特開 2024-105681 筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼの発現を抑制および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉するための組換えウイルス産物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024105681

(43)【公開日】2024-08-06

(54)【発明の名称】筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼの発現を抑制および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉するための組換えウイルス産物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240730BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240730BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240730BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240730BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240730BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240730BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240730BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/113 130Z

A61P21/04

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

C12N15/86 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024083610

(22)【出願日】2024-05-22

(62)【分割の表示】P 2021509821の分割

【原出願日】2019-08-22

(31)【優先権主張番号】62/721,105

(32)【優先日】2018-08-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス セバスティアン ウェイン

(72)【発明者】

【氏名】スコット クエントン ハーパー

(72)【発明者】

【氏名】ケリー リード クラーク

(57)【要約】

【課題】筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼの発現を抑制および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉するための組換えウイルス産物および方法の提供。
【解決手段】本開示は、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の発現を抑制するための、ＲＮＡ干渉に基づく方法に関する。本開示の組換えアデノ随伴ウイルスは、ＤＭＰＫの発現をノックダウンまたはＩ型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）に関連するＣＴＧリピートの発現に干渉する、抑制ＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。この方法は、ＤＭ１、および異常ＤＭＰＫ発現に関連する他の障害を含む、筋強直性ジストロフィーの処置における適用を有する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の発現を抑制ならびに／または筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧトリヌクレオチドリピートのリピート伸長に干渉するための、ＲＮＡ干渉に基づく産物および方法に関する。本開示の組換えアデノ随伴ウイルスは、ＤＭＰＫの発現をノックダウンするか、またはＣＴＧリピート伸長に干渉する非コードＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。該方法は、筋ジストロフィー、特に筋強直性ジストロフィーの処置にて適用される。

【0002】

配列表の一部としての援用
本出願は、本開示の独立部分として、コンピュータ読み取り可能な形態（ファイル名：５３３１７Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、４８，０１８バイト、２０１９年８月２１日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含む。これは、本明細書の一部を構成するものとして、本明細書全体の内容を援用する。

【背景技術】

【0003】

筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）は、筋強直症、筋肉機能不全および稀にではあるが心臓伝導障害によって特徴づけられている。主要な型として２つの型が存在している。Ｉ型（ＤＭ１）は、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子における変異によって引き起こされ、ＩＩ型（ＤＭ２）は、ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質（ＣＮＢＰ）遺伝子における変異によって引き起こされる。患者とその家族は、筋肉、心臓に悪影響を及ぼすこうした疾患と、神経系が原因の認知障害により極度に影響を受ける。現状、これらの深刻な障害の両方にとって利用可能な治療的処置は存在しておらず、患者には症状管理といった選択のみが残されている。

【0004】

ＤＭ１は、成人発症の筋ジストロフィーのうち、最もありふれた形態の１つである。ＤＭ１は、骨格筋、心臓、脳、皮膚、眼および内分泌系に悪影響を及ぼす。筋強直性ジストロフィーの有病率は、８，０００人に１人であると推測されているが、フィンランドおよび他のヨーロッパ諸国では更に高い有病率が報告されている。

【0005】

ＤＭ１は、少なくともいくつかの例では、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域にＣＴＧヌクレオチドリピートが存在することで引き起こされる。こうした毒性リピートは、これらが他のタンパク質を捕捉する核内で処理および蓄積される。これによりタンパク質は正常に働くことができなくなり、観察される疾患症状を引き起こす。ＤＭ１を含むＤＭの処置、ならびに処置のための新規手段を試験するための産物および方法に関して、当該技術分野における必要が未だ存在している。

【0006】

ＤＭ１向けのマウスモデルはほとんど利用することができないため、こうしたモデルはＤＭ１疾患の全特徴を再現できていない。この点がＤＭ１の研究分野における負担であり、これが見込みのある治療用の新規薬物の試験を複雑にしている。ＤＭ１向けの処置およびＤＭ１を処置するための新規方法を試験するためのモデルに関して、当該技術分野における需要が未だ存在している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

Ｉ型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）を処置する必要がある対象において、これを処置するための産物および方法が本明細書では提供される。本開示は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域における、毒性リピートとしても既知であるＣＴＧヌクレオチドリピートを含む、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の発現を予防または抑制するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を基にした産物および方法を提供する。この方法は、対象の細胞にＤＭＰＫ遺伝子に特異的な抑制ＲＮＡを送達することに関連する。いくつかの態様では、この方法はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用い、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡまたはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧリピートを標的とする、抑制ＲＮＡを送達する。本開示のＤＭＰＫ抑制ＲＮＡには、ＤＭＰＫの発現を抑制する、アンチセンスＲＮＡ、スモール抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡもしくはＵ－ＲＮＡ）、または人工マイクロＲＮＡ（ＤＭＰＫ ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これに限定されない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

いくつかの態様では、本開示は、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモータ（以降、「ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡヌクレオチド」）またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモータ（以降、「ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡヌクレオチド」）に操作可能に結合された、ＤＭＰＫ遺伝子（例えば、３’非翻訳領域にＣＴＧリピート伸長を含むＤＭＰＫ遺伝子）の発現を減少させる抑制ＲＮＡを含む核酸を含む。これらの態様のいくつかの実施形態では、ＤＭＰＫ遺伝子の発現を減少させる抑制ＲＮＡは、とりわけｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。

【0009】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号：３～１９のいずれか１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む、ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

【0010】

いくつかの態様では、本開示は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のうち１つに明記された配列またはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む、ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様では、本開示は、Ｕ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のうち１つに明記された配列またはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む、ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

【0011】

本開示は、（ａ）配列番号：３～１９のうち１つに明記された配列もしくはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列もしくはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：２５～３６のうち１つに明記された配列もしくはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：３７～４８のうち１つに明記された配列もしくはそれらの相補性配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：３７～４８のうち１つに明記された配列に結合されたＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：４９～６０のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡ逆相補配列；（ｇ）配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＲＮＡをコードする逆相補配列；ならびに／または（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および／もしくは（ｇ）のうちいずれか１つもしくは複数の組合せを含む核酸を提供する。

【0012】

本開示は、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ
Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、または配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびに／または配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列との組合せを含む、核酸を提供する。

【0013】

本開示は、本明細書に記載の核酸のいずれかを含むウイルスベクターを追加的に提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルス（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、もしくはシュードタイプウイルス、および／もしくは異種タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、もしくは低分子を含むウイルス）である。

【0014】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわちＡＡＶ１末端逆位配列（ＩＴＲ）およびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわちＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわちＡＡＶ３ＩＴＲおよびＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわちＡＡＶ４ＩＴＲおよびＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわちＡＡＶ５ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわちＡＡＶ６ＩＴＲおよびＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわちＡＡＶ７ＩＴＲおよびＡＡＶ７カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわちＡＡＶ８ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわちＡＡＶ９ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１０（すなわちＡＡＶ１０ＩＴＲおよびＡＡＶ１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわちＡＡＶ１１ＩＴＲおよびＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわちＡＡＶ１２ＩＴＲおよびＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（すなわちＡＡＶ１３ＩＴＲおよびＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわちＡＡＶｒｈ７４ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわちＡＡＶｒｈ．８ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、またはＡＡＶｒｈ．１０（すなわちＡＡＶｒｈ．１０ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）などのＡＡＶである。

【0015】

いくつかの態様では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶ、ｒＡＡＶ、またはｓｃＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、またはＡＡＶｒｈ．１０である。

【0016】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つのＡＡＶ血清型由来のＩＴＲおよび異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含むシュードタイプＡＡＶである。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／９である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／８である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／１である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８もしくはＡＡＶｒｈ．１０由来の１つまたは複数のカプシドタンパク質のキメラを含むカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは組換え線形ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、または組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

【0019】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む抑制ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および／またはＵ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含むＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、ウイルスベクター（例えばＡＡＶなどの本明細書に記載のウイルスベクター）を提供する。

【0020】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、または配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびに／または配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列との組合せを含む核酸を含む、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶなどの、本明細書に記載のウイルスベクター）を提供する。

【0021】

いくつかの実施形態では、本開示は本明細書に記載のような任意のアデノ随伴ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物を提供する。

【0022】

本開示はまた、細胞において、ＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制ならびに／またはＤＭＰＫ遺伝子の発現に干渉もしくは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）に干渉する方法を提供し、この方法は、細胞と、本明細書に記載されるような核酸のいずれかを含む本明細書に記載のＡＡＶベクターといったウイルスベクターとを接触させることを含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）は、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、または配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびに／または配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列との組合せを含む、核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む抑制ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸、および／またはＵ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含むＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の核酸を含む。

【0023】

本開示は、本明細書に記載の、ＤＭＰＫを標的とする干渉ＲＮＡをコードする核酸を含む、有効量のウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）を、対象に投与することを含む、筋強直性ジストロフィーを患っている対象を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）は、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、または配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびに／または配列番号：２５～３６および配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列との少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列との組合せを含む、核酸を含む。いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む抑制ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸、および／またはＵ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含むＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の核酸を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、本開示は、必要がある対象において筋強直性ジストロフィーを処置する方法を提供し、対象に、本明細書に記載のＤＭＰＫを標的とする干渉ＲＮＡをコードする核酸を含む有効量のウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）を投与する工程を含み、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）のゲノムは、（１）ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５の発現を抑制；（２）ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制；および／または（３）ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）またはＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５に干渉するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド、またはその組合せを含む。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２０～２４のいずれか１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでいる。いくつかの態様では、Ｕ７ｓＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２５～３６および６１～７２のいずれか１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでいる。いくつかの態様では、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む抑制ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸、および／またはＵ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含むＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の核酸を含む。

【0025】

本開示は、必要がある対象において筋強直性ジストロフィーを処置する方法を提供し、対象に有効量のウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）を投与する工程を含み、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）のゲノムは、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）の発現もしくはＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２０～２４のいずれか１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでいる。

【0026】

本開示は、必要がある対象において筋強直性ジストロフィーを処置する方法を提供し、対象に有効量のウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）を投与する工程を含み、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）のゲノムは、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧｅｘｐ）の発現もしくはＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２５～３６および６１～７２のいずれか１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含んでいる。

【0027】

本開示は、必要がある対象において筋強直性ジストロフィーを処置する方法を提供し、対象に有効量のウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）を投与する工程を含み、ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）のゲノムは、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化されたＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化されたＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸、および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧｅｘｐ）もしくはＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化されたＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸と併用する、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化されたＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化されたＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸、および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧｅｘｐ）もしくはＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化されたＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２０～２４のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含んでおり、ならびに／またはＵ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：２５～３６および６１～７２のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含んでいる。

【0028】

本開示は、その必要がある対象において、筋強直性ジストロフィーを処置、回復、および／もしくは予防することにおける、（ａ）配列番号：３～１９のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：２５～３６のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：３７～４８のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：３７～４８のうち１つに明記された配列に結合されたＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号：４９～６０のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ
ＲＮＡ逆相補配列；（ｇ）配列番号：６１～７２のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ＲＮＡをコードする逆相補配列；ならびに／または（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および／もしくは（ｇ）のうちいずれか１つもしくは複数の組合せを含む少なくとも１つの核酸、または当該１つまたは複数の核酸を含む組成物を提供する。

【0029】

本開示は、その必要がある対象において筋強直性ジストロフィーを処置、回復、および／または予防することにおける、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）の使用を提供する。

【0030】

いくつかの実施形態では、本開示の方法によって処置される筋強直性ジストロフィーはＤＭ１である。本開示はまた、本明細書に記載されるように、ＤＭ１（ｉＤＭ１）の新規ウイルスベクター（例えば、線形ＡＡＶまたはｓｃＡＡＶなどのＡＡＶ）誘導多系統性マウスモデルを提供する。このモデルは、ＤＭ１を含むＤＭのための新規治療学を検査する場合に有用である。

【0031】

本開示の他の特徴および利点は、以下の図面の説明および詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、図面、詳細な説明、および実施例は、開示された主題の実施形態を示しているが、例示の手段としてのみ与えられている。本開示の精神および範囲内である種々の変更および修正は、図面、詳細な説明、および実施例から明らかとなるためである。

【0032】

定義
本明細書で使用される用語は、本明細書の文脈および各用語が使用される特定の文脈内にて、当該技術におけるその用語の一般的な意味を概して有する。ある特定の用語は、以下にて、または本明細書の任意の箇所で記載され、本発明の方法または如何にその方法を使用するかを記載する場合に、開業医に対して更なる指導を提供する。

【0033】

本明細書で使用される場合、用語「約」は、記載の値の１０％超または１０％未満内である値を指す。例えば、語句「約１００核酸残基」は、９０～１１０核酸残基の値を指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ」およびその短縮形である「ＤＭＰＫ」は、例えばヒト対象における、骨格筋構造および機能の調節に関係しているセリン／トレオニンキナーゼタンパク質を指す。用語「筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ」および「ＤＭＰＫ」は、本明細書においては互換的に使用されており、ＤＭＰＫ遺伝子の野生型形態だけではなく、野生型ＤＭＰＫタンパク質のバリアントおよび同様のものをコードする核酸も指している。ヒトＤＭＰＫ ｍＲＮＡの２つのアイソフォームの核酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号．ＢＣ０２６３２８．１およびＢＣ０６２５５３．１である（３’ＵＴＲは含まれていない）。

【0035】

本明細書で使用される場合、用語「干渉ＲＮＡ」は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡを指す。これらは、（ｉ）標的ＲＮＡ転写物をアニーリングし、これにより二本鎖核酸を形成すること、および（ｉｉ）ＲＮＡ転写物のヌクレアーゼ媒介性分解を促進すること、および／または（ｉｉｉ）例えば、機能性リボソームＲＮＡ転写物複合体の形成を立体的に妨げるか、それ以外の場合には標的ＲＮＡ転写物由来の機能性タンパク質産物の形成を減弱させることでＲＮＡ転写物の翻訳を遅延、抑制もしくは妨害することによって、標的ＲＮＡ転写物の発現を抑制する。本明細書に記載の干渉ＲＮＡは、例えば、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの形態で、または干渉ＲＮＡをコードしている導入遺伝子を含むベクター（例えば、本明細書に記載のアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター）の形態で、筋強直性ジストロフィーに罹患しているヒト患者などの患者に提供されてよい。代表的な干渉ＲＮＡプラットフォームは例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ４：ｅ２５２（２０１５）；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１：７４６－７６９（２００９）；およびＢｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：６９２－７０１（２０１４）にて記載されており、このそれぞれの開示は、本明細書の一部を構成するものとして、本明細書全体の内容を援用する。

【0036】

本明細書で使用される場合、用語「筋強直性ジストロフィー」は、ＤＭＰＫをコードし、かつ５０～４，０００ＣＵＧリピートを有する伸長されたＣＵＧトリヌクレオチドリピート領域など、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における伸長されたＣＵＧトリヌクレオチドリピート領域を含む、ＲＮＡ転写物の核保持により特徴づけられる遺伝性筋萎縮障害を指す。比較すると野生型ＲＭＰＫ ＲＮＡ転写物は典型的には、３’ＵＴＲにおいては５～３７ＣＵＧリピートを含む。筋強直性ジストロフィーに罹患している患者では、伸長されたＣＵＧリピート領域は、筋肉ブラインド様タンパク質（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）などのＲＮＡ結合スプライシング因子と相互作用する。この相互作用により、変異転写物は核内フォーカス内に保持され、他のプレｍＲＮＡ基質から離れたところにＲＮＡ結合タンパク質を隔離させる。次いで、筋構造および機能の調節に関係しているタンパク質の異常スプライシングを促進させる。Ｉ型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）においては、多くの場合、骨格筋は最も極度に悪影響を受ける組織である。しかしこの疾患は、心臓ならびに平滑筋、水晶体および脳にも有毒作用を及ぼす。頭蓋、四肢遠位部、および横隔膜筋は優先的に悪影響を受ける。手先の器用さは早期に失われるため、これにより数十年にわたる深刻な身体障害が生じる。筋強直性ジストロフィー患者の死亡時年齢の中央値は５５歳である。これは通常、呼吸不全によって生じる（ｄｅ Ｄｉｅ－Ｓｍｕｌｄｅｒｓ Ｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １２１：１５５７－１５６３（１９９８））。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「操作可能に結合された」は、第２の分子（例えば、第２の核酸）に結合された第１の分子（例えば、第１の核酸）を指す。これらの分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を及ぼすように配置される。２つの分子は、単独の隣接する分子の一部であってもよく、またはその一部でなくてよい。またはこれらの分子は、互いに隣接した状態であってもなくてよい。例えばプロモータは、このプロモータが細胞中で関心対象の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、転写可能なポリヌクレオチド分子と操作可能に結合されている。更には、転写調節因子の２部分は、一方の部分の転写活性化機能がもう一方の部分の存在によって有害に影響しない場合には、互いに操作可能に結合されている。２つの転写調節因子は、リンカー核酸（例えば、介入非コード核酸）を介して互いに操作可能に結合されてよいか、または介入ヌクレオチドが存在しない状態で互いに操作可能に結合されてよい。

【0038】

本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書に記載されるような特定の疾患または状態（例えば筋強直性ジストロフィーといった遺伝性筋萎縮障害など）向けの処置を受ける有機体を指す。対象および患者の例には、ヒトといった哺乳動物が含まれ、本明細書に記載の疾患または状態向けの処置を受ける。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置を指す。この治療的処置では、目的は、筋強直性ジストロフィー、および特にＩ型筋強直性ジストロフィーなどの遺伝性筋萎縮障害の進行といった、望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（減らす）ことである。筋強直性ジストロフィーの処置といった文脈では、成功した処置を意味している有益なまたは所望の治療結果は、検出可能か不可能かのいずれかで、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行を遅延または遅らせること、疾患状態の回復または緩和、および鎮静（部分的または全体的のいずれか）を含むがこれに限定されない。

【0040】

本特許または本出願ファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも１つ含まれる。１つまたは複数のカラー図面を含むこの特許または特許出願公報の複写物は、要請および必要な料金の支払いに応じて、官庁により提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
核酸であって、
ａ）配列番号：３～１９のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：２０～２４のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：２５～３６のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号：３７～４８のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；
ｅ）配列番号：３７～４８のうちいずれか１つに明記された配列に結合する、ＤＭＰＫ
ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；
ｆ）配列番号：４９～６０のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ ＲＮＡ逆相補配列；
ｇ）配列番号：６１～７２のうちいずれか１つに明記された配列との、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を含む、ＤＭＰＫ Ｕ７ＲＮＡをコードする逆相補配列、ならびに／または
ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、および／もしくは（ｇ）の１つまたは複数のいずれかの組合せを含む、核酸。
(項目２)
項目１の核酸を含む、ウイルスベクター。
(項目３)
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、項目２に記載のウイルスベクター。
(項目４)
前記ウイルスベクターがＡＡＶである、項目３に記載のウイルスベクター。
(項目５)
前記ＡＡＶがｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している、項目４に記載のウイルスベクター。
(項目６)
前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、項目４または５に記載のウイルスベクター。
(項目７)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、およびＡＡＶｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、項目４から６のうちいずれか一項に記載のウイルスベクター。
(項目８)
前記ＡＡＶがＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、項目４から７のうちいずれか一項に記載のウイルスベクター。
(項目９)
前記ＡＡＶがシュードタイプＡＡＶである、項目４から８のうちいずれか一項に記載のウイルスベクター。
(項目１０)
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、項目９に記載のウイルスベクター。
(項目１１)
項目２から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
(項目１２)
細胞において、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の発現を抑制ならびに／またはこの遺伝子の発現に干渉もしくは、前記ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）に干渉する方法であって、前記細胞と項目４から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクターとを接触させることを含む、方法。
(項目１３)
筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）を患っている対象を処置する方法であって、前記対象に有効量の項目４から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクターを投与することを含む、方法。
(項目１４)
前記ＤＭがＤＭ１である、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
必要がある対象において筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）を処置する方法であって、前記対象に有効量のウイルスベクターを投与する工程を含み、前記ウイルスベクターのゲノムが、
ａ）筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子のエクソン５の発現を抑制；
ｂ）前記ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制；および／または
ｃ）前記ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）、もしくは前記ＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５に干渉するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドおよび／もしくは少なくとも１つのＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド、またはその組合せを含む、方法。
(項目１６)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記ウイルスベクターがＡＡＶである、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記ＡＡＶがｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、項目１７または１８に記載の方法。
(項目２０)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、およびＡＡＶｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、項目１７から１９のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記ＡＡＶがＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、項目１７から２０のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記ＡＡＶがシュードタイプＡＡＶである、項目１７から２１のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、項目１５から２３のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、配列番号：２５～３６および６１～７２のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、項目１５から２４のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
前記ＤＭがＤＭ１である、項目１５から２５のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
必要がある対象において筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）を処置する方法であって、前記対象に有効量のウイルスベクターを投与する工程を含み、前記ウイルスベクターのゲノムが、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、前記ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、または前記ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）の発現もしくは前記ＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドを含む、方法。
(項目２８)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記ウイルスベクターがＡＡＶである、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記ＡＡＶがｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、項目２９または３０に記載の方法。
(項目３２)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、およびＡＡＶｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、項目２９から３１のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
前記ＡＡＶがＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、項目２９から３２のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
前記ＡＡＶがシュードタイプＡＡＶである、項目２９から３３のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目３５)
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、配列番号：２０～２４のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、項目２７から３５のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
前記ＤＭがＤＭ１である、項目２７から３６のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
必要がある対象において筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）を処置する方法であって、前記対象に有効量のウイルスベクターを投与する工程を含み、前記ウイルスベクターのゲノムが、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子のエクソン５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド、前記ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン８の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｈＲＮＡポリヌクレオチド、または前記ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）の発現もしくは前記ＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳エクソン１５の発現を抑制するように標的化された、少なくとも１つのＵ７ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドを含む、方法。
(項目３９)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
前記ウイルスベクターがＡＡＶである、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
前記ＡＡＶがｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、項目４０または４１に記載の方法。
(項目４３)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、およびＡＡＶｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、項目４０から４２のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記ＡＡＶがＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、項目４０から４３のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目４５)
前記ＡＡＶがシュードタイプＡＡＶである、項目４０から４４のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記ＡＡＶがＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
前記Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、配列番号：２５～３６および６１～７２のうち１つに明記された配列に対する、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、項目３８から４６のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記ＤＭがＤＭ１である、項目３８から４７のうちいずれか一項に記載の方法。
(項目４９)
必要がある対象において、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）を処置、回復、および／もしくは予防することにおける、項目１に記載の少なくとも１つの核酸、項目２から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター、または項目１１に記載の組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1-1】Ｕ６ ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を示す。

【図1-2】Ｕ６ ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を示す。

【図1-3】Ｕ６ ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を示す。

【図1-4】Ｕ６ ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を示す。

【図1-5】Ｕ６ ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を示す。 図１Ａは、Ｕ６．ｓｈ２５７７である。図１Ｂは、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８である。図１Ｃは、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５である。図１Ｄは、Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６である。図１Ｅは、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２６８３である。

【0042】

【図2-1】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-2】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-3】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-4】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-5】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-6】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-7】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-8】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-9】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-10】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-11】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。

【図2-12】Ｕ７ ｓｎＲＮＡコンストラクトを示す。 図２Ａ～図２Ｄは、エクソン５を標的とする。図２Ｅ～図２Ｈは、エクソン８を標的とする。図２Ｉ～図２Ｌは、３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピートを標的とする。これらの配列のそれぞれは、ＤＭＰＫのリーディングフレームを破壊するおよび／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧトリヌクレオチドリピートのリピート伸長に干渉するように設計された。緑色で強調されたヌクレオチドは、ｓｎＲＮＡループを表す。緑色で強調され、かつイタリック体で表記されているヌクレオチドは、ループラベル配列を表す。紫色で強調されたヌクレオチドは、Ｓｍ結合を表す。黄色で強調されたヌクレオチドは、Ｕ７ プロモータおよび３’ＵＴＲを表す。灰色で強調された配列は、アンチセンス配列を表す。図２Ａ中、赤色で強調された配列は、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ切断部位を示す。

【0043】

【図3-1】ＲＴ－ｑＰＣＲおよびノーザンブロットの結果を示す。

【図3-2】ＲＴ－ｑＰＣＲおよびノーザンブロットの結果を示す。 図３Ａは、組換えＡＡＶショートヘアピンＲＮＡ（ｒＡＡＶ．ｓｈＲＮＡ）で処置されたＤＭ１筋原細胞から単離された全ｍＲＮＡ（すなわち、２５７７、２６８５およびＤＨ６．５）におけるＤＭＰＫ発現のＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｓｈＲＮＡ ２５７７および２６８３は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域を標的とし、ｓｈＲＮＡ ＤＨ６．５は、ＤＭＰＫコード領域を標的とする。図３Ｂは、伸長されたＤＭＰＫ転写物「［ＣＴＧ］２０００」における減少を示す指定のＡＡＶ．ｓｈＲＮＡに感染した後の全ＲＮＡのノーザンブロット解析を示す。レーン１のラベル「－ｖｅ」は、未処置の対照細胞を表す。

【0044】

【図4-1】種々の配列の設計を示す。

【図4-2】種々の配列の設計を示す。

【図4-3】種々の配列の設計を示す。 図４Ａは、ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡによる標的を目的に、ＤＭＰＫ配列（配列番号：１（ヌクレオチド）、配列番号：２（アミノ酸））における破壊のため、エクソン５中でアンチセンス配列が設計された場所を示す。図４Ｂは、ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡによる標的を目的に、ＤＭＰＫ配列（配列番号：１（ヌクレオチド）、配列番号：２（アミノ酸））における破壊のため、エクソン８中でアンチセンス配列が設計された場所を示す。図４Ｃは、ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡによる標的を目的に、ＤＭＰＫ配列（配列番号：１（ヌクレオチド）、配列番号：２（アミノ酸））の３’非翻訳領域におけるＣＵＧリピートを標的とするようにアンチセンス配列が設計された場所を示す。

【0045】

【図5-1】ＡＡＶ．４８０ＣＴＧの注射後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）におけるＤＭ１の病理学的特徴の誘発を示す。

【図5-2】ＡＡＶ．４８０ＣＴＧの注射後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）におけるＤＭ１の病理学的特徴の誘発を示す。図５Ｂは、対照である図５Ａにて、ＡＡＶ．ＣＴＧ０の注射は、ＡＡＶ．４８０ＣＴＧ（図５Ｂ）の注射と比較すると中心核形成を引き起こさないことを示すのに比べ、マウスの骨格筋においては、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０の発現により、注射後２週間で広範囲の炎症、注射後４週間で、ジストロフィー筋で一般的に観察される主要な病理学的変化の１つである中心核形成の出現が引き起こされることを示す。図５Ｃは、対照と比較した、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０の投与後のマウスの筋肉での異なるｍＲＮＡのスプライシング変化を示す。ＡＡＶ．４８０ＣＴＧまたはＡＡＶ．０ＣＴＧの注射後２週間時点での注射された前脛骨（ＴＡ）筋から分離されたＲＮＡにおけるＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０を注射した筋肉内のみで、塩素電位依存性チャネル１（ＣＬＣＮ１）、筋小胞体－滑面小胞体カルシウム輸送アデノシントリフォスファターゼ（ＳＥＲＣＡ）１（ＳＥＲＣＡ１）、筋肉ブラインド様タンパク質２（ＭＢＮＬ２）およびインスリン受容体（ＩＲまたはＩＮＳＲ）遺伝子について、選択的にスプライスされたエクソンを示した。こうした結果は、インビボで、筋肉におけるＤＭ１特徴を誘発するＡＡＶ．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０手法の能力を示している。

【図5-3】ＡＡＶ．４８０ＣＴＧの注射後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）におけるＤＭ１の病理学的特徴の誘発を示す。図５Ｂは、対照である図５Ａにて、ＡＡＶ．ＣＴＧ０の注射は、ＡＡＶ．４８０ＣＴＧ（図５Ｂ）の注射と比較すると中心核形成を引き起こさないことを示すのに比べ、マウスの骨格筋においては、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０の発現により、注射後２週間で広範囲の炎症、注射後４週間で、ジストロフィー筋で一般的に観察される主要な病理学的変化の１つである中心核形成の出現が引き起こされることを示す。図５Ｃは、対照と比較した、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０の投与後のマウスの筋肉での異なるｍＲＮＡのスプライシング変化を示す。ＡＡＶ．４８０ＣＴＧまたはＡＡＶ．０ＣＴＧの注射後２週間時点での注射された前脛骨（ＴＡ）筋から分離されたＲＮＡにおけるＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＣＴＧ４８０を注射した筋肉内のみで、塩素電位依存性チャネル１（ＣＬＣＮ１）、筋小胞体－滑面小胞体カルシウム輸送アデノシントリフォスファターゼ（ＳＥＲＣＡ）１（ＳＥＲＣＡ１）、筋肉ブラインド様タンパク質２（ＭＢＮＬ２）およびインスリン受容体（ＩＲまたはＩＮＳＲ）遺伝子について、選択的にスプライスされたエクソンを示した。こうした結果は、インビボで、筋肉におけるＤＭ１特徴を誘発するＡＡＶ．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０手法の能力を示している。

【0046】

【図6】図６は、天然ｍｉ／ｓｈＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列および構造を表し、どのように抑制ｍＲＮＡが設計されているかを示す。天然ｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、独自のセンス（青文字）配列および関心対象領域を標的とするアンチセンス（赤文字）配列によって置換される。オレンジ色のヌクレオチドは、ｐｏｌＩＩＩ依存性Ｕ６プロモータ向けの終結シグナルとして使用するために加えられている３’末端ポリＵを除き、ヒトｍｉＲ－３０ａを由来とする。天然ｍｉｒ－３０のＤｒｏｓｈａ切断部位およびＤｉｃｅｒ切断部位は維持されており、これらは青色および黄色の矢印によってそれぞれ示されている。Ｄｒｏｓｈａ切断部位（－２位置）のすぐ上流に位置するミスマッチは、適切なプロセシングのために維持されている。

【0047】

【図7】関心対象の変性Ｕ７ｓｎＲＮＡ標的領域を示す。スプライセオソームのｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列（Ｕ７ｓｍＯＰＴ；赤文字は、ｗｔ ｓｍとｓｍＯＰＴとの間のヌクレオチド変化に対応している）で、野生型Ｕ７ Ｓｍ結合部位を置き換えることにより、得られたＲＮＡは、スプライセオソームのｓｎＲＮＡにて見いだされた７つのＳｍタンパク質で構築されている。青色のドーナツ状部分は、スプライシング因子を補充するために重要である変性Ｕ７と結合するＬｓｍタンパク質に対応する。これにより特定のスプライシング現象を調節することが可能となる。

【0048】

【図8】ショートヘアピンＲＮＡ（ｒＡＡＶ．ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ（すなわち、２５７７および２６８５）を含むＡＡＶによる、ヒトＰＡＮＣ－１およびＨＥＫ２９３細胞におけるＤＭＰＫ発現の下方制御を示す。

【0049】

【図9-1】ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写物を用いて下方制御またはこれに干渉するように設計された種々のコンストラクトを含むＡＡＶ８（１．２５×１０^１１ｖｇ／動物）で、４週齢で処置されたヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスにおける、ｈＤＭＰＫ発現の下方制御を示す。

【図9-2】ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写物を用いて下方制御またはこれに干渉するように設計された種々のコンストラクトを含むＡＡＶ８（１．２５×１０^１１ｖｇ／動物）で、４週齢で処置されたヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスにおける、ｈＤＭＰＫ発現の下方制御を示す。

【図9-3】ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写物を用いて下方制御またはこれに干渉するように設計された種々のコンストラクトを含むＡＡＶ８（１．２５×１０^１１ｖｇ／動物）で、４週齢で処置されたヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスにおける、ｈＤＭＰＫ発現の下方制御を示す。図９Ａは研究デザインを示す。表に列記された３つのコンストラクト（ＰＬＡ１（配列番号：２０）、ＰＬＡ３（配列番号：３４）、ＰＬＡ４（配列番号：３１））は、それぞれ１．２５×１０^１１ｖｇ／動物にて筋肉内（ＩＭ）注射によって、４週齢のヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウス（Ｈｅｍｉ）の左側前脛骨（ＴＡ）筋へと注射された。対側脚は未処置の対照であった。マウスを投与後４週間目で屠殺し、その組織をＲＮＡシーケンス（ＲＮＡｓｅｑ）によりＲＮＡ発現解析のために回収した。図９Ｂは、ＰＬＡ１が、ＲＮＡｓｅｑによる評価時に、未処置の対側脚と比較し、処置済脚においてｈＤＭＰＫ ＲＮＡ発現を減少させたことを示す。図９Ｃは、ＰＬＡ１－処置ＴＡ筋マウスの脚におけるｈＤＭＰＫレベルの２２％減少を示す。

【発明を実施するための形態】

【0050】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および産物は、成人において最も一般的な筋ジストロフィーである筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）の処置にて使用される。本開示は、ＤＭ１およびＤＭ２の両方の処置のための方法および産物を含む。Ｉ型（ＤＭ１）およびＩＩ型（ＤＭ２）の両方ともが、その臨床症状に類似点を有する常染色体優性遺伝形式の多系統性障害である。ＤＭ１およびＤＭ２における臨床症状には、進行性の筋力低下、筋強直症、ＣＫレベルの上昇、心臓伝導障害および白内障が含まれる。ＤＭ２では、症状はより不一致であり、非常に多種多様である。ＤＭ１は、少なくともいくつかの例では、プロテインキナーゼ（染色体１９ｑ１３．３上のエクソン１５における、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子）の３’非翻訳領域における伸長（ＣＴＧ）ｎリピート配列（ＣＴＧ伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）とも呼ばれる）によって引き起こされる。ＣＴＧ^ｅｘｐにより、核内フォーカスを形成する毒性ＲＮＡを産生しているＣＵＧトリプレットリピート伸長が生じる。

【0051】

いくつかの態様では、本開示はＤＭ１の処置における産物および方法を含む。ＤＭ１は、成人発症の筋ジストロフィーの最もありふれた形態であり、骨格筋、心臓、脳、皮膚、眼および内分泌系に悪影響を及ぼす。筋強直性ジストロフィーの有病率は、８，０００人に１人であると推測されているが、フィンランドおよび他のヨーロッパ諸国では更に高い有病率が報告されている。

【0052】

ＤＭＰＫ遺伝子は、骨格筋の構造および機能の維持に必要である、約６９．４ｋＤａのタンパク質（ミオトニンプロテインキナーゼ、ＤＭ－キナーゼ、ＤＭ１プロテインキナーゼ、および筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼとも呼ばれる。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０９０１３（ＤＭＰＫ＿ＨＵＭＡＮ）を参照されたい）をコードする。ＤＭＰＫは、低分子量ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーの一部と相互作用する他のキナーゼと密接に関連しているセリン－トレオニンキナーゼである。この酵素のための基質には、ミオゲニン、Ｌ型カルシウムチャネルのβ－サブユニット、およびホスホレマンが含まれる。この遺伝子の３’非翻訳領域は、ＣＴＧトリヌクレオチドリピートの約５～３８のコピーを含む。この非安定モチーフを５０～５，０００コピーまで伸長することにより、Ｉ型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）が引き起こされ、リピート因子のコピー数が増加するのに伴い重症度が増加する。リピート伸長は、この領域における遺伝子の発現を妨害させる局所的なクロマチン構造の凝縮と関連している。

【0053】

ＤＭＰＫはまた、心筋収縮力の調節および適切な心臓伝導活性の維持にとって重大な意味を有している。いくつかの態様では、ヒトＤＭＰＫをコードする核酸は、配列番号：１に明記されたヌクレオチド配列にて明記されている。いくつかの態様では、ヒトＤＭＰＫのアミノ酸配列は、配列番号：２に明記されたアミノ酸配列にて明記されている。いくつかの態様では、マウスＤＭＰＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５４２６５）またはマウスＤＭＰＫをコードする核酸配列も使用される。種々の態様では、本開示の方法はまた、配列番号：１にて明記されたヌクレオチド配列のアイソフォームおよびバリアントも標的にする。いくつかの態様では、このバリアントは、配列番号：１に明記されたヌクレオチド配列に対する、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％および７０％の同一性を含む。いくつかの態様では、本開示の方法は、配列番号：２にて明記されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のアイソフォームおよびバリアントを標的にする。いくつかの態様では、このバリアントは、配列番号：２に明記されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対し、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％および７０％の同一性を含む。

【0054】

大半の人では、この遺伝子内のＣＴＧリピート数は、約５～３４の範囲である。ＤＭ１に罹患している人々は、大半の細胞内に約５０～５，０００ＣＴＧリピートを有する。リピート数は、筋細胞などのある特定の種類の細胞においては更に多くてもよい。トリヌクレオチドリピート伸長のサイズは、徴候や症状の深刻度と関連している。成人初期の筋力低下および筋消耗を含む、古典型のＤＭ１の特徴を有する人々は、通常１００～１，０００の間のＣＴＧリピートを有する。より重篤な先天型ＤＭ１をもって生まれた人々は、多数のＣＴＧリピート（多くの場合、２，０００超）を有する傾向がある。この状態のこうした型は乳児期に明らかとなり、生命を脅かすような健康問題に関与してすることがある。本開示はＤＭ１を処置する方法を含む。

【0055】

上記に示したように、変異ＤＭＰＫ遺伝子は、変性した型のｍＲＮＡを産生する。変性ｍＲＮＡはタンパク質を捕捉し、細胞内部に凝集塊を形成する。この凝集塊は多くの他のタンパク質の産生に干渉する。例えば二次ＲＮＡ構造は、これらのフォーカス内のスプライシング因子である筋肉ブラインド様タンパク質１（ＭＢＮＬ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＲ５６（ＭＢＮＬ１＿ＨＵＭＡＮ））を捕捉し、ＣＵＧ－結合タンパク質／Ｅｌａｖ様ファミリータンパク質（ＣＵＧＢＰ／ＣＥＬＦ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９２８７９（ＣＥＬＦ１＿ＨＵＭＡＮ））を上方制御する。結果として、ＤＭ１の成人患者は、筋形質／筋小胞体カルシウムアデノシントリフォスファターゼ１（ＳＥＲＣＡ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ１４９８３（ＡＴ２Ａ１＿ＨＵＭＡＮ）、塩素電位依存性チャネル１（ＣＬＣＮ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３５５２３（ＣＬＣＮ１＿ＨＵＭＡＮ））、および架橋インテグレータ１（ＢＩＮ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００４９９（ＢＩＮ１＿ＨＵＭＡＮ））などの異常スプライシングによって生成された胎生期タンパク質アイソフォームが増加して存在していることを立証する。これらの変化により、筋細胞および他の組織の細胞の適切な機能が妨げられ、筋力低下および筋消耗、ならびに白内障、性腺機能不全、欠陥性内分泌腺機能、男性における脱毛症、ならびに不整脈を含む、ＤＭ１の他の特徴が引き起こされる。

【0056】

ＤＭ１に罹患している患者では、筋強直症／筋硬直により、障害された運動制御および可動性が引き起こされる。筋強直症は、ＤＭ１患者のうち、最も蔓延している症状のうちの１つである。筋緊張症は、さまざまな側面で、筋電図検査（ＥＭＧ）を使用して筋肉の過興奮性をテストすることによって電気生理学的に定量化されます［Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６５２）：１９７８－８０（２００３）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ。投資する。１１７（１２）：３９５２－７（２００７）；Ｓｔａｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＭＡ ３０８（１３）：１３５７－６５（２０１２）］。

【0057】

疾患の深刻度は、リピート数とともに変化する。軽度の患者は、５０～１５０リピートを有し、古典型ＤＭに罹患している患者は１００～１，０００リピートを有し、先天的な発症では２，０００リピート超を有する。変性ＤＭＰＫ遺伝子はある世代から次の世代へと受け継がれるため、ＣＴＧリピート伸長のサイズは増大することが多い。約３５～４９ＣＴＧリピートを有する人々は、Ｉ型筋強直性ジストロフィーにかかると報告されてはいない。ただし、この人々の子供らは、ＣＴＧリピート数が増大した場合には障害を有する危険を抱えている。約３５～４９のリピート長は、前突然変異と呼ばれる。

【0058】

現状では、この疾患を患っている患者には症状の管理以外の治療的処置が存在していない。更には、これまでその多系統的な態様を含む、ＤＭ１表現型を適切に再現する動物モデルが存在してこなかった。本開示の治療的アプローチは、（非コードＲＮＡを含む抑制ＲＮＡを介して）アンチセンス配列を送達し、ＤＭＰＫ遺伝子および／または３’非翻訳領域もしくは非翻訳エクソン１５における、ＣＵＧトリプレットリピート伸長（ＣＴＧ^ｅｘｐ）の発現をノックダウン／これに干渉するためのＡＡＶなどのウイルスベクターの使用である。なぜなら、このリピートは、筋肉ブラインド様タンパク質１（ＭＢＬＮ１）を捕捉するフォーカスの形成を単独で引き起こし、プレ－ｍＲＮＡ選択的スプライシング制御を介在し、その結果、ＣＵＧ－ＢＰ、Ｅｌａｖ様ファミリーメンバー１（ＣＥＬＦ１）、プレ－ｍＲＮＡ選択的スプライシング、ｍＲＮＡ翻訳、および安定性を制御する高度に保存されたＲＮＡ結合タンパク質の過剰発現を誘発するためである。本開示は、ＤＭ１を処置するためのこうした治療的アプローチを含む。

【0059】

本開示は、変異ＤＭＰＫ遺伝子および結果的に変性した型のｍＲＮＡから生じる、ＤＭ１または他の障害に罹患した対象を回復させるおよび／または処置する目的で、ＤＭＰＫ発現を下方制御するおよび／またはＣＴＧリピートの発現を下方制御もしくはこれに干渉するためのＲＮＡ干渉の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、種々の疾患を処置するために検討されてきた、真核細胞における遺伝子調節機序である。ＲＮＡｉは、抑制ＲＮＡによって媒介された遺伝子発現の転写後制御を指す。

【0060】

天然ＲＮＡｉ経路の理解が進展したため、研究者は、疾患を処置するため、標的遺伝子の発現を調節する際に使用するための人工ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを設計してきた。短い（または小さい）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短い（または小さい）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など、哺乳類細胞でＲＮＡｉプロセスをトリガーするいくつかのクラスのｓｍａｌｌ ＲＮＡが知られており、これらは同様のクラスを構成します。ベクター発現トリガー［Ｄａｖｉｄｓｏｎｅｔａｌ．、Ｎａｔ。遺伝子牧師。１２：３２９－４０、２０１１；ハーパー、アーチ。Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３－８、２００９］。ｓｈＲＮＡとｍｉＲＮＡは、プラスミドベースまたはウイルスベースのベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現するため、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモータが活性である限り、１回の投与で長期の遺伝子サイレンシングを達成できます（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、メソッド酵素。３９２：１４５－７３、２００５）。重要なことには、このベクター発現アプローチは、筋遺伝子治療分野にて既に行われていた数十年の長さにわたる進歩を強化する。ただし、遺伝子をコードするタンパク質を発現する代わりに、ＲＮＡｉ治療戦略におけるベクターカーゴは、関心対象の疾患遺伝子を標的とする人工ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡカセットである。この戦略は天然ｍｉＲＮＡを発現させるために使用される。各ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列および構造に基づいている。天然ｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、標的遺伝子を由来とする固有のセンス配列（図６、青文字）およびアンチセンス配列（図６、赤文字）によって置き換えられる。オレンジ色のヌクレオチドは、ｐｏｌＩＩＩ依存性Ｕ６プロモータ向けの終結シグナルとして使用するために加えられている３’末端ポリＵを除き、ヒトｍｉＲ－３０ａを由来とする。天然ｍｉｒ－３０のＤｒｏｓｈａ切断部位およびＤｉｃｅｒ切断部位は維持されており、これらは青色および黄色の矢印によってそれぞれ示されている。Ｄｒｏｓｈａ切断部位（－２位置）のすぐ上流に位置するミスマッチは、適切なプロセシングのために維持されなければならない。

【0061】

いくつかの実施形態では、本開示の産物およびその方法は、ＤＭＰＫ発現に悪影響を与える（例えば発現をノックダウンもしくは抑制する）か、またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧリピート伸長に干渉するショートヘアピンＲＮＡまたはスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現を停止させるために使用され得る、堅固なヘアピンターンを伴う人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、比較的低い割合の分解と代謝回転を有するといった点でＲＮＡｉの有益なメディエータであるが、これは発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムを形質導入すると、次にｓｈＲＮＡは、プロモータ選択によってポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。産物は、プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによって処理される。得られたプレ－ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から排出される。次にこの産物はＤｉｃｅｒによって処理され、ＲＮＡ誘発発現停止複合体（ＲＩＳＣ）中へとロードされる。センス（パッセンジャー）鎖は分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的な配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを配向する。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を阻止する。これらの場合ではどちらも、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子の発現停止を引き起こす。いくつかの態様では、本開示は、ｓｈＲＮＡを介してＤＭＰＫアンチセンス配列を発現しているＡＡＶベクターの産生および投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、種々のプロモータの使用によって調節される。プロモータ選択は、頑強なｓｈＲＮＡ発現を得るためには必須である。種々の態様では、Ｕ６およびＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモータ、およびポリメラーゼＩＩＩプロモータが使用される。いくつかの態様では、Ｕ６ｓｈＲＮＡが使用される。

【0062】

いくつかの態様では、本開示はＵ６ｓｈＲＮＡ分子を使用して、遺伝子発現を抑制、ノックダウンまたはこれに干渉する。従来のスモール／ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は通常、Ｕ６などのｐｏｌＩＩＩプロモータを含むベクターから細胞核内部へ転写される。内因性Ｕ６プロモータは通常、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられています［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．。、Ｎａｔｕｒｅ。３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ。２（２）：１９６－２０４（１９８８）；Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ。２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様では、Ｕ６プロモータは哺乳動物の細胞のｓｈＲＮＡ分子によるベクターに基づく発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］。これは、（１）プロモータがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）によって認識され、かつｓｈＲＮＡの高レベルで恒常的発現を制御し、（２）プロモータが大半の哺乳動物の細胞型にて活性であるためである。いくつかの態様では、プロモータは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するのに必要な全因子が転写開始部位の上流に位置付けられる（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））という点で、ＩＩＩ型ｐｏｌＩＩＩプロモータである。本開示は、マウスおよびヒトの両方のＵ６プロモータを含む。ループによって接続された、標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核からＤｉｃｅｒがこれをスモール／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと処理する箇所である細胞質内部へと輸送される。

【0063】

いくつかの実施形態では、本開示の産物および方法は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を含む。これはまた、一般的にはＵ－ＲＮＡと呼ばれ、ＤＭＰＫ発現に影響を与える。ｓｎＲＮＡは、真核細胞内の細胞核のスプライシングスペックルおよびカハール体内部で見られる低分子ＲＮＡのクラスである。核内低分子ＲＮＡは、一連の特異タンパク質と関連しており、その複合体は核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ、多くの場合には「スナープス」と発音される）と呼ばれる。各ｓｎＲＮＰ粒子は、ｓｎＲＮＡ成分と、複数のｓｎＲＮＰ－特異タンパク質（核内タンパク質のファミリーであるＳｍタンパク質を含む）からなる。ｓｎＲＮＡは、その関連タンパク質とともにリボ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）を形成し、プレ－ｍＲＮＡ基質上の特異的な配列に結合する。これらはＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのいずれかによって転写される。ｓｎＲＮＡは多くの場合、ＲＮＡ結合ＬＳｍタンパク質といった共通配列の特徴および関連タンパク質因子の両方に基づき２つのクラスに分類される。Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡとして既知である第１のクラスは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ１１およびＵ１２からなる。Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。Ｌｓｍ－クラスｓｎＲＮＡとして既知である第２のクラスは、Ｕ６およびＵ６ａｔａｃからなる。Ｌｓｍ－クラスｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、Ｓｍ－クラスｓｎＲＮＡと比較すると核を離れることがない。いくつかの態様では、本開示はＤＭＰＫアンチセンス配列を送達するための、Ｕ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生および投与を含む。

【0064】

いくつかの態様では、本開示は遺伝子発現を抑制、ノックダウンまたはこれに干渉するためにＵ７ｓｎＲＮＡ分子を使用する。Ｕ７ｓｎＲＮＡは通常、ヒストンプレ－ｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、いくつかの態様では、スプライシング調節用の可変性ツールへと変換されるか、または細胞内で継続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）］。野生型Ｕ７Ｓｍ結合部位と、スプライセオソームのｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列を置き換えることで、得られたＲＮＡは、スプライセオソームのｓｎＲＮＡ内で見られる７つのＳｍタンパク質で会合する（図７）。結果として、このＵ７ ＳｍＯＰＴ ＲＮＡは核細胞質内に更に効率的に蓄積し、それ以上ヒストンプレ－ｍＲＮＡ切断を媒介しない。ただし、依然としてこのＵ７ ＳｍＯＰＴ ＲＮＡはヒストンプレ－ｍＲＮＡに結合することができ、野生型 Ｕ７ｓｎＲＮＰ用の競合抑制剤として機能する。ヒストン下流因子に結合している配列と、スプライシング基質における特定の標的に相補的な配列とを更に置き換えることで、特異的なスプライシング現象を調節可能であるＵ７ｓｎＲＮＡを生成することができる。Ｕ７誘導体を使用する利点は、アンチセンス配列が核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内へと包埋されることである。さらに、遺伝子治療ベクターに埋め込まれると、これらの小さなＲＮＡは、１回の注射後に標的細胞内で恒久的に発現することができます［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．ハム．ジェネット．１８（９）：９６９－７０（２０１０）；Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２、（２０１０）；Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］．ＣＵＧリピートの発現を変化させるためのＵ７の使用は、ＤＭ１患者細胞株でｉｎｖｉｔｒｏでテストされています［Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．構造体．モル．Ｂｉｏｌ．１８（１）：８５－７（２０１１）］ここで、ＣＵＧリピートを標的とするＵ７ ＲＮＡは、ＤＭＰＫ関連の病巣の量を減少させ、異常なスプライシングパターンを修正することが示されています。しかし、このアプローチは、レンチウイルスに基づいていたし、ｉｎ ｖｉｖｏでさらに追求していませんでした。ＡＡＶアプローチを使用した神経筋障害におけるＵ７ｓｎＲＮＡシステムの可能性がｉｎｖｉｖｏで調査されました（ＡＡＶ．Ｕ７）［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．ハム．ジェネット．１８（９）：９６９－７０（２０１０）；Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２（２０１０）；Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルの欠損ＲＮＡを標的にするこのＡＡＶ９．Ｕ７の単回注射により、心臓および横隔膜を含むあらゆる筋肉内の疾患の長期にわたる補正がもたらされる。心臓を標的とする能力は、ＤＭ１患者が心臓異常を示すことから非常に重要度が高い。

【0065】

Ｕ７ｓｎＲＮＡは通常、ヒストンプレ－ｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、これはまたスプライシング調節用の可変性ツールとして使用されるか、または細胞内で継続的に発現されるアンチセンス配列として使用される。Ｕ７誘導体を使用する１つの利点は、アンチセンス配列が核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内へと包埋されることである。更には、遺伝子治療ベクターに包埋される場合には、これらの低分子ＲＮＡは単回注射後に標的細胞内部で持続的に発現され得る。

【0066】

いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域に、毒性リピートとしても既知であるＣＴＧヌクレオチドリピートを含むＤＭＰＫ遺伝子の発現を、予防および抑制する抑制ＲＮＡをコードする配列を含む。抑制ＲＮＡはアンチセンス配列を含み、これはＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５および／エクソン８の発現を抑制および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉する。いくつかの態様では、アンチセンス配列は、配列番号：３～１９のうちのいずれかに明記された配列のいずれか、または、配列番号：３～１９のうちのいずれかに明記された配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含むバリアント配列である。いくつかの態様では、本開示は、Ｕ６プロモータの制御下で、配列番号：３～７のいずれかに明記されたアンチセンス配列、または配列番号：３～７のいずれかに明記された配列のうちいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含むそのバリアント配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、Ｕ７プロモータの制御下で、配列番号：８～１９のいずれかに明記されたアンチセンス配列、または配列番号：８～１９のいずれかに明記された配列のうちいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を含むそのバリアント配列を含む。

【0067】

ＤＭＰＫまたはそのＣＵＧトリプレットリピート伸長を標的とするための、ｓｈＲＮＡ内で使用される代表的なアンチセンス配列には、
Ｕ６．ｓｈ２５７７ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡ（配列番号：３）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧ（配列番号：４）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧ（配列番号：５）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡ（配列番号：６）；および
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２６８３ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＣＴＡ（配列番号：７）が含まれるがこれに限定されない。
上で明記のＤＮＡ配列は、ＤＭＰＫを標的とするためのＲＮＡアンチセンス配列をコードする。

【0068】

ＤＭＰＫまたはそのＣＵＧトリプレットリピート伸長を標的とするための、ｓｎＲＮＡ内で使用される代表的なアンチセンス配列には、
＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴ（配列番号：８）；
＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧ（配列番号：９）；
＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号：１０）；
＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣ（配列番号：１１）；
＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：１２）；
＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡ（配列番号：１３）；
＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＡＧ（配列番号：１４）；
＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＣ（配列番号：１５）；
Ｕ７－１５ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１６）；
Ｕ７－２０ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１７）；
Ｕ７－５’ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号：１８）；および
Ｕ７－３’ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：
ＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１９）が含まれるが、これに限定されない。
上で明記のＤＮＡ配列は、ＤＭＰＫを標的とするためのＲＮＡアンチセンス配列をコードする。

【0069】

いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＰＫ遺伝子の発現を抑制もしくはこれに干渉する／および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉する、ＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡまたはＵ－ＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、ｓｈＲＮＡはヒトまたはマウスＵ６プロモータ、すなわちＵ６ｓｈＲＮＡの制御により、またはこの制御下で駆動される。いくつかの態様では、ｓｎＲＮＡはヒトまたはマウスＵ７プロモータ、すなわちＵ７ｓｎＲＮＡの制御により、またはこの制御下で駆動される。

【0070】

いくつかの態様では、本開示は完全コンストラクト（本明細書ではＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドコンストラクトおよび／またはＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドコンストラクト）を含む。これは、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５および／またはエクソン８の発現を抑制し、および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉する。したがって、本開示はＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。配列特異的遺伝子の発現停止の原因である抑制ＲＮＡをコードする代表的な配列には、配列番号：２０～３６、または配列番号：２０～３６のいずれか１つに明記された配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むそのバリアント配列が含まれるが、これに限定されない。いくつかの態様では、これらのコンストラクトは単一のベクターへと結合されており、これはＤＭＰＫ Ｕ６ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびＤＭＰＫ Ｕ７ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの組合せと呼ばれる。

【0071】

ＤＭＰＫまたはそのＣＵＧトリプレットリピート伸長を標的とするために使用される代表的な配列には、以下が含まれるが、これに限定されない。
Ｕ６．ｓｈ２５７７：
ＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号：２０）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８：
ＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号：２１）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５：
ＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号：２２）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６：
ＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号：２３）；
Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２６８３：
ＧＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号：２４）；
Ｕ７ＥＸ５＃１：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：２５）；
Ｕ７ＥＸ５＃２：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：２６）；
Ｕ７ＥＸ５＃３：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：２７）；
Ｕ７ＥＸ５＃４：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：２８）；
Ｕ７ＥＸ８＃１：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：２９）；
Ｕ７ＥＸ８＃２：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３０）；
Ｕ７ＥＸ８＃３
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３１）；
Ｕ７ＥＸ８＃４：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３２）；
Ｕ７－１５ＣＴＧ：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３３）；
Ｕ７－２０ＣＴＧ：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３４）；
Ｕ７－５’ＣＴＧ：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３５）；および
Ｕ７－３’ＣＴＧ：
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡ（配列番号：３６）。
上で明記されたＤＮＡ配列は、ＤＭＰＫを標的とするためのＵ６ ｓｈＲＮＡまたはＵ７ ｓｎＲＮＡ配列をコードする。

【0072】

いくつかの態様では、これらのコンストラクトは、５＃１（または＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７）、５＃２（または＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４）、５＃３（または＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２）、５＃４（＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１）、８＃１（または＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４）、８＃２（または＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６）、８＃３（＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２）、８＃４（＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４）、１５ＣＡＧ（またはＵ７－１５ＣＴＧ），２０ＣＡＧ（Ｕ７－２０ＣＴＧ），５’ＣＡＧ（Ｕ７－５’ＣＴＧ）、３’ＣＡＧ（Ｕ７－３’ＣＴＧ）、Ｕ６．ｓｈ２５７７、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５、Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６およびＵ６Ｔ６．ｓｈ２６８３と呼ばれる。ＣＵＧリピートを標的とする４つのアンチセンス配列は、数回結合され得る。

【0073】

例示的なＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡコンストラクト（すなわち、Ｕ６ｓｈｒＲＮＡコンストラクト）は、配列番号：２０～２４に明記されたヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたものである。例示的なＤＭＰＫ ｓｎＲＮＡコンストラクト（すなわち、Ｕ７ｓｎＲＮＡ）は、配列番号：２５～３６に明記されたヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたものである。

【0074】

いくつかの態様では、本開示は、Ｕ６ ｓｈＲＮＡおよびＵ７ ｓｎＲＮＡが結合するように設計されている標的配列を含む。代表的な標的配列には、以下に明記されるように、配列番号：３７～４８に明記されたヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。
エクソン「５」を標的とする
＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７
標的とする配列：
ＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴ（配列番号：３７）
＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４
標的とする配列：ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡ（配列番号：３８）
＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２
標的とする配列：
ＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号：３９）
＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１
標的とする配列：
ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＡＴＴ（配列番号：４０）
エクソン「８」を標的とする
＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４
標的とする配列：
ＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号：４１）
＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６
標的とする配列：
ＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号：４２）
＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２：
標的とする配列：
ＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＴ（配列番号：４３）
＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４
標的とする配列：
ＧＡＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡ（配列番号：４４）
ＣＴＧリピートを標的とする
Ｕ７－１５ＣＴＧ
標的とする配列：ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４５）
Ｕ７－２０ＣＴＧ
標的とする配列：：ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４６）
Ｕ７－５’ＣＴＧ
標的とする配列：
ＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４７）；および
Ｕ７－３’ＣＴＧ
標的とする配列：
ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣ（配列番号：４８）

【0075】

いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン５および／もしくはエクソン８の発現を抑制ならびに／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート伸長に干渉する、逆相補配列を含む。したがって、本開示は逆相補配列をコードするＤＮＡ配列および逆相補配列のＲＮＡ配列を提供する。代表的な配列には、配列番号：８～１９、４９～６０、および６１～７２、または配列番号８～１９、４９～６０、および６１～７２のいずれか１つに明記された配列に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するそれらのバリアント配列が含まれるが、これに限定されない。いくつかの態様では、これらの配列はＵ６プロモータまたはＵ７プロモータの制御下にある。すなわち、例えば配列番号：６１～７２を参照されたい。いくつかの態様では、これらの配列の１つまたは複数のコピーは、単一のベクター中に結合される。

【0076】

いくつかの態様では、逆相補配列をコードする代表的なＤＮＡ配列およびＲＮＡ逆相補配列は、ＤＭＰＫまたはＣＵＧトリプレットリピート伸長を標的とする目的で使用した。かかる代表的な配列には、以下に明記の配列が含まれるがこれに限定されない：
エクソン「５」を標的とする
＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７：
逆相補配列：
ＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴ（配列番号：８）
ＲＮＡ逆相補配列：ＡＣＡＧＣＧＧＵＣＣＡＧＣＡＧＧＡＵＧＵＵＧＵＣＧＧＧＵＵＵＧＡＵＧＵＣＣＣＵ（配列番号：４９）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ５＃１：ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６１）；
＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４：
逆相補配列：ＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧ（配列番号：９）
ＲＮＡ逆相補配列：ＵＣＵＧＵＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＵＧＧＣＵＣＡＣＣＧＵＵＣＣＡＵＣＵＧＣＣＣＧＣＡＧＣＵＵＧＡＧＧ（配列番号：５０）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ５＃２：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６２）；
＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２：
逆相補配列：ａｃＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号：１０）
ＲＮＡ逆相補配列：ＡＣＣＧＵＵＣＣＡＵＣＵＧＣＣＣＧＣＡＧＣＵＵＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号：５１）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ５＃３：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６３）；
＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１：
逆相補配列：ＡＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣ（配列番号：１１）
ＲＮＡ逆相補配列：ＡＡＵＧＡＡＣＣＵＣＣＣＵＵＣＵＧＵＧＧＵＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣ（配列番号：５２）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ５＃４：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６４）；
エクソン「８」を標的とする
＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４：
逆相補配列：
ＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：１２）
ＲＮＡ逆相補配列：ＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＵＵＣＣＣＧＡＡＵＧＵＣＣＧＡＣＡＧＵＧＵＣＵＣＣＵＧＣＧ（配列番号：５３）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ８＃１：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６５）
＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６：
逆相補配列：ＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡ（配列番号：１３）
ＲＮＡ逆相補配列：ＧＧＡＧＵＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＵＧＧＡＣＣＣＣＵＡＧＣＧＧＣＧＣＡ（配列番号：５４）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ８＃２：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６６）；
＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２：
逆相補配列：ＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＡＧ（配列番号：１４）
ＲＮＡ逆相補配列：
ＡＣＣＵＧＡＧＧＧＣＣＡＵＧＣＡＧＧＡＧＵＡＧＧＡＧＵＡＧ（配列番号：５５）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ８＃３
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６７）；
＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４：
逆相補配列：
ＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＣ（配列番号：１５）
ＲＮＡ逆相補配列：ＵＣＵＣＣＵＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＵＧＵＧＡＧＣＡＧＣＡＧＵＣＧＵＣ（配列番号：５６）
逆相補配列 Ｕ７ＥＸ８＃４：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６８）；
ＣＴＧリピートを標的とする
Ｕ７－１５ＣＴＧ：
逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１６）
ＲＮＡ逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：５７）
逆相補配列 Ｕ７－１５ＣＴＧ
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：６９）；
Ｕ７－２０ＣＴＧ：
逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１７）
ＲＮＡ逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：５８）
逆相補配列 Ｕ７－２０ＣＴＧ：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：７０）；
Ｕ７－５’ＣＴＧ：
逆相補配列：
ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号：１８）
ＲＮＡ逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＵＵＣＣＣＧＧＣＵＡＣＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号：５９）
逆相補配列 Ｕ７－５’ｃｔｇ：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：７１）；および
Ｕ７－３’ＣＴＧ：
逆相補配列：ＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１９）
ＲＮＡ逆相補配列：ＧＡＡＡＵＧＧＵＣＵＧＵＧＡＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：６０）
逆相補配列 Ｕ７－３’ＣＴＧ：
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣ（配列番号：７２）。

【0077】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号：３～７２のうち任意の１つもしくは複数に明記されたヌクレオチド配列、または配列番号：３～７２のうちのいずれかに明記された配列に対し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するそれらのバリアント配列のうち、１つまたは複数を含むベクターを含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号：３～７２のうち任意の１つもしくは複数に明記されたヌクレオチド配列、または配列番号：３～７２のうちのいずれかに明記された配列に対し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するそれらのバリアント配列のうち、１つもしくは複数の組合せまたは複数のコピーを含むベクターを含む。いくつかの態様では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。

【0078】

本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスベクター、または例えばキメラウイルス、モザイクウイルスもしくはシュードタイプウイルスといった合成ウイルス、および／または異種タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子もしくは低分子を含むウイルス）を使用し、本明細書に記載の核酸を送達する。

【0079】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわちＡＡＶ１末端逆位配列（ＩＴＲ）およびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわちＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわちＡＡＶ３ＩＴＲおよびＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわちＡＡＶ４ＩＴＲおよびＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわちＡＡＶ５ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわちＡＡＶ６ＩＴＲおよびＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわちＡＡＶ７ＩＴＲおよびＡＡＶ７カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわちＡＡＶ８ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわちＡＡＶ９ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわちＡＡＶｒｈ７４ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわちＡＡＶｒｈ．８ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわちＡＡＶｒｈ．１０ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわちＡＡＶ１１ＩＴＲおよびＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわちＡＡＶ１２ＩＴＲおよびＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、またはＡＡＶ１３（すなわちＡＡＶ１３ＩＴＲおよびＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）などのＡＡＶである。

【0080】

いくつかの実施形態では、本開示はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用し、ＤＭＰＫをノックダウンおよび／または核内フォーカスを形成する毒性ＲＮＡをノックダウンするＤＭＰＫ ｍＲＮＡまたはＣＵＧリピートを標的とする抑制ＲＮＡを送達する。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され（ＡＡＶ－８に関連する米国特許第７，２８２，１９９号および米国特許第７，７９０，４４９号も参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体の導入を指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモータ（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモータ（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモータから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。

【0081】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的である固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。更に、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および導入を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部または全てが、外来ＤＮＡで置き換えられてよい。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは容易にアデノウイルス（５６～６５℃で数時間）を不活性化させるのに使用される状態に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低下させる。ＡＡＶは凍結乾燥されてよく、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。いくつかの態様では、ＡＡＶはＵ６プロモータの制御下でｓｈＲＮＡを送達するのに使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶはＵ７プロモータの制御下でｓｎＲＮＡを送達するのに使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶはＵ７プロモータおよびＵ６プロモータの制御下で、ｓｎＲＮＡとｓｈＲＮＡの両方を送達するのに使用される。いくつかの態様では、ＡＡＶはＵ６プロモータの制御下でｓｈＲＮＡと、Ｕ７プロモータの制御下でｓｎＲＮＡの両方を送達するのに使用される。

【0082】

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのエクソン２－標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトに隣接している１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。例示的な実施形態を含むいくつかの実施形態では、Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドはそれ自身のプロモータを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－ｒｈ７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－１３を含むがこれに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来してよい。上記の背景部分に記載されるように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。

【0083】

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを集合させて感染性ウイルス粒子にするために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１－欠失型アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）で感染させるのに許容可能な細胞へと転移される。その中で、パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスがＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０およびＡＡＶ－ｒｈ．７４を含むがこれに限定されない、ｒＡＡＶ ゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型から誘導され得るか、またはこれに由来する任意のＡＡＶ血清型に由来してよい。いくつかの態様では、ｒＡＡＶ ゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０およびＡＡＶ－ｒｈ．７４を含むがこれに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来している。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記に記載されるように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が、特に熟考されている。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0084】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つのＡＡＶ血清型由来のＩＴＲおよび異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含むシュードタイプＡＡＶである。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／９である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／８である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。いくつかの実施形態では、シュードタイプＡＡＶはＡＡＶ２／１である（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶである）。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８もしくはＡＡＶｒｈ．１０由来の１つまたは複数のカプシドタンパク質のキメラを含むカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは組換え線形ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ、または組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

【0087】

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば１つまたは複数の筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）抑制ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接している、１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＡｍｂｉｏｎＩｎｃなどの商用プロバイダー。（テキサス州オースティン）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ（バージニア州ハーンドン）は、カスタム阻害ＲＮＡ分子を生成します。これに加え、受注生産のｓｉＲＮＡ分子を産生するために、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）またはｐｓｉＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）といった市販のキットが利用可能である。実施形態は、配列番号：２５～３６のいずれかに明記されたヌクレオチド配列を含む核酸を含む、ｒＡＡＶゲノムを含む。

【0088】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ。ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。

【0089】

ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３－５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ。Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。種々のアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ。５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ。Ｖｉｒｏｌ。、６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔ ａｌ．、１９８８Ｍｏｌ。細胞。Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；米国特許。米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

【0090】

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの、安定状態で形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

【0091】

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、および国際公開第９８／０９６５７号に開示される方法が含まれる。

【0092】

別の実施形態では、本開示は本明細書に記載のコンストラクトのうち任意のものを含むｒＡＡＶを含む組成物を含む。一態様では、本開示は本明細書に記載のｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを送達するためのｒＡＡＶを含む組成物を含む。本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤などの他の成分を含んでもよい。許容される担体および希釈剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度では不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0093】

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

【0094】

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、および細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（例えば、それぞれ１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇおよび１×１０^１４ｖｇ）で表されてもよい。

【0095】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号：２０～３６のうち任意のものに明記されたＤＭＰＫ抑制ＲＮＡをコードするＤＮＡを、その必要がある対象に送達する方法を提供し、この方法はＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡをコードするＡＡＶを対象に投与することを含む。

【0096】

いくつかの態様では、本開示はＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡを送達するため、ＡＡＶ形質導入細胞を提供する。

【0097】

インビボまたはインビトロにて、ｒＡＡＶを用いて標的細胞を形質導入する方法が、本開示に含まれる。該方法は、対象に、本開示のｒＡＡＶを含む有効量または複数の有効量の組成物を投与する工程を含み、この対象には、必要がある動物（例えばヒト）が含まれる。用量がＤＭ－１の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量がＤＭ－１の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効量は、処置されるＤＭ－１に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する用量であり、ＤＭ－１への進行を遅延させるか、または予防する用量であり、障害／疾患状態の進行を遅延させるか、または予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の鎮静（部分的または完全な）をもたらす用量であり、および／または生存を延長させる用量である。

【0098】

有効量のＡＡＶ、ｒＡＡＶ、またはＡＡＶ、ｒＡＡＶを含む１つもしくは複数の組成物、または本開示の核酸の投与は、筋肉内投与、非経口投与、血管内投与、静脈内投与、経口投与、頬側投与、鼻腔投与、経肺投与、脳内投与、脳室内投与、脊髄内投与、骨内投与、眼内投与、直腸内投与、または膣内投与を含むがこれに限定されない、当該技術分野で標準的な経路であってよい。種々の態様では、有効量は経路の組合せによって送達される。例えば、種々の態様では、有効量は静脈内でおよび筋肉内で、または静脈内でおよび脳室内で、またはその同等の方法で送達される。いくつかの態様では、有効量は順を追って、または連続的に送達される。いくつかの態様では、有効量は同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、処置される感染症および／または疾患状態、ならびにＤＭＰＫを発現する細胞などの標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は筋肉内投与である。いくつかの実施形態では、投与経路は静脈内投与である。

【0099】

特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示に従う投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注射および／または直接脳もしくは他の器官への注射が含まれるがこれに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するのみで、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと共投与できる他の成分に既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避すべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

【0100】

筋肉内注射を目的として、ゴマ油や落花生油などのアジュバント溶液、または水性プロピレングリコール溶液、および滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。

【0101】

注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。いくつかの態様では、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0102】

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

【0103】

用語「形質導入」は、レシピエント細胞によるＤＭＰＫ抑制ＲＮＡの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのＤＭＰＫ抑制ＲＮＡの投与／送達を指すように使用される。

【0104】

一態様では、ｒＡＡＶを用いた形質導入はインビトロで実行される。一実施形態では、所望の標的細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶを用いて形質導入され、対象に再導入される。代替的には、同系または異種細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種細胞が使用され得る。

【0105】

対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによって、インビトロで形質導入され得る。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。

【0106】

本開示は、有効量（または実質的に同時に投与される投与量、もしくは間隔をあけて投与される投与量）の抑制ＲＮＡをコードするｒＡＡＶ、およびＤＭＰＫを標的とするｓｈＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡを含む抑制ＲＮＡの組合せをコードするｒＡＡＶを、その必要がある対象へ投与する方法を提供する。

【0107】

本開示のｒＡＡＶを有する細胞を形質導入することで、ＤＭＰＫ発現を標的とする抑制ＲＮＡの持続的な発現が生じる。したがって本開示は、抑制ＲＮＡを発現するｒＡＡＶを、対象に投与／送達する方法を提供する。こうした対象は動物対象であり、いくつかの態様では対象はヒトである。

【0108】

こうした方法には、血管系、中枢神経系および組織（筋細胞および神経細胞、骨格筋を含む筋肉などの組織、心臓、脳、皮膚、眼などの器官、ならびに内分泌系、ならびに内分泌腺および口腔腺などの腺を含むがこれに限定されない）に、本開示の１つまたは複数のｒＡＡＶを用いて形質導入することを含む。いくつかの態様では、形質導入は組織特異性制御要素を含む遺伝子カセットを用いて行われる。例えば、本開示の一実施形態は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい）、筋細胞特異的エンハンサ結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御エレメント（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心臓アクチン遺伝子、筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９）（１９８９）を参照されたい）およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサ（ｍＣＫ）エレメント、急収縮性骨格トロポニンＣ遺伝子、遅収縮性心筋トロポニンＣ遺伝子、および遅収縮性心筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント：低酸素誘導性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性エレメントおよびプロモータ（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ｔＭＣＫプロモータ［Ｗａｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：１４８９－１４９９（２００８）を参照されたい］、ＣＫ６プロモータ［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい］およびその他の制御エレメントを含むものに由来するものを含むが、これらに限定されない筋特異的制御エレメントによって指示される筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。

【0109】

ＡＡＶはＤＭ１に冒された器官全てを標的とするため、本開示は、抑制ＲＮＡをコードするＤＮＡの、対象の全細胞、全組織および全器官への送達を含む。いくつかの態様では、血管系、中枢神経系、筋組織、心臓および脳はインビボでのＤＮＡ送達のための誘引標的である。本開示は、ＤＭＰＫ発現に影響を与える（例えば、発現のノックダウンもしくは抑制）か、またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＵＧリピート伸長に干渉する、形質導入細胞由来のｓｈＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡの持続的な発現を含む。いくつかの態様では、本開示は、形質導入筋繊維由来のｓｈＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡの持続的な発現を含む。「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。こうした筋細胞はいくつかの態様では、筋原細胞、ミオサイト、筋管、心筋細胞および心筋原細胞などに区別されるか、または区別されない。

【0110】

更に別の実施形態では、本開示は、ＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡをコードするｒＡＡＶと細胞との接触を含む、細胞内のＤＭＰＫ遺伝子の発現を防止または抑制する方法を提供する。この場合、ＲＮＡは配列番号：２０～３６に明記されたＤＮＡによってコードされる。いくつかの態様では、ＤＭＰＫの発現は、少なくとも約５パーセント、約１０パーセント、約１５パーセント、約２０パーセント、約２５パーセント、約３０パーセント、約３５パーセント、約４０パーセント、約４５パーセント、約５０パーセント、約５５パーセント、約６０パーセント、約６５パーセント、約７０パーセント、約７５パーセント、約８０パーセント、約８５パーセント、約９０パーセント、約９５パーセント、約９６パーセント、約９７パーセント、約９８パーセント、約９９パーセント、または約１００パーセントだけ抑制される。いくつかの態様では、ＣＴＧリピート数の発現は、少なくとも約５パーセント、約１０パーセント、約１５パーセント、約２０パーセント、約２５パーセント、約３０パーセント、約３５パーセント、約４０パーセント、約４５パーセント、約５０パーセント、約５５パーセント、約６０パーセント、約６５パーセント、約７０パーセント、約７５パーセント、約８０パーセント、約８５パーセント、約９０パーセント、約９５パーセント、約９６パーセント、約９７パーセント、約９８パーセント、約９９パーセント、または約１００パーセントだけ抑制される。

【0111】

更に別の態様では、本開示は、ＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡをコードするＡＡＶを、対象に投与することを含む筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１および／またはＤＭ２を含むがこれに限定されない）を予防または処置する方法を提供する。この場合、ＤＭＰＫ
ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡは、配列番号：２０～３６に明記されたポリヌクレオチドのうちいずれか１つによってコードされている。いくつかの態様では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠損している。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。

【0112】

「処置」は、筋強直性ジストロフィーの１つまたは複数の症状（筋消耗、筋力低下、筋強直症、骨格筋の問題、心臓機能の異常、呼吸困難、白内障、発話および嚥下に関する課題（構音障害および嚥下障害）、認知障害、日中の過度な眠気、または糖尿病の症状を含むがこれに限定されない）を回復または抑制させることを含む。

【0113】

分子的、生物学的、組織学的および機能的なエンドポイントは、ＤＭＰＫ ｓｈＲＮＡとｓｎＲＮＡの治療有効性を立証する。本開示によって考えられたエンドポイントは、ＤＭＰＫタンパク質の発現の減少もしくは消失、核内のタンパク質機能に干渉するＣＴＧリピート（すなわち毒性リピート）の減少もしくは消失、ならびに／または、例えばＣＬＣＮ（およびＣＬＣＮ１、ＣＬＣＮ２、ＣＬＣＮ３、ＣＬＣＮ４、ＣＬＣＮ５、ＣＬＣＮ６なと）、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、ＭＬＢＮ２およびＩＲを含むがこれに限定されない遺伝子内の正常な遺伝子スプライシングパターンの修復、ならびに／またはＣＥＬＦ１およびＭＢＬＮ１の発現の減少、ならびに／または核内フォーカスもしくはＣＵＧフォーカス（ＭＢＬＮ１のような遺伝子を捕捉するフォーカスを含む）の数の減少または中央核形成（ｃｅｎｔｒｏｎｕｃｌｅａｔｏｉｎ）の減少を含むがこれに限定されない筋強直性ジストロフィー症状の減少もしくは消失、ならびに筋電図検査を用いて検査されるような筋肉の過剰興奮性の回復のうち、１つまたは複数を含む。

【0114】

本開示はまた、ＤＭ１の新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）誘導マウスモデルを提供する。ＤＭ１（ｉＤＭ１）の誘導性多系統性マウスモデルは、ＡＡＶウイルスベクターを用いる毒性ＣＴＧ^ｅｘｐ（ヒトＤＭＰＫエクソン１５の状況内で）を送達することによって生成された。この理由はＡＡＶがＤＭ１に冒された器官全てを標的としていることであった。これにより誘導モデルを有することで複雑かつ非効率的なマウスの繁殖を行う必要がなくなる。毒性リピートはその自然な状況の中で発現されることから、このモデルは、遺伝子導入育種の不安定さに遭遇するといった困難を抱えることなく、ＤＭ１の治療学を迅速に評価するといった点で使用するために、ＤＭ１表現型を完全に再現するように設計された。

【0115】

ｉＤＭ１モデルの作製においては、４８０ＣＴＧリピートおよびＧＦＰタグ（すなわち、「ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０」）を含むヒトＤＭＰＫエクソン１５の発現が細胞核内で蓄積することが可能であり、ＤＭ１患者にて見られる筋肉ブラインド様タンパク質１（ＭＢＬＮ１）を捕捉するであろうフォーカスを形成することが、インビトロで最初に確認された。ヒトＤＭＰＫエクソン１５およびＧＦＰタグ（ＣＴＧリピートなし）のみを含む対照（すなわち、「ＧＦＰ－ＣＴＧ０」）は、その毒性がコンストラクトのバックボーンに関連しないことを確認するために使用された。ＭＢＬＮ１は、筋原細胞内で高度に発現し、特別なヒト線維芽細胞の細胞株（Ｃ１９ＧＳＫ＿ ｈｔＭｙｏＤ）はこの実験を実施するのに使用された。この細胞株は、筋原細胞へと分化転換させる能力を有している。これはこの細胞が、筋形成のためのマスター遺伝子である筋性分化（ＭｙｏＤ）遺伝子をコードするレンチウイルスに感染していたからである。感染９６時間後、ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０コンストラクトは、架橋インテグレータ１（ＢＩＮ１）およびインスリン受容体（ＩＮＳＲ）のスプライシングパターンを変性することができ、２つの遺伝子はＭＢＬＮ１が不在の状態でミススプライシングされる。

【0116】

このコンストラクトがインビボでＤＭ１表現型を誘発するかどうかを評価するため、ＣＭＶ．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０コンストラクトはＡＡＶ（すなわち、「ＡＡＶ６．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０」）へとパッケージされ、ＡＡＶ６．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０は、４週齢の野生型マウスに筋肉内注射された。２つの異なる投与量（動物あたり３ｅ１０および１ｅ１１ウイルスゲノム（ｖｇ））を使用した。注射４週間後、ＡＡＶ６．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０は、核内フォーカス形成、ＢＩＮ１および筋形質／筋小胞体カルシウムアデノシントリフォスファターゼ１（ＳＥＲＣＡ１）スプライシングにおける変性、および毒性ＲＮＡリピートを有するＭＢＮＬ－１の核内共局在などのＤＭ１特徴を誘発することができた。このＡＡＶ誘導マウスモデルの形成は、本明細書に記載されるように、インビボでの関連の有望なＤＭ１向け治療アプローチをより効果的に評価するための有用なツールを提供する。

【実施例0117】

実施例
本開示の態様および実施形態は、以下の実施例によって例示される。

【0118】

実施例１
ＤＭ１のマウスモデル
この実施例における実験の目的は、遺伝子導入育種の不安定さに遭遇するといった困難なしに研究を行うためにＤＭ１の誘導性多系統性マウスモデル（ｉＤＭ１）を生成かつ評価することであった。このモデルを生成するため、ヒトＤＭＰＫエクソン１５（５Ｅ１１ｖｇ）の状況内で毒性ＣＴＧ^ｅｘｐを発現するＡＡＶウイルスベクターを、両方の前脛骨（ＴＡ）筋／４週齢のオスおよびメスＣ５７ＢＬ／６マウスのグループへと筋肉内で注射した。リピートは自然な状況の中で発現され、かつＡＡＶはＤＭ１に冒された全ての器官を標的とすることから、このモデルはＤＭ１表現型を完全に再現しなければならない。

【0119】

４８０ＣＴＧリピートおよび緑色の蛍光（ＧＦＰ）タグを含むヒトＤＭＰＫエクソン１５（すなわち、ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０）の発現は、核内で蓄積し、ＤＭ１患者で見られるように、ＭＢＬＮ１を捕捉しうるフォーカスを形成するとインビトロで確認された。ＤＭＰＫエクソン１５を含む対照である、ＧＦＰ－ＣＴＧ０は、その毒性がコンストラクトのバックボーンに関連しないことを確認するために使用された。ＭＢＬＮ１は、筋原細胞内で大幅に発現し、特別なヒト線維芽細胞株（すなわちＣ１９ＧＳＫ＿ｈｔＭｙｏＤ）が使用された。この細胞株は、筋形成のためのマスター遺伝子であるＭｙｏＤをコードするレンチウイルスに感染した後、筋原細胞へと分化転換させる能力を有する。感染９６時間後、ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０コンストラクトは、架橋インテグレータ１（Ｂｉｎ１）遺伝子およびインスリン受容体（ＩＲ）遺伝子のスプライシングパターンを変性することができ、２つの遺伝子は、筋肉ブラインド様１（ＭＢＮＬ１）が不在の状態でミススプライシングされ、所定の結果を確認した。

【0120】

このコンストラクトがマウス内にて、インビボでＤＭ１表現型を誘発するかどうかを評価するため、ＣＭＶ．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０コンストラクトはＡＡＶ（ＡＡＶ６．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０）へとパッケージされ、オスとメスのＣ５７ＢＬ／６野生型マウスは、４週齢にてＴＡ筋へと筋肉内注射された。２つの異なる投与量（動物あたり３ｅ１０および１ｅ１１ウイルスゲノム（ｖｇ））を使用した。図５Ａに示すように、注射４週間後、ＡＡＶ６．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０ベクターは、ＡＡＶ６誘導マウスモデルに、中心核形成、塩素チャネルタンパク質、骨格筋（ＣＬＣＮ）および筋形質／筋小胞体カルシウムアデノシントリフォスファターゼ１（ＳＥＲＣＡ－１）、筋肉ブラインド様２（ＭＢＮＬ２）、およびインスリン受容体（ＩＲ）などの複数の遺伝子のスプライシングの変性といったＤＭ１特徴を誘発させることができた。これらの遺伝子のスプライシング変性は、本明細書にて上に記載されるように、患者においてはＤＭ１に関連する一般的な特徴であるため、これらの結果は、インビボで、筋肉にＤＭ１特徴を誘発させるＡＡＶ．ＧＦＰ－ＣＴＧ４８０アプローチの能力を立証している。したがって、この実施例は、ＤＭ１の新規の誘導性多系統性マウスモデル（ｉＤＭ１）を提供する。

【0121】

実施例２
ＤＭ１のマウスモデルにおけるリピート伸長の全身送達
この実施例における実験の目的は、心臓および横隔膜を含む中枢神経系（ＣＮＳ）および全筋肉を標的とする抑制ＤＭＰＫ ＲＮＡを含むＡＡＶ９コンストラクトを、全身静脈内送達する効果を観察することである。ＤＭ１は多系統性障害であるため、複数の冒された器官においてＣＵＧ毒性リピートを効率的に同時並行で発現させることができるアプローチには大きな価値がある。ＡＡＶ９．ＣＴＧ０およびＡＡＶ９．ＣＴＧ４８０ベクターを、５Ｅ１１ｖｇ／動物を用いる顔面静脈注射により、新生児のオスとメス両方の動物（ｎ＝１０）の顔面静脈に生後１～２日の時点（Ｐ１～Ｐ２）で注射することで、全身に送達させる。１０匹のＰＢＳ注射済マウスは対照の役割を担う。評価は、注射手順に関与していない個々の実験者により盲検法で実施される。

【0122】

ＡＡＶ９コンストラクトを用いた注射４週間後と１２週間後に、これらのマウスのＴＡは筋電図検査（ＥＭＧ）、力測定を用いて解析され、盲検および無作為法にてスプライシング変性について評価される。筋緊張性ジストロフィーはＤＭ１患者の最も一般的な症状の１つであるため、筋緊張性ジストロフィーは筋電図検査（ＥＭＧ）を使用して筋肉の過興奮性をテストすることにより電気生理学的に定量化されます［Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６５２）：１９７８－８０（２００３）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ。投資する。６０３－６０４（２００１）に記載されている。Ｓｔａｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＭＡ ３０８（１３）：１３５７－６５（２０１２）］。ＥＭＧにおけるミオトニー電位はＴＡ筋から記録され、ＤＭ１患者における筋強直症の臨床ＥＭＧ評価に関する実験を用いて盲検評価者により定量化される［Ｋａｎａｄｉａ（上記）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記）；Ｓｔａｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（上記５）］。ＥＭＧによる筋強直症の重症度は、ＤＭ１表現型の発症を同定している、単純な翻訳読み出しとして使用される。加えて、筋力評価検査が行われる。等尺性筋力（強度評価を提供している）および伸縮性収縮（筋鞘安定性を評価する）はまた、エクスビボのＴＡ標本において測定される。検査結果は、毒性リピートのウイルス送達後、この動物モデルにおける筋強直症の存在を示す。

【0123】

加えて、そのスプライシングパターンがＭＢＬＮ－１によって調節される遺伝子であるＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ１、ＩＲ、およびＣＬＣＮ１のスプライシング変性は、ＲＴ－ＰＣＲによって検査される。ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ１、ＩＲおよびＣＬＣＮ１の異常スプライシングは、ＣＵＧ毒性リピートを用いて形質導入されたマウス内に存在する。核内ＣＵＧフォーカスの数が計測され、インサイチュでの蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）検査は、これらのフォーカスがＭＢＮＬ－１と共存しているかどうかを決定するために行われる。ＣＵＧフォーカスは、ＣＵＧ毒性リピートを用いて形質導入されたＤＭ１およびマウスではＭＢＬＮ１を捕捉する。

【0124】

ＣＥＬＦ－１がＤＭ１にて過剰発現するため、ローディング・コントロールタンパク質として抗ＣＥＬＦ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗－ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を用い、ＣＥＬＦ１のウェスタンブロット検出を回収された筋肉ホモジネートにて実施する。ＣＥＬＦ－１はＣＵＧ毒性リピートを用いて形質導入されたマウスにて過剰発現される。

【0125】

組織診断を行って線維サイズを測定し、中心核形成された線維の存在を確認する。ＴＡに加え、少なくとも腓腹筋、三頭筋、心臓、横隔膜および脳を含む他の筋肉は組織診断用に回収される。

【0126】

ＡＡＶ９が骨格筋および心筋の両方を形質導入するため、潜在的な筋強直症を伴うスプライス変性を引き起こす、複数の骨格筋および心臓内部の毒性ＲＮＡの核内蓄積が予測される。同様に、ＡＡＶ９が血液脳関門と標的とする神経を横断可能であることから、神経伝達欠陥が予測される。

【0127】

実施例３
ＤＭＰＫに特異的なＵ６ｓｈＲＮＡコンストラクト
この実施例は、ＤＭＰＫを標的とすることについて特異的である、Ｕ６ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列を提供する。これらのコンストラクトを合成し、ｐＡＡＶ．シャトルプラスミドへとクローニングした。アンチセンス標的配列は、「設計ルール」を用いて予測された［Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５（２）：１９９－２０８（２００３）；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １１５：２０９－１６（２００３）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３２６－３０（２００４）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ １３：１７６５－７４（２００７）］。コンストラクトの５’末端にある下線で強調されたヌクレオチド配列は、マウスＵ６プロモータをコードする。太字のヌクレオチド配列は、ショートヘアピンＲＮＡをコードする。コンストラクトの３’末端にある下線で強調されたヌクレオチド配列は、Ｕ６ターミネータをコードする。

【0128】

＞Ｕ６．ｓｈ２５７７

【化1】

Ｕ６．ｓｈ２５７７ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＡＣＴＣＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡ（配列番号：３）

【0129】

＞Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８

【化2】

【化3】

Ｕ６Ｔ６．ｓｈ４３６４－ｅｘ８ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧ（配列番号：４）

【0130】

＞Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５

【化4】

Ｕ６Ｔ６．ｓｈ５４７５－ｅｘ５ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧ（配列番号：５）

【0131】

＞Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６

【化5】

Ｕ６Ｔ６．ｓｈＤ６ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＡ（配列番号：６）

【0132】

＞Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２６８３

【化6】

Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２６８３ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＣＴＡ（配列番号：７）

【0133】

実施例４
ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするＵ６ｓｈＲＮＡ
この実施例は、Ｕ６ｓｈＲＮＡが毒性ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの発現に干渉するのに使用され得るかどうかを決定するために実施された実験を開示している。ＡＡＶはＤＭＰＫ ｍＲＮＡまたはＣＵＧリピート自身を標的とするｓｈＲＮＡを送達するのに使用された。これらの実験で使用されたＵ６ｓｈＲＮＡコンストラクトの配列は、実施例３と図１Ａ～図１Ｅで上にて提供される。

【0134】

Ｕ６プロモータの制御下で、ヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ（ｓｈ２５７７、ｓｈ２６８３）を標的とするｓｈＲＮＡを含むＡＡＶベクターが構築された。これらのアンチセンスＲＮＡは、ＤＭＰＫ ＲＮＡの３’非翻訳領域を標的とする。対照として、ＤＭＰＫのコード領域に対する確立された標的（ｓｈＲＮＡ ＤＨ６．５またはｓｈＤＨ６．５）［Ｓｏｂｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（２）：３８０－７（２０１３）］が使用された。ヒトＤＭ１の初代線維芽細胞（ＧＭ０３１３２、Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用し、ＤＭＰＫをノックダウンするこれらのｓｈＲＮＡの能力を評価した。

【0135】

ＭＢＬＮ１は筋原細胞で更に大量に発現されることから、線維芽細胞はＭｙｏＤを発現するレンチウイルスを用いて筋原細胞へと変換された。細胞は、翌日には約５０％の培養密度を有するように、１２ウェルプレートに３０％の培養密度にて播種された。レンチウイルスの形質導入を目的として、２～５ｅ９ｖｇ／ｍＬの各レンチウイルス（ｈｔｅｒｔ－ピューロマイシンおよびドキシサイクリン誘導性Ｍｙｏ－Ｄ－ハイグロマイシン）を、４００μＬの増殖培地に加えた。１ｍｌの培地を翌日に加えた。１～２日後に、細胞を６ウェルプレートに播種し、７０％の培養密度に達するまで増殖させた。この時点において、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンと１μｇ／ｍＬのプロマイシンを増殖培地に補充した。細胞を少なくとも１２日間にわたり、選択圧下で維持した。培地を２～３日ごとに変えた。１０ｃｍの皿をラミニン（ＴＢＳを用いた０．５ｍｇ／ｍｌのストック溶液（ｐＨ７．４）、ＨＢＳＳを用いた１００μｇ／ｍｌの使用溶液）でコーティングした。適正な量のラミニンを加えた後、皿を３７℃で２時間インキュベートさせた。次に、皿をＰＢＳで３回すすいだ。１０ｃｍのラミニンでコーティングした皿を使用し、５０％の培養密度最大値にて線維芽細胞を播種した。筋原細胞を誘導するため、線維芽細胞が７０％の培養密度に達した際には培地を筋原細胞培地と交換した（新たに作製した４μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで補充した）。２～３日後、細胞は９０～９５％コンフルエントな状態であり、その細胞の形態は変化した。培地を分化培地と交換した（新たに作製した４μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで補充した）。

【0136】

誘導ＤＭ１筋原細胞は次に、ＡＡＶ．Ｕ６．ｓｈＲＮＡ（ｓｈ２５７７、ｓｈ２６８３、またはｓｈＤＨ６．５）ベクターを用いて形質導入された。ｓｈＲＮＡ ２５７７および２６８３は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域を標的とし、ｓｈＲＮＡ ＤＨ６．５はＤＭＰＫコード領域を標的とする。感染の２日後、細胞にＲＴ－ｑＰＣＲおよびノーザンブロットアッセイを行った。両方のアッセイは、毒性ＤＭＰＫ転写物のＲＮＡ発現が減少したことを立証した。ｒＡＡＶ．ｓｈＲＮＡで処置されたＤＭ１筋原細胞から単離された、全てのｍＲＮＡにおけるＤＭＰＫ発現のＲＴ－ｑＰＣＲは、ｓｈＲＮＡ（２６８３、２５７７、およびＤＨ６．５）がＤＭＰＫ発現を減少可能であることを示した（図３Ａ）。指示されたＡＡＶ．ｓｈＲＮＡを用いた感染後の全てのＲＮＡのノーザンブロット解析は、伸長されたＤＭＰＫ転写物である「［ＣＴＧ］２０００」における減少を立証した（図３Ｂ）。これらの実験は、ｓｈ２５７７およびｓｈ２６８３の両方のＵ６ｓｈＲＮＡコンストラクトは、筋原細胞におけるＤＭＰＫ転写物を効率的にノックダウン可能であったことを示す。

【0137】

実施例５
ＤＭＰＫに特異的なＵ７ｓｎＲＮＡコンストラクト
この実施例は、標的化された配列および逆相補配列の識別を含む、ＤＭＰＫのリーディングフレームを切断するように特異的に設計されたＵ７ｓｎＮＡコンストラクトの配列を提供する。４つの配列はエクソン５（図２Ａ～図２Ｄ）を標的とするように設計された。４つの配列はエクソン８（図２Ｅ～図２Ｈ）を標的とするように設計され、４つの配列は、ＤＭＰＫ遺伝子の全てである非翻訳エクソン１５（図２Ｉ～図２Ｌ）におけるＣＴＧリピートを標的とするように設計された。これらのコンストラクトを合成し、ｐＡＡＶ．シャトルプラスミドへとクローニングした。アンチセンス標的配列は、ヒト・スプライシングのファインダーウェブサイト（ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ３／）を用いて予想された［Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（９）：Ｅ６７（２００９）］。

【0138】

エクソン「５」を標的とする

【0139】

＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７
標的とする配列：ＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴ（配列番号：３７）
逆相補配列：ＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴ（配列番号：８）

【化7】

＃１ ３９ｂｐ：－２＿３７ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴ（配列番号：８）

【0140】

＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４
標的とする配列：ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡ（配列番号：３８）
逆相補配列：ＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧ（配列番号：９）

【化8】

＃２ ４９ｂｐ：７０＿＋２４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＴＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧ（配列番号：９）

【0141】

＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２
標的とする配列：ＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧｇｔ（配列番号：３９）
逆相補配列：ａｃＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号：１０）

【化9】

＃３ ３５ｂｐ：６２＿＋２ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣ（配列番号：１０）

【0142】

＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１
標的とする配列：ｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇａｃｃａｃａｇａａｇｇｇａｇｇｔｔｃａｔｔ（配列番号：４０）
逆相補配列：ａａｔｇａａｃｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇｔｇｇｔｃｃｃａｃｃａｇｇｃ（配列番号：１１）

【化10】

【化11】

＃４ ３１ｂｐ：－６１＿－３１ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＡＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣ（配列番号：１１）

【0143】

エクソン「８」を標的とする

【0144】

＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４
標的とする配列：ＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号：４１）
逆相補配列：ＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：１２）

【化12】

＃１ ３９ｂｐ：－５＿３４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：１２）

【0145】

＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６
標的とする配列：ＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣ（配列番号：４２）
逆相補配列：ＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡ（配列番号：１３）

【化13】

【化14】

＃２ ３９ｂｐ：２７＿６６ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡ（配列番号：１３）

【0146】

＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２：
標的とする配列：ＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧｇｔ（配列番号：４３）
逆相補配列：ａｃＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＡＧ（配列番号：１４）

【化15】

＃３ ２９ｂｐ：６０＿＋２ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＧＴＡＧ（配列番号：１４）

【0147】

＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４
標的とする配列：ｇａｃｇａｃｔｇｃｔｇｃｔｃａｃａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｃｔｔｇｃｇｃａｇＧＡＧＡ（配列番号：４４）
逆相補配列：ＴＣＴＣｃｔｇｃｇｃａａｇａｃａｃａｃａｇａｔｇｔｇａｇｃａｇｃａｇｔｃｇｔｃ（配列番号：１５）

【化16】

＃４ ３９ｂｐ：－３５＿４ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＣ（配列番号：１５）

【0148】

ＣＴＧリピートを標的とする

【0149】

＞Ｕ７－１５ＣＴＧ
標的とする配列：ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４５）
逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１６）

【化17】

Ｕ７－１５ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１６）

【0150】

＞Ｕ７－２０ＣＴＧ
標的とする配列：：ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４６）
逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１７）

【化18】

Ｕ７－２０ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１７）

【0151】

＞Ｕ７－５’ＣＴＧ
標的とする配列：ＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号：４７）
逆相補配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号：１８）

【化19】

Ｕ７－５’ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号：１８）

【0152】

＞Ｕ７－３’ＣＴＧ
標的とする配列：ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣ（配列番号：４８）
逆相補配列：ＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１９）

【化20】

Ｕ７－３’ＣＴＧ ＤＭＰＫを標的とするアンチセンス配列：ＧＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号：１９）

【0153】

実施例６
ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするためのＵ７ｓｎＲＮＡの使用
この実施例は、核内フォーカスを形成する毒性ＲＮＡを含むＤＭＰＫ転写物をノックダウンするか、またはこれに干渉するためのＤＭＰＫ ｍＲＮＡまたはＣＵＧリピート自身を標的とする、Ｕ７ｓｎＲＮＡコンストラクトを送達するためのＡＡＶの使用を開示している。遺伝子治療ベクターに包埋される場合、これらのｓｎＲＮＡは標的細胞で恒久的に発現され得る。

【0154】

ＤＭＰＫ転写物をノックダウンするか、またはこれに干渉するため、１２個のコンストラクトが設計され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）に注文された。８個のコンストラクトは、ヒト・スプライシングファインダー［Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（９）：ｅ６７，２００９）；（ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦ３／）］およびオンラインのバイオインフォマティクスツールを用いて設計され、スプライシングシグナルを予想した。８個のコンストラクトは、ＤＭＰＫ転写物のエクソン５（ｎ＝４；５＃１、５＃２、５＃３、５＃４）またはエクソン８（ｎ＝４；８＃１、８＃２、８＃３、８＃４）のいずれかを読み飛ばすように設計された。４個の追加コンストラクト（１５ＣＡＧ、２０ＣＡＧ、５’ＣＡＧ、３’ＣＡＧ）は、ＤＭＰＫリピート伸長を標的とするように設計された。これらのコンストラクトの配列は、実施例５および図２Ａ～図２Ｌに明記される。

【0155】

コンストラクトを、ｑＰＣＲプローブを含むｐＡＡＶ．シャトルプラスミド内でクローニングし（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（５）：２５０９－１４，１９９８）、ウイルス、５’および３’末端逆位配列およびカナマイシン耐性遺伝子を定量化した。コンストラクトおよびＧＦＰ対照は２９３個の細胞内にトランスフェクトされた。細胞は遺伝子導入後３６時間で停止された。ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲを実施した。細胞からのＲＮＡ抽出は、３２５μＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）を用いて実行された。細胞可溶化物は、Ｒ１０５４ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてカラムに加えられた。ＲＮＡ抽出は、製造者のプロトコルに従って実行された。次に逆転写は、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ ＲＴ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用して、５００ｎｇのＲＮＡを用いて実施された。１５０ｎｇの逆転写酵素は、各ＰＣＲのために使用された。エクソン３およびエクソン６（エクソン５スキッピングのために探索する）、またはエクソン７およびエクソン１０（エクソン８スキッピングのために探索する）のいずれかにてプライマーを用いて、ＰＣＲは実行された。

【0156】

現在までのＲＴ－ＰＣＲ結果は、コンストラクト８＃２およびコンストラクト８＃３が、エクソン８のスキッピングを誘導可能であると示した。

【0157】

実施例７
ＡＡＶ．４８０ＣＴＧは、マウス内のＤＭ１－関連遺伝子においてスプライシング変性を引き起こす
この実施例は、ＡＡＶ．４８０ＣＴＧがマウス内のＤＭ１－関連遺伝子においてスプライシング変性を引き起こすかどうかを決定するために実行された実験からの実験結果を提供する。マウスは、上記の実施例２にて本明細書に記載されるように、ＡＡＶ．４８０ＣＴＧコンストラクトを用いて注射された。ウイルスコンストラクトによる注射の２週間後、ＲＮＡ抽出は、ＡＡＶ．４８０ＣＴＧまたはＡＡＶ．０ＣＴＧのいずれかを用いて注射された筋肉からの１５×３０μｍ切片において、５００μＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）を用いて実施された。次に、製造者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））に従い、可溶化物をＴＲＩｚｏｌ（商標）によって処理した。次に逆転写は、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用し、５００ｎｇのＲＮＡを用いて実施された。ＣＬＣＮ、ＳＥＲＣＡ１、ＭＢＬＮ２およびＩＮＳＲ遺伝子を増幅させるための種々の集合のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。１８ｓ遺伝子のＰＣＲを行い、相対的な発現を正規化した。１５０ｎｇのＲＴは、各ＰＣＲのために使用された。

【0158】

ＲＴ－ＰＣＲ結果は、ウイルスコンストラクトを用いた注射２週間後の、ＣＬＣＮ１、ＳＥＲＣＡ１、ＭＢＬＮ２およびＩＲ遺伝子の、コンストラクト４８０ＣＴＧ変性スプライシングを示した。ＤＭ１患者では、注射されたマウスにて観察されるように、マウスにおいてはこのコンストラクトがＤＭ１表現型をインビボで誘導したことを示していることから、ＣＬＣＮ１、ＳＥＲＣＡ１、ＭＢＬＮ２およびＩＲはミススプライスされている。

【0159】

実施例８
ＦＩＳＨによる、ＭＢＮＬを用いた核内ＣＵＧフォーカスおよび共局在の定量化
ＣＵＧフォーカスの検出は、標準的な手順を用いて、固定された凍結細胞または新鮮な凍結組織切片（１０μｍ）のいずれかにおいて、Ｃｙ３－（ＣＡＧ）１０プローブを用いて成し遂げられた。細胞は、室温（ＲＴ）で１０分間にわたり、１倍のＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（または１０％のＮＢＦ）を用いて固定し、次に１倍のＰＢＳで３回洗浄（各３分間）した。次に細胞は、室温で５分間にわたり、ＰＢＳ中の１ｍＬの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで透過処理し、室温で１倍ＴＢＳを用いて２回洗浄した。細胞を室温で２時間にわたり、ＴＢＳ中の１％のＢＳＡを有する、１０％の標準的なヤギ血清中でブロックし、真空トラップを用いて排出した。細胞を４℃で一晩かけて、１％のＢＳＡを有するＴＢＳ中の一次抗体（マウス抗－ＭＢＮＬ、１：５００に希釈）を用いてインキュベートした。次の日、細胞を０．０２５％のＴｒｉｔｏｎを有するＴＢＳ中で３分間にわたり２回すすいだ。次に細胞を１倍のＴＢＳで１回洗浄した。細胞を室温で１時間にわたり、二次抗体（ヤギ－抗－マウス Ａ４８８、１：５００に希釈）を用いてインキュベートした。次に、１倍のＴＢＳで１回、室温でＰＢＳを用いて２回（それぞれ３分）、室温で１０分間にわたって１ｍＬの３０％ホルムアミド、２倍のＳＳＣを用いて洗浄した。

【0160】

次にＦＩＳＨプローブに、３７℃で２時間にわたって、３０％のホルムアミド、２倍のＳＳＣ中の２μｇ／ｍＬのＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、１ｎｇ／μＬのＣｙ３－（ＣＡＧ）１０を加えた。次に細胞を、３７℃で３０分間にわたって、３０％のホルムアミド、２倍のＳＳＣで洗浄した。細胞を、室温で３０分間にわたって１倍のＳＳＣで洗浄し、室温で２５～３０分間にわたって１倍のＰＢＳでＮｕｃＢｌｕｅプローブを用いて染色した（ｍＬあたり２滴のＰＢＳを加えた）。細胞を１倍のＰＢＳで１回洗浄し、次にＣＣ／Ｍｏｕｎｔで標本作成してカバーガラスをかけた。ＣＵＧフォーカスの定量化は、５つの無作為な顕微鏡下で重複しない２０倍領域およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化された核内フォーカスの数を選択することによって成し遂げられた。Ｃｙ３－（ＣＴＧ）１０のセンスプローブは、陰性対照として機能させた。ＤＭＰＫ抑制ＲＮＡを用いた処置後、フォーカスおよびＭＢＬＮ１の共局在の減少を伴うＣＵＧフォーカス数の減少が観察された。ＣＵＧフォーカス数はＤＭ１に罹患している患者で増加するため、ＣＵＧフォーカスの減少は、本明細書で記載されるようにＤＭＰＫ抑制ＲＮＡ配列を用いた処置が有効であったことを示す。ＭＢＬＮ１はＤＭ１に罹患している患者において上昇するため、ＭＢＬＮ１の下方制御は、本明細書に記載されるようにＤＭＰＫ抑制ＲＮＡ配列を用いた処置が有効であったことを示す。

【0161】

実施例９
ＣＥＬＦ１のウェスタンブロット解析
ＤＭ１発病の重要な特徴はＲＮＡの核内蓄積であり、これはＣＵＧ結合タンパク質（ＣＵＧＢＰ）の機能を変性させることで、特異的プレ－ｍＲＮＡの異常選択的スプライシングを引き起こす。ＣＵＧＢＰ Ｅｌａｖ様ファミリーメンバー１（ＣＥＬＦ１）は、プレ－ｍＲＮＡ選択的スプライシングを調節するタンパク質ファミリーの一員であり、ｍＲＮＡ編集および翻訳にも関与する可能性がある。上昇したＣＥＬＦ１タンパク質レベルが、ＣＵＧリピートＲＮＡのフォーカスを含む核で見いだされた。本明細書に記載されるようにＤＭＰＫ抑制ＲＮＡが、ＤＭＰＫ翻訳およびＣＵＧ毒性リピートの蓄積をノックダウンするか、またはこれに干渉するかどうかを決定するため、ローディング・コントロールタンパク質として抗－ＣＥＬＦ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗－ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ）を用い、ＣＥＬＦ１のウェスタンブロット検出を回収した筋肉ホモジネートにて実施した。

【0162】

ＣＥＬＦ１はＤＭ１に罹患している患者において上昇するため、ＤＭＰＫ抑制ＲＮＡを用いて形質導入された細胞および組織におけるＣＥＬＦ１発現の下方制御は、本明細書にて記載されるようにＤＭＰＫ抑制ＲＮＡを用いた処置が有効であったことを示す。

【0163】

実施例１０
ＡＡＶ注射および送達
筋肉および脳の両方がＤＭ１に冒されているため、ベクターは全ての細胞内へと送達されるために注射される。マウスは、適切な齢（Ｐ１～１２週齢）にて、有効量（いくつかの実施例では、投与量はＰＢＳ（０．９％の塩化ナトリウム）中で希釈された最大３００μＬを用いて最大で約１Ｅ１５である）で注射される。いくつかの例では、用量および注射量は注射経路によって変化する。例えば、大半の例における量は、それぞれ、筋肉内注射、静脈内注射（顔面静脈または尾静脈）、脳室内注射、または小脳延髄内注射（大槽）のために、５０μＬ、５０μＬ、３００μＬを超えることがない、または５μＬもしくは１５μＬの最大１Ｅ１５ベクターゲノム／μＬを超えることがない。いくつかの例では、注射経路はプロモータおよびコンストラクトに基づいて変化し、これは筋肉内（例えば、前脛骨（ＩＭ））、血管内（例えば、尾静脈（ＴＶ）もしくは顔面静脈（ＦＶ））、脳室内注射（ＩＣＶ）、または小脳延髄内注射（例えば、大槽（ＩＣＭ／腰椎））であり得る。

【0164】

大半の例では、尾静脈注射は麻酔なしに実施されるが、マウスは円錐状の拘束内部に短時間静置される。他の注射は全て、顔面静脈およびＩＣＶを除き吸引を介し、ＩＰまたはイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ、５％誘導、２％維持）経由でケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔下にあるマウスに実施される。これら後者の手順のために、Ｐ１～Ｐ３動物に注射を実施することを理由に、麻酔は氷上に配置されることで実行される（以下に記載の冷凍麻酔プロセス）。注射後、動物は加熱パッド上に置かれる。麻酔されたマウスは、胸を地面につけて腹ばいになる姿勢から回復するまで観察された。

【0165】

筋肉内注射（最大約５０μＬの容量）：

【0166】

約２１日齢マウスと約８５日齢マウスは、イソフルオランで鎮静される。脚部は剪毛され、最大５０μＬのＡＡＶまたは０．９％の生理食塩水を前脛骨へと注射する。動物を加熱パッド上に置いて完全に回復するまで観察され、その後ケージに戻される。

【0167】

尾静脈注射（ＴＶ、容量範囲：約１５０～３００μＬ）：

【0168】

約２１日齢マウスと約８５日齢マウスは、尾静脈機器内に置かれた。尾部は白熱電球を用いて温められ、静脈を拡張させた。尾静脈が可視化されると、ＡＡＶ９またはＰＢＳが注射される。注射後、滅菌コットンパッドを注射部位に置き、あらゆる出血が止まるまで圧力を加えながら保持された。マウスをケージに戻す。

【0169】

槽内大槽（ＩＣＭ）／腰椎穿刺（容量範囲：約３～１５μＬ）：

【0170】

約２１日齢マウスと約８５日齢マウスは、イソフルオランで鎮静される。滅菌メスを用いて、１ｃｍの皮膚切開を頭蓋の基部にて行った。マイクロキャピラリー針を１ｍｍの深さで槽内部へと挿入し、ウイルス（例えばＡＡＶ）またはＰＢＳのいずれかを注射される。組織接着剤またはステープルを用いて切開部位を閉鎖した。動物を加熱パッド上に置いて完全に回復するまで観察され、その後ケージに戻される。皮膚切開は小さい範囲のみで行われているため、疼痛の薬物処方は必要ない。腰椎穿刺はＩＣＭ注射と同様であり、以下の非常に類似する工程に従った。椎骨であるＬ４とＬ５の間の髄腔内へとマイクロキャピラリー針を挿入したが、皮膚に切開を行うことはない。この注射は何ら外科手術を必要としない。

【0171】

ＩＣＶ注射（容量範囲：約３～５μＬ）：

【0172】

１～３日齢の子を氷上に配置することで麻酔する（以下に記載の凍結麻酔プロセス）。麻酔された子を清浄な面に配置し、親指と人差し指の間で着実に保持した。もう一方の手を用い、レーザ加工されたホウケイ酸ガラス製のマイクロチューブ針を眼（片側）の上約１ｍｍに、０．５～１ｍｍの深さで挿入する。５μＬ未満のウイルスまたはＰＢＳを挿入する。これは、実施するのに３分未満しか要さない最小限の侵襲性手順である。注射後、子を回復させるために加熱パッド上または保育器内に置く。動物が動いたら、母親と一緒にケージ内に戻して置く。

【0173】

顔面静脈注射（容量範囲：最大約５０μＬ）：

【0174】

１～３日齢の子を氷上に配置することで麻酔する（以下に記載の凍結麻酔プロセス）。麻酔された子を清浄な面に配置し、親指と人差し指の間で着実に保持した。もう一方の手を用いて、インスリン針を眼（片側）上約１ｍｍに、０．５～１ｍｍの深さで頭蓋静脈内に挿入する。５０μＬ未満のウイルスまたは０．９％の生理食塩水を挿入する。これは、実施するのに３分未満しか要さない最小限の侵襲性手順である。注射後、子を回復させるために加熱パッド上に置く。動物が動いたら、その母親と一緒にケージ内に戻して置く。

【0175】

ＤＭＰＫ抑制ＲＮＡをマウスに形質導入後、実験を行い（例えば、本明細書の上で記載されるように、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、ウェスタンブロット解析、ＦＩＳＨ解析などが行われる）、Ｕ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡがＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするか、および／またはＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧトリヌクレオチドリピートの発現に干渉するかどうかを決定する。

【0176】

本明細書に記載のＵ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡコンストラクトで処置されたマウスにおいて、例えばＣＬＣＮ（およびＣＬＣＮ１、ＣＬＣＮ２、ＣＬＣＮ３、ＣＬＣＮ４、ＣＬＣＮ５、ＣＬＣＮ６など）、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、ＭＬＢＮ２およびＩＲを含むがこれに限定されない遺伝子における標準の遺伝子スプライシングパターンの修復、ならびに／またはＣＥＬＦ１およびＭＢＬＮ１の発現の減少、ならびに／または核内フォーカス数もしくはＣＵＧフォーカス（ＭＢＬＮ１などの遺伝子を捕捉するフォーカスを含む）数の減少、または中心核形成の減少、ならびに筋電図検査を使用する筋肉の過剰興奮性の回復を含むがこれに限定されない、筋強直性ジストロフィー症状の減少または消失がある。

【0177】

実施例１１
Ｕ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡはＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするおよび／またはＤＭＳＸＬモデルにおけるＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧトリヌクレオチドリピートの発現に干渉する
ＤＭ１の病理学的特徴は、本明細書に開示されたＵ６ｓｈＲＮＡおよび／またはＵ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶの局所的筋肉内送達および／または全身送達に続き、特徴がはっきりとした、１０００ＣＴＧリピートを含むヒトＤＭＰＫを含むＤＭＳＸＬマウスモデルを用いて評価される［Ｈｕｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．８（１１）（２０１２）；８（１１）；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００３０４３］。

【0178】

注射４週間後および１２週間後に、マウスの前脛骨（ＴＡ）を、筋電図検査（ＥＭＧ）、力測定、スプライシング変性の評価を用いて解析する。ＤＭ１に罹患している患者では、筋強直症／筋硬直により、障害された運動制御および可動性が引き起こされる［Ｌｏｇｉｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７４（１８）：１４４１－８（２０１０）］。

【0179】

先行研究は、筋強直症が最も蔓延している症状のうちの１つであり、ＤＭ１患者の９０％により報告されることを立証した［Ｈｅａｔｗｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７９（４）：３４８－５７（２０１２）］。筋電図（ＥＭＧ）を使用して筋肉の過興奮性をテストすることにより、筋生理学的に筋緊張症を定量化することができます［Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６５２）：１９７８－８０（２００３）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ。調査１１７（１２）：３９５２－７（２００７）；Ｓｔａｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＭＡ ３０８（１３）：１３５７－６５（２０１２）］。ＥＭＧの筋緊張性電位は、ＴＡ筋から記録され、ＤＭ１患者の筋緊張の臨床ＥＭＧ評価の経験を持つ盲検評価者によって定量化されます［Ｋａｎａｄｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２（５６５２）：１９７８－１９８０（２００３）；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ。調査１１７（１２）：３９５２－７（２００７）；Ｓｔａｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＭＡ ３０８（１３）：１３５７－６５（２０１２）］。

【0180】

ＥＭＧによる筋強直症の重症度は、ＤＭ１表現型の発症を同定している、単純な翻訳読み出しとして使用される。加えて、力測定もまた実施される。２つの検査がエクスビボでのＴＡ標本：等尺性筋力（強度評価を提供している）および伸縮性収縮（筋鞘安定性を評価する）において実施される。この目的は、マウスの伸筋ＴＡ向けに分離された筋機能測定を実施することである。このアッセイは、インビトロでの分離された筋肉の等尺性筋力の評価に限定される。

【0181】

筋機能の評価には、麻酔下の動物から腱から腱まで筋肉を注意深く外科的に切除することが求められる。マウスの骨格筋を機能的に検査するには、最小でも４つの要素が必要となる。すなわち、（１）力生成を監視するための力トランスデューサ、（２）筋肉を興奮させる刺激装置および電極、（３）酸素化したリンガー溶液で筋肉を灌流させる浴、ならびに（４）力生成を記録する装置である。腱を切除する間、筋肉は脚部に結合させた状態で維持され、マウスから血流および酸素流を受け取り続ける。比較目的のため、全ての力測定は、単位横断領域ごとに表される（正規化された等尺性筋力または張力：ｍＮ／ｍｍ^２）。横断領域（ＣＳＡ）は、以下の等式：ＣＳＡ＝（ｇでの筋肉質量）／［ｃｍでの最適な線維長さ］×（ｇ／ｃｍ^３での筋密度）］であり、式中、筋密度は１．０６ｇ／ｃｍ^３である等式を用いて計算される。

【0182】

遺伝子スプライシング変性（例えば、ＣＬＣＮ１、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、およびＭＬＢＮ２）は、ＲＴ－ＰＣＲにより評価される。更に、核内ＣＵＧフォーカス数を定量化する（本明細書の上にて記載される）。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ＣＵＧフォーカスがＭＢＮＬ－１と共存しているかどうかを決定するために確認に使用される（本明細書の上にて記載される）。更に、ＣＥＬＦ－１のウェスタンブロット解析はＣＥＬＦ－１が過剰発現されているかどうかを決定するために行われる。組織診断を行って筋線維サイズを測定し、中心核形成された線維の存在を確認する。筋電図検査を用いて筋肉を検査する。

【0183】

本明細書に記載のＵ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡコンストラクトで処置されたマウスにおいて、例えばＣＬＣＮ１、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、ＭＬＢＮ２およびＩＲを含むがこれに限定されない遺伝子における標準の遺伝子スプライシングパターンの修復、ならびに／またはＣＥＬＦ１およびＭＢＬＮ１の発現の減少、ならびに／または核内フォーカス数もしくはＣＵＧフォーカス（ＭＢＬＮ１などの遺伝子を捕捉するフォーカスを含む）数の減少、または中心核形成の減少、ならびに筋電図検査を使用する筋肉の過剰興奮性の回復を含むがこれに限定されない、筋強直性ジストロフィー症状の減少または消失がある。

【0184】

実施例１２
Ｕ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡはＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするおよび／またはｉＤＭ１モデルにおけるＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧトリヌクレオチドリピートの発現に干渉する
ＤＭ１の病理学的特徴は、本明細書に記載のＵ６ｓｈＲＮＡおよび／またはＵ７ｓｎＲＮＡコンストラクトを含むＡＡＶ（本明細書の実施例１０に記載）の送達後のｉＤＭ１モデル（本明細書の実施例１および２に記載）で評価される。

【0185】

注射の４週間後および１２週間後、マウスの前脛骨（ＴＡ）を抽出した。細胞および組織を組織診断のために解析する。筋肉の健康状態は筋電図検査（ＥＭＧ）および力測定を用いて検査される。細胞および組織は、スプライシング変性、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロット、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析のために評価される。遺伝子スプライシング変性（例えば、ＣＬＣＮ１、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、および／またはＭＬＢＮ２）は、ＲＴ－ＰＣＲにより評価される。更に、核内ＣＵＧフォーカス数を定量化する（本明細書の上にて記載される）。ＦＩＳＨは、ＣＵＧフォーカスがＭＢＮＬ－１と共存しているかどうかを決定するために確認に使用される（本明細書の上にて記載される）。更に、ＣＥＬＦ－１のウェスタンブロット解析はＣＥＬＦ－１が過剰発現されているかどうかを決定するために行われる。組織診断を行って筋線維サイズを測定し、中心核形成された線維の存在を確認する。筋電図検査および力測定を用いて筋肉を検査する。

【0186】

本明細書に記載のＵ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡコンストラクトで処置されたマウスにおいて、例えばＣＬＣＮ１、ＢＩＮ１、ＳＥＲＣＡ－１、ＭＬＢＮ１、ＭＬＢＮ２およびＩＲを含むがこれに限定されない遺伝子における標準の遺伝子スプライシングパターンの修復、ならびに／またはＣＥＬＦ１およびＭＢＬＮ１の発現の減少、ならびに／または核内フォーカス数もしくはＣＵＧフォーカス（ＭＢＬＮ１などの遺伝子を捕捉するフォーカスを含む）数の減少、または中心核形成の減少、ならびに筋電図検査を使用する筋肉の過剰興奮性の回復を含むがこれに限定されない、筋強直性ジストロフィー症状の減少または消失がある。

【0187】

実施例１３
ヒト細胞におけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンするＵ６ｓｈＲＮＡ
この実施例は、インビトロにてＰＡＮＣ－１細胞およびＨＥＫ２９３細胞を用いてヒトＤＭＰＫ発現を減少させるために、ＤＭＰＫ転写物をノックダウンまたはこれに干渉するようＤＭＰＫ ｍＲＮＡを標的とするＵ６ｓｈＲＮＡコンストラクト（すなわち、３’ＵＴＲに結合するように標的化された）を送達するためのＡＡＶの使用を開示している。

【0188】

ヒト膵臓癌細胞（すなわちＰＡＮＣ－１）およびヒト腎臓癌細胞（すなわちＨＥＫ２９３細胞）を、遺伝子導入２４時間前に播種した（２ｅ５細胞／ウェル）。これらの細胞株においてＤＭＰＫ転写物をノックダウンするか、またはこれに干渉させるために、２５７７（すなわち、配列番号：３）および２６８３（すなわち、配列番号：７）をコードするＤＮＡ、ならびに更に特異的には、Ｕ６Ｔ６．ｓｈ２５７７（すなわち、配列番号：２０）およびＵ６Ｔ６．ｓｈ２６８３（すなわち、配列番号：２４）をコードするＤＮＡを含むコンストラクトが使用された。コンストラクト（５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ）およびＧＦＰ対照は、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて、ＰＡＮＣ－１細胞およびＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトされた。遺伝子導入後７２時間の細胞を収集し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分離した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｂｅを用いてＲＮＡから生成された。ＲＮＡの完全性はＡｇｌｉｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析された。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、データを３つのハウスキーピング遺伝子（すなわち、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、およびＨＰＲＴ１）を用いて正規化した。倍率変化は、ｓｉＧＡＰＤＨ（対照）でトランスフェクトされた細胞と比較された。細胞可溶化物は、Ｒ１０５４ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてカラムに加えられた。

【0189】

ｑＰＣＲ結果は、Ｕ６プロモータの制御下にてヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ（すなわち、ｓｈ２５７７およびｓｈ２６８３）を標的とするｓｈＲＮＡを含むＡＡＶベクターは、約５０～５３％（すなわち、ｓｈ２５７７）および約４０～４４％（すなわち、ｓｈ２６８３）と同程度でＤＭＰＫ発現を下方制御するのに成功したことを示した（図８を参照されたい）。

【0190】

実施例１４
Ｕ６ｓｈＲＮＡおよびＵ７ｓｎＲＮＡは、ヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスにおけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現をノックダウンする
本研究の目的は、Ｉ型筋強直性ジストロフィーのマウスモデルであるＤＭＳＸＬマウスにおいて、３つの異なるＤＭＰＫ標的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）コンストラクトを検査することである。遺伝子導入ＤＭＳＸＬマウス株は、１０００超のＣＴＧリピートを有するヒトＤＭＰＫ遺伝子（ｈＤＭＰＫ）を含む、４５－ｋｂヒトゲノム断片を輸送する。ヘミ接合性マウスは、単一のｈＤＭＰＫコピー由来の転写物を輸送し、かつこれを発現する。各ＡＡＶコンストラクトは、１．２５×１０^１１ｖｇ／動物の用量にて、ヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウス（Ｈｅｍｉ）の左脚前脛骨（ＴＡ）筋へと筋肉内注射された（図９Ａ）。対側ＴＡは未処置のまま維持され、対照脚として機能させた。４週齢である３匹のヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスのメスと、３匹のヘミ接合性ＤＭＳＸＬマウスのオスの全ては、例えば、ＰＬＡ１（すなわち、配列番号：２０（Ｕ６．ｓｈ２５７７））、ＰＬＡ３（配列番号：３４（Ｕ７－２０ＣＴＧ））およびＰＬＡ４（配列番号：３１（Ｕ７ＥＸ８＃３））といった各ＡＡＶコンストラクトを用いて注射された（すなわち６匹分のサンプルサイズ）。投与の４週間後、右側ＴＡ筋と左側ＴＡ筋の両方を回収した。ＲＮＡを分離して調製し、ｈＤＭＰＫのＲＮＡ配列およびＲＮＡ発現レベルを解析した。未処置の脚と比較される、処置された脚におけるｈＤＭＰＫ ＲＮＡ発現の減少レベルは、ＰＬＡ１コンストラクト（すなわち、配列番号：２０（Ｕ６．ｓｈ２５７７））で処置されたマウスにて観察された（図９Ｂ）。ＰＬＡ１コンストラクトは、未処置の対側に対する、処置されたＴＡ筋中のｈＤＭＰＫの２２％のノックダウンを示した（図９Ｃ）。

【0191】

本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更および修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。

【0192】

本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0193】

本明細書に開示されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下に記載された表１に明記されている。

【0194】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図2-9】

【図2-10】

【図2-11】

【図2-12】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【配列表】

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