知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッドの特許一覧
特開2024-107295操作された産生細胞株ならびにそれを作製および使用する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024107295
(43)【公開日】2024-08-08
(54)【発明の名称】操作された産生細胞株ならびにそれを作製および使用する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240801BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240801BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240801BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240801BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N7/01
C12N15/113 Z
C12N5/10
C12N15/864 100Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024094278
(22)【出願日】2024-06-11
(62)【分割の表示】P 2021559793の分割
【原出願日】2020-04-09
(31)【優先権主張番号】62/839,207
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/833,548
(32)【優先日】2019-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/979,483
(32)【優先日】2020-02-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】513009107
【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】オーブリー アール． ティアナン
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス リチャーズ
(57)【要約】
【課題】操作された産生細胞株ならびにそれを作製および使用する方法の提供。
【解決手段】本出願は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）力価を増加させるための、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を低下させるように操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株に関する。操作された細胞株を生成する方法も本明細書に記載される。さらに、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質を同定する方法もまた、本明細書に記載される。
【選択図】なし
【解決手段】本出願は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）力価を増加させるための、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を低下させるように操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株に関する。操作された細胞株を生成する方法も本明細書に記載される。さらに、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質を同定する方法もまた、本明細書に記載される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８３３，５４８号、２０１９年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８３９，２０７号および２０２０年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９７９，４８３号に基づく利益および優先権を主張しており、これらの開示はすべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
本出願は、２０１９年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８３３，５４８号、２０１９年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８３９，２０７号および２０２０年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９７９，４８３号に基づく利益および優先権を主張しており、これらの開示はすべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出され、その全体が参考として本明細書によって援用される配列表を含有する。２０２０年４月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＵＬＰ－００５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１１３ｋｂバイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出され、その全体が参考として本明細書によって援用される配列表を含有する。２０２０年４月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＵＬＰ－００５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１１３ｋｂバイトのサイズである。
【0003】
開示の分野
本出願は全体として、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）力価を増加させるための、操作された産生および／またはパッケージング細胞株、ならびに操作された産生および／またはパッケージング細胞株を生成する方法に関する。
本出願は全体として、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）力価を増加させるための、操作された産生および／またはパッケージング細胞株、ならびに操作された産生および／またはパッケージング細胞株を生成する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
ｒＡＡＶに基づくベクターは、ヒト遺伝子治療のための最も有望なビークルのうちの１つである。ｒＡＡＶベクターは、多岐にわたる遺伝子治療応用に関して検討されている。特に、ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。ｒＡＡＶを産生するための系は、過去２０年にわたって発展してきたが、いくつかの問題が依然として解決されていない。ｒＡＡＶ産生系の１つの制限はｒＡＡＶ粒子の低力価収率である。前臨床段階におけるｒＡＡＶに基づく遺伝子産物の医薬品としての開発は、ヒトにおける投薬量を予測するのに役立つ完全な毒性および体内分布研究を可能にするために、より大型の種における研究のための大量のｒＡＡＶベクターを必要とする。さらに、現在のｒＡＡＶ産生系は低力価収率をもたらすため、ヒト試験および商業的な応用における使用に十分なレベルのｒＡＡＶを製造することは困難である。研究者らは十分に高力価のｒＡＡＶ粒子を生成する多数の方法を探索しているが、依然としてこの問題に対処する大きな必要性がある。特に、高力価収率を伴う高品質ｒＡＡＶを産生することができる効率的な細胞株に対する必要性がある。本明細書に記載される操作された細胞株による高力価ｒＡＡＶの産生は、このベクター系のｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療使用のための応用を促す。
ｒＡＡＶに基づくベクターは、ヒト遺伝子治療のための最も有望なビークルのうちの１つである。ｒＡＡＶベクターは、多岐にわたる遺伝子治療応用に関して検討されている。特に、ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。ｒＡＡＶを産生するための系は、過去２０年にわたって発展してきたが、いくつかの問題が依然として解決されていない。ｒＡＡＶ産生系の１つの制限はｒＡＡＶ粒子の低力価収率である。前臨床段階におけるｒＡＡＶに基づく遺伝子産物の医薬品としての開発は、ヒトにおける投薬量を予測するのに役立つ完全な毒性および体内分布研究を可能にするために、より大型の種における研究のための大量のｒＡＡＶベクターを必要とする。さらに、現在のｒＡＡＶ産生系は低力価収率をもたらすため、ヒト試験および商業的な応用における使用に十分なレベルのｒＡＡＶを製造することは困難である。研究者らは十分に高力価のｒＡＡＶ粒子を生成する多数の方法を探索しているが、依然としてこの問題に対処する大きな必要性がある。特に、高力価収率を伴う高品質ｒＡＡＶを産生することができる効率的な細胞株に対する必要性がある。本明細書に記載される操作された細胞株による高力価ｒＡＡＶの産生は、このベクター系のｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療使用のための応用を促す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質が改変されている細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供することによって、遺伝子治療応用のための改善されたｒＡＡＶ力価を得ることに対する必要性に対処する。また、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質を同定する方法、ならびに操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を生成する方法も本明細書に記載される。
本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質が改変されている細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供することによって、遺伝子治療応用のための改善されたｒＡＡＶ力価を得ることに対する必要性に対処する。また、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質を同定する方法、ならびに操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を生成する方法も本明細書に記載される。
【0006】
対照親細胞と比較して高い力価のｒＡＡＶを産生することができる細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を生成する組成物および方法が本明細書に記載される。より具体的には、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現がモジュレートされ、結果として対照親細胞と比較して高いｒＡＡＶ力価をもたらす細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株が本明細書において提供される。一態様では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２（ＡＴＰ合成酵素Ｆ１サブユニットイプシロン偽遺伝子２）、ＬＩＮＣ００３１９（長鎖遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ３１９）、ＣＹＰ３Ａ７（シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー７）、ＡＢＣＡ１０（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１０）、ＮＯＧ（ノギン）、ＲＧＭＡ（反発性ガイダンス分子ＢＭＰ共役受容体Ａ）、ＳＰＡＮＸＮ３（ＳＰＡＮＸファミリーメンバーＮ３）、ＰＧＡ５（ペプシノゲンＡ５）、ＭＹＲＩＰ（ミオシンＶＩＩＡおよびＲａｂ相互作用タンパク質）、ＫＣＮＮ２（カルシウム活性化カリウムチャネルサブファミリーＮメンバー２）および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１（ＮＡＬＣＮアンチセンスＲＮＡ１）の発現は、対照親細胞と比較して低下している。
【0007】
一部の実施形態では、本開示は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。
【0008】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示すｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。
【0009】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子の発現が、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用により低下しているｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。
【0010】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現が、配列番号１～１１の配列のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡの使用により低下している。例えば、一部の実施形態では、ＡＴＰ５ＥＰ２の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＬＩＮＣ００３１９の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＣＹＰ３Ａ７の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮＯＧの発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＳＰＡＮＸＮ３の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＹＲＩＰの発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＫＣＮＮ２の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＲＧＭＡの発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＧＡ５の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１０の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＣＡ１０の発現が低下しており、ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１１の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２の配列を含む。
【0011】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させるために使用されるヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質からなる群から選択される。
【0012】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現が、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集の使用により低下している。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ対は、遺伝子を標的として、その遺伝子の発現を低下させるおよび／または除去するために使用される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現がガイドＲＮＡ対の使用により低下しており、各ガイドＲＮＡが、（ａ）配列番号１２～１５のヌクレオチド配列から選択される配列を含む、および／または（ｂ）配列番号１６～３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される標的ＤＮＡ配列を標的とする。例えば、一部の実施形態では、ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１４の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子が、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログである。
【0013】
ある特定の実施形態では、１つのガイドＲＮＡ対が１つの遺伝子の発現を低下させるために使用される。ある特定の他の実施形態では、複数のガイドＲＮＡ対が１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させるために使用される。ある特定の実施形態では、１つもしくは複数の遺伝子の遺伝子発現、ならびに／または１つもしくは複数の遺伝子および／もしくはタンパク質の活性は、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株において、対照親細胞株と比較して低下しているおよび／または除去されている。ある特定の実施形態では、遺伝子発現および／または活性は、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞において、対照親細胞と比較して除去される。
【0014】
本明細書に記載される一部の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は真核細胞株である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株はヒト細胞株である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は昆虫細胞株である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株はＨｅＬａ細胞株である。ある特定の他の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。
【0015】
本明細書に記載される一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は、対照親細胞株よりも高いｒＡＡＶ力価を産生する。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞株の細胞から産生されるｒＡＡＶの力価は、対照親細胞を含む細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価と比較して約１．５～約７倍増加している。また、操作された細胞株の溶解液も本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、より高い力価のｒＡＡＶは溶解液から収集される。また、操作された細胞株からの細胞培養上清も本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、より高い力価のｒＡＡＶは細胞培養上清から収集される。
【0016】
また、産生細胞株を生成する方法であって、ｒＡＡＶベクターを、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下しているパッケージング細胞株の細胞に送達することを含む方法も本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本開示は、産生細胞株を生成する方法であって、ｒＡＡＶベクターを、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下しているパッケージング細胞株の細胞に送達することを含む、方法を提供する。
【0017】
また、パッケージング細胞株によって生成された産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることによってｒＡＡＶを産生する方法であって、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が、パッケージング細胞株において、対照親細胞と比較して低下している方法も本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現は、パッケージング細胞株において、対照親細胞と比較して低下している。
【0018】
一態様では、本開示は、産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることによってｒＡＡＶを産生する方法であって、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が、産生細胞株において、対照親細胞と比較して低下している方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることによってｒＡＡＶを産生する方法であって、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が、産生細胞株において、対照親細胞と比較して低下している方法を提供する。
【0019】
また、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞株と比較して低下している産生細胞株からｒＡＡＶを収集する方法も本明細書に記載される。また、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞株と比較して低下している産生細胞株からｒＡＡＶを収集する方法も記載される。ある特定の実施形態では、本開示の産生細胞株からのｒＡＡＶの産生は対照親細胞株と比較して増強される。
【0020】
また、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法も本明細書に記載され、方法は、ｉ．）ｒＡＡＶ力価を増加させる１種または複数種の補充物質を細胞株へ添加すること；ｉｉ．）補充および無補充細胞株におけるトランスクリプトームにわたって網羅的遺伝子発現を測定すること；ｉｉｉ．）補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現される遺伝子のリストを得ること；ならびにｉｖ．）ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の同定された遺伝子は、ｒＡＡＶの産生を低下させることを担う。
【0021】
また、ｒＡＡＶの産生の増加を促進するｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生する方法も本明細書に記載される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生は、補充ｒＡＡＶ産生細胞株と無補充ｒＡＡＶ産生細胞株の間で差次的に発現する遺伝子のリストから同定される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現をモジュレートすることによって増加する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ力価は、補充ｒＡＡＶ産生細胞株と無補充ｒＡＡＶ産生細胞株の間で差次的に発現する遺伝子のリストから同定される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現をモジュレートすることによって増加する。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質のモジュレーションは、ｒＡＡＶ力価を、モジュレーションを行わない細胞株のｒＡＡＶ力価と比較して少なくとも１．５倍増加させる。ある特定の実施形態では、発現をモジュレートすることは１つまたは複数の遺伝子の発現の低下である。ある特定の実施形態では、発現をモジュレートすることは１つまたは複数のタンパク質の発現の低下を含む。ある特定の実施形態では、発現をモジュレートすることは１つまたは複数の遺伝子の発現の除去である。ある特定の実施形態では、発現をモジュレートすることは１つまたは複数のタンパク質の発現の除去を含む。
【0022】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は真核細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株はヒト細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株は昆虫細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株はＨｅＬａ細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。
【0023】
また、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株も本明細書に記載される。
【0024】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性が無期限にまたは永続的に低下している。
【0025】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失を含むように操作されている。
【0026】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊を含むように操作されている。
【0027】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に遺伝子破壊を含むように操作されている。
【0028】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作されている。
【0029】
一部の実施形態では、細胞株は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作されている。
【0030】
また、対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示す組換えパッケージングおよび／または産生細胞株も提供される。
【0031】
本開示の他の特性および利点は、次の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0032】
別段の記述がない限り、本明細書において参照されるすべての刊行物、参考文献、特許および／または特許出願は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
【0033】
本開示は、以下を参照することでより完全に理解されるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２）
ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む、項目１に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目３）
前記発現が、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用により低下している、項目１または２に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４）
前記発現が、配列番号１～１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡの使用により低下している、項目１から３のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５）
ＡＴＰ５ＥＰ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目６）
ＬＩＮＣ００３１９の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目７）
ＣＹＰ３Ａ７の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目８）
ＮＯＧの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目９）
ＳＰＡＮＸＮ３の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１０）
ＭＹＲＩＰの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１１）
ＫＣＮＮ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１２）
ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１３）
ＲＧＭＡの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１４）
ＰＧＡ５の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１０の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１の配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１５）
ＡＢＣＡ１０の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１１の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２の配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１６）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質からなる群から選択される、項目３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１７）
前記発現がＣＲＩＳＰＲゲノム編集の使用により低下している、項目１から１６のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１８）
前記発現がガイドＲＮＡ対の使用により低下しており、各ガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号１２～１５のヌクレオチド配列から選択される配列を含む、および／または
（ｂ）配列番号１６～３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される標的ＤＮＡ配列を標的とする、
項目１７に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１９）
前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、項目１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２０）
前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１４の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、項目１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２１）
各ｇＲＮＡ分子が、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログである、項目１９または２０に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２２）
前記遺伝子発現が対照親細胞と比較して除去されている、項目１から２１のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２３）
ヒト細胞株である、項目１から２２のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２４）
前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、項目２３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２５）
ｒＡＡＶパッケージング細胞株である、項目１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
（項目２６）
ｒＡＡＶ産生細胞株である、項目１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
（項目２７）
ｒＡＡＶの力価が、前記対照親細胞を含む細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価と比較して約１．５～約７倍増加している、項目２６に記載の細胞株。
（項目２８）
項目１から２７のいずれか一項に記載の細胞株の溶解液。
（項目２９）
項目１から２７のいずれか一項に記載の細胞株からの細胞培養上清。
（項目３０）
産生細胞株を生成する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを項目２５に記載のパッケージング細胞株の細胞に送達すること含む、方法。
（項目３１）
ｒＡＡＶを産生する方法であって、項目３０に記載の方法によって生成された産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
（項目３２）
ｒＡＡＶを産生する方法であって、項目２６に記載の産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
（項目３３）
前記ｒＡＡＶが前記産生細胞株から収集される、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
ｒＡＡＶの前記産生が対照親細胞株と比較して増強される、項目３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
ｉ．ｒＡＡＶ力価を増加させる１種または複数種の補充物質を細胞株へ添加すること；
ｉｉ．補充および無補充細胞株におけるトランスクリプトームにわたって網羅的遺伝子発現を測定すること；
ｉｉｉ．補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現される遺伝子のリストを得ること；ならびに
ｉｖ．ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定すること
を含む、方法。
（項目３６）
前記細胞株に添加される前記１種または複数種の補充物質が、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、コルチゾン、プレドニゾン、ブデソニドまたはトリアムシノロンを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生してｒＡＡＶの産生の増加を促進する方法であって、項目３５に記載の方法を使用して同定された１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、方法。
（項目３８）
前記細胞株がｒＡＡＶパッケージング細胞株である、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞株がｒＡＡＶ産生細胞株である、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ｒＡＡＶ産生細胞株が、ｒＡＡＶ力価を、対応する１つまたは複数の遺伝子の発現のモジュレーションを行わないｒＡＡＶ産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶ力価よりも少なくとも１．５倍大きく増加する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させることを含む、項目３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を除去することを含む、項目３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞株がヒト細胞株である、項目３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４６）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性が無期限にまたは永続的に低下している、項目４５に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４７）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失を含むように操作されている、項目４６に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４８）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊を含むように操作されている、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４９）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に遺伝子破壊を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５０）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５１）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５２）
対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示す組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２）
ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む、項目１に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目３）
前記発現が、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用により低下している、項目１または２に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４）
前記発現が、配列番号１～１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡの使用により低下している、項目１から３のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５）
ＡＴＰ５ＥＰ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目６）
ＬＩＮＣ００３１９の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目７）
ＣＹＰ３Ａ７の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目８）
ＮＯＧの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目９）
ＳＰＡＮＸＮ３の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１０）
ＭＹＲＩＰの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１１）
ＫＣＮＮ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１２）
ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１３）
ＲＧＭＡの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１４）
ＰＧＡ５の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１０の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１の配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１５）
ＡＢＣＡ１０の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１１の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２の配列を含む、項目４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１６）
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質からなる群から選択される、項目３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１７）
前記発現がＣＲＩＳＰＲゲノム編集の使用により低下している、項目１から１６のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１８）
前記発現がガイドＲＮＡ対の使用により低下しており、各ガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号１２～１５のヌクレオチド配列から選択される配列を含む、および／または
（ｂ）配列番号１６～３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される標的ＤＮＡ配列を標的とする、
項目１７に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目１９）
前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、項目１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２０）
前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１４の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、項目１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２１）
各ｇＲＮＡ分子が、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログである、項目１９または２０に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２２）
前記遺伝子発現が対照親細胞と比較して除去されている、項目１から２１のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２３）
ヒト細胞株である、項目１から２２のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２４）
前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、項目２３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目２５）
ｒＡＡＶパッケージング細胞株である、項目１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
（項目２６）
ｒＡＡＶ産生細胞株である、項目１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
（項目２７）
ｒＡＡＶの力価が、前記対照親細胞を含む細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価と比較して約１．５～約７倍増加している、項目２６に記載の細胞株。
（項目２８）
項目１から２７のいずれか一項に記載の細胞株の溶解液。
（項目２９）
項目１から２７のいずれか一項に記載の細胞株からの細胞培養上清。
（項目３０）
産生細胞株を生成する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを項目２５に記載のパッケージング細胞株の細胞に送達すること含む、方法。
（項目３１）
ｒＡＡＶを産生する方法であって、項目３０に記載の方法によって生成された産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
（項目３２）
ｒＡＡＶを産生する方法であって、項目２６に記載の産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
（項目３３）
前記ｒＡＡＶが前記産生細胞株から収集される、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
ｒＡＡＶの前記産生が対照親細胞株と比較して増強される、項目３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
ｉ．ｒＡＡＶ力価を増加させる１種または複数種の補充物質を細胞株へ添加すること；
ｉｉ．補充および無補充細胞株におけるトランスクリプトームにわたって網羅的遺伝子発現を測定すること；
ｉｉｉ．補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現される遺伝子のリストを得ること；ならびに
ｉｖ．ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定すること
を含む、方法。
（項目３６）
前記細胞株に添加される前記１種または複数種の補充物質が、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、コルチゾン、プレドニゾン、ブデソニドまたはトリアムシノロンを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生してｒＡＡＶの産生の増加を促進する方法であって、項目３５に記載の方法を使用して同定された１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、方法。
（項目３８）
前記細胞株がｒＡＡＶパッケージング細胞株である、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞株がｒＡＡＶ産生細胞株である、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ｒＡＡＶ産生細胞株が、ｒＡＡＶ力価を、対応する１つまたは複数の遺伝子の発現のモジュレーションを行わないｒＡＡＶ産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶ力価よりも少なくとも１．５倍大きく増加する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させることを含む、項目３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を除去することを含む、項目３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞株がヒト細胞株である、項目３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４６）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性が無期限にまたは永続的に低下している、項目４５に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４７）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失を含むように操作されている、項目４６に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４８）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊を含むように操作されている、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目４９）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に遺伝子破壊を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５０）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５１）
ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、項目４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
（項目５２）
対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示す組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【0035】
【0036】
【図3-1】図３Ａ～３Ｂは、非補充細胞培養培地において培養した細胞における遺伝子発現の非感染細胞（ヘルパーウイルスに感染していない細胞）に対する対数倍率変化、および補充細胞培養培地において培養した細胞における遺伝子発現の非補充細胞培養培地に対する対数倍率変化として表される、ＰＧＡ５（図３Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｂ）に関するＲＮＡ－Ｓｅｑデータのバイオインフォマティクス解析から得た遺伝子発現の対数倍率変化値を示すグラフである。図３Ｃ～３Ｄは、非補充および補充細胞培養培地において培養した細胞におけるＰＧＡ５（図３Ｃ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｄ）の発現の非感染細胞に対するＲＴ－ｑＰＣＲ倍率変化値を示すグラフである。
【図3-2】図３Ａ～３Ｂは、非補充細胞培養培地において培養した細胞における遺伝子発現の非感染細胞（ヘルパーウイルスに感染していない細胞）に対する対数倍率変化、および補充細胞培養培地において培養した細胞における遺伝子発現の非補充細胞培養培地に対する対数倍率変化として表される、ＰＧＡ５（図３Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｂ）に関するＲＮＡ－Ｓｅｑデータのバイオインフォマティクス解析から得た遺伝子発現の対数倍率変化値を示すグラフである。図３Ｃ～３Ｄは、非補充および補充細胞培養培地において培養した細胞におけるＰＧＡ５（図３Ｃ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｄ）の発現の非感染細胞に対するＲＴ－ｑＰＣＲ倍率変化値を示すグラフである。
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【図7】図７Ａは、上位１９の２Ｈ５ノックアウトクローンの２４ディープウエル力価を示すグラフである。力価は１ｍＬあたりのゲノムコピーとして報告される。対照試料は非改変２Ｈ５である。図７Ｂは、２Ｈ５対照と比較した力価の倍率変化を示すグラフである。２Ｈ５力価は１に設定され、他の力価は２Ｈ５対照に対する増加倍率として表示される。図７Ｃは、上位１９の７Ｂ１２ノックアウトクローンの２４ディープウエル力価を示すグラフである。力価は１ｍＬあたりのゲノムコピーとして報告される。対照試料は非改変７Ｂ１２である。図７Ｄは、７Ｂ１２対照と比較した力価の倍率変化を示すグラフである。７Ｂ１２力価は１に設定され、他の力価は７Ｂ１２対照に対する増加倍率として表示される。
【0041】
【図8】図８Ａは、上位５つの２Ｈ５ノックアウトクローンのａｍｂｒ（登録商標）１５力価を示すグラフである。力価は１ｍＬあたりのゲノムコピーとして報告される。対照試料は非改変２Ｈ５である。図８Ｂは、２Ｈ５対照と比較した力価の倍率変化を示すグラフである。２Ｈ５力価は１に設定され、他の力価は２Ｈ５対照に対する増加倍率として表示される。図８Ｃは、上位４つの７Ｂ１２ノックアウトクローンのａｍｂｒ（登録商標）１５力価を示すグラフである。力価は１ｍＬあたりのゲノムコピーとして報告される。対照試料は非改変７Ｂ１２である。図８Ｄは、７Ｂ１２対照と比較した力価の倍率変化を示すグラフである。７Ｂ１２力価は１に設定され、他の力価は７Ｂ１２対照を超える増加倍率として表示される。
【0042】
【発明を実施するための形態】
【0043】
開示の詳細な説明
本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現がモジュレートされている細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株を記載する。遺伝子発現のモジュレーションは、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現がモジュレートされていない細胞株と比較して増加した力価収率をもたらす。
本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現がモジュレートされている細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株を記載する。遺伝子発現のモジュレーションは、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現がモジュレートされていない細胞株と比較して増加した力価収率をもたらす。
【0044】
他に示されない限り、技術用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義はＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．），
Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８に見出されうる。
Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５ （ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８に見出されうる。
【0045】
以下の定義は、本主題を理解することを目的として、および添付の特許請求の範囲を構築するために含まれる。本明細書において使用される略記は、化学および生物学の技術分野における従来の意味を有する。
定義
定義
【0046】
本明細書において使用される場合、「モジュレーション」または「モジュレートする」とは、遺伝子および／またはタンパク質の制御、発現または活性の変更を指す。モジュレーションは、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を増加している、低下（減少）している、または除去している場合がある。複数の遺伝子および／またはタンパク質がモジュレートされる場合、遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性のすべてが増加してよく、遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性のすべてが減少してよく、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質が増加し、他の遺伝子および／またはタンパク質が減少してよい。
【0047】
本明細書において使用される場合、用語「細胞」は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生できる任意の１個または複数個の細胞を指す。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞またはＶｅｒｏ細胞である。他の実施形態では、細胞は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、Ｓｆ－２１細胞、Ｔｎ－３６８細胞またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞である。用語「細胞株」は、分裂し続け、老化を受けずにいることができる細胞のクローン集団を指す。他に示さない限り、用語「細胞」または「細胞株」は、示される細胞または細胞株の改変されたまたは操作されたバリアントを含むと理解される。
【0048】
本明細書において使用される場合、用語「操作された細胞株」は、１つまたは複数の内在性に発現する遺伝子および／またはタンパク質（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現または他の性質（例えば、生物活性）を低下させる１つまたは複数の手段によってｒＡＡＶの産生を増大するように改変された細胞株を指す。
【0049】
本明細書において使用される場合、用語「対照親細胞」は、１つまたは複数の内在性に発現する遺伝子および／またはタンパク質（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現または他の性質（例えば、生物活性）を低下させる１つまたは複数の手段によってｒＡＡＶの産生を増大するように改変されていない細胞を指す。
【0050】
本明細書において使用される場合、用語「対照親細胞株」は、分裂し続け、老化を受けずにいることができる対照親細胞のクローン集団を指す。
【0051】
「溶解」とは、細胞の完全性を損なうウイルス、酵素または浸透圧機構によることが多い、細胞の破壊を指す。「溶解細胞」とは、実質的な溶解を受けた細胞である。本明細書において使用される場合、用語「溶解液」は、溶解細胞の内容物を含有する流体を指す。
【0052】
本明細書において使用される場合、用語「より高い力価」は、非改変対照親細胞株および／または対照親細胞によって産生される力価との比較において増加した力価を示す。
【0053】
本明細書において使用される場合、用語「細胞培養上清」は、細胞が懸濁されるおよび／または培養される細胞培養培地を指す。
【0054】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」は、転写単位、ならびに転写単位に隣接（例えば、上流および下流に位置）し、作動可能に連結する制御領域を指す。転写単位とは、ＲＮＡ分子に転写される一連のヌクレオチドである。転写単位はコード領域を含みうる。「コード領域」とは、その後ｍＲＮＡにプロセシングされる、プロセシングされていないｐｒｅＲＮＡ（すなわち、エクソンおよびイントロンの両方を含むＲＮＡ分子）をコードするヌクレオチド配列である。転写単位は非コードＲＮＡをコードしうる。非コードＲＮＡとは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子である。非コードＲＮＡの例としてはマイクロＲＮＡが挙げられる。転写単位の境界は、転写単位の５’末端における開始部位および転写単位の３’末端における転写終結因子によって一般に決定される。「制御領域」とは、それが作動可能に連結する転写単位の発現を制御するヌクレオチド配列である。制御配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写終結因子およびポリ（Ａ）シグナルが挙げられる。転写単位の上流に位置する制御領域は５’ＵＴＲと称される場合があり、転写単位の下流に位置する制御領域は３’ＵＴＲと称される場合がある。制御領域は転写されてよく、プロセシングされていないｐｒｅＲＮＡの部分であってよい。
【0055】
本文書の文脈では、用語「標的」または「標的遺伝子」は、タンパク質コード遺伝子および非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子を含む、モジュレートされた場合にウイルス産生の一部の状況を変更する任意の遺伝子を指す。標的遺伝子としては、内在性遺伝子、ウイルス遺伝子および導入遺伝子が挙げられる。
【0056】
遺伝子表記に関して、単一遺伝子はしばしば複数の記号によって表される。本文書の文脈では、遺伝子記号は、ヒトであるかまたは非ヒトであるかどうかに関わらず、大文字または小文字のいずれかによって表記される。１つの特定の記号の使用も、小文字または大文字記号の採用も、これらの開示の文脈において遺伝子の範囲を限定することを意図していない。本明細書において同定されるすべての遺伝子同定番号（遺伝子ＩＤ）は、他に同定されない限り、米国立生物工学情報センター「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」またはＫＥＧＧウェブサイトに由来する。
【0057】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書において、およそ、ほぼ、おおよそ、または前後を意味するために使用される。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値範囲と共に使用される場合、許容される値範囲内において、記載された数値よりも上および／または下に境界を延長することによってその範囲を修正する。
【0058】
本開示において使用される場合、移行句にあるかまたは特許請求の範囲の本文にあるかどうかに関わらず、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的な意味を有すると解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、語句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と同義に解釈されるべきである。方法の文脈において使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、方法が列挙されたステップを少なくとも含むが、追加的なステップを含んでよいことを意味する。組成物の文脈において使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物が列挙された特性または成分を少なくとも含むが、追加的な特性または成分もまた含んでよいことを意味する。
【0059】
本明細書に記載される実施形態の理解を促進することを目的として、好ましい実施形態および特定の語を参照して、それを記載する。本明細書において使用される術語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、本開示の範囲を限定することを意図していない。本開示全体を通じて使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他のことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書において使用されるすべてのパーセンテージおよび比は、他に示さない限り、重量によるものである。
【0060】
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは等しい方法および材料が本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。付加的に、材料、方法および例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図していない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参考として援用される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
【0061】
ＡＡＶは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さな無エンベロープの複製欠陥ウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことが知られておらず、非常に軽度な免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存続することができる。これらの特性により、ＡＡＶは遺伝子治療に魅力的なウイルスベクターとなっている。ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２だけでなく、非ヒト霊長類由来の１００を超える血清型を含む、多数の血清学的に識別可能なタイプを含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０５（１）： １７－２４ （２００８）、およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，
７８（１２）， ６３８１－６３８８ （２００４）を参照されたい）。ＡＡＶは、非自律的に複製し、潜伏期および感染期を有する生活環を有する。潜伏期において、細胞がＡＡＶに感染した後、ＡＡＶはプロウイルスとして宿主のゲノムに部位特異的に組み込まれる。ＡＡＶの複製を可能にするヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）または単純ヘルペスウイルス）もまた細胞に感染しなければ、感染期は生じない。
７８（１２）， ６３８１－６３８８ （２００４）を参照されたい）。ＡＡＶは、非自律的に複製し、潜伏期および感染期を有する生活環を有する。潜伏期において、細胞がＡＡＶに感染した後、ＡＡＶはプロウイルスとして宿主のゲノムに部位特異的に組み込まれる。ＡＡＶの複製を可能にするヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）または単純ヘルペスウイルス）もまた細胞に感染しなければ、感染期は生じない。
【0062】
野生型ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド封入および組み込みを指示するシグナル配列を含有する２つの１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含有する。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーター、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシングと組み合わされて、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質はゲノム複製を担う。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現し、ｃａｐ遺伝子のスプライスバリアントである３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを形成する。
【0063】
複製、カプシド封入および組み込みのためのシス作用性シグナルがＩＴＲ内に含有されるため、一部またはすべての４．３ｋｂ内部ゲノムは、外来ＤＮＡ、例えば目的の外来タンパク質のための発現カセットで置換されうる。この場合、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、例えばプラスミド上でトランスに提供される。ＡＡＶベクターを産生するために、ＡＡＶ複製を許容する細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、ならびにヘルパーウイルス、例えばＡＶ遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡによって提供されるヘルパー機能を発現しなければならない（Ｗｅｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｐｐ． １－２３， ２０１１）。ＡＡＶベクターの産生は、ＡＡＶベクターの使用前に除去されなければならないまたは不活性化されなければならないヘルパーウイルス粒子の産生ももたらしうる。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞および昆虫細胞を含む多数の細胞型がＡＡＶベクターを産生するのに好適である（例えば米国特許第６，１５６，３０３号、第５，３８７，４８４号、第５，７４１，６８３号、第５，６９１，１７６号、第５，６８８，６７６号、第８，１６３，５４３号、米国公開第２００２００８１７２１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４７７５７号、第ＷＯ００／２４９１６号および第ＷＯ９６／１７９４７号を参照されたい）。ＡＡＶベクターは典型的には、これらの細胞型において、ＩＴＲ隣接発現カセットを含有する１つのプラスミド、ならびに追加的なＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つまたは複数の追加的なプラスミドによって産生される。
【0064】
任意の血清型のＡＡＶを本開示において使用することができる。同様に、任意のＡＶタイプを使用することができることが企図され、当業者はその所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の産生に好適なＡＡＶおよびＡＶタイプを特定することができる。ＡＡＶおよびＡＶ粒子は、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオジキサノール勾配またはＣｓＣｌ勾配によって精製されうる。
【0065】
野生型ＡＡＶのゲノムは、一本鎖ＤＮＡであり、４．７ｋｂである。ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂであるか、または５．２ｋｂ規模の特大ゲノムもしくは３．０ｋｂほどの小さなゲノムを含む、４．７ｋｂよりも大きいかもしくは小さい一本鎖ゲノムを有しうる。さらに、ベクターゲノムは、ウイルス内でゲノムが実質的に二本鎖であるように、実質的に自己相補性でありうる。すべてのタイプのゲノムを含有するＡＡＶベクターは、本開示の方法における使用に好適である。
【0066】
上で論じたように、ＡＡＶは、その生活環の感染期に入るためにヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとしてはアデノウイルス（ＡＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられ、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞においてＡＡＶを産生するための系が存在する。パピローマウイルスもまたＡＡＶのためのヘルパー機能を提供しうるということも提唱されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９， Ｓ２８９－Ｓ２９０ （２００４）を参照されたい）。ヘルパーウイルスとしては、ＡＡＶ複製を生み出し、可能にすることができる任意のウイルスが挙げられる。ＡＶは、およそ３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する無エンベロープの核ＤＮＡウイルスである。ＡＶは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ遺伝子を提供し、ＡＡＶ複製およびカプシド封入を可能にすることによって細胞における潜在ＡＡＶプロウイルスをレスキューすることができる。ＨＳＶは、比較的大きな二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムが脂質二重層エンベロープに包まれている正二十面体カプシドにカプシド封入されたウイルスのファミリーである。ＨＳＶは感染性かつ高度に伝染性である。以下のＨＳＶ－１複製タンパク質：ヘリカーゼ／プライマーゼ複合体（ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２）ならびにＵＬ２９遺伝子によってコードされるＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８は、ＡＡＶ複製に必要なものとして同定され、他のタンパク質はヘルパー機能を増強した。ＡＡＶパッケージング系は２つの目的に役立つ、すなわち、ＡＡＶパッケージング系は、トランスフェクションプロセスの問題を回避し、１つまたはいくつかのヘルパー機能の使用に基づく産生技術を実現する。
ｒＡＡＶの産生
ｒＡＡＶの産生
【0067】
ｒＡＡＶの一般原則は他の箇所において概観することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３：５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ， １９９２， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：９７－１２９を参照されたい）。概して、ｒＡＡＶの産生を可能にするために、細胞は、ＡＡＶのＩＴＲ（例えば、目的の異種性ヌクレオチド配列に隣接していてよい）、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能だけでなく追加的ヘルパー機能も含んで提供されなければならない。これらは、任意の数のプラスミドまたはベクターを使用して細胞に提供されうる。追加的ヘルパー機能は、例えばアデノウイルス（ＡＶ）感染によって、必要なすべてのＡＶヘルパー機能遺伝子を保有するプラスミドによって、またはＨＳＶもしくはバキュロウイルスなどのウイルスによって提供されうる。任意の遺伝子、遺伝子機能または細胞によるｒＡＡＶ産生のために必要な他の遺伝材料は、細胞内に一過的に存在しうる、または細胞ゲノムに安定に挿入されうる。本開示の方法とともに使用されるのに好適なｒＡＡＶ産生方法は、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：１３２９～１３４１頁（１９９５年）、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：２５３～２６９頁（２０１３年）、Ｔｈｏｒｎｅら、Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：７０７～７１４頁（２００９年）、Ｆｒａｓｅｒ
Ｗｒｉｇｈｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：６９８～７０６頁（２００９年）およびＶｉｒａｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：８０７～８１７頁（２００９年）に開示されたものを含む。ＡＡＶ産生系に関する２つの主要な手法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージング細胞株およびアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生細胞株である。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：７０７～７１４頁（２００９年）、Ｆｒａｓｅｒ
Ｗｒｉｇｈｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：６９８～７０６頁（２００９年）およびＶｉｒａｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：８０７～８１７頁（２００９年）に開示されたものを含む。ＡＡＶ産生系に関する２つの主要な手法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージング細胞株およびアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生細胞株である。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株
【0068】
ｒＡＡＶパッケージング細胞株は、本明細書に記載されるＡＡＶ遺伝子エレメントの細胞発現を可能にすることによって産生することができる。細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ）にＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを用いた安定なトランスフェクションを行うことで、パッケージング細胞株の産生をもたらしうる。このｒＡＡＶパッケージング細胞株に、２つの異なるアデノウイルス（ＡＡＶ遺伝子治療エレメントを含有するヘルパーウイルスおよびハイブリッドウイルス）を共感染させて、ｒＡＡＶ粒子を産生することができる。代替的に、パッケージング細胞にｒＡＡＶベクターを含有するプラスミドを用いた安定なトランスフェクションを行うまたはパッケージング細胞にｒＡＡＶベクターを感染させると、ｒＡＡＶ産生細胞株を生じる。産生細胞へのヘルパーウイルスの感染は、ｒＡＡＶの産生を生じる。図１は、パッケージングおよび産生細胞株を例示する。
【0069】
本開示のある特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を含むｒＡＡＶパッケージング細胞株は、ｒＡＡＶ力価を増加するように操作される。
【0070】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージング細胞株を提供する。例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現は対照親細胞と比較して低下している。
【0071】
一部の実施形態では、本開示は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージング細胞株を提供する。
【0072】
他の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶ産生細胞株を提供する。例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現は対照親細胞と比較して低下している。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞株は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の遺伝子発現を低下させるように操作されている。
【0073】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞株は接着または懸濁液形態でありうる。
【0074】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）は哺乳動物細胞株（例えば、ＨｅＬａ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９またはＶｅｒｏ細胞株）である。ある特定の実施形態では、細胞株は昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ－２１、Ｔｎ－３６８またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４）である。
ｒＡＡＶ産生細胞株を生成する方法
ｒＡＡＶ産生細胞株を生成する方法
【0075】
一部の実施形態では、本開示は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照細胞と比較して低下している細胞を含む操作されたｒＡＡＶパッケージング細胞株にｒＡＡＶベクターを送達することによって産生細胞株を生成する方法を提供する。
【0076】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む操作されたｒＡＡＶパッケージング細胞株にｒＡＡＶベクターを送達することによって産生細胞株を生成する方法を提供する。
補充物質
補充物質
【0077】
本明細書において使用される場合、用語「補充物質」は、化学的起源であるかまたは生物学的起源であるか否かに関わらず、ｒＡＡＶ力価を増加させるため、またはｒＡＡＶ力価の増加に関してアッセイするために細胞培養のための培地に使用されうる任意の化合物または他の物質を指す。補充物質の非限定的な例としては、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質、酵素、ヌクレオシド、代謝産物、界面活性剤、乳化剤、無機塩およびポリマーが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株に添加される１種または複数種の補充物質は、グルココルチコイドアナログである。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株に添加される１種または複数種の補充物質としては、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、コルチゾン、プレドニゾン、ブデソニドおよび／またはトリアムシノロンが挙げられる。
【0078】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ力価を増加させるための溶液中のグルココルチコイドアナログの濃度は、１μＭよりも大きいもしくはそれと等しい、０．１μＭよりも大きいもしくはそれと等しい、０．０１μＭよりも大きいもしくはそれと等しい、０～１μＭの間、０～０．１μＭの間、０～０．０１μＭの間、０．０１～１μＭの間または０．０１～０．１μＭの間でありうる。
【0079】
本明細書において使用される場合、「補充細胞株」とは、１種または複数種の補充物質（例えば、グルココルチコイドアナログ）がｒＡＡＶ力価を増加させるために添加されている細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）を指す。本明細書において使用される場合、「無補充細胞株」とは、ｒＡＡＶ力価を増加させるための単数または複数の補充物質に曝露されない細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）を指す。本明細書において使用される場合、用語「無補充」および「非補充」は交換可能に使用されて、細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）がｒＡＡＶ力価を増加させるための単数または複数の補充物質に曝露されない培養条件を指す。
ｒＡＡＶ産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法
ｒＡＡＶ産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法
【0080】
本開示は部分的には、補充および無補充細胞株における網羅的遺伝子発現パターンを比較することによってｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法を対象とする。
【0081】
用語「網羅的遺伝子発現」は当技術分野において周知である（Ｗａｎｇ Ｚ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １０（１）， ５７－６３ （２００９）を参照されたい）。用語「網羅的遺伝子発現」とは、遺伝子発現の異なる状況に関する情報を含有するデータの１つまたは複数のセットを指す。データセットは、細胞または細胞由来試料における標的転写物の存在；標的転写物の相対および絶対存在量レベル；種々の処理（例えば、補充物質の添加）の、特定の遺伝子の発現をモジュレートする能力；ならびに種々の処理（例えば、補充物質の添加）の、特定の遺伝子の発現を異なるレベルに変化させる能力に関する情報を必要に応じて含む。
【0082】
用語「差次的に発現する」は当技術分野において周知である（Ｗａｎｇ Ｚ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １０（１）， ５７－６３ （２００９）、Ｏｚｓｏｌａｋ， Ｆ． ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １２（２）， ８７－９８ （２０１１）、Ｈａｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ， ９， ２９－４６ （２０１５）を参照されたい）。
【0083】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）には、ｒＡＡＶの産生を増加させる１種または複数種の補充物質が補充される。一部の実施形態では、ＲＮＡ試料は、周知の手順のいずれかを使用して１つまたは複数の細胞株（補充および無補充）から抽出される。例えば、全ＲＮＡは、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）精製プラットフォーム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの自動化適合性９６ウエルフォーマットにおけるシリカに基づく単離を使用して細胞から精製することができる。
【0084】
発現したＲＮＡ試料における遺伝子発現のパターンは、定性的および定量的測定のいずれか（または両方）によって評価することができる。一部の実施形態では、遺伝子の発現のレベルを他の発現産物に対しておよび／または対照配列に対して定量することが有用である。１つの簡便かつ広範に適用可能な相対発現量を決定する方法は、１つまたは複数の目的の遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子（例えば、ＨＰＲＴ１、ＨＳＰ７０またはβ－アクチン）などの対照遺伝子の発現量と比較することである。
【0085】
観察された発現データ、例えば生体試料（例えば、補充および無補充細胞株）の１つまたは複数の処理（例えば、補充物質の添加）に応答した遺伝子発現プロファイルの変化が有意であるかどうか、例えば単に実験のノイズまたは集団の異種性の産物ではないかどうかを確認するために、確率分布の推定を、各生体試料における各遺伝子および表現型エンドポイントに関して構築することができる。推定集団分布の構築は、各処理に関する複数の独立した実験を行うことを伴い、例えば、すべての実験は、２回反復、３回反復、４回反復等で行われる。複数の生体試料（例えば、補充および無補充細胞株）からの発現データは、多変量解析を使用して群分けするまたはクラスター化することができる。データの解析は、処理に応答して、例えば補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現する遺伝子のリストを作成することができる。差次的に発現する遺伝子のリストは、ｒＡＡＶの産生を増加させるのに有用な１つまたは複数の遺伝子を同定するために、種々の遺伝子フィルタリング方法論を使用してフィルタリングすることができる。
【0086】
一部の実施形態では、本開示は、補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現する遺伝子のリストからｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法を対象とする。ある特定の実施形態では、細胞株は真核細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株はヒト細胞株である。ある特定の実施形態では、細胞株はＨｅＬａ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株である。ある特定の実施形態では、網羅的遺伝子発現は、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定するために、異なる細胞株にわたって（例えば、無補充ＨｅＬａ細胞株と補充ＨｅＬａ細胞株の間、無補充ＨＥＫ２９３細胞株と補充ＨＥＫ２９３細胞株の間、無補充ＨｅＬａ細胞株と補充ＨＥＫ２９３細胞株の間、無補充ＨｅＬａ細胞株と無補充ＨＥＫ２９３細胞株の間、補充ＨｅＬａ細胞株と補充ＨＥＫ２９３細胞株の間で）測定される。ある特定の実施形態では、補充ＨＥＫ２９３および補充ＨｅＬａからの網羅的遺伝子発現データを組み合わせ、無補充ＨＥＫ２９３および無補充ＨｅＬａ細胞株からの組み合わされた網羅的遺伝子発現データと比較して、ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定することができる。
【0087】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶの産生の増加を促進するｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生する方法を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生は、補充ｒＡＡＶ産生細胞株と無補充ｒＡＡＶ産生細胞株の間で差次的に発現する遺伝子のリストから同定される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現をモジュレートすることによって増加する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶの力価は、補充ｒＡＡＶ産生細胞株と無補充ｒＡＡＶ産生細胞株の間の差次的発現遺伝子のリストから同定される１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現をモジュレートすることによって増加する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ力価は、対応する遺伝子および／またはタンパク質の発現のモジュレーションを行わない細胞株によって産生されるｒＡＡＶ力価と比較して少なくとも１．５倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍または３０倍）増加する。
モジュレートされる遺伝子および／またはタンパク質
モジュレートされる遺伝子および／またはタンパク質
【0088】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株において（個別にまたは組み合わせて）モジュレートされた場合にｒＡＡＶの産生を増強する遺伝子のリストを提供する。
【0089】
ＡＴＰ合成酵素Ｆ１サブユニットイプシロン偽遺伝子２（ＡＴＰ５ＥＰ２としても公知）は、ミトコンドリアのＡＴＰ合成酵素サブユニットイプシロン様タンパク質をコードする。ＡＴＰ５ＥＰ２は、呼吸鎖の電子伝達複合体によって生成される膜を挟んだプロトン勾配の存在下においてＡＤＰからＡＴＰを産生するミトコンドリア膜ＡＴＰ合成酵素である。ヒトＡＴＰ５ＥＰ２配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿００６８８６．４（配列番号４３）またはＮＧ＿０５３１６３．１（配列番号４４）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0090】
長鎖遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ３１９（ＬＩＮＣ００３１９としても公知）は、ＲＮＡ遺伝子であり、非コードＲＮＡクラスに属する。長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、多発がんの病因および進行において制御に関わる重要な役割を果たすことが示されている。ＬＩＮＣ００３１９配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿１９４３０９（配列番号４５）またはＮＲ＿０２６９６０．１（配列番号４６）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0091】
シトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー７（ＣＹＰ３Ａ７としても公知）は、薬物代謝、ならびにコレステロール、ステロイドおよび他の脂質の合成に関わる酵素であるシトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーをコードする遺伝子である。この酵素は、テストステロンおよびデヒドロエピアンドロステロン３－サルフェートをヒドロキシル化し、妊娠中のエストリオールの形成に関与する。この遺伝子は、染色体７ｑ２１．１における関連遺伝子のクラスターの一部である。ＣＹＰ３Ａ７配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿０００７６５（配列番号４７）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0092】
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１０（ＡＢＣＡ１０としても公知）は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのスーパーファミリーのメンバーに所属する膜関連タンパク質をコードする。ＡＢＣタンパク質は、細胞外膜および細胞内膜を越えて種々の分子を輸送する。ＡＢＣ遺伝子は、７つの別個のサブファミリー（ＡＢＣ１、ＭＤＲ／ＴＡＰ、ＭＲＰ、ＡＬＤ、ＯＡＢＰ、ＧＣＮ２０およびＷｈｉｔｅ）に分けられる。ＡＢＣＡ１０は、ＡＢＣ１サブファミリーのメンバーである。ＡＢＣ１サブファミリーのメンバーは、多細胞真核生物にのみ見出される唯一の主要なＡＢＣサブファミリーを構成する。この遺伝子は、１７ｑ２４において４つの他のＡＢＣ１ファミリーメンバーの間でクラスター形成する。ＡＢＣＡ１０配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿０８０２８２．３（配列番号４８）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0093】
ノギン（ＮＯＧとしても公知）は、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）などの形質転換増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーシグナル伝達タンパク質のメンバーと結合しそれを不活性化する分泌ポリペプチドをコードする。理論に拘束されるものではないが、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのメンバーよりも効率的に細胞外マトリックスに拡散することによって、このタンパク質は、形態形成勾配を生み出すことにおいて主要な役割を有しうると考えられている。ＮＯＧは、発生の初期および後期の両方において多面的な効果を有するようである。ＮＯＧ配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿００５４５０．４（配列番号４９）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0094】
反発性ガイダンス分子ＢＭＰ共役受容体Ａ（ＲＧＭＡとしても公知）は、反発性ガイダンス分子ファミリーのメンバーをコードする遺伝子である。コードされるタンパク質は、発達期中枢神経系および成体中枢神経系において軸索誘導タンパク質として機能するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質である。このタンパク質は、一部のがんにおける腫瘍抑制因子としても機能しうる。ＲＧＭＡ配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿０２０２１１．２（配列番号５０）またはＮＭ＿００１１６６２８３．１（配列番号５１）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0095】
ＳＰＡＮＸ（Ｘ染色体の核と関連する精子タンパク質）ファミリーメンバーＮ３（ＳＰＡＮＸＮ３としても公知）はタンパク質コード遺伝子である。ＳＰＡＮＸＮ３配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿００１００９６０９（配列番号５２）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0096】
ペプシノゲン－５、グループＩ（ＰＧＡ５またはペプシノゲンＡとしても公知）は、エンドペプチダーゼのペプチダーゼＡ１ファミリーのメンバーである消化酵素ペプシンのタンパク質前駆体をコードする。コードされる前駆体は、胃の主細胞によって分泌され、酸性条件において自己触媒的切断を受けて活性酵素を形成し、食品タンパク質の消化において機能する。この遺伝子は、それぞれが複数のペプシノゲンのうちの１つをコードする第１１染色体における関連遺伝子のクラスター中に見出される。ＰＧＡ５配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿０１４２２４．４（配列番号５３）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0097】
ミオシンＶＩＩＡおよびＲａｂ相互作用タンパク質（ＭＹＲＩＰとしても公知）は、メラノソーム結合ＲＡＢ２７Ａと運動タンパク質ＭＹＯ５ＡおよびＭＹＯ７Ａとの連結器として役立つ、メラノソーム輸送に関与するＲａｂエフェクタータンパク質をコードする。このＲａｂエフェクタータンパク質は、プロテインキナーゼＡアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）として機能し、ＰＫＡを開口放出機構の成分と連結する足場タンパク質として作用することができ、したがってインスリン放出を含む開口放出を容易にする。ＭＹＲＩＰ配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿０１５４６０（配列番号５４）またはＮＭ＿００１２８４４２３．１（配列番号５５）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0098】
カルシウム活性化カリウムチャネルサブファミリーＮメンバー２（ＫＣＮＮ２としても公知）遺伝子は、カリウムチャネル遺伝子のＫＣＮＮファミリーのメンバーである。コードされるタンパク質は、電位非依存性カルシウム活性化チャネルを３つの他のカルモジュリン結合サブユニットと共に形成する膜内在性タンパク質である。この遺伝子の選択的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。ＫＣＮＮ２配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＭ＿１７０７７５．２（配列番号５６）またはＮＭ＿００１２７８２０４．１（配列番号５７）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0099】
ＮＡＬＣＮアンチセンスＲＮＡ１（ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１としても公知）は、ＲＮＡ遺伝子であり、非コードＲＮＡクラスに属する。ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１配列の例は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおける参照配列ＮＷ＿０１１３３２７００．１（配列番号５８）またはＮＲ＿０４７６８７．１（配列番号５９）（ヌクレオチド配列）の下で入手可能である。
【0100】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。
【0101】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含むｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を提供する。
【0102】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株において個別にモジュレートされた場合にｒＡＡＶの産生を対照親細胞株と比較して増強する遺伝子のリストを提供する。一部の態様では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における遺伝子の異なる組合せのモジュレーションは、ｒＡＡＶの産生を増加させる。一部の態様では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０または少なくとも１１の遺伝子の発現をモジュレートすることは、対照親細胞株と比較して増加したｒＡＡＶ産生をもたらす。
１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質をモジュレートする方法
１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質をモジュレートする方法
【0103】
遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現または活性をモジュレートすること（例えば、低下させること）は、以下：１）遺伝子コピー数、２）遺伝子の転写もしくは翻訳、３）転写物の安定性もしくは寿命、４）ｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡのコピーの数、５）非コードＲＮＡもしくは非コードＲＮＡ標的部位のアベイラビリティ、６）タンパク質の翻訳後修飾の位置もしくは程度、または７）タンパク質の活性のうちの１つまたは複数を変更することを含むがこれだけに限らない様々な機構によって達成することができる。遺伝子発現をモジュレートするために使用することができる手段としては、これだけに限らないが、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失が挙げられる。
ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼ
【0104】
ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーションは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して達成される。合成ＺＦＮは、例えばＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインと融合したジンクフィンガー結合ドメインから構成される。ＺＦＮは、多様な生物において、遺伝子発現をノックアウトするまたはノックインすることを含むがこれだけに限らない細胞のゲノム編集のために設計／操作することができる。メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、および三重鎖もまた、幅広い細胞型においてゲノム操作のために使用することができる。記載される試薬を使用して、プロモーター、タンパク質コード領域（エクソン）、イントロン、５’および３’ＵＴＲ等を標的とすることができる。
モジュレーションのための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子
モジュレーションのための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子
【0105】
ある特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が、本明細書に記載される細胞株（例えば、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株）における１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートするために使用されうる。ｄｓＲＮＡ分子は、配列相同性に基づく対応するＲＮＡ配列の標的化によって１つまたは複数の遺伝子と拮抗するように設計することができる。そのようなｄｓＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）でありうる。そのようなｄｓＲＮＡの配列は、モジュレートされる１つまたは複数の遺伝子をコードするｍＲＮＡの相補的な部分を含むことができる。この部分は、ｍＲＮＡ内の標的部分と１００％相補的であることができるが、より低いレベルの相補性（例えば、９０％もしくはそれよりも高い、または９５％もしくはそれよりも高い）もまた使用することができる。典型的には、相補性パーセントは、ある長さの連続する核酸残基にわたって決定される。本開示のｄｓＲＮＡ分子は、例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個またはそれよりも多い核酸残基にわたって測定して、ｍＲＮＡ内の標的部分と少なくとも８０％の相補性を有しうる。場合によっては、ｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の長さ全体にわたってｍＲＮＡ内の標的部分と少なくとも８０％の相補性を有する。
【0106】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を使用する別の遺伝子標的試薬は、ｓｈＲＮＡとも称される小ヘアピンＲＮＡである。例えば発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルス）を介して細胞に送達されるｓｈＲＮＡは、用いられるプロモーターの種類に応じて、遺伝子発現の長期低下を恒常的または制御的に実現する能力を有する。一実施形態では、レンチウイルス粒子のゲノムは、目的の遺伝子（複数可）を標的とする１つまたは複数のｓｈＲＮＡ発現カセットを含むように改変される。そのようなレンチウイルスは、細胞に感染し、そのウイルスゲノムを宿主ゲノムに安定に組み込み、恒常的、制御的、または（複数のｓｈＲＮＡが発現している場合は）恒常的および制御的にｓｈＲＮＡを発現させることができる。したがって、一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、単一遺伝子または複数の密接に関連する遺伝子ファミリーメンバーの個々のバリアントを標的とするように設計することができる。個々のｓｈＲＮＡは、類似したまたは重複した機能または配列モチーフを有する標的の集合をモジュレートすることができる。当業者は、レンチウイルス構築物がクローンＤＮＡまたはＯＲＦ発現構築物を組み込むこともできることを認識するであろう。
【0107】
本明細書に記載される複数の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む遺伝子標的試薬は、遺伝子機能をモジュレートするために使用することができる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、多様な化学修飾、目的の標的転写物との複数のレベルの相補性、ならびに安定性、細胞送達、特異性および機能性を増強するための設計（米国特許第８，１８８，０６０号を参照されたい）を組み込むことができる。加えて、そのような試薬は、遺伝子の多様な領域（ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲを含む）または（場合によっては）目的の遺伝子をコードするゲノムＤＮＡのプロモーター／エンハンサー領域を標的とするように設計することができる。遺伝子モジュレーション（例えば、遺伝子発現の低下、すなわちノックダウン）は、（細胞に）単一ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、または同じｍＲＮＡ転写物の異なる領域を標的とする複数のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡのプールを導入することによって達成することができる。合成ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ送達は、１）自己送達、２）脂質媒介送達、３）エレクトロポレーションまたは４）ベクター／プラスミドに基づく発現系を含むがこれだけに限らない多くの方法によって達成することができる。導入されるＲＮＡ分子は、外来ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと称される場合がある。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、単一遺伝子または複数の密接に関連する遺伝子ファミリーメンバーの個々のバリアントを標的とするように設計することができる。
【0108】
ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現を低下させるために使用することができる。一部の実施形態では、配列番号１～１１から選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントを含むｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を低下させるために使用される。
＊遺伝子の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡ配列（センスおよびアンチセンス）。
配列中の小文字ヌクレオチドは３’オーバーハングを表す。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
配列中の小文字ヌクレオチドは３’オーバーハングを表す。
【0109】
一部の実施形態では、ＡＴＰ５ＥＰ２の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。
【0110】
一部の実施形態では、ＬＩＮＣ００３１９の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【0111】
一部の実施形態では、ＣＹＰ３Ａ７の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号３のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む。
【0112】
一部の実施形態では、ＮＯＧの発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。
【0113】
一部の実施形態では、ＳＰＡＮＸＮ３の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【0114】
一部の実施形態では、ＭＹＲＩＰの発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。
【0115】
一部の実施形態では、ＫＣＮＮ２の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。
【0116】
一部の実施形態では、ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。
【0117】
一部の実施形態では、ＲＧＭＡの発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号９のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む。
【0118】
一部の実施形態では、ＰＧＡ５の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号１０のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１のヌクレオチド配列を含む。
【0119】
一部の実施形態では、ＡＢＣＡ１０の発現を低下させるために使用されるｓｉＲＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド配列またはそのバリアントを含む。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖に配列番号１１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
【0120】
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートするために使用することができる。典型的には、ＡＳＯは、１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させるために使用される。モジュレートされる１つまたは複数の遺伝子の配列に関する知識に基づいて公知の技法を使用することで、ＡＳＯ分子は、配列相同性に基づく対応するＲＮＡの標的化によって１つまたは複数の遺伝子と拮抗するように設計することができる。ＡＳＯ配列は、１つまたは複数の遺伝子から産生されるｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡの標的部分と相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。この部分は、ｍＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ内の標的部分と１００％相補的であることができるが、より低いレベルの相補性（例えば、９０％もしくはそれよりも高い、または９５％もしくはそれよりも高い）もまた使用することができる。
【0121】
一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列の少なくとも１つのヌクレオシド連結が、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アミノアルキルホスホトリエステル連結、アルキレンホスホネート連結、ホスフィネート連結、ホスホロアミデート連結、およびアミノアルキルホスホロアミデート連結、チオホスホロアミデート連結、チオノアルキルホスホネート（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）連結、チオノアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）連結、チオリン酸連結、セレノリン酸連結またはボラノリン酸連結であるアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドでありうる。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオシド間連結はホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間連結はホスホロチオエート連結である。
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集
【0122】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における遺伝子発現のモジュレーションはＣＲＩＳＰＲゲノム編集を使用して実行される。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集は典型的には、２つの別個の成分：（１）ガイドＲＮＡおよび（２）エンドヌクレアーゼ、具体的にはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ガイドＲＮＡは、単一キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写物となる内在性細菌ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せである。理論に拘束されるものではないが、ｇＲＮＡおよびＣａｓが細胞において発現する場合、ゲノム標的配列は改変されうるまたは永続的に破壊されうると考えられている。
【0123】
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、ｇＲＮＡ配列と、低下に関する遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の標的ＤＮＡ配列の相補配列との間の塩基対形成によって標的配列に動員される。Ｃａｓの首尾よい結合のためには、ゲノム標的配列は、標的配列の直後に正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有していなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体の結合は、野生型Ｃａｓが二本鎖切断を引き起こすＤＮＡの両方の鎖を切断することができるように、Ｃａｓを本開示の１つまたは複数の遺伝子のゲノム標的配列に局在化させる。二本鎖切断は、２つの一般的修復経路：（１）非相同末端結合ＤＮＡ修復経路または（２）相同組換え修復経路のうちの一方によって修復することができる。非相同修復経路は、フレームシフトおよび／または未成熟停止コドンを生じうる挿入／欠失を二本鎖切断の位置にもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを効果的に破壊することができる。相同組換え修復経路は、二本鎖切断を直すために使用される修復鋳型の存在を必要とする。
【0124】
任意の適切なｇＲＮＡ対がＣＲＩＳＰＲゲノム編集のために使用されうる。典型的には、ｇＲＮＡ対は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現を低下させるために使用される。本明細書に記載される一部の実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現をモジュレートする（例えば、低下させるまたは除去／ノックアウトする）ために使用される。
【0125】
ｇＲＮＡ対は、モジュレートされる１つまたは複数の遺伝子の配列に関する知識に基づいて公知の技法を使用して、典型的には任意の公的に利用可能な適切なコンピュータプログラムを使用して設計することができる。ノックアウトパッケージングおよび／または産生細胞は、標準的な技法が当技術分野において公知であり、好適なキットが市販されている任意の適切な技法を使用して生成されうる。
【0126】
ｇＲＮＡ対は、任意の適切な手段によって本開示の産生細胞株に送達することができる。好適な技法は、当技術分野において公知であり、ｇＲＮＡ対を産生細胞株に送達するプラスミド、ウイルスおよび細菌ベクターの使用を含む。典型的には、ｇＲＮＡ対はプラスミドＤＮＡを使用して送達される。
【0127】
ｇＲＮＡ対は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現を低下させるために使用されうる。複数のｇＲＮＡ対は、遺伝子の発現をモジュレートするために使用されうる。本明細書に記載される一部の実施形態では、ｇＲＮＡ対は、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つの発現を低下させるために使用される。複数のｇＲＮＡ対は、ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現をモジュレートするために使用されうる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的部位との結合を増加させ、ヌクレアーゼ分解を阻害することによって編集効率を増強するように改変されうる。ある特定の実施形態では、これらの改変は、ｇＲＮＡの５’および３’末端の両方の末端の３ヌクレオチドにおける２’Ｏ－メチルアナログおよび３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結でありうる。１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートするために使用されるｇＲＮＡ対によって標的とされる例示的な標的ＤＮＡ配列は、表２に列挙される配列番号１６～３１から選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントのいずれか１つを含みうる。
【表2-1】
【表2-2】
【0128】
例えば、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用されるｇＲＮＡ対は、配列番号１２～１５のヌクレオチド配列（表２に示される）から選択される配列を含みうる。一部の実施形態では、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用されるｇＲＮＡ対は、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用されるｇＲＮＡ対は、配列番号１４の配列を含むまたは有する第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含むまたは有する第２のｇＲＮＡ分子を含む。
【0129】
一部の実施形態では、ＫＣＮＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログであり、配列番号１２、１３、１４または１５の配列を含む。
【0130】
バリアントｇＲＮＡ配列は、任意の適切な長さの配列にわたって測定して、本開示の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有しうる。典型的には、配列同一性パーセントは、ある長さの連続する核酸にわたって決定される。本開示のバリアントｇＲＮＡ配列は、例えば、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個またはそれよりも多い核酸残基にわたって測定して、本開示の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントｇＲＮＡ分子は、バリアントｇＲＮＡ分子の長さ全体にわたって本開示のｇＲＮＡ分子に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示のバリアントｇＲＮＡ分子は、標的領域が配列番号１６～３０のうちの１つの標的配列と相補的である１つまたは複数のｇＲＮＡ分子のバリアントでありうる。本開示のｇＲＮＡ対は、遺伝子、例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される遺伝子を標的とする対になった２つのｇＲＮＡ配列のうちの一方または両方のバリアントを含みうる。例えば、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含むｇＲＮＡ対のバリアントは、１）配列番号１２の配列のバリアントを含む第１のｇＲＮＡ分子、２）配列番号１３の配列のバリアントを含む第２のｇＲＮＡ分子または３）両方を含みうる。
タンパク質レベルのモジュレーション
タンパク質レベルのモジュレーション
【0131】
別の実施形態では、遺伝子の発現および／または活性のモジュレーションは、タンパク質（例えば、ポリペプチド）レベルで行われる。例として、タンパク質レベルでの遺伝子機能の低下は、小分子、ペプチド、アプタマー、不安定化ドメインを用いてタンパク質を標的とすること、または例えば遺伝子産物の活性を下方制御するもしくは遺伝子産物の分解の速度を増強することができる他の方法を含むがこれだけに限らない方法によって達成することができる。代替的に、発現されるタンパク質は、部位特異的変異誘発および／またはミスセンスもしくはナンセンス変異の組み込みを介して生物活性を低下させるまたは除去するように改変されうる。一部の実施形態では、例えば活性部位と結合し、標的タンパク質の機能を阻害する小分子は、例えば細胞培養培地に添加され、それによってパッケージングおよび／または産生細胞に導入することができる。代替的に、標的タンパク質機能は、例えば、例えばタンパク質間相互作用を妨げるペプチドを細胞（例えば、パッケージングおよび／または産生細胞）に導入することによってモジュレートすることができる（Ｓｈａｎｇａｒｙ ｅｔ． ａｌ．， （２００９） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ４９：２２３を参照されたい）。そのようなペプチドは、例えばトランスフェクションもしくはエレクトロポレーションによって、または発現構築物を介して細胞（例えば、パッケージングおよび／または産生細胞）に導入することができる。代替的に、ペプチドは、細胞送達を容易にする１つもしくは複数の部分を添加すること（例えば、コンジュゲーションを介して）、または自己送達を増強する分子を過給することによって細胞（例えば、パッケージングおよび／または産生細胞）に導入することができる。ペプチドを発現させるための技法としては、これだけに限らないが、それぞれペプチドを目的の位置または区画に安定化させるまたは指向させるための、ペプチドの足場への融合またはシグナル配列の付加が挙げられる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は、上述の方法のいずれかを使用して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を低下させるように操作された細胞を含む。
１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現に対するモジュレーションの効果
１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質の発現に対するモジュレーションの効果
【0132】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、高力価のｒＡＡＶを産生するｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を生成するために利用することができる。ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）の発現の有意な低下および／または１つまたは複数の遺伝子によって発現されるタンパク質の活性の有意な低下（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％またはそれよりも大きい低下）をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子の発現は、約４０％～約１００％（例えば、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約１００％、約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％）低下する。
【0133】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、標的遺伝子（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１）によって発現されるタンパク質またはＲＮＡの活性の有意な低下をもたらすことができる。例えば、本明細書に記載される方法は、標的遺伝子によって発現されるタンパク質またはＲＮＡの活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％またはそれよりも大きい低下をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子タンパク質またはＲＮＡ活性は、約４０％～約１００％（例えば、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約１００％、約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％）低下する。さらに、１つまたは複数の遺伝子のモジュレーションは、複数の遺伝子のモジュレーション（例えば、ｍｉＲＮＡによる）をもたらすことができる。
【0134】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、遺伝子産物（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の遺伝子産物）の発現の有意な低下（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％またはそれよりも大きい低下）をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、遺伝子産物の発現は、約４０％～約１００％（例えば、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約１００％、約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％）低下する。
【0135】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの発現（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の少なくとも１つからの）の有意な低下（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％またはそれよりも大きい低下）をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの発現は、約４０％～約１００％（例えば、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約１００％、約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％）低下する。
【0136】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるモジュレーションの方法は、発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の少なくとも１つからの）の活性の有意な低下（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％またはそれよりも大きい低下）をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの活性は、約４０％～約１００％（例えば、約４０％～約９５％、約４０％～約９０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約１００％、約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、または約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％）低下する。
【0137】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子、タンパク質またはＲＮＡの発現および／または活性の低下は、約５日間（例えば、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日またはそれよりも長く）維持される。
【0138】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子、タンパク質またはＲＮＡの発現および／または活性の低下は、例えば遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失の使用を通じて無期限にまたは永続的に維持されることが意図される。
【0139】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子、タンパク質またはＲＮＡの発現および／または活性の低下は、培養中のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株の少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回またはそれよりも多い継代の間維持される。
ｒＡＡＶ産生に対するモジュレーションの効果
ｒＡＡＶ産生に対するモジュレーションの効果
【0140】
ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質のモジュレーションは、ｒＡＡＶの力価の増加をもたらしうる。一部の実施形態では、モジュレーションは、約１．５～約７倍（例えば、約１．５～約６．５、約１．５～約６、約１．５～約５．５、約１．５～約５、約１．５～約４．５、約１．５～約４、約１．５～約３．５、約１．５～約３．０、約１．５～約２．５、約１．５～約２．０、約２～約７、約２．５～約７、約３～約７、約３．５～約７、約４～約７、約４．５～約７、約５～約７、約５．５～約７、約６～約７、約６．５～約７、または約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５もしくは約７．０）増加するｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価の増加をもたらす。一部の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも多く増加する。１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質のモジュレーションの結果として生じるｒＡＡＶ力価のいかなる増加も、対照親細胞株から産生されるｒＡＡＶ力価と比較することができる。
【0141】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株における１つまたは複数の遺伝子および／またはタンパク質のモジュレーションは、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日またはそれよりも長い間ｒＡＡＶ力価産生を増加しうる。
ｒＡＡＶを産生する方法
ｒＡＡＶを産生する方法
【0142】
ある特定の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子、タンパク質または非コードＲＮＡの発現をモジュレートするように操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株からｒＡＡＶを産生する方法を記載する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶベクターを操作されたｒＡＡＶパッケージング細胞株に送達することによって生成されたｒＡＡＶ産生細胞株の細胞を感染させることによって産生される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、１つまたは複数の遺伝子、タンパク質または非コードＲＮＡの発現がモジュレートされているｒＡＡＶ産生細胞株の細胞を感染させることによって産生される。ある特定の実施形態では、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株からのｒＡＡＶの産生は対照親細胞株と比較して増強される。
【0143】
ある特定の実施形態では、操作されたパッケージング細胞株の細胞を、ｒＡＡＶの複製を可能にするヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）または単純ヘルペスウイルス）に感染させる。一部の実施形態では、操作された産生細胞株の細胞を、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）または単純ヘルペスウイルス）に感染させる。
ｒＡＡＶを収集する方法
ｒＡＡＶを収集する方法
【0144】
ｒＡＡＶ粒子は、細胞を溶解することにより、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞から得られうる。操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞の溶解は、感染性ウイルス粒子を放出するために細胞を化学的にまたは酵素的に処理する方法により達成されうる。これらの方法は、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼ、トリプシンなどのプロテアーゼ、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を含む。ホモジナイゼーションもしくは粉砕などの物理的破壊、またはマイクロフルイダイザー圧力セルによる加圧、または凍結融解サイクルも使用されうる。ある特定の実施形態では、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞由来の溶解液は、ｒＡＡＶ粒子を収集するために使用することができる。
【0145】
ある特定の実施形態では、細胞培養上清は、細胞溶解を必要とせずに、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞から採取されうる。本開示のある特定の実施形態では、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞は、細胞溶解を必要とせずに細胞培養上清から採取することができるｒＡＡＶ粒子を分泌する。ある特定の実施形態では、操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株は、対照親細胞株のｒＡＡＶ力価よりも高いｒＡＡＶ力価を有し、その結果、対照親細胞株と比較してより多くのｒＡＡＶが操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株から収集される。
【0146】
ｒＡＡＶ粒子を回収した後に、例えば、細胞溶解の結果として生じた細胞残屑を除去するために、ｒＡＡＶ粒子を含有する試料を精製することが必要であり得る。ＡＡＶ粒子の最小限の精製の方法は、当分野で公知である。２つの例示的な精製方法は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）およびイオジキサノールに基づく密度勾配精製である。両方法は、Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６巻（４号）：１４７～１５７頁（２０１５年）に記載されている。最小限の精製は、例えば、ＡＶＢセファロース親和性樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することもできる。ＡＶＢセファロース親和性樹脂を使用するＡＡＶ精製の方法は、例えば、Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、２巻：１５０４０頁（２０１５年）に記載されている。精製後、ｒＡＡＶ粒子はフィルタリングされ、－６０℃以下で保存されうる。
【0147】
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞が２つの異なるアデノウイルスに共感染した後に、操作されたｒＡＡＶパッケージング細胞株から産生されるｒＡＡＶ粒子を収集する方法を提供する。
【0148】
ある特定の実施形態では、本開示は、操作されたｒＡＡＶパッケージング細胞株から生成されたｒＡＡＶ産生細胞株の感染後に産生されるｒＡＡＶ粒子を収集する方法を提供する。
【0149】
ある特定の実施形態では、本開示は、操作されたｒＡＡＶ産生細胞株へのヘルパーウイルスの感染後に産生されるｒＡＡＶ粒子を収集する方法を提供する。
ｒＡＡＶ粒子の定量
ｒＡＡＶ粒子の定量
【0150】
ｒＡＡＶ粒子の定量は、ＡＡＶ感染がｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞変性効果をもたらさず、したがって、感染力価を決定するためにプラークアッセイが使用できないという事実により、複雑である。しかしながら、ｒＡＡＶ粒子は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０巻、１０３１～１０３９頁（１９９９年））、ドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻、３８２２～３８２８頁（１９８９年））を含むいくつかの方法を使用して、および高度に精製されたベクター調製物の光学密度により（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、７巻、１２２～１２８頁（２００３年））定量可能である。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）は、サーモサイクラー（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ９６ウエルブロックフォーマットサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））におけるリアルタイム定量的遺伝子発現低減ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）により、定量可能である。ｒＡＡＶ粒子を含有する試料が、ＤＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートされ、続いて、５０℃で６０分間のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）消化（１０Ｕ／ｍｌ）、次いで、９５℃で３０分間、変性させられ得る。使用されるプライマープローブセットは、ｒＡＡＶベクターゲノムの非天然部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的であるべきである。ＰＣＲ産物は、プライマー、プローブおよび増幅された配列の長さおよび組成に基づく、任意の適切なサイクリングパラメータのセットを使用して増幅されうる。代替プロトコールは、例えば、Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５巻（２号）：１１５～１２５頁（２０１４年）に開示されている。
【0151】
ウイルスゲノム増幅もまた、上に記載したものと類似したｑＰＣＲ技法を使用して測定することができる。しかしながら、産生細胞内の全ゲノム増幅を定量するためには、細胞内試料のみが採取され、この試料は、パッケージングウイルスゲノムおよび非パッケージングウイルスゲノムの両方を測定するためにＤＮａｓｅＩでは処理されない。ウイルスゲノム増幅は、宿主細胞ハウスキーピング遺伝子、例えばＲＮａｓｅ Ｐを同時に測定することによって宿主細胞あたりで算出されうる。
【0152】
ｒＡＡＶ粒子の感染力は、例えば、Ｚｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１５巻：７０９～７１５頁（２００４年）に記載のＴＣＩＤ５０（５０％の組織培養感染量）アッセイを使用して決定されうる。このアッセイでは、ｒＡＡＶベクター粒子が連続的に希釈され、９６ウエルプレート中でＡＶ粒子とともにＲｅｐ／Ｃａｐ発現細胞株に共感染するために使用される。感染後４８時間で、感染させたウエルおよび対照ウエルからの全細胞内ＤＮＡが抽出される。次いで、導入遺伝子特異的プローブおよびプライマーとともにｑＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶベクターの複製が測定される。１ミリリットルあたりのＴＣＩＤ５０感染力（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、１０倍の連続希釈でのＡＡＶ陽性のウエルの比を使用して、Ｋａｅｒｂｅｒ方程式により計算される。
治療応用
治療応用
【0153】
本明細書に記載される操作されたｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株から産生されるｒＡＡＶは、例えば哺乳動物における遺伝子治療のために使用することができる。本明細書に記載される操作された細胞から産生されるｒＡＡＶは、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療応用のために使用することができる。本明細書に記載される操作された細胞から産生されるｒＡＡＶは、例えば、小分子（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）、ペプチドおよび／またはタンパク質を送達するために使用することができる。
【0154】
一部の実施形態では、本明細書に記載される操作された細胞株から生成されるｒＡＡＶは、必要としているヒト対象における疾患または障害を処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される操作された細胞株から生成されるｒＡＡＶは、薬学的に許容される担体と共に投与することができる。
【0155】
任意の好適な方法または経路が、本明細書に記載される操作されたパッケージングおよび／または産生細胞株から産生されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用されうる。投与経路としては、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路が挙げられる。一部の実施形態では、操作されたパッケージングおよび／または産生細胞株から産生されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物は静脈内投与される。
【0156】
本開示の実施は、例示的目的のためだけに本明細書において提示され、いかなる方法においても本開示を限定すると解釈されるべきでない、前述の例からさらに十分に理解される。
【実施例0157】
（実施例１）
ノックダウンプロトコールの開発
ｓｉＲＮＡノックダウン実験を、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１をノックダウンすることによって６ウエルおよび２４ウエルフォーマットに関して最適化および開発した。２４ウエルにおいて実施した実験を、播種密度、細胞培養条件（例えば、二酸化炭素（ＣＯ２）パーセント、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のパーセント）、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ）とｓｉＲＮＡの比（「比」）、インキュベーション時間およびｓｉＲＮＡ濃度などの多数の因子に基づいて評価した。ＨＰＲＴ１遺伝子ノックダウンのために設計された市販のｓｉＲＮＡを使用して実験条件を最適化した。ＨｅＬａ産生細胞に様々な濃度のｓｉＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘを製造業者の使用説明書に従って使用してトランスフェクトした。ＨＰＲＴ１発現の低下パーセントをリアルタイムＰＣＲによって決定した。最適化された２４ウエルｓｉＲＮＡノックダウン方法は、高度に発現される遺伝子であるＨＰＲＴ１を、ベースライン対照と比較して８０％超ノックダウンすることができた。図２Ａ～Ｄに示すように、ウエルあたり細胞１×１０５個で播種した細胞、１：５のトランスフェクション試薬とｓｉＲＮＡの比、８ｎＭのｓｉＲＮＡが最も高いノックダウン効率を示した。図２Ａは、ＨＰＲＴ１のノックダウンパーセントに対する、使用された様々なｓｉＲＮＡ濃度／比の効果を示す。図２Ｂは、ＨＰＲＴ１の発現パーセントに対する様々なｓｉＲＮＡ濃度／比の効果を示す。６ウエルプロトコール最適化のために、２つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を試験した。図２Ａおよび２Ｂにプロットされたデータに関しては、５×１０４、８×１０４および１×１０５の播種密度が試験された。図２Ｃは、ＨＰＲＴ１のノックダウンパーセントに対する様々なｓｉＲＮＡ濃度の効果を示す。図２Ｄは、ＨＰＲＴ１の発現パーセントに対する様々な濃度のｓｉＲＮＡの効果を示す。すべての実験は３回反復で実施した。
（実施例２）
ＲＮＡ配列決定
ノックダウンプロトコールの開発
ｓｉＲＮＡノックダウン実験を、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１をノックダウンすることによって６ウエルおよび２４ウエルフォーマットに関して最適化および開発した。２４ウエルにおいて実施した実験を、播種密度、細胞培養条件（例えば、二酸化炭素（ＣＯ２）パーセント、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のパーセント）、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ）とｓｉＲＮＡの比（「比」）、インキュベーション時間およびｓｉＲＮＡ濃度などの多数の因子に基づいて評価した。ＨＰＲＴ１遺伝子ノックダウンのために設計された市販のｓｉＲＮＡを使用して実験条件を最適化した。ＨｅＬａ産生細胞に様々な濃度のｓｉＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘを製造業者の使用説明書に従って使用してトランスフェクトした。ＨＰＲＴ１発現の低下パーセントをリアルタイムＰＣＲによって決定した。最適化された２４ウエルｓｉＲＮＡノックダウン方法は、高度に発現される遺伝子であるＨＰＲＴ１を、ベースライン対照と比較して８０％超ノックダウンすることができた。図２Ａ～Ｄに示すように、ウエルあたり細胞１×１０５個で播種した細胞、１：５のトランスフェクション試薬とｓｉＲＮＡの比、８ｎＭのｓｉＲＮＡが最も高いノックダウン効率を示した。図２Ａは、ＨＰＲＴ１のノックダウンパーセントに対する、使用された様々なｓｉＲＮＡ濃度／比の効果を示す。図２Ｂは、ＨＰＲＴ１の発現パーセントに対する様々なｓｉＲＮＡ濃度／比の効果を示す。６ウエルプロトコール最適化のために、２つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を試験した。図２Ａおよび２Ｂにプロットされたデータに関しては、５×１０４、８×１０４および１×１０５の播種密度が試験された。図２Ｃは、ＨＰＲＴ１のノックダウンパーセントに対する様々なｓｉＲＮＡ濃度の効果を示す。図２Ｄは、ＨＰＲＴ１の発現パーセントに対する様々な濃度のｓｉＲＮＡの効果を示す。すべての実験は３回反復で実施した。
（実施例２）
ＲＮＡ配列決定
【0158】
８つの３リットルバイオリアクターを、２つの異なるＨｅＬａＳ３産生細胞株に対して補充および無補充産生条件において運転した。２つの追加的なバイオリアクターを、非感染対照としてアデノウイルス５（Ａｄ５）を用いずに運転した。表３に、バイオリアクター条件および産生レベルの詳細を記載する。
表３で使用される略記： １種または複数種の補充物質の添加は（＋）によって示し、１種または複数種の補充物質の非存在は（－）によって示す； ＭＯＩ－感染多重度。
【表3】
【0159】
Ａｄ５の感染の３０時間後、試料をＲＮＡ－Ｓｅｑのために取り出した。試料を、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、細胞ペレットを発送直前まで－８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出および抽出したＲＮＡのｃＤＮＡ合成を当技術分野において周知の方法によって実施した。配列決定前に、ライブラリー調製を、市販のＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製キットを使用して行った。ＲＮＡ配列決定を、市販のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームを使用して行った。生成したリードを、当技術分野において周知のマッピング方法を使用してヒトゲノム、Ａｄ５ゲノムおよびＡＡＶ２ゲノムにマッピングした。Ａｄ５ゲノムにマッピングされたあらゆるリードを廃棄した。配列決定をもう１ラウンド実施して、ヒトゲノムにマッピングされたリードを濃縮した。差分解析を、ＲＮＡ配列決定によって生成されたデータを使用して実施した（表４を参照されたい）。
＊ ＰＣＬ１－産生細胞株１； ＰＣＬ２－産生細胞株２；無産生－非感染対照細胞；産生（Ｎ．Ｓ．）－無補充条件下で培養したＡｄ５感染細胞；産生（Ｓ）－補充条件下で培養したＡｄ５感染細胞。
【表4】
【0160】
本実施例では、発現差分解析を、対照条件と比較した実験条件のｍＲＮＡレベルの対数倍率変化（ＬｏｇＦＣ）として算出した。上方制御した遺伝子を正のＬｏｇＦＣとして表し、下方制御した遺伝子を負のＬｏｇＦＣとして表した。０．０５以下のｐ値を有する差次的に発現遺伝子を統計的に有意と見なした。各差分解析において数百～数千の遺伝子が有意に上方または下方制御された。フィルタリング基準を確立し（例えば、図６を参照されたい）、データセットを評価のために扱いやすい遺伝子数まで縮小するために適用した。遺伝子セットを実施例６に記載されるようにアラインメントし、フィルター基準にかけた。
（実施例３）
ＲＮＡ配列決定から得た結果のＲＴ－ｑＰＣＲによる検証
（実施例３）
ＲＮＡ配列決定から得た結果のＲＴ－ｑＰＣＲによる検証
【0161】
小さな遺伝子セットをＲＮＡ配列決定データの検証のために選択した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ結果を、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを当技術分野において周知の方法に従って使用して確認した。ΔΔＣｔ法を使用してデータを解析した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータにおいて観察された傾向を独立して確認した。図３Ａ～Ｂは、ＰＧＡ５（図３Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｂ）に関するＲＮＡ－Ｓｅｑデータのバイオインフォマティクス解析から得た遺伝子発現の対数倍率変化値を示す。ｘ軸は産生細胞株を増殖させた条件（補充（表４に記載の差分解析番号５）対無補充（表４に記載の差分解析番号１））を示し、ｙ軸は遺伝子発現の対数倍率変化（ＬｏｇＦＣ）を示す。非補充細胞培養培地において培養した細胞におけるＰＧＡ５（図３Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｂ）発現の対数倍率変化を、非感染細胞（ヘルパーウイルスに感染していない細胞）における対応する遺伝子発現に対してプロットする。補充細胞培養培地において培養した細胞におけるＰＧＡ５（図３Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｂ）発現の対数倍率変化を、非補充細胞培養培地において培養した細胞における対応する遺伝子発現に対してプロットする。
【0162】
補充および無補充条件下で増殖させた産生細胞株におけるＰＧＡ５およびＳＰＡＮＸＮ３遺伝子発現を、当技術分野において周知の方法を使用することによりＲＴ－ｑＰＣＲによっても評価した。図３Ｃ～Ｄは、非補充および補充細胞培養培地において培養した細胞におけるＰＧＡ５（図３Ｃ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図３Ｄ）の発現の非感染細胞（ヘルパーウイルスに感染していない細胞）に対するＲＴ－ｑＰＣＲ倍率変化値を示す。図３Ａ～Ｄは、ｑＰＣＲおよびＲＮＡ配列決定から得たデータが同じ傾向に従うことを示す。
（実施例４）
産生細胞株の異なるクローンにおける、ＲＮＡ配列決定から得た結果のＲＴ－ｑＰＣＲによる検証
（実施例４）
産生細胞株の異なるクローンにおける、ＲＮＡ配列決定から得た結果のＲＴ－ｑＰＣＲによる検証
【0163】
ＲＮＡ配列決定結果を、ＨｅＬａ Ｓ３産生細胞株の異なるクローンから抽出したＲＮＡに関してＲＴ－ｑＰＣＲ実験を行うことによってさらに検証した。図４Ａ～Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲから決定した、非補充細胞培養培地および補充細胞培養培地において培養した産生細胞株クローンにおけるＰＧＡ５（図４Ａ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図４Ｂ）発現の非感染細胞（ヘルパーウイルスに感染していない細胞）に対する倍率変化値を示す。２１Ｃ５、３Ｃ６および２Ｂ６は、ＨｅＬａ産生細胞株の異なるクローンを表す。図４Ｃ～Ｄは、補充細胞培養培地において培養した産生細胞株クローン２１Ｃ５、３Ｃ６および２Ｂ６におけるＰＧＡ５（図４Ｃ）およびＳＰＡＮＸＮ３（図４Ｄ）発現の無補充細胞培養培地において培養したクローンと比較した相対増加倍率を示す。これらの結果は、実施例３に記載のバイオインフォマティクスＲＮＡ配列決定およびＲＴ－ｑＰＣＲデータをさらに実証する。
（実施例５）
ｒＡＡＶ力価に対する遺伝子ノックダウンの効果
（実施例５）
ｒＡＡＶ力価に対する遺伝子ノックダウンの効果
【0164】
ノックダウン実験を、ＨｅＬａ産生細胞株における遺伝子を実施例１において論じた最適化されたプロトコールに基づいて個別にノックダウンすることによって実施した。ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を各遺伝子に関して設計した（表１を参照されたい）。
【0165】
条件を、１×１０５の播種密度ならびに８ｎＭ ｓｉＲＮＡおよび１：５のｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸ比に設定した。ＡＡＶ産生を遺伝子の発現の低下の２４時間後に誘導し、ｒＡＡＶを感染の７２時間後に収集した。力価を各試料に関して決定し、非標的ミスセンスｓｉＲＮＡ対照と比較した。この実験を独立して３回実施し、結果を平均し、統計解析を実施した。図５Ａ～５Ｃは、産生細胞株１～３それぞれにおける個々の遺伝子のｓｉＲＮＡの結果を絶対ｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍＬ、ＧＣ＝ゲノムコピー）により示す。図５Ｄ～５Ｆは、異なる産生細胞株１～３それぞれにおける個々の遺伝子のｓｉＲＮＡによるｒＡＡＶ力価に関する増加倍率を示す。
【0166】
図５Ａ～５Ｆに示すように、産生細胞株におけるＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡまたはＳＰＡＮＸＮ３の発現の低下は、ミスセンス対照よりも２～４倍高い統計的に有意なｒＡＡＶ力価をもたらした。３つの産生細胞株にわたって、これら４つの遺伝子は、ノックダウンした場合、力価に対する統計的に関連する良い影響を示す。これらの結果は、これらの遺伝子がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトなどのより永続的な改変のための優れた標的であることを示す。
（実施例６）
遺伝子フィルタリング方法論
（実施例６）
遺伝子フィルタリング方法論
【0167】
フィルター１に関して、差分解析１および７（表３に記載される）からの遺伝子をアラインメントした。１および７の差分解析は、無補充条件においてアデノウイルス５の添加時に上方または下方制御する遺伝子を定義した。解析１は、２１Ｃ５産生細胞株（産生細胞株１、ＰＣＬ１）由来の細胞を検査した。解析７は、２Ｂ６（産生細胞株２、ＰＣＬ２）由来の細胞を検査した。このフィルター１後の遺伝子のリストは細胞株特異的でない遺伝子を同定し、このアラインメントは２つの産生細胞株間で共通した合計９１４９の遺伝子を提供した。
【0168】
フィルター２に関して、フィルター１からの遺伝子を差分解析５に存在する遺伝子に対してアラインメントした。解析５は、補充条件における２１Ｃ５産生細胞株（ＰＣＬ１）由来の細胞において、無補充条件と比較して上方および下方制御した遺伝子を検査した。この差分解析の目的は、無補充条件下での産生に対する補充条件下での産生の効果を定義することであった。フィルター１からの遺伝子セットを差分解析５に対してアラインメントする目的は、産生性改善条件において、１）産生改善条件の副産物ではなく、２）２つの異なる細胞株に関連する可能性がある遺伝子を同定することであった。アラインメント後、３７４の遺伝子を先へ進めた。
【0169】
フィルター３に関して、絶対値２超のＬｏｇＦＣという大きなＬｏｇＦｃ閾値を有した遺伝子のみを先へ進めた。これは、先へ進めた遺伝子における高レベルの上方／下方制御を保証するため、および選択された遺伝子がＲＮＡ－Ｓｅｑのアーチファクトではなかったというある程度の信頼性を得るために行った。フィルター後、７７の遺伝子を先へ進めた。
【0170】
フィルター４に関して、差分解析１および差分解析５の両方において上方制御、または差分解析１および差分解析５の両方において下方制御を示した遺伝子のみを保持した。例えば、７７の遺伝子のうちの１つは、差分解析１から上方制御を示し、さらに差分解析５において上方制御を示さなければならない、または差分解析１において下方制御を示し、さらに差分解析５において下方制御を示さなければならない。このフィルターの目的は、評価される遺伝子に関して、高力価条件が低力価条件と比較してその特定の遺伝子の制御に対して拮抗効果を有していなかったことを保証することであった。フィルター後、１１の遺伝子が残り、評価された。例示的な遺伝子フィルタリング方法論を示す例示的なフローチャートを図６に示す（使用される略記：ＬｏｇＦＣ＝対数倍率変化）。
【0171】
表５は、産生性に関して重要な遺伝子をフィルタリングするプロセス中の各比較からのＬｏｇ２ＦＣデータを提供する。
（実施例７）
ＫＣＮＮ２の遺伝子ノックアウト
【表5】
ＫＣＮＮ２の遺伝子ノックアウト
【0172】
本実施例では、２つの既存の高度に最適化されたモノクローナルＨｅＬａ産生細胞株（ＰＣＬ）－２Ｈ５および７Ｂ１２－を遺伝子改変して、カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質ＳＫ２をコードするＫＣＮＮ２遺伝子（本明細書に記載のＲＮＡ－ｓｅｑスクリーニングにおいてこれまでに同定された）をノックアウトした。
【0173】
ＫＣＮＮ２を、ｅＧＦＰ選択マーカーを使用して２Ｈ５または７Ｂ１２ＨｅＬａ細胞においてノックアウトした。ＫＣＮＮ２がノックアウトされたと思われる細胞をｅＧＦＰ発現に関して濃縮し、９６ウエルプレートに播種した。細胞コロニーを形成させ、ゲノムＤＮＡを収集し、ＰＣＲを実施してノックアウトを含有する領域を増幅した。ＰＣＲ産物をサンガー配列決定し、配列決定ファイルを挿入／欠失の存在に関して解析した。ノックアウトに関して高い尤度を有する２Ｈ５および７Ｂ１２クローンをさらなる試験のためにスケールアップした。
【0174】
上位のクローンを無血清浮遊培養に移行した。親株と比較したクローン産生性を２４ディープウエルｒＡＡＶ産生により評価した。クローンを３ｍＬの培養中、細胞２×１０５個／ｍＬで播種し、Ａｄ５を用いて感染多重度（ＭＯＩ）５０で感染させた。感染の４日後、ｒＡＡＶを収集し、力価に関して評価した。力価の増加倍率を親対照に対して正規化した。最良のクローンは、対照試料と比較して力価の１．５～２．７の増加倍率を呈した。２Ｈ５力価は２．４６×１０９～４．９８×１０１０ＧＣ／ｍＬの範囲であった（図７Ａ）。力価を親対照に対して正規化した場合、増加倍率は１．２～２．７倍の範囲で見られた（図７Ｂ）。７Ｂ１２力価は４．３３×１０８～１．８８×１０１０ＧＣ／ｍＬの範囲であった（図７Ｃ）。力価を親対照に対して正規化した場合、増加倍率は１．５～２．６倍の範囲で見られた（図７Ｄ）。次いで、最小の１．５の増加倍率を有するクローンを振盪フラスコ培養にスケールし、高播種密度補充ｒＡＡＶ産生のためにａｍｂｒ（登録商標）１５に蒔いた。細胞を、細胞１．５×１０６個／ｍＬで播種し、Ａｄ５を用いてＭＯＩ、５０で感染させた。ｒＡＡＶを感染の４日後に収集し、力価に関して評価した。力価の増加倍率を親対照に対して正規化した。最良のクローンは、対照試料と比較して力価の１．５～２．３の増加倍率を呈した。２Ｈ５力価は１．５×１０１１～３．８２×１０１１ＧＣ／ｍＬの範囲であった（図８Ａ）。力価を親対照に対して正規化した場合、増加倍率は１．３～２．３倍の範囲で見られた（図８Ｂ）。７Ｂ１２力価は２．６２×１０１０～１．３５×１０１１ＧＣ／ｍＬの範囲であった（図８Ｃ）。力価を親対照に対して正規化した場合、増加倍率は１．２～１．５倍の範囲で見られた（図８Ｄ）。
【0175】
これらのデータは、ＡＡＶ産生細胞における本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させるまたは除去すること（例えば、遺伝子ノックアウトを介して）を、操作された細胞からのｒＡＡＶの産生を増加させるために用いることができることを立証する。
（実施例８）
マルチコンビナトリアルｓｉＲＮＡノックダウン
（実施例８）
マルチコンビナトリアルｓｉＲＮＡノックダウン
【0176】
本実施例では、本明細書に記載のＲＮＡ－ｓｅｑスクリーニングにおいてこれまでに同定された遺伝子の、ｓｉＲＮＡを使用した複数組合せノックダウンを実施して、複数の遺伝子を同時に標的とすることが力価に対して相加効果を生じるかどうかを決定した。
【0177】
複数組合せノックダウンを、実施例５に記載の方法の改変法を使用して実施した。簡潔に述べると、細胞を、８ｎＭの各ｓｉＲＮＡを使用して、１：５のｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸの比を維持してトランスフェクトした。ＡＡＶ産生を遺伝子の発現の低下の２４時間後に誘導し、ｒＡＡＶを感染の７２時間後に収集した。力価を各試料に関して決定し、非標的ミスセンスｓｉＲＮＡ対照と比較した。
【0178】
本実施例では、ＫＣＮＮ２を、これまでに記載した他のｓｉＲＮＡのパネルと組み合わせてノックダウンした。付加的に、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３を互いに組み合わせてノックダウンした。２Ｈ５では、組合せノックダウンはミスセンス対照と比較して４．６～１１．４倍の範囲の力価増加を呈した（図９Ａ）。７Ｂ１２では、組合せノックダウンはミスセンス対照と比較して３．４～９．７倍の範囲の力価増加を呈した（図９Ｂ）。いずれの組合せも力価の増加を呈したが、すべての組合せがＫＣＮＮ２単独をノックダウンすることを上回る改善となるわけではなかった。ＫＣＮＮ２ノックダウンは、２Ｈ５では５．３の増加倍率（図９Ａ）、７Ｂ１２では５．１の増加倍率（図９Ｂ）をもたらした。
【0179】
これらのデータは、ｒＡＡＶの産生の追加的な増加が、確立した高ｒＡＡＶ力価産生モノクローナルＰＣＬにおける複数のゲノム領域の直接標的化により獲得されうることを立証する。
番号付き実施形態
１． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
２． ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む、実施形態１に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
３． 前記発現が、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用により低下している、実施形態１または２に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
４． 前記発現が、配列番号１～１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡの使用により低下している、実施形態１から３のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
５． ＡＴＰ５ＥＰ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
６． ＬＩＮＣ００３１９の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
７． ＣＹＰ３Ａ７の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
８． ＮＯＧの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
９． ＳＰＡＮＸＮ３の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１０． ＭＹＲＩＰの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１１． ＫＣＮＮ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１２． ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１３． ＲＧＭＡの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１４． ＰＧＡ５の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１０の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１の配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１５． ＡＢＣＡ１０の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１１の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２の配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１６． 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質からなる群から選択される、実施形態３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。１７． 前記発現がＣＲＩＳＰＲゲノム編集の使用により低下している、実施形態１から１６のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１８． 前記発現がガイドＲＮＡ対の使用により低下しており、各ガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号１２～１５のヌクレオチド配列から選択される配列を含む、および／または
（ｂ）配列番号１６～３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される標的ＤＮＡ配列を標的とする、
実施形態１７に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１９． 前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、実施形態１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２０． 前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１４の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、実施形態１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２１． 各ｇＲＮＡ分子が、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログである、実施形態１９または２０に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２２． 前記遺伝子発現が対照親細胞と比較して除去されている、実施形態１から２１のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２３． ヒト細胞株である、実施形態１から２２のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２４． 前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、実施形態２３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２５． ｒＡＡＶパッケージング細胞株である、実施形態１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
２６． ｒＡＡＶ産生細胞株である、実施形態１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
２７． ｒＡＡＶの力価が、前記対照親細胞を含む細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価と比較して約１．５～約７倍増加している、実施形態２６に記載の細胞株。
２８． 実施形態１から２７のいずれか一項に記載の細胞株の溶解液。
２９． 実施形態１から２７のいずれか一項に記載の細胞株からの細胞培養上清。
３０． 産生細胞株を生成する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを実施形態２５に記載のパッケージング細胞株の細胞に送達すること含む、方法。３１． ｒＡＡＶを産生する方法であって、実施形態３０に記載の方法によって生成された産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
３２． ｒＡＡＶを産生する方法であって、実施形態２６に記載の産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
３３． 前記ｒＡＡＶが前記産生細胞株から収集される、実施形態３１または３２に記載の方法。
３４． ｒＡＡＶの前記産生が対照親細胞株と比較して増強される、実施形態３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
３５． ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
ｒＡＡＶ力価を増加させる１種または複数種の補充物質を細胞株へ添加すること；
補充および無補充細胞株におけるトランスクリプトームにわたって網羅的遺伝子発現を測定すること；
補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現される遺伝子のリストを得ること；ならびに
ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定すること
を含む、方法。
３６． 前記細胞株に添加される前記１種または複数種の補充物質が、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、コルチゾン、プレドニゾン、ブデソニドまたはトリアムシノロンを含む、実施形態３５に記載の方法。
３７． ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生してｒＡＡＶの産生の増加を促進する方法であって、実施形態３５に記載の方法を使用して同定された１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、方法。
３８． 前記細胞株がｒＡＡＶパッケージング細胞株である、実施形態３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
３９． 前記細胞株がｒＡＡＶ産生細胞株である、実施形態３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
４０． 前記ｒＡＡＶ産生細胞株が、ｒＡＡＶ力価を、対応する１つまたは複数の遺伝子の発現のモジュレーションを行わないｒＡＡＶ産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶ力価よりも少なくとも１．５倍大きく増加する、実施形態３９に記載の方法。
４１． 前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させることを含む、実施形態３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
４２． 前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を除去することを含む、実施形態３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
４３． 前記細胞株がヒト細胞株である、実施形態３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
４４． 前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、実施形態４３に記載の方法。
４５． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
４６． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性が無期限にまたは永続的に低下している、実施形態４５に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４７． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失を含むように操作されている、実施形態４６に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４８． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊を含むように操作されている、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４９． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に遺伝子破壊を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
５０． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
５１． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。５２． 対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示す組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
参照による組み込み
番号付き実施形態
１． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
２． ＫＣＮＮ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＲＧＭＡおよびＳＰＡＮＸＮ３の発現が対照親細胞と比較して低下している細胞を含む、実施形態１に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
３． 前記発現が、ヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用により低下している、実施形態１または２に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
４． 前記発現が、配列番号１～１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡの使用により低下している、実施形態１から３のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
５． ＡＴＰ５ＥＰ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
６． ＬＩＮＣ００３１９の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号２のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
７． ＣＹＰ３Ａ７の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号３のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３４のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
８． ＮＯＧの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号４のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３５のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
９． ＳＰＡＮＸＮ３の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号５のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１０． ＭＹＲＩＰの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号６のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１１． ＫＣＮＮ２の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号７のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３８のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１２． ＮＡＬＣＮ－ＡＳ１の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号８のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号３９のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１３． ＲＧＭＡの発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号９のヌクレオチド配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４０のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１４． ＰＧＡ５の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１０の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４１の配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１５． ＡＢＣＡ１０の発現が低下しており、前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に配列番号１１の配列、およびアンチセンス鎖に配列番号４２の配列を含む、実施形態４に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１６． 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化され規則的に間隔の空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質からなる群から選択される、実施形態３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。１７． 前記発現がＣＲＩＳＰＲゲノム編集の使用により低下している、実施形態１から１６のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１８． 前記発現がガイドＲＮＡ対の使用により低下しており、各ガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号１２～１５のヌクレオチド配列から選択される配列を含む、および／または
（ｂ）配列番号１６～３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される標的ＤＮＡ配列を標的とする、
実施形態１７に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
１９． 前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１２の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１３の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、実施形態１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２０． 前記ｇＲＮＡ対が、ＫＣＮＮ２を標的とするために使用され、配列番号１４の配列を含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５の配列を含む第２のｇＲＮＡ分子を含む、実施形態１８に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２１． 各ｇＲＮＡ分子が、その５’および３’末端のいずれかまたは両方の末端の３ヌクレオチドにおける３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む２’Ｏ－メチルアナログである、実施形態１９または２０に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２２． 前記遺伝子発現が対照親細胞と比較して除去されている、実施形態１から２１のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２３． ヒト細胞株である、実施形態１から２２のいずれか一項に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２４． 前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、実施形態２３に記載のパッケージングおよび／または産生細胞株。
２５． ｒＡＡＶパッケージング細胞株である、実施形態１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
２６． ｒＡＡＶ産生細胞株である、実施形態１から２４のいずれか一項に記載の細胞株。
２７． ｒＡＡＶの力価が、前記対照親細胞を含む細胞株から産生されるｒＡＡＶの力価と比較して約１．５～約７倍増加している、実施形態２６に記載の細胞株。
２８． 実施形態１から２７のいずれか一項に記載の細胞株の溶解液。
２９． 実施形態１から２７のいずれか一項に記載の細胞株からの細胞培養上清。
３０． 産生細胞株を生成する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを実施形態２５に記載のパッケージング細胞株の細胞に送達すること含む、方法。３１． ｒＡＡＶを産生する方法であって、実施形態３０に記載の方法によって生成された産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
３２． ｒＡＡＶを産生する方法であって、実施形態２６に記載の産生細胞株の細胞にヘルパーウイルスを感染させることを含む、方法。
３３． 前記ｒＡＡＶが前記産生細胞株から収集される、実施形態３１または３２に記載の方法。
３４． ｒＡＡＶの前記産生が対照親細胞株と比較して増強される、実施形態３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
３５． ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、
ｒＡＡＶ力価を増加させる１種または複数種の補充物質を細胞株へ添加すること；
補充および無補充細胞株におけるトランスクリプトームにわたって網羅的遺伝子発現を測定すること；
補充細胞株と無補充細胞株の間で差次的に発現される遺伝子のリストを得ること；ならびに
ｒＡＡＶの産生に関連する１つまたは複数の遺伝子を同定すること
を含む、方法。
３６． 前記細胞株に添加される前記１種または複数種の補充物質が、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、コルチゾン、プレドニゾン、ブデソニドまたはトリアムシノロンを含む、実施形態３５に記載の方法。
３７． ｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株を産生してｒＡＡＶの産生の増加を促進する方法であって、実施形態３５に記載の方法を使用して同定された１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、方法。
３８． 前記細胞株がｒＡＡＶパッケージング細胞株である、実施形態３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
３９． 前記細胞株がｒＡＡＶ産生細胞株である、実施形態３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
４０． 前記ｒＡＡＶ産生細胞株が、ｒＡＡＶ力価を、対応する１つまたは複数の遺伝子の発現のモジュレーションを行わないｒＡＡＶ産生細胞株によって産生されるｒＡＡＶ力価よりも少なくとも１．５倍大きく増加する、実施形態３９に記載の方法。
４１． 前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を低下させることを含む、実施形態３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
４２． 前記発現をモジュレートすることが１つまたは複数の遺伝子の発現を除去することを含む、実施形態３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
４３． 前記細胞株がヒト細胞株である、実施形態３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
４４． 前記ヒト細胞株がＨｅＬａ細胞株またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である、実施形態４３に記載の方法。
４５． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性を対応する非改変親細胞と比較して低下させるように操作された細胞を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
４６． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から発現される遺伝子産物の発現および／または活性が無期限にまたは永続的に低下している、実施形態４５に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４７． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊または部分的もしくは完全な遺伝子欠失を含むように操作されている、実施形態４６に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４８． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに遺伝子破壊を含むように操作されている、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
４９． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に遺伝子破壊を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
５０． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２および／またはＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つに部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。
５１． ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１から選択される少なくとも２つの遺伝子に部分的または完全な遺伝子欠失を含むように操作された、実施形態４７に記載のｒＡＡＶパッケージングおよび／または産生細胞株。５２． 対応する親細胞株と比較して、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＬＩＮＣ００３１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＢＣＡ１０、ＮＯＧ、ＲＧＭＡ、ＳＰＡＮＸＮ３、ＰＧＡ５、ＭＹＲＩＰ、ＫＣＮＮ２およびＮＡＬＣＮ－ＡＳ１のうちの少なくとも１つから発現されるポリペプチドまたはポリリボヌクレオチドの低下した発現および／または活性を示す組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）パッケージングおよび／または産生細胞株。
参照による組み込み
【0180】
本明細書において参照される特許文書および科学記事のそれぞれの開示全体は、すべての目的について参照により組み込まれる。
均等物
均等物
【0181】
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化されうる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明への制限よりむしろ、あらゆる点で例示的であると見なされるべきである。本発明の範囲は、したがって前述の記載によってよりむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に生じるすべての変化は、それに含まれることが意図される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【外国語明細書】