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特開2024-106134難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉製造方法、難消化性澱粉製造方法、米粉ゲル製造方法、食品製造方法、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024106134
(43)【公開日】2024-08-07
(54)【発明の名称】難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉製造方法、難消化性澱粉製造方法、米粉ゲル製造方法、食品製造方法、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20240731BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20240731BHJP
A23L 7/10 20160101ALI20240731BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240731BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 Z
A01H6/46
A23L7/10 Z
C12N9/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023010264
(22)【出願日】2023-01-26
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載日 令和４年６月４日 掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２２８４－０２２－００５７３－５
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】306024148
【氏名又は名称】公立大学法人秋田県立大学
(74)【代理人】
【識別番号】100097113
【弁理士】
【氏名又は名称】堀 城之
(74)【代理人】
【識別番号】100162363
【弁理士】
【氏名又は名称】前島 幸彦
(74)【代理人】
【識別番号】100194283
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 大勇
(72)【発明者】
【氏名】藤田 直子
(72)【発明者】
【氏名】クロフツ 尚子
(72)【発明者】
【氏名】三浦 聡子
【テーマコード（参考）】
2B030
4B023
4B050
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB02
2B030AD08
2B030CA01
2B030CA05
2B030CB02
4B023LC09
4B023LE07
4B023LE30
4B023LP20
4B050CC10
4B050DD13
4B050DD14
4B050KK07
4B050KK15
4B050LL02
4B050LL10
(57)【要約】
【課題】遺伝子組み換え手法を用いず、難消化性澱粉含量が高く種子重量が大きい難消化性澱粉高含有イネ変異体を提供する。
【解決手段】
イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、遺伝的に固定されており、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、非遺伝子組み換え体である。このような変異体では、イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上である。さらに、イネ変異体の生米粉における難消化性澱粉の含有率が２０％以上となる。
【選択図】図１
【解決手段】
イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、遺伝的に固定されており、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、非遺伝子組み換え体である。このような変異体では、イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上である。さらに、イネ変異体の生米粉における難消化性澱粉の含有率が２０％以上となる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体である
ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体。
ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体。
【請求項2】
スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが優性ホモである
ことを特徴とする請求項１に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
ことを特徴とする請求項１に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
【請求項3】
イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上である
ことを特徴とする請求項１に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
ことを特徴とする請求項１に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
【請求項4】
イネ変異体の生米粉における難消化性澱粉の含有率が２０％以上である
ことを特徴とする請求項３に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
ことを特徴とする請求項３に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
【請求項5】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造する
ことを特徴とする米粉製造方法。
ことを特徴とする米粉製造方法。
【請求項6】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の炊飯米、及び／又は該イネ種子が粉末化された米粉から難消化性澱粉を抽出する
ことを特徴とする難消化性澱粉製造方法。
ことを特徴とする難消化性澱粉製造方法。
【請求項7】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体の米粉に加水、加熱して米粉ゲルを製造する
ことを特徴とする米粉ゲル製造方法。
ことを特徴とする米粉ゲル製造方法。
【請求項8】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子、該イネ種子を粉末化した米粉、該米粉から抽出された難消化性澱粉、及び前記米粉に加水、加熱して製造された米粉ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造する
ことを特徴とする食品製造方法。
ことを特徴とする食品製造方法。
【請求項9】
非遺伝子組み換えの方式により、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定させる
ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法。
ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉製造方法、難消化性澱粉製造方法、米粉ゲル製造方法、食品製造方法、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法に係り、特に枝作り酵素とスターチシンターゼアイソザイムの特定の組み合わせにより難消化性澱粉高含有であり、且つ種子重量が高くなる難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉製造方法、難消化性澱粉製造方法、米粉ゲル製造方法、食品製造方法、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖及びα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖及びα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。
【0003】
澱粉の生合成には、少なくとも４種類の酵素が関与していることが分かっている。この４種類の酵素は、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付加した余分な枝分かれ構造をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）である。なお、各酵素には異なる遺伝子にコードされた多数のアイソザイムが存在する。また、澱粉生合成に関与する酵素は、他にもあると考えられている（非特許文献１参照）。
【0004】
一方、澱粉には、αアミラーゼ等で容易に消化される成分の澱粉と、消化されにくい難消化性澱粉が存在する。難消化性澱粉（以下、「ＲＳ」ともいう。）は、ヒトがもつ消化液では分解されにくく、高分子のまま小腸を通過して大腸に到達する澱粉のことである。難消化性澱粉は、小腸でグルコースにまで分解されにくいため、カロリーオフ効果がある。難消化性澱粉は、アミロース含量が高い澱粉に多く含まれることがある。このため、高アミローストウモロコシが、ダイエット素材として、利用されている。
【0005】
特許文献１を参照すると、遺伝子組み換え手法を用いず、難消化性澱粉含量が高いイネ変異体が記載されている。この変異体では、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、インディカ米由来のＳＳＩＩａ遺伝子及びＧＢＳＳＩ遺伝子を交配により導入した非遺伝子組み換え体のイネ変異体を得る。当該イネ変異体は、野生型と比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質が維持されている。さらに、このイネ変異体のイネ種子は、難消化性澱粉含量を含んでおり、炊飯米の難消化性澱粉の含有量が１０％～３０％となり、アミロースの割合が３５％以上となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１７－０３８５８８号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ： ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、ｐ．７１８－７２５
【非特許文献2】Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００６年、１４０、ｐ．１０７０－１０８４
【非特許文献3】Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００５年、５８、ｐ．２１３－２２７
【非特許文献4】Ｎ． Ｃｒｏｆｔｓ他、Ｌａｃｋ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩＩａ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｅ－ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｍｙｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、２０１２年、１９３、１９４、ｐ．６２－６９
【非特許文献5】Ａ． Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｓｅ－ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、ｐ．４５９－４７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ここで、難消化性澱粉の含有率と米の種子重量は、トレードオフの関係にあり、つまり、難消化性澱粉の含有率が高い系統は、種子が小さくなる。
このため、特許文献１に記載された難消化性澱粉の含有率が高いイネ変異体と同等以上の難消化性澱粉の含有率でありつつ、且つ、種子重量が高いイネ変異体の開発が望まれていた。
このため、特許文献１に記載された難消化性澱粉の含有率が高いイネ変異体と同等以上の難消化性澱粉の含有率でありつつ、且つ、種子重量が高いイネ変異体の開発が望まれていた。
【0009】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが優性ホモであることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上であることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、イネ変異体の生米粉における難消化性澱粉の含有率が２０％以上であることを特徴とする。
本発明の米粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造することを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の炊飯米、及び／又は該イネ種子が粉末化された米粉から難消化性澱粉を抽出することを特徴とする。
本発明の米粉ゲル製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の米粉に加水、加熱して米粉ゲルを製造することを特徴とする。
本発明の食品製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子、該イネ種子を粉末化した米粉、該米粉から抽出された難消化性澱粉、及び前記米粉に加水、加熱して製造された米粉ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造することを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定させることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが優性ホモであることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上であることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、イネ変異体の生米粉における難消化性澱粉の含有率が２０％以上であることを特徴とする。
本発明の米粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造することを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子の炊飯米、及び／又は該イネ種子が粉末化された米粉から難消化性澱粉を抽出することを特徴とする。
本発明の米粉ゲル製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の米粉に加水、加熱して米粉ゲルを製造することを特徴とする。
本発明の食品製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子、該イネ種子を粉末化した米粉、該米粉から抽出された難消化性澱粉、及び前記米粉に加水、加熱して製造された米粉ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造することを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定させることを特徴とする。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し、インディカ米由来の澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子が高発現型であり、ジャポニカ米由来のスターチシンターゼＳＳＩＩａが低活性型であり、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが正常に発現することで、従来と同等以上のイネ種子の難消化性澱粉の含有率で、且つ、種子重量が高いイネ変異体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の実施例に係る完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図2】本発明の実施例に係る各系統の玄米の形態を示す写真である。
【図3】本発明の実施例に係る枝切り澱粉を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによる（ａ）見かけのアミロース含量、（ｂ）アミロペクチンの短鎖と長鎖の比率を示すグラフである。
【図4A】本発明の実施例に係る＃１２０３（ＢＣ3）、秋田６３号、カサラス、及びＥＭ１０（ＢＣ3）の胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンの比較を示すグラフである。
【図4B】本発明の実施例に係る＃１２０３（ＢＣ3）の鎖長分布の差分曲線のグラフである。
【図4C】本発明の実施例に係る（ａ）＃１２０３（ＢＣ3）、（ｂ）＃１２０６（ＢＣ3）の鎖長分布の差分曲線のグラフである。
【図5A】本発明の実施例に係る＃１２０６（ＢＣ3）、秋田６３号、カサラス、及び＃４０１９（ＢＣ3）の胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンの比較を示すグラフである。
【図5B】本発明の実施例に係る＃１２０６（ＢＣ3）と秋田６３号との差分曲線のグラフである。
【図5C】本発明の実施例に係る（ａ）＃１２０３（ＢＣ3）、（ｂ）＃１２０６（ＢＣ3）との差分曲線のグラフである。
【図6】本発明の実施例に係る、それぞれ異なる方法で処理された米のＲＳ値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
＜実施の形態＞
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
本発明者らは、健康に資する機能性米の開発と普及を目指して、食後の血糖値上昇抑制や整腸作用が期待できる難消化性澱粉の含有量（以下、「ＲＳ値」という。）を多く含む実用的なイネ変異体の作出を行っていた。加工食品を製造する際、混合割合が少量でより高い機能性を発揮させるためには、さらにＲＳ値が高い品種の開発が必要であった。
具体的には、特許文献１に記載されたようなＲＳ値の高いイネ変異体の系統において、ＲＳ値と米の種子重量は、トレードオフの関係にあった。つまり、ＲＳ値が高い系統は、種子が小さくなり、種子重量が低くなっていた。種子重量が低いことで、収量の低下につながり、精米効率も低下していた。従って、ＲＳ値が高く、且つ、種子重量が高い系統の開発が必要であるという技術的な要求があった。
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
本発明者らは、健康に資する機能性米の開発と普及を目指して、食後の血糖値上昇抑制や整腸作用が期待できる難消化性澱粉の含有量（以下、「ＲＳ値」という。）を多く含む実用的なイネ変異体の作出を行っていた。加工食品を製造する際、混合割合が少量でより高い機能性を発揮させるためには、さらにＲＳ値が高い品種の開発が必要であった。
具体的には、特許文献１に記載されたようなＲＳ値の高いイネ変異体の系統において、ＲＳ値と米の種子重量は、トレードオフの関係にあった。つまり、ＲＳ値が高い系統は、種子が小さくなり、種子重量が低くなっていた。種子重量が低いことで、収量の低下につながり、精米効率も低下していた。従って、ＲＳ値が高く、且つ、種子重量が高い系統の開発が必要であるという技術的な要求があった。
【0014】
これに対して、本発明者らは、澱粉生合成に関する研究及び試験を鋭意行ってきた。その過程で、澱粉生合成に関与する酵素のうち、枝作り酵素（ＢＥ）ＩＩｂが欠損すると種子のＲＳ値が著しく上昇することを発見した。さらに、ＢＥＩＩｂ以外の澱粉生合成に関与する酵素の欠損や強発現を組み合わせることで、澱粉構造やその性質を制御できることを見出してきた。その試行錯誤の過程で、ＢＥＩＩｂが欠損し、澱粉粒結合型スターチシンターゼ（ＧＢＳＳＩ）がインディカ米由来で発現が強く、スターチシンターゼ（ＳＳ）ＩＩａの活性は弱く、ＳＳＩＩＩａの活性が正常という組み合わせが、ＲＳ値が高く、且つ種子重量が高い組み合わせであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
すなわち、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、イネ枝作り酵素ＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）が欠損し（「ｂｅ２ｂ」。以下、遺伝子型の欠損型を小文字の遺伝子名で示す。）、澱粉粒結合型スターチシンターゼＧＢＳＳＩの遺伝子がインディカ米由来の高発現型（「ＧＢＳＳ１」。以下、遺伝子型の高活性型又は高発現型を大文字の遺伝子名で示す。）であり、スターチシンターゼＳＳＩＩａがジャポニカ米由来の低活性型（「ｓｓ２ａL」。以下、遺伝子型の低活性型を上付きの「L」で示す。）であり、ＳＳＩＩＩａが正常に発現しており、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
【0016】
ここで、ＳＳＩＩａ遺伝子は、インディカ米を野生型（ＳＳ２ａ）と考えたときに、ジャポニカ米のＳＳＩＩａ遺伝子（ｓｓ２ａL）では、４か所にアミノ酸置換が生じており、それらが原因で活性が弱くなった酵素を発現する。したがって、本実施形態においては、それぞれ、インディカ米由来のＳＳ２ａを「高活性型」、ジャポニカ米由来のｓｓ２ａLを「低活性型」と呼ぶ。
一方、ＧＢＳＳＩ遺伝子は、野生型（ＧＢＳＳ１）であるインディカ米に対して、ジャポニカ米のＧＢＳＳＩ遺伝子（ｇｂｓｓ１L）では、イントロン１の最後の塩基に変異が生じており、そのせいでタンパク質の発現が低くなっている。したがって、本実施形態においては、それぞれ、インディカ米由来のＧＢＳＳ１を「高発現型」、ジャポニカ米由来のｇｂｓｓ１Lを「低発現型」と呼ぶ。
また、ＳＳＩＩＩａ遺伝子は、劣性ホモであればｓｓ３ａと示し、活性を示すもの（正常に発現しているもの、優性ホモ）をＳＳ３ａと示す。
一方、ＧＢＳＳＩ遺伝子は、野生型（ＧＢＳＳ１）であるインディカ米に対して、ジャポニカ米のＧＢＳＳＩ遺伝子（ｇｂｓｓ１L）では、イントロン１の最後の塩基に変異が生じており、そのせいでタンパク質の発現が低くなっている。したがって、本実施形態においては、それぞれ、インディカ米由来のＧＢＳＳ１を「高発現型」、ジャポニカ米由来のｇｂｓｓ１Lを「低発現型」と呼ぶ。
また、ＳＳＩＩＩａ遺伝子は、劣性ホモであればｓｓ３ａと示し、活性を示すもの（正常に発現しているもの、優性ホモ）をＳＳ３ａと示す。
【0017】
具体的には、本実施形態に係るイネ変異体は、特定の酵素に対する抗体、分子マーカー、澱粉形質の特定等の技術を用いて、非組み換え（非遺伝子組み換え）の手法で、上述の組み合わせ（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂ）の変異体米として、ＳＳ３ａ ｂｅ２ｂ変異体とＧＢＳＳ１をもつインディカ米との交配を行ったものを取得し、分子マーカーにより選抜した。この上で、超多収米品種であり、秋田地方で栽培適性がある「秋田６３号」を３回戻し交配した。最終的には、ＢＥＩＩｂが欠損し、且つ、ＧＢＳＳＩがインディカ米由来である系統を、ＲＳ値が高く且つ種子重量が高い系統として確立した。具体的には、後述する実施例で示すように、その農業形質を「秋田６３号」に類似させた「＃１２０３Ｂ－ＢＣ3」（実施例では、「＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）」のようにカッコ付けで記載する。）系統を、２系統分、単離した。この＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統は、特許文献１に記載の従来のＲＳ値が高いのイネ変異体種子と比べても、ＲＳ値が高く、種子重量が１．３５倍程度、高かった。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は、ＲＳ値の高い高ＲＳのイネ変異体を加工食品として利用するに当たって、より多くのＲＳを含み、且つ、種子の大きさや収量などの農業形質がより高いものなるという効果が得られる。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は、ＲＳ値の高い高ＲＳのイネ変異体を加工食品として利用するに当たって、より多くのＲＳを含み、且つ、種子の大きさや収量などの農業形質がより高いものなるという効果が得られる。
【0018】
ここで、秋田６３号は、高収量、大粒、早生のエリートイネ品種である。秋田６３号の種子サイズの拡大は、種子サイズを決定するＧＳ３及びｑＳＷ５遺伝子の機能喪失変異によるものである。さらに、秋田６３号は優れた窒素吸収能力も示しており、その収量は、同じ施肥条件下で一般的に消費されるジャポニカ米品種である、あきたこまちの１５０％である。このため、本実施形態に係るイネ変異体では、秋田６３号を使用して逐次戻し交雑を行うことで、肥料由来の窒素の環境中への放出を抑え、環境にやさしいイネ品種の開発にもつながる。
なお、アミロペクチンの構造とアミロース含量は、種子の登熟中の周囲温度の影響を受ける可能性があるため、本実施形態に係るイネ変異体の作出時に、戻し交配するエリートイネ品種は、成長環境に基づいて選択し、秋田６３号以外のものを選択することも可能である。この場合も、同じ（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂ）の遺伝子型とすることで、当該エリートイネ品種の特質を持ちつつ、ＲＳ値を高めることが可能となる。
なお、アミロペクチンの構造とアミロース含量は、種子の登熟中の周囲温度の影響を受ける可能性があるため、本実施形態に係るイネ変異体の作出時に、戻し交配するエリートイネ品種は、成長環境に基づいて選択し、秋田６３号以外のものを選択することも可能である。この場合も、同じ（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂ）の遺伝子型とすることで、当該エリートイネ品種の特質を持ちつつ、ＲＳ値を高めることが可能となる。
【0019】
なお、いずれにしても、種子内でＳＳＩＩａの活性が低く、ＧＢＳＳＩの発現が高ければ、同様の効果を示す。よって、上述の＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統以外の変異体であっても、同様の表現型の系統を当業者が作出することが可能である。
さらに、ＢＥＩＩｂに関しても、欠損によりＢＥＩＩｂの活性がゼロである変異体であれば、同様の表現型となることは言うまでもない。このＢＥＩＩｂ遺伝子への欠損の入り方（塩基置換等）は、特に限定されず、活性がゼロになれば同様の効果が得られる。
また、他の遺伝子についても同様に、塩基置換等は特に限定されず、活性の高さ又は低さについて、同様の効果が得られる程度に有性又は劣性であればよい
さらに、ＢＥＩＩｂに関しても、欠損によりＢＥＩＩｂの活性がゼロである変異体であれば、同様の表現型となることは言うまでもない。このＢＥＩＩｂ遺伝子への欠損の入り方（塩基置換等）は、特に限定されず、活性がゼロになれば同様の効果が得られる。
また、他の遺伝子についても同様に、塩基置換等は特に限定されず、活性の高さ又は低さについて、同様の効果が得られる程度に有性又は劣性であればよい
【0020】
これに加えて、本発明の実施の形態に係るイネ変異体はＳＳＩＩＩａが正常に発現していることを特徴とする。具体的には、ＳＳＩＩＩａが野生型、優性ホモ（ＳＳ３ａ）であることを特徴とする。
ここで、上述した＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統は、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが野生型の優性ホモ（ＳＳ３ａ）であるのに対して、実施例で示すＳＳＩＩＩａ遺伝子が欠損している＃１２０６－ＢＣ3系統はＳＳＩＩＩａが欠損している（ｓｓ３ａ）。これらを比較したところ、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統の方が、＃１２０６－ＢＣ3系統よりもＲＳ値が高く、種子が大きくなっていた。すなわち、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性ホモである方が、ＲＳ値が高く、種子重量も大きくなることが期待できる。
ここで、上述した＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統は、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａが野生型の優性ホモ（ＳＳ３ａ）であるのに対して、実施例で示すＳＳＩＩＩａ遺伝子が欠損している＃１２０６－ＢＣ3系統はＳＳＩＩＩａが欠損している（ｓｓ３ａ）。これらを比較したところ、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統の方が、＃１２０６－ＢＣ3系統よりもＲＳ値が高く、種子が大きくなっていた。すなわち、スターチシンターゼＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性ホモである方が、ＲＳ値が高く、種子重量も大きくなることが期待できる。
【0021】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、イネ変異体の玄米一粒当たりの平均重量が２５ｍｇ以上であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態に係るイネ変異体は、秋田６３号との戻し交配後、すべての系統の種子重量が大幅に増加した。後述する実施例で示すように、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統の種子は、典型的な野生型のジャポニカ米の種子（１粒あたり１９～２０ｍｇ）よりも１５０％重かった（１粒あたり２８～２９ｍｇ）。
このように、本実施形態のイネ変異体は、従来のＲＳ値が高いイネ変異体よりも種子重量が大きいため、精米する上で大きなメリットとなる。また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、超多収米品種と戻し交配することで、その形質を備えさせることができ、収量が高くなり、生産性の高さが経済性にも貢献する。
これにより、ＲＳを取得したり食品を製造したりする際に低コスト化につながる。このため、実際に食品等を製造する際、又は、炊飯米として提供する際の実用性を高めることができる。
具体的には、本実施形態に係るイネ変異体は、秋田６３号との戻し交配後、すべての系統の種子重量が大幅に増加した。後述する実施例で示すように、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統の種子は、典型的な野生型のジャポニカ米の種子（１粒あたり１９～２０ｍｇ）よりも１５０％重かった（１粒あたり２８～２９ｍｇ）。
このように、本実施形態のイネ変異体は、従来のＲＳ値が高いイネ変異体よりも種子重量が大きいため、精米する上で大きなメリットとなる。また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、超多収米品種と戻し交配することで、その形質を備えさせることができ、収量が高くなり、生産性の高さが経済性にも貢献する。
これにより、ＲＳを取得したり食品を製造したりする際に低コスト化につながる。このため、実際に食品等を製造する際、又は、炊飯米として提供する際の実用性を高めることができる。
【0022】
また、本発明の実施の形態に係るイネ変異体は、イネ変異体の生米粉におけるＲＳ値が２０％以上であることを特徴とする。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は、特許文献１のイネ変異体と比べて、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統のように種子重量が大きくてもＲＳ値を高めることができる。さらに、本実施形態に係るイネ変異体は、米粉及び炊飯米のＲＳ値も高くなる。実際に、後述する実施例で示すように、野生型の秋田６３号ではＲＳ値がごくわずか（０．４％）であったものの、本実施形態に係る＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統では、図６で示すように、生米粉のＲＳ値は２０～２９％、すり潰していない炊飯米のＲＳ値は３０～３５％と高くなった。なお、本実施形態においては、特に記載がない場合、「米粉」は「生米粉」である例について記載する。
また、本実施形態に係るイネ変異体では、特許文献１のイネ変異体よりも、戻し交配により開花が早くなる。これにより、種子の登熟中の温度が高くなることで、ＲＳ生合成に最適な温度が確保されることが期待できる。これにより、ＲＳの性質をより好適なものに変化させつつ、ＲＳ値をより高めることが期待できる。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は、特許文献１のイネ変異体と比べて、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統のように種子重量が大きくてもＲＳ値を高めることができる。さらに、本実施形態に係るイネ変異体は、米粉及び炊飯米のＲＳ値も高くなる。実際に、後述する実施例で示すように、野生型の秋田６３号ではＲＳ値がごくわずか（０．４％）であったものの、本実施形態に係る＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統では、図６で示すように、生米粉のＲＳ値は２０～２９％、すり潰していない炊飯米のＲＳ値は３０～３５％と高くなった。なお、本実施形態においては、特に記載がない場合、「米粉」は「生米粉」である例について記載する。
また、本実施形態に係るイネ変異体では、特許文献１のイネ変異体よりも、戻し交配により開花が早くなる。これにより、種子の登熟中の温度が高くなることで、ＲＳ生合成に最適な温度が確保されることが期待できる。これにより、ＲＳの性質をより好適なものに変化させつつ、ＲＳ値をより高めることが期待できる。
【0023】
なお、ＲＳ値は、調理方法によって大きく異なる。これに対して、本実施形態の変異体米においては、生米粉、米粉ゲル（糊化米粉）、炊飯米、及びすり潰した炊飯米（米ゲル）において、特許文献１に記載のイネ変異体と同等以上のＲＳ値となる。このため、食品中のＲＳ値も調理方法により変化するものの、本実施形態の変異体米を米粉又は精製澱粉として添加して食品を製造した場合、従来より少ない添加量で、所定のＲＳ値とすることが可能という効果を得ることができる。すなわち、この場合でも、本実施形態のイネ変異体では、種子重量が大きいことから、加える種子の数自体を少なくし、つまりコストを下げることができる。
【0024】
さらに、本発明の実施の形態に係るｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂのイネ変異体は、既に遺伝的に固定された系統であり、この種子を植えて自殖によって稔った種子は、全て同型質になる。このため、安定して生産が可能である。
さらに、本実施形態のイネ変異体は、非遺伝子組み換え体（非組換え体）であるため、一般の水田での栽培も可能となり、大規模栽培も可能である。結果として、栽培用作物として実用性が高いＲＳ値を含むイネ変異体を提供することができる。
また、本実施形態に係る＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統のイネ変異体のように、ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂのイネ変異体の農業形質等を確定し品種育成への適性を見極め、品種化することで、より農業的な生産体制を確立することが可能となる。
さらに、本実施形態のイネ変異体は、非遺伝子組み換え体（非組換え体）であるため、一般の水田での栽培も可能となり、大規模栽培も可能である。結果として、栽培用作物として実用性が高いＲＳ値を含むイネ変異体を提供することができる。
また、本実施形態に係る＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統のイネ変異体のように、ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂのイネ変異体の農業形質等を確定し品種育成への適性を見極め、品種化することで、より農業的な生産体制を確立することが可能となる。
【0025】
また、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、特許文献１のイネ変異体種子と同様に、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１３以下が減少され、ＤＰ１４以上が増加されることを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、特許文献１のイネ変異体種子と同様に、ＥＭ１０を用いて製造される澱粉よりも１℃以上、典型的には約７℃程度高い、糊化温度であることを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、特許文献１のイネ変異体種子と同様に、ＥＭ１０を用いて製造される澱粉よりも１℃以上、典型的には約７℃程度高い、糊化温度であることを特徴とする。
【0026】
また、本発明の実施の形態に係る米粉製造方法として、本実施形態に係るイネ変異体のイネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造することが可能である。すなわち、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子は、粉末化することで米粉としても利用可能であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態に係るイネ変異体の種子（変異体米）は、粉砕機等で粉砕して、米粉として使用することができる。この米粉は、生米粉として用いることで、ＲＳ値を高めることができる。すなわち、本実施形態に係る米粉製造方法は、生米粉の製造方法であってもよい。
具体的には、本実施形態に係るイネ変異体の種子（変異体米）は、粉砕機等で粉砕して、米粉として使用することができる。この米粉は、生米粉として用いることで、ＲＳ値を高めることができる。すなわち、本実施形態に係る米粉製造方法は、生米粉の製造方法であってもよい。
【0027】
また、本実施形態の変異体米から抽出した澱粉自体を、ＲＳを含む澱粉として使用することも可能である。
さらに、本発明の実施の形態に係るＲＳ製造方法として、本実施形態に係るイネ変異体のイネ種子の炊飯米、及び／又は該イネ種子が粉末化された米粉からＲＳ自体を抽出することも可能である。
さらに、本発明の実施の形態に係るＲＳ製造方法として、本実施形態に係るイネ変異体のイネ種子の炊飯米、及び／又は該イネ種子が粉末化された米粉からＲＳ自体を抽出することも可能である。
【0028】
さらに、本発明の実施の形態に係る米粉ゲル製造方法として、本実施形態に係るイネ変異体の米粉に加水、加熱して米粉ゲルを製造することも可能である。この米粉ゲルは、後述する実施例の「糊化米粉」と同様な手法で製造し、提供することが可能である。さらに、この米粉ゲルは、モチや団子のようなもの及びこの材料となる加工品も含む。
また、米粉そのものではなく、加水した米自体を炊飯し、高速せん断撹拌することで、ゲル状に加工して米ゲルとして加工することも可能である。この場合、後述する実施例の「すりつぶした炊飯米」と同様な手法で製造可能である。
また、米粉そのものではなく、加水した米自体を炊飯し、高速せん断撹拌することで、ゲル状に加工して米ゲルとして加工することも可能である。この場合、後述する実施例の「すりつぶした炊飯米」と同様な手法で製造可能である。
【0029】
さらに、本実施形態に係る食品製造方法として、本実施形態に係るイネ変異体のイネ種子、該イネ種子を粉末化した生米粉、該生米粉から抽出されたＲＳを含む澱粉、米粉に加水、加熱して製造された米粉ゲル（糊化米粉）、炊飯米、米ゲル（すりつぶした炊飯米）のいずれか又は任意の組み合わせを含んで食品を製造することが可能である。
【0030】
具体的には、本実施形態に係る変異体米は、玄米のまま又は精米して機能性米として提供することが可能である。また、変異体米の米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、食品に混合させて利用することができる。
より具体的には、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、精米、レトルトの炊飯米、その他の様々な食品（パン、麺、菓子等）、グルテンフリー食品、ＲＳを精製したサプリメント等に利用できる。さらに具体的には、本実施形態のイネ種子、米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、ピラフ若しくはリゾット、米菓、グラノーラ等の食品に好適に用いることができ、味わい、口触り、食感、咀嚼感、風味等で特徴ある食品を製造することができる。すなわち、この特徴を食品に付加する等の処理剤として使用できる。このため、本実施形態に係るイネ種子、米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、食感改良剤としても使用することができる。
より具体的には、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、精米、レトルトの炊飯米、その他の様々な食品（パン、麺、菓子等）、グルテンフリー食品、ＲＳを精製したサプリメント等に利用できる。さらに具体的には、本実施形態のイネ種子、米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、ピラフ若しくはリゾット、米菓、グラノーラ等の食品に好適に用いることができ、味わい、口触り、食感、咀嚼感、風味等で特徴ある食品を製造することができる。すなわち、この特徴を食品に付加する等の処理剤として使用できる。このため、本実施形態に係るイネ種子、米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、食感改良剤としても使用することができる。
【0031】
また、本実施形態に係るイネ種子、米粉、ＲＳを含む澱粉、及び米粉ゲルは、これらを用いた各種健康食品やダイエット食品等に利用可能である。特に、後述するように、＃１２０３Ｂ－ＢＣ3系統の一部系統のように果皮の赤い系統の玄米は、ポリフェノールを多く含むため、抗酸化活性等が期待できる。このため、食品加工、健康食品メーカー、病院、老人介護施設の給食、弁当、牛丼メーカー、コンビニ、ドラッグストアー等で利用可能である。
【0032】
また、このような本実施形態に係る変異体米及びこの粉末等を用いた食品は、麺、パン、ピラフ、かゆ、米菓等の米由来のダイエット素材として用いることが可能である。また、これらの食品は、習慣的に摂取することにより、低カロリー性を備え、大腸環境を整えるため糖尿病、大腸癌、便秘の予防等の効果が期待される。
【0033】
すなわち、本発明の実施の形態に係るイネ種子、米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、従来のＥＭ１０よりアミロース含量が増加していることで、ＥＭ１０とは違った物性を示す。ここで、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及びＲＳを含む澱粉、米粉ゲルは、高アミロース含量及びアミロペクチンの長鎖が多いことに起因する老化性の高さから、老化性が有利に働く調理法において、調理性を高めることができる。
【0034】
ここで、ＲＳは、消化酵素によって容易に分解されない澱粉として単純に定義されているものの、ＲＳ構造が異なる変異体イネ系統間で異なることを示す証拠が増えている。消化酵素による分解後の残留澱粉の構造分析によって、アミロペクチン分岐が少ないものの長い（ＤＰ＞１５）ことと、アミロース含量が高いことが、消化酵素による分解に対する耐性の高さと相関することが示唆されている。これは、隣接するグルカン鎖が二重らせんを形成するためであり、不完全ではあるが、澱粉が消化されにくくなっているためである。残留澱粉中の長いグルカン鎖の含有量は、生米粉よりも、糊化米粉の方が高くなる。これは、老化したアミロペクチンが近くの枝やアミロースと二重らせんを形成する可能性が高く、消化酵素によって分解されにくくなるためである。
【0035】
健康のために澱粉を改良するのに考慮すべきこととして、澱粉構造は、血流へのグルコースの放出速度に影響を与える。したがって、本実施形態に係るイネ変異体の種子による米粉のように、ＲＳに加えて消化速度の遅い澱粉の割合が増えることで、食後の血糖値スパイクを防ぐのに有益である可能性がある。消化後の残留グルカン鎖からなるＲＳは、繊維のようにプレバイオティクス様に機能し、大腸フローラによる短鎖脂肪酸の産生を促進し、結腸癌やアレルギーを予防し得るという効果が期待できる。
【0036】
加えて、本実施形態に係る＃１２０３Ｂ－ＢＣ3は、現時点で２系統あり、そのうち１系統は果皮が赤く、玄米で加工した場合、ポリフェノールが豊富であるため、抗酸化活性が強いと予想される。このため、玄米で使用する場合、ＲＳによる機能性に加えて、新たな機能性を付与することが可能である。
【0037】
また、本実施形態のイネ変異体の米粉や澱粉は、アミロースの含量が高いことにより、工業的な用途にて使用可能である。これは、生分解性プラスチック等、成形が必要な場合は、老化性が高い方が有利であるためである。たとえば、アミロースは温水に溶けるため、フィルム状に成形して、生分解性フィルム、医療用材料、縫合糸のような用途に用いることができる。また、体内で吸収分解される性質を用いて、再生医療の「足場」用の部材として用いることが可能である。
さらに、グラスファイバー作成時の資材、工業用糊、建築材料の配合剤、植物栽培用の資材等、様々な工業用途に利用可能である。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は産業上利用することができる。
さらに、グラスファイバー作成時の資材、工業用糊、建築材料の配合剤、植物栽培用の資材等、様々な工業用途に利用可能である。
このように、本実施形態に係るイネ変異体は産業上利用することができる。
【0038】
以上のように、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法においては、高いＲＳ値をもつイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来するＲＳ値が高い澱粉、米粉ゲル、及びその製造方法を得ることができる。さらに、本発明は、当該澱粉を利用する飲食品及び工業製品に用いることができる。
【実施例0039】
以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【0040】
〔実験方法と材料〕
（植物材料）
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｂｅ２ｂ単一変異体、ＥＭ１０（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂ）は、ジャポニカ米の野生型（ＷＴ）品種であるＫｉｎｍａｚｅ（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ＢＥ２ｂ）のＮ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（メタンニトロソウレア、ＭＮＵ）変異誘発集団から、特許文献１に記載されたように分離されたものである。なお、上述の各系統の遺伝子を示す小文字は劣性、大文字は優性を示す。また、各遺伝子の「L」は、活性又は発現量が低い低活性型であることを示し、「L」のついていないものは活性又は発現量が通常又は高い活性型（高発現型）であることを示す。たとえば、ＥＭ１０の（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂ）は、ＳＳＩＩａ遺伝子がジャポニカ米由来の低活性型で、ＳＳ３ａはＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性型、ｇｂｓｓ１L は、ＧＢＳＳＩ遺伝子が劣性で低発現型、ｂｅ２ｂ遺伝子が劣性で発現がゼロであることを示す。ＥＭ１０は、ＢＥＩＩｂのイントロン９の最後のヌクレオチドに変異を持っており、これがスプライシングを阻害し、タンパク質を産生しない。
（植物材料）
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｂｅ２ｂ単一変異体、ＥＭ１０（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂ）は、ジャポニカ米の野生型（ＷＴ）品種であるＫｉｎｍａｚｅ（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ＢＥ２ｂ）のＮ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（メタンニトロソウレア、ＭＮＵ）変異誘発集団から、特許文献１に記載されたように分離されたものである。なお、上述の各系統の遺伝子を示す小文字は劣性、大文字は優性を示す。また、各遺伝子の「L」は、活性又は発現量が低い低活性型であることを示し、「L」のついていないものは活性又は発現量が通常又は高い活性型（高発現型）であることを示す。たとえば、ＥＭ１０の（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂ）は、ＳＳＩＩａ遺伝子がジャポニカ米由来の低活性型で、ＳＳ３ａはＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性型、ｇｂｓｓ１L は、ＧＢＳＳＩ遺伝子が劣性で低発現型、ｂｅ２ｂ遺伝子が劣性で発現がゼロであることを示す。ＥＭ１０は、ＢＥＩＩｂのイントロン９の最後のヌクレオチドに変異を持っており、これがスプライシングを阻害し、タンパク質を産生しない。
【0041】
ｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ変異体の＃４０１９系統（ｓｓ２ａL ｓｓ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂ）は、ジャポニカ米品種である日本晴のＴｏｓ１７挿入変異体であるｓｓ３ａ変異体（ｅ１、ｓｓ２ａL ｓｓ３ａ ｇｂｓｓ１L ＢＥ２ｂ）とｂｅ２ｂ変異体のＥＭ１０とを交配することによって生成された。
また、ｅ１系統は、ＳＳＩＩＩａの最初のエクソン１にＴｏｓ１７が挿入されており、ＳＳＩＩＩａタンパク質を生成しない。
また、ｅ１系統は、ＳＳＩＩＩａの最初のエクソン１にＴｏｓ１７が挿入されており、ＳＳＩＩＩａタンパク質を生成しない。
【0042】
ＳＳ２ａ及び／又はＧＢＳＳ１対立遺伝子を導入するために、ｂｅ２ｂ又はｓｓ３ａ ｂｅ２ｂの系統を、インディカ米品種であるカサラス（ＳＳ２ａ ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ＢＥ２ｂ）と交配し、それぞれ＃１２０３又は＃１２０６と名付けた。
次に、インディカ米由来の高活性型ＳＳＩＩａと高発現レベルのＧＢＳＳＩを持つ＃１２０６系統、＃１２０６Ｃ（ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂ）系統を、超多収のエリートジャポニカ米品種である秋田６３号（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ＢＥ２ｂ）と交配した。得られたＦ1種子を成長させ、自家受粉させてＦ2種子を得た。Ｆ2種子からＤＮＡを分離し、分子マーカーによって、ＳＳＩＩａ遺伝子及びＧＢＳＳＩ遺伝子がインディカ米品種に由来するパターンを示す個体を選抜し、更にＳＳＩＩＩａ遺伝子及びＢＥＩＩｂ遺伝子型において、求める遺伝子型をもつもの（つまり、＃１２０３系統はＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性型でＢＥＩＩｂ遺伝子が劣性、＃１２０６系統は両遺伝子が劣性の遺伝子をもつものである）を選抜し、栽培を続けた。
次に、インディカ米由来の高活性型ＳＳＩＩａと高発現レベルのＧＢＳＳＩを持つ＃１２０６系統、＃１２０６Ｃ（ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂ）系統を、超多収のエリートジャポニカ米品種である秋田６３号（ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ＢＥ２ｂ）と交配した。得られたＦ1種子を成長させ、自家受粉させてＦ2種子を得た。Ｆ2種子からＤＮＡを分離し、分子マーカーによって、ＳＳＩＩａ遺伝子及びＧＢＳＳＩ遺伝子がインディカ米品種に由来するパターンを示す個体を選抜し、更にＳＳＩＩＩａ遺伝子及びＢＥＩＩｂ遺伝子型において、求める遺伝子型をもつもの（つまり、＃１２０３系統はＳＳＩＩＩａ遺伝子が優性型でＢＥＩＩｂ遺伝子が劣性、＃１２０６系統は両遺伝子が劣性の遺伝子をもつものである）を選抜し、栽培を続けた。
【0043】
このようにして、ホモ接合体である＃１２０３Ａ（ＢＣ3）、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）、及び＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）系統が単離された。また、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）系統は、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－１及び＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－２の二つを用いた。＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）も、＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－１及び＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－２の二つを用いた。また、＃１２０６Ａ（ＢＣ3）、＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）、＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）の系統も単離された。この本実施例で使用された系統の遺伝子型は、後述する表１に示す。さらに、自殖を繰り返したＦ3種子及びＦ4種子をその後の分析に使用した。すべてのイネ系統は秋田県立大学の実験水田で夏の間、自然光条件下で栽培された。
【0044】
（ＤＮＡ抽出方法）
上述の分子マーカーによる選抜のため、幼植物からのＤＮＡを抽出した。具体的には、培地からセルトレイに移植した幼植物の葉身２ｃｍ程度をマルチビーズショッカー用のチューブに移し、液体窒素に入れ、凍らせてマルチビーズショッカーで粉砕した（ＳＰＥＥＤ ＭＥＴＥＲ：１６００ｒｐｍ、ＯＮ ＴＩＭＥ：２０秒、ＣＹＣＬＥ：１回）。４００μＬのＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）を加えてボルテックスし、１５０００ｒｐｍ、２０℃で５分間、遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、３００μＬのイソプロパノールを加えよく混合し、１５分間静置した。その後、上述のものと同じ条件で遠心分離し、チューブの底に半透明な沈殿があるか確認した後、７０％エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を除去した。残った沈殿を減圧乾燥し、氷上で２５μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ）を加え懸濁した。その後、実験に用いるまで－３０℃で冷凍保存した。
上述の分子マーカーによる選抜のため、幼植物からのＤＮＡを抽出した。具体的には、培地からセルトレイに移植した幼植物の葉身２ｃｍ程度をマルチビーズショッカー用のチューブに移し、液体窒素に入れ、凍らせてマルチビーズショッカーで粉砕した（ＳＰＥＥＤ ＭＥＴＥＲ：１６００ｒｐｍ、ＯＮ ＴＩＭＥ：２０秒、ＣＹＣＬＥ：１回）。４００μＬのＤＮＡ抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）を加えてボルテックスし、１５０００ｒｐｍ、２０℃で５分間、遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、３００μＬのイソプロパノールを加えよく混合し、１５分間静置した。その後、上述のものと同じ条件で遠心分離し、チューブの底に半透明な沈殿があるか確認した後、７０％エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を除去した。残った沈殿を減圧乾燥し、氷上で２５μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ）を加え懸濁した。その後、実験に用いるまで－３０℃で冷凍保存した。
【0045】
（ウエスタンブロッティング）
ウエスタンブロッティングのため、各タンパク質は、特許文献１に記載の手法に、わずかな変更を加えて分画した。
具体的には、成熟した米粒を細かい粉末に粉砕した。可溶性タンパク質（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び澱粉にゆるく結合したタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｌｏｏｓｅｌｙ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｇｒａｎｕｌｅ）（以下、これらを「ＳＰ＋ＬＢＰ」という。）は、５５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８Ｍ 尿素、２．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び５％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ボリューム（ｗ／ｖ）のバッファーを使用して抽出された。遠心分離後、上清に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、１２％ β－メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．２％ ブロモフェノールブルーを含む３×ＳＤＳ－サンプルバッファーを半量加え、５分間、煮沸した。ＳＰ＋ＬＢＰを抽出した後に得られた残りの澱粉ペレットを、
５５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び５％（ｖ／ｖ） β－メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む１ｍＬのバッファーで洗浄した。澱粉に強固に結合したタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ Ｓｔａｒｃｈ。以下、「ＴＢＰ」という。）は、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８Ｍ 尿素、４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ） β－メルカプトエタノール、及び０．０５％（ｗ／ｖ） ブロモフェノールブルーを含む３０ボリューム（ｗ／ｖ）のバッファーを用いて、室温で一晩抽出した。遠心分離後、上清を使用した。
ウエスタンブロッティングのため、各タンパク質は、特許文献１に記載の手法に、わずかな変更を加えて分画した。
具体的には、成熟した米粒を細かい粉末に粉砕した。可溶性タンパク質（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び澱粉にゆるく結合したタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｌｏｏｓｅｌｙ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｇｒａｎｕｌｅ）（以下、これらを「ＳＰ＋ＬＢＰ」という。）は、５５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８Ｍ 尿素、２．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び５％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ボリューム（ｗ／ｖ）のバッファーを使用して抽出された。遠心分離後、上清に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、１２％ β－メルカプトエタノール、２０％グリセロール、０．２％ ブロモフェノールブルーを含む３×ＳＤＳ－サンプルバッファーを半量加え、５分間、煮沸した。ＳＰ＋ＬＢＰを抽出した後に得られた残りの澱粉ペレットを、
５５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．３％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び５％（ｖ／ｖ） β－メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む１ｍＬのバッファーで洗浄した。澱粉に強固に結合したタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ Ｓｔａｒｃｈ。以下、「ＴＢＰ」という。）は、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８Ｍ 尿素、４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ） β－メルカプトエタノール、及び０．０５％（ｗ／ｖ） ブロモフェノールブルーを含む３０ボリューム（ｗ／ｖ）のバッファーを用いて、室温で一晩抽出した。遠心分離後、上清を使用した。
【0046】
すべてのタンパク質サンプルは、７．５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、メンブレン（ＰＶＤＦ膜、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＩＰＶＨ００１０）にブロットされた。メンブレンを４％ スキムミルク／ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍＬで振盪し、１０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後に、抗ＧＢＳＳＩ（１：５０００希釈、非特許文献２）、抗ＳＳＩＩａ（１：１０００希釈、非特許文献３）、抗ＳＳＩＩＩａ（１：１０００希釈、非特許文献４）、及び抗ＢＥＩＩｂ（１：５０００、非特許文献５）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。
【0047】
翌日、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、洗浄した。その後、パーオキシダーゼ標識二次抗体（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を４％ スキムミルク／ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）で５０００倍希釈した二次抗体溶液１０ｍＬに浸し、約２時間ゆっくり浸とうさせた。その後、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２で１回洗い、ＴＢＳで３回洗った後、新しいＴＢＳに浸し、検出に用いた。
【0048】
洗浄したメンブレンにＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｒｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１ｍＬかけることで発光させ、Ｆｕｊｉ ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）で発光したバンドを写真に撮り、その画像データをソフトウェア：ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅを用いて、検出したバンドの明るさやコントラストを編集した。
【0049】
（種子の形態観察）
玄米の種子の形態観察は、実体顕微鏡（ＳＺＸ７－ＩＬＳＴ－０（ＳＰ）、ＯＬＹＭＰＵＳ製）を使用して、光源を上下に配置して観察した。写真は、デジタルカメラを使用して撮影された。
玄米の種子の形態観察は、実体顕微鏡（ＳＺＸ７－ＩＬＳＴ－０（ＳＰ）、ＯＬＹＭＰＵＳ製）を使用して、光源を上下に配置して観察した。写真は、デジタルカメラを使用して撮影された。
【0050】
（澱粉の精製方法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸漬法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ ２８：２４１－２４４（１９８１））を用いて、精白米粒から澱粉を精製した。
１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％ ＮａＯＨを１００ｍＬ加えて一晩４℃で静置した。
翌日、上清を捨て、氷上で、５０ｍＬの０．１％ ＮａＯＨとともに乳鉢ですりつぶし、１００μｍのメッシュに通すことを５回繰り返した後、３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％ ＮａＯＨを１５０ｍＬ加えて氷中で３時間振とうし、３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿を、０．１％ ＮａＯＨ ２００ｍＬで懸濁し、一晩４℃で静置した。翌日、上清を捨て、蒸留水で懸濁し、１Ｎの塩酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
澱粉の精製は、冷アルカリ浸漬法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ ２８：２４１－２４４（１９８１））を用いて、精白米粒から澱粉を精製した。
１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％ ＮａＯＨを１００ｍＬ加えて一晩４℃で静置した。
翌日、上清を捨て、氷上で、５０ｍＬの０．１％ ＮａＯＨとともに乳鉢ですりつぶし、１００μｍのメッシュに通すことを５回繰り返した後、３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％ ＮａＯＨを１５０ｍＬ加えて氷中で３時間振とうし、３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿を、０．１％ ＮａＯＨ ２００ｍＬで懸濁し、一晩４℃で静置した。翌日、上清を捨て、蒸留水で懸濁し、１Ｎの塩酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
【0051】
（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉５ｍｇに蒸留水０．２５ｍＬを加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えて、３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．６５ｍＬを加え、５Ｎ ＨＣｌを９５μＬ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１．５ｍＬ加え、シュードモナスイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μＬ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、３７℃で２４時間、振盪しながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍＬ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍＬ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍＬ加えて、４℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
精製した澱粉５ｍｇに蒸留水０．２５ｍＬを加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えて、３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．６５ｍＬを加え、５Ｎ ＨＣｌを９５μＬ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１．５ｍＬ加え、シュードモナスイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μＬ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、３７℃で２４時間、振盪しながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍＬ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍＬ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍＬ加えて、４℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
【0052】
使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００×２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００×２０ｍｍ）３本（両カラムとも、ＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％ ＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＲＩ８０２０、東ソー社製）で検出した。
【0053】
（アミロース含量）
澱粉は、シュードモナスイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）を使用して枝切りし、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ－５５Ｓ及びＨＷ－５０Ｓ×３、東ソー社製）で分析した。アミロース（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉ）、長いアミロペクチン鎖（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩ）、短いアミロペクチン鎖（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩＩ）の各ピークを、特許文献１に記載されたものと同様に定量化した。
澱粉は、シュードモナスイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）を使用して枝切りし、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ－５５Ｓ及びＨＷ－５０Ｓ×３、東ソー社製）で分析した。アミロース（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉ）、長いアミロペクチン鎖（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩ）、短いアミロペクチン鎖（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩＩ）の各ピークを、特許文献１に記載されたものと同様に定量化した。
【0054】
（アミロペクチンの鎖長分布解析）
成熟したイネ種子から澱粉を抽出し、シュードモナスイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）を使用して枝切りした。次に、枝切りされた澱粉を蛍光標識し、キャピラリー電気泳動（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で分析した。
成熟したイネ種子から澱粉を抽出し、シュードモナスイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）を使用して枝切りした。次に、枝切りされた澱粉を蛍光標識し、キャピラリー電気泳動（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で分析した。
【0055】
具体的に説明すると、試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末を用いた。
各々に５ｍＬのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％ メタノールを５ｍＬ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に０．３Ｎ ＮａＯＨを３００μＬ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸１９μＬで中和した後、蒸留水を１１００μＬ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μＬ、２％ アジ化ナトリウムを１５μＬ、シュードモナスイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を２μＬ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応させた。
各々に５ｍＬのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％ メタノールを５ｍＬ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に０．３Ｎ ＮａＯＨを３００μＬ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸１９μＬで中和した後、蒸留水を１１００μＬ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μＬ、２％ アジ化ナトリウムを１５μＬ、シュードモナスイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を２μＬ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応させた。
【0056】
次に、イソアミラーゼを２μＬ追加して８時間以上反応した後、１５分沸騰し、常温において１００００ｇで遠心分離し、上清に脱イオンレジン（ＡＧ５０１－Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を加えて、３０分間、せん回し、脱イオンした。
次に、α－グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため試料中の糖含量を定量し５～１０ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα－グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１－アミノピレン－３，６，８－三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（２．５％ ＡＰＴＳ、１５％ 酢酸）を２μＬ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム）を２μＬ添加し、５５℃で９０分間反応させた。蒸留水４６μＬを添加し、反応を停止した。
分析時には２０倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）５以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ７０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌａｒ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌａｒ％）のグラフを作成した。
次に、α－グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため試料中の糖含量を定量し５～１０ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα－グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１－アミノピレン－３，６，８－三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（２．５％ ＡＰＴＳ、１５％ 酢酸）を２μＬ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム）を２μＬ添加し、５５℃で９０分間反応させた。蒸留水４６μＬを添加し、反応を停止した。
分析時には２０倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）５以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ７０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌａｒ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌａｒ％）のグラフを作成した。
【0057】
（ＲＳ値の測定）
さまざまな形態の試料（生米粉、糊化米粉、すり潰していない炊飯米、すり潰した炊飯米）のＲＳ含量は、特許文献１と同様に決定された。
まず、炊飯方法について述べる。１５ｍＬフタ付き遠沈管に約１００ｍｇの精米（５～８粒）を秤量し、パスツールピペットを用いて遠沈管内でサンプルを２回水洗した。遠沈管内の水分が精米重量の１．５倍±０．３ｍｇの水量になるように蒸留水を加えた。すなわち、遠沈管内の全重量が精米の２．５倍になるようにした。遠沈管側面に付いた水を遠心分離機にかけて落とした。５合炊き炊飯器の炊飯釜に約２５０ｍＬの水道水を入れ、マイクロチューブスタンドとガラスシャーレ（直径１２ｃｍ）を置き、その上にサンプルの入った１５ｍＬ遠沈管をななめに置いて、５合炊き炊飯器で炊飯した。
次に、ＲＳ含量は、メガザイム社が販売しているＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（以下、「ＲＳ測定キット」という。）により測定した。
さまざまな形態の試料（生米粉、糊化米粉、すり潰していない炊飯米、すり潰した炊飯米）のＲＳ含量は、特許文献１と同様に決定された。
まず、炊飯方法について述べる。１５ｍＬフタ付き遠沈管に約１００ｍｇの精米（５～８粒）を秤量し、パスツールピペットを用いて遠沈管内でサンプルを２回水洗した。遠沈管内の水分が精米重量の１．５倍±０．３ｍｇの水量になるように蒸留水を加えた。すなわち、遠沈管内の全重量が精米の２．５倍になるようにした。遠沈管側面に付いた水を遠心分離機にかけて落とした。５合炊き炊飯器の炊飯釜に約２５０ｍＬの水道水を入れ、マイクロチューブスタンドとガラスシャーレ（直径１２ｃｍ）を置き、その上にサンプルの入った１５ｍＬ遠沈管をななめに置いて、５合炊き炊飯器で炊飯した。
次に、ＲＳ含量は、メガザイム社が販売しているＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（以下、「ＲＳ測定キット」という。）により測定した。
【0058】
ＲＳ測定キットの測定用のパンクレアチンα－アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋アミログルコシターゼ（３Ｕ／ｍＬ）の作成方法は以下の通りである。
５０ｍＬ遠沈管に０．１Ｍマレート・ナトリウム・バッファー（ｐＨ ６．０）５０ｍＬとＲＳ測定キットに付属のブタ膵臓α－アミラーゼ０．５ｇを溶かし、氷上で５分間振とう機で撹拌した。３００Ｕ／ｍＬに希釈したアミログルコシターゼ（ＡＭＧ）溶液０．５ｍＬを加え撹拌し３０００ｒｐｍ、２５℃、１０分遠心分離し、上清を新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。この試薬は必要分等倍に変化させ、その都度作成した。
５０ｍＬ遠沈管に０．１Ｍマレート・ナトリウム・バッファー（ｐＨ ６．０）５０ｍＬとＲＳ測定キットに付属のブタ膵臓α－アミラーゼ０．５ｇを溶かし、氷上で５分間振とう機で撹拌した。３００Ｕ／ｍＬに希釈したアミログルコシターゼ（ＡＭＧ）溶液０．５ｍＬを加え撹拌し３０００ｒｐｍ、２５℃、１０分遠心分離し、上清を新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。この試薬は必要分等倍に変化させ、その都度作成した。
【0059】
このように準備したパンクレアチンα－アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ＡＭＧ（３Ｕ／ｍＬ）４ｍＬを各炊飯米に加え、恒温振とう機（ＭＨ－１０，ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて１６４ｒｐｍ、３７℃で１６時間、激しく振とうさせた。１００％エタノール４ｍＬを加えて撹拌し、３０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離し、５０ｍＬ遠沈管に、すばやく上清を回収した。沈殿物に５０％エタノールを２ｍＬ入れて撹拌した後、再度５０％エタノールを８ｍＬ加え、全体量を１０ｍＬにし、撹拌した。３０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離して、上記の５０ｍＬ遠沈管にすばやく上清を移した。この作業をもう一度行い、沈殿（この中に含まれる難消化性澱粉をｒｓとする）と上清（この中に含まれる可溶化した澱粉量をｎｏｎ－ｒｓとする）を分離した。なお、この一連の操作の際に用いた遠心分離機は（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－３０Ｒ、ＢＥＣＫＭＡＮ社製）であり、スイングローター（ＳＸ４４００）のバケットを用いた。
【0060】
沈殿に残っている上清をピペットでできるだけ取り除き、１５ｍＬ遠沈管に入っているｒｓをプラスチックペッスルで潰しながら、２ｍＬの２Ｍ ＫＯＨを加えた。スターラーバーを入れ、氷中で２０分撹拌した。１．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３．８）を８ｍＬ、ＡＭＧ（３３００Ｕ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加えて、ｒｓをグルコースまで分解させた。５分に１回ボルテックスで撹拌しながら、５０℃で３０分加熱し、３０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離した。
グルコースまで分解されたｒｓは遠沈管の目盛１１ｍＬ、ｎｏｎ－ｒｓは目盛３０ｍＬまで、蒸留水でメスアップした。ｒｓは難消化性澱粉の含量が高いサンプル（難消化性澱粉が１５％を超えるもの）及び、ｎｏｎ－ｒｓは０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で１０倍希釈した。各溶解液及び希釈液１０μＬとグルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）１５０μＬとをそれぞれ２ホールずつ９６穴のマイクロプレートの各穴にアプライした。また、別の穴に、検量線作成のためのグルコース溶液標準液（ｍｇ／ｍＬ）、その上から、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）、グルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）をアプライした。マイクロプレートシートでふたをし、ハイブリオーブン（ＴＡＩＴＥＣ ＨＢ－８０）で５０℃、２０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍの吸光度を測定した。
グルコース溶液の測定値から検量線を引き、各サンプルのグルコース濃度（ｍｇ／ｍＬ）を求め、１００ｍｇ精米中のｒｓ及びｎｏｎ－ｒｓ量を算出した。ＲＳ値（％）は以下の式（１）により算出した。
ＲＳ値（％）＝ｒｓ（ｍｇ）／［ｒｓ（ｍｇ）＋ｎｏｎ－ｒｓ（ｍｇ）］……式（１）
グルコースまで分解されたｒｓは遠沈管の目盛１１ｍＬ、ｎｏｎ－ｒｓは目盛３０ｍＬまで、蒸留水でメスアップした。ｒｓは難消化性澱粉の含量が高いサンプル（難消化性澱粉が１５％を超えるもの）及び、ｎｏｎ－ｒｓは０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で１０倍希釈した。各溶解液及び希釈液１０μＬとグルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）１５０μＬとをそれぞれ２ホールずつ９６穴のマイクロプレートの各穴にアプライした。また、別の穴に、検量線作成のためのグルコース溶液標準液（ｍｇ／ｍＬ）、その上から、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）、グルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）をアプライした。マイクロプレートシートでふたをし、ハイブリオーブン（ＴＡＩＴＥＣ ＨＢ－８０）で５０℃、２０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍの吸光度を測定した。
グルコース溶液の測定値から検量線を引き、各サンプルのグルコース濃度（ｍｇ／ｍＬ）を求め、１００ｍｇ精米中のｒｓ及びｎｏｎ－ｒｓ量を算出した。ＲＳ値（％）は以下の式（１）により算出した。
ＲＳ値（％）＝ｒｓ（ｍｇ）／［ｒｓ（ｍｇ）＋ｎｏｎ－ｒｓ（ｍｇ）］……式（１）
【0061】
（糊化温度の測定）
１０５℃で２時間乾燥させた澱粉、約３ｍｇに蒸留水９μＬを加えて混合し、昇温速度３℃／分で５℃から２００℃までの温度変化させたときの示差走査熱量が、示差走査熱量測定器ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）であるＤＳＣ６１００（セイコーインスツル株式会社製）で測定された。
その後、同機種のアプリケーションソフトを用いて、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量が算出された。
１０５℃で２時間乾燥させた澱粉、約３ｍｇに蒸留水９μＬを加えて混合し、昇温速度３℃／分で５℃から２００℃までの温度変化させたときの示差走査熱量が、示差走査熱量測定器ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）であるＤＳＣ６１００（セイコーインスツル株式会社製）で測定された。
その後、同機種のアプリケーションソフトを用いて、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量が算出された。
【0062】
（データ分析）
種子の重量、アミロース含量、熱糊化特性、及びＲＳ値は、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法によって統計的に分析された（Ｐ＜０．０５）。
種子の重量、アミロース含量、熱糊化特性、及びＲＳ値は、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法によって統計的に分析された（Ｐ＜０．０５）。
【0063】
〔結果〕
（ＳＳとＢＥの有無）
高ＲＳ値の性質をもち、且つ、種子重が大きいイネ系統を育成するため、ＳＳＩＩａ遺伝子型が高活性型（ＳＳ２ａ）か低活性型（ｓｓ２ａL）か、ＧＢＳＳＩ遺伝子型が高発現型（ＧＢＳＳ１）か低発現型（ｇｂｓｓ１L）か、ＳＳＩＩＩａ遺伝子型並びにＢＥＩＩｂ遺伝子型が優性型（それぞれ、ＳＳ３ａ並びにＢＥ２ｂ）か劣性型（それぞれ、ｓｓ３ａ並びにｂｅ２ｂ）か、についてのあらゆる組み合わせの材料を作出し、それらを超多収米品種である秋田６３号と３回戻し交配した系統を単離した。
これらの本実施例で使用したすべての系統の遺伝子型と、その粒重関連データを、下記の表１に示す。
（ＳＳとＢＥの有無）
高ＲＳ値の性質をもち、且つ、種子重が大きいイネ系統を育成するため、ＳＳＩＩａ遺伝子型が高活性型（ＳＳ２ａ）か低活性型（ｓｓ２ａL）か、ＧＢＳＳＩ遺伝子型が高発現型（ＧＢＳＳ１）か低発現型（ｇｂｓｓ１L）か、ＳＳＩＩＩａ遺伝子型並びにＢＥＩＩｂ遺伝子型が優性型（それぞれ、ＳＳ３ａ並びにＢＥ２ｂ）か劣性型（それぞれ、ｓｓ３ａ並びにｂｅ２ｂ）か、についてのあらゆる組み合わせの材料を作出し、それらを超多収米品種である秋田６３号と３回戻し交配した系統を単離した。
これらの本実施例で使用したすべての系統の遺伝子型と、その粒重関連データを、下記の表１に示す。
【0064】
【表1】
【0065】
具体的には、表１は、それぞれ、系統（Ｌｉｎｅ）、遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）、粒重（Ｇｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔ）、平均値±標準誤差％（Ｍｅａｎ±ＳＥ）、戻し交配後の増加率（Ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅ）（％）を示す。
表中において、粒重は、各イネ系統の玄米１個の重量（ｍｇ）であり、平均±標準誤差（ＳＥ、ｎ＝２０）及び野生型（ＷＴ）品種の金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）の種子重量のパーセントとして示す。異なる小文字は、異なる系統間の有意差を示す（Ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）。
また、増加率は、戻し交配前の種子重量に対する戻し交配後の種子重量の増加率を示す。同じ遺伝子型を持つ複数の系統が利用可能な場合、平均種子重量を使用した。
表中において、粒重は、各イネ系統の玄米１個の重量（ｍｇ）であり、平均±標準誤差（ＳＥ、ｎ＝２０）及び野生型（ＷＴ）品種の金南風（Ｋｉｎｍａｚｅ）の種子重量のパーセントとして示す。異なる小文字は、異なる系統間の有意差を示す（Ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）。
また、増加率は、戻し交配前の種子重量に対する戻し交配後の種子重量の増加率を示す。同じ遺伝子型を持つ複数の系統が利用可能な場合、平均種子重量を使用した。
【0066】
この戻し交配系統の＃１２０３Ａ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ＳＳ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂであった。＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）は、ｓｓ２ａL ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂであった。＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ＳＳ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂである。加えて、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）の２系統を、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－１、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－２とし、＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）の２系統を＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－１、＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－２とした。
戻し交配系統＃１２０６Ａ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂであった。＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）は、ｓｓ２ａL ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂであった。＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂであった。
戻し交配系統＃１２０６Ａ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ｇｂｓｓ１L ｂｅ２ｂであった。＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）は、ｓｓ２ａL ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂであった。＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）は、ＳＳ２ａ ｓｓ３ａ ＧＢＳＳ１ ｂｅ２ｂであった。
【0067】
図１に、この完熟胚乳の抽出物を用いた澱粉生合成酵素ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａ、ＧＢＳＳＩ、ＢＥＩＩｂのウエスタンブロッティング解析の結果を示す。
図１（ａ）は可溶性タンパク質及び澱粉にゆるく結合したタンパク質（ＳＰ＋ＬＢＰ）、図１（ｂ）は澱粉に強固に結合したタンパク質（ＴＢＰ）の結果を示す。
図１（ａ）は可溶性タンパク質及び澱粉にゆるく結合したタンパク質（ＳＰ＋ＬＢＰ）、図１（ｂ）は澱粉に強固に結合したタンパク質（ＴＢＰ）の結果を示す。
【0068】
ＳＳＩＩＩａはｅ１、＃４０１９、及び３つの＃１２０６（ＢＣ3）系統すべてに存在しないことが示された。同様に、抗ＢＥＩＩｂ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＥＭ１０、＃４０１９、及びすべての＃１２０３（ＢＣ3）及び＃１２０６（ＢＣ3）系統でＢＥＩＩｂが存在しないことが確認された。
【0069】
ＧＢＳＳＩと活性型ＳＳＩＩａとは、澱粉と強固に結合していることが知られている。抗ＳＳＩＩａ抗体を使用したＴＢＰのウエスタンブロッティングでは、秋田６３号、ｅ１、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）、及び＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）等のｓｓ２ａL遺伝子型を持つ系統よりも、野生型のカサラス（Ｋａｓａｌａｔｈ）、＃１２０３Ａ（ＢＣ3）、＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）、＃１２０６Ａ（ＢＣ3）、及び＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）等のＳＳ２ａ遺伝子型（すなわち、活性型ＳＳＩＩａを含む）を持つイネ系統の方が、ＳＳＩＩａがより豊富に存在することが明らかになった。ＢＥＩＩｂが存在しない場合も、ＥＭ１０及び＃４０１９のＴＢＰ画分のＳＳＩＩａタンパク質の量が増加した。
【0070】
ＧＢＳＳＩは、ＴＢＰ画分に富んでいた。カサラス、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）、＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）、＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）、及び＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）等のＧＢＳＳ１遺伝子型を持つ系統には、秋田６３号、ＥＭ１０、ｅ１、＃４０１９、＃１２０３Ａ（ＢＣ3）、＃１２０６Ａ（ＢＣ3）等のｇｂｓｓ１L遺伝子型を持つ系統よりもより高いレベルのＧＢＳＳＩタンパク質が含まれていた。
これらの結果は、本実施例で使用されたすべての系統が正しい遺伝子型を持ち、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａ、ＧＢＳＳＩ、及びＢＥＩＩｂタンパク質存在量についても予想されるパターンを示すことを確認するものであった。
これらの結果は、本実施例で使用されたすべての系統が正しい遺伝子型を持ち、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａ、ＧＢＳＳＩ、及びＢＥＩＩｂタンパク質存在量についても予想されるパターンを示すことを確認するものであった。
【0071】
（種子の形態と種子の重さ）
図２に、各イネ系統の完熟玄米（脱皮成熟種子）の形態を示す。各系統において、上図は完熟玄米の上から光を当てて撮影した写真、下図は完熟玄米の下から光を当てて撮影した写真である。スケールバーは５ｍｍである。玄米が白濁していると、下から光を当てると黒く見える。
図２に、各イネ系統の完熟玄米（脱皮成熟種子）の形態を示す。各系統において、上図は完熟玄米の上から光を当てて撮影した写真、下図は完熟玄米の下から光を当てて撮影した写真である。スケールバーは５ｍｍである。玄米が白濁していると、下から光を当てると黒く見える。
【0072】
ＢＥＩＩｂを欠くすべてのイネ系統の種子は白濁であったが、ＷＴ、秋田６３号、及びカサラスの種子は半透明であった。＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－２及び＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－２の種子は、カサラスから継承された特性である赤い果皮を示した。長粒種子を生成したカサラスと、種子が他の系統の種子よりも小さく、時には扁平であった＃１２０３Ａ（ＢＣ3）を除き、ＢＣ3系統は全て大きな短粒種子を形成した。
【0073】
上述した表１に示したように、秋田６３号の種子重量は大きく（１粒あたり２８ｍｇ）、典型的なジャポニカイネ品種である金南風の種子重量（１粒あたり１９ｍｇ）の１４９％であった。戻し交配後のすべてのＲＳ高含量の系統の種子重量は、戻し交配前のＲＳ高含量系統と比較して大幅に改善され、約１３２～１９０％増加した（ＥＭ１０は１８１％、＃４０１９は１３４％、＃１２０３Ａは１３５％、＃１２０３Ｂは最大１９０％、＃１２０３Ｃは１５３％、＃１２０６Ａは１４５％、＃１２０６Ｂは１３２％、及び＃１２０６Ｃは１４５％）。すなわち、＃１２０３Ｂ系統は、種子重量が、ほぼ２５ｍｇ以上となった。
【0074】
＃１２０３Ａ（ＢＣ3）を除く、ほぼすべての系統の戻し交配後の種子重量は、典型的なジャポニカ米である金南風の重量と同等かそれより重かった。＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）系統は、全ての戻し交配系統の中で最大の種子を生産し、種子あたりの平均重量は２８～２９ｍｇで、秋田６３号の種子重量とほぼ同じであった。＃１２０３Ａの種子重量は、種子あたり平均１２．７ｍｇであった。戻し交配前に比べて戻し交配後の種子重量は１３５％増加したが、これはすべての戻し交配系統の中で最も低かった。これらの結果は、戻し交配がＲＳ高含量の系統の種子重量を首尾よく増加させたことを示している。これは、おそらく、種子サイズが大きいだけでなく、澱粉合成中の最適温度を確保する早期開花にも関与する遺伝子座の継承によって引き起こされたものである。戻し交配系統は、戻し交配前の系統の開花時期よりも約１０～３０日早く、８月の初めに開花した。早期の開花は、胚乳澱粉生合成がピークに達する開花後５～３０日（ＤＡＦ）での累積温度の上昇が伴った。戻し交配後の累積温度は６８０～６９３°Ｃであったが、戻し交配前の累積温度は４５２～６４０°Ｃであった。
【0075】
（アミロース含量とアミロペクチンの短鎖と長鎖の比率）
ＧＢＳＳＩの発現レベルは、種子登熟中の温度の影響を受ける。種子登熟中の温度が高いと、ＧＢＳＳＩのＲＮＡスプライシングが損なわれ、成熟したＧＢＳＳＩのｍＲＮＡの転写量が低下し、結果としてＧＢＳＳＩタンパク質のレベルが低下し、アミロース含量が減少する。高アミロース含量は、ＲＳ値の上昇に寄与することが知られているため、戻し交配後のＲＳ高含量の系統の見かけのアミロース含量をゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。
具体的には、枝切り澱粉を使用して、戻し交配前のものと、澱粉生合成酵素の異なる組み合わせを含むイネ系統のものと比較した。
ＧＢＳＳＩの発現レベルは、種子登熟中の温度の影響を受ける。種子登熟中の温度が高いと、ＧＢＳＳＩのＲＮＡスプライシングが損なわれ、成熟したＧＢＳＳＩのｍＲＮＡの転写量が低下し、結果としてＧＢＳＳＩタンパク質のレベルが低下し、アミロース含量が減少する。高アミロース含量は、ＲＳ値の上昇に寄与することが知られているため、戻し交配後のＲＳ高含量の系統の見かけのアミロース含量をゲル濾過クロマトグラフィーで分析した。
具体的には、枝切り澱粉を使用して、戻し交配前のものと、澱粉生合成酵素の異なる組み合わせを含むイネ系統のものと比較した。
【0076】
図３に、枝切り澱粉を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによる見かけのアミロース含量の測定結果と、アミロペクチンの短鎖と長鎖の比率とを示す。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過クロマトグラフィーのパターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒ．Ｉ、画分Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒ．ＩＩ、画分ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ、画分ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。すなわち、このゲル濾過クロマトグラフィーでは、画分Ｉには、アミロースとアミロペクチンの超長鎖が含まれているものの、主にアミロースを含んでいる。画分ＩＩにはアミロペクチンの長鎖が含まれている。画分ＩＩＩにはアミロペクチンの短鎖が含まれている。図３は、これらを数値化したものを示す。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過クロマトグラフィーのパターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒ．Ｉ、画分Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒ．ＩＩ、画分ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ、画分ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。すなわち、このゲル濾過クロマトグラフィーでは、画分Ｉには、アミロースとアミロペクチンの超長鎖が含まれているものの、主にアミロースを含んでいる。画分ＩＩにはアミロペクチンの長鎖が含まれている。画分ＩＩＩにはアミロペクチンの短鎖が含まれている。図３は、これらを数値化したものを示す。
【0077】
図３（ａ）は、見かけのアミロース含量（画分Ｉ）を示す。
図３（ｂ）は、短いアミロペクチン鎖と長いアミロペクチン鎖の比率（画分ＩＩＩ／画分ＩＩ）を示す。すなわち、画分ＩＩＩの値を画分ＩＩの値で割って計算した、短いアミロペクチン鎖と長いアミロペクチン鎖の比である。
いずれも、異なる小文字は有意差を示す（Ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）
図３（ｂ）は、短いアミロペクチン鎖と長いアミロペクチン鎖の比率（画分ＩＩＩ／画分ＩＩ）を示す。すなわち、画分ＩＩＩの値を画分ＩＩの値で割って計算した、短いアミロペクチン鎖と長いアミロペクチン鎖の比である。
いずれも、異なる小文字は有意差を示す（Ｐ＜０．０５；Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）
【0078】
結果として、＃４０１９や＃１２０６等のｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ系統の見かけのアミロース含量は、ＥＭ１０や＃１２０３等のｂｅ２ｂ系統よりも戻し交配の前後で高かった。ＥＭ１０や＃１２０３等のｂｅ２ｂ系統の短いアミロペクチン鎖と長いアミロペクチン鎖の比率は、戻し交雑に関係なく、＃４０１９や＃１２０６等のｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ系統（１．１～１．５）よりも低かった（０．８～１．２）。これらの結果は、＃１２０３系統が＃１２０６系統よりも長いアミロペクチン鎖を含むことを示している。
ｂｅ２ｂ系統のうち、＃１２０３Ｂや＃１２０３Ｃ等のＧＢＳＳ１遺伝子型を持つ系統のアミロース含量（３５～３９％）は、ＥＭ１０（２０～２７％）や＃１２０３Ａ（１５－１６％）等のｇｂｓｓ１L系統よりも高かった、＃１２０３Ａの見かけのアミロース含量は、戻し交雑に関係なく、ＥＭ１０よりも低かった。
ｂｅ２ｂ系統のうち、＃１２０３Ｂや＃１２０３Ｃ等のＧＢＳＳ１遺伝子型を持つ系統のアミロース含量（３５～３９％）は、ＥＭ１０（２０～２７％）や＃１２０３Ａ（１５－１６％）等のｇｂｓｓ１L系統よりも高かった、＃１２０３Ａの見かけのアミロース含量は、戻し交雑に関係なく、ＥＭ１０よりも低かった。
【0079】
すべてのｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ系統の見かけのアミロース含量は高く、ＧＢＳＳ１又はｇｂｓｓ１L対立遺伝子を持つ系統間で有意差は観察されなかった。これは、ＳＳＩＩＩａが存在しないとＡＧＰａｓｅ活性が上昇し、ＧＢＳＳＩを含むスターチシンターゼ（ＳＳ）の基質であるＡＤＰ－グルコースレベルが上昇すると、ＧＢＳＳＩの発現レベルが低い場合でもアミロース生合成が促進されるためと考えられる。さらに、ＧＢＳＳＩの高発現レベルは、ＡＤＰ－グルコースの量の制限のために、見かけのアミロース含量をさらに増加させることができない場合がある。
ほとんどすべての系統の見かけのアミロース含量は、戻し交配後にわずかに減少した。これはおそらく、種子登熟中の高温のためである。
ほとんどすべての系統の見かけのアミロース含量は、戻し交配後にわずかに減少した。これはおそらく、種子登熟中の高温のためである。
【0080】
（アミロペクチン分岐構造）
次に、詳細なアミロペクチン分岐構造を明らかにするために、澱粉を枝切りし、キャピラリー電気泳動で分析した。
次に、詳細なアミロペクチン分岐構造を明らかにするために、澱粉を枝切りし、キャピラリー電気泳動で分析した。
【0081】
図４Ａに、＃１２０３（ＢＣ3）、秋田６３号、カサラス、及びＥＭ１０（ＢＣ3）の胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンの比較結果を示す。図４Ａ（ａ）は、＃１２０３Ａ（ＢＣ3）、（ｂ）は＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）、（ｃ）は＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）の鎖長分布パターンをそれぞれ示す。各グラフは、少なくとも三回の試行結果から得られた典型的なパターンを示す。
【0082】
結果として、秋田６３号の鎖長分布パターンと比較し、ＢＥＩＩｂを欠くＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）系統のピークアミロペクチン鎖長は、ＤＰ１１からＤＰ１４まで、３グルコース鎖分、増加した。また、これらのピークの高さは秋田６３号のものよりも、かなり低かった。これは、ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）系統にて、秋田６３号の分布と比較して、ＢＥＩＩｂの損失が短鎖の数を減少させ、長鎖の数を増加させたことを示している。＃１２０３（ＢＣ3）系統の鎖長分布パターンは、戻し交配前と基本的に同じであり、わずかな増加のみが見られた（ＤＰ＜２０）。
【0083】
ここで、＃１２０３（ＢＣ3）系統と秋田６３号系統の鎖長分布パターンの違いをより詳しく調べた。
図４Ｂに、ＢＥＩＩｂ損失の影響を判断するため、＃１２０３（ＢＣ3）系統の値から秋田６３号の値を差し引いて差分曲線を作成したものを示す。図４Ｂ（ａ）は「＃１２０３Ａ（ＢＣ3）－秋田６３号」、（ｂ）は「＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－秋田６３号」、（ｃ）は「＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－秋田６３号」の結果をそれぞれ示す。
結果として、短鎖（ＤＰ＜１３）の数は大幅に減少したが、長鎖（ＤＰ＞１５）の数は秋田６３号の数と比較して＃１２０３（ＢＣ3）系統で増加していた。
図４Ｂに、ＢＥＩＩｂ損失の影響を判断するため、＃１２０３（ＢＣ3）系統の値から秋田６３号の値を差し引いて差分曲線を作成したものを示す。図４Ｂ（ａ）は「＃１２０３Ａ（ＢＣ3）－秋田６３号」、（ｂ）は「＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－秋田６３号」、（ｃ）は「＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－秋田６３号」の結果をそれぞれ示す。
結果として、短鎖（ＤＰ＜１３）の数は大幅に減少したが、長鎖（ＤＰ＞１５）の数は秋田６３号の数と比較して＃１２０３（ＢＣ3）系統で増加していた。
【0084】
図４Ｃ（ａ）は、ｂｅ２ｂ遺伝子型でのアミロペクチン構造に対する活性型ＳＳＩＩａの効果を調べるため、差分曲線を作成したものを示す。図４Ｃ（ａ）は「＃１２０３Ａ（ＢＣ3）－ＥＭ１０（ＢＣ3）」及び「＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）」を、「カサラス－秋田６３号」と比較したものである。
【0085】
また、カサラスの鎖長分布パターンは、秋田６３号に比べて２グルコース鎖分、大きい側にシフトしており、カサラスの値から秋田６３号の値を差し引いた差分曲線は、秋田６３号の短鎖がカサラスより多いことを示し、従来の結果と一致していた。これは、活性型ＳＳＩＩａはアミロペクチン分岐をＤＰ６～１２からＤＰ１２～２４に伸長するように機能するためである。
【0086】
このように、秋田６３号に対する短鎖の減少率は、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）よりも＃１２０３Ａ（ＢＣ3）と＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）の方が大きく、活性型ＳＳＩＩａは短鎖を利用し、より長い鎖を生成することが示された。
【0087】
結果として、活性型ＳＳＩＩａを持つ系統には、短いアミロペクチン枝（ＤＰ≦１２）が少なく、長いアミロペクチン枝（１３＜ＤＰ＜３０）が含まれており、活性型ＳＳＩＩａが短いアミロペクチン鎖（ＤＰ≦１２）から長いアミロペクチン枝（１３＜ＤＰ＜３０）を合成することを示していた。ただし、「カサラス－秋田６３号」と比較して、ＢＥＩＩｂの非存在下ではモル％の絶対値がはるかに小さかった。これはおそらく、ＢＥＩＩｂ損失による短い分岐が欠如しており、これがＳＳＩＩａのプライマーとして機能するためであった。
【0088】
次に、図５Ａにより、＃１２０６系統（ＢＣ3）と、秋田６３号系統、カサラス系統、及び＃４０１９系統（ＢＣ3）との胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンの比較について説明する。図５（ａ）は＃１２０６Ａ（ＢＣ3）、（ｂ）は＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）、（ｃ）は＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）の鎖長分布パターンを、それぞれ示す。各グラフは、少なくとも三回の試行結果から得られた典型的な一つパターンを示す。
【0089】
結果として、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂを欠く＃４０１９（ＢＣ3）系統と＃１２０６（ＢＣ3）系統の鎖長分布パターンも、ＤＰ１１からＤＰ１２または１４へと、秋田６３号と比較して約２グルコース鎖分、大きな側にシフトしていた。
＃４０１９（ＢＣ3）系統及び＃１２０６（ＢＣ3）系統はＤＰ１４でより高いピークを示し、＃１２０３（ＢＣ3）とは対照的に、ＤＰ１９で特徴的な下がり方を示した。＃１２０６（ＢＣ3）系統の鎖長分布パターンは、戻し交配前とほぼ同じであり、わずかな増加（ＤＰ＜２０）のみが検出された。
＃４０１９（ＢＣ3）系統及び＃１２０６（ＢＣ3）系統はＤＰ１４でより高いピークを示し、＃１２０３（ＢＣ3）とは対照的に、ＤＰ１９で特徴的な下がり方を示した。＃１２０６（ＢＣ3）系統の鎖長分布パターンは、戻し交配前とほぼ同じであり、わずかな増加（ＤＰ＜２０）のみが検出された。
【0090】
図５Ｂは、ＳＳＩＩＩａ及びＢＥＩＩｂの欠損の影響を決定するため、＃１２０６（ＢＣ3）系統の値から秋田６３号の値を差し引いて差分曲線を作成したものを示す。図５Ｂ（ａ）は、＃１２０６Ａ（ＢＣ3）、（ｂ）は＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）、（ｃ）は＃１２０６（ＢＣ3）の差分曲線をそれぞれ示す。
結果として、短鎖（ＤＰ≦１２）の数は大幅に減少し、長鎖（ＤＰ＞１５）の数は秋田６３号の数と比較して＃１２０６（ＢＣ3）系統で増加した。＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）系統よりも＃１２０６Ａ（ＢＣ3）系統と＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）系統の方が、秋田６３号系統と比較して短鎖の減少率が大きくなるため、活性型ＳＳＩＩａは短鎖を利用し、より長い鎖を生成することが示された。
結果として、短鎖（ＤＰ≦１２）の数は大幅に減少し、長鎖（ＤＰ＞１５）の数は秋田６３号の数と比較して＃１２０６（ＢＣ3）系統で増加した。＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）系統よりも＃１２０６Ａ（ＢＣ3）系統と＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）系統の方が、秋田６３号系統と比較して短鎖の減少率が大きくなるため、活性型ＳＳＩＩａは短鎖を利用し、より長い鎖を生成することが示された。
【0091】
次に、ｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ遺伝子型のアミロペクチン構造に対する活性ＳＳＩＩａの効果を求めた。
再び図４Ｃを参照すると、図４Ｃ（ｂ）は、「＃１２０６Ａ（ＢＣ3）－＃４０１９ＢＣ3」及び「＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）－＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）」の差分曲線を作成し、「カサラス－秋田６３号」と比較したものを示す。
結果として、活性型ＳＳＩＩａを持つ系統は、より短いアミロペクチン枝（ＤＰ≦１２）が少なく、より長いアミロペクチン枝（１５＜ＤＰ＜３０）を多く含んでおり、これらの系統における活性ＳＳＩＩａの効果はカサラスのものよりも穏やかであったが、＃１２０３（ＢＣ3）のものよりも強かった。
再び図４Ｃを参照すると、図４Ｃ（ｂ）は、「＃１２０６Ａ（ＢＣ3）－＃４０１９ＢＣ3」及び「＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）－＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）」の差分曲線を作成し、「カサラス－秋田６３号」と比較したものを示す。
結果として、活性型ＳＳＩＩａを持つ系統は、より短いアミロペクチン枝（ＤＰ≦１２）が少なく、より長いアミロペクチン枝（１５＜ＤＰ＜３０）を多く含んでおり、これらの系統における活性ＳＳＩＩａの効果はカサラスのものよりも穏やかであったが、＃１２０３（ＢＣ3）のものよりも強かった。
【0092】
図５Ｃは、差分曲線を生成し、ＢＥＩＩｂのみ、又はＢＥＩＩｂとＳＳＩＩＩａの両方が存在しない場合のＧＢＳＳ１又はｇｂｓｓ１L対立遺伝子の効果を比較したものを示す。すると、ＧＢＳＳ１を保有するがＢＥＩＩｂを欠く系統では、「＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）－ＥＭ１０（ＢＣ3）」及び「＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）－＃１２０３Ａ（ＢＣ3）」は、８＜ＤＰ＜２０のアミロペクチン鎖が多く、ＤＰ＞２０のアミロペクチン鎖が少ないことを示した。対照的に、「＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）－＃４０１９（ＢＣ3）」及び「＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）－＃１２０６Ａ（ＢＣ3）」の絶対値は小さく、ＳＳＩＩＩａ及びＢＥＩＩｂの非存在下でもＧＢＳＳＩタンパク質レベルがアミロペクチン構造に影響を与えなかったことを示唆している。
【0093】
（澱粉の熱糊化特性）
アミロペクチンの枝の長さの違いは、澱粉の糊化温度と老化のしやすさと強く相関しており、どちらも種子登熟中の温度の影響を受ける。老化した澱粉はＲＳとしても機能するため、精製澱粉の熱糊化特性を示差走査熱量測定法で分析し、戻し交配の前後で澱粉生合成遺伝子のさまざまな組み合わせを含む系統間で比較した。
この各系統の示差走査熱量計で分析した澱粉の熱特性を、下記の表２に示す：
アミロペクチンの枝の長さの違いは、澱粉の糊化温度と老化のしやすさと強く相関しており、どちらも種子登熟中の温度の影響を受ける。老化した澱粉はＲＳとしても機能するため、精製澱粉の熱糊化特性を示差走査熱量測定法で分析し、戻し交配の前後で澱粉生合成遺伝子のさまざまな組み合わせを含む系統間で比較した。
この各系統の示差走査熱量計で分析した澱粉の熱特性を、下記の表２に示す：
【0094】
【表2】
【0095】
表２中の各系統（Ｌｉｎｅ）、遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）について、ＴO（℃）は糊化開始温度、ＴP（℃）は糊化ピーク温度、ＴC（℃）は糊化最終温度、ΔＨ（Ｊ／ｇ）は澱粉の糊化熱量を、それぞれ示す。各データは平均±ＳＥ（ｎ＝３）を示す。異なる小文字は、イネ遺伝子型間の有意差を示す（Ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）。
【0096】
結果として、ＥＭ１０（ＢＣ3）のＢＥＩＩｂの欠損とカサラスのＳＳ２ａ対立遺伝子の存在により、秋田６３号よりも糊化温度が高くなった。ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）の糊化ピーク温度は、＃４０１９（ＢＣ3）及び＃１２０６（ＢＣ3）よりも約７℃高かった。これは、ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）系統は、＃４０１９（ＢＣ3）および＃１２０６（ＢＣ3）系統と比較して、短いアミロペクチン鎖（ＤＰ≦１２）が少なく、長いアミロペクチン鎖（ＤＰ＞１３）が多かったためと考えられる。＃１２０３Ａ（ＢＣ3）の糊化ピーク温度は、ＥＭ１０（ＢＣ3）及び他の＃１２０３（ＢＣ3）系統の糊化温度より約３℃高かった。一方、＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）の糊化ピーク温度は、他の＃１２０６（ＢＣ3）系統の糊化ピーク温度より約３℃低かった。これらの結果は、ＤＰ＞１３のアミロペクチン鎖の量が＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）又は＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）よりも＃１２０３Ａ（ＢＣ3）の方が高かったためと考えられる。また、ＤＰ＞１３のアミロペクチン鎖の量は、＃１２０６Ａ（ＢＣ3）又は＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）よりも＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）の方が少なかった。これらの結果から、１３＜ＤＰ＜２５のアミロペクチン鎖の存在量の増加が糊化温度の上昇をもたらしたと考えられる。全ての系統の澱粉の糊化ピーク温度は、戻し交配後に２～４℃上昇したが、これは、開花時期が早くなることで登熟温度が高くなったためと考えられる。
【0097】
（ＲＳ値）
米粒のＲＳ値は、消化酵素の澱粉へのアクセス可能性を変える調理方法に応じて大幅に変化する。そこで、生米粉、糊化米粉、すり潰していない炊飯米、及びすり潰した炊飯米を用いて、全澱粉中のＲＳ値を測定した。
米粒のＲＳ値は、消化酵素の澱粉へのアクセス可能性を変える調理方法に応じて大幅に変化する。そこで、生米粉、糊化米粉、すり潰していない炊飯米、及びすり潰した炊飯米を用いて、全澱粉中のＲＳ値を測定した。
【0098】
図６は、異なる方法で処理された米のＲＳ値の結果を示す。図６（ａ）は生米粉、（ｂ）糊化米粉、（ｃ）すり潰していない炊飯米、及び（ｄ）すり潰した炊飯米のＲＳ値である。データは平均±標準誤差（ＳＥ、ｎ＝３）を示す。異なる小文字は、系統間の有意差を示す（Ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法）。
【0099】
全体として、ＥＭ１０（ＢＣ3）、＃４０１９（ＢＣ3）、＃１２０３（ＢＣ3）、及び＃１２０６（ＢＣ3）系統等の高ＲＳ系統のＲＳ値は、秋田６３号と比べて、処理方法に関係なく、かなり高かった（最大２９０倍）。米を糊化処理及びすりつぶし処理するとＲＳ値が減少した。生米粉（５～２９％）、すり潰していない炊飯米（１５～３５％）のＲＳ値は、それぞれ、糊化米粉（１～１１％）、すり潰した炊飯米（３～１５％）よりも高かった。
より具体的には、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）の生米粉のＲＳ値は、２０％以上であった。
一方、処理方法に関係なく、秋田６３号のＲＳ値はごくわずか（＜０．７％）で、カサラスも低かった（＜２．７％）。
より具体的には、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）の生米粉のＲＳ値は、２０％以上であった。
一方、処理方法に関係なく、秋田６３号のＲＳ値はごくわずか（＜０．７％）で、カサラスも低かった（＜２．７％）。
【0100】
活性型ＳＳＩＩａを有する＃１２０３Ａ（ＢＣ3）及び＃１２０６Ａ（ＢＣ3）の生米粉サンプルのＲＳ値は、活性型ＳＳＩＩａの少ないＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃４０１９（ＢＣ3）のサンプルより、それぞれ高かった。ＧＢＳＳＩ活性の高い＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）の生米粉のＲＳ値も、ＧＢＳＳＩ活性の低い＃１２０６Ａ（ＢＣ3）よりも高かった。これらの結果は、長鎖アミロペクチン及びアミロースの含有量が増加すると、生米粉のＲＳ値が上昇することを示唆している。米粉を糊化、又は米飯をすり潰すと、ＥＭ１０（ＢＣ3）と＃１２０３Ａ（ＢＣ3）のＲＳ値は、＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）と＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）に比べてかなり低くなった。また、＃４０１９（ＢＣ3）の糊化米粉及びすりつぶした炊飯米のＲＳ値は、他の＃１２０６（ＢＣ3）系統よりも低かった。ＢＥＩＩｂが存在しない場合、アミロースと長いアミロペクチンの分岐が相互作用して、老化の際に不完全なヘリックスを形成し、消化酵素による分解を防ぎ、ＲＳの一種である「ＲＳ２」及び「ＲＳ３」として機能すると推測できる。対照的に、長いアミロペクチン鎖の数は、ＢＥＩＩｂのみを欠く系統と比較して、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの両方を欠く系統では少なく、消化が容易になる。試験したすべての処理方法の中で、すり潰していない炊飯米のＲＳは、ＲＳ１だけでなく、ＲＳ２及びＲＳ３の側面も示すため、遺伝子型に関係なく、すり潰していない炊飯米が最も高いＲＳ値を示した。ＥＭ１０（ＢＣ3）やすべての＃１２０３（ＢＣ3）等のすりつぶしていない炊飯米サンプルのＲＳ値は高く、類似していた。
【0101】
戻し交配前のＥＭ１０系統、＃１２０３Ｂ系統、＃１２０３Ｃ系統の玄米のＲＳ値は２０～２６％であり、戻し交配によりＲＳ値がわずかに増加した。
本実施例の結果から、特定の食品用途向けのイネ品種の選択は、ＲＳ値だけでなく、澱粉とＲＳ構造にも基づく必要があることを示唆している。
本実施例の結果から、特定の食品用途向けのイネ品種の選択は、ＲＳ値だけでなく、澱粉とＲＳ構造にも基づく必要があることを示唆している。
【0102】
（アミロペクチンの構造、熱特性、及びアミロース含量がＲＳ値に及ぼす影響）
戻し交配前後の高ＲＳイネ系統の鎖長分布パターンは本質的に同じであり、戻し交配後のＤＰはわずかに増加した。戻し交配後、すべての系統の糊化温度がわずかに（２～４℃）上昇した。これは、おそらく開花時期が早かったことに伴う熟成温度が高いためである。具体的には、８＜ＤＰ＜２０のアミロペクチン鎖の割合を増加させたＳＳＩ等の他の澱粉生合成酵素の発現レベル及び／又は活性が高まった可能性がある。
戻し交配前後の高ＲＳイネ系統の鎖長分布パターンは本質的に同じであり、戻し交配後のＤＰはわずかに増加した。戻し交配後、すべての系統の糊化温度がわずかに（２～４℃）上昇した。これは、おそらく開花時期が早かったことに伴う熟成温度が高いためである。具体的には、８＜ＤＰ＜２０のアミロペクチン鎖の割合を増加させたＳＳＩ等の他の澱粉生合成酵素の発現レベル及び／又は活性が高まった可能性がある。
【0103】
ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）では、秋田６３号と比較して、短いアミロペクチン鎖（ＤＰ≦１２）が大幅に減少し、長いアミロペクチン鎖（１２＜ＤＰ＜３０）が増加した。ただし、＃４０１９（ＢＣ3）と＃１２０６（ＢＣ3）は、ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）よりも短鎖が多く、長鎖が少なかった。ＳＳＩＩＩａの欠損によりＳＳＩ発現が高まったことで、＃４０１９（ＢＣ3）と＃１２０６（ＢＣ3）が、ＥＭ１０（ＢＣ3）と＃１２０３（ＢＣ3）に比べて短鎖（ＤＰ≦１２）数の量が高いことを説明できると考えられる。表２に示したように、ＥＭ１０（ＢＣ3）及び＃１２０３（ＢＣ3）系統の短鎖の割合の減少は、それらの糊化温度に影響し、＃４０１９（ＢＣ3）及び＃１２０６（ＢＣ3）系統よりも約７℃高くなった。鎖長分布パターンの違いもＲＳ値に影響を与えた。ＢＥＩＩｂ欠損系統（＃１２０３）の米粉及び糊化米粉でのＲＳ値は、ＳＳＩＩＩａとＢＥＩＩｂの両方を欠損している系統（＃１２０６）よりもが高かった。
【0104】
加えて、ＧＢＳＳＩの高発現レベルもＲＳ値の増加に貢献した。ＥＭ１０（ＢＣ3）と＃１２０３Ｂ（ＢＣ3）との比較、及び＃１２０３Ａ（ＢＣ3）と＃１２０３Ｃ（ＢＣ3）との比較によれば、高発現ＧＢＳＳ１対立遺伝子を持つ系統が、低発現ｇｂｓｓ１L対立遺伝子を持つ系統よりも、高いアミロース及びＲＳ値を含むことを示した。＃４０１９（ＢＣ3）及び＃１２０６（ＢＣ3）のようなｓｓ３ａ ｂｅ２ｂの遺伝子型の系統では、アミロース含量は、ＧＢＳＳＩ対立遺伝子に関係なく高かった（３７～４２％）。これは、遺伝子型（ＧＢＳＳ１又はｇｂｓｓ１L）に関係なく、ＳＳＩＩＩａの非存在下でＧＢＳＳＩタンパク質のレベルが増加するためである。ＳＳＩＩＩａの欠損もＡＧＰａｓｅ活性を増加させる。すなわち、図１に示すように、ＧＢＳＳＩタンパク質レベルが＃１２０６Ｂ（ＢＣ3）及び＃１２０６Ｃ（ＢＣ3）系統よりも低いにもかかわらず、＃４０１９（ＢＣ3）及び＃１２０６Ａ（ＢＣ3）系統でアミロースが効率的に合成されたことを示唆している。それにもかかわらず、図６に示すように、ｓｓ３ａ ｂｅ２ｂ系統の中で、高発現ＧＢＳＳ１対立遺伝子を持つものは、低発現ｇｂｓｓ１L対立遺伝子を持つものよりも高いＲＳ値を示した。ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンにおける画分Ｉと画分ＩＩの間の谷は、ｇｂｓｓ１L対立遺伝子を保有する系統よりもＧＢＳＳ１対立遺伝子を保有する系統の方が高かった。長いアミロペクチン鎖又は短いアミロース等のグルカン鎖は、ＧＢＳＳＩによって合成されているため、ＲＳの形成に貢献している。このため、ＧＢＳＳＩの高発現レベルが戻し交配前の＃１２０３Ｂ及び＃１２０３Ｃ系統のアミロペクチン超長鎖の伸長に寄与した可能性があると考えられる。
【0105】
特許文献１に示すように、戻し交配前のＥＭ１０系統、＃１２０３Ｂ系統、＃１２０３Ｃ系統の精米のＲＳ値は２０～２６％であり、戻し交配によりＲＳ値がわずかに増加した。アミロース含量は戻し交配後にわずかに減少したが、長いアミロペクチン鎖の割合がわずかに増加したため、戻し交配によってＲＳ値のレベルがわずかに増加した。すり潰していない炊飯米のＲＳ値は、粒度、精米度、及び炊飯に加える水の量によっても影響を受ける可能性がある。しかしながら、戻し交配により開花が早くなり、その結果として種子の登熟中の温度が高くなり、ＲＳ生合成に最適な温度が確保されたためと考えられる。
【0106】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明は、高ＲＳ値で高種子重量のイネ変異体を提供でき、これを基にした米粉、ＲＳを含む澱粉、米粉ゲル、及び食品を製造でき、産業上利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】