特開 2024-105542 ＦｒａＣアクチノポリンに基づくバイオポリマーセンシングおよび配列決定のための生物学的ナノポア

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024105542

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】ＦｒａＣアクチノポリンに基づくバイオポリマーセンシングおよび配列決定のための生物学的ナノポア

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20240730BHJP

   G01N 27/00 20060101ALI20240730BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20240730BHJP

【ＦＩ】

C07K14/435 ZNA

G01N27/00 Z

C07K14/435

C12Q1/6869 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024078970

(22)【出願日】2024-05-14

(62)【分割の表示】P 2022014867の分割

【原出願日】2017-05-24

(31)【優先権主張番号】62/360,999

(32)【優先日】2016-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＥＦＬＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514265131

【氏名又は名称】レイクスユニフェルシテイト フローニンゲン

(74)【代理人】

【識別番号】100126572

【弁理士】

【氏名又は名称】村越 智史

(72)【発明者】

【氏名】マリア， ジョバンニ

(72)【発明者】

【氏名】カーステン， ウォーカ

(72)【発明者】

【氏名】ムッター， ナタリー リサ

(72)【発明者】

【氏名】ソスキン， ミーシャ

(72)【発明者】

【氏名】ファン， グァン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ナノポアを通した移行の間に電気的測定を行うことによる、種々の適用、例えば、バイオポリマーおよび高分子の分析におけるその使用を提供する。
【解決手段】アクチノポリンタンパク質ファミリー由来のメンバーであるαヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシステムであって、前記αヘリックスポア形成毒素が、フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）、変異体ＦｒａＣ、ＦｒａＣパラログまたはＦｒａＣホモログである、システムを提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アクチノポリンタンパク質ファミリー由来のメンバーであるαヘリックスポア形成毒素
を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシステムであって、前記αヘリックスポア形
成毒素が、フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）、変異体ＦｒａＣ、ＦｒａＣパラログまた
はＦｒａＣホモログである、システム。

【請求項2】

ナノポアが第１の液体媒体と第２の液体媒体との間に位置し、少なくとも一方の液体媒
体が分析物を含み、システムが分析物の特性を検出するように作動する、請求項１に記載
のシステム。

【請求項3】

分析物を、ポアを通して移行させるおよび／またはポア中にトラップするように作動す
る、請求項１または２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項4】

分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナノポアと相互作用するように、ナノ
ポアを電場に供することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項5】

分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナノポアを通して電気泳動および／ま
たは電気浸透によって移行するように、ナノポアを電場に供することを含む、請求項１か
ら４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項6】

特性が、分析物の電気的、化学的または物理的特性である、請求項４または５に記載の
システム。

【請求項7】

ナノポアが、（平面状）脂質二重層中に含まれる、請求項１から６のいずれか一項に記
載のシステム。

【請求項8】

脂質二重層が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、好ましくは１，２－ジフィタノイル－
ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを含むまたはそれからなる、請求項７に記載のシステ
ム。

【請求項9】

前記ＦｒａＣが変異体ＦｒａＣである、請求項１から８のいずれか一項に記載のシステ
ム。

【請求項10】

前記変異体ＦｒａＣが、ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、中性
もしくは正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭
い部分における中性アミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの
置換を含む、請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

前記変異体ＦｒａＣが、１０位における変異、好ましくは変異Ａｓｐ１０Ａｒｇまたは
Ａｓｐ１０Ｌｙｓを含む、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記変異体ＦｒａＣが、前記ＦｒａＣの溶血活性を回復させる１つまたは複数の代償性
変異をさらに含み、好ましくは、前記代償性変異が、２位、９位、３４位、５２位、１１
２位、１５０位、１５３位および／または１５９位、好ましくは１５９位に存在する、請
求項１０から１１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項13】

好ましくはそのＣ末端で、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグなどのタンパク質親和性タ
グに融合されたＦｒａＣを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれか一項に記載のシステムを提供するための方法であって、
アクチノポリンタンパク質ファミリー由来の前記αヘリックスポア形成毒素の組換えモ
ノマーを用意する工程と、
前記モノマーをリポソームと接触させて、前記モノマーをオリゴマーへとアセンブルす
る工程と、
前記リポソームから前記オリゴマーを回収する工程と、
前記オリゴマーを、スフィンゴミエリンを含有し得る脂質二重層と接触させて、ナノポ
アの形成を可能にする工程と、
を含む、方法。

【請求項15】

請求項１から１３のいずれか一項に記載のシステムに電場を印加する工程を含む方法で
あって、前記αヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のナノポアが、第１の伝導性液体媒
体と第２の伝導性液体媒体との間に位置する、方法。

【請求項16】

前記伝導性液体媒体の少なくとも一方が分析物を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記分析物が前記ナノポアと相互作用する際のイオン電流を測定して電流パターンを得
るステップを含む方法において前記分析物を検出するステップをさらに含み、前記電流パ
ターンにおける遮断の発生が、前記分析物の存在を示す、請求項１５または１６に記載の
方法。

【請求項18】

分析物を同定するステップをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の
方法。

【請求項19】

分析物を同定するステップが、電流パターンを、同じ条件下で既知の分析物を使用して
得られた既知の電流パターンと比較することを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記分析物が、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク
質、ポリマー、薬物、イオン、汚染物質、ナノスコピックな物体または生物兵器剤である
、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

分析物がポリマーである、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、折り畳まれていないペ
プチド、折り畳まれていないオリゴペプチドおよび折り畳まれていないタンパク質からな
る群から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ポリマーが核酸である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記核酸が、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せである、請求項
２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ＦｒａＣナノポアが変異体ＦｒａＣナノポアである、請求項１５から２４のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項26】

変異体ＦｒａＣナノポアのトンネルを通るコンダクタンスが、その対応する野生型Ｆｒ
ａＣナノポアを通るコンダクタンスよりも高い、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基へ
の少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭い部分における中性アミノ酸残基から
、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む第１の変異体ＦｒａＣモノ
マーを少なくとも含む、変異体フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）ナノポア。

【請求項28】

３位もしくは１０位、または３位および１０位の両方における置換を含む、請求項２７
に記載の変異体。

【請求項29】

１０位における変異、好ましくはＤ１０Ｒを含む、請求項２８に記載の変異体ＦｒａＣ
ナノポア。

【請求項30】

ＦｒａＣの溶血活性を回復させる１つまたは複数の代償性変異をさらに含む変異体Ｆｒ
ａＣであって、好ましくは、前記代償性変異が、２位、９位、３４位、５２位、１１２位
、１５０位、１５３位、１５９位、および／または好ましくは１５９位に存在し、より好
ましくは、前記変異体ＦｒａＣが、変異Ｄ１０ＲおよびＫ１５９Ｅを含む、請求項２７か
ら２９のいずれか一項に記載の変異体。

【請求項31】

野生型ＦｒａＣモノマー、第２の変異体ＦｒａＣモノマー、野生型ＦｒａＣパラログま
たはホモログモノマーおよび変異体ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーからなる群
から選択される第２のモノマーを少なくともさらに含み、第２の変異体ＦｒａＣモノマー
が、第１の変異体ＦｒａＣモノマーと同じでも異なってもよい、請求項２７から３０のい
ずれか一項に記載の変異体ＦｒａＣナノポア。

【請求項32】

第２のモノマーが、野生型ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーである、請求項３
１に記載の変異体ＦｒａＣナノポア。

【請求項33】

第１の変異体ＦｒａＣモノマーが変異Ｄ１０を含み、好ましくは、変異体が表３に示さ
れるものから選択される、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の変異体ＦｒａＣナ
ノポア。

【請求項34】

その対応する野生型ＦｒａＣナノポアのトンネルを通るコンダクタンスよりも高い、ト
ンネルを通るコンダクタンスを有する、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の変異
体ＦｒａＣナノポア。

【請求項35】

分子モーターをさらに含み、分子モーターが、分子モーターの非存在下で分析物がナノ
ポア中にまたはナノポアを通して移行する平均移行速度よりも低い平均移行速度で、分析
物をナノポア中にまたはナノポアを通して移動させることが可能である、請求項２７から
３４のいずれか一項に記載の変異体ＦｒａＣナノポア。

【請求項36】

分子モーターが酵素である、請求項３５に記載の変異体ＦｒａＣナノポア。

【請求項37】

酵素が、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼまたはクレノウ断片である、請求項３６に
記載の変異体ＦｒａＣナノポア。

【請求項38】

バイオポリマーセンシングおよび／またはバイオポリマー配列決定のための、請求項１
から１３のいずれか一項に記載のシステムまたは請求項２７から３７のいずれか一項に記
載の変異体ＦｒａＣナノポアの使用。

【請求項39】

前記バイオポリマーが、タンパク質、ペプチドまたは核酸である、請求項３８に記載の
使用。

【請求項40】

前記バイオポリマーが核酸であり、好ましくは、前記核酸が、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ
、ＲＮＡ、またはそれらの組合せである、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

前記バイオポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、折り畳まれてい
ないペプチド、折り畳まれていないオリゴペプチドまたは折り畳まれていないタンパク質
である、請求項３９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は概して、ナノポアの分野、および典型的にはナノポアを通した移行の間に電気
的測定を行うことによる、種々の適用、例えば、バイオポリマーおよび高分子の分析にお
けるその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ナノポアは、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの正体を決定するため、
または配列決定のためにポリマー中の個々の構成単位の正体を推定するためにバイオポリ
マーを分析する、魅力的な方法となる。これは、この方法がラベルなしであり、少数のま
たはさらには単一の分子に依存する測定を提供し、高度にスケーラブルな電気シグナルを
生成するからである。

【0003】

ナノポアを利用する測定システムでは、システムの一部の特性は、ナノポア中のヌクレ
オチドに依存し、その特性の電気的測定が行われる。例えば、測定システムは、ナノポア
を絶縁膜中に配置し、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの存在下でナノポアを通る電圧駆
動性イオン流を測定することによって創出される。

【0004】

ナノポアは、化学反応および酵素反応の単一分子モニタリング、タンパク質の検出なら
びに核酸の配列決定のための強力なアプローチとして出現した［１］、［２］。Ｐｈｉ２
９［３］ならびにＣｌｙＡ［４］は、二本鎖ＤＮＡの移行を可能にすることが示されてい
る。最近、アエロリジンが、アデニンからなるが長さが異なるホモポリマーを識別するた
めに使用された［５］。今日まで、αＨＬおよびＭｓｐＡのみが、核酸を識別することが
示されている。両方のナノポアは、それらの膜貫通領域中にβシートを有する。ＤＮＡが
ＭｓｐＡを通るとき、遮断された電流のレベルは、４つ以上のヌクレオチドによって影響
されるが［６］、αＨＬは、約２０核酸塩基を収容するそのバレル型構造中に３つのセン
シングゾーンを有する［７］。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、配列決定の精度を改善し、および／または異なるエラープロファイルを提供
する、異なる構造および認識部位を有する新規ナノポアを提供する。本明細書で、本発明
者らは、スフィンゴミエリンと複合体を形成した、アクチノポリンタンパク質ファミリー
由来のメンバーであるαヘリックスポア形成毒素フラガセアトキシン（Ｆｒａｇａｃｅａ
ｔｏｘｉｎ）Ｃ（ＦｒａＣ）の精製および事前オリゴマー化、ならびに１，２－ジフィタ
ノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）から構成される平面状脂質二
重層への再構成を記載する。本発明者らは、ｓｓＤＮＡの捕捉および移行を可能にし、ニ
ュートラアビジン（ＮＡ）で固定化したアデニン、チミンおよびシトシンのホモポリマー
を識別するＦｒａＣ変異体（例えば、ＲｅＦｒａＣ）をさらに操作した。特に、ｄｓＤＮ
Ａは、ＦｒａＣを通して、最も可能性が高いのは、ナノポアの弾性的に変形したαヘリッ
クス状のくびれを介して、移行し得る。

【0006】

注目すべきことに、ＦｒａＣナノポアは、タンパク質配列決定および折り畳まれたタン
パク質の分析のための理想的な形状を有することが見出された。電気浸透流が、ナノポア
の内側へのタンパク質およびポリペプチドの進入を誘導する支配的な力であることが、本
明細書で以下に示される。ナノポアのくびれを正確に操作することまたは溶液ｐＨを変化
させることのいずれかによってナノポアの内側表面を調整することによって、正に荷電し
たポリペプチドおよび負に荷電したポリペプチドの両方の移行を観察できた。固定された
印加電位において正の残基および負の残基の両方を輸送するのに十分に強い電気浸透流を
誘導することが可能であることが示されているので、これは注目すべきことである。異な
るサイズ、例えば、１．２～２５ｋＤａの範囲の一連の（折り畳まれていない）タンパク
質は、個々の遮断に基づいて識別できることが、注目すべきことに見出された。２０アミ
ノ酸のモデルポリペプチドを使用して、単一アミノ酸残基における差異でさえもナノポア
記録によって観察できることが実証され、これは、ＦｒａＣナノポアが、移行するポリペ
プチド中の特定の配列特色の同定を可能にすることを示している。

【0007】

さらに、本発明者らは、スフィンゴミエリンを含まない平面状脂質二重層中で事前オリ
ゴマー化されたＦｒａＣナノポアを再構成する方法を発明した。ＲｅＦｒａＣナノポアは
、電気泳動によるＤＮＡ捕捉を可能にするために操作され、ｓｓＤＮＡホモポリマー間の
識別を示した。ＤＮＡを配列決定するために使用される他のナノポア（例えば、αＨＬお
よびＭｓｐＡ）とは対照的に、ＦｒａＣは、核酸塩基識別を微調整するのに有利なαヘリ
ックスＶ字型の膜貫通領域を有する。これは、膜貫通αヘリックス内の異なる位置におけ
るアミノ酸置換が、くびれのサイズおよび化学組成の両方をモジュレートし得るからであ
る。

【0008】

ＲｅＦｒａＣは、低い印加電位でＤＮＡ二重鎖のアンジッピングを誘導すること、また
は高い印加電位でそれらの移行を可能にすることもまた、本明細書で示されている。ＤＮ
Ａヘアピンまたはより高次のＤＮＡ構造のアンジッピングは、αＨＬナノポアを使用して
調査されてきた［２０］、［２１］。しかし、ＲｅＦｒａＣのシス前庭（５．５ｎｍ）は
、αＨＬのシス前庭（２．６ｎｍ）［１３］またはＭｓｐＡのシス前庭（４．８ｎｍ）［
２２］よりも広く、これは、ＦｒａＣが、より大きい高次のｄｓＤＮＡ構造、例えばＧ－
四重鎖、または折り畳まれたＲＮＡ構造、例えばｔＲＮＡを研究するために有利に使用さ
れ得ることを示している。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、第１の態様では、本発明は、アクチノポリンタンパク質ファミリー由来の
メンバーであるαヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシ
ステムを提供する。より具体的には、αヘリックスポア形成毒素は、フラガセアトキシン
Ｃ（ＦｒａＣ）、変異体ＦｒａＣ、ＦｒａＣパラログまたはＦｒａＣホモログである。Ｆ
ｒａＣは、好ましくはそのＣ末端で、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグなどのタンパク質
親和性タグに融合され得る。

【0010】

非常に良好な結果が、変異体ＦｒａＣを用いて得られ得る。例えば、変異体ＦｒａＣは
、ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、中性もしくは正に荷電したア
ミノ酸残基への少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭い部分における中性アミ
ノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む。例えば、変
異体は、膜貫通ヘリックス中に少なくとも１つの変異を含む。好ましくは、少なくとも１
つの負に荷電したアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基に変化される。好ましい実
施形態では、変異体ＦｒａＣは、１０位における変異、好ましくは変異Ａｓｐ１０Ａｒｇ
またはＡｓｐ１０Ｌｙｓ（結晶構造ＰＤＢ ＩＤ ４ＴＳＹと同様の残基番号付け）を含
む。変異体ＦｒａＣは、ＦｒａＣの溶血活性を回復させる１つまたは複数の代償性変異を
さらに含み得、好ましくは、前記代償性変異は、２位、９位、３４位、５２位、１１２位
、１５０位、１５３位および／もしくは１５９位、ならびに／または好ましくは１５９位
に存在する。例えば、前記代償性変異は、Ａ２Ｓ、Ｉ９Ｔ、Ａ３４Ｖ、Ｆ５２Ｙ、Ｗ１１
２Ｌ、Ｔ１５０Ｉ、Ｇ１５３Ｄ、Ｋ１５９Ｅ、Ｉ１７１Ｔおよびそれらの任意の組合せか
らなる群から選択される。具体的な態様では、変異体ＦｒａＣは、１５９位における変異
、好ましくはＬｙｓ１５９Ｇｌｕを（さらに）含む。例えば、ＦｒａＣ二重変異体Ｄ１０
Ｒ／Ｋ１５９Ｅが使用される。

【0011】

ナノポアは第１の液体媒体と第２の液体媒体との間に位置し得、少なくとも一方の液体
媒体は分析物を含み、システムは分析物の特性を検出するように作動する。

【0012】

一実施形態では、システムは、トンネルを通して分析物を移行させるように作動する。
別の実施形態では、このシステムは、分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナ
ノポアと相互作用するように、ナノポアを電場に供することを含む。印加電位（電場を作
り出す）は、電流を有するために必要である。電流は、アウトプットシグナルである。例
えば、このシステムは、分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナノポアを通し
て電気泳動および／もしくは電気浸透によって移行するように、ならびに／またはナノポ
ア中にトラップされるように、ナノポアを電場に供することを含む。特性は、分析物の電
気的、化学的または物理的特性であり得る。

【0013】

好ましくは、ナノポアは、（平面状）脂質二重層中に含まれる。具体的な態様では、脂
質二重層は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、好ましくは１，２－ジフィタノイル－ｓｎ
－グリセロ－３－ホスホコリンを含むまたはそれからなる。

【0014】

第２の態様では、本発明は、本発明に従うシステムを提供するための方法であって、
アクチノポリンタンパク質ファミリー由来の前記αヘリックスポア形成毒素の組換えモ
ノマーを用意するステップ；
前記モノマーをリポソームと接触させて、前記モノマーをオリゴマーへとアセンブルす
るステップ；
リポソームからオリゴマーを回収するステップ；および
オリゴマーを、スフィンゴミエリンを含有し得る脂質二重層と接触させて、ナノポアの
形成を可能にするステップ
を含む方法を提供する。

【0015】

第３の態様では、本発明は、本明細書に開示されるシステムに電場を印加するステップ
を含む方法であって、αヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のナノポアが、第１の伝導
性液体媒体と第２の伝導性液体媒体との間に位置する、方法を提供する。伝導性液体媒体
の少なくとも一方は、分析物を含み得る。この方法は、分析物がナノポアと相互作用する
際のイオン電流を測定して電流パターンを得るステップを含む方法において分析物を検出
するステップをさらに含み得、電流パターンにおける遮断の発生は、分析物の存在を示す
。この方法は、例えば、電流パターンを、同じ条件下で既知の分析物を使用して得られた
既知の電流パターンと比較することによって、分析物を同定するステップをさらに含み得
る。分析物は、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、薬物
、イオン、汚染物質、ナノスコピックな物体または生物兵器剤であり得る。

【0016】

一実施形態では、分析物は、ポリマー、例えば、タンパク質、ペプチドまたは核酸であ
る。好ましくは、分析物は、核酸、例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそ
れらの組合せである。別の好ましい態様では、分析物は、例えば、約１～約４０ｋＤａ、
好ましくは約１～約３０ｋＤａの範囲のサイズを有する、タンパク質、ポリペプチドまた
はオリゴペプチドである。一実施形態では、分析物は、オリゴペプチド（約１０以下のア
ミノ酸）、ポリペプチド（＞１０のアミノ酸）または折り畳まれたタンパク質（＞５０の
アミノ酸）である。

【0017】

本発明の方法では、ＦｒａＣナノポアは、好ましくは、変異体ＦｒａＣナノポアである
。変異体ＦｒａＣナノポアのトンネルを通るコンダクタンスは、典型的には、その対応す
る野生型ＦｒａＣナノポアを通るコンダクタンスよりも高い。

【0018】

なおさらなる態様は、ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、正に荷
電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭い部分における
中性アミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む第１
の変異体ＦｒａＣモノマーを少なくとも含む、変異体フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）
ナノポアに関する。例えば、変異体は、膜貫通ヘリックス中に少なくとも１つの変異を含
む。好ましくは、少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸
残基に変化される。変異体は、３位もしくは１０位、または３位および１０位の両方にお
ける置換を含み得る。好ましい実施形態では、変異体ＦｒａＣは、１０位における変異、
好ましくは変異Ａｓｐ１０ＡｒｇまたはＡｓｐ１０Ｌｙｓ（結晶構造ＰＤＢ ＩＤ ４Ｔ
ＳＹと同様の残基番号付け）を含む。変異体ＦｒａＣは、ＦｒａＣの溶血活性を回復させ
る１つまたは複数の代償性変異をさらに含み得、好ましくは、前記代償性変異は、２位、
９位、３４位、５２位、１１２位、１５０位、１５３位および／もしくは１５９位、なら
びに／または好ましくは１５９位に存在する。例えば、前記代償性変異は、Ａ２Ｓ、Ｉ９
Ｔ、Ａ３４Ｖ、Ｆ５２Ｙ、Ｗ１１２Ｌ、Ｔ１５０Ｉ、Ｇ１５３Ｄ、Ｋ１５９Ｅ、Ｉ１７１
Ｔおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。具体的な態様では、変異体Ｆ
ｒａＣは、１５９位における変異、好ましくはＬｙｓ１５９Ｇｌｕを（さらに）含む。非
常に良好な結果が、ＦｒａＣ二重変異体Ｄ１０Ｒ／Ｋ１５９Ｅを用いて得られ得る。具体
的に好ましい変異体には、以下の本明細書の表３のものが含まれる。

【0019】

変異体ＦｒａＣナノポアは、野生型ＦｒａＣモノマー、第２の変異体ＦｒａＣモノマー
、野生型ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーおよび変異体ＦｒａＣパラログまたは
ホモログモノマーからなる群から選択される第２のモノマーを少なくともさらに含み得、
第２の変異体ＦｒａＣモノマーは、第１の変異体ＦｒａＣモノマーと同じでも異なっても
よい。例えば、第２のモノマーは、野生型ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーであ
る。一実施形態では、変異体ＦｒａＣナノポアの第１の変異体ＦｒａＣモノマーは、変異
Ｄ１０Ｒを含み、好ましくは、変異体は、表３に示されるものから選択される。

【0020】

変異体ＦｒａＣナノポアは、好ましくは、その対応する野生型ＦｒａＣナノポアのトン
ネルを通るコンダクタンスよりも高い、トンネルを通るコンダクタンスを有する。

【0021】

変異体ＦｒａＣナノポアは、分子モーターをさらに含み得、分子モーターは、分子モー
ターの非存在下で分析物がナノポア中にまたはナノポアを通して移行する平均移行速度よ
りも低い平均移行速度で、分析物をナノポア中にまたはナノポアを通して移動させること
が可能である。

【0022】

例えば、分子モーターは、酵素、例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼまたはク
レノウ断片である。

【0023】

タンパク質分析のために、荷電したくびれによって誘導される、シス区画からトランス
区画への電気浸透流（ＥＯＦ）を有することが好ましい。くびれと同じ電荷のアミノ酸の
移行は、分析物溶液のｐＨの操作によって得られ得る。低いｐＨ値（＜約４．５）で負の
電荷を維持する１つまたは複数の非天然アミノ酸を使用することが有利であり、例えば、
硫酸（ＳＯ₄ ^2-）またはリン酸（ＰＯ₄ ^2-）部分は、適切なアミノ酸側鎖基である。したが
って、負の印加電位（ｐＨ４．５以下）下でシス区画からトランス区画への強い電気浸透
流を有するように操作されたナノポアもまた提供される。

【0024】

本発明は、バイオポリマーセンシングおよび／またはバイオポリマー配列決定のための
、本明細書に開示されるシステムまたは本発明に従う変異体ＦｒａＣナノポアの使用もま
た提供する。例えば、前記バイオポリマーは、タンパク質、ペプチドまたは核酸である。
好ましくは、核酸、例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質もしく
はポリペプチド、あるいはそれらの組合せのセンシングおよび／あるいは配列決定のため
の、本明細書に開示されるシステムまたは本発明に従う変異体ＦｒａＣナノポアの使用が
提供される。

【0025】

例えば、ＦｒａＣナノポアは、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドバイオ
マーカーを認識するために有利に使用される。ナノポアの内側に入ると、異なるサイズの
タンパク質およびポリペプチドは、イオン電流によって識別され得る。個々のアミノ酸は
、移行の間にオンザフライで同定できなかったが、本発明者らは、トリプトファン残基１
個だけが異なる２つの小さい（折り畳まれていない）オリゴペプチドであるエンドセリン
１およびエンドセリン２（２．５ｋＤａ）が、イオン電流記録によって区別できることを
示した。したがって、ポリペプチドの移行が、例えば酵素の使用によって制御できる場合
、ＦｒａＣナノポアは、移行するポリペプチド中の特定の配列特色の同定を可能にする。

【0026】

一実施形態では、（変異体）ＦｒａＣナノポアは、単一分子プロテオミクス分析におい
てセンサーとして使用される。ナノポアプロテオミクスの最も単純な実行では、タンパク
質は、それらがナノポアを通して直線的に移行するとき、アミノ酸毎に認識される。生物
中のタンパク質およびオリゴペプチドの配列は、ゲノム分析から公知であるので、タンパ
ク質は、ナノポアを通過する折り畳まれていない移行の間の具体的なタンパク質遮断を、
公知のタンパク質遮断のデータベースと単純に比較することによって認識され得る。ある
いは、折り畳まれたタンパク質は、ナノポアを移行してまたは移行せずに、ナノポア前庭
の内側にそれらが留まるときに認識され得る。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ）およびＤ１０Ｒ－Ｋ１５９Ｅ ＦｒａＣ（ＲｅＦｒａＣ）ナノポア。（Ａ）クーロン力表面彩色（赤＝負の電荷、青＝正の電荷）を示すオクタマーＷｔＦｒａＣの断面図。ＷｔＦｒａＣのくびれゾーン中に位置するアスパラギン酸残基１０が示される。（Ｂ）ＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の上面図。（Ｃ）１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中＋５０ｍＶでのＷｔＦｒａＣ（青）およびＲｅＦｒａＣ（赤）の単一チャネルコンダクタンスヒストグラム。（Ｄ）同一の取得設定（２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレート）を用いて得た、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中＋１００ｍＶでのＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の生トレース。

【図2】ＲｅＦｒａＣを用いたＤＮＡ識別。（Ａ）ＲｅＦｒａＣを使用する、ＮＡと複合体を形成したホモポリマーＤＮＡ鎖の代表的遮断。模式図は、電流遮断の説明を示す。（Ｂ）ＲｅＦｒａＣナノポアを用いてＡ₂₀、Ｃ₂₀、Ｔ₂₀ホモポリマー鎖について得られた残留電流の代表的分布。（Ｃ）同じＲｅＦｒａＣポアへの、ホモポリマーＣ₂₀およびＡ₂₀ヌクレオチドによって誘導された連続的トレースの電流遮断。示されるトレースは、１００Ｈｚカットオフを用いてデジタルでフィルタリングした。（Ｄ）Ｃ₂₀およびＡ₂₀ホモポリマー鎖の混合物によって課された残留電流の分布。（Ｅ）ホモポリマーＣ₂₀およびＴ₂₀ヌクレオチドの混合物を分解するための実験の連続的トレース。（Ｆ）Ｃ₂₀およびＴ₂₀ホモポリマー鎖の混合物によって課された残留電流の分布。トレースを、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で記録した。トレースＣおよびＥを、さらなる１００Ｈｚガウスデジタルフィルタリングに供した。

【図3】ＲｅＦｒａＣによるｄｓＤＮＡのアンジッピング／移行。（Ａ）＋５０ｍＶでの、ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ複合体を捕捉するＲｅＦｒａＣの代表的トレース。開放ポア電流は、「１」として示され、比較のために、複合体の捕捉後が示される。２つのレベルをこのブロックにおいて観察できる：まず、ホモポリマーシトシンに対応する可能性が高い、より低いレベル（「２」）であって、これは、中間レベル（アンジッピング、角括弧）を介して、ホモポリマーアデニンに対応する可能性が最も高い、より高いレベル（「３」）へと変換する。電位の逆転の際（「４」）に、このブロックは即座に放出され、これは、二本鎖領域ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ複合体が剥がされたことを示す。（Ｂ）＋１００ｍＶでは、事例の半分よりも多くにおいて（挿入図）、単一のブロック（「２」）が、ｄｓＤＮＡ部分が押し通された後に観察され（変形、角括弧）、－３０ｍＶの印加の際に、このブロックは、即座には放出され得ない（「３」）。より高い負の電位では、このブロックは放出され得、これは、ロタキサンが形成されたことを示している（さらなる例は図８中）。トレースを、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で記録した。

【図4】ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣナノポアについて決定した単位チャネルコンダクタンス分布および電圧電流依存性。Ａ：平面状脂質二重層中で再構成したＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の事前オリゴマー化されたポアについて測定した単位チャネルコンダクタンス分布。コンダクタンスは、－５０ｍＶの印加電位において測定した。各個々のチャネルの配向を、コンダクタンスにおける非対称に従って検証した。Ｂ：ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣナノポアについて測定した電圧電流依存性。実験を３回反復し、エラーバーは、実験値間の標準偏差を示す。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および１Ｍ ＮａＣｌ中で実施した。

【図5】ＷｔＦｒａＣ、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣの溶血活性。溶血率を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５０ｍＭ ＮａＣｌ中１％のウマ赤血球懸濁物において観察された濁度（６５０ｎｍ波長における光学密度として測定される）における５０％の減少までの経過時間の逆数として計算した。タンパク質を２００ｎＭ濃度で添加し、溶血率はＷｔＦｒａＣの百分率として示される。実験を３回反復し、エラーバーは、実験値間の標準偏差を示す。

【図6】ＲｅＦｒａＣナノポアを用いて記録したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ ＤＮＡ基質の移行および固定化。Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ基質（トレースの上に示される）を、オリゴＩ（５’ビオチン化ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴ ＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ）およびオリゴＩＩ（ＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＡＣ）のアニーリングによって作製した。Ａ：１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ単独（左）および０．２５μＭのニュートラアビジンと複合体を形成したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ（右）によってＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発された遮断。基質は、＋５０ｍＶの印加電位下でシスに添加した。Ｂ：１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ単独（左）および０．２５μＭのニュートラアビジンと複合体を形成したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ（右）によってＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発された遮断。基質は、＋７０ｍＶでシスに添加した。遊離Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ遮断について検出された２つのレベルの残留電流は、薄紫の破線で示される。遮断されたポアおよび開放ポアに対応する電流レベルは、それぞれ、薄紫および灰色の破線として示される。電圧ステッピングプロトコールは、トレースの下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング周波数は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。

【図7】ＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発されたＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ－ニュートラアビジン遮断内の残留電流の段階的増強を示す代表的トレース。１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃおよび０．２５μＭのニュートラアビジンは、＋５０ｍＶでシスに存在した。遮断内で、残留電流は、８．８±０．７％（初期レベル）から１２．５±０．７％（最終レベル）へと切り替わった。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。

【図8】＋１００ｍＶの印加電位でＲｅＦｒａＣナノポア中に駆動されたＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ－ニュートラアビジンによるロタキサン形成を示すトレースのさらなる例。１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃおよび０．２５μＭのニュートラアビジンを、シスに添加した。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。ロタキサンを、印加電位を－４０ｍＶに切り替えることによって解体した。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。

【図9】ＲｅＦｒａＣナノポア内に固定化されたオリゴヌクレオチドＩ－ニュートラアビジンによる擬ロタキサンおよびロタキサン形成を示す代表的トレース。Ａ：シスに存在する１μＭのオリゴＩおよび０．２５μＭのニュートラアビジンによって誘発された擬ロタキサン形成。Ｂ：１μＭのオリゴヌクレオチドＩＩがトランスに添加された、シスに存在する１μＭのオリゴヌクレオチドＩおよび０．２５μＭのニュートラアビジンによるロタキサン形成。ロタキサンを、印加電位を－４０ｍＶに切り替えることによって解体した（トレースの上の赤い矢印は、ロタキサンの解体を示す）。ｄｓＤＮＡのアンジッピングを説明する一過的状態は、角括弧中に示される。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。

【図10】２つの異なるｐＨ条件で２つのＦｒａＣバリアントを用いたオリゴペプチド（エンドセリン１）およびタンパク質（キモトリプシン）の捕捉。ａ）野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ、ＰＤＢ：４ＴＳＹ）およびＤ１０Ｒ－Ｋ１５９Ｅ－ＦｒａＣ（ＲｅＦｒａＣ）の断面。ｂ～ｃ）ＷｔＦｒａＣ（左）およびＲｅＦｒａＣ（右）に対する、１μＭのエンドセリン１（ｂ）および２００ｎＭのキモトリプシン（ｃ）によって誘導された代表的トレース。キモトリプシン（ＰＤＢ：５ＣＨＡ）およびヒトエンドセリン１（ＰＤＢ：１ＥＤＮ）は、表面提示として示される。エンドセリン１およびキモトリプシンは、負の印加電位下ではＷｔＦｒａＣに進入するが、正の印加電位下ではＲｅＦｒａＣに進入する。ＷｔＦｒａＣへのキモトリプシン遮断は、ｐＨ７．５および４．５で－５０ｍＶ下でも観察されたが、十分な数の遮断を得るために、印加電位を－１００ｍＶまで増加させた。ｐＨ７．５では、正の印加バイアス下でのキモトリプシンによるＲｅＦｒａＣへの遮断は、負の印加バイアス下でのＷｔＦｒａＣへの遮断よりも、高い電位を必要とした。ｐＨ７．５の緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓを含み、ｐＨ４．５の緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基を含んだ。エンドセリン１およびキモトリプシンを、シス区画に添加した。全てのトレースを、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して記録した。彩色は、それぞれ負の電位および正の電位（範囲－４～＋４ｋｂＴ／ｅｃ）に対応する赤および青により、ＡＰＢＳ（１３）（１Ｍ ＫＣｌ中ｐＨ７．５）によって計算された分子表面の静電電位を示す。ＰｙＭＯＬを使用して構造をレンダリングした。

【図11】ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣの静電分布およびイオン選択性。ａ）モノマー平均したシミュレートされた静電電位は、それぞれ、ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａｃの負に荷電したくびれおよび正に荷電したくびれを明らかにする。ＲｅＦｒａｃについて、ｐＨを７．５から４．５に低下させることは、静電電位に対して小さい影響を有しただけであったが、ＷｔＦｒａＣについて、くびれの中心部におけるピーク値は、約４１％低下した。全てのシミュレーションは、１Ｍ ＫＣｌでＡＰＢＳ（１３）を使用して実施し、各滴定可能な残基の部分的電荷を、ＰＤＢ２ＰＱＲソフトウェアの改変バージョンを用いてそれらの平均プロトン化状態に従って調整した（１４）。残基のｐＫａ値を、ＰＲＯＰＫＡを使用して推定した（３３、３４）。ｂ）逆転電位の決定は、ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣが、それらのくびれにおける静電電位から予測されるように、それぞれカチオン選択的およびアニオン選択的であることを示している。ｐＨを７．５から４．５に低下させることは、シミュレートされた静電電位の低減された大きさに従って、ＷｔＦｒａＣのイオン選択性（Ｐ＿（Ｋ＾＋）／Ｐ＿（［Ｃｌ］＾－））を約４３％低減させた。対照的に、ｐＨ４．５におけるＲｅＦｒａＣのイオン選択性における約３７％の増加は、シミュレーションによって予測されなかった。全ての逆転電位を、非対称な塩条件（トランスでは４６７ｍＭ ＫＣｌ、シスでは１９６０ｍＭ ＫＣｌ）下で測定し、イオン選択性を、Ｇｏｌｄｍａｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ－Ｋａｔｚ方程式を使用して決定した。詳細な実験手順は、サポート情報中で与えられる。全ての電流－電圧曲線の背後の外被は、そのそれぞれの標準偏差を示す。

【図12】ｐＨ４．５でＷｔＦｒａＣを用いたバイオマーカーの特徴付け。ａ）上から下に：キモトリプシン（２５ｋＤ、ＰＤＢ：５ＣＨＡ）の分子表面および模式図提示（Ｐｙｍｏｌ）を伴った表面提示、－１５０ｍＶの印加電位下で得られた代表的トレース、－１５０ｍＶでのＩｒｅｓ％に対する滞留時間分布を示すヒートプロット、Ｉｒｅｓ％の電圧依存性、滞留時間の電圧依存性、および捕捉頻度。ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）はそれぞれ、β２－ミクログロブリン（１１．６ｋＤ、ＰＤＢ：１ＬＤＳ）、ヒトＥＧＦ（６．２ｋＤ、ＰＤＢ：１ＪＬ９）、エンドセリン１（２．５ｋＤ、ＰＤＢ：１ＥＤＮ）およびアンジオテンシンＩ（１．３ｋＤ）についての同じ情報を示す。アンジオテンシンＩは、Ｐｙｍｏｌを用いて引き出したランダム構造として示される。バイオマーカーの濃度は以下のとおりであった：それぞれ、キモトリプシンについて２００ｎＭ、β２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ）について２００ｎＭ、ヒトＥＧＦについて２μＭ、エンドセリン１について１μＭ、アンジオテンシンＩについて２μＭ。バイオマーカーの等電点は、文献から、またはオンライン計算ツールＰｅｐｃａｌｃを用いて得られる。エラーバーは、少なくとも３回の反復および各反復について少なくとも３００の事象から得られた標準偏差を示す。データを、Ｂ－スプライン関数（Ｏｒｉｇｉｎ ８．１）を使用してフィットさせた。全ての記録を、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを用いて収集した。

【図13】ｐＨ４．５においてＷｔＦｒａＣを用いたエンドセリン１および２の識別。ａ）静電彩色（ＰｙＭＯＬ）を使用したエンドセリン１およびエンドセリン２の分子表面提示。ｂ）上：エンドセリン１および２のアミノ酸配列。青線は、各オリゴペプチド中のジスルフィド架橋を示す。下：ｐＨ４．５緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基）中－５０ｍＶでのエンドセリン１およびエンドセリン２遮断についてのＩｒｅｓ％および滞留時間。ｃ）－５０ｍＶの印加電位下での同じＦｒａＣナノポアへの代表的エンドセリン１およびエンドセリン２遮断。ｄ）２μＭのエンドセリン１によって誘発された残留電流のヒストグラム（左）、およびＩｒｅｓ％に対する電流振幅の標準偏差を示す対応するヒートプロット（右）。ｅ）第２の集団を明らかにする同じポアへの８μＭのエンドセリン２の添加後ではあるが、（ｄ）と同じ。グラフは、カスタムＲスクリプトを用いて創出した。全ての記録を、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚ Ｂｅｓｓｅｌローパスフィルターを用いて実施した。

【発明を実施するための形態】

【0028】

実験セクション
セクションＡ
材料および方法
特記しない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＮ
Ａは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し
た。酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓから、脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓか
ら取得した。本研究における全ての誤差は、標準偏差として与えられる。

【0029】

ＦｒａＣクローニング
クローニングを可能にするために、Ｎｃｏ Ｉ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）を、Ａ．ｆｒ
ａｇａｃｅａ由来の成熟ＷｔＦｒａＣに対応するＤＮＡ配列の開始部（５’末端）におい
て導入した。リーディングフレームを維持するために、さらに２つの塩基をＮｃｏ Ｉ部
位の後ろに挿入し、開始メチオニンの後のさらなるアラニン残基を生じさせた。精製目的
のために、ＦｒａＣのＣ末端で、Ｈｉｓ９親和性タグを、可撓性グリシン－セリン－アラ
ニンリンカーを介して結合させ、オープンリーディングフレームを、２つの連続する停止
コドンとその後のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位（３’末端）によって終結させた。最適化さ
れたコドン組成を有する合成遺伝子（ＩＤＴ）５０ｎｇが、以下のＰＣＲ反応のための鋳
型として機能した：遺伝子を、３００μＬ体積中６μＭのプライマーＦｒｆおよびＦｒｒ
（表２）を使用して、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ
ｉｎｎｚｙｍｅｓ）によって増幅した。ＰＣＲプロトコールは以下のとおりであった：９
８℃で３０秒間の事前インキュベーションステップの後には、３０サイクルの９８℃で５
秒間の変性および７２℃で１分間の伸長が続いた。Ｈｉ９タグ化ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含
む得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＦａｓｔＤｉ
ｇｅｓｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて消化した。ゲル精製された挿入物（ＱＩＡｑｕ
ｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を、Ｎｃｏ Ｉ（５’
）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（３’）部位を介した粘着末端ライゲーション（Ｔ４リガーゼ
、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してｐＴ７－ＳＣ１発現プラスミド中にＴ７プロモーター
の制御下でクローニングした。ライゲーション混合物のうち０．６μＬを、５０μＬのＥ
．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーション
によって形質転換した。形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ
寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた。クローンの正体を、配列決定によって確認し
た。

【0030】

１０Ｒ ＦｒａＣの構築
ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミドのうち１００ｎｇが、ＰＣＲ反応
のための鋳型として機能した：この遺伝子を、３００μＬ体積中６μＭのプライマー１０
Ｒｆ（Ｄ１０Ｒをコードする）およびＴ７ターミネーター（表２）を使用してＰｈｉｒｅ
Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）によって増幅
した。ＰＣＲ反応サイクリングプロトコールは以下のとおりであった：９８℃で３０秒間
の事前インキュベーションステップの後には、３０サイクルの９８℃で５秒間の変性およ
び７２℃で１分間の伸長が続いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順^[1]によって
ｐＴ７発現プラスミド（ｐＴ７－ＳＣ１）中にクローニングした：約５００ｎｇの精製さ
れたＰＣＲ産物を、ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミド約３００ｎｇと
混合し、増幅を、５０μＬの最終体積中でＰｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した（９８℃で３０秒間の事前イン
キュベーション、次いで、３０サイクルの９８℃で５秒間の変性、７２℃で１．５分間の
伸長）。環状鋳型を、Ｄｐｎ Ｉ（１ＦＤＵ）との３７℃で２時間のインキュベーション
によって排除した。得られた混合物のうち０．６μＬを、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１
０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。形質
転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天プレート上で３７℃
で一晩増殖させた。クローンの正体を、配列決定によって確認した。

【0031】

エラープローンＰＣＲによる１０Ｒ ＦｒａＣライブラリーの構築
Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマー（表２）を使用してプラスミド
ＤＮＡからＤ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子を増幅することによって、ライブラリーを構築した
。

【0032】

【表1】

表２． 本研究で使用したオリゴヌクレオチド。「５Ｂｉｏｓｇ」は、Ｃ６リンカー（Ｉ
ＤＴ）を介してＤＮＡの５’末端にコンジュゲートされたビオチン基を示す。

【0033】

第１ラウンドの変異誘発において、本発明者らは、１０Ｒ ＦｒａＣをコードする合成
遺伝子を含むプラスミドを、鋳型として使用した。第２の変異誘発ラウンドにおいて、本
発明者らは、第１ラウンドのスクリーニングにおいて同定された最も高い活性を有するク
ローン由来のＤＮＡプラスミドのプールを使用した。ＤＮＡ増幅を、エラープローンＰＣ
Ｒによって実施した：４００μＬのＰＣＲミックス（２００μｌのＲＥＤＴａｑ Ｒｅａ
ｄｙＭｉｘ、６μＭのＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマー、約４００
ｎｇのプラスミド鋳型）を、０～０．２ｍＭのＭｎＣｌ₂を含む８つの反応体積に分割し
、２７回サイクリングした（９５℃で３分間の事前インキュベーション、次いでサイクリ
ング：９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸
長）。これらの条件は、典型的には、最終ライブラリー中に１遺伝子当たり１～４個の変
異を生じた。ＰＣＲ産物を一緒にプールし、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順によってｐＴ７発
現プラスミド（ｐＴ７－ＳＣ１）中にクローニングした：約５００ｎｇの精製されたＰＣ
Ｒ産物を、１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミド約３００ｎｇと混合
し、増幅を、５０μＬの最終体積中でＰｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した（９８℃で３０秒間の事前インキュ
ベーション、その後３０サイクル：９８℃で５秒間の変性、７２℃で１．５分間の伸長）
。環状鋳型を、Ｄｐｎ Ｉ（１ＦＤＵ）との３７℃で２時間のインキュベーションによっ
て排除した。得られた混合物のうち０．６μＬを、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細
胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換さ
れた細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖
させると、典型的には＞１０⁵コロニーが得られ、これを、プラスミドＤＮＡライブラリ
ー調製のために収集した。

【0034】

ＦｒａＣ過剰発現後の粗製溶解物における溶血活性についてのスクリーニング
６００のクローン（上記を参照）由来の一晩スターター培養物を、新しい９６深ウェル
プレート中で４５０μＬの新鮮な培地中に接種し、培養物を、約０．８のＯＤ６００まで
３７℃で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加して過剰発現を誘導し、温
度を一晩インキュベーションのために２５℃に低減させた。次の日に、４℃で３０００×
ｇで１５分間の遠心分離によって細菌を収集した。上清を廃棄し、ペレットを－８０℃で
２時間凍結して、細胞破壊を促進した。次いで、細胞ペレットを、０．４ｍＬの溶解緩衝
液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌリ
ゾチーム、０．２単位／ｍＬ ＤＮＡｓｅ Ｉ）中で再懸濁し、３７℃で１３００ＲＰＭ
で３０分間振盪することによって溶解させた。次いで、粗製溶解物のうち０．５～５μＬ
を、１００μＬの約１％ウマ赤血球懸濁物に添加した。後者を、ウマ血液（ｂｉｏＭｅｒ
ｉｅｕｘ Ｂｅｎｅｌｕｘ）を４℃で６０００×ｇで５分間遠心分離し、１５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でペレットを再懸濁することによっ
て調製した。上清が赤色を呈した場合、この溶液を再度遠心分離し、ペレットを同じ緩衝
液中で再懸濁した。溶血活性を、経時的な６５０ｎｍでのＯＤにおける減少によってモニ
タリングした（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。

【0035】

ＦｒａＣ中のＤ１０Ｒアミノ酸置換の有害効果を代償する変異についてのスクリーニン
グ
Ｄ１０Ｒアミノ酸置換は、ＦｒａＣの溶血活性における約５分の１の減少を生じた（図
５）。Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣは、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコ
リン（ＤＰｈＰＣ）で作製された平面状二重層中でオリゴマー化および再構成されること
がなおも可能であったが、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣの溶血活性をＷｔＦｒａＣ
レベルに戻して回復させる代償性変異について探索した。ＦｒａＣの溶血活性を維持する
ことは、２つの理由のために重要である：まず、これは、標的化された脂質二重層上でオ
リゴマーポアへとアセンブルする能力を反映し、したがって、オリゴマーナノポアのより
効率的な調製につながり得る。他方で、溶血活性は、任意のアミノ酸配列変化を有するバ
リアントの機能性をスクリーニングするための簡便な方法を提供し、したがって、Ｆｒａ
Ｃナノポアに対する将来的な操作の試みを促進するであろう。代償性変異を同定するため
に、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子に基づいてランダム変異誘発ライブラリー
を構築し、それをＢｌ２１ ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、参照としてＷｔＦｒ
ａＣを使用して、過剰発現後の粗製溶解物におけるウマ赤血球に対する溶血活性について
、個々のバリアントをスクリーニングした。第１ラウンドにおいて、本発明者らは、６０
０のバリアントをスクリーニングし、溶血活性スクリーニングと組み合わせた第２ラウン
ドのランダム変異誘発のための鋳型として１２のクローンを選択した。次いで、最も高い
レベルの溶血活性を有する７つのクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。対応
する遺伝子中に生じた配列変化を表３にまとめる。

【0036】

【表2】

表３．ＦｒａＣ中のＤ１０Ｒ変異の有害効果を代償する配列変化

【0037】

精製されたバリアントを、スフィンゴミエリン：ＤＰｈＰＣ（１：１）リポソームにお
いてオリゴマー化し、０．６％ＬＤＡＯ中に可溶化した。Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィ
ーによって界面活性剤を０．０２％ＤＤＭに交換した後、オリゴマータンパク質を、ＤＰ
ｈＰＣから構成される平面状脂質二重層中でのポア形成活性について試験した。最初に、
本発明者らは、最も有望なポア形成体として、３、４およびＲｅＦｒａＣと称するバリア
ント（表３）を同定した。しかし、バリアント３によって作製されたナノポアは不均一で
あり（５０％未満がオクタマーポアを生じた）、バリアント４のポア形成活性は、４℃で
貯蔵した場合には数日内に減衰していた。オリゴマーＲｅＦｒａＣは、４℃で貯蔵した場
合には数か月間にわたってポア形成活性を維持し、ｓｓＤＮＡを捕捉することができるま
まで、ＷｔＦｒａＣとほぼ同様に均一なナノポアを形成した。したがって、本発明者らは
、本研究におけるさらなるＤＮＡ分析のためにＲｅＦｒａＣを選んだ。さらに、本発明者
らは、ＲｅＦｒａＣ中のアスパラギン酸１０をアスパラギンで置き換えてＤ１０Ｎ Ｋ１
５９Ｅバリアントを得たが、ｓｓＤＮＡ進入は検出できなかった。

【0038】

ＷｔＦｒａＣ（タンパク質配列）
ＭＡＳＡＤＶＡＧＡＶＩＤＧＡＧＬＧＦＤＶＬＫＴＶＬＥＡＬＧＮＶＫＲＫＩＡＶＧＩＤ
ＮＥＳＧＫＴＷＴＡＭＮＴＹＦＲＳＧＴＳＤＩＶＬＰＨＫＶＡＨＧＫＡＬＬＹＮＧＱＫＮ
ＲＧＰＶＡＴＧＶＶＧＶＩＡＹＳＭＳＤＧＮＴＬＡＶＬＦＳＶＰＹＤＹＮＷＹＳＮＷＷＮ
ＶＲＶＹＫＧＱＫＲＡＤＱＲＭＹＥＥＬＹＹＨＲＳＰＦＲＧＤＮＧＷＨＳＲＧＬＧＹＧＬ
ＫＳＲＧＦＭＮＳＳＧＨＡＩＬＥＩＨＶＴＫＡＧＳＡＨＨＨＨＨＨ＊＊
ＷｔＦｒａＣ（ＤＮＡ配列）
ＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＴＧ
ＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣ
ＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴ
ＡＡＣＧＡＡＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴ
ＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＡＧＧＴ
ＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴ
ＣＧＣＧＧＴＣＣＴＧＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴ
ＡＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣ
ＣＧＴＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣ
ＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＧＣＡ
ＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧ
ＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＡＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＣ
ＡＡＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＡＴＣＣ
ＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ

【0039】

ＦｒａＣの過剰発現および精製
Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＦｒａＣ遺
伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミドで形質転換した。形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌの
アンピシリンを補充したＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得
られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（Ｓｉｇｍａ）中
に接種した。培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、約０．８のＯＤ₆₀₀に達するまで
、３７℃で増殖させた。次いで、ＦｒａＣの発現を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によっ
て誘導し、増殖を２５℃で継続した。次の日に、細菌を、６０００×ｇで２５分間の遠心
分離によって収集し、ペレットを－８０℃で貯蔵した。モノマーＦｒａＣを含むペレット
（５０～１００ｍｌの細菌培養物に由来する）を解凍し、４０ｍｌの１５ｍＭ Ｔｒｉｓ
．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０５単位／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ
（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中で再懸濁した。次いで、細胞破壊を開始するために、細菌懸濁
物に０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび２Ｍ尿素（デブリの形成を防止するため）を補充
し、それを、周囲温度で４０分間にわたる精力的な振盪に供した。残存細菌を、プローブ
超音波処理によって破壊した。粗製溶解物を、６０００×ｇで２０分間の遠心分離によっ
て清澄化し、上清を、洗浄緩衝液（１０ｍＭイミダゾール １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５
ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５）で事前平衡化した２００μＬ（ビーズ体積）のＮ
ｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。周囲温度での１時間の穏やかな混合後、樹
脂をカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、約５ｍｌ
の洗浄緩衝液で洗浄した。ＦｒａＣを、３００ｍＭイミダゾールを含む洗浄緩衝液およそ
約０．５ｍＬで溶出した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定し
た。ＦｒａＣモノマーを、さらなる使用まで４℃で貯蔵した。

【0040】

溶血活性アッセイ
脱線維素ウマ血液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｂｅｎｅｌｕｘ）を、上清が透明になるま
で１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５で洗浄した。次いで
、赤血球を、同じ緩衝液で約１％の濃度（０．６～０．８のＯＤ ６５０ｎｍ）になるよ
うに再懸濁した。次いで、懸濁物を、２００ｎＭのＦｒａＣと混合した。溶血活性を、Ｍ
ｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅ
ｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＯＤ６５０における減少をモニ
タリングすることによって測定した。溶血率を、濁度における５０％の減少までの経過時
間にわたって一体として決定した。

【0041】

スフィンゴミエリン：ＤＰｈＰＣリポソームの調製
２０ｍｇのスフィンゴミエリン（脳、ブタ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ
）およびＤＰｈＰＣ（１：１）混合物を、０．５％エタノール（スフィンゴミエリンの溶
解を補助するため）を補充したペンタン４ｍｌ中に溶解し、丸底フラスコ中に配置した。
溶媒を、壁上に脂質フィルムを沈着させるために、フラスコを緩徐に回転させながら蒸発
させた。脂質フィルムの沈着後に、フラスコを３０分間にわたって開けたままにして、溶
媒を完全に蒸発させた。次いで、脂質フィルムを、超音波処理槽（周囲温度で５～１０分
間）を使用して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５（総
脂質の最終濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。得られたリポソームを－２０℃で貯
蔵した。

【0042】

ＦｒａＣのオリゴマー化
モノマーＦｒａＣを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．
５緩衝液中でリポソーム（脂質／タンパク質質量比は１０：１）と混合した。混合物を、
短時間超音波処理し（超音波処理槽）、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、
プロテオリポソームを０．６％ＬＤＡＯで可溶化し、５分間インキュベートし、混合物を
、ＤＤＭ含有洗浄緩衝液（０．０２％ＤＤＭ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５）で２０倍希釈し、ＤＤＭ含有洗浄緩衝液で事前平衡化した約１
００μｌ（ビーズ体積）のＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。１
時間穏やかに混合した後、樹脂をカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ－Ｒａ
ｄ）上にロードし、約２ｍｌのＤＤＭ洗浄緩衝液で洗浄した。ＦｒａＣを、５０μｌの溶
出緩衝液（２００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＤＤＭ、ｐＨ８－あるいは、本発明者らは
１Ｍイミダゾール ０．０２％ＤＤＭを使用することもあり得たが、ＥＤＴＡがより効率
的であることが証明された）によってカラムから溶出させた。精製されたＦｒａＣオリゴ
マーを４℃で貯蔵した。

【0043】

あるいは、ＦｒａＣオリゴマーは、ＦｒａＣモノマーを、スフィンゴミエリン単独によ
って形成されたリポソームと混合する（３７℃で１時間、次いで、４℃で一晩）ことによ
って形成され得る。次の日に、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＤＤＭ（最終）をプロテオリ
ポソームに添加し、室温で１５分間インキュベートする。次いで、溶液を、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．０５％ＤＤＭ １５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ７．５ １５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む１ｍｌ体積になるまで希釈する。次いで、溶液を、１００ｋＤａカットオフ限外濾
過デバイスを用いて約１００ｕｌまで濃縮する。

【0044】

平面状脂質二重層における電気的記録
印加電位とは、トランス電極の電位を指す。ＦｒａＣナノポアを、接地電極に接続した
シス区画から、脂質二重層中に挿入した。２つの区画を、直径約１００μｍのオリフィス
を含む２５μｍ厚のポリテトラフルオロエチレンフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって分離した。開口部を、ペンタン中１０％のヘ
キサデカン約５μｌで事前処理し、二重層を、両方の電気生理学チャンバーへのペンタン
中の１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）（１０
ｍｇ／ｍＬ）約１０μＬの添加によって形成した。典型的には、シス区画（０．５ｍＬ）
への０．０１～１０ｎｇのオリゴマーＦｒａＣの添加が、単一のチャネルを得るために十
分であった。ＷｔＦｒａＣナノポアは、負の印加電位よりも正の印加電位において、より
高い開放ポア電流を示し、ポアの配向を決定するための有用なツールを提供した。電気的
記録を、１Ｍ（ＦｒａＣナノポアの初期特徴付け）および３ＭのＮａＣｌ（振幅を増幅す
るためのポリヌクレオチド分析のため）、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中で
実施した。

【0045】

データの記録および分析
平面状二重層記録からの電気的シグナルを、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂパッチクラン
プ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して増幅し、Ｄｉｇｉｄａｔａ
１４４０ Ａ／Ｄ変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデジタル化した
。データを、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．４ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ）を使用することによって記録し、引き続く分析を、Ｃｌａｍｐｆｉｔソフトウェア
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施した。電気的記録を、２ｋＨｚロ
ーパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを適用することによ
って取得した。レベル０からレベル１への電流遷移を、Ｃｌａｍｐｆｉｔ中の「単一チャ
ネルサーチ」機能を用いて分析した。残留電流値（Ｉ_res）を、遮断されたポア電流値（
Ｉ_B）および開放ポア電流値（Ｉ_O）から、Ｉ_res＝１００^*Ｉ_B／Ｉ_Oとして計算した。Ｉ_B
およびＩ_Oを、事象の振幅ヒストグラムへのガウシアンフィッティングから決定した。段
階的電流増強を示す事象の場合、残留電流レベルを、ホールポイント電流ヒストグラムへ
のガウシアンフィッティングから計算した。事象寿命を決定するために、事象滞留時間（
ｔ_off）を、累積分布として一緒にビニングし、単一指数関数にフィットさせた。段階的
電流増強（図３Ａ）およびロタキサン形成性遮断を示す事象の頻度を、手動で計算した。
グラフは、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＣｌａ
ｍｐｆｉｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて作成した。

【0046】

ＦｒａＣナノポアのグラフィック提示
分子グラフィックスを、Ｃｈｉｍｅｒａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．
ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ）を用いて実施した。

【実施例0047】

平面状脂質二重層中での野生型ＦｒａＣポアの再構成
Ｃ末端でＨｉ９タグに遺伝学的に融合させた組換え野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ、図
１Ａ；１Ｂ、上）タンパク質モノマーを、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株において発
現させた。以前の研究は、アクチノポリンのポアアセンブリが、脂質二重層中のＳＭの存
在によって誘発されることを確立している［９］、［１０］、［１１］、［８］。一致し
て、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製されたＷｔＦｒａＣの水溶性モノマー
は、ＤＰｈＰＣ平面状脂質二重層中ではポアを形成しなかった。したがって、本発明者ら
は、モノマーをＤＰｈＰＣ：ＳＭ（１：１）リポソームを用いて事前オリゴマー化した。
０．６％Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）中でのリポソームの
可溶化後、オリゴマーの解離を防止するために［１２］、ＬＤＡＯを、第２ラウンドのＮ
ｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー（ＳＩ）によって０．０２％β－ドデシルマルトシド（Ｄ
ＤＭ）に交換した。ＤＰｈＰＣ平面状脂質二重層のシス側への、０．０２％ＤＤＭ中のオ
リゴマーＷｔＦｒａＣの精製されたマイクログラムに満たない量の添加は、容易にポアを
生じた。１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液におけるＷｔ
ＦｒａＣポアについての単位チャネルコンダクタンスの分布は、最近決定された結晶構造
において観察されたオクタマーにおそらくは対応する、単一のコンダクタンス型（図１Ｃ
；４Ａ、上）を主に明らかにした［８］。他の生物学的ナノポアと同様に、ＷｔＦｒａＣ
チャネルは、ポアの配向の決定を可能にする、非対称な電流－電圧（Ｉ－Ｖ）関係（図４
Ｂ）を示した。３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中で得
られた例示的トレースは、図１Ｄ、上に示される。

【実施例0048】

核酸分析のためのＷｔＦｒａＣの操作
オクタマーＷｔＦｒａＣの結晶構造は、このナノポアが、ｓｓＤＮＡの貫通を可能にす
るのに十分に大きい（くびれ直径１．２ｎｍ）ことを示唆している［８］。しかし、本発
明者らの最初の実験では、本発明者らは、ｓｓＤＮＡ遮断を観察できず、これは、ＷｔＦ
ｒａＣポアの負に荷電したくびれ領域がＤＮＡ移行を防止したことに起因する可能性が最
も高い［１３］、［１４］。ＦｒａＣを通したｓｓＤＮＡの貫通を誘導するために、本発
明者らは、アスパラギン酸１０をアルギニンで置換して、正に荷電したくびれを有するナ
ノポアを産生した（図１Ｂ、下）。Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣは低いポア形成活性を示したので
（図５）、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子の背景に対してランダム変異誘発を
実施し、得られたバリアントの溶血活性をスクリーニングした（ＳＩ）。結果として、本
発明者らは、広い前庭の外側縁に位置するリジン１５９からグルタミン酸への代償性変異
（Ｋ１５９Ｅ）を同定した（図１Ａ）。ＦｒａＣの二重変異体Ｄ１０Ｒ，Ｋ１５９Ｅ（Ｒ
ｅＦｒａＣ）は、ＷｔＦｒａＣと比較して変更されたＩ－Ｖ関係を有するにもかかわらず
（図４Ｂおよび図１Ｄ、下）、ほぼ野生型レベルの溶血活性を示し（図５）、均一なポア
を生じた（図１Ｃ）。１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中で±
５０ｍＶでのＲｅＦｒａＣポアのより低いコンダクタンスは、アルギニンがアスパラギン
酸よりも嵩高い側鎖を有するので、より狭いくびれに帰せられ得る（図１Ｂ）。