重要な細胞上にも存在する抗原（例えば、タイプ１またはタイプ２の抗原）を標的にすることを可能にする。本方法は、（１）標的系譜特異的細胞表面抗原を保有する細胞の数を、かかる抗原を標的にする薬剤を使用して減少させること；および（２）抗原を提示ししたがって薬剤の投与によって死滅し得る正常細胞（例えば、非癌細胞）を、系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞と置換することを含む。本明細書中に記載の方法は、目的の系譜特異的細胞表面抗原を発現する標的細胞（癌細胞を含む）の監視を維持し、かつ被験体の発生および／または生存に極めて重要であり得る前述の系譜特異的抗原を発現する非癌細胞集団の監視も維持することができる。

【0061】

したがって、系譜特異的細胞表面抗原（ＣＤ３３またはＣＤ１９など）を標的にする抗原結合断片を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞と、造血器悪性疾患を処置するための系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）など）との同時使用を本明細書中に記載する。キメラ受容体、かかるキメラ受容体をコードする核酸、かかるキメラ受容体を含むベクター、およびかかるキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）も本明細書中に提供する。本開示はまた、系譜特異的抗原を欠損している遺伝子操作された造血細胞（本明細書中に記載の細胞など）およびかかる細胞の作製方法（例えば、ゲノム編集法）を提供する。

【0062】

定義
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、またはマウス、ウシ、ウマ、イヌ、もしくはネコの種を含むが、これらに限定されない。本開示の文脈では、用語「被験体」はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養できるか、ｉｎ ｖｉｖｏで操作できる組織および細胞を含む。用語「被験体」を、用語「生物」と互換的に使用できる。

【0063】

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」を、互換的に使用する。これらの用語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのヌクレオチドのいずれかの多量体形態を指す。ポリヌクレオチドの例は、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオチドをさらに改変することができる。ヌクレオチドの配列を、非ヌクレオチド成分で分断することもできる。ポリヌクレオチドを、標識剤との抱合などによって重合後に改変することもできる。

【0064】

用語「ハイブリッド形成」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対合、フーグスティーン型結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二重鎖を形成する２本の鎖、多重鎖を形成する３本またはそれを超える鎖、自己ハイブリッド形成する一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリッド形成反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断などの、より広範な過程の一工程を構成し得る。所与の配列とハイブリッド形成できる配列は、所与の配列の「相補物」と呼ばれる。

【0065】

用語「組換え発現ベクター」は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの構築物を意味し、この構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合に、このベクターは前述の細胞内で前述のｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるのに十分な条件下でこの細胞と接触される。本開示のベクターは、全体として天然に存在しない。一部のベクターは、天然に存在し得る。本開示の天然に存在しない組換え発現ベクターは、任意のタイプのヌクレオチド（合成されたか、一部には天然供給源から得た一本鎖または二本鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに天然、非天然、または変化したヌクレオチドを含み得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むが、これらに限定されない）を含み得る。

【0066】

本明細書中で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」は、物理的方法または化学的方法を使用する宿主細胞への１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。

【0067】

「抗体」、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、または「抗原結合部分」は、特異的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片または一部を意味するために互換的に使用される（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（９）：１１２６）。本発明の抗体は、抗体および／またはその断片であり得る。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｆｃ、またはバリアントおよび／もしくは混合物を含む。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、または二重得意性抗体であり得る。全ての抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む）が本開示に含まれる。適切なＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域は、フレームワーク領域と、その間に挟み込まれた相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域とからなる。本発明の抗体または抗原結合部分のＣＤＲは、非ヒトまたはヒト供給源に由来し得る。本発明の抗体または抗原結合部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒトのフレームワーク（例えば、ヒトにおける抗原性を減少させるように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、コンセンサス配列）であり得る。

【0068】

本発明の抗体または抗原結合部分は、約１０^－７Ｍ未満、約１０^－８Ｍ未満、約１０^－９Ｍ未満、約１０^－１０Ｍ未満、約１０^－１１Ｍ未満、または約１０^－１２Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で特異的に結合することができる。本開示の抗体の親和性を、従来の技術を使用して容易に決定できる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物を参照のこと）。

【0069】

用語「キメラ受容体」、「キメラ抗原受容体」、または「ＣＡＲ」は、本明細書を通して互換的に使用され、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および以下に定義の刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書中で「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８（１０）：２７８０；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１４）２５７（１）：１２７；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｃａｎｃｅｒ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃａｒ－ｔ－ｃｅｌｌｓ。１つの実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。１つの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの以下に定義の共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。共刺激分子はまた、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／もしくはＤ２８、またはこれらの分子の断片であり得る。別の態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。あるいは、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲはまた、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質含み得る。核酸配列によってコードされるＣＡＲの抗原認識部分は、任意の系譜特異的抗原結合抗体断片を含むことができる。抗体断片は、１つまたは複数のＣＤＲ、可変領域（またはその一部）、定常領域（またはその一部）、または前述のうちのいずれかの組み合わせを含むことができる。

【0070】

用語「シグナル伝達ドメイン」は、セカンドメッセンジャーを生成するか、かかるメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することによって定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活動を制御するように細胞内に情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分を指す。

【0071】

用語「ζ」あるいは「ζ鎖」、「ＣＤ３－ζ」、または「ＴＣＲ－ζ」を、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿９３２１７０、ＮＰ＿０００７２５、またはＸＰ＿０１１５０８４４７として提供されるタンパク質；または非ヒト種（例えば、マウス、げっ歯類、サル、および類人猿など）由来の等価な残基と定義し、「ζ刺激ドメイン」あるいは「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」または「ＴＣＲ－ζ刺激ドメイン」を、Ｔ細胞活性化に必要な最初のシグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基と定義する。

【0072】

用語「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」は、遺伝子操作によって（例えば、ゲノム編集によって）操作された細胞を指す。すなわち、細胞は、前述の細胞中に天然には存在しない異種配列を含む。典型的には、異種配列を、ベクター系または細胞に核酸分子を導入するための他の手段（リポソームを含む）を介して導入する。異種核酸分子を、細胞のゲノムに組み込むことができるか、例えば、プラスミドの形態で、染色体外に存在させることができる。この用語は、遺伝子操作された単離ＣＡＲポリペプチドの細胞への導入の実施形態も含む。

【0073】

用語「自家の」は、同じ個体由来の任意の材料を指し、この材料は後に、同じ個体に再度導入される。

【0074】

用語「同種の」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。１つまたは複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合の２またはそれを超える個体を相互に同種であるという。

【0075】

用語「細胞系譜」は、共通の祖先を有し、同じタイプの同定可能な細胞から特定の同定可能な／機能性細胞へと発達する細胞を指す。本明細書中で使用される細胞系譜は、呼吸器、前立腺、膵臓、乳房、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血器、筋肉、または心臓の細胞系譜を含むが、これらに限定されない。

【0076】

用語「阻害」は、系譜特異的抗原の遺伝子の発現または機能に関して使用される場合、系譜特異的抗原の遺伝子の発現レベルまたは機能の低下を指し、ここで阻害は、遺伝子の発現または機能の干渉の結果である。阻害は、完全（発現または機能が検出不可能である場合）であり得るか、部分的であり得る。部分的阻害は、ほぼ完全な阻害～ほぼ存在しない阻害の範囲であり得る。特定の標的細胞の排除により、ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定の細胞系譜の発現全体を有効に阻害できる。

【0077】

「系譜特異的抗原を欠損している」造血細胞などの細胞は、その天然に存在する対応物（例えば、同一タイプの内因性造血細胞、または系譜特異的抗原を発現しない、すなわち、ＦＡＣＳなどの日常的なアッセイによって検出不可能な、細胞）と比較して系譜特異的抗原の発現レベルが実質的に低下している細胞を指す。いくつかの例では、「抗原を欠損している」細胞の系譜特異的抗原の発現レベルは、天然に存在する対応物の同じの系譜特異的抗原の発現レベルの約４０％未満（例えば、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ未満）であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「約」は、特定の値＋／－５％を指す。例えば、約４０％の発現レベルは、３５％～４５％の間の任意の発現量を含み得る。

【0078】

系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤
本開示の態様は、例えば、標的癌細胞上の系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤を提供する。かかる薬剤は、系譜特異的細胞表面抗原を結合し標的にする抗原結合断片を含み得る。いくつかの例では、抗原結合断片は、系譜特異的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。

【0079】

Ａ．系譜特異的細胞表面抗原
本明細書中で使用される場合、用語「系譜特異的細胞表面抗原」および「細胞表面系譜特異的抗原」は、互換的に使用でき、細胞表面上に十分に存在し、かつ細胞系譜（複数可）の１つまたは複数の集団に関連する任意の抗原を指す。例えば、抗原は、細胞系譜（複数可）の１つまたは複数の集団上に存在してよく、かつ他の細胞集団の細胞表面上で不在であり得る（または低レベルで存在し得る）。

【0080】

一般に、系譜特異的細胞表面抗原を、抗原および／または抗原が存在する細胞集団が宿主生物の生存および／または発生に必要であるかどうかなどのいくつかの要因に基づいて分類できる。系譜特異的抗原の例示的なタイプのまとめを、以下の表１に提供する。図１も参照のこと。

【0081】

【表1】

【0082】

表１および図１に示すように、タイプ０系譜特異的細胞表面抗原は、組織のホメオスタシスおよび生存に必要であり、タイプ０系譜特異的細胞表面抗原を保有する細胞型も被験体の生存に必要であり得る。したがって、タイプ０系譜特異的細胞表面抗原またはタイプ０系譜特異的細胞表面抗原を保有する細胞のホメオスタシスおよび生存における重要性を考慮すると、このカテゴリーの抗原を標的にすることは、かかる抗原およびかかる抗原を保有する細胞の阻害または除去は被験体の生存に有害であり得るので、従来のＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法を使用して困難であり得る。したがって、系譜特異的細胞表面抗原（タイプ０系譜特異的抗原など）および／またはかかる抗原を保有する細胞型は生存に必要であり得る（例えば、それらが被験体において重要な必須の機能を果たすため）ので、この系譜特異的抗原タイプはＣＡＲ Ｔ細胞ベースの免疫療法の良い標的ではないであろう。

【0083】

タイプ０抗原と対照的に、タイプ１細胞表面系譜特異的抗原およびタイプ１細胞表面系譜特異的抗原を保有する細胞は、組織のホメオスタシスまたは被験体の生存に必要とされない。タイプ１細胞表面系譜特異的抗原を標的にしても、被験体において有害な結果をもたらす可能性は低い。例えば、ＣＤ３０７（正常な形質細胞上および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞上の両方に固有に発現されるタイプ１抗原）を標的にするように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、両方の細胞型を排除するであろう（図２）（Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１０：２２２２（２０１２））。しかし、形質細胞系譜は生物の生存のために消費されるので、ＣＤ３０７および他のタイプ１系譜特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの免疫療法に適切な抗原である。タイプ１クラスの系譜特異的抗原は、多種多様な異なる組織（卵巣、精巣、前立腺、乳房、子宮内膜、および膵臓を含む）で発現され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、タイプ１抗原である細胞表面系譜特異的抗原を標的にする。

【0084】

タイプ１抗原と比較して、タイプ２抗原を標的にすることは、非常に困難である。タイプ２抗原は、以下を特徴とする抗原である：（１）この抗原は、生物の生存のために重要ではない（すなわち、生存に必要とされない）、かつ（２）この抗原を保有する細胞系譜は、生物の生存に不可欠である（すなわち、特定の細胞系譜は生存に必要とされる）。例えば、ＣＤ３３は、正常な骨髄性細胞および急性骨髄球性白血病（新）（ＡＭＬ）細胞の両方で発現されるタイプ２抗原である（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３７３：１１３６（２０１５））。結果として、ＣＤ３３抗原を標的にするように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、正常な細胞およびＡＭＬ細胞の両方を死滅させることができ、このことは被験体の生存には不適合であり得る（図３）。いくつかの実施形態では、薬剤は、タイプ２抗原である細胞表面系譜特異的抗原を標的にする。

【0085】

本開示の方法および組成物によって多種多様な抗原を標的にすることができる。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入するか、目的の抗原での動物の免疫化後の従来のモノクローナル抗体法（例えば、上記考察のＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリッド形成技術）を含む、標準的な技術を使用して生成できる。抗体または抗体をコードする核酸を、任意の標準的なＤＮＡまたはタンパク質の配列決定技術を使用して配列決定できる。

【0086】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法および細胞を使用して標的にされる細胞表面系譜特異的抗原は、白血球または白血球の亜集団の細胞表面系譜特異的抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原は、骨髄性細胞に関連する抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原は、細胞膜分化抗原（ＣＤ）である。ＣＤ抗原の例は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、Ｄ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、およびＣＤ３６３を含むが、これらに限定されない。ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＢＤ＿Ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ＣＤＭａｒｋｅｒＨｕｍａｎ＿Ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆ．を参照のこと。

【0087】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６である。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原は、ＣＤ３３またはＣＤ１９である。

【0088】

あるいはまたはさらに、細胞表面系譜特異的抗原は、癌抗原（例えば、癌細胞上に差分的に存在する細胞表面系譜特異的抗原）であり得る。いくつかの実施形態では、癌抗原は、組織または細胞系譜に特異的な抗原である。特定の癌タイプに関連する細胞表面系譜特異的抗原の例は、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（新）（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（コモン（プレＢ）急性リンパ球性白血病および悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮およびリンパ性の悪性疾患）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、およびＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性疾患）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌腫、胆管腺癌、および膵臓の導管腺腫）、ならびに前立腺特異的膜抗原を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原ＣＤ３３は、ＡＭＬ細胞に関連する。

【0089】

Ｂ．抗原結合断片
任意の抗体またはその抗原結合断片を、本明細書中に記載の系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の構築のために使用できる。かかる抗体または抗原結合断片を、従来の方法、例えば、ハイブリドーマテクノロジーまたは組換えテクノロジーによって調製できる。

【0090】

例えば、目的の系譜特異的抗原に特異的な抗体を、従来のハイブリドーマテクノロジーによって作製できる。ＫＬＨなどの担体タンパク質にカップリングできる系譜特異的抗原を使用して、かかる複合体に結合する抗体を生成するための宿主動物を免疫化できる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、本明細書中にさらに記載されるように、抗体の刺激および産生のための確立された従来の技術を遵守する。マウス抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の産生のための一般的な技術は当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている。任意の哺乳動物被験体（ヒトまたはヒト由来の抗体産生細胞を含む）を、哺乳動物（ヒトハイブリドーマ細胞株を含む）の産生のための基本としての機能を果たすように操作できることが意図される。典型的には、宿主動物に、ある量の免疫原（本明細書中に記載の免疫原を含む）を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内に接種する。

【0091】

ハイブリドーマを、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７の一般的な体細胞ハイブリッド形成技術またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７－３８１（１９８２）による修正された技術を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製できる。利用可能な骨髄腫株（Ｘ６３－Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ由来の骨髄腫株を含むが、これらに限定されない）を、ハイブリッド形成で使用できる。一般に、技術は、ポリエチレングリコールなどの融合物質を使用するか、当業者に周知の電気的手段による骨髄腫細胞およびリンパ球系細胞の融合を含む。融合後に、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択成長培地中で成長させて、ハイブリッド形成しなかった親細胞を排除する。血清を補足するか補足しない本明細書中に記載の任意の培地を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養のために使用できる。細胞融合技術の代替技術として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本明細書中に記載のＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生できる。ハイブリドーマを拡大およびサブクローン化し、必要に応じて、上清を、従来の免疫アッセイ手順（例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイする。

【0092】

抗体の供給源として使用できるハイブリドーマは、系譜特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導体、子孫細胞を含む。かかる抗体を産生するハイブリドーマを、公知の手順を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで成長させることができる。モノクローナル抗体を、必要に応じて従来の免疫グロブリン精製手順（硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィ、および限外濾過など）によって、培養培地または体液から単離できる。必要に応じて、望ましくない活性（ある場合）を、例えば、固相に付着させた免疫原から作製された吸着剤上に調製物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出するか放出させることによって除去できる。二機能性剤または誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による抱合）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による抱合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である））を使用する、免疫化される種において免疫原性を示すタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤）に抱合された標的抗原または標的アミノ酸配列を含む断片での宿主動物の免疫化は、抗体集団（例えば、モノクローナル抗体）を生成できる。

【0093】

必要に応じて、目的の抗体（例えば、ハイブリドーマによって産生）を配列決定でき、次いで、ポリヌクレオチド配列を、発現または増殖のためのベクター中にクローン化できる。目的の抗体をコードする配列を、宿主細胞にてベクター中で維持でき、次いで、宿主細胞を拡大し、その後の使用のために凍結できる。代替法では、遺伝子操作のためにポリヌクレオチド配列を使用して、抗体を「ヒト化」するか、親和性（親和性の成熟）または抗体の他の特徴を改善できる。例えば、抗体を臨床試験およびヒトでの処置で使用する場合、定常領域を、免疫応答を回避するためにヒト定常領域により類似するように操作できる。系譜特異的抗原に対する親和性がより高くなるように抗体配列を遺伝子操作することが望ましいかもしれない。抗体の１つまたは複数のポリヌクレオチドを変化させても前述の抗体の標的抗原に対する結合特異性を依然として維持できることが当業者に明らかであろう。

【0094】

他の実施形態では、完全ヒト抗体を、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用して得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはより頑強な免疫応答が得られるように設計されたトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成のために使用することもできる。かかるテクノロジーの例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。代替法において、抗体を、ファージディスプレイまたは酵母テクノロジーによって組換えて作成できる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７；５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０；ならびにＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイテクノロジー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３）を使用して、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生できる。

【0095】

インタクトな抗体（全長抗体）の抗原結合断片を、日常的な方法によって調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片を、抗体分子のペプシン消化によって産生でき、Ｆａｂ断片を、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成できる。

【0096】

遺伝子操作された抗体（ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異性抗体など）を、例えば、従来の組換えテクノロジーによって産生できる。一例を挙げれば、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用により）容易に単離しおよび配列決定できる。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡを１つまたは複数の発現ベクター中に配置でき、次いで、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成する。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２号を参照のこと。ＤＮＡを次いで、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列をマウス相同配列の代わりに置き換えること（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１）によるか、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合により連結することによって改変できる。この様式で、標的抗原への結合特異性を有する遺伝子操作された抗体（「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体など）を調製できる。

【0097】

「キメラ抗体」の産生のために開発された技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４；およびＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照のこと。

【0098】

ヒト化抗体を構築する方法も、当該分野で周知である。例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）を参照のこと。一例を挙げれば、親非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域を、当該分野で公知の方法後に三次元分子モデリング解析に供する。次に、正確なＣＤＲ構造の形成に重要であると予想されるフレームワークアミノ酸残基を、同一の分子モデリング解析を使用して同定する。並行して、親非ヒト抗体のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するヒトのＶＨ鎖およびＶＬ鎖を、検索クエリーとして親のＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、任意の抗体遺伝子データベースから同定する。次いで、ヒトのＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子を選択する。

【0099】

選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域を、親非ヒト抗体またはその機能的バリアント由来のＣＤＲ領域と置換できる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用に重要であると予想される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記説明を参照のこと）を使用して、ヒトアクセプター遺伝子中の対応する残基を置換できる。

【0100】

単鎖抗体を、組換えテクノロジーを用いて、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することによって調製できる。好ましくは、可動性リンカーを、２つの可変領域の間に組み込む。あるいは、単鎖抗体の産生について記載の技術（米国特許第４，９４６，７７８号および同第４，７０４，６９２号）を採用してファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリーを産生でき、系譜特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンを、日常的な手順後にライブラリーから同定できる。陽性クローンをさらなるスクリーニングに供して、系譜特異的抗原に結合するクローンを同定できる。

【0101】

いくつかの例では、目的の系譜特異的抗原はＣＤ３３であり、抗原結合断片はＣＤ３３（例えば、ヒトＣＤ３３）を特異的に結合する。抗ヒトＣＤ３３抗体の例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列を、以下に提供する。アミノ酸配列中のＣＤＲ配列を、下線を引いた太字で示す。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【0102】

本明細書中に記載のＣＤ３３を標的にする薬剤の構築で用いる抗ＣＤ３３抗体結合断片は、配列番号１２および配列番号１３と同一の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域を含み得る。かかる抗体は、１つまたは複数のフレームワーク領域中のアミノ酸残基変異を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３３抗体断片は、配列番号１２と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を有する重鎖可変領域を含みおよび／または配列番号１３と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を有する軽鎖可変領域を含み得る。

【0103】

２つのアミノ酸配列の「同一率」を、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３にあるように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定する。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して実行して、本開示のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載のギャップありＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップありＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用できる。

【0104】

Ｃ．キメラ受容体を発現する免疫細胞
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤は、系譜特異的抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合できる抗原結合断片（例えば、単鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。キメラ受容体の抗原結合断片によってその細胞表面上に系譜特異的抗原を有する標的細胞（例えば、癌細胞）が認識されると、キメラ受容体のシグナル伝達ドメイン（複数可）（例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または細胞質シグナル伝達ドメイン）に活性化シグナルが伝達され、それはキメラ受容体を発現する免疫細胞におけるエフェクター機能を活性化できる。

【0105】

本明細書中で使用される場合、キメラ受容体は、宿主細胞表面上で発現され細胞表面系譜特異的抗原に結合する抗原結合断片を含む天然に存在しない分子を指す。一般に、キメラ受容体は、異なる分子に由来する少なくとも２つのドメインを含む。本明細書中に記載の抗原結合断片に加えて、キメラ受容体は、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインの１つまたは複数をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、細胞表面系譜特異的抗原、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のキメラ受容体は、抗原結合断片と膜貫通ドメインの間に存在し得るヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、タンパク質の２ドメイン間に一般に見いだされ、相互に比較してタンパク質の可撓性およびドメインの一方または両方の運動性を付与し得るアミノ酸セグメントである。キメラ受容体の別のドメインと比較して抗原結合断片にかかる可撓性および運動性を付与する任意のアミノ酸配列を使用できる。

【0107】

ヒンジドメインは、約１０～２００アミノ酸（例えば、１５～１５０アミノ酸、２０～１００アミノ酸、または３０～６０アミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、約１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００アミノ酸長であり得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該分野で公知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書中に記載のキメラ受容体での使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に可撓性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部であり、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）の連続するアミノ酸を含む断片である。

【0109】

抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体など）のヒンジドメインはまた、本明細書中に記載のキメラ受容体での使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインであり、抗体のヒンジドメインおよび抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインおよび抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。

【0110】

天然に存在しないペプチドであるヒンジドメインを含むキメラ受容体も本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端の間のヒンジドメインは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカー（式中、ｘおよびｎは、独立して、３と１２の間の整数（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれを超える整数を含む）であり得る）などの、ペプチドリンカーである。

【0111】

本明細書中に記載のキメラ受容体のヒンジドメインで使用できるさらなるペプチドリンカーは当該分野で公知である。例えば、Ｗｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）８０（６）：７３６－７４６およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０８８４６１号を参照のこと。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のキメラ受容体は、膜貫通ドメインを含み得る。キメラ受容体で用いる膜貫通ドメインは、当該分野で公知の任意の形態であり得る。本明細書中で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造を指す。本明細書中で使用されるキメラ受容体での使用に適合する膜貫通ドメインを、天然に存在するタンパク質から得ることができる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメント（例えば、細胞膜中で熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメント）であり得る。

【0113】

膜貫通ドメインは、膜貫通ドメイントポロジー（膜貫通ドメインの膜通過数およびタンパク質の配向を含む）に基づいて分類される。例えば、１回貫通タンパク質は細胞膜を１回通過し、複数回貫通膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれを超える回数）通過する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、１回貫通膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、キメラ受容体のＮ末端が細胞の細胞外側に配向し、キメラ受容体のＣ末端が細胞の細胞内側に配向する１回貫通膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、１回貫通膜貫通タンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８αの膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＣＯＳの膜貫通ドメインである。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のキメラ受容体は、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、エフェクター機能などの免疫応答を誘導するように細胞内のシグナル伝達を媒介するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書中に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球など）によって媒介される応答を調整する、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、１つを超える（少なくとも２、３、４、またはそれを超える）共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、異なる共刺激タンパク質から得られる１つを超える共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。

【0116】

一般に、多数の免疫細胞は、細胞の増殖、分化、および生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生および分泌、食作用性、増殖、分化、生存、および／または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導できる。任意の共刺激タンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書中に記載のキメラ受容体での使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、キメラ受容体を発現すると考えられる免疫細胞のタイプ（例えば、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞株、ＮＫ細胞株）および所望の免疫エフェクター機能（例えば、細胞傷害性）などの要因に基づいて選択される。キメラ受容体で用いる共刺激シグナル伝達ドメインの例は、共刺激タンパク質（ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、Ｃｄ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３を含むが、これらに限定されない）の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳに由来する。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはＣＤ２８に由来し、キメラ受容体は、４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第２の共刺激ドメインを含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、１つを超える共刺激ドメインまたは１つを超える共刺激ドメインの一部を含む融合ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ由来の共刺激ドメインの融合物である。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のキメラ受容体は、細胞質シグナル伝達ドメインを含む。任意の細胞質シグナル伝達ドメインを、本明細書中に記載のキメラ受容体で使用できる。一般に、細胞質シグナル伝達ドメインは、シグナル（細胞外リガンド結合ドメインのそのリガンドとの相互作用など）を中継して、細胞のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性）の誘導などの細胞応答を刺激する。

【0119】

当業者に明らかなように、Ｔ細胞活性化に関与する要因は、細胞質シグナル伝達ドメインの免疫受容体免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化である。当該分野で公知の任意のＩＴＡＭ含有ドメインを使用して、本明細書中に記載のキメラ受容体を構築できる。一般に、ＩＴＡＭモチーフは、６～８アミノ酸で分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉ（式中、各ｘは、独立して、任意のアミノ酸である）の２つのリピートを含んでよく、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉを産生する。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。

【0120】

例示的なキメラ受容体を、以下の表２および表３に提供する。

【0121】

【表2】

【0122】

キメラ受容体の構築のための例示的な成分の核酸配列を以下に提供する。

【化5】

【化6】

【化7】

【0123】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＣＤ３３に結合し、かつ配列番号１２のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する重鎖可変領域および配列番号１３のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む抗原結合断片をコードする。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、配列番号１２によって提供される重鎖可変領域および配列番号１３によって提供される軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ヒンジドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。

【0124】

表３は、本明細書中に記載の例示的なキメラ受容体を提供する。例示的な構築物は、Ｎ末端からＣ末端に、抗原結合断片、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの例では、キメラ受容体は、抗原結合断片と膜貫通ドメインの間に存在するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの例では、キメラ受容体は、膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間に存在し得る１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。

【0125】

【表3】

【0126】

上記の表３に列挙した例示的なキメラ受容体のアミノ酸配列を、以下に提供する：

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【0127】

上記の表３に列挙した例示的なキメラ受容体の核酸配列を、以下に提供する：

【化16】

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

【化21】

【化22】

【0128】

本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を、組換えテクノロジーなどの日常的な方法によって調製できる。本明細書中のキメラ受容体を調製する方法は、キメラ受容体の各ドメイン（抗原結合断片および、任意選択的に、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む）を含むポリペプチドをコードする核酸の生成を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の各成分をコードする核酸は、組換えテクノロジーを使用して相互に連結される。

【0129】

キメラ受容体の各成分の配列を、日常的なテクノロジー（例えば、当該分野で公知の種々の供給源の任意の１つ由来のＰＣＲ増幅）から得ることができる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の１つまたは複数の成分の配列を、ヒト細胞から得る。あるいは、キメラ受容体の１つまたは複数の成分の配列を合成できる。各成分（例えば、ドメイン）の配列を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を使用して直接または間接的に（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用して）連結して、キメラ受容体をコードする核酸配列を形成できる。あるいは、キメラ受容体をコードする核酸を合成できる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。

【0130】

各成分の配列の連結前または連結後のキメラ受容体の１つまたは複数の成分（例えば、抗原結合断片など）内の１つまたは複数の残基の変異。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の成分の１つまたは複数を、標的の成分（例えば、標的抗原の抗原結合断片）の親和性を調整（増加または減少）し、および／または成分の活性を調整するように変異させることができる。

【0131】

本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を、従来のテクノロジーによって発現に適切な免疫細胞中に導入できる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、初代Ｔ細胞またはＴ細胞株などのＴ細胞である。あるいは、免疫細胞は、樹立ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ－９２細胞）などのＮＫ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ８（ＣＤ８^＋）またはＣＤ８およびＣＤ４（ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋）を発現するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、樹立Ｔ細胞株のＴ細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞）である。

【0132】

初代Ｔ細胞を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺、または腫瘍組織などの組織など、任意の供給源から得ることができる。所望の免疫細胞型を得るのに適切な供給源は、当業者に自明であろう。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、患者から得た骨髄由来またはＰＢＭＣ由来など、造血器悪性疾患を有するヒト患者に由来する。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、健康なドナーに由来する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、キメラ受容体を発現する免疫細胞がその後に投与される被験体から得られる。そこから細胞が得られた同じ被験体に投与される免疫細胞が自家細胞と呼ばれるのに対して、免疫細胞が投与される被験体ではない被験体から得られる免疫細胞は同種異系細胞と呼ばれる。

【0133】

所望の宿主細胞型を、刺激分子と細胞を共インキュベーションすることにより得られた細胞の集団内で拡大でき、例えば、Ｔ細胞の拡大のために抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。

【0134】

本明細書中に記載の任意のキメラ受容体構築物を発現する免疫細胞を構築するために、キメラ受容体構築物の安定発現または一過性発現のための発現ベクターを、本明細書中に記載の従来の方法を介して構築し、免疫宿主細胞に導入できる。例えば、キメラ受容体をコードする核酸を、適切な発現ベクター（適切なプロモーターに作動可能に連結されるウイルスベクターなど）中にクローン化できる。核酸およびベクターを適切な条件下で制限酵素と接触させて、相互に対合できリガーゼを用いて連結できる各分子上の相補性末端を作出できる。あるいは、合成核酸リンカーを、キメラ受容体をコードする核酸の末端にライゲートできる。合成リンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、キメラ受容体発現のための宿主細胞型に依存するであろうが、真核細胞での取り込みおよび複製に適切であるべきである。

【0135】

種々のプロモーターを、本明細書中に記載のキメラ受容体の発現のために使用でき、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、Ｍａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲ、骨髄増殖性（ｍｙｅｏｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター、ＥＦ１－αイントロンを含むか含まない伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーターを含むが、これらに限定されない。キメラ受容体発現のためのさらなるプロモーターは、免疫細胞中で構成性に活性な任意のプロモーターを含む。あるいは、免疫細胞内での発現を調整できるような任意の制御可能なプロモーターを使用できる。

【0136】

さらに、ベクターは、例えば、以下のいくつかまたは全てを含み得る：宿主細胞中で安定なまたは一過性のトランスフェクタントを選択するためのネオマイシン遺伝子などの選択マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；α－グロビンまたはβ－グロビンのような高発現遺伝子由来のｍＲＮＡ安定性および翻訳効率のための５’－および３’－非翻訳領域；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多用途多重クローニング部位；センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７プロモーターおよびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；誘発された場合にベクターを保有する細胞を死滅させる「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、およびキメラ受容体の発現を評価するためのレポーター遺伝子。以下のセクションＶＩを参照のこと。導入遺伝子を含むベクターの産生に適切なベクターおよび方法は、当該分野で周知であり、かつ利用可能である。キメラ受容体の発現のためのベクターの調製例を、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。

【0137】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物または前述のキメラ受容体をコードする核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物または前述のキメラ受容体をコードする核酸はＤＮＡベクターであり、免疫細胞に電気穿孔され得る（例えば、Ｔｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１１９（１７）：３９４０－３９５０を参照のこと）。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードする核酸はＲＮＡ分子であり、ＲＮＡ分子は、免疫細胞に電気穿孔され得る。

【0138】

本明細書中に記載のキメラ受容体構築物をコードする核酸配列を含む任意のベクターも、本開示の範囲内にある。かかるベクターを、適切な方法によって宿主免疫細胞などの宿主細胞中に送達できる。免疫細胞へのベクターの送達方法は、当該分野で周知であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンのエレクトロポレーション、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンを送達させるためのトランスフェクション試薬（リポソームまたはナノ粒子など）；機械的変形によるＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンもしくはタンパク質の送達（例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０（６）：２０８２－２０８７を参照のこと）；またはウイルス形質導入を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現用ベクターは、ウイルス形質導入によって宿主細胞に送達される。例示的なウイルス送達方法は、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６号；ＷＯ９４／０３６２２号；ＷＯ９３／２５６９８号；ＷＯ９３／２５２３４号；ＷＯ９３／１１２３０号；ＷＯ９３／１０２１８号；ＷＯ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４２号を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号；ＷＯ９３／１９１９１号；ＷＯ９４／２８９３８号；ＷＯ９５／１１９８４号、およびＷＯ９５／００６５５号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、キメラ受容体発現用のベクターは、レトロウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体発現用のベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体発現用のベクターは、アデノ随伴ウイルスである。

【0139】

ウイルスベクターを使用してキメラ受容体をコードするベクターを宿主細胞に導入する例では、免疫細胞に感染できかつベクターを保有するウイルス粒子を、当該分野で公知の任意の方法によって産生でき、前述の方法を、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２号、ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１号、および米国特許第６，１９４，１９１号に見出すことができる。ウイルス粒子を細胞培養上清から採取し、単離および／または精製後にウイルス粒子を免疫細胞と接触させることができる。

【0140】

本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を発現する宿主細胞の調製方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで免疫細胞を活性化および／または拡大する工程を含み得る。宿主細胞の活性化は、宿主細胞がエフェクター機能（例えば、細胞傷害性）を発揮できるかもしれない活性状態に宿主細胞を刺激することを意味する。宿主細胞を活性化する方法は、キメラ受容体の発現のために使用される宿主細胞の型に依存するであろう。宿主細胞の拡大は、キメラ受容体を発現する細胞の数を増加させる任意の方法を含み、例えば、宿主細胞を増殖させるか、宿主細胞を増殖するよう刺激する。宿主細胞の拡大を刺激する方法は、キメラ受容体の発現のために使用される宿主細胞の型に依存し、この方法は当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を発現する宿主細胞は、被験体への投与前にｅｘ ｖｉｖｏで活性化および／または拡大される。

【0141】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤は、抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）である。当業者に明らかなように、用語「抗体薬物抱合体」は、「免疫毒素」と互換的に使用でき、毒素または薬物の分子に抱合された抗体（またはその抗原結合断片）を含む融合分子を指す。抗体の対応する抗原への結合により、細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）に毒素または薬物の分子が送達され、それにより、標的細胞の死滅をもたらす。

【0142】

いくつかの実施形態では、薬剤は抗体薬物抱合体である。いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体は、抗原結合断片および標的細胞において細胞傷害性を誘導する毒素または薬物を含む。いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体は、タイプ２抗原を標的にする。いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体は、ＣＤ３３またはＣＤ１９を標的にする。

【0143】

いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体の抗原結合断片は、配列番号１２によって提供される重鎖可変領域と同一の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１３によって提供される軽鎖可変領域と同一の軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体の抗原結合断片は、配列番号１２によって提供される重鎖可変領域および配列番号１３によって提供される同一の軽鎖可変領域を有する。

【0144】

抗体薬物抱合体での使用に適合する毒素または薬物は、当該分野で周知であり、当業者に自明であろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５を参照のこと。いくつかの実施形態では、抗体薬物抱合体は、抗体および薬物の分子に付着するリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）をさらに含み得る。

【0145】

本明細書中に記載のＡＤＣを、本明細書中に記載の併用療法を受けている被験体に対する継続処置として使用できる。

【0146】

系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞
本開示はまた、系譜特異的細胞表面抗原を欠損するように遺伝子改変されているＨＳＣなどの造血細胞を提供する。いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞の両方を生成でき、これらの前駆細胞は、骨髄性細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）をそれぞれさらに生成できる。ＨＳＣは細胞表面マーカーＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４^＋）の発現（これをＨＳＣの同定および／または単離に使用できる）およびある細胞系譜への拘束に関連する細胞表面マーカーが存在しないことを特徴とする。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、哺乳動物被験体などの被験体から得られる。いくつかの実施形態では、哺乳動物被験体は、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ヒト患者（造血器悪性疾患を有するヒト患者など）から得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、健康なドナーから得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞がその後に投与される被験体から得られる。そこから細胞が得られる同じ被験体に投与されるＨＳＣが自家細胞と呼ばれるのに対して、ＨＳＣが投与される被験体ではない被験体から得られるＨＳＣは同種異系細胞と呼ばれる。

【0148】

ＨＳＣを、当該分野で公知の従来の手段を使用して、任意の適切な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、被験体由来の試料（骨髄試料など）または血液試料から得られる。あるいはまたはさらに、ＨＳＣを、臍帯から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来する。一般に、骨髄細胞を、被験体の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の骨髄腔から得ることができる。骨髄を、患者から採取し、当該分野で公知の種々の分離手順および洗浄手順によって単離できる。例示的な骨髄細胞の単離手順は、以下の工程を含む：ａ）骨髄試料の抽出；ｂ）骨髄懸濁液の３つの画分への遠心分離による分離および中間画分（すなわち、バフィーコート）の収集；ｃ）工程（ｂ）由来のバフィーコート画分を分離液（一般に、Ｆｉｃｏｌｌ（商標））中で再度遠心分離し、骨髄細胞を含む中間の画分を収集すること；およびｄ）再輸液可能な骨髄細胞の回収のために工程（ｃ）由来の収集した画分を洗浄すること。

【0149】

ＨＳＣは典型的には、骨髄中に存在するが、末梢血からＨＳＣを採取するために動員剤を投与することにより循環血中に動員できる。いくつかの実施形態では、そこからＨＳＣを得る被験体に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などの動員剤を投与する。動員剤を用いる動員後のＨＳＣの収集数は典型的には、動員剤を使用せずに得られる細胞数より多い。

【0150】

いくつかの実施形態では、試料を被験体から得、次いで、所望の細胞型（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－細胞）を富化する。例えば、本明細書中に記載のように、ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ３４^＋造血細胞を血液から単離できる。細胞を、例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いる単離および／または活性化によって、他の細胞から単離することもできる。使用できる別の方法は、受容体連結による細胞の活性化を用いずに特定の細胞を選択的に富化させるための細胞表面マーカーに対する抗体を使用するネガティブ選択を含む。

【0151】

ＨＳＣ集団を、系譜特異的細胞表面抗原が欠損するようにＨＳＣを遺伝子操作する前または後に拡大できる。細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、またはインターロイキン６（ＩＬ－６）などの、１つまたは複数のサイトカインを含む拡大培地を含む条件下で培養できる。細胞を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日間または必要に応じた任意の範囲の日数で拡大できる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣを、被験体から得た試料からの所望の細胞集団（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－）の単離後かつ遺伝子操作前に拡大する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣを遺伝子操作後に拡大し、それにより遺伝子改変を受けておりかつ系譜特異的細胞表面抗原を欠損している細胞を選択的に拡大する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変後に所望の特徴（例えば、表現型または遺伝子型）を有するある細胞（「クローン」）またはいくつかの細胞を選択し、独立して拡大できる。

【0152】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系譜特異的抗原を欠損するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、造血細胞は、薬剤によって標的にされる同一の細胞表面系譜特異的抗原を欠損するように遺伝子操作される。本明細書中で使用される場合、造血細胞は、造血細胞が、遺伝子操作された造血細胞と同型の天然に存在する造血細胞（例えば、ＣＤ３４などの同一の細胞表面マーカーの存在を特徴とする）と比較して、実質的に低下された細胞表面系譜特異的抗原の発現を有する場合、細胞表面系譜特異的抗原を欠損していると見なされる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系譜特異的抗原の検出可能な発現がない。細胞表面系譜特異的抗原の発現レベルを、当該分野で公知の任意の手段によって評価できる。例えば、細胞表面系譜特異的抗原の発現レベルを、抗原特異的抗体を用いて抗原を検出すること（例えば、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング）によって評価できる。

【0153】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞上の細胞表面系譜特異的抗原の発現を、天然に存在する造血細胞上の細胞表面系譜特異的抗原の発現と比較する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作により、天然に存在する造血細胞上の細胞表面系譜特異的抗原の発現と比較して、細胞表面系譜特異的抗原の発現レベルが、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％減少する。

【0154】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系譜特異的抗原をコードする内因性遺伝子全体を欠損している。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原をコードする内因性遺伝子全体が欠失されている。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系譜特異的抗原をコードする内因性遺伝子の一部を含む。いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系譜特異的抗原の一部（例えば、短縮タンパク質）を発現する。他の実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原をコードする内因性遺伝子の一部が欠失されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれを超える細胞表面系譜特異的抗原をコードする遺伝子が欠失されている。

【0155】

当業者が認識するように、細胞表面系譜特異的抗原をコードするヌクレオチド配列の一部または１つまたは複数の非コード配列を、造血細胞が抗原を欠損する（例えば、実質的に低下された抗原発現を有する）ように欠失させることができる。

【0156】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原はＣＤ３３である。ＣＤ３３の予測される構造は、２つの免疫グロブリンドメイン、１つのＩｇＶドメイン、および１つのＩｇＣ２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３の免疫グロブリンＣドメインの一部が欠失される。

【0157】

細胞表面系譜特異的抗原を欠損している、ＨＳＣなどの、任意の遺伝子操作された造血細胞を、日常的な方法または本明細書中に記載の方法によって調製できる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集を使用して遺伝子操作を行う。本明細書中で使用される場合、「ゲノム編集」は、生物の、任意のタンパク質コードまたは非コードヌクレオチド配列を含むゲノムを、標的遺伝子の発現をノックアウトするように改変する方法を指す。一般に、ゲノム編集法は、例えば標的にされたヌクレオチド配列で、ゲノムの核酸を切断できるエンドヌクレアーゼの使用を含む。ゲノム中の二本鎖切断物を、変異を導入して修復でき、かつ／または外因性核酸を、標的にされた部位に挿入できる。

【0158】

ゲノム編集法は一般に、標的核酸中の二本鎖切断物の生成に関与するエンドヌクレアーゼのタイプに基づいて分類される。これらの方法は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を含む。

【0159】

野生型Ｃａｓ酵素または変異Ｃａｓ酵素を使用できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素をコードするヌクレオチド配列を、タンパク質活性が変化するように改変する。変異Ｃａｓ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠き得る。Ｃａｓ９は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに相同な２つの独立したヌクレアーゼドメインを保有し、これらの２つのドメインのいずれかの変異により、Ｃａｓ９タンパク質を、一本鎖切断物を導入するニッカーゼに変換できる（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３（２０１３））。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣＩ触媒ドメイン中のアスパラギン酸－アラニン置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ガイドＲＮＡ（複数可）（例えば、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的にする２つのガイドＲＮＡ）と組み合わせて使用できる。

【0160】

本明細書中で使用される場合、用語「塩基エディタ」は、ヌクレオチド塩基を編集するタンパク質を指す。「編集」は、一方の核酸塩基の他方の核酸塩基への変換を指す（例えば、ＡからＧへ、ＡからＣへ、ＡからＴへ、ＣからＴへ、ＣからＧへ、ＣからＡへ、ＧからＡへ、ＧからＣへ、ＧからＴへ、ＴからＡへ、ＴからＣへ、ＴからＧへ）。いくつかの実施形態では、核酸塩基エディタは、１）ヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸塩基を改変する酵素と、２）特定の核酸配列に結合するようにプログラミングできる核酸結合タンパク質との組み合わせを使用して、大部分の（例えば、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、９９．９％超、または１００％）核酸配列中のある核酸塩基の別の核酸塩基への変換（すなわち、移行または塩基転換）をもたらす高分子または高分子複合体である。塩基エディタは、（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）デアミナーゼドメイン、を含む融合タンパク質であり得る。１つの実施形態では、塩基エディタは、ａ）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ；およびｂ）シチジンデアミナーゼを含む融合ポリペプチドである。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３３：４２０を参照のこと。

【0161】

いくつかの実施形態では、塩基エディタは、塩基エディタを標的配列に向かわせるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９などのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基エディタは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）に融合された核酸塩基改変酵素を含む。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼの点変異体（Ｄ１０Ａ）であるｎＣａｓ９は、ニックエンドヌクレアーゼ活性を有する。「核酸塩基改変酵素」は、核酸塩基を改変し、一方の核酸塩基を他方の核酸塩基に変換できる酵素（例えば、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼなどのデアミナーゼ）である。いくつかの実施形態では、核酸塩基エディタは、核酸配列中のシトシン（Ｃ）塩基を標的にし、Ｃをチミン（Ｔ）塩基に変換できる。いくつかの実施形態では、ＣからＴへの編集を、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ）によって行う。他のタイプの塩基変換（例えば、アデノシン（Ａ）からグアニン（Ｇ）へ、ＣからＧへ）を行うことができる塩基エディタも意図される。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクタードメイン（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを、ガイドヌクレオチド配列によってプログラムできる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（すなわち、ｄＣａｓ９）である。本明細書中で使用されるｄＣａｓ９は、そのヌクレアーゼ活性が完全に不活性であるか、そのヌクレアーゼ活性が部分的に不活性であるＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性アルゴノートである。いくつかの実施形態では、塩基エディタは、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、またはアルゴノートタンパク質を含む。例えば、塩基エディタは、シトシンデアミナーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質、シトシンデアミナーゼ－Ｃａｓ９ニッカーゼ融合タンパク質、デアミナーゼ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ融合タンパク質、ＵＧＩ－デアミナーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質、ＵＧＩ－デアミナーゼ－Ｃａｓ９ニッカーゼ融合タンパク質、ＡＰＯＢＥＣ１－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ融合タンパク質、ＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＵＧＩ融合タンパク質であり得る。

【0163】

塩基エディタ（ＢＥ）システムの種々の誘導体（ＢＥ１、ＢＥ２、およびＢＥ３など）を使用できる。１つの実施形態では、本方法はＢＥ２を使用する。別の実施形態では、本方法はＢＥ３を使用する。

【0164】

本開示の方法および組成物を、Ｃａｓ９の一本鎖または二本鎖誘導バージョンならびに他のＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ（他の細菌Ｃａｓ９様システムなど）と共に使用できることが特に意図される。本明細書中に記載の本発明の方法および組成物の配列特異的ヌクレアーゼは、操作されているか、キメラであるか、生物から単離されたヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼを、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質の形態で細胞中に導入できる。

【0165】

標準的な手順を使用して、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、または塩基エディタＣａｓ９を発現でき、手順は、プラスミドのトランスフェクション、レンチウイルス粒子の形質導入、またはタンパク質のヌクレオフェクションを含む。

【0166】

本開示の１つの態様では、系譜特異的抗原が改変された正常細胞を使用して、腫瘍細胞を、改変された正常細胞集団と置換する。かかる改変は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用した任意の系譜特異的抗原の枯渇または阻害を含み得る。ここで、前述のクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ９システムは、操作された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムである（図４）。

【0167】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、種々の生物（細菌、ヒト、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、および植物を含むが、これらに限定されない）のゲノムを編集するためにうまく利用されている。例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）３１（３）：２３３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ（２０１３）５：１１７３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１３）７：４３３６；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），３：２２７）；Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９４：１０２９；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８１９；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８２３；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）３：２３０；およびＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）４１（２０）：ｅｌ８８を参照のこと。

【0168】

本開示は、系譜特異的抗原ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリッド形成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する方法を提供し、ここで、前述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単鎖ガイドＲＮＡ）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、系譜特異的抗原ポリヌクレオチドに結合し抗原ポリヌクレオチドの切断を可能にし、それによりポリヌクレオチドを改変できる。

【0169】

本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞表面系譜特異的抗原内のコード領域もしくは非コード領域中の、遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなど）、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの、非転写領域内の目的の領域に結合し、かつ／またはそれを切断できる。本開示で使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ｇＲＮＡがゲノム中の予め決定した切断部位（標的部位）へのＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の結合を指示するように設計できる。切断部位を、未知配列の領域または、ＳＮＰ、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、再編成などを含む領域を含む断片を放出するように選択できる。

【0170】

遺伝子領域の切断は、Ｃａｓ酵素による標的配列の位置での１つまたは２つの鎖の切断を含み得る。１つの実施形態では、かかる切断により、標的遺伝子の転写を減少させることができる。別の実施形態では、切断は、相同組換えによって切断された標的ポリヌクレオチドを外因性のテンプレートポリヌクレオチドを用いて修復することをさらに含んでよく、この修復は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換をもたらす。

【0171】

用語「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、および「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」は、本明細書を通して互換的に使用でき、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓＤＮＡ結合タンパク質の特異性を決定づける配列を含む核酸を指す。ｇＲＮＡは、宿主細胞のゲノム中の標的核酸配列とハイブリッド形成する（部分的にまたは完全に相補的に）。標的核酸とハイブリッド形成するｇＲＮＡまたはその一部は、１５～２５ヌクレオチド長、１８～２２ヌクレオチド長、または１９～２１ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸とハイブリッド形成するｇＲＮＡ配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的核酸とハイブリッド形成するｇＲＮＡ配列は、１０～３０または１５～２５ヌクレオチド長である。

【0172】

標的核酸に結合する配列に加えて、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは足場配列も含む。標的核酸に相補的な配列および足場配列の両方をコードするｇＲＮＡの発現は、標的核酸への結合（ハイブリッド形成）およびエンドヌクレアーゼの標的核酸への動員の両方の二重機能を有し、それは部位特異的ＣＲＩＳＰＲ活性をもたらす。いくつかの実施形態では、かかるキメラｇＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれ得る。

【0173】

本明細書中で使用される場合、「足場配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ、相補ｇＲＮＡ配列に結合される（ハイブリッド形成する）標的核酸にＣａｓエンドヌクレアーゼを動員する核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含みかつエンドヌクレアーゼを動員する任意の足場配列を、本明細書中に記載の遺伝因子およびベクター中で使用できる。例示的な足場配列は、当業者に自明であり、例えば、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０９３６９４号、およびＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。

【0174】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は足場配列を含まず、足場配列は別の転写物として発現される。かかる実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、足場配列の一部に相補的であり、足場配列に結合（ハイブリッド形成）してエンドヌクレアーゼを標的核酸に動員するように機能するさらなる配列をさらに含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である（ｇＲＮＡ配列の標的ポリヌクレオチド配列との相補性の教示について参考として援用される米国特許第８，６９７，３５９号も参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的核酸の３’末端付近の標的核酸の間のミスマッチはヌクレアーゼ切断活性を無効にし得ることが実証されている（Ｕｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）３（１２）：２２３３－２２３８）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸の３’末端（例えば、標的核酸の３’末端の最後の５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である。

【0176】

標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’側に隣接し、ＰＡＭは、エンドヌクレアーゼと相互作用でき、かつ標的核酸へのエンドヌクレアーゼ活性の標的化にさらに関与し得る。標的核酸に隣接するＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが由来する供給源に依存すると一般的に考えられている。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡである。Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて、ＰＡＭ配列はＴＴＮである。

【0177】

いくつかの実施形態では、細胞の遺伝子操作はまた、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの細胞への導入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を、同一の核酸（例えば、１つのベクター）上で提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸を、異なる核酸（例えば、異なるベクター）上で提供する。あるいはまたはさらに、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、タンパク質の形態で細胞内に提供するか導入できる。

【0178】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９酵素またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞中での発現のためにコドン最適化できる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のホモログまたはオルソログである。

【0179】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質活性を変化させるようにさらに改変される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性な残基の変異（Ｄ１０およびＨ８４０）を含み、ヌクレアーゼ活性を持たない。あるいはまたはさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、別のタンパク質またはその一部に融合できる。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢドメインなどのリプレッサードメインに融合される。いくつかの実施形態では、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のために本明細書中に記載の構築物と共に使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲなどのアクチベータードメインに融合される。いくつかの実施形態では、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ））のために本明細書中に記載の構築物と共に使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼドメインまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなどの後成的調整ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＬＳＤ１もしくはｐ３００またはこれらの一部に融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９融合を、ＣＲＩＳＰＲベースの後成的調整のために使用する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合されたＣａｓ９またはｄＣａｓ９を、ゲノム編集のために使用する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質を、ゲノム遺伝子座の標識および／もしくは可視化またはＣａｓエンドヌクレアーゼを発現する細胞の同定のために使用する。

【0180】

あるいはまたはさらに、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｒｏｖｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．またはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞中での発現のためにコドン最適化できる。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して造血細胞における細胞表面系譜特異的抗原を阻害するための組成物および方法を提供し、ここでガイドＲＮＡ配列が細胞表面系譜特異的抗原をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原はＣＤ３３であり、ｇＲＮＡは、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列の一部とハイブリッド形成する（図５）。ＣＤ３３を標的にするｇＲＮＡの例を表４に提供しているが、ＣＤ３３とハイブリッド形成するさらなるｇＲＮＡを作出でき、それらを本明細書中に記載の方法で使用できる。

【0182】

表４は、ＣＤ３３の一部とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想される例示的なガイドＲＮＡ配列を提供する。

【0183】

【表4】

【0184】

一定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）を示すドナーＨＳＣの利用に関する。例えば、ＣがＴに変化したＳＮＰｒｓ１２４５９４１９（ｃｈｒ１９：５１，２２５，２２１；ｈｇ３８）は、ＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それにより、成熟転写物からエクソン２が喪失される。エクソン２によってコードされる領域は、ＣＤ３３の細胞外領域であり、この領域は、ＣＤ３３を標的にするモノクローナル抗体の大部分の結合部位である。したがって、このＳＮＰ（またはＣＤ３３成熟転写物においてエクソン２を喪失させるか、欠損型エクソン２を生じる任意のＳＮＰ）を有するＨＳＣの利用は、系譜特異的細胞表面抗原が欠損または変異された造血細胞集団を提供するための、かつそれ故に抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復できる標的化方法である。

【0185】

別の実施形態では、ドナー細胞がＳＮＰｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示すかどうかと無関係にドナー細胞中のＥＳＥ部位を破壊し、それ故に、ＣＤ３３成熟転写物中のＣＤ３３エクソン２の喪失または変異を保証する遺伝的操作方法（ゲノム操作を含む）を使用する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮ、ＺｎＦタンパク質、および／または修正ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９塩基編集システムを使用して、ドナー細胞中のエクソン２スプライシングを破壊する（例えば、ＥＳＥ部位を破壊し、かつ／またはスプライスアクセプターを操作する）ことができる。ドナー細胞由来のＥＳＥ部位を破壊するためのこのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、系譜特異的細胞表面抗原が欠損または変異された造血細胞集団を提供しそれ故に、抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復できる代替方法である。したがって、この実施形態は、ＣＤ３３標的剤で処置した患者に対するＨＳＣを回復する方法である。

【0186】

したがって、本開示の実施形態は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および
（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を含む。

【0187】

さらなる実施形態では、造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示す。

【0188】

なおさらなる実施形態では、ＳＮＰがＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失される。

【0189】

さらなる実施形態では、本開示は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量および
（ｉｉ）変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含むように遺伝子操作されている造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0190】

さらなる実施形態では、ＣＤ３３遺伝子は、造血細胞中でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって操作される。

【0191】

さらなる実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を、ＣＤ３３の発現を消失させるか、ＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失されるように編集することによって調製される。

【0192】

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＳＲＳＦ２に対するエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉しそれによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失される変異が作出される。

【0193】

なおさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作は、ＣＤ３３を標的にする薬剤によって認識されないＣＤ３３をもたらす。

【0194】

ＣＤ３３のエクソン２は、シアル酸結合を媒介する免疫グロブリン様可変ドメイン（ＩｇＶ）をコードする。Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１５，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２ ３５５７－３５７０。

【0195】

本開示は、変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。本開示は、エクソン２を欠くか、変異型エクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、少なくとも１つのｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子を保有し得る。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子（例えば、ｒｓ１２４５９４１９－ＣＴ）についてホモ接合性であり得るか、ｒｓ１２４５９４１９－Ｔ対立遺伝子についてヘテロ接合性であり得る。造血細胞（例えば、造血幹細胞）は、ＣＤ３３成熟転写物においてエクソン２を欠失させるか変異型エクソン２を生じる少なくとも１つの対立遺伝子を保有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３成熟転写物中のＣＤ３３のエクソン２の全体または一部は、欠失されるか、変異される。ゲノム編集または遺伝子操作（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む）を使用して、変異型または欠損型のエクソン２を有するＣＤ３３の成熟転写物を含む造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を操作できる。

【0196】

本開示は、ＣＤ３３のＩｇＶドメインを欠損している造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。造血細胞（例えば、ＨＳＣ）は、ＩｇＶドメインを欠くＣＤ３３、および／または変異型ＩｇＶドメインを有するＣＤ３３を含み得る。造血細胞（例えば、ＨＳＣ）は、野生型ＩｇＶドメインを有するＣＤ３３を有する造血細胞と比較して、シアル酸を結合する能力を欠き得るか、シアル酸を結合する能力が低下し得る。

【0197】

配列番号５２～５８（表５～７）から選択される１つまたは複数のガイド配列と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用することによって調製される造血細胞（例えば、ＨＳＣ）も本開示に含まれる。

【0198】

表５は、ＣＤ３３の一部とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想される例示的なガイドＲＮＡ配列を提供する。相同テンプレートの非存在下で野生型Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせて使用する場合、これらのガイドＲＮＡは、エクソン２のスプライシング部位および／またはＥＳＥ部位にインデルを作出し得る。これにより、エクソン２および／またはフレームワークが読み飛ばされるであろう。あるいは、野生型Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムおよび特異的部位（複数可）に変異（複数可）を有する相同テンプレートと組み合わせて使用した場合、これらのガイドＲＮＡは、エクソン２のスプライシング部位および／またはＥＳＥ部位でのヌクレオチド変化を生じることができる。

【0199】

【表5】

【0200】

表６は、ＣＤ３３の一部とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想される例示的なガイドＲＮＡ配列を提供する。相同テンプレートの非存在下でニッカーゼＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせて使用される場合、これらのガイドＲＮＡは、エクソン２のスプライシング部位および／またはＥＳＥ部位にインデルを作出し得る。これにより、エクソン２の読み飛ばしおよび／またはフレームシフトが起こるであろう。あるいは、ニッカーゼＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムおよび特異的部位（複数可）に変異（複数可）を有する相同テンプレートと組み合わせて使用される場合、これらのガイドＲＮＡは、エクソン２のスプライシング部位および／またはＥＳＥ部位でヌクレオチドを変化させることができる。

【0201】

【表6】

【0202】

表７は、ＣＤ３３の一部とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想される例示的なガイドＲＮＡ配列を提供する。塩基エディタＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、塩基エディタ２（ＢＥ２）Ｃａｓ９）と組み合わせて使用される場合、これらのガイドＲＮＡは、スプライスアクセプターおよびＥＳＥ内の４つのＧをＡに変換し（逆の鎖については、ＣからＴに変換し）、それにより、エクソン２のスプライスアクセプターおよび／またはＥＳＥ部位を喪失させることができる。

【0203】

【表7】

【0204】

表５～７中の配列は、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃ．２０１３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）Ａｓｓｅｍｂｌｙに基づく。

【0205】

ＣＤ３３は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ｓｉｇｌｅｃ）ファミリーのメンバーである。ＣＤ３３関連ｓｉｇｌｅｃファミリー内の複数の受容体も骨髄性細胞上で発現され、重複した機能を有する（Ｃａｏ ａｎｄ Ｃｒｏｃｋｅｒ，２０１１，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３２：１８－２６；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３４：７２８－７３５）。本明細書中で考察されるガイドＲＮＡ配列は、ＣＤ３３偽遺伝子（ＳＩＧＬＥＣ１７Ｐ、ＳＩＧＬＥＣ２１Ｐ、ＳＩＧＬＥＣ２２Ｐ、およびＳＩＧＬＥＣ２９Ｐを含むが、これらに限定されない）を標的にしてもしなくてもよい。

【0206】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣ、特に同種ＨＳＣを、移植片対宿主効果を低下させるようにさらに遺伝操作することが望ましいかもしれない。例えば、再発性ＡＭＬの標準的治療は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。しかし、ＨＳＣＴの成功を制限する少なくとも１つの要因は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であり、これは、細胞表面分子ＣＤ４５の発現が関与している。例えば、Ｖａｎ Ｂｅｓｉｅ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１３）５６；Ｍａｗａｄ Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２０１３）８（２）：１３２を参照のこと。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯは、ＣＤ４５（赤血球を除く全ての造血細胞上で見いだされる）のイソ型である。Ｔリンパ球では、ＣＤ４５ＲＡはナイーブ細胞上で発現される一方で、ＣＤ４５ＲＯは記憶細胞上で発現される。ＣＤ４５ＲＡＴ細胞は、ＨＳＣＴ後のレシピエント特異的抗原に対する反応性が潜在的に高く、それにより、ＧＶＨＤをもたらす。したがって、移植片拒絶またはＧＶＨＤの可能性も低下させる有効でかつ安全なＡＭＬ処置が依然として必要である。ＣＤ４５はタイプ１系譜抗原である。なぜならＣＤ４５保有細胞は生存に必要とされるがこの抗原はＣＲＩＳＰＲを使用して幹細胞から欠失され得るからである。

【0207】

ＨＳＣＴ後のＧｖＨＤの発症に起因する合併症を考慮して、本開示はまた、ＣＤ４５ＲＡを標的にするための組成物および方法を提供する。かかる組成物および方法は、ＧｖＨＤの発生および程度を予防および／または低下させる手段である。

【0208】

したがって、ＧＶＨＤの場合、患者の処置は、以下の工程を含み得る：（１）Ｔ細胞の治療有効量を患者に投与する工程であって、ここでＴ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ系譜特異的抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、投与する工程；および（２）患者に造血幹細胞を注入する工程であって、ここで造血細胞は、ＣＤ４５ＲＡ系譜特異的抗原の低下された発現を有する、注入する工程。

【0209】

さらに、本開示は、ＣＤ３３系譜特異的抗原およびＣＤ４５ＲＡ系譜特異的抗原の両方の組み合わせた阻害のための組成物および方法を提供する。かかる処置レジメンは、以下の工程を含み得る：（１）Ｔ細胞の治療有効量を患者に投与する工程であって、ここでＴ細胞が、ＣＤ３３系譜特異的抗原およびＣＤ４５ＲＡ系譜特異的抗原の両方を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、投与する工程；および（２）自家または同種のいずれかの造血幹細胞を患者に注入または再注入する工程であって、ここで造血細胞は、ＣＤ３３系譜特異的抗原およびＣＤ４５ＲＡ系譜特異的抗原の両方の低下された発現を有する、注入または再注入する工程。

【0210】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原ＣＤ４５ＲＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して造血細胞中で欠失または阻害される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ４５ＲＡをコードするヌクレオチド配列の一部とハイブリッド形成する（図６）。ＣＤ４５ＲＡを標的にするｇＲＮＡの例を表８に提供するが、ＣＤ４５ＲＡとハイブリッド形成するさらなるｇＲＮＡを作出でき、それらを本明細書中に記載の方法で使用できる。

【0211】

表８は、ヒトＣＤ４５のエクソン４またはエクソン５とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想される例示的なガイドＲＮＡ配列を提供する。

【0212】

【表8】

【0213】

細胞を準備する工程および前述の細胞にゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムの成分を導入する工程を含む、細胞表面系譜特異的抗原を欠損している細胞を産生する方法も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、系譜特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列の一部とハイブリッド形成するか、ハイブリッド形成すると予想されるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸を、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ベクター上のｇＲＮＡを細胞に導入する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを細胞に導入する。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｉｄｍｅｎｔ）では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に導入する。いくつかの実施形態では、同じ核酸（例えば、同じベクター）上のｇＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、タンパク質の形態で細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで予め形成し、複合体として細胞に導入する。

【0214】

本開示は、さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の１つまたは複数の成分をコードできる操作された天然に存在しないベクターおよびベクター系を提供し、ここで、ベクターは、（ｉ）系譜特異的抗原配列とハイブリッド形成する（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣａｓシステムガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0215】

本開示のベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中の１つまたは複数の配列の発現を駆動できる。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：１８７）を含む。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの調節機能は典型的には、１つまたは複数の制御エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、および本明細書中に開示され、当業者に公知のウイルスに由来する。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｃｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の１６章および１７章を参照のこと。

【0216】

本開示のベクターは、核酸の発現を特定の細胞型で優先的に指示できる（例えば、核酸を発現するために組織特異的制御エレメントを使用する）。かかる制御エレメントは、組織特異的または細胞特異的であり得るプロモーターを含む。用語「組織特異的」は、この用語をプロモーターに適用する場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を、異なる組織型における同じ目的のヌクレオチド配列の発現の相対的な不在下で特定の組織型（例えば、シード）において指示できるプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、この用語をプロモーターに適用する場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を、同じ組織内の異なる細胞型における同じ目的のヌクレオチド配列の発現の相対的な不在下で特定の細胞型において指示できるプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」はまた、プロモーターに適用する場合、単一の組織内の領域中の目的のヌクレオチド配列の選択的発現を促進できるプロモーターを意味する。プロモーターの細胞型特異性を、当該分野で周知の方法（例えば、免疫組織化学染色）を使用して評価できる。

【0217】

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする核酸を導入できる。かかる方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分をコードする核酸を培養物中のまたは宿主生物中の細胞に投与できる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書中に記載のベクターの転写物）、裸の核酸、および送達ビヒクルと複合体化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソーム性ゲノムまたは取り込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。

【0218】

遺伝子療法の手順の概説について。
ウイルスベクターを、患者に直接投与でき（ｉｎ ｖｉｖｏ）、または細胞を操作するためにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用し、改変された細胞を患者に投与できる。１つの実施形態では、本開示は、遺伝子移入のためにウイルスベースのシステム（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない）を利用する。さらに、本開示は、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどの、宿主ゲノム中の組み込みができるベクターを提供する。好ましくは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現のために使用されるベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0219】

１つの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードする１つまたは複数のベクターの真核細胞への導入を提供する。細胞は、癌細胞であり得る。あるいは、細胞は、造血細胞（造血幹細胞など）である。幹細胞の例は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、および単能性幹細胞を含む。多能性幹細胞の例は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌腫細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。好ましい実施形態では、本開示は、造血幹細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の導入を提供する。

【0220】

本開示のベクターは、被験体の真核細胞に送達される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを介する真核細胞の改変は細胞培養中で起こり、その方法は、改変前に被験体から真核細胞を単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前述の真核細胞および／または前述の真核細胞に由来する細胞を被験体に戻す工程をさらに含む。

【0221】

併用療法
本明細書中に記載のように、細胞表面系譜特異的抗原に結合する抗原結合断片を含む薬剤を、細胞表面系譜特異的抗原を欠損している造血細胞と組み合わせて被験体に投与できる。本明細書中で使用される場合、「被験体」、「個体」、および「患者」は、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、またはマウス、ウシ、ウマ、イヌ、もしくはネコの種を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、被験体は、造血器悪性疾患を有するヒト患者である。

【0222】

いくつかの実施形態では、薬剤および／または造血細胞を、薬学的に許容され得る担体と混合して医薬組成物を形成でき、この医薬組成物も本開示の範囲内にある。

【0223】

本明細書中に記載の方法を実施するために、有効量の細胞表面系譜特異的抗原に結合する抗原結合断片を含む薬剤の有効量および造血細胞の有効量を、処置を必要とする被験体に同時投与できる。

【0224】

本明細書中で使用される用語「有効量」は、用語「治療有効量」と互換的に使用でき、それを必要とする被験体に投与した際に所望の活性を得るのに十分な薬剤、細胞集団、または医薬組成物（例えば、薬剤および／または造血細胞を含む組成物）の量を指す。本開示の文脈内で、用語「有効量」は、本開示の方法によって処置される障害の発症を遅延させるか、進行を停止させるか、少なくとも１つの症状を軽減または緩和するのに十分な化合物、細胞集団、または医薬組成物の量を指す。有効成分の組み合わせを投与する場合、組み合わせの有効量は、各成分を個別に投与した場合に有効であった各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意すべきである。

【0225】

有効量は、当業者によって認識されるように、処置される特定の容態、容態の重症度、各患者のパラメーター（年齢、健康状態、サイズ、性別、および体重を含む）、処置期間、現行治療の性質（受けている場合）、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および経験の範囲内の同様の要因に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、被験体において任意の疾患または障害を緩和するか、軽減するか、回復させるか、改善するか、症状を軽減するか、進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体は、造血器悪性疾患を有するヒト患者である。

【0226】

本明細書中で使用される場合、キメラ受容体を発現する造血細胞および／または免疫細胞は、被験体の自家細胞であってよく、すなわち、この細胞は処置を必要とする被験体から得られ、細胞表面系譜特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現を欠損するように遺伝子操作され、次いで同じ被験体に投与される。被験体への自家細胞の投与により、非自家細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶が軽減され得る。あるいは、宿主細胞は同種異系細胞であり、すなわち、この細胞は第１の被験体から得られ、細胞表面系譜特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現を欠損するように遺伝子操作され、第１の被験体と異なるが同じ種である第２の被験体に投与される。例えば、同種免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーと異なるヒトレシピエントに投与できる。

【0227】

いくつかの実施形態では、免疫細胞および／または造血細胞は同種異系細胞であり、移植片対宿主病を軽減するようにさらに遺伝子操作されている。例えば、本明細書中に記載のように、造血幹細胞を、ＣＤ４５ＲＡ発現を低下させるように遺伝子操作できる（例えば、ゲノム編集を使用して）。

【0228】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を発現する免疫細胞を、標的細胞（例えば、癌細胞）の数を少なくとも２０％（例えば、５０％、８０％、１００％、１／２、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、またはそれ未満）低下させるのに有効な量で被験体に投与する。

【0229】

哺乳動物（例えば、ヒト）へ投与される細胞（すなわち、免疫細胞または造血細胞）の典型的な量は、例えば、１００万個～１０００億個の範囲であり得る；しかし、この例示的な範囲未満またはそれを超える量も本発明の範囲内にある。例えば、細胞の一日用量は、約１００万個～約５００億個（例えば、約５００万個、約２５００万個、約５億個、約１０億個、約５０億個、約２００億個、約３００億個、約４００億個、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）、好ましくは、約１０００万個～約１０００億個（例えば、約２０００万個、約３０００万個、約４０００万個、約６０００万個、約７０００万個、約８０００万個、約９０００万個、約１００億個、約２５０億個、約５００億個、約７５０億個、約９００億個、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）、より好ましくは、約１億個～約５００億個（例えば、約１億２０００万個、約２億５０００万個、約３億５０００万個、約４億５０００万個、約６億５０００万個、約８億個、約９億個、約３０億個、約３００億個、約４５０億個、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。

【0230】

１つの実施形態では、キメラ受容体（例えば、キメラ受容体をコードする核酸）を免疫細胞に導入し、被験体（例えば、ヒト患者）は、キメラ受容体を発現する免疫細胞の初回投与または初回用量を受ける。薬剤（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）の１回または複数回の投与を患者に、前の投与後１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日間の間隔で与えてよい。１週間あたり１を超える用量の薬剤を被験体に投与できる（例えば、２、３、４、またはそれを超える薬剤の投与）。被験体は、１週間に１用量を超える薬剤（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）を受け、その後１週間薬剤の投与がなく、その後最後に１または複数のさらなる用量の薬剤を投与できる（例えば、１週間に１回を超えるキメラ受容体を発現する免疫細胞の投与）。キメラ受容体を発現する免疫細胞を、２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれを超える期間にわたって、１日おきに週３回投与できる。

【0231】

本開示の文脈において本明細書中に列挙した任意の病状に関する限り、用語「処置する」および「処置」などは、かかる病状に関連する少なくとも１つの症状を軽減するか緩和し、またはかかる病状の進行を遅延させるか逆行させることを意味する。本開示の意味の範囲内で、用語「処置する」はまた、疾患を停止させ、開始（すなわち、疾患の臨床症状前の期間）を遅延させ、かつ／または疾患の発症または悪化のリスクを低下させることを示す。例えば、がんに関連して、用語「処置する」は、患者の全身腫瘍組織量の消失もしくは低下、または転移の予防、遅延、または抑制などを意味し得る。

【0232】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤および細胞表面系譜特異的抗原を欠損している造血細胞集団。したがって、かかる治療方法では、薬剤は、標的死滅のために細胞表面系譜特異的抗原を発現する標的細胞を認識する（結合する）。抗原を欠損している造血細胞は、薬剤の標的にされる細胞型を再増殖させることができる。いくつかの実施形態では、患者の処置は、以下の工程を含み得る：（１）細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤の治療有効量を患者に投与する工程および（２）自家または同種のいずれかの造血幹細胞を患者に注入または再注入する工程であって、ここで造血細胞は、系譜特異的疾患関連抗原の低下された発現を有する、注入または再注入する工程。いくつかの実施形態では、患者の処置は、以下の工程を含み得る：（１）キメラ受容体を発現する免疫細胞の治療有効量を患者に投与する工程であって、ここで免疫細胞が、細胞表面系譜特異的疾患関連抗原に結合するキメラ受容体をコードする核酸配列を含む、投与する工程；および（２）自家または同種のいずれかの造血細胞（例えば、造血幹細胞）を患者に注入または再注入する工程であって、ここで造血細胞は、系譜特異的疾患関連抗原の低下された発現を有する、注入または再注入する工程。

【0233】

細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤および細胞表面系譜特異的抗原を欠損している造血細胞集団を使用する治療方法の有効性を、当該分野で公知の任意の方法によって評価でき、この方法は、医療専門家に明らかであろう。例えば、治療の有効性を、被験体の生存または被験体もしくは被験体の組織もしくは試料の腫瘍量によって評価できる。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、細胞の特定の集団または系譜に属する細胞数の定量によって評価される。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、細胞表面系譜特異的抗原を提示する細胞数の定量によって評価される。

【0234】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原に結合する抗原結合断片を含む薬剤および造血細胞集団を、同時投与する。

【0235】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤（例えば、本明細書中に記載のキメラ受容体を発現する免疫細胞）を、造血細胞の投与前に投与する。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤（例えば、本明細書中に記載のキメラ受容体を発現する免疫細胞）を、造血細胞の投与の少なくとも約１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間前、１１週間前、１２週間前、３ヶ月前、４ヶ月前、５ヶ月前、６ヶ月前、またはそれ以前に投与する。

【0236】

いくつかの実施形態では、造血細胞を、細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む薬剤（例えば、本明細書中に記載のキメラ受容体を発現する免疫細胞）の投与前に投与する。いくつかの実施形態では、造血細胞集団を、細胞表面系譜特異的抗原に結合する抗原結合断片を含む薬剤の投与の少なくとも約１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間前、１１週間前、１２週間前、３ヶ月前、４ヶ月前、５ヶ月前、６ヶ月前、またはそれ以前に投与する。

【0237】

いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤および造血細胞集団を、実質的に同時に投与する。いくつかの実施形態では、細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤を投与し、患者をある期間中に評価し、その後に造血細胞集団を投与する。いくつかの実施形態では、造血細胞集団を投与し、患者をある期間中に患者を評価し、その後に細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤を投与する。

【0238】

薬剤および／または造血細胞集団の複数の投与（例えば、用量）も本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、薬剤および／または造血細胞集団を、被験体に１回投与する。いくつかの実施形態では、薬剤および／または造血細胞集団を、被験体に１回を超える回数で（例えば、少なくとも２、３、４、５回、またはそれを超える回数で）投与する。いくつかの実施形態では、薬剤および／または造血細胞集団を、被験体に、一定の間隔で（例えば、６ヶ月毎）投与する。

【0239】

いくつかの実施形態では、被験体は、造血器悪性疾患を有するヒト被験体である。本明細書中で使用される場合、造血器悪性疾患は、造血細胞（例えば、前駆細胞および幹細胞を含む血球）に関与する悪性の異常を指す。造血器悪性疾患の例は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。白血病は、急性骨髄球性白血病（旧）、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（旧）、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、白血病は、急性骨髄球性白血病（旧）（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、重要な分化および成長の制御経路を破壊する極めて重要な遺伝子の変化が進行的に獲得された形質転換細胞を起源とする異種クローン性新生物疾患と特徴づけられる（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ，（２０１５）３７３：１１３６）。ＣＤ３３糖タンパク質は、大部分の骨髄球性白血病細胞上でならびに正常な骨髄系前駆細胞および単球系前駆細胞上で発現し、ＡＭＬ治療の魅力的な標的であると見なされている（Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．（２０１４）２８（４）：１４３－５３）。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体ベースの治療を使用した臨床試験は、標準的な化学療法と併用した場合にＡＭＬ患者の部分集合で生存の改善を示したが、これらの効果には安全性および有効性の懸念もあった。

【0241】

ＡＭＬ細胞を標的にすることを目的とした他の試みは、ＡＭＬにおいてＣＤ３３を選択的に標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の生成を含んだ。Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２）：６５（２０１５）。しかし、データは限られており、このアプローチが患者の処置においてどの程度有効であり得るのか（全ての標的にされた細胞が消失するかどうか）不確かである。さらに、骨髄細胞系譜細胞は生命に不可欠であるので、被験体から骨髄細胞系譜細胞を枯渇させると、患者の生存に悪影響を及ぼす可能性があった。本開示は、ＡＭＬ処置に関連するかかる問題の少なくとも一部の解決を目的としている。

【0242】

あるいはまたはさらに、本明細書中に記載の方法を使用して、非造血癌（肺癌、耳鼻咽喉癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、乳がん、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨の癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼球の癌；頭頸部癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；肝臓癌；線維腫、神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；腎癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃がん；睾丸癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫および肉腫を含むが、これらに限定されない）を処置できる。

【0243】

癌腫は、上皮起源のがんである。本開示の方法を用いた処置を意図する癌腫は、小葉がん、小葉癌、肺胞腺癌（腺様嚢胞癌、腺筋上皮腫、篩状癌、および円柱腫とも呼ばれる）、腺様癌、腺癌、副腎皮質の癌腫、胞巣状癌、肺胞上皮癌（細気管支癌、肺胞細胞腫瘍、および肺腺腫症とも呼ばれる）、基底細胞癌、基底細胞がん（バサローマ、またはバシローマ、および毛母癌とも呼ばれる）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌、乳房癌腫、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳様癌、胆管細胞癌（胆管腫および肝内胆管癌とも呼ばれる）、絨毛癌、粘液癌、面皰性乳癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚がん、円柱癌腫、円柱細胞癌、管癌、硬性癌、胎児性癌、脳様癌、上眼球癌、類上皮癌、腺上皮癌、潰瘍癌、線維癌、膠様癌、膠様癌腫、巨細胞癌、巨細胞歯肉腫、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母組織癌、血様癌、肝細胞癌（ヘパトーム、悪性ヘパトーム、および肝細胞がんとも呼ばれる）、ヒュルトレ細胞癌（Ｈｕｉｒｔｈｌｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硝子状癌、副腎様癌、乳児胎児性癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌、クロムペッヘル癌腫、クルチツキー細胞癌腫、レンズ状癌、レンズ状がん、脂肪腫様癌、リンパ上皮性癌、乳腺癌、髄様癌、髄様がん、黒色がん、悪性黒色腫、粘液癌、粘液分泌癌、粘液細胞癌、粘膜類表皮癌、粘液がん、粘膜癌、粘液腫様癌、鼻咽腔癌、黒色癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、卵巣癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、前立腺がん、腎臓の腎細胞癌（腎臓の腺癌および副腎様癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｏｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）とも呼ばれる）、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌腫（ｓｃｈｅｉｎｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、スキルス癌、子宮膣部癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮がん、扁平上皮癌、数珠様癌、血管拡張癌、毛細血管拡性癌腫、移行上皮癌、結節がん、結節癌、疣状癌、絨毛がんを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本開示の方法を、乳房、子宮頸部、卵巣、前立腺、肺、結腸直腸、膵臓、胃、または腎臓の癌を有する被験体を処置するために使用する。

【0244】

肉腫は、骨および軟部組織中に生じる間葉新生物である。様々なタイプの肉腫が認識されており、これらは、以下を含む：脂肪肉腫（粘液様脂肪肉腫および多形性脂肪肉腫（ｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｉｃ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）を含む）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性シュワン細胞腫、神経線維肉腫、または神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫瘍（骨のユーイング肉腫、骨外性（すなわち、非骨）ユーイング肉腫、および原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）を含む）、滑膜肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、線維肉腫、硬性線維腫（進行性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管周囲細胞腫、悪性間葉腫、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、結合組織形成性小細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても公知）、骨肉腫（骨原性肉腫としても公知）－骨格および骨外性、ならびに軟骨肉腫。

【0245】

いくつかの実施形態では、処置すべきがんは、難治性がんであり得る。「難治性がん」は、本明細書中で使用される場合、処方された標準的ケアに耐性を示すがんである。これらのがんは、最初は処置に応答したように見える場合があるか（その後再発する）、処置に全く応答しない場合がある。通常の標準的なケアは、癌のタイプおよび被験体における進行度に応じて変化するであろう。ケアは、化学療法、手術、放射線療法、またはこれらの組み合わせであり得る。当業者は、かかる標準的ケアを承知している。したがって、本開示にしたがって難治性がんを処置される被験体は、別の癌処置を事前に受けている可能性がある。あるいは、がんが難治性である可能性が高い場合（例えば、がん細胞の分析または被験体の病歴による）、被験体は別の処置を事前に受けていない可能性がある。難治性がんの例は、白血病、黒色腫、腎細胞癌、結腸癌、肝臓癌（肝癌）、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、および肺癌を含むが、これらに限定されない。

【0246】

本明細書中に記載の任意のキメラ受容体を発現する免疫細胞を、医薬組成物として薬学的に許容され得る担体または賦形剤中で投与できる。

【0247】

句「薬学的に許容され得る」は、本開示の組成物および／または細胞に関連して使用される場合、生理学的に忍容性が高く、かつ哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した場合に有害反応を典型的には生じない、かかる組成物の分子実体および他の成分を指す。好ましくは、本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容され得る」は、哺乳動物、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。「許容され得る」は、担体が組成物の有効成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療抗体）と適合し、かつ 組成物（複数可）を投与される被験体に悪影響を及ぼさないことを意味する。本方法で使用されるべき任意の医薬組成物および／または細胞は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で薬学的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤を含み得る。

【0248】

薬学的に許容され得る担体（緩衝液を含む）は、当該分野で周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；アミノ酸；疎水性ポリマー；モノサッカリド；ジサッカリド；および他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照のこと。

【0249】

治療用キット
細胞表面系譜特異的抗原を欠損している造血細胞集団と組み合わせた細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤を使用するためのキットも本開示の範囲内にある。かかるキットは、細胞表面系譜特異的抗原を結合する抗原結合断片を含む任意の薬剤（例えば、本明細書中に記載のキメラ受容体を発現する免疫細胞）および薬学的に許容され得る担体を含む第１の医薬組成物、ならびに細胞表面系譜特異的抗原を欠損している造血細胞集団（例えば、造血幹細胞）および薬学的に許容され得る担体を含む第２の医薬組成物を含む１つまたは複数の容器を含み得る。

【0250】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書中に記載の任意の方法で用いる説明書を含み得る。同封される説明書は、被験体が意図する活性を得るための被験体への第１および第２の医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットはさらに、被験体が処置を必要とするかどうかの同定に基づいて処置に適切な被験体を選択するための説明を含んでもよい。いくつかの実施形態では、説明書は、処置を必要とする被験体への第１および第２の医薬組成物の投与の説明を含む。

【0251】

本明細書中に記載の細胞表面系譜特異的抗原を標的にする薬剤ならびに第１および第２の医薬組成物の使用に関する説明書は一般に、意図する処置のための投薬量、投与計画、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数回用量包装）または副次的単位用量であり得る。本開示のキット中に提供される説明書は典型的には、ラベルまたは添付文書上に印刷された説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が被験体の疾患または障害の処置、発症の遅延、および／または緩和のために使用されることを示す。

【0252】

本明細書中に提供されるキットは、適切な包装物に入っている。適切な包装物は、バイアル、ボトル、ジャー、および軟包装などを含むが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて用いるための包装も意図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有する静脈注射用溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る。医薬組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書中に記載のキメラ受容体バリアントである。

【0253】

キットは任意選択的に、緩衝液および解釈を補助する情報などのさらなる構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器および容器上または容器に付随したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記キットの内容物を含む製品を提供する。

【0254】

一般的技術
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当該分野の技術の範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用いるであろう。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で十分に説明されている。

【0255】

さらに詳述することなく、当業者は、上記説明に基づいて、本開示を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示と解釈すべきであり、本開示の残りの部分をいかようにも限定するものではない。本明細書中に引用した全ての刊行物は、本明細書中で参照される目的または手段のために参考として援用される。

【0256】

実施例１：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ３３のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失
ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９システムがｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３３を標的にする能力を試験するために、ヒト白血病細胞Ｋ－５６２を、Ｎｅｏｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｃａｓ９－ＧＦＰ（ＰＸ４５８、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＮＧＧ ＰＡＭ配列を含むガイドＲＮＡ（図４）（ガイドＲＮＡを、ｈＣＤ３３ゲノム配列を標的にするようにデザインした）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、Ｃａｓ９を発現する細胞を同定し、ＧＦＰについて選別するＦＡＣＳを使用して単離した。細胞を次いで、９６時間インキュベートし、フローサイトメトリーによりＣＤ３３発現について試験した（図５）。抗ＣＤ３３抗体を使用するフローサイトメトリープロットは、Ｃａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上のプロット）および後（下のプロット）のＫ－５６２細胞によるＣＤ３３発現を示す。図５に示すように、９８％の細胞がトランスフェクション後にＣＤ３３発現を欠いていた。

【0257】

この実施例は、ヒト白血病細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用するＣＤ３３の有効な欠失を実証する。

【0258】

実施例２：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ４５のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４５ＲＡを標的にするためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用した。簡潔に述べれば、ＴＩＢ－６７細網肉腫マウスマクロファージ様細胞を、Ｎｅｏｎ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｃａｓ９－ＧＦＰ（ＰＸ４５８、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびｈＣＤ４５ＲＡゲノム配列を標的にするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ（「ＮＧＧ」ＰＡＭ配列を含む）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現する細胞を同定し、ＧＦＰについて選別するＦＡＣＳを使用して単離した。細胞を次いで、９６時間インキュベートし、ＣＤ４５ＲＡ発現について試験した（図６）。ＣＤ４５ＲＡ抗体を使用するフローサイトメトリープロットは、Ｃａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上のプロット）および後（下のプロット）のＣＤ４５ＲＡ発現を示す。

【0259】

白血病細胞においてＣＤ３３発現がうまく低下された実施例１と同様に、この実施例における所見は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用するＣＤ４５ＲＡの有効な標的化を示す。

【0260】

実施例３：急性骨髄球性白血病（新）（ＡＭＬ）における細胞表面系譜特異的ＣＤ３３の標的化
本実施例は、ＡＭＬにおけるＣＤ３３抗原の標的化を含む。本実施例の特定の工程を、表９に概説する。

【0261】

【表9】

【0262】

Ｉ．ＣＤ３３標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療
Ａ．抗ＣＤ３３ＣＡＲ構築物の生成
本明細書中に記載のＣＤ３３を標的にするキメラ抗原受容体は、５’から３’への順序で以下の成分からなり得る：ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎレンチウイルスバックボーン（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１８１２１／）、ペプチドシグナル、ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達ドメイン。

【0263】

最初に、ペプチドシグナル、抗ＣＤ３３軽鎖（配列番号１）、可動性リンカー、および抗ＣＤ３３重鎖（配列番号２）を、任意選択的なＫｏｚａｋ配列を有するｐＨＩＶ－ＺｓｇｒｅｅｎのＥｃｏＲＩ部位にクローン化する。

【0264】

軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζの基本構造をもつ、ＣＤ３３を結合する例示的なキメラ受容体の核酸配列を以下に提供する。

パート１：軽鎖－リンカー－重鎖（配列番号１６）：Ｋｏｚａｋ開始部位を太字で示す。ペプチドシグナルＬ１を斜体で示す。リンカーで分離された抗ＣＤ３３の軽鎖および重鎖を太字の斜体で示す。

【化23】

パート２：ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζＮｏｔＩ制限酵素認識部位を、大文字で示す。翻訳停止部位を太字で示す。ＢａｍＨＩ制限切断部位を、下線で示す。

【化24】

【化25】

【化26】

【0265】

次の工程では、ＴＣＲ－ζのヒンジ領域、ＣＤ２８ドメイン（配列番号３）、および細胞質成分を、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（ペプチドシグナルおよびＣＤ３３ｓｃＦｖを事前に含む）のＮｏｔＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローン化する。あるいは、ＣＤ２８ドメインを、ＩＣＯＳドメイン（配列番号４）で置換できる。

【0266】

ＣＤ２８ドメインおよびＩＣＯＳドメインに加えて、ＣＤ２８のフラグメントおよびＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合ドメインを操作し（配列番号５）、さらなるキメラ受容体の生成のために使用するであろう。かかる立体配置は、キメラ受容体が抗原結合断片、抗ＣＤ３３軽鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ３３重鎖可変領域、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッド領域（ＣＤ２８のＴＭ領域を含む）、およびＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達ドメインを含む。

【0267】

キメラ受容体を生成するために使用できる成分の例示的なアミノ酸配列（ＣＤ２８ドメイン（配列番号６）、ＩＣＯＳドメイン（配列番号７）、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッドドメイン（配列番号８）、およびＴＣＲ－ζなど）を本明細書中に提供する。あるいは、キメラ受容体も生成できる（セクションＢ）。

【0268】

Ｂ．抗ＣＤ３３ＣＡＲ構築物の別の生成方法
例示的なキメラ受容体の略図を、図７のパネルＡ～Ｄに示す。キメラ受容体を、ＣＤ３３抗原を認識する細胞外ヒト化ｓｃＦｖ（細胞外ＣＤ８ヒンジ領域によって連結される）、膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ－シグナル伝達鎖を使用して生成するであろう（図７、パネルＢ）。抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするＤＮＡを、ヒト化ｓｃＦｖ使用して生成するであろう（Ｅｓｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（２０１３）２７３（２）：１６６）。代替法は、ＣＤ２８もしくはＣＤ２８／ＯＸ１またはＣＤ２８／４－１－Ｂ－Ｂハイブリッドの代わりにＯＸ－１または４１－ＢＢを含むＣＡＲ Ｔ細胞を含む（図７、パネルＣおよびＤ）。

【0269】

抗ＣＤ３３ｓｃＦＶ配列を生成するために、上記の抗ＣＤ３３抗体の可変領域の重鎖および軽鎖のコード領域（配列番号１および２）を、特異的プライマーで増幅し、細胞での発現のためのｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクターにクローン化するであろう。ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）の標的抗原への結合強度を評価するために、ｓｃＦｖをＨｅｋ２９３Ｔ細胞中で発現させるであろう。この目的のために、ベクター（コード領域を含むｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ）を、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ細菌に形質転換しプラスミドを調製するであろう。ｓｃＦｖ抗体をコードする得られた発現ベクターを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞へトランスフェクションによって導入するであろう。トランスフェクトされた細胞を５日間培養した後、上清を取り出し、抗体を精製するであろう。

【0270】

得られた抗体を、当該分野で公知のプロトコールによるフレームワーク置換を使用してヒト化できる。参照として、例えば、１つのかかるプロコールはＢｉｏＡｔｌａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）によって提供され、ここではテンプレート抗体に由来するフラグメントライブラリーをコードする合成ＣＤＲを、機能的に発現された抗体由来の生殖系列配列に制限されたヒトフレームワークプール由来のフラグメントをコードするヒトフレームワーク領域にライゲートする（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｅｘｐｒｅｓｓ－ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ／）。

【0271】

抗原結合親和性を改善するために、親和性の成熟を行うことができる。ファージディスプレイ（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９９６）、２６３：５５１）などの当該分野で公知の一般的な技術を用いてこれを行うことができる。バリアントを、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用してその生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングできる。改変の優れた候補と考えられる超可変領域残基を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定できる。さらに、記載のコンビナトリアルライブラリーを、抗体親和性の改善のために使用することもできる（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００５）１０２（２４）：８４６６）。あるいは、ＢｉｏＡｔｌａは、抗体の迅速かつ有効な親和性の成熟のためのプラットフォームを開発しており、このプラットフォームを、抗体最適化のために利用することもできる（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ／）。

【0272】

（Ｃ）ＣＡＲ構築物のアセンブリ
次に、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを、細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζ－シグナル伝達鎖に連結するであろう。簡潔に述べれば、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ配列に特異的なプライマーを使用して、上記のｓｃＦｖを増幅するであろう。完全なヒトＣＤ８コード配列を保有するプラスミド（ｐＵＮ１－ＣＤ８）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｕｎｏ－ｃｄ８ａ）を使用して、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン（アミノ酸１３５～２０５）を増幅するであろう。ＣＤ３ζフラグメントを、完全なヒトＣＤ３ζコード配列を保有するＩｎｖｉｖｏｇｅｎプラスミド ｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ＿１０Ｅ２６ｖ０６．ｐｄｆ）から増幅するであろう。最後に、ＣＤ２８（アミノ酸１５３～２２０、ＣＤ２８のＴＭドメインおよびシグナル伝達ドメインに対応する）を、Ｔｒｉｚｏｌ法によって活性化Ｔ細胞から回収したＲＮＡを使用して生成したｃＤＮＡから増幅するであろう。抗ＣＤ３３－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ヒンジ＋ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むフラグメントを、スプライス重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを使用してアセンブリするであろう。次いで、得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＥＬＰＳレンチウイルスベクターにクローン化するであろう。ｐＥＬＰＳは、第３世代レンチウイルスベクターｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥの誘導体であり、それはＣＭＶプロモーターがＥＦ－１αプロモーターに置換され、ＨＩＶのセントラルポリプリン配列がプロモーターの５’側に挿入されている（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）（８）：１４５３，Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１１）（８）：７２５）。全構築物を、配列決定によって検証するであろう。

【0273】

あるいは、ＣＤ２８ドメインの代わりにＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４１ＢＢ、またはＯＸ－４０シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを生成し、Ｔ細胞に導入し、ＣＤ３３陽性細胞を根絶する能力について試験するであろう（図７、パネルＣ）。効力をさらに増強するために複数のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０など）を組み合わせた「第３世代」キメラ受容体の生成も意図する（図７、パネルＤ）（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）４：３８８）。

【0274】

（Ｄ）抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
初代ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、免疫磁気分離法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって患者の末梢血から単離するであろう。Ｔ細胞を、以前に記載のように（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９（１２）：５９２１）、完全培地（１０％熱失活ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足したＲＰＭＩ１６４０）中で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂをコーティングしたビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激するであろう。

【0275】

パッケージング細胞株を使用して、標的細胞に形質導入でき抗ＣＤ３３キメラ受容体を含むウイルスベクターを生成するであろう。レンチウイルス粒子を生成するために、この実施例のセクション（１）で生成したＣＡＲを、不死化した通常の胎児腎臓２９３Ｔパッケージング細胞にトランスフェクトするであろう。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭを用いて培養するであろう。トランスフェクションから４８～７２時間後に、上清を回収し、組換えレンチウイルスを、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中で濃縮するであろう。次に、初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ポリブレンの存在下にて約５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入するであろう。ヒト組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、一日おきに添加するであろう（５０ＩＵ／ｍＬ）。Ｔ細胞を、刺激後約１４日間培養するであろう。ヒト初代Ｔ細胞の形質導入効率を、ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子の発現によって評価するであろう（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。

【0276】

Ｅ．患者へのＣＡＲ Ｔ細胞の注入
患者への抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、濃縮するであろう。無菌の閉鎖系を提供するＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ ＣｅｌｌＳａｖｅｒ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）などのセルプロセッサーを、製剤化前の洗浄および濃縮工程で使用するであろう。抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する終末Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミンを補足した１００ｍｌの滅菌規定食塩液に処方するであろう。最後に、患者に、１～１０×１０^７個Ｔ細胞／ｋｇを１～３日間にわたって注入するであろう（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１４）３７１（１６）：１５０７）。注入される抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞の数は、癌患者の状態、患者の年齢、以前の処置など多数の要因に依存するであろう。

【0277】

さらに、ＡＭＬ患者におけるＣＤを標的にするキメラ受容体に加えて、ＣＤ４５ＲＡを標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞も本明細書中で意図される。これを、以下の２つの異なるアプローチで達成できる：１）抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞および抗ＣＤ４７ＲＡキメラ受容体を発現する免疫細胞を個別に生成し、両方の免疫細胞型を個別に患者に注入すること、または２）ＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡの両方を同時に標的にする免疫細胞を生成すること（Ｋａｋａｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２）：１５１（２０１４））。

【0278】

ＩＩ．ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞を使用する自家造血幹細胞移植片（ＨＳＣＴ）
患者からの幹細胞の単離、移植前処置移植前処置、および患者への幹細胞の注入に関するプロトコールは、患者の年齢、状態、治療歴、および処置が行われる施設に依るところが非常に大きいと理解される。したがって、下記のプロトコールは単なる例示であり、当業者によって日常的に最適化される。

【0279】

Ａ．抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入後の末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）動員を使用する造血幹細胞の単離
ＡＭＬ患者を、１０ｍｇ／ｋｇ／日の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）のｉ．ｖ．投与によって刺激するであろう。ＣＤ３４^＋細胞のポジティブ選択を、免疫磁性ビーズおよび免疫磁性富化デバイスを使用して行うであろう。最少で２×１０^６個ＣＤ３４^＋細胞／ｋｇ体重が、ＦｅｎｗａｌｌＣＳ３０００＋セルセパレーターを用いて収集されると予想される（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００３）３２：８８９）。

【0280】

Ｂ．患者の移植前処置
自家末梢血幹細胞移植片（ＰＢＳＣＴ）の移植前処置を、エトポシド（ＶＰ－１６）＋シクロホスファミド（ＣＹ）＋全身照射（ＴＢＩ）を使用して行うであろう。簡潔に述べれば、このレジメンは、単回用量としての２６時間にわたる１．８ｇ／ｍ^２のエトポシド（ＶＰ－１６）のｉ．ｖ．持続注入（ｃ．ｉ．ｖ．）、その後の２時間にわたる３日間の６０ｍｇ／ｋｇ／日ｉ．ｖ．でのシクロホスファミド（ＣＹ）、その後の３日間の３００ｃＧｙ／日の全身照射（ＴＢＩ）からなるであろう。

【0281】

用量を計算するために、理想体重または実際の体重のいずれか少ない方を使用するであろう。前述のように、正確な移植前処置を決定する際には、癌患者の状態、患者の年齢、以前の処置、および手順を行われる施設のタイプなどの要因の全てが考慮されるであろう。

【0282】

Ｃ．ＣＤ３３を標的にするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのプラスミド構築
インサートＣａｓ９およびピューロマイシン耐性遺伝子を含むｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２を、Ａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド番号５２９６１）から入手するであろう（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）（８）：７８３）。単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＣＤ３３ガイド配列をクローン化するために、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２を切断し、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｓｍＢＩおよびＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて３７℃で２時間脱リン酸化するであろう。ＣＤ３３を標的にするｇＲＮＡを、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ．でのオンライン最適化デザインツールを使用してデザインするであろう。あるいは、ｇＲＮＡは、図１２に示す配列を有するであろう（配列番号１１）。ＣＤ３３ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から入手し、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して３７℃で３０分間リン酸化し、９５℃への５分間の加熱および２５℃への１．５℃／分の冷却によってアニーリングするであろう。Ｔ７リガーゼを使用して、オリゴをアニーリングし、その後にアニーリングしたオリゴをゲル精製したベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に２５℃で５分間ライゲートするであろう。次いで、得られたプラスミドを、無内毒素－ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅できる（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）（８）：７８３）。

【0283】

あるいは、２つのベクター系を、以前に記載されたプロトコール（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）で使用できる（ｇＲＮＡおよびＣａｓを個別のベクターから発現させる場合）。ここで、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．は、非ウイルスベクターから発現されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、ヒト造血幹細胞中の遺伝子の効率的な消失を達成した。

【0284】

簡潔に述べれば、Ｃ末端ＳＶ４０核局在シグナルを含むヒトコドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、２Ａ－ＧＦＰを有するＣＡＧ発現プラスミドにクローン化するであろう。Ｃａｓ９に目的のＣＤ３３配列を切断させるために、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ（配列番号１１））を、ヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むプラスミドから個別に発現するであろう。ｇＲＮＡ配列オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から入手し、アニーリングし、ＢｂｓＩ制限部位を使用してプラスミドに導入するであろう。ヒトＵ６プロモーターの転写開始には「Ｇ」塩基が必要であるため、かつＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列も必要であるため、ゲノム標的はＧＮ_２０ＧＧヌクレオチド配列を含むであろう。

【0285】

患者にＣＤ３３枯渇造血幹細胞ＨＳＣを注入することに加えて、患者にその後ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＨＳＣを注入するプロトコールが開発されるであろう。あるいは、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、ＣＤ３３遺伝子およびＣＤ４５ＲＡ遺伝子の両方を同時に減少させるためのＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－ＣＤ４５ＲＡ^－細胞を生成するであろう。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３３のための例示的なガイドＲＮＡ配列を、表４～８に示す。

【0286】

Ｄ．ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞を生成するためのＣＤ３４^＋細胞ＨＳＣのトランスフェクション
新たに単離した末梢血由来ＣＤ３４^＋細胞（工程４由来）を、１×１０^６細胞／ｍｌで、細胞培養グレードの幹細胞因子（ＳＣＦ）３００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３－Ｌ ３００ｎｇ／ｍｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）１００ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ－３ ６０ｎｇ／ｍｌの存在下で無血清ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地に播種するであろう。２４時間の事前刺激後に、ＣＤ３４^＋ＨＳＣを、ＡｍａｘａヒトＣＤ３４細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｕ－００８）（#ＶＰＡ－１００３）を使用して、Ｃａｓ９およびＣＤ３３ｇＲＮＡを含むＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２でトランスフェクトするであろう（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）。トランスフェクションから２４～４８時間後に、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞を１．２μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択する。ピューロマイシン選択後に、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞を、無ピューロマイシン培地中で２日間維持するであろう。

【0287】

Ｅ．ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞の患者への再注入
ｅｘ ｖｉｖｏにてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＣＤ３３でトランスフェクトしたＣＤ３４^＋細胞（ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^－細胞）を、フィルターを使用しない標準的な血液投与セットを使用して、直ちにヒックマンカテーテルによって再注入する（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ（２０１５）３１３（１５）：１５５０）。

【0288】

一般に、上記概説の処置プロトコールを受けた患者を、循環芽球および血球減少の再出現についてモニタリングするであろう。さらに、特定の患者におけるＡＭＬの発症機序に応じて、処置の成功を、有益な分子マーカーもしくは細胞遺伝学的マーカーの再出現、または有益なフローサイトメトリーパターンの試験によってモニタリングするであろう。例えば、フィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬにおけるＢＣＲ－ＡＢＬシグナルの再出現を、ＢＣＲ（２２番染色体について）およびＡＢＬ（９番染色体について）に対するプローブを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）を使用して検出するであろう。

【0289】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを介するＣＤ３３欠失の成功を評価するために、末梢血ＣＤ３４^＋細胞を、タンパク質（移植後）から単離し、例えばフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または免疫組織化学を使用して、ＣＤ３３発現について評価するであろう。

【0290】

本明細書中に記載のように、この実施例に記載のＨＳＣＴは、自家または同種のいずれかであり得、両方のアプローチが適切であり、本開示に記載の方法に組み込むことができる。

【0291】

ＩＩＩ．任意選択的な工程：毒素に付着されたＣＤ３３抗体による患者の継続処置
Ａ．ＣＤ３３免疫毒素ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）による患者の処置
患者を、２週間間隔で２回の用量における２時間の静脈内注入として、９ｍｇ／ｍ^２の抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）で処置するであろう（Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２００５），１０４（７）：１４４２－５２）。ＧＯは、細胞増殖抑制薬カリチアマイシンと抱合されたＣＤ３３に対するヒト化モノクローナル抗体から構成される（図８）。

【0292】

あるいは、抗ＣＤ３３抗体を、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、またはリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）などの異なる毒に抱合して生成できる（Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２３（１６）：２４７０）。同様に、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を毒素に付着させ、処置レジメンに含めることができる。

【0293】

実施例４：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞およびＮＫ細胞株は、ＣＤ３３を発現する標的細胞の細胞死を誘導する
ＣＤ３３へのキメラ受容体の結合
ＣＤ３３を結合するキメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、ＣＡＲＴ３）を、従来の組換えＤＮＡテクノロジーを使用して生成し、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に挿入した。キメラ受容体を含むベクターを使用してレンチウイルス粒子を生成し、これを使用して、異なる細胞型、例えば、Ｔ細胞株（例えば、２９３Ｔ細胞）およびＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞）に形質導入した。キメラ受容体の発現を、ウェスタンブロッティング（図９、パネルＡ）およびフローサイトメトリー（図９、パネルＢ）によって検出した。

【0294】

キメラ受容体を発現する細胞を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって選択し、そのＣＤ３３への結合能力を評価した。簡潔に述べれば、キメラ受容体を発現する２９３Ｔ細胞のライセートを、ＣＤ３３またはＣＤ３３－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合体と同時インキュベートした。試料をタンパク質電気泳動に供し、ポンソータンパク質染料（図１０、パネルＡ）で染色するか、膜に移して抗ＣＤ３ζ一次抗体で探索した（図１０、パネルＢ）。両方の場合で、キメラ受容体とそれらの標的ＣＤ３３の間の結合。

【0295】

キメラ受容体を発現するＫ５６２細胞も、プローブとしてＣＤ３３を使用するフローサイトメトリーによりＣＤ３３への結合について評価した（図１０、パネルＣ）。空のベクターコントロールを含む細胞と比較して、キメラ受容体（ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３）の発現およびＣＤ３３結合について陽性の細胞数が増加し、キメラ受容体がＣＤ３３に結合することが示された。

【0296】

キメラ受容体を発現する細胞によって誘導される細胞傷害性
キメラ受容体を発現するＮＫ－９２細胞を、細胞表面上にＣＤ３３を提示する標的細胞（例えば、Ｋ５６２は、ＣＤ３３＋であるヒト慢性骨髄性白血病（新）細胞株である）の細胞傷害性を誘導する能力について機能的に特徴づけた。細胞傷害性アッセイを行うために、エフェクター細胞（ＮＫ－９２細胞などの免疫細胞）を、キメラ受容体をコードするレンチウイルス粒子で感染させ、拡大した。感染から７日後に、キメラ受容体を発現する細胞を、キメラ受容体コードベクターによってもコードされる蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ＋またはＲｅｄ＋）について選択することによるＦＡＣＳ分析によって選択した。キメラ受容体を発現する選択された細胞を、１週間拡大した。感染から１４日後に、標的細胞（標的細胞表面系譜特異的抗原ＣＤ３３を発現する細胞）のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｙｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ）での染色ならびに標的細胞およびキメラ受容体を発現する細胞の計数を含む細胞傷害性アッセイを行った。標的細胞およびキメラ受容体を発現する細胞を、異なる比で丸底９６ウェルプレート中にて４．５時間同時インキュベートし、その後に７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を添加して生育不能細胞を染色した。フローサイトメトリーを行って、生存標的細胞集団および生育不能標的細胞集団を計数した。図１１のパネルＡおよびＢに示すように、キメラ受容体ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３を発現するＮＫ９２細胞は、評価した各細胞比で相当量の標的Ｋ５６２細胞の細胞死を誘導した。

【0297】

Ｋ５６２細胞の細胞死がＣＤ３３へのキメラ受容体の特異的標的化に依存するかどうかを決定するために、Ｋ５６２を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＣＤ３３が欠損するように遺伝子操作した。簡潔に述べれば、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＣＤ３３のＩｇＣドメインの一部を標的にするｇＲＮＡをＫ５６２細胞中で発現し、それにより、ＣＤ３３欠損型Ｋ５６２細胞集団を得た。この細胞を拡大し、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞と同時インキュベートし、細胞傷害性アッセイを上記のように行った。図１２のパネルＡに示すように、プールしたＣＤ３３欠損型Ｋ５６２細胞は、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞と同時インキュベートした場合に細胞死のわずかな減少を示した。しかし、ＣＤ３３欠損型Ｋ５６２細胞の単一クローンを単離し、拡大し、これを使用して細胞傷害性アッセイを行った場合、細胞傷害性のより顕著な低下が観察された（図１２、パネルＢ）。

【0298】

初代Ｔ細胞におけるキメラ受容体の発現
初代Ｔ細胞集団を、ＦＡＣＳによるＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の陽性選択によってドナーから得たＰＭＢＣから単離し、それにより、高純度の集団を得た（図１３、パネルＡおよびＢ）。各初代Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞）を、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ８）を含むレンチウイルスベクターで形質導入し、それによって得られたキメラ受容体を発現する初代Ｔ細胞を使用して、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。キメラ受容体を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞集団のＫ５６２（１０００個の標的Ｋ５６２細胞）との同時インキュベーションは、Ｋ５６２細胞の細胞傷害性を生じなかった（図１４、パネルＡ）。対照的に、キメラ受容体を発現するＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のいずれかおよび１０００個の標的Ｋ５６２細胞を使用する細胞傷害性アッセイでは、ＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞は、低細胞比でＫ５６２細胞の細胞死を誘導できた（図１４、パネルＢ）。

【0299】

造血幹細胞の遺伝子操作
いくつかのｇＲＮＡを、ＣＤ３３のＩｇＣドメインとハイブリッド形成するようにデザインした（例えば、表４、配列番号１１または２８～３１を参照のこと）。各ｇＲＮＡを、Ｋ５６２細胞中でＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｃｕｌｅａｓｅ）と共に発現させた。ＣＤ３３の発現を、フローサイトメトリーによって評価した（図１５）。Ｃｒｉｓｐｒ３（配列番号２８）およびＣｒｉｓｐｒ５（配列番号２９）について示すように、ＣＤ３３を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを発現する細胞において、ＣＤ３３を発現する対照細胞と比較して、ＣＤ３３が顕著に減少した。

【0300】

ＣＤ３３欠損型造血幹細胞を、種々の特徴（増殖、赤血球生成性分化（ｅｒｙｔｈｏｐｏｅｉｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、およびコロニー形成を含む）についても評価した。簡潔に述べれば、ＣＤ３３欠損型造血幹細胞および対照細胞を、ヘミンへの前述の細胞の暴露によって分化誘導し、ＣＤ７１（赤血球前駆体のマーカー）を、フローサイトメトリーによって異なる時点で評価した（図１６、パネルＡおよびＢ）。ＣＤ３３欠損型造血幹細胞は赤血球生成性分化（ｅｒｙｔｈｏｐｏｅｉｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を受け、フローサイトメトリープロフィールは、対照細胞（ＣＤ３３＋）に類似するようであった。細胞をＭＴＴアッセイにも供して、ＣＤ３３欠損型造血幹細胞の代謝活性を測定した。図１６のパネルＣに示すように、ＣＤ３３欠損型造血幹細胞は対照細胞と同程度に機能した。最後に、細胞が増殖して細胞コロニーを形成する能力を、微視的コロニー形成アッセイを使用して観察した。この場合も、ＣＤ３３欠損型造血幹細胞は、対照細胞と同程度にコロニーを形成できた（図１８）。これらの結果は、ＣＤ３３の一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ欠失が細胞の増殖能力、分化能力、またはコロニー形成力に有意に影響を及ぼさないことを示す。

【0301】

実施例５
ある実施形態では、本発明は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型を示すドナーＨＳＣの利用に関する。ある実施形態では、ＳＮＰは：ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中の（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）（図１９を参照のこと）である。このＳＮＰは、ＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、その結果、成熟転写物からエクソン２が喪失する。エクソン２によってコードされる領域は、ＣＤ３３を標的にするほとんどのモノクローナル抗体の結合部位である。したがって、このＳＮＰ（またはエクソン２を喪失させる類似のＳＮＰ）と共にＨＳＣを利用することは、系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞集団を提供し、それ故に抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復できる標的化方法である。

【0302】

別の実施形態では、ドナー細胞がＳＮＰｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示すかどうかと無関係にドナー細胞由来のＥＳＥ部位を破壊し、それ故にＣＤ３３エクソン２の喪失を保証するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用方法を提供する。したがって、この実施形態は、ドナー細胞由来のＥＳＥ部位を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用に関する。ＰＡＭを有するガイドおよびこの方法のための配列全体の概要を図１９に示す。ドナー細胞由来のＥＳＥを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの利用は、系譜特異的細胞表面抗原を欠損している造血細胞集団を提供しそれ故に抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復できる代替法である。

【0303】

この実施形態の重要な配列の態様の概要を述べた略図を図１９に示す。

【0304】

したがって、ある態様では、ドナーＨＳＣを、本明細書中に記載のＳＮＰの存在についてスクリーニングでき、この場合、ＳＮＰがＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それにより成熟転写物からエクソン２が喪失するので、さらなる遺伝子操作は必要ないであろう。この様式で、ＣＤ３３標的化処置を受けた患者にＨＳＣの回復集団を提供でき、患者らの正常なＨＳＣが回復されるであろう。

【0305】

あるいは、かかるＳＮＰの非存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、本明細書中に記載のドナー細胞由来のＥＳＥ部位を破壊してＣＤ３３エクソン２を有効に排除し、抗原特異的処置後に正常な造血細胞を回復するためのＨＳＣを生成するための代替法を提供する。

【0306】

したがって、本開示の１つの態様は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量；および
（ｉｉ）ＣＤ３３遺伝子のエクソン２が変異しているか欠損している造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0307】

さらなる実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３３遺伝子のエクソン２中に一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９（Ｃ＞Ｔ；Ａｌａ１４Ｖａｌ）を示す。

【0308】

なおさらなる実施形態では、ＳＮＰは、ＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２を喪失させる。

【0309】

さらなる実施形態では、本開示は、造血器悪性疾患を処置する方法であって、前述の処置を必要とする被験体に、以下の：
（ｉ）系譜特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤の有効量であって、前述の薬剤が、ＣＤ３３である系譜特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合断片を含む、薬剤の有効量および
（ｉｉ）ＣＤ３３遺伝子のエクソン２が変異するか欠損するように遺伝子操作された造血細胞集団
を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0310】

さらなる実施形態では、ＣＤ３３遺伝子は、造血細胞中でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって操作される。

【0311】

さらなる実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、ＣＤ３３をコードする内因性遺伝子を、ＣＤ３３の発現を消失させるかＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失されるように編集することによって調製される。

【0312】

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＳＲＳＦ２のエクソン内スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合部位に干渉し、それによりＣＤ３３の成熟転写物からエクソン２が喪失される変異が作出される。

【0313】

なおさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作により、ＣＤ３３を標的にする薬剤によって認識されないＣＤ３３が得られる。

【0314】

本明細書中で使用される場合、造血器悪性疾患は、造血細胞（例えば、前駆体および幹細胞を含む血球）が関与する悪性の異常を指す。造血器悪性疾患の例は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。白血病は、急性骨髄球性白血病（新）（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病（新）、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む。

【0315】

あるいはまたはさらに、本明細書中に記載の方法を使用して、非造血癌（肺癌、耳鼻咽喉癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、乳がん、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨の癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼球の癌；頭頸部癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；肝臓癌；線維腫、神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；腎癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃がん；睾丸癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫および肉腫を含むが、これらに限定されない）を処置できる。

【0316】

参考文献
Ｌａｍｂａ ＪＫ１，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ａｕｇ １０；３５（２３）：２６７４－２６８２．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１６．７１．２５１３．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ ２３． ＣＤ３３ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｒｅｐｏｒｔ Ｆｒｏｍ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒｉａｌ ＡＡＭＬ０５３１．

【0317】

他の実施形態
本明細書中に開示の全ての特徴を、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書中に開示の各特徴を、同一、等価、または類似の目的を果たす別の特徴に置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示の各特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の一例にすぎない。

【0318】

上記の説明から、当業者は、本開示の本質的特質を容易に確認でき、その意図および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応するように本開示の種々の変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内にある。

【0319】

均等物
本明細書中にいくつかの本発明の実施形態を記載および例示しているが、当業者は、本明細書中に記載の機能を発揮し、そして／または結果および／または１つまたは複数の利点を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、かかる変形および修正の各々が本明細書中に記載の本発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載の全てのパラメーター、寸法、材料、および構成が例示であることを意味すること、ならびに、実際のパラメーター、寸法、材料、および構成が本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態の多数の均等物を認識するか、確認できるであろう。したがって、前述の実施形態がほんの一例として示されおり、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態を、具体的に説明および主張された方法以外の方法で実施できると理解すべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書中に記載の個別の特徴、システム、製品、材料、キット、および／または方法に関する。さらに、かかる特徴、システム、製品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２つまたはそれを超えるかかる特徴、システム、製品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせが、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

【0320】

本明細書中で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参考として援用される文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を制すると理解されるべきである。

【0321】

本明細書中に開示の全ての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参考として援用され、場合によっては文書全体を包含し得る。

【0322】

本明細書中および特許請求の範囲中で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0323】

本明細書中および特許請求の範囲中で使用される句「および／または」は、前述の句で連結された要素の「いずれかまたは両方」（すなわち、ある場合には連言的に存在し、別の場合には離接的に存在する要素）を意味すると理解すべきである。「および／または」を用いて列挙した複数の要素は、同一の様式にある（すなわち、前述の句で連結された「１つまたは複数」の要素）と解釈されるべきである。前述の具体的に指定された要素と関連するか無関係かに関わらず、「および／または」節によって具体的に指定された要素以外の他の要素が任意選択的に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」との言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの非制限用語と併せて使用される場合、１つの実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意選択的に含む）などを指し得る。

【0324】

本明細書中および特許請求の範囲中で使用される場合、「または」は、上記定義の「および／または」と同一の意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包含、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意選択的に、列挙されていないさらなる項目も含むと解釈されるものとする。「１つのみ」もしくは「正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合の「～からなる」などの逆を明確に示す用語のみが、複数の要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指すであろう。一般に、本明細書中で使用される用語「または」は、「いずれか」、「１つの」、「たった１つの」、または「正確に１つの」などの排他性を示す用語が先行する場合、代替物を排除する（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）ことのみを示すと解釈されるものとする。「～から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法で使用される通常の意味を持つものとする。

【0325】

本明細書中および特許請求の範囲中で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、複数の要素のリスト中の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、複数の要素のリスト内に具体的に列挙された各要素およびあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、かつ複数の要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解すべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ」が指す要素のリストの範囲内に具体的に指定された要素以外の要素が、前述の具体的に指定された要素と関連するか無関係かに関わらず、任意選択的に存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、等価に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、等価に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在しない（かつＢ以外の要素を任意選択的に含む）少なくとも１つのＡ（任意選択的に１超を含む）；別の実施形態では、Ａが存在しない（かつＡ以外の要素を任意選択的に含む）少なくとも１つのＢ（任意選択的に１超を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択的に１超を含む）および少なくとも１つのＢ（任意選択的に１超を含む）（かつ他の要素を任意選択的に含む）などを指し得る。

【0326】

逆に明確に示されない限り、１つを超える工程または行為を含む本明細書中に主張した任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-06-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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