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特開2024-107016ボツリヌス神経毒素Ａサブタイプ６および薬理学的使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024107016
(43)【公開日】2024-08-08
(54)【発明の名称】ボツリヌス神経毒素Ａサブタイプ６および薬理学的使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/33 20060101AFI20240801BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240801BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20240801BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240801BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240801BHJP
C12N 9/52 20060101ALI20240801BHJP
A61K 8/64 20060101ALN20240801BHJP
A61Q 19/00 20060101ALN20240801BHJP
C12R 1/145 20060101ALN20240801BHJP
【ＦＩ】
C07K14/33
A61K38/16
A61P21/00
A61P25/00
A61P25/06
A61P27/02
A61P17/00
C12N9/52
A61K8/64
A61Q19/00
C12R1:145
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024079408
(22)【出願日】2024-05-15
(62)【分割の表示】P 2020520234の分割
【原出願日】2018-10-11
(31)【優先権主張番号】62/572,159
(32)【優先日】2017-10-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】591013274
【氏名又は名称】ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン エリック
(72)【発明者】
【氏名】モリッツ モリー
(72)【発明者】
【氏名】ペレット サビーン
(72)【発明者】
【氏名】ブラッドショー マリテ
(72)【発明者】
【氏名】テップ ウィリアム
(57)【要約】
【課題】製剤およびボツリヌス毒素療法において使用するための特徴付けされた他のボツリヌス毒素を提供する。
【解決手段】本発明は、ボツリヌス毒素Ａ６の調製物および使用方法に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、ボツリヌス毒素Ａ６の調製物および使用方法に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法が必要な症状を有する患者を処置する方法であって、調製物が、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素または毒素複合体である、方法。
【請求項2】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０7～２×１０8ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
処置が、神経系障害または神経筋障害を特徴とする状態のためである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
処置が、頚部ジストニア、眼瞼けいれん、重度の原発性腋窩多汗症、斜視、アカラシア、慢性限局性ニューロパシーおよび片頭痛および他の頭痛障害、化粧品による問題、筋けいれん、上位運動ニューロン症候群、発汗、ならびにＢｏＮＴ／Ａ１で処置される神経障害からなる群から選択される状態のためである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
処置が化粧的処置である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
調製物が、少なくとも９５％の純度のＡ６毒素または毒素複合体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
調製物が、少なくとも９８％の純度のＡ６毒素複合体を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
調製物の細胞内への取り込みが、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して増大している、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が除去されるように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が除去されるように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
【請求項13】
調製物が、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
調製物が、少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
株がＣＤＣ４１３７０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６遺伝子が発現されるように改変された組換え微生物の培養物を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップ
を含む、方法。
（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６遺伝子が発現されるように改変された組換え微生物の培養物を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項17】
請求項１２に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
【請求項18】
請求項１６に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
【請求項19】
少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体の調製物。
【請求項20】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、請求項１９に記載の調製物。
【請求項21】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、請求項１９に記載の調製物。
【請求項22】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、請求項１９に記載の調製物。
【請求項23】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０7～２×１０8ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、請求項１９に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づき、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５７２，１５９号の利益を請求する。
連邦政府資金による研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＮＳ０８３６８８の下での政府支援を伴って行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づき、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５７２，１５９号の利益を請求する。
連邦政府資金による研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられたＮＳ０８３６８８の下での政府支援を伴って行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
本発明の分野は、ボツリヌス神経毒素Ａ６、組成物、および使用方法に関する。
人類に知られている最も有毒な物質であるボツリヌス神経毒素（Botulinum neurotoxin）（ＢｏＮＴ）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（クロストリジウム・ボツリヌム）ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒａｔｉｉの選択株によって生産されるタンパク毒素である（Hill and Smith, 2013; Johnson and Montecucco, 2008）。ＢｏＮＴは、ジスルフィド結合によって連結された１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）および５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）から作られた１５０ｋＤａの二本鎖タンパク質として合成される。ＨＣは、細胞質基質内へのＬＣの移動を助けるＮ末端ドメイン（ＨN）、および神経細胞上の細胞表面受容体を認識しこれに結合するＣ末端ドメイン（Ｈc）にさらに分けられる（Montal, 2010）。細胞内に入ると、ＬＣは、可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）の一部を特異的に切断し、これによって、神経伝達物質の放出を不活化する（Montecucco and Schiavo, 1994; Schiavo et al., 1995）。ＢｏＮＴは重い病気を生じさせる可能性を有するが、これはまた、３０億ドルを超え成長しているビジネスを含む、いくつかの神経筋障害の処置において効果的に使用され得る。
人類に知られている最も有毒な物質であるボツリヌス神経毒素（Botulinum neurotoxin）（ＢｏＮＴ）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（クロストリジウム・ボツリヌム）ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒａｔｉｉの選択株によって生産されるタンパク毒素である（Hill and Smith, 2013; Johnson and Montecucco, 2008）。ＢｏＮＴは、ジスルフィド結合によって連結された１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）および５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）から作られた１５０ｋＤａの二本鎖タンパク質として合成される。ＨＣは、細胞質基質内へのＬＣの移動を助けるＮ末端ドメイン（ＨN）、および神経細胞上の細胞表面受容体を認識しこれに結合するＣ末端ドメイン（Ｈc）にさらに分けられる（Montal, 2010）。細胞内に入ると、ＬＣは、可溶性Ｎ－エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）の一部を特異的に切断し、これによって、神経伝達物質の放出を不活化する（Montecucco and Schiavo, 1994; Schiavo et al., 1995）。ＢｏＮＴは重い病気を生じさせる可能性を有するが、これはまた、３０億ドルを超え成長しているビジネスを含む、いくつかの神経筋障害の処置において効果的に使用され得る。
【0003】
ＢｏＮＴは７つの確認された血清型（Ａ～Ｇ）に分けられ、これらは、アミノ酸配列のバリエーションに基づいてサブタイプにさらに下位分類される（Gimenez and Gimenez, 1995; Hill et al., 2007; Hill and Smith, 2013; Montecucco, 2015; Smith et al., 2005）。数多くのＢｏＮＴアイソタイプが今日知られているにもかかわらず、医薬品として利用されているのはただ２つだけ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１と、規模はずっと小さいがＢｏＮＴ／Ｂ１とだけである。これは、一部には、ほとんどのＢｏＮＴサブタイプの、そのアミノ酸配列および免疫学的特性に基づいて主に規定されている医薬特性の知識が比較的欠如していることに起因する。
【0004】
ここ数年で、その生物学的特性に関して特徴付けされたＢｏＮＴサブタイプは、比較的わずかしかない。ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ１～５のインビトロおよびインビボでの調査によって、効能、細胞移入動態、および作用期間を含む、血清型の中の一部のサブタイプの固有の特性が明らかにされている（Henkel et al., 2009; Tepp et al., 2012; Pier et al., 2011; Whitemarsh, 2013）。特に、ＢｏＮＴ／Ａ２は、治療的処置のために選択される別のサブタイプとして示唆され（Torii et al., 2010; Torii et al., 2014; Kaji, 2015）、日本において臨床試験中である。ＢｏＮＴ／Ａ２はＢｏＮＴ／Ａ１よりも速くかつ効率的に細胞内に入ることが示されている（Pier, 2010）。さらなる研究は、ＢｏＮＴ／Ａ２が、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、インビボでより効能があり、より低い副作用リスクで注射部位内に局在したままでいることが示唆している（Torii et al., 2010; Torii et al., 2014; Kaji, 2015）。さらに、最近検出されたＢｏＮＴ／ＡサブタイプＡ７およびＡ８は、インビトロで部分的に特徴付けされている（Morineaux et al., 2015）。
【0005】
しかし、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプの１つであるＢｏＮＴ／Ａ６ではほとんどのことが分かっておらず、その理由の大部分は、ＢｏＮＴ／Ａ６が２種毒素生産株において生産され、それがその単離および特徴付けを複雑にするという事実による。ＢｏＮＴ／Ａ６は、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプとアミノ酸配列が１４～４％異なり、最も大きい類似性はＡ１（９５．７％）およびＡ５（９５．９％）に対してであり、最も大きい不同性はＡ３（８６％）に対してである（Luquez et al., 2009; Morineaux et al., 2015）。興味深いことに、Ａ６のＬＣをＡ１と比較すると１つのアミノ酸だけが異なり（Ｔ４１４Ａ）、ＨＣの受容体結合ドメインおよび移動ドメインの両方においては、より大きな相違がある（Kull et al., 2015）。
製剤およびボツリヌス毒素療法において使用するための特徴付けされた他のボツリヌス毒素が必要である。
製剤およびボツリヌス毒素療法において使用するための特徴付けされた他のボツリヌス毒素が必要である。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物を対象に投与することを含む、ボツリヌス毒素療法を必要とする対象を処置する方法を提供する。
この研究は、インビトロおよびインビボの両方でのＢｏＮＴ／Ａ６の単離および特徴付けを記載する。本明細書において記載されるデータは、マウスおよびラットの初代ニューロンならびにヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するニューロンを含む他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較した、培養された神経細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の増大した効能およびより速い細胞移入動態を示す。マウスでの研究は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、局所的筋肉内注射後の、より速い作用発現および少なくとも同じ長さの作用期間と、長期間の最大局所麻痺とを示す。マウスでの研究はまた、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６を局所注射した後に重度の全身症状が少ないことも示す。これらのデータは、新規性および進歩性のあるバイオ医薬品としてのＢｏＮＴ／Ａ６の可能性を示す。
この研究は、インビトロおよびインビボの両方でのＢｏＮＴ／Ａ６の単離および特徴付けを記載する。本明細書において記載されるデータは、マウスおよびラットの初代ニューロンならびにヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するニューロンを含む他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較した、培養された神経細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の増大した効能およびより速い細胞移入動態を示す。マウスでの研究は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、局所的筋肉内注射後の、より速い作用発現および少なくとも同じ長さの作用期間と、長期間の最大局所麻痺とを示す。マウスでの研究はまた、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６を局所注射した後に重度の全身症状が少ないことも示す。これらのデータは、新規性および進歩性のあるバイオ医薬品としてのＢｏＮＴ／Ａ６の可能性を示す。
【0007】
一態様では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６または神経毒素複合体を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法の恩恵を受ける症状を有する患者を処置する方法であって、調製物が、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素または毒素複合体である、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６毒素のみを発現する（そして、他のＢｏＮＴ毒素は発現しない）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株を培養すること、および（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ６毒素を培養物から単離することを含み、毒素が少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体である、方法を提供する。一部の実施形態では、培養物は、組換えＢｏＮＴ／Ａ６毒素を発現する。他の変形では、培養物は、ＢｏＮＴ／Ａ６を含む、２つ以上の毒素を先天的に発現する細菌株の改変型である。
別の態様では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６毒素のみを発現する（そして、他のＢｏＮＴ毒素は発現しない）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株を培養すること、および（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ６毒素を培養物から単離することを含み、毒素が少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体である、方法を提供する。一部の実施形態では、培養物は、組換えＢｏＮＴ／Ａ６毒素を発現する。他の変形では、培養物は、ＢｏＮＴ／Ａ６を含む、２つ以上の毒素を先天的に発現する細菌株の改変型である。
【0008】
別の態様では、本開示は、少なくとも９０％または少なくとも９５％の純度のＡ６毒素または毒素複合体である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の調製物を提供する。
本発明の前述のおよび他の態様ならびに利点は、以下の記載から明らかとなろう。本明細書において、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照され、この図面においては、説明のための手段として、本発明の好ましい実施形態が示されている。このような実施形態は、本発明の全範囲を必ずしも表しているわけではないが、したがって、本発明の範囲を解釈するためには、特許請求の範囲および本明細書が参照される。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴うこの特許または特許出願の刊行物のコピーは、必要経費の要求および支払いが済んだ後に特許庁によって提供されるであろう。
本発明の前述のおよび他の態様ならびに利点は、以下の記載から明らかとなろう。本明細書において、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照され、この図面においては、説明のための手段として、本発明の好ましい実施形態が示されている。このような実施形態は、本発明の全範囲を必ずしも表しているわけではないが、したがって、本発明の範囲を解釈するためには、特許請求の範囲および本明細書が参照される。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴うこの特許または特許出願の刊行物のコピーは、必要経費の要求および支払いが済んだ後に特許庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】ＭＳＣ由来の初代ニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を示す図である。細胞を、ＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に４８時間曝露した。ＭＳＣ細胞の溶解物を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって分析した。３連の試料の平均および標準偏差を示す代表的なウェスタンイメージおよびグラフが示されている。グラフはＰＲＩＳＭ６ソフトウェアで作成し、非線形回帰直線を使用してＥＣ50値を決定した。ＥＣ５０は０．０２ｐＭであった。比較として、ＢｏＮＴ／Ａ１のＥＣ５０は０．１５～０．２ｐＭである。
【図1B】ＲＳＣ由来のニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を示す図である。細胞を、ＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に４８時間曝露した。ＲＳＣ細胞の溶解物を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって分析した。３連の試料の平均および標準偏差を示す代表的なウェスタンイメージおよびグラフが示されている。グラフはＰＲＩＳＭ６ソフトウェアで作成し、非線形回帰直線を使用してＥＣ50値を決定した。ＥＣ５０は０．０２ｐＭであった。比較として、ＢｏＮＴ／Ａ１のＥＣ５０は０．２ｐＭである。
【図1C】ｈｉＰＳＣ由来のニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を示す図である。細胞を、ＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に４８時間曝露した。ｈｉＰＳＣ細胞の溶解物を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって分析した。３連の試料の平均および標準偏差を示すグラフが示されている。グラフはＰＲＩＳＭ６ソフトウェアで作成し、非線形回帰直線を使用してＥＣ50値を決定した。ＥＣ５０は０．０４ｐＭであった。比較として、ＢｏＮＴ／Ａ１のＥＣ５０は０．３ｐＭである。
【図2A】ｈｉＰＳＣ由来のニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50および作用期間を示す図である。ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンを、ＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に７２時間曝露し、その後、毒素を完全に除去した。細胞を、毒素を含まない培養培地においてインキュベートし、曝露後３日目、３９日目、および７０日目に採取した。３連の試料の平均および標準偏差を示すグラフが示されている。グラフはＰＲＩＳＭ６ソフトウェアで作成し、非線形回帰直線を使用してＥＣ50値を決定した。
【図2B】ｈｉＰＳＣ由来のニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ１のＥＣ50および作用期間を示す図である。ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンを、ＢｏＮＴ／Ａ１の連続希釈物に７２時間曝露し、その後、毒素を完全に除去した。細胞を、毒素を含まない培養培地においてインキュベートし、曝露後３日目、３９日目、および７０日目に採取した。３連の試料の平均および標準偏差を示すグラフが示されている。グラフはＰＲＩＳＭ６ソフトウェアで作成し、非線形回帰直線を使用してＥＣ50値を決定した。
【図2C】ｈｉＰＳＣ由来のニューロンにおける、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の半減期を示す図である。Ａ１およびＡ６の半減期を、式ｔ１／２＝ＬＮ（２）／傾きを使用して、経時的なＥＣ50値を介して、回帰直線フィットの傾きを使用して推定した。半減期は類似しており、Ａ１およびＡ６でそれぞれ約１２日間および約１４日間であった。
【図3】ＲＳＣにおける切断されていないＳＮＡＰ－２５の回復を示す図である。ＲＳＣを、８ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ６に曝露した。細胞溶解物を、毒素への曝露後８ヶ月間にわたり、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって、切断された／切断されていないＳＮＡＰ－２５について分析した。図は、これまでにＢｏＮＴ／Ａ１で観察されたものに類似のまたはそれと少なくとも同じ長さの、ラット初代脊髄細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ６活性の長い持続性を示す。
【図4A】Ａ１およびＡ２と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を示す図である。ｉＣｅｌｌニューロンを同量の毒素に曝露し、曝露後、示した時点でのＳＮＡＰ－２５の切断について分析した。細胞を、等しいｐＭ量の（６７ｐＭ（５００ｐｇ））のＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６毒素に曝露した（Ａ）。
【図4B】Ａ１およびＡ２と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を示す図である。ｉＣｅｌｌニューロンを同量の毒素に曝露し、曝露後、示した時点でのＳＮＡＰ－２５の切断について分析した。細胞を、等しい単位量のＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６毒素に曝露した。このデータは、ＢｏＮＴ／Ａ６がＢｏＮＴ／Ａ１よりも速く、かつＢｏＮＴ／Ａ２と少なくとも同じ速さで細胞に入ることを示す。
【図5A】インビボでのＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ１の作用発現および作用期間を示す図である。右腓腹筋に０．６、０．４、および０．２ＵのＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ１を注射されたマウスの平均ＤＡＳスコアが、グラフで示されている。ｎ＝５。
【図5B】インビボでのＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ１の作用発現および作用期間を示す図である。右腓腹筋に０．６、０．４、および０．２ＵのＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ１を注射されたマウスの平均ロータロッド時間が、グラフで示されている。ｎ＝５。
【図5C】インビボでのＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ１の作用発現および作用期間を示す図である。注射後最初の７２時間以内のＤＡＳスコアを示すグラフを別個に観察して、最大麻痺の作用発現を比較した。ｎ＝５。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、１つまたは複数の好ましい実施形態に関して記載されており、明示的に言及されたものとは別に、多くの同等物、代替物、変形、および改変が可能であり、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。ボツリヌス神経毒素Ａサブタイプ６（ＢｏＮＴ／Ａ６）は、商業的な他のＢｏＮＴと比較して、広範な状態の治療的処置のため、および美容的使用のための、有利なバイオ医薬品としての可能性を示す。現在のところ、ＢｏＮＴ／Ａ１（ボトックス、ゼオミン、ディスポート）または規模は小さいがＢｏＮＴ／Ｂ１（Ｍｙｏｂｌｏｃ）のみが、経済的に大きく成長している３０億ドルの産業を構成する医薬品として使用されている。他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較したＢｏＮＴ／Ａ６の研究によって、Ａ６がＡ１またはＡ２での処置よりも優れた利点を有すると考えられることが示されている。
【0011】
毒素は、異なる構造および配列を有する。Ａ６のアミノ酸配列は、Ａ１のアミノ酸配列と異なる（主に重鎖において４．３％の差）。Ａ１の結晶構造は決定されているが、Ａ６は結晶化されていない。
ＧｅｎｂａｎｋにおけるＡ１の配列の受託番号は、Ａ１ ＣＡＬ８２３６０．１ボツリヌス神経毒素タイプＡ前駆体［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ株ＡＴＣＣ ３５０２］であり、Ａ６は、Ａ６ ＡＣＷ８３６０８．１ボツリヌス神経毒素タイプＡ［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ］である。
ＧｅｎｂａｎｋにおけるＡ１の配列の受託番号は、Ａ１ ＣＡＬ８２３６０．１ボツリヌス神経毒素タイプＡ前駆体［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ株ＡＴＣＣ ３５０２］であり、Ａ６は、Ａ６ ＡＣＷ８３６０８．１ボツリヌス神経毒素タイプＡ［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ］である。
【0012】
ヒト細胞および齧歯類細胞の研究の本発明者らの結果は、ＢｏＮＴ／Ａ６が、培養されたニューロンにおいて、特にヒトニューロンにおいて、Ａ１と比較して１０倍高い効能があり、培養されたニューロンにおける標的（ＳＮＡＲＥ）切断の作用発現がより速く、かつ、長い作用期間を有することを示す。インビボでのマウスでの研究は、作用期間がＡ１およびＡ２と少なくとも同じ長さであること、ならびに局所的筋肉内注射後の全身分布がＡ１およびＡ２と比較して少ないことを示す。さらに、ＢｏＮＴ／Ａ６は、Ａ２と少なくとも同じ効能またはそれよりも高い効能を有する。
いかなる理論にも拘束されないが、Ａ６での処置は、注射部位内に局在化し続けるその能力に起因して、より安全であり、したがって、毒素の（全身への）分散に起因する副作用のリスクを低下させる。さらに、ニューロンにおける、より高い効能およびより速い作用発現は、ＢｏＮＴ／Ａ６が、同一の薬学的効果を得るための用量がおそらくより少なくてよい、より効果的な処置としての可能性を有することを示す。ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、注射された組織においてより局在化し続けることによる副作用のリスクを低下させながら、迅速な活性作用発現ならびにＡ１およびＡ２と少なくとも同じ長さの持続期間を伴う、症状を緩和する能力を有する。
いかなる理論にも拘束されないが、Ａ６での処置は、注射部位内に局在化し続けるその能力に起因して、より安全であり、したがって、毒素の（全身への）分散に起因する副作用のリスクを低下させる。さらに、ニューロンにおける、より高い効能およびより速い作用発現は、ＢｏＮＴ／Ａ６が、同一の薬学的効果を得るための用量がおそらくより少なくてよい、より効果的な処置としての可能性を有することを示す。ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、注射された組織においてより局在化し続けることによる副作用のリスクを低下させながら、迅速な活性作用発現ならびにＡ１およびＡ２と少なくとも同じ長さの持続期間を伴う、症状を緩和する能力を有する。
【0013】
本発明は、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素または毒素複合体であり、部分的複合体を含み得る、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の単離された調製物を検討する。別の実施形態では、調製物は、少なくとも９５％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体である。本発明はまた、少なくとも９０％の純度である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の単離された調製物も検討する。
本明細書において記載される調製物としては、部分的毒素複合体を含む調製物を含む、精製されたＢｏＮＴ／Ａ６毒素複合体が含まれ得る。一部の実施形態では、調製物は、ＢｏＮＴタンパク質を安定化させることが知られている安定剤をさらに含み得る。適切な安定剤は当技術分野において公知であり、これとしては、限定はしないが、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６６３号（この内容は、参照によりその全体が組み込まれる）においてとりわけ記載されている、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチン、組換えアルブミンが含まれる。
本明細書において記載される調製物としては、部分的毒素複合体を含む調製物を含む、精製されたＢｏＮＴ／Ａ６毒素複合体が含まれ得る。一部の実施形態では、調製物は、ＢｏＮＴタンパク質を安定化させることが知られている安定剤をさらに含み得る。適切な安定剤は当技術分野において公知であり、これとしては、限定はしないが、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６６３号（この内容は、参照によりその全体が組み込まれる）においてとりわけ記載されている、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチン、組換えアルブミンが含まれる。
【0014】
一部の実施形態では、開示される方法において使用されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも少なくとも約１０倍高い効能がある。さらなる実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、齧歯類細胞モデルおよびヒト細胞モデルにおいて、約２０～約４０ｆＭ、例えば約３０ｆＭのＥＣ５０を有する。ＢｏＮＴ／Ａ６は、同一の細胞モデルにおいて、Ａ２に類似のＥＣ５０を有する。Ａ１のＥＣ５０は、Ａ６よりも約１０倍高く、すなわち、２００～４００ｆＭである。
一部の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、低減された全身組織の毒素分布を有する。一部の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素は局在化が可能であり、筋肉内に投与した場合、低減された全身組織分布を有する。いかなる理論にも拘束されないが、この全身組織分布の低減によって、（１）より多くの量が接触区域で濃縮されたままとなるため、より高い投薬量の使用が可能となり、ならびに（２）神経毒素が投与部位の付近に留まるため、より大きな安全性および意図しない副作用を低減できる。例えば、用量依存性で影響および期間を増大させるＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、より多くの量のＢｏＮＴ／Ａ６を注射することができ、全身への広がりがあまりないことによって、これらのより多くの量のＢｏＮＴ／Ａ６の安全な投与が可能となる。
一部の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、低減された全身組織の毒素分布を有する。一部の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素は局在化が可能であり、筋肉内に投与した場合、低減された全身組織分布を有する。いかなる理論にも拘束されないが、この全身組織分布の低減によって、（１）より多くの量が接触区域で濃縮されたままとなるため、より高い投薬量の使用が可能となり、ならびに（２）神経毒素が投与部位の付近に留まるため、より大きな安全性および意図しない副作用を低減できる。例えば、用量依存性で影響および期間を増大させるＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、より多くの量のＢｏＮＴ／Ａ６を注射することができ、全身への広がりがあまりないことによって、これらのより多くの量のＢｏＮＴ／Ａ６の安全な投与が可能となる。
【0015】
一部の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ１と同一の治療効果を、より少ない量のＢｏＮＴ／Ａ６を使用することによって得ることができる。
さらに、一態様では、培養されたニューロンにおいてＡ６の効能がより高いことによって、製品リリース試験のための細胞ベースアッセイの開発がより容易になる。
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、約１～３×１０7ＬＤ５０ユニット／ｍｇ、例えば、約１．７×１０7マウスＬＤ５０ユニット／ｍｇの特異的活性を有する。ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体の特異的活性は、マウスにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１とほぼ同一である。
一実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法を必要とする症状を有する患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、調製物は、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素である。別の実施形態では、調製物は、少なくとも９３％の純度のＡ６毒素、あるいは少なくとも９５％の純度のＡ６毒素、あるいは少なくとも９８％の純度のＡ６毒素である。
一部の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ６調製物の細胞内への取り込みは、ＢｏＮＴ／Ａ２を含む調製物と比較して、増大している。
さらに、一態様では、培養されたニューロンにおいてＡ６の効能がより高いことによって、製品リリース試験のための細胞ベースアッセイの開発がより容易になる。
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６は、約１～３×１０7ＬＤ５０ユニット／ｍｇ、例えば、約１．７×１０7マウスＬＤ５０ユニット／ｍｇの特異的活性を有する。ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体の特異的活性は、マウスにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１とほぼ同一である。
一実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法を必要とする症状を有する患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、調製物は、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素である。別の実施形態では、調製物は、少なくとも９３％の純度のＡ６毒素、あるいは少なくとも９５％の純度のＡ６毒素、あるいは少なくとも９８％の純度のＡ６毒素である。
一部の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ６調製物の細胞内への取り込みは、ＢｏＮＴ／Ａ２を含む調製物と比較して、増大している。
【0016】
用語「対象」および「患者」は、区別せずに用いられ、ある特定の処置のレシピエントとなる、限定はしないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含む任意の動物（例えば哺乳動物）を指す。典型的には、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関連して、本明細書において区別せずに用いられる。
本明細書において使用される場合、用語「処置する」は、患者における、ボツリヌス毒素療法の恩恵を受ける症状の状態を低減させること、根絶すること、改善すること、または前記症状のあらゆる態様の重症度を減少することを指す。特に、本発明は、ボツリヌス毒素療法の恩恵を受ける症状を有する患者を処置する方法を含む。このようなケースでは、本方法は、有効量の、本明細書において提供されるＢｏＮＴ／Ａ６調製物で患者を処置し、それによって、症状を低減させる、根絶する、または減少することを含み得る。
本明細書において使用される場合、用語「処置する」は、患者における、ボツリヌス毒素療法の恩恵を受ける症状の状態を低減させること、根絶すること、改善すること、または前記症状のあらゆる態様の重症度を減少することを指す。特に、本発明は、ボツリヌス毒素療法の恩恵を受ける症状を有する患者を処置する方法を含む。このようなケースでは、本方法は、有効量の、本明細書において提供されるＢｏＮＴ／Ａ６調製物で患者を処置し、それによって、症状を低減させる、根絶する、または減少することを含み得る。
【0017】
本発明のＢｏＮＴ／Ａ６調製物は、治療有効量で投与することができる。用語「有効量」または「治療有効量」は、有利なまたは所望の生物学的および／または臨床的結果をもたらすために十分な量を指す。本発明のＢｏＮＴ／Ａ６調製物は、必要な処置のタイプに応じて、治療有効量で投与することができる。個々の処置について適切な投薬量または投薬量範囲を決定する方法は、当業者に公知である。本明細書において提供される方法では、本発明のＢｏＮＴ／Ａ６調製物は、意図した目的を達成する、または当業者によって適切であるとみなされる、任意の手段によって投与することができる。典型的な実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ６調製物は、単回用量として、または、適切であれば、例えば、ミニポンプシステムを使用する連続投与として、投与される。一部のケースでは、ＢｏＮＴ／Ａ６調製物は、液体投薬形態として、または凍結乾燥された投薬形態として、すなわち、例えば投与前に再構成されて提供される。
いかなる理論にも拘束されないが、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体を含む製剤は、全身毒性が低いことに起因して、より良好な安全性プロファイルを有し、したがって、ボトックス療法が使用される任意の適用に使用することができる。
いかなる理論にも拘束されないが、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体を含む製剤は、全身毒性が低いことに起因して、より良好な安全性プロファイルを有し、したがって、ボトックス療法が使用される任意の適用に使用することができる。
【0018】
一実施形態では、適切な投薬量は、約０．０１～２０００ユニットであり、好ましくは、成人では０．５～６００ユニットが筋肉内に一度に投与される。１ユニットは、本明細書において、腹腔内投与した場合にマウスの半数が死亡する毒素量（１ＬＤ50）として定義される。患者のための総用量は、約０．０１～２０００ユニットの範囲内である。一実施形態では、適切な投薬量は、約５００～１０００Ｕである。
本発明のＢｏＮＴ／Ａ６の調製物は、筋肉の過活動を伴う疾患に罹患している患者を処置するために、またいくつかの例では、タイプＡ１ボツリヌス毒素に対する中和抗体を有する対象において、好適に使用することができる。本明細書において記載される調製物は、局所的な筋肉の異常収縮を減少させるために使用することができる。好適な疾患としては、限定はしないが、例えば、とりわけ、頚部ジストニア、眼瞼けいれん、重度の原発性腋窩多汗症、斜視、アカラシア、慢性的な限局性ニューロパシーおよび片頭痛および他の頭痛障害、化粧品による問題、筋けいれん、上位運動ニューロン症候群、発汗、ＢｏＮＴ／Ａ１で処置される神経障害、片側顔面けいれん、けいれん性斜頸、脳卒中後の痙性、脳性麻痺、けいれん性発声障害、腰痛などの慢性疼痛、肩凝り、パーキンソン病もしくは多発性硬化症の発症で生じる不全麻痺、筋筋膜性疼痛症候群、咀嚼筋のけいれん、慢性的な裂肛、過活動膀胱、ブラキシズム、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニア、またはしわが含まれる。慢性片頭痛などの頭痛は、首および肩における病的な筋肉の異常収縮に起因して生じ得、その筋張力は、筋肉の疲労に起因して病的に促進することがあり、最終的には、腰痛、首もしくは背中の痛みなどの慢性疼痛、または肩凝りを誘発する。
本発明のＢｏＮＴ／Ａ６の調製物は、筋肉の過活動を伴う疾患に罹患している患者を処置するために、またいくつかの例では、タイプＡ１ボツリヌス毒素に対する中和抗体を有する対象において、好適に使用することができる。本明細書において記載される調製物は、局所的な筋肉の異常収縮を減少させるために使用することができる。好適な疾患としては、限定はしないが、例えば、とりわけ、頚部ジストニア、眼瞼けいれん、重度の原発性腋窩多汗症、斜視、アカラシア、慢性的な限局性ニューロパシーおよび片頭痛および他の頭痛障害、化粧品による問題、筋けいれん、上位運動ニューロン症候群、発汗、ＢｏＮＴ／Ａ１で処置される神経障害、片側顔面けいれん、けいれん性斜頸、脳卒中後の痙性、脳性麻痺、けいれん性発声障害、腰痛などの慢性疼痛、肩凝り、パーキンソン病もしくは多発性硬化症の発症で生じる不全麻痺、筋筋膜性疼痛症候群、咀嚼筋のけいれん、慢性的な裂肛、過活動膀胱、ブラキシズム、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニア、またはしわが含まれる。慢性片頭痛などの頭痛は、首および肩における病的な筋肉の異常収縮に起因して生じ得、その筋張力は、筋肉の疲労に起因して病的に促進することがあり、最終的には、腰痛、首もしくは背中の痛みなどの慢性疼痛、または肩凝りを誘発する。
【0019】
本発明の調製物で処置される筋肉の異常収縮を伴う疾患は、好ましくは、筋肉の異常収縮の迅速且つ長く続く緩和が必要な疾患、すなわち、即効性を有する調製物での処置が必要な疾患である。筋肉の異常収縮を伴うこのような疾患としては、処置が累積の有効性で行われる、有効用量が決定されるまで用量を調整しながら調製物が投与される疾患が含まれる。筋肉の異常収縮を伴う全身性疾患としては、全身性ジストニア、全身性拘縮、脳卒中後の痙性、脳性麻痺、パーキンソン病、および多発性硬化症が含まれる。
本発明の調製物は、有効量で投与することができる。ヒトに投与する場合、その好ましい投与経路は局所投与であるかまたは注射によるものであり、さらに好ましくは、筋肉内投与および皮下投与である。投与のタイミングおよび用量は特に限定されず、症状の重症度、年齢、性別、体重、投与部位、および投与経路に応じて変化し得る。
別の実施形態では、処置は、化粧的処置である。
本発明の調製物は、有効量で投与することができる。ヒトに投与する場合、その好ましい投与経路は局所投与であるかまたは注射によるものであり、さらに好ましくは、筋肉内投与および皮下投与である。投与のタイミングおよび用量は特に限定されず、症状の重症度、年齢、性別、体重、投与部位、および投与経路に応じて変化し得る。
別の実施形態では、処置は、化粧的処置である。
【0020】
本明細書において記載されるＢｏＮＴ／Ａ６毒素の調製物のための好適な投与経路としては、限定はしないが、直接的な注射によるまたは局所適用による適用が含まれる。
ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が不活化されているかまたはノックアウトされている株ＣＤＣ４１３７０（ＣＤＣから入手可能）を含む、ＴＡ改変Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株を、本明細書において記載される方法のための、精製されたｂｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体を生産する方法において使用することができる。遺伝子を不活化またはノックアウトする適切な方法は、当技術分野において公知であり、これとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓもしくはｐｙｒｅ技術が含まれるか、または、Ｃｌｏｓｔｒｏｎ方法論の使用が、その内容の全体が組み込まれる、Pellett et al. 2016において、他の株向けにこれまでに記載されている。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法もまた提供される。一実施形態では、本方法は、（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子を欠いている改変Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株ＣＤＣ４１３７０の培養物を培養するステップ、および（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップを含む。本方法は、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６、あるいは少なくとも９５％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６、あるいは少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６を含む調製物を生産することを可能とする。
ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が不活化されているかまたはノックアウトされている株ＣＤＣ４１３７０（ＣＤＣから入手可能）を含む、ＴＡ改変Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株を、本明細書において記載される方法のための、精製されたｂｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体を生産する方法において使用することができる。遺伝子を不活化またはノックアウトする適切な方法は、当技術分野において公知であり、これとしては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓもしくはｐｙｒｅ技術が含まれるか、または、Ｃｌｏｓｔｒｏｎ方法論の使用が、その内容の全体が組み込まれる、Pellett et al. 2016において、他の株向けにこれまでに記載されている。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法もまた提供される。一実施形態では、本方法は、（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子を欠いている改変Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株ＣＤＣ４１３７０の培養物を培養するステップ、および（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップを含む。本方法は、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６、あるいは少なくとも９５％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６、あるいは少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６を含む調製物を生産することを可能とする。
【0021】
本発明の毒素は、様々な他の手段で生産することができる。先におよび以下に記載の株は、この毒素を先天的に生産することが現在知られている唯一の株である。しかし、この株は、第２のＢｏＮＴ（Ｂ２）遺伝子が完全にノックアウトされるように改変することができる。また、ＢｏＮＴ／Ａ６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、または酵母の遺伝子組換え、あるいはＢｏＮＴ／Ａ６遺伝子の発現による別の一般的な発現系によって生産することができる。
本発明はまた、記載される方法において使用できるキットも提供する。例えば、一実施形態では、キットは、約９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素であるＢｏＮＴ／Ａ６の調製物、および投与のための指示を提供する。キットはまた、凍結乾燥されたＢｏＮＴ／Ａ６、および投与の前にその中でＢｏＮＴ／Ａ６毒素を再構成するための無菌の薬学的に許容可能な担体を含み得る。
適切な薬学的担体としては、限定はしないが、例えば、生理食塩水溶液（例えば、０．９％塩化ナトリウム）、リン酸緩衝生理食塩水、ラクトリンゲル液、およびそれに類するものが含まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮して、より完全に理解されよう。
本発明はまた、記載される方法において使用できるキットも提供する。例えば、一実施形態では、キットは、約９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素であるＢｏＮＴ／Ａ６の調製物、および投与のための指示を提供する。キットはまた、凍結乾燥されたＢｏＮＴ／Ａ６、および投与の前にその中でＢｏＮＴ／Ａ６毒素を再構成するための無菌の薬学的に許容可能な担体を含み得る。
適切な薬学的担体としては、限定はしないが、例えば、生理食塩水溶液（例えば、０．９％塩化ナトリウム）、リン酸緩衝生理食塩水、ラクトリンゲル液、およびそれに類するものが含まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮して、より完全に理解されよう。
【実施例0022】
（実施例１）ＢｏＮＴ／Ａ６の単離および特徴付け
この実施例は、インビトロおよびインビボの両方でのＢｏＮＴ／Ａ６の単離および特徴付けを説明する。本明細書において記載されるデータは、マウスおよびラット初代ニューロンならびにヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するニューロンを含む他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較した、培養された神経細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の増大した効能およびより速い細胞移入動態を示す。マウスでの研究は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、局所的筋肉内注射後の、より速い作用発現および少なくとも同じ長さの作用期間と、長期間の最大局所麻痺とを示す。これらのデータは、新規性および進歩性のあるバイオ医薬品としてのＢｏＮＴ／Ａ６の可能性を示す。
材料および方法：
バイオセーフティー、バイオセキュリティー、および倫理
Ｊｏｈｎｓｏｎの実験室および職員は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）およびクロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）のＢｏＮＴ生産株を伴うリサーチについて、連邦政府の指定生物剤プログラムに登録されている。リサーチのプログラム、手順、ドキュメンテーション、セキュリティー、および施設は、ウィスコンシン大学マディソン校のバイオセキュリティータスクフォース、ウィスコンシン大学マディソン校のバイオセーフティーオフィス、ウィスコンシン大学マディソン校の指定生物剤プログラム、およびウィスコンシン大学マディソン校の指定生物剤プログラムの一部としてのアメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって、緊密に監視されている。全ての職員は、ＢｏＮＴおよび神経毒素生産性のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍを伴う実験室での研究に参加する前に、適合性評価を受けており、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）またはＢＳＬ２および指定生物剤の訓練を含む、厳しく継続的なバイオセーフティートレーニングを完了している。全ての動物実験は、ウィスコンシン大学の動物実験委員会のガイドラインによって承認され、これに従って行われた。
この実施例は、インビトロおよびインビボの両方でのＢｏＮＴ／Ａ６の単離および特徴付けを説明する。本明細書において記載されるデータは、マウスおよびラット初代ニューロンならびにヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するニューロンを含む他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較した、培養された神経細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の増大した効能およびより速い細胞移入動態を示す。マウスでの研究は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、局所的筋肉内注射後の、より速い作用発現および少なくとも同じ長さの作用期間と、長期間の最大局所麻痺とを示す。これらのデータは、新規性および進歩性のあるバイオ医薬品としてのＢｏＮＴ／Ａ６の可能性を示す。
材料および方法：
バイオセーフティー、バイオセキュリティー、および倫理
Ｊｏｈｎｓｏｎの実験室および職員は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）およびクロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）のＢｏＮＴ生産株を伴うリサーチについて、連邦政府の指定生物剤プログラムに登録されている。リサーチのプログラム、手順、ドキュメンテーション、セキュリティー、および施設は、ウィスコンシン大学マディソン校のバイオセキュリティータスクフォース、ウィスコンシン大学マディソン校のバイオセーフティーオフィス、ウィスコンシン大学マディソン校の指定生物剤プログラム、およびウィスコンシン大学マディソン校の指定生物剤プログラムの一部としてのアメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって、緊密に監視されている。全ての職員は、ＢｏＮＴおよび神経毒素生産性のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍを伴う実験室での研究に参加する前に、適合性評価を受けており、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）またはＢＳＬ２および指定生物剤の訓練を含む、厳しく継続的なバイオセーフティートレーニングを完了している。全ての動物実験は、ウィスコンシン大学の動物実験委員会のガイドラインによって承認され、これに従って行われた。
【0023】
ボツリヌス神経毒素
ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を、これまでに記載されているようにして、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株Ｈａｌｌ Ａ－ｈｙｐｅｒおよびＫｙｏｔｏ－Ｆから精製した（Malizio et al., 2000; Tepp et al., 2012; Jacobson et al., 2011）。ＢｏＮＴ／Ａ６を、ＢｏＮＴ／Ｂ２およびＢｏＮＴ／Ａ６の両方を発現する改変株ＣＤＣ４１３７０から精製した。ＢｏＮＴ／Ｂ２の遺伝子を、他の株向けにこれまでに記載されているようにして（参照によりその全体が組み込まれる、Pellett et al., 2016）、Ｃｌｏｓｔｒｏｎ方法論を使用してサイレンシングし、ＢｏＮＴ／Ａ６を高レベルで排他的に発現する株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-を得た。ＢｏＮＴ／Ａ６を次いで、（Malizio et al. 2000; Tepp et al, 2012; Jacobson et al., 2011; Lin et al., 2010）に記載されている、これまでに公開されている方法を使用して、株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-から単離した。毒素の純度を、分光法およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。精製された毒素を、使用するまで、４０％グリセロール中で－２０℃で保管した。各サブタイプ調製物の特異的活性を、これまでに記載されているようにして、腹腔内のマウスバイオアッセイ（ＭＢＡ）を使用して判定した。毒素の特異的活性は、３．５ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ１）、７．９ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ２）、および５．９５ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ６）であった。
ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を、これまでに記載されているようにして、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株Ｈａｌｌ Ａ－ｈｙｐｅｒおよびＫｙｏｔｏ－Ｆから精製した（Malizio et al., 2000; Tepp et al., 2012; Jacobson et al., 2011）。ＢｏＮＴ／Ａ６を、ＢｏＮＴ／Ｂ２およびＢｏＮＴ／Ａ６の両方を発現する改変株ＣＤＣ４１３７０から精製した。ＢｏＮＴ／Ｂ２の遺伝子を、他の株向けにこれまでに記載されているようにして（参照によりその全体が組み込まれる、Pellett et al., 2016）、Ｃｌｏｓｔｒｏｎ方法論を使用してサイレンシングし、ＢｏＮＴ／Ａ６を高レベルで排他的に発現する株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-を得た。ＢｏＮＴ／Ａ６を次いで、（Malizio et al. 2000; Tepp et al, 2012; Jacobson et al., 2011; Lin et al., 2010）に記載されている、これまでに公開されている方法を使用して、株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-から単離した。毒素の純度を、分光法およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。精製された毒素を、使用するまで、４０％グリセロール中で－２０℃で保管した。各サブタイプ調製物の特異的活性を、これまでに記載されているようにして、腹腔内のマウスバイオアッセイ（ＭＢＡ）を使用して判定した。毒素の特異的活性は、３．５ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ１）、７．９ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ２）、および５．９５ｐｇ／ＬＤ５０（Ａ６）であった。
【0024】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析を、これまでに記載されているようにして行った（Pellett et al., 2010; Whitemarsh et al., 2012; Pellett et al., 2007）。全ての細胞溶解物を、ＭＥＳランニングバッファーを使用して１２％Ｎｏｖｅｘ ＮＵＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜をブロックバッファーで３０分間、次いで、抗ＳＮＡＰ－２５（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）一次抗体溶液で一晩、インキュベートした。洗浄バッファー（ＫＰＬ）で５５分間洗浄した後、膜をｄｄＨ2Ｏですすぎ、抗マウス二次抗体（ＫＰＬ）溶液で１時間インキュベートした。５回のさらなる洗浄を行い、膜をｄｄＨ2Ｏですすぎ、化学発光基質（Ｐｈｏｓｐｈａｇｌｏ、ＫＰＬ）で約３分間インキュベートした。膜のバンドの画像を得、ＴｏｔａｌＬａｂ ＱｕａｎｔおよびＰＲＩＳＭ６ソフトウェアを用いてデンシトメトリーによって分析した。
ウェスタンブロット分析を、これまでに記載されているようにして行った（Pellett et al., 2010; Whitemarsh et al., 2012; Pellett et al., 2007）。全ての細胞溶解物を、ＭＥＳランニングバッファーを使用して１２％Ｎｏｖｅｘ ＮＵＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜をブロックバッファーで３０分間、次いで、抗ＳＮＡＰ－２５（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）一次抗体溶液で一晩、インキュベートした。洗浄バッファー（ＫＰＬ）で５５分間洗浄した後、膜をｄｄＨ2Ｏですすぎ、抗マウス二次抗体（ＫＰＬ）溶液で１時間インキュベートした。５回のさらなる洗浄を行い、膜をｄｄＨ2Ｏですすぎ、化学発光基質（Ｐｈｏｓｐｈａｇｌｏ、ＫＰＬ）で約３分間インキュベートした。膜のバンドの画像を得、ＴｏｔａｌＬａｂ ＱｕａｎｔおよびＰＲＩＳＭ６ソフトウェアを用いてデンシトメトリーによって分析した。
【0025】
初代ラット脊髄細胞（ＲＳＣ）および初代マウス脊髄細胞（ＭＳＣ）のアッセイ
初代ラット脊髄細胞および初代マウス脊髄細胞を、これまでに記載されているようにして調製した（Pellett et al., 2007; Pellett et al., 2010）。細胞を、０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および８．３μｇ／ｃｍ2のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたＴｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＴＰＰ）９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を培養培地（ＣＭ）（Ｂ２７、ｇｌｕｔａｍａｘ、およびペニシリン／ストレプトマイシン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）中で維持し、最短で２週間にわたり成熟させた。細胞を、ウェル当たり５０μｌのＣＭにおいてＢｏＮＴに曝露し、３７℃で、５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で、提示した時間にわたりインキュベートした。細胞を７５μｌの１×ＬＤＳ溶解バッファーで溶解し、ウェスタンブロットによって分析した。
初代ラット脊髄細胞および初代マウス脊髄細胞を、これまでに記載されているようにして調製した（Pellett et al., 2007; Pellett et al., 2010）。細胞を、０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および８．３μｇ／ｃｍ2のマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたＴｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＴＰＰ）９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を培養培地（ＣＭ）（Ｂ２７、ｇｌｕｔａｍａｘ、およびペニシリン／ストレプトマイシン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）中で維持し、最短で２週間にわたり成熟させた。細胞を、ウェル当たり５０μｌのＣＭにおいてＢｏＮＴに曝露し、３７℃で、５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で、提示した時間にわたりインキュベートした。細胞を７５μｌの１×ＬＤＳ溶解バッファーで溶解し、ウェスタンブロットによって分析した。
【0026】
有効濃度５０（ＥＣ50）を決定するために、ＭＳＣおよびＲＳＣを、ＣＭで、ＢｏＮＴの３倍希釈物に曝露した。実験は少なくとも３連で行い、毒素なしの対照を各反復に含めた。毒素の希釈物は、３７℃で、５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で、４８時間にわたり細胞上に維持された。細胞を次いで溶解し、これまでに記載されているようにして、切断されたおよび切断されていないＳＮＡＰ－２５の存在について、ウェスタンブロットによって分析した。
神経細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間を判定するために、ＲＳＣ細胞において１００％のＳＮＡＰ－２５の切断を達成するために必要な最少量である８ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ６にＲＳＣを７２時間曝露し、その後、細胞外の毒素を除去し、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプについてこれまでに記載されているようにして（Whitemarsh et al., 2014）、毒素を含まない培養培地においてさらにインキュベートした。細胞を、毒素への最初の曝露の３日後に採取し、その後、曝露後８ヶ月まで、毎月採取した。全ての時点で４回反復して試験し、全ての時点で毒素なしの対照を含めた。切断されたおよび切断されていないＳＮＡＰ－２５を、ウェスタンブロットによって経時的にモニタリングした。
神経細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間を判定するために、ＲＳＣ細胞において１００％のＳＮＡＰ－２５の切断を達成するために必要な最少量である８ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ６にＲＳＣを７２時間曝露し、その後、細胞外の毒素を除去し、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプについてこれまでに記載されているようにして（Whitemarsh et al., 2014）、毒素を含まない培養培地においてさらにインキュベートした。細胞を、毒素への最初の曝露の３日後に採取し、その後、曝露後８ヶ月まで、毎月採取した。全ての時点で４回反復して試験し、全ての時点で毒素なしの対照を含めた。切断されたおよび切断されていないＳＮＡＰ－２５を、ウェスタンブロットによって経時的にモニタリングした。
【0027】
ｉＣｅｌｌニューロンの細胞アッセイ
ｉＣｅｌｌニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）は、使用するまで液体窒素中で保管した。細胞を、０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチンで処理され、８．３μｇ／ｃｍ2のマトリゲルでコーティングされた、ＴＰＰ ９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を、ｉＣｅｌｌニューロン培地添加物（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を添加したｉＣｅｌｌニューロン維持培地において維持し、毒素に曝露するまで９日間成熟させた。
ｉＣｅｌｌニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を判定するために、細胞を、培養培地でＢｏＮＴ／Ａ６の４倍希釈物に７２時間曝露した。ＢｏＮＴ／Ａ６中毒からのｉＣｅｌｌニューロンの回復を判定するために、細胞を、毒素の連続希釈物に７２時間曝露し、その後、全ての毒素を除去し、細胞を完全に洗浄して、あらゆる細胞外の毒素を除去した。細胞を、曝露後３日目、３９日目、および７０日目に採取した。
ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を比較するために、ｉＣｅｌｌニューロンを、モル濃度（６７ｐＭ）およびユニット（１００Ｕ）が共に等しい同量の各毒素サブタイプに曝露した。毒素添加後、細胞を提示した時点で採取し、細胞溶解物を、ＳＮＡＰ－２５の切断について、ウェスタンブロットによって分析した。移入動態を、各時点での各毒素の少なくとも３連の試料のウェスタンブロット分析およびデンシトメトリー計算によって判定されたＳＮＡＰ－２５の切断に基づいて推定した。
ｉＣｅｌｌニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）は、使用するまで液体窒素中で保管した。細胞を、０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチンで処理され、８．３μｇ／ｃｍ2のマトリゲルでコーティングされた、ＴＰＰ ９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を、ｉＣｅｌｌニューロン培地添加物（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を添加したｉＣｅｌｌニューロン維持培地において維持し、毒素に曝露するまで９日間成熟させた。
ｉＣｅｌｌニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を判定するために、細胞を、培養培地でＢｏＮＴ／Ａ６の４倍希釈物に７２時間曝露した。ＢｏＮＴ／Ａ６中毒からのｉＣｅｌｌニューロンの回復を判定するために、細胞を、毒素の連続希釈物に７２時間曝露し、その後、全ての毒素を除去し、細胞を完全に洗浄して、あらゆる細胞外の毒素を除去した。細胞を、曝露後３日目、３９日目、および７０日目に採取した。
ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を比較するために、ｉＣｅｌｌニューロンを、モル濃度（６７ｐＭ）およびユニット（１００Ｕ）が共に等しい同量の各毒素サブタイプに曝露した。毒素添加後、細胞を提示した時点で採取し、細胞溶解物を、ＳＮＡＰ－２５の切断について、ウェスタンブロットによって分析した。移入動態を、各時点での各毒素の少なくとも３連の試料のウェスタンブロット分析およびデンシトメトリー計算によって判定されたＳＮＡＰ－２５の切断に基づいて推定した。
【0028】
マウスにおける筋肉内ＬＤ50
５頭の雌ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ）からなる群に、提示した量のＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、またはＢｏＮＴ／Ａ６の１０μｌＧｅｌＰｈｏｓバッファー溶液を、０．３ｃｃのインスリンシリンジを使用して、右腓腹筋に注射した。５頭のマウスからなる比較群には、同一の毒素希釈物の０．５ｍＬＧｅｌＰｈｏｓ溶液の腹腔内注射を行った。マウスを注射後５日間にわたり観察し、全ての死亡を記録した。ｐｇ単位のＬＤ50を、筋肉内注射したマウス（ＩＭ）および腹腔内注射したマウス（ＩＰ）の両方について、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した（Reed and Muench, 1938）。ＩＰのデータ、および１ユニット＝ＩＰ注射後４日間以内にマウスの５０％が死亡するために必要な毒素の量、というユニット定義に基づいて、各毒素の特異的活性を、この比較アッセイで使用した毒素希釈物について、ユニット（ＩＰ ＬＤ50）で判定した。ＩＭ ＬＤ50のユニットを、ＩＰ ＬＤ50値に基づいて計算した。
５頭の雌ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ）からなる群に、提示した量のＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、またはＢｏＮＴ／Ａ６の１０μｌＧｅｌＰｈｏｓバッファー溶液を、０．３ｃｃのインスリンシリンジを使用して、右腓腹筋に注射した。５頭のマウスからなる比較群には、同一の毒素希釈物の０．５ｍＬＧｅｌＰｈｏｓ溶液の腹腔内注射を行った。マウスを注射後５日間にわたり観察し、全ての死亡を記録した。ｐｇ単位のＬＤ50を、筋肉内注射したマウス（ＩＭ）および腹腔内注射したマウス（ＩＰ）の両方について、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法を使用して計算した（Reed and Muench, 1938）。ＩＰのデータ、および１ユニット＝ＩＰ注射後４日間以内にマウスの５０％が死亡するために必要な毒素の量、というユニット定義に基づいて、各毒素の特異的活性を、この比較アッセイで使用した毒素希釈物について、ユニット（ＩＰ ＬＤ50）で判定した。ＩＭ ＬＤ50のユニットを、ＩＰ ＬＤ50値に基づいて計算した。
【0029】
インビボでの作用発現および作用期間
インビボでの作用発現および作用期間を、これまでに記載されているようにして判定した（Pellett et al. 2015）。０．３ｃｃのインスリンシリンジを使用して、５頭の雌ＩＣＲマウスからなる群に、提示した量のＢｏＮＴ／Ａ６の１０μｌＧｅｌＰｈｏｓ溶液を右腓腹筋に注射した。局所麻痺の作用発現を判定するために、各マウスの右後肢の指外転スコア（digit abduction score）（ＤＡＳ）を、注射後の最初の４８時間以内のいくつかの時点およびその後２４時間ごとに、１～５スケールで判定した。同一の時点で、ロータロッド分析（ＭＥＤ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を各マウスで行った。ロータロッドのスピードを４～４０ｒｐｍに増大させながら、各マウスを合計５分間走らせることを試みた。ロータロッド分析は、全てのマウスが正味５分間走ったら、終了した。
インビボでの作用発現および作用期間を、これまでに記載されているようにして判定した（Pellett et al. 2015）。０．３ｃｃのインスリンシリンジを使用して、５頭の雌ＩＣＲマウスからなる群に、提示した量のＢｏＮＴ／Ａ６の１０μｌＧｅｌＰｈｏｓ溶液を右腓腹筋に注射した。局所麻痺の作用発現を判定するために、各マウスの右後肢の指外転スコア（digit abduction score）（ＤＡＳ）を、注射後の最初の４８時間以内のいくつかの時点およびその後２４時間ごとに、１～５スケールで判定した。同一の時点で、ロータロッド分析（ＭＥＤ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を各マウスで行った。ロータロッドのスピードを４～４０ｒｐｍに増大させながら、各マウスを合計５分間走らせることを試みた。ロータロッド分析は、全てのマウスが正味５分間走ったら、終了した。
【0030】
結果：
ＢｏＮＴ／Ａ６は、神経細胞において高い効能を有する
これまでの研究は、様々な細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａサブタイプ１～５の効能を記載している（Whitemarsh et al., 2013; Whitemarsh et al, 2014）。マウスおよびラット初代脊髄細胞（ＭＳＣ細胞およびＲＳＣ細胞）をＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に曝露すると、ＢｏＮＴ／Ａ２でこれまでに観察されたものと類似のＳＮＡＰ－２５切断パターンが生じ、毒素に曝露した４８時間後に、５０％のＳＮＡＰ－２５切断が、約０．０３Ｕ／５０μｌ／ウェル（２７ｆＭ）のＢｏＮＴ／Ａ６で生じた（図１）。ＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンにおいても判定した。他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと同様に、ｈｉＰＳＣ由来のニューロンを曝露すると、毒素に３日間曝露された細胞では、３ｌｏｇ未満の、０～１００％の切断まで延びている急勾配の用量応答曲線が得られた。ＥＣ50は約０．０４Ｕ／５０μｌ／ウェル（３２ｆＭ）であると計算され（図１Ｃ）、これは、ＢｏＮＴ／Ａ１で報告されているもの（Whitemarsh et al., 2013）よりも１０倍以上感受性が高い。これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａ２と同様に、ＢｏＮＴ／Ａ６が、培養されたニューロンにおいて、特にヒトニューロンにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも有意に効能が高いことを示す。
ＢｏＮＴ／Ａ６は、神経細胞において高い効能を有する
これまでの研究は、様々な細胞モデルにおけるＢｏＮＴ／Ａサブタイプ１～５の効能を記載している（Whitemarsh et al., 2013; Whitemarsh et al, 2014）。マウスおよびラット初代脊髄細胞（ＭＳＣ細胞およびＲＳＣ細胞）をＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に曝露すると、ＢｏＮＴ／Ａ２でこれまでに観察されたものと類似のＳＮＡＰ－２５切断パターンが生じ、毒素に曝露した４８時間後に、５０％のＳＮＡＰ－２５切断が、約０．０３Ｕ／５０μｌ／ウェル（２７ｆＭ）のＢｏＮＴ／Ａ６で生じた（図１）。ＢｏＮＴ／Ａ６のＥＣ50を、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンにおいても判定した。他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと同様に、ｈｉＰＳＣ由来のニューロンを曝露すると、毒素に３日間曝露された細胞では、３ｌｏｇ未満の、０～１００％の切断まで延びている急勾配の用量応答曲線が得られた。ＥＣ50は約０．０４Ｕ／５０μｌ／ウェル（３２ｆＭ）であると計算され（図１Ｃ）、これは、ＢｏＮＴ／Ａ１で報告されているもの（Whitemarsh et al., 2013）よりも１０倍以上感受性が高い。これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａ２と同様に、ＢｏＮＴ／Ａ６が、培養されたニューロンにおいて、特にヒトニューロンにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも有意に効能が高いことを示す。
【0031】
培養されたニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間
これまでの報告によって、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ４、およびＢｏＮＴ／Ａ５のＬＣが、培養されたラット初代脊髄ニューロンにおいて１０ヶ月以上にわたり活性を維持すること、および中毒細胞における切断されていないＳＮＡＰ－２５の回復速度が着実ではあるが非常に遅く、１０ヶ月後でも５０％に満たないことが報告されている（Whitemarsh et al., 2014）。培養された齧歯類の初代ニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間を判定するために、ＲＳＣ細胞を、７２時間後に完全なＳＮＡＰ－２５切断を確実にするのに十分なＢｏＮＴ／Ａ６に曝露した（８ｐＭ）。細胞溶解物を曝露後３日目、および月ごとに８ヶ月間にわたり、神経細胞の回復を示す切断されていないＳＮＡＰ－２５の出現について分析した。毒素への最初の曝露後の７ヶ月目に、初回のウェスタンブロット分析は、切断されていないＳＮＡＰ－２５のわずかな回復の兆候を示した。回復期間の８ヶ月後、最初に８ｐＭに曝露されたＲＳＣにおけるＳＮＡＰ－２５の切断は、７９％で高いままであった（図３）。ＳＮＡＰ－２５の回復の兆候は、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ１～５でのこれまでの研究と比較して、後まで見られなかったが、切断されていないＳＮＡＰ－２５が始まる時の兆候の直線の傾きは、以下のこれまでのデータ（Whitemarsh et al., 2014）に類似している。ＳＮＡＰ－２５の回復のパターンは、４倍増しのＢｏＮＴ／Ａ６（３２ｐＭ）に曝露された細胞に類似していた（データは示していない）。
これまでの報告によって、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ４、およびＢｏＮＴ／Ａ５のＬＣが、培養されたラット初代脊髄ニューロンにおいて１０ヶ月以上にわたり活性を維持すること、および中毒細胞における切断されていないＳＮＡＰ－２５の回復速度が着実ではあるが非常に遅く、１０ヶ月後でも５０％に満たないことが報告されている（Whitemarsh et al., 2014）。培養された齧歯類の初代ニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間を判定するために、ＲＳＣ細胞を、７２時間後に完全なＳＮＡＰ－２５切断を確実にするのに十分なＢｏＮＴ／Ａ６に曝露した（８ｐＭ）。細胞溶解物を曝露後３日目、および月ごとに８ヶ月間にわたり、神経細胞の回復を示す切断されていないＳＮＡＰ－２５の出現について分析した。毒素への最初の曝露後の７ヶ月目に、初回のウェスタンブロット分析は、切断されていないＳＮＡＰ－２５のわずかな回復の兆候を示した。回復期間の８ヶ月後、最初に８ｐＭに曝露されたＲＳＣにおけるＳＮＡＰ－２５の切断は、７９％で高いままであった（図３）。ＳＮＡＰ－２５の回復の兆候は、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ１～５でのこれまでの研究と比較して、後まで見られなかったが、切断されていないＳＮＡＰ－２５が始まる時の兆候の直線の傾きは、以下のこれまでのデータ（Whitemarsh et al., 2014）に類似している。ＳＮＡＰ－２５の回復のパターンは、４倍増しのＢｏＮＴ／Ａ６（３２ｐＭ）に曝露された細胞に類似していた（データは示していない）。
【0032】
培養されたニューロンにおける作用期間を、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンで、ニューロンをＢｏＮＴ／Ａ１またはＢｏＮＴ／Ａ６の連続希釈物に７２時間曝露し、その後、細胞外の毒素を完全に除去し、培養培地においてさらにインキュベートすることによって、さらに調べた。各希釈段階の細胞を、３日目、３９日目、および７０日目に３連で採取し、ＳＮＡＰ－２５切断のＥＣ50を各時点について判定した。ＢｏＮＴ／Ａ６では、ＥＣ50値は、３日目、３９日目、および７０日目でそれぞれ約０．０４、０．７、および１Ｕ／５０μｌ／ウェル（３２、５６０、および８００ｆＭ）であった（図２Ａ）。ＢｏＮＴ／Ａ１では、ＥＣ50値は、３日目、３９日目、および７０日目で約０．７、６．３、および２８Ｕ／５０μｌ／ウェル（それぞれ、３１３、２９４０、および１２８８０ｆＭ）であった（図２Ｂ）。経時的なＥＣ50値から判定した、これらのｈｉＰＳＣ由来のニューロンにおけるＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の半減期は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の両方で類似しており、それぞれおよそ１２日間および１４日間であった（図２Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ａ６が、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプに類似して、長い作用期間を有することを示す。
【0033】
ＢｏＮＴ／Ａ６は、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプよりも効率的に細胞に移入する
サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を調べるために、ｈｉＰＳＣ由来のニューロンを、６７ｐＭの各毒素に曝露した（図４Ａ）。細胞を、曝露後１０時間にわたる様々な時点で採取した。溶解物を、切断されたおよび切断されていないＳＮＡＰ－２５の量について調べた。ＳＮＡＰ－２５切断の作用発現は、ＢｏＮＴ／Ａ６に曝露した細胞において、より迅速に生じた（図４）。これらの細胞ではまた、最後の１０時間の時点で、平均９４±５．３％のＳＮＡＰ－２５が切断されたが、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に曝露した細胞は、それぞれおよそ６４±４％および８４±１．２％の切断に至った。このアッセイにおいて、等モル濃度量の毒素を使用し、ここで、この３つの毒素は、わずかに異なる特異的活性を有していた（Ａ１では３．５ｐｇ／ＬＤ50、Ａ２では７．９ｐｇ／ＬＤ50、およびＡ６では６ｐｇ／ＬＤ50）。細胞を同一の生物学的活性（ユニット数）の各毒素（Ａ１では１００Ｕ／５０μｌ／ウェルまたは４７ｐＭ、Ａ２では１０５ｐＭ、およびＡ６では８０ｐＭ）に曝露する第２のアッセイでは、類似のデータが得られたが、ＢｏＮＴ／Ａ２とＢｏＮＴ／Ａ６との間の差は、わずかに小さくなった（図４Ｂ）。このことは、ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ２についてこれまでに記載されているもの（Pier et al.）と類似のまたはさらにそれよりも早い、培養されたニューロンにおける活性のより早い発現を有していることを示す。
サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６の細胞移入動態を調べるために、ｈｉＰＳＣ由来のニューロンを、６７ｐＭの各毒素に曝露した（図４Ａ）。細胞を、曝露後１０時間にわたる様々な時点で採取した。溶解物を、切断されたおよび切断されていないＳＮＡＰ－２５の量について調べた。ＳＮＡＰ－２５切断の作用発現は、ＢｏＮＴ／Ａ６に曝露した細胞において、より迅速に生じた（図４）。これらの細胞ではまた、最後の１０時間の時点で、平均９４±５．３％のＳＮＡＰ－２５が切断されたが、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に曝露した細胞は、それぞれおよそ６４±４％および８４±１．２％の切断に至った。このアッセイにおいて、等モル濃度量の毒素を使用し、ここで、この３つの毒素は、わずかに異なる特異的活性を有していた（Ａ１では３．５ｐｇ／ＬＤ50、Ａ２では７．９ｐｇ／ＬＤ50、およびＡ６では６ｐｇ／ＬＤ50）。細胞を同一の生物学的活性（ユニット数）の各毒素（Ａ１では１００Ｕ／５０μｌ／ウェルまたは４７ｐＭ、Ａ２では１０５ｐＭ、およびＡ６では８０ｐＭ）に曝露する第２のアッセイでは、類似のデータが得られたが、ＢｏＮＴ／Ａ２とＢｏＮＴ／Ａ６との間の差は、わずかに小さくなった（図４Ｂ）。このことは、ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ２についてこれまでに記載されているもの（Pier et al.）と類似のまたはさらにそれよりも早い、培養されたニューロンにおける活性のより早い発現を有していることを示す。
【0034】
マウスにおけるＢｏＮＴ／Ａ６のＩＭ ＬＤ50
ＢｏＮＴ／Ａ６のより速い細胞移入によって、局所的筋肉内注射の後に注射部位から広がる毒素が少なくなり得るかどうかを判定するために、マウスにおける相対的ＩＭ ＬＤ50（同一の毒素希釈物のＩＰ ＬＤ50に対して）を、右腓腹筋内へのＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６の注射について判定した。ＢｏＮＴ／Ａ６のＩＭ ＬＤ50はＢｏＮＴ／Ａ１のＩＭ ＬＤ50よりも有意に高く、またＢｏＮＴ／Ａ２に類似しており、ＢｏＮＴ／Ａ１の１．４倍の毒素のユニットを要する（表１）。これは、ＢｏＮＴ／Ａ２およびＢｏＮＴ／Ａ１を比較するこれまでのデータ（Torii et al, 2014）と一致する。
ＢｏＮＴ／Ａ６のより速い細胞移入によって、局所的筋肉内注射の後に注射部位から広がる毒素が少なくなり得るかどうかを判定するために、マウスにおける相対的ＩＭ ＬＤ50（同一の毒素希釈物のＩＰ ＬＤ50に対して）を、右腓腹筋内へのＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６の注射について判定した。ＢｏＮＴ／Ａ６のＩＭ ＬＤ50はＢｏＮＴ／Ａ１のＩＭ ＬＤ50よりも有意に高く、またＢｏＮＴ／Ａ２に類似しており、ＢｏＮＴ／Ａ１の１．４倍の毒素のユニットを要する（表１）。これは、ＢｏＮＴ／Ａ２およびＢｏＮＴ／Ａ１を比較するこれまでのデータ（Torii et al, 2014）と一致する。
【0035】
【表1】
【0036】
インビボでのＢｏＮＴ／Ａ６の作用発現および作用期間
ＢｏＮＴ／Ａ１と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６作用発現および作用期間を判定するために、マウスに、０．２～０．６Ｕの範囲のいずれかの毒素の希釈物を、右脚の腓腹筋の後部に注射した。ＤＡＳスコア（局所麻痺を測定するため）およびロータロッド時間（全体的な運動ニューロン性失調を測定するため）を、各マウスについて、注射後の最初の４８時間のいくつかの時点で、次いで１６日間にわたり各日１回、記録した。各毒素の注射用量を、同一の希釈物を使用して、ＩＰ ＬＤ50アッセイによって確認した（データは示していない）。他のＢｏＮＴでこれまでに見られているように、ＤＡＳスコアおよびロータロッドの回復時間は、共に用量依存性であった（図５）。ＤＡＳスコアのピークは、ＢｏＮＴ／Ａ２についてのこれまでの報告と類似して、またＢｏＮＴ／Ａ１よりもわずかに早く、３６～４８時間の間で現れ、３～４日目に低下し始めた（図５Ａ、Ｃ）。１６日目までに、ＤＡＳスコアは、最も高い毒素希釈物を注射されたマウスでは約１．５まで低下し（図５Ａ）、これは、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ５でこれまでに観察されたもの（Pellett et al., 2015）と類似している。ロータロッドによって測定された全体的な運動ニューロン性失調は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の両方に類似しており（図５Ｂ）、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプでこれまでに観察されているもの（Pellett et al., 2015）と類似していた。これらのデータは、全体的な運動ニューロン性失調が類似していることに加えて、局所的筋肉内注射の後のマウスにおける局所麻痺について、ＢｏＮＴ／Ａ６の作用発現および作用期間がＢｏＮＴ／Ａ１と比較して類似していることを示す。
ＢｏＮＴ／Ａ１と比較した、ＢｏＮＴ／Ａ６作用発現および作用期間を判定するために、マウスに、０．２～０．６Ｕの範囲のいずれかの毒素の希釈物を、右脚の腓腹筋の後部に注射した。ＤＡＳスコア（局所麻痺を測定するため）およびロータロッド時間（全体的な運動ニューロン性失調を測定するため）を、各マウスについて、注射後の最初の４８時間のいくつかの時点で、次いで１６日間にわたり各日１回、記録した。各毒素の注射用量を、同一の希釈物を使用して、ＩＰ ＬＤ50アッセイによって確認した（データは示していない）。他のＢｏＮＴでこれまでに見られているように、ＤＡＳスコアおよびロータロッドの回復時間は、共に用量依存性であった（図５）。ＤＡＳスコアのピークは、ＢｏＮＴ／Ａ２についてのこれまでの報告と類似して、またＢｏＮＴ／Ａ１よりもわずかに早く、３６～４８時間の間で現れ、３～４日目に低下し始めた（図５Ａ、Ｃ）。１６日目までに、ＤＡＳスコアは、最も高い毒素希釈物を注射されたマウスでは約１．５まで低下し（図５Ａ）、これは、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ５でこれまでに観察されたもの（Pellett et al., 2015）と類似している。ロータロッドによって測定された全体的な運動ニューロン性失調は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の両方に類似しており（図５Ｂ）、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプでこれまでに観察されているもの（Pellett et al., 2015）と類似していた。これらのデータは、全体的な運動ニューロン性失調が類似していることに加えて、局所的筋肉内注射の後のマウスにおける局所麻痺について、ＢｏＮＴ／Ａ６の作用発現および作用期間がＢｏＮＴ／Ａ１と比較して類似していることを示す。
【0037】
考察：
ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ６は、２００９年に、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の組換え事象に由来する可能性がある固有のＢｏＮＴ／Ａサブタイプとして最初に記載された（Luquez et al., 2009）。ＢｏＮＴ／Ａ６のＬＣ配列は、Ａ１のＬＣ配列と１アミノ酸残基のみ異なる（Ｔ４１４Ａ）が、移動ドメインおよび受容体結合ドメインはそれぞれ４．５％および９．５％異なる。Ａ１とＡ６移動ドメインとの差の大部分はＡ２でも見られるが、Ａ６に固有の差のほとんどは、受容体結合ドメインで見られる。ＢｏＮＴ／Ａ６は、１９９６年に食餌性ボツリヌス症のケースから単離された２種毒素生産株であるＣＤＣ４１３７０で先天的に発現される（Luquez et al., 2009）。ＢｏＮＴ／Ａ６に加えて、この株はＢｏＮＴ／Ｂ２も発現し、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素の単離および特徴付けを複雑にしている。二価の株からの他のＢｏＮＴの単離でこれまでに行われているように（Pellett et al., 2016）、この研究においては、株ＣＤＣ４１３７０を改変して、ＢｏＮＴ／Ｂ２の発現を排除した。ＢｏＮＴ／Ａ６は、得られた単一発現株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-において高レベルで発現した。ＢｏＮＴ／Ａ６を単離し、インビトロで、培養されたニューロンにおいて、およびマウスにおいて、生物学的特性および薬理学的特性を調べた。ＢｏＮＴ／Ａ２についてこれまでに示されているものに類似して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、ラットおよびマウスの初代脊髄ニューロンならびにｈｉＰＳＣ由来のニューロンを含む全ての試験した細胞モデルにおいて、Ａ１よりも高い効能を示した（図１～２）。これらの所見は、ＢｏＮＴ／Ａ２と同様に、ＢｏＮＴ／Ａ６が、ヒトニューロンを含む培養されたニューロンにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍効能が高く、より速い作用発現を有することを示す（図２、４）。ＢｏＮＴ／Ａ２と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、ヒトニューロンにおいて約２倍大きな効能およびわずかに速い作用発現を有することが分かったが、この所見が統計的に有意なサブタイプ特異的な差を反映しているかどうかを見定めるためには、さらなる毒素調製物の試験が必要であろう。これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａ６が、毒素が注射部位から広がることに起因する副作用を低下させる結果となる、インビボでの筋肉内注射の後に注射部位内にさらに局所化したまま残る能力を有するかどうか、および ＢｏＮＴ／Ａ６が他の現在利用可能なサブタイプと比較して注射後により早く効果的となる能力を有し得るかどうか、という疑問を提起する。さらに、より効率的およびより速い細胞移入によって、同一の局所的麻痺効果を達成するために必要なＢｏＮＴ／Ａ６の用量が、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して少なくなり得る。
ＢｏＮＴ／Ａサブタイプ６は、２００９年に、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の組換え事象に由来する可能性がある固有のＢｏＮＴ／Ａサブタイプとして最初に記載された（Luquez et al., 2009）。ＢｏＮＴ／Ａ６のＬＣ配列は、Ａ１のＬＣ配列と１アミノ酸残基のみ異なる（Ｔ４１４Ａ）が、移動ドメインおよび受容体結合ドメインはそれぞれ４．５％および９．５％異なる。Ａ１とＡ６移動ドメインとの差の大部分はＡ２でも見られるが、Ａ６に固有の差のほとんどは、受容体結合ドメインで見られる。ＢｏＮＴ／Ａ６は、１９９６年に食餌性ボツリヌス症のケースから単離された２種毒素生産株であるＣＤＣ４１３７０で先天的に発現される（Luquez et al., 2009）。ＢｏＮＴ／Ａ６に加えて、この株はＢｏＮＴ／Ｂ２も発現し、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素の単離および特徴付けを複雑にしている。二価の株からの他のＢｏＮＴの単離でこれまでに行われているように（Pellett et al., 2016）、この研究においては、株ＣＤＣ４１３７０を改変して、ＢｏＮＴ／Ｂ２の発現を排除した。ＢｏＮＴ／Ａ６は、得られた単一発現株ＣＤＣ４１３７０Ｂ２tox-において高レベルで発現した。ＢｏＮＴ／Ａ６を単離し、インビトロで、培養されたニューロンにおいて、およびマウスにおいて、生物学的特性および薬理学的特性を調べた。ＢｏＮＴ／Ａ２についてこれまでに示されているものに類似して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、ラットおよびマウスの初代脊髄ニューロンならびにｈｉＰＳＣ由来のニューロンを含む全ての試験した細胞モデルにおいて、Ａ１よりも高い効能を示した（図１～２）。これらの所見は、ＢｏＮＴ／Ａ２と同様に、ＢｏＮＴ／Ａ６が、ヒトニューロンを含む培養されたニューロンにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍効能が高く、より速い作用発現を有することを示す（図２、４）。ＢｏＮＴ／Ａ２と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、ヒトニューロンにおいて約２倍大きな効能およびわずかに速い作用発現を有することが分かったが、この所見が統計的に有意なサブタイプ特異的な差を反映しているかどうかを見定めるためには、さらなる毒素調製物の試験が必要であろう。これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａ６が、毒素が注射部位から広がることに起因する副作用を低下させる結果となる、インビボでの筋肉内注射の後に注射部位内にさらに局所化したまま残る能力を有するかどうか、および ＢｏＮＴ／Ａ６が他の現在利用可能なサブタイプと比較して注射後により早く効果的となる能力を有し得るかどうか、という疑問を提起する。さらに、より効率的およびより速い細胞移入によって、同一の局所的麻痺効果を達成するために必要なＢｏＮＴ／Ａ６の用量が、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して少なくなり得る。
【0038】
以前に分析されたＢｏＮＴ／ＡサブタイプであるＢｏＮＴ／Ａ３は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して有意に短い作用期間を有することが示されているため、ＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間を、他のＢｏＮＴ／Ａサブタイプについてこれまでに行われた通りに、培養されたニューロンおよびマウスの両方において試験した。１００％のＳＮＡＰ－２５の切断を達成するために必要な最少量のＢｏＮＴ／Ａ６に曝露されているラット初代脊髄細胞を、切断されていないＳＮＡＰ－２５の回復について、最大８ヶ月間にわたりモニタリングした。穏やかな回復が、曝露後の７ヶ月後に、明らかに見られた。８ヶ月後、約８０％を超えるＳＮＡＰ－２５が切断されたままであった（図３）。ＢｏＮＴ／Ａ１～５についてのこれまでの類似の研究は、切断されていないＳＮＡＰ－２５の回復の最初の兆候を３～４ヶ月目に示し、ＳＮＡＰ－２５の約５０％が９ヶ月目に切断されたままであった（Whitemarsh et al., 2014）。培養されたニューロンの、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６中毒からの回復もまた、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンにおいて判定した（図２）。興味深いことに、これらのニューロン培養物は、種（ヒト対ラット）ならびに細胞組成（＞９８％の純度の前脳様のニューロン対脊髄ニューロンおよびグリア細胞の混合物）が初代培養物と異なるが、３ヶ月未満の内に、切断されていないＳＮＡＰ－２５を完全に回復させた。これによって、このヒト細胞培養物におけるＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ６の半減期の推定が可能となり、データは、Ａ１およびＡ６でそれぞれ約１２日間および約１４日間という類似の半減期を示している（図２Ｃ）。これらのデータは、ＲＳＣにおけるＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間が、ＢｏＮＴ／Ａ１と少なくとも同じ長さであることを示す。同様に、マウスモデルを使用したインビボでの研究は、ＢｏＮＴ／Ａ６で、腓腹筋への局所的筋肉内注射の後の局所麻痺期間が、ＢｏＮＴ／Ａ１と少なくとも同じ長さであることを示した。同様に、ＢｏＮＴ／Ａ２でこれまでに観察されているように、局所麻痺の発現は、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較してＢｏＮＴ／Ａ６でわずかに早かった（図５）。これらのデータは、局所的筋肉内注射の後のマウスにおいて、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ６の作用期間が類似しており、局所麻痺の発現がより早いことを示す。
【0039】
ＢｏＮＴ／Ａ６が、全身に広がる毒素の量を低減させることによって副作用のリスクを低下させ得るという考えを調べるために、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ６について、右腓腹筋内への筋肉内注射について、ＬＤ50を判定した。これは、同一の毒素希釈物のＩＰ注射を伴う標準的なＭＢＡから決定された、計算されたＬＤ50に基づくものであった。ＢｏＮＴ／Ａ６およびＢｏＮＴ／Ａ２のＩＭ注射は、死に至らしめるためには、ＩＰ注射された毒素の量と比較して２倍多くの毒素が必要であり、その一方で、ＢｏＮＴ／Ａ１は、死に至らしめるためには、ＩＰ注射された場合と比較して、ＩＭ注射においてわずか１．４倍多くの毒素だけが必要であった（表１）。重要なこととして、これは、３つの試験対照の毒素の同一の毒素希釈について並行してＩＰ ＬＤ50およびＩＭ ＬＤ50を決定する比較研究であり、結果は、ＢｏＮＴ／Ａ６の筋肉内注射によって、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも全身的な毒素分布が少なくなることを示す。
【0040】
本発明者らの結果に基づいて、ＢｏＮＴ／Ａ６は、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも有利な、またＢｏＮＴ／Ａ２に類似のまたはそれよりも優れたバイオ医薬品としての可能性を有することが分かる。ＢｏＮＴ／Ａ６での処置は、長く続く効果を犠牲にすることなく、より少ない副作用のリスクで、標的の症状をより速く緩和し得る。今後の研究を通して、ＢｏＮＴ／Ａ６は、現在は他のサブタイプを使用している処置のための、より安全でより効果的な選択肢であることが証明され得る。
参考文献
参考文献
【0041】
【0042】
本開示において引用される各刊行物、特許、および特許公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、先の実施例に限定されることを意図したものではないが、全てのこのような改変および変形を、添付の特許請求の範囲内にあるものとして包含する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ毒素のＢｏＮＴ／Ａ６毒素のみを発現するように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
（ａ）ＢｏＮＴ毒素のＢｏＮＴ／Ａ６毒素のみを発現するように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
調製物が、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
調製物が、少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
株がＣＤＣ４１３７０である、請求項１に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0042】
本開示において引用される各刊行物、特許、および特許公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、先の実施例に限定されることを意図したものではないが、全てのこのような改変および変形を、添付の特許請求の範囲内にあるものとして包含する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法が必要な症状を有する患者を処置する方法であって、調製物が、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素または毒素複合体である、方法。
〔２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０ 7 ～２×１０ 8 ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕処置が、神経系障害または神経筋障害を特徴とする状態のためである、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕処置が、頚部ジストニア、眼瞼けいれん、重度の原発性腋窩多汗症、斜視、アカラシア、慢性限局性ニューロパシーおよび片頭痛および他の頭痛障害、化粧品による問題、筋けいれん、上位運動ニューロン症候群、発汗、ならびにＢｏＮＴ／Ａ１で処置される神経障害からなる群から選択される状態のためである、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕処置が化粧的処置である、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕調製物が、少なくとも９５％の純度のＡ６毒素または毒素複合体を含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕調製物が、少なくとも９８％の純度のＡ６毒素複合体を含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕調製物の細胞内への取り込みが、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して増大している、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が除去されるように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
〔１３〕調製物が、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕調製物が、少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１５〕株がＣＤＣ４１３７０である、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１６〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６遺伝子が発現されるように改変された組換え微生物の培養物を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップ
を含む、方法。
〔１７〕前記〔１２〕に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
〔１８〕前記〔１６〕に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
〔１９〕少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体の調製物。
〔２０〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２１〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２３〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０ 7 ～２×１０ 8 ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６を含む有効量の調製物で患者を処置するステップを含む、ボツリヌス毒素療法が必要な症状を有する患者を処置する方法であって、調製物が、少なくとも９０％の純度のＡ６毒素または毒素複合体である、方法。
〔２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０ 7 ～２×１０ 8 ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕処置が、神経系障害または神経筋障害を特徴とする状態のためである、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕処置が、頚部ジストニア、眼瞼けいれん、重度の原発性腋窩多汗症、斜視、アカラシア、慢性限局性ニューロパシーおよび片頭痛および他の頭痛障害、化粧品による問題、筋けいれん、上位運動ニューロン症候群、発汗、ならびにＢｏＮＴ／Ａ１で処置される神経障害からなる群から選択される状態のためである、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕処置が化粧的処置である、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕調製物が、少なくとも９５％の純度のＡ６毒素または毒素複合体を含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕調製物が、少なくとも９８％の純度のＡ６毒素複合体を含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕調製物の細胞内への取り込みが、ＢｏＮＴ／Ａ１と比較して増大している、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ｂｏｎｔ／Ｂ２遺伝子が除去されるように改変された改変クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を株から単離するステップ
を含む、方法。
〔１３〕調製物が、少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕調製物が、少なくとも９８％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１５〕株がＣＤＣ４１３７０である、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１６〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６の精製された調製物を得る方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ６遺伝子が発現されるように改変された組換え微生物の培養物を培養するステップ、および
（ｂ）少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体であるＢｏＮＴ／Ａ６毒素を単離するステップ
を含む、方法。
〔１７〕前記〔１２〕に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
〔１８〕前記〔１６〕に記載の方法によって生成されたＢｏＮＴ／Ａ６調製物。
〔１９〕少なくとも９０％の純度のＢｏＮＴ／Ａ６神経毒素または毒素複合体を含む、ＢｏＮＴ／Ａ６毒素または毒素複合体の調製物。
〔２０〕クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも約１０倍高い効能がある、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２１〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約３０ｆＭのＥＣ５０を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２２〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低減された全身組織の毒素分布を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
〔２３〕クロストリジウム・ボツリヌム神経毒素ＢｏＮＴ／Ａ６が、約０．５×１０ 7 ～２×１０ 8 ＬＤ５０／ｍｇの特異的活性ＬＤ５０を有する、前記〔１９〕に記載の調製物。
【外国語明細書】