特開 2024-107801 分生子形成能が増大した糸状菌変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024107801

(43)【公開日】2024-08-09

(54)【発明の名称】分生子形成能が増大した糸状菌変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20240802BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240802BHJP

   C12P 1/02 20060101ALI20240802BHJP

   A23L 31/00 20160101ALI20240802BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20240802BHJP

【ＦＩ】

C12N1/15

C12N15/31

C12P1/02 Z

A23L31/00

C12N9/14

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023011914

(22)【出願日】2023-01-30

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年１１月１０日に、小川真弘、土屋慧、岩間亮、堀内裕之が、第２１回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集において、小川真弘によってなされた発明の一態様を公開した。

(71)【出願人】

【識別番号】000173935

【氏名又は名称】公益財団法人野田産業科学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】小川 真弘

【テーマコード（参考）】

4B018

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B018LB04

4B018LB10

4B018MD07

4B018MD49

4B018MD58

4B018MD91

4B050DD04

4B050LL02

4B064AG01

4B064CA05

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD19

4B064CD20

4B064DA10

4B065AA58X

4B065AA60X

4B065AA62X

4B065AA63X

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA22

4B065BC01

4B065BD38

4B065BD39

4B065CA42

(57)【要約】

【課題】分生子形成能が増大した糸状菌変異体の提供。
【解決手段】本発明は、糸状菌を宿主とする変異体であって、ｓｒｄＡ遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている、変異体の提供に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

糸状菌を宿主とする変異体であって、当該宿主が、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基配列：
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列；
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子、あるいは以下の（ｅ）～（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子、
を有しており、当該変異体において、当該宿主との比較で分生子形成能が増大する変異が導入されている、変異体。

【請求項2】

前記遺伝子が、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子をコードする遺伝子、又はそのホモログ若しくはオーソログである、請求項１に記載の変異体。

【請求項3】

前記遺伝子が欠損又は破壊されている、請求項１又は２に記載の変異体。

【請求項4】

前記変異が、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子のＤＮＡ結合ドメイン又は核移行シグナル部位における変異である、請求項１又は２に記載の変異体。

【請求項5】

前記変異が配列番号１の３１１位～３１７位における変異及び／又は２５５３位～２５５９位における変異である、請求項４に記載の変異体。

【請求項6】

前記糸状菌がアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス ミュータント カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｍｕｔ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フィシェリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）又はアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に属する、請求項１又は２に記載の変異体。

【請求項7】

更に、ｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下する変異が導入されている、請求項１又は２に記載の変異体。

【請求項8】

宿主との比較で、菌体外酵素生産能が増大している、請求項７に記載の変異体。

【請求項9】

前記菌体外酵素が、エンドキシラナーゼである、請求項８に記載の変異体。

【請求項10】

請求項１又は２に記載の変異体の培養物又はその抽出物。

【請求項11】

糸状菌宿主との比較で分生子形成能が増大した変異体の製造方法であって、当該宿主において、請求項１又は２に記載の遺伝子の機能を低下させる工程を含む、製造方法。

【請求項12】

請求項１０に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、請求項１又は２に記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。

【請求項13】

前記原料が大豆及び小麦を含む、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項14】

前記培養物が麹又は諸味である、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項15】

有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、請求項１又は２に記載の変異体、あるいはその培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。

【請求項16】

前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、請求項１５に記載の製造方法。

【請求項17】

糸状菌において形成される分生子を増大させる方法であって、当該糸状菌において、請求項１又は２に記載の遺伝子の機能を低下させる工程を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分生子形成能が増大した糸状菌変異体等に関する。

【背景技術】

【0002】

アスペルギルス属の糸状菌は、世界中の様々な環境より分離される非常に良く知られたカビの仲間である。このアスペルギルス属の糸状菌の中でも、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、そしてアスペルギルス・リュウチュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）は麹菌と呼ばれ、東アジア地域の発酵産業に重要な役割を果たしている。例えば、アスペルギルス・オリゼは日本酒、醤油、味噌の製造に、アスペルギルス・ソーヤはおもに醤油の生産に、そしてアスペルギルス・リュウチュウエンシスは焼酎や泡盛の醸造に利用される（Ｉｃｈｉｓｈｉｍａ， Ｅ． （２０１６）． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８０， １６８１）。

【0003】

麹菌をはじめとするカビ類は、菌体外に大量の加水分解酵素を分泌する能力があることが一般的に知られている。中でもこれら麹菌類により分泌される糖質加水分解酵素、タンパク質加水分解酵素、そして脂質加水分解酵素などの各種加水分解酵素群は、醸造の初期段階において重要な工程である原料の分解を担っている（村上英也 編著（２０１８）、麹学 第６版、日本醸造協会）。これら各種分解酵素の細胞外分泌能を強化するための様々な研究が行われている。

【0004】

またその研究には、麹菌類と同じくアスペルギルス属の糸状菌で、分子・細胞生物学的な解析が麹菌類よりも先行しているアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）が用いられる事も有る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １３１， ５８９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者は以前、麹菌類においてタンパク質分泌を増強させることが知られていた変異遺伝子のアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）におけるオーソログであるｒｓｅＡ破壊株のタンパク質分泌量が増加することを示した（Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １３１， ５８９）。しかしながら、ｒｓｅＡ破壊株は細胞壁に異常があることや、分生子形成能が著しく低下していることなど、ｒｓｅＡ破壊株には培養上のデメリットが存在していることが本発明者によって明らかとなった。

【0007】

そのため、ｒｓｅＡ破壊株の分生子形成能を回復させる方法を見出すことができれば、高い菌体外酵素生産能と分生子形成能を有するアスペルギルス属糸状菌の育種に役立つ知見が得られることが期待される。さらにその知見は、分生子形成能が低下した糸状菌において、その分生子形成能を回復させる方法や、糸状菌において分生子形成量をより増大させる方法として、広く利用できる可能性がある。

【0008】

本発明は、分生子形成能が増大した糸状菌変異体等の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、ｒｓｅＡ破壊株を親株として分生子形成能を回復させる変異株を取得し、原因遺伝子としてＺｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子をコードすると推定される遺伝子、ＡＮ５８４９を同定した。本明細書では、この遺伝子をｓｒｄＡ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｒｓｅＡ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）と称する。

【0010】

即ち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
糸状菌を宿主とする変異体であって、当該宿主が、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基配列：
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列；
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子、あるいは以下の（ｅ）～（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子、
を有しており、当該変異体において、当該宿主との比較で分生子形成能が増大する変異が導入されている、変異体。
［２］
前記遺伝子が、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子をコードする遺伝子、又はそのホモログ若しくはオーソログである、［１］に記載の変異体。
［３］
前記遺伝子が欠損又は破壊されている、［１］又は［２］に記載の変異体。
［４］
前記変異が、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子のＤＮＡ結合ドメイン又は核移行シグナル部位における変異である、［１］又は［２］に記載の変異体。
［５］
前記変異が配列番号１の３１１位～３１７位における変異及び／又は２５５３位～２５５９位における変異である、［４］に記載の変異体。
［６］
前記糸状菌がアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス ミュータント カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｍｕｔ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フィシェリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）又はアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に属する、［１］又は［２］に記載の変異体。
［７］
更に、ｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下する変異が導入されている、［１］又は［２］に記載の変異体。
［８］
宿主との比較で、菌体外酵素生産能が増大している、［７］に記載の変異体。
［９］
前記菌体外酵素が、エンドキシラナーゼである、［８］に記載の変異体。
［１０］
［１］又は［２］に記載の変異体の培養物又はその抽出物。
［１１］
糸状菌宿主との比較で分生子形成能が増大した変異体の製造方法であって、当該宿主において、［１］又は［２］に記載の遺伝子の機能を低下させる工程を含む、製造方法。
［１２］
［１０］に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、［１］又は［２］に記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。
［１３］
前記原料が大豆及び小麦を含む、［１２］に記載の製造方法。
［１４］
前記培養物が麹又は諸味である、［１２］に記載の製造方法。
［１５］
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、［１］又は［２］に記載の変異体、あるいはその培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
［１６］
前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、［１５］に記載の製造方法。
［１７］
糸状菌において形成される分生子を増大させる方法であって、当該糸状菌において、［１］又は［２］に記載の遺伝子の機能を低下させる工程を含む、方法。

【発明の効果】

【0011】

分生子形成不全の表現型は発酵産業等において不利な形質であるが、本発明によれば、糸状菌におけるｓｒｄＡを破壊等することで、菌体外酵素生産を保ちつつ、分生子形成能を回復させることができる。理論に拘束されることを意図するものではないが、糸状菌における分生子形成能の回復の効果は、細胞壁や細胞内シグナル伝達系の異常等に起因する様々な原因の分生子形成不全に対しても有効であると予想される

【0012】

また、糸状菌宿主においてｓｒｄＡ破壊に加えて、ｒｓｅＡにも変異等が導入されている場合には、分生子形成能を回復させるだけではなく、いくつかの菌体外加水分解酵素の生産を増大させる場合もある。加水分解酵素の生産能の向上は、原料の加水分解工程が必要とされる醸造・発酵産業における生産性や効率性の増大に資する。しかしながら、本発明の変異体又はその培養物、又は培養物からの抽出物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができるため、その用途は食品分野に限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】分子生物学的なモデルとして使用されるアスペルギルス・ニデュランスの菌糸、頂嚢、及び分生子部分を拡大した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真。Ａ：菌糸；Ｂ：頂嚢；Ｃ：Ｂにおける分生子（胞子）の部分拡大写真。

【図2】アスペルギルス・ニデュランスにおけるｒｓｅＡ破壊株であるＤＲＡ株と、その比較対象となる野生型株であるｗｔＲＡ株の表現型との比較。Ａ：最少培地上の各株のコロニーの写真；Ｂ：各株のＳＥＭ写真；Ｃ：固体培養サンプルのデジタルマイクロスコープ写真。各写真における左側がｗｔＲＡ株であり、右側がＤＲＡ株である。

【図3】アスペルギルス・ニデュランスＤＲＡ株のコロニー上に出現した自然変異株。

【図4】ｒｓｅＡ破壊とＰＣＲによるその確認方法（実施例１）。図中のＩからＩＩＩで示した領域は遺伝子破壊確認の際にＰＣＲにより増幅させる部分を示す。

【図5】ＰＣＲによる自然変異株のｒｓｅＡ破壊確認（実施例１）。Ｉ：破壊時欠失領域；ＩＩ：破壊用断片導入部分５’側；ＩＩＩ：破壊用断片導入部分３’側。

【図6】アスペルギルス・ニデュランスＤＲＡ株及び自然変異株のコロニーの表現型（実施例１）。Ａ：ｗｔＲＡ株（野生型株）；Ｂ：ＤＲＡ株（ｒｓｅＡ破壊株）；Ｃ：変異株 Ｂ；Ｄ：変異株 Ｄ。

【図7】ＤＲＡ株及び抑圧変異株のＳＥＭ写真（実施例１）。Ａ：ｗｔＲＡ株（野生型株）；Ｂ：ＤＲＡ株（ｒｓｅＡ破壊株）；Ｃ：変異株 Ｂ；Ｄ：変異株 Ｄ。

【図8】次世代シーケンサーによる全ゲノム解析に用いた菌株の系統関係（実施例２）。

【図9】変異導入部位周辺のアスペルギルス属糸状菌間における保存性（実施例２）。図中の矢印は、Ｃの１塩基欠失が生じた部位（上部）及びＣの１塩基挿入が生じた部位（下部）を示す。

【図10】実施例３にて作製を行った菌株の系統図。

【図11】ｒｓｅＡ破壊確認のサザンハイブリダイゼーションの概要（実施例３）。

【図12】サザンハイブリダイゼーション（図１１）によるＮ３１４９ＲＰ－ｒｄ２株におけるｒｓｅＡ破壊を確認した結果（実施例３）。

【図13】ｓｒｄＡ破壊とＰＣＲによるその確認方法（実施例３）。図中のＩからＩＩＩで示した領域は遺伝子破壊確認の際にＰＣＲにより増幅させる部分を示す。

【図14】ｐｙｒＧマーカー相補とＰＣＲによるその確認方法（実施例３）。

【図15】ｒｉｂｏＢマーカー相補とＰＣＲによるその確認方法（実施例３）。

【図16】ＰＣＲによるＮ３１４９ＲＰ－ＤＲＳ株のｓｒｄＡ破壊確認（実施例３）。Ｉ：破壊時欠失領域；ＩＩ：破壊用断片導入部分５’側；ＩＩＩ：破壊用断片導入部分３’側。

【図17】ＰＣＲによるＮ３１４９ＲＰ－ＤＳ株のｓｒｄＡ破壊確認（実施例３）。Ｉ：破壊時欠失領域；ＩＩ：破壊用断片導入部分５’側；ＩＩＩ：破壊用断片導入部分３’側。

【図18】Ｎ３１４９ＲＰ－ｐ１株およびＮ３１４９ＲＰ－ＤＳ株におけるｐｙｒＧマーカー相補の確認（実施例３）。

【図19】Ｎ３１４９ＲＰ－Ｃ株およびＮ３１４９ＲＰ－ＤＲ株におけるｒｉｂｏＢマーカー相補の確認（実施例３）。

【図20】アスペルギルス・ニデュランスにおけるｒｓｅＡｓｒｄＡ二重破壊株とｓｒｄＡ単独破壊株のコロニー写真（実施例４）。Ａ：Ｎ３１４９ＲＰ－Ｃ（野生型株）；Ｂ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＲ（ｒｓｅＡ破壊株）；Ｃ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＲＳ（ｒｓｅＡｓｒｄＡ破壊株）Ｄ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＳ（ｓｒｄＡ破壊株）。

【図21】アスペルギルス・ニデュランスにおけるｒｓｅＡｓｒｄＡ二重破壊株とｓｒｄＡ単独破壊株のＳＥＭ写真（実施例４）。Ａ：Ｎ３１４９ＲＰ－Ｃ（野生型株）；Ｂ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＲ（ｒｓｅＡ破壊株）；Ｃ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＲＳ（ｒｓｅＡｓｒｄＡ破壊株）Ｄ：Ｎ３１４９ＲＰ－ＤＳ（ｓｒｄＡ破壊株）。

【図22】推定されるｓｒｄＡ破壊による分生子形成能回復のメカニズム（実施例４）。

【図23】子嚢菌門の糸状菌におけるＳｒｄＡオーソログの系統樹（実施例５）。

【図24】アスペルギルス属糸状菌におけるＳｒｄＡオーソログのアミノ酸配列の同一性（実施例５）。

【図25】アスペルギルス属糸状菌のＳｒｄＡオーソログにおける主要なモチーフの保存性（実施例６）。

【図26】変異株 Ｂによる菌体外キシラナーゼ生産（実施例７）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

１．糸状菌を宿主とする変異体及びその製法
本発明は、糸状菌を宿主とする変異体であって、ｓｒｄＡ遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている変異体を提供する。

【0015】

麹菌をはじめとするアスペルギルス属糸状菌には、その生活環において無性生活環が存在する。この無性生活環においてこれらの生物は、菌糸として伸長して増殖するだけでなく（図１Ａ）、一定の条件が整うと頂嚢（コニディアルヘッド）と呼ばれる分生子形成器官を形成する（図１Ｂ）。この頂嚢には小さな球状の分生子が形成される（図１Ｂ右側）。この分生子一つ一つが、再び菌糸として伸長し増殖する能力を有している。このように分生子形成は、アスペルギルス属糸状菌において、極めて重要な増殖方法の一つである（Ａｄａｍｓ， Ｔ．Ｈ．ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２， ３５）。

【0016】

特に、麹菌の分生子は種麹とも呼ばれ、醸造微生物の保管に用いられるだけでなく、発酵の初期段階において、この種麹が原料に対して直接接種し使用される。（Ｈｏｆｒｉｃｈｔｅｒ，Ｍ．，Ｅｄ．（２０１０）．Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｔａ Ｘ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）。したがって麹菌では、高い菌体外酵素生産性ともに、高い分生子形成能も求められることになる。

【0017】

アスペルギルス属糸状菌における分生子形成制御機構については、分子生物学的なモデル生物として利用されるアスペルギルス・ニデュランスにおいて集中的な解析が行われており、既に分生子形成制御に関与する転写制御因子が複数同定されている（Ｗｕ， Ｍ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．（２０１８）． ｍＢｉｏ ９， ｅ０１１３０－１８）。例えば、分生子形成に中心的な役割を果たす、ＢｒｌＡ、ＡｂａＡそしてＷｅｔＡや、分生子形成を促進する働きをもつＦｌｂＢ、ＦｌｂＣ、ＦｌｂＤ、そして分生子形成を抑制する働きを持つＳｆｇＡやＮｏｓＡなどが知られている（Ａｄａｍｓ， Ｔ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２， ３５； Ｌｅｅ， Ｍ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ６， ２８８７４）。また、アスペルギルス・ニデュランスにて見出されている主要な分生子形成制御因子は、そのオーソログが麹菌アスペルギルス・オリゼにも存在しており、アスペルギルス・オリゼとアスペルギルス・ニデュランスでは類似した分生子形成制御がとられていると考えられている（Ｏｇａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｆｕｎｇａｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ． ４７，１０）。したがって、モデル微生物であるアスペルギルス・ニデュランスを使用して得られた分生子形成制御に関する知見は、産業的に利用されるアスペルギルス・オリゼなどの麹菌類にも適用できることが想定される。

【0018】

アスペルギルス・ニデュランスのｒｓｅＡ破壊株では、分生子形成能が大幅に低下する現象が確認されている（Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １３１， ５８９）。図２にはアスペルギルス・ニデュランスにおけるｒｓｅＡ破壊株であるＤＲＡ株と、その比較対象となる野生型株であるｗｔＲＡ株の表現型を示した。ＤＲＡ株のコロニーは野生型株と比べ明らかに色が薄くなっている（図２Ａ）。またＳＥＭ写真（図２Ｂ）からしても、ＤＲＡ株では頂嚢の形成数が大幅に低下するとともに、未成熟で異常な形の頂嚢しか形成されず、分生子形成能が低下していることが確認できる。また、通常アスペルギルス属糸状菌では分生子形成が促進される小麦フスマを用いた固体培養でも、野生型株では多数の頂嚢が形成されているのに対し、ＤＲＡ株では頂嚢が形成されていない状態であることが、ＨｉＲＯＸ社製のデジタルマイクロスコープを用いた観測結果からも分かる（図２Ｃ）。ｒｓｅＡ破壊株では、株により程度の差があるものの、産業利用上不利な形質を示すことがある。

【0019】

Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型の転写制御因子は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４ｐに代表される真菌類において特徴的な転写制御因子である（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７０， ５８３）。また、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型の転写制御因子としてアスペルギルス・ニデュランスでは、ＡｌｃＲやＰｒｎＡ、そしてＮｉｒＡなどといった主要な転写制御因子が既に見出されている（Ｐａｎｏｚｚｏ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２２８５９； Ｇoｍｅｚ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４， ５８５； Ｂｕｒｇｅｒ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．（１９９１）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１， ５７４６）。

【0020】

ｒｓｅＡ破壊に起因する分生子形成不全を回復させる原因遺伝子として同定された、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子をコードすると推定される遺伝子、ＡＮ５８４９は、配列番号１に示す全長３，５７１ｂｐの７つのエクソンより構成される遺伝子である。ＡＮ５８４９は、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子に相当する、配列番号２に示す１，０７７残基のアミノ酸をコードする。ＡＮ５８４９は抑圧変異の原因遺伝子の有力な候補であると考えられたことから、本発明者は、配列番号１の遺伝子を、ｓｒｄＡ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｓｅＡ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）と命名した。

【0021】

また、ｓｒｄＡは、アスペルギルス属糸状菌において分生子形成を負に抑制する転写制御因子であるとも考えられる。そのため、ｓｒｄＡの遺伝子破壊や機能欠失は、ｒｓｅＡ破壊株のみならず他の分生子形成不全株でも分生子形成を回復させることが可能であると予想される。

【0022】

ｓｒｄＡは、その遺伝子を破壊させるか、又は機能を欠失させることにより分生子形成能が増大する限り、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子をコードする遺伝子、あるいはその変異体、ホモログ若しくはオーソログであってもよい。

【0023】

一実施態様において、ｓｒｄＡは、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基配列：
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個、好ましくは２～５個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上である塩基配列；
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子、あるいは以下の（ｅ）～（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個、好ましくは２～５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列と相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子、
を有している。

【0024】

本明細書で使用する場合、「相同性」は同一性を指す場合がある。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。

【0025】

上記のような塩基配列の配列相同性を示すような遺伝子は、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。

【0026】

ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｎｇ ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

【0027】

本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５～９００ｍＭ、好ましくは１５～６００ｍＭ、さらに好ましくは１５～１５０ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることができる。

【0028】

したがって、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列としては、例えば、全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列で表される遺伝子であり、且つＺｎ₂Ｃｙｓ₆型転写制御因子の機能を保持する遺伝子を挙げることができる。かかる相同性の程度は、配列番号２のアミノ酸配列の相同性についても適用される。

【0029】

２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。

【0030】

上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

【0031】

本明細書における糸状菌の宿主は、ｓｒｄＡ遺伝子と相同性が高く、且つ同一の機能を有する遺伝子を保有する糸状菌であれば特に限定されない。そのような糸状菌は、アスペルギルス属糸状菌であることが好ましい。アスペルギルス属糸状菌の例として、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・リュウチュウエンシス ミュータント カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｍｕｔ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フィシェリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、等が挙げられる。中でもアスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。

【0032】

糸状菌には、ｓｒｄＡ遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入される。本明細書で使用する場合、「ｓｒｄＡ遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異」とは、宿主と比較した場合に分生子形成能を増大させるようなｓｒｄＡ遺伝子の任意の変異を意味する。例えば、ｓｒｄＡ遺伝子の一部又は全部を破壊すること、例えば、ｓｒｄＡ遺伝子の一部又は全部を欠失させたり、ｓｒｄＡ遺伝子の途中に薬剤耐性遺伝子等、別の遺伝子を挿入するなどして正常に機能しないように遺伝子を修飾すること等により、糸状菌の分生子形成能を増大させることができる。分子形成能の増大には分子形成能不全の回復も含まれる。

【0033】

一実施態様において、ｓｒｄＡ遺伝子は欠損又は破壊されている。

【0034】

ｓｒｄＡ遺伝子の欠失変異体は、ｓｒｄＡ遺伝子のうちの欠失させたい任意の領域の両端をつなぎ合わせたベクターを用いて遺伝子組換えを行うことで任意の領域を欠失させることにより調製できる。ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ａｄｅＡ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ｓＣ、ｐｙｒｏＡ、ｒｉｂｏＢのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、ピリチアミン、オーレオバシジンそしてオリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。

【0035】

変異の種類や方法は特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の部位特異的に変異を導入する方法、ランダムに変異を導入する方法、変異原となる薬剤を作用させる方法、紫外線照射法、タンパク質工学的手法等を広く用いることができる。特定の領域の一部又は全部を変異させてもよい。そのような領域として、ＤＮＡ結合ドメインや核移行シグナル等の機能性部位を含む大部分の領域が挙げられる。

【0036】

一実施態様において、ｓｒｄＡ遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異は、配列番号１の３１１位～３１７位の間でのＣの１塩基欠失又は２８７０位～２８７６位の間でのＣの１塩基挿入である。

【0037】

一実施態様において、糸状菌を宿主とする変異体には更に、ｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下する変異が導入されている。

【0038】

麹菌アスペルギルス・オリゼそしてアスペルギルス・ソーヤでは、推定糖転移酵素の遺伝子であるｒｓｅＡを破壊すると、菌体外酵素の生産量が増加することが見出されている（特許６５２９７６９号）。また本発明者らは以前、ｒｓｅＡの変異および破壊は分子生物学的モデル生物であるアスペルギルス・ニデュランスでもいくつかの菌体外酵素生産を増加させる効果があることを見出している（Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １３１， ５８９）。

【0039】

ＲｓｅＡはアスペルギルス属糸状菌とペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)糸状菌において広く保存されていることが確認されている。その他にも、本発明における糸状菌として、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）等に属する菌株が意図される。ｒｓｅＡ遺伝子を有するアスペルギルス属糸状菌として、アスペルギルス・ニデュランスＦＧＳＣ Ａ４株やアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＮＢＲＣ１００９５９）、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９、等がある。

【0040】

一実施態様において、ｒｓｅＡ遺伝子は以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ａ）アスペルギルス・ニデュランスＦＧＳＣ Ａ４由来の配列暗号５５で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ： ＸＰ＿６８２３３８．１）；
（ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば１個、２個、３個、４個５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個、好ましくは２～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列と相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるアミノ酸；
であらわされるタンパク質をコードする遺伝子であるか、
あるいは以下の（ｄ）～（ｇ）のいずれかの塩基配列：
（ｄ）配列番号５６（ＧｅｎＢａｎｋ: ＢＮ００１３０６．１：５３３２７５－５３５４４７）；
（ｅ）配列番号５６又の塩基配列において、１若しくは数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個、好ましくは２～５個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号５６の塩基配列と相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である塩基配列；
（ｇ）配列番号５６の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素の生産を制御する遺伝子、
から選択される。

【0041】

アスペルギルス・ニデュランスＦＧＳＣ Ａ４のＲｓｅＡのアミノ酸配列（配列番号５５）とアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のＲｓｅＡのアミノ酸配列（配列番号５７）は、７０％以上の同一性を有している。

【0042】

配列番号５６の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列としては、例えば、全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素の生産制御に関与する遺伝子を挙げることができる。かかる相同性の程度は、本発明に係るタンパク質と相同のタンパク質についても適用される。

【0043】

「ｒｓｅＡ遺伝子の機能が低下又は欠損する変異」とは、宿主と比較した場合に加水分解酵素の生産能を増大させるようなｒｓｅＡ遺伝子の任意の変異を意味する。例えば、ｒｓｅＡ遺伝子の一部又は全部を破壊すること、例えば、ｒｓｅＡ遺伝子の一部又は全部を欠失させたり、ｒｓｅＡ遺伝子の途中に薬剤耐性遺伝子等、別の遺伝子を挿入するなどして正常に機能しないように遺伝子を修飾すること等により、糸状菌の加水分解酵素の生産能を増大させることができる。

【0044】

一実施態様において、ｒｓｅＡ遺伝子の機能が低下又は欠損する変異は、加水分解酵素の生産を抑制する遺伝子の機能を低下又は欠損させる変異である。

【0045】

ｒｓｅＡ遺伝子の欠失変異体は、ｒｓｅＡ遺伝子のうちの欠失させたい任意の領域の両端をつなぎ合わせたベクターを用いて遺伝子組換えを行うことで任意の領域を欠失させることにより調製できる。ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ａｄｅＡ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ｓＣ、ｒｉｂｏＢ、ｐｙｒｏＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、ピリチアミン、オーレオバシジンそしてオリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。

【0046】

高い分生子形成能と酵素生産性を両立させる観点からは、ｓｒｄＡとｒｓｅＡの両方の遺伝子が破壊されていることが好ましい。

【0047】

ｒｓｅＡの変異の種類や方法は特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の部位特異的に変異を導入する方法、ランダムに変異を導入する方法、変異原となる薬剤を作用させる方法、紫外線照射法、タンパク質工学的手法等を広く用いることができる。部位特異的変異導入法により、対応するアミノ酸配列において、１８４位に相当するロイシンを欠失させるか、または他のアミノ酸、例えばセリンに置換する変異（Ｌ１８４Ｓ）を行うことでｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下又は欠損させてもよい。ＲｓｅＡは、ヒアルロン酸合成酵素として知られるＣｐｓ１と相同性が高い。Ｃｐｓ１ファミリーのアミノ酸配列には高度に保存された領域が複数存在しているが、触媒部位にあるＤＸＤモチーフはクリプトコッカス・ネオフォルマンスの場合１３５位に、そしてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の場合１３１位に位置する。糸状菌の上記１８４位に相当するロイシンはＤＸＤモチーフの最初のアスパラギン酸から数えて約５３残基下流に存在する。

【0048】

糸状菌では、ｒｓｅＡ遺伝子が変異していることにより、糸状菌から産生する種々のタンパク質分解系加水分解酵素や多糖分解系加水分解酵素の生産能が有意に増大している。限定することを意図するものではないが、本発明により活性が増大する加水分解酵素、特に菌体外に分泌される加水分解酵素として、例えばアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼが挙げられる。

【0049】

２．変異体の用途
本発明は更に、上記変異体を用いて得られる培養物を提供する。本発明の変異体を含む培養物は、タンパク質を多く含む原料、例えば、植物性タンパク質を含む穀物類、野菜類など（例えば、大豆、小麦など）、そして動物性タンパク質を含む肉類、魚類などの加水分解工程で使用することができる。本明細書で使用する場合、「培養物」は変異体を添加した麹や、更には変異体を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。

【0050】

本発明の培養物は、上記変異体とタンパク質性の原料とを接触させる工程を含む方法により製造することができる。変異体を添加するタイミングは特に限定されない。本発明の効果、例えば向上した加水分解酵素生産能を損なわない限り、培養物の調製の途中又はその前後の工程で変異体以外の菌を添加して培養物を処理してもよい。その他の工程については、所望とする用途に応じて当業者が適宜決定することができる。

【0051】

本発明の変異体又はその培養物は、生産量が亢進された加水分解酵素により処理されることが必要な種々の分野、特に醸造・発酵産業での使用が想定される。例えば、糸状菌を利用して製造される種々の発酵食品、例えば醤油、味噌等の製造に本発明の変異体等を使用した場合、原料利用率の向上に資する。食品分野に限らず、本発明の変異体又はその培養物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができる。本明細書で使用する場合、「有機性材料」とは、天然・非天然の由来を問わず、広く炭素を主要元素として、酸素、水素、窒素原子などで構成される物質であって、糸状菌によって分解可能な物質を意味する。例えば、本発明の変異体又はその培養物によれば、糸状菌によって分解されるタンパク質、多糖、脂質等を含む食物残渣やバイオマスを効率的にその構成単位であるペプチドや単糖にまで分解することができる。

【0052】

以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。

【実施例0053】

ｒｓｅＡ破壊株における分生子形成不全が抑圧された自然変異株の表現型および遺伝子型の解析

【0054】

１．１．自然変異による分生子形成能が回復した変異株の取得
アスペルギルス・ニデュランスにおけるｒｓｅＡ（ＡＮ９０６９）破壊株であるＤＲＡ株（Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（２０２１）. Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． １３１， ５８９に記載されている）をＭＭＧｐ最少寒天培地に植菌し、３７℃で７日間培養した。ＭＭＧｐ最少寒天培地の１Ｌ当たりの組成は、グルコース：２０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．０５ｇ、塩化カリウム：０．５３ｇ、リン酸二水素カリウム：１．５３ｇ、硝酸ナトリウム：６．０ｇ、ピリドキシン塩酸塩：０．５ｍｇ、×１０００トレースメタル溶液１ｍＬ、寒天：１５ｇであり、初期ｐＨは６．５であった。×１０００トレースメタル溶液の１Ｌあたりの組成は、硫酸第一鉄・７水和物：１．０ｇ、硫酸亜鉛・７水和物：８．８ｇ、硫酸銅・５水和物：０．４ｇ、硫酸マンガン・４水和物：０．１５ｇ、四ホウ酸ナトリウム：０．１ｇ、モリブデン酸アンモニウム・４水和物：０．０５ｇ、であった（Ｒｏｗｌａｎｄｓ ，Ｒ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９７３）. Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １２６， ２０１）。

【0055】

２０５個のＤＲＡ株のコロニーのうち、図３に示す２つのコロニーにて分生子形成が回復した自然変異株が出現した。出現した自然変異株は、それぞれ変異株 Ｂ、変異株 Ｃ、および変異株 Ｄという名称を付けた。このうち変異株 Ｂと変異株 Ｃは同じＤＲＡコロニーから出現していたが、変異株 Ｄは別のＤＲＡのコロニーから出現していた。そのため、遺伝的なバックグランドが異なると考えられる、変異株 Ｂと変異株 Ｄを以降の解析に用いた。

【0056】

１．２．自然変異株におけるｒｓｅＡ破壊の確認
変異株 Ｂおよび変異株 ＤにおいてｒｓｅＡが破壊されているかをＰＣＲにより確認した。その方法としては図４に概略を示した通りであり、遺伝子破壊により欠失される領域の検出をＩ．のＰＣＲにて、遺伝子破壊用のＤＮＡ断片が目的とする場所に正しく導入されているかの検出を、ＩＩ．（ＤＮＡ断片導入の５’側の確認）およびＩＩＩ．（ＤＮＡ断片導入の３’側の確認）のＰＣＲにて行っている。なお、遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の導入は、遺伝子破壊時に導入したＤＮＡ断片内に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと、遺伝子断片が導入された部位の外側のゲノム上の領域に設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより確認している。

【0057】

２つの自然変異株を、ＹＧ液体培地（１Ｌあたりの組成で、酵母エキス５．０ｇ、グルコース１０ｇ、×１０００トレースメタル １ｍＬ、初期ｐＨ６．５）にて３日間振とう培養し、プロメガ社のＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用しゲノムＤＮＡを調製した。これを滅菌水により希釈しＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーとしては、Ｉ．領域の検出には配列番号３および４に示すものを、ＩＩ．に示す領域の検出には配列番号５および６に示すものを、ＩＩＩ．に示す領域の検出には配列番号７および８に示すものを用いた。ＰＣＲ用の酵素には、東洋紡株式会社のＫＯＤ Ｆｘ ｎｅｏを使用した。ＰＣＲによる確認結果を図５に示した。ＩからＩＩＩのいずれの領域を増幅し検出を行った際にも、自然変異株は、ｒｓｅＡ破壊株と同じ増幅パターンを示した。これは、変異株 Ｂおよび変異株 ＤのｒｓｅＡが破壊されていることを示しており、さらにこの２つの自然変異株は、破壊したはずのｒｓｅＡが野生型のｒｓｅＡに復元された復帰変異株ではなく、ゲノム上のｒｓｅＡ以外の領域に変異を有する、抑圧変異株であることを示唆するものであった。

【0058】

１．３．抑圧変異株の表現型観察
アスペルギルス・ニデュランスのＤＲＡ株、変異株 Ｂおよび変異株 ＤをＭＭＧｐ最少寒天培地に植菌した。また、比較対象として、野生型株であるｗｔＲＡ株（Ｏｇａｗａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １３１， ５８９）も、最少寒天培地に植菌した。これらの株を３７℃で６０時間培養後のコロニーの写真を図６に示した。ＤＲＡ株では分生子形成能が大幅に低下しているため、コロニーの色が全体的に薄くなっているが、変異株 Ｂと変異株 ＤではｗｔＲＡ株と同様に、コロニーに濃い緑色の部分が存在していたことから、これらの株では分生子形成が回復されているものと思われた。

【0059】

１．４．走査型電子顕微鏡観察用サンプルの固定化処理
上記コロニーについて、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）での高倍率の観察を行うことにより、各株の分生子の形成状態を直接的に調べることを試みた。ＳＥＭ観察では、試料の前処理（固定化処理）が必要なため、以下の操作を行った。
最少寒天培地で６０時間培養した各検体のコロニーを、２ｍｍ角に切り出し、２％のパラフォルムアルデヒドと２％のグルタルアルデヒドを含む１００ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて一晩、前固定した。これを、１％タンニン酸を含むカコジル酸緩衝液にて２時間固定したのち、さらに２％のオスミウム酸を含むカコジル酸緩衝液にて３時間固定した。固定化したサンプルは、エタノールの濃度グラジェントにより脱水し、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール凍結乾燥法により乾燥させた後、オスミウムプラズマコーターにより処理した。

【0060】

１．５．抑圧変異株のＳＥＭ観察
固定化処理を行った検体を、日本電子製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ－７５００Ｆにより観察した（図７）。ｗｔＲＡ株では正常な頂嚢が形成され、そこに大量の分生子が形成されているが、ＤＲＡ株では頂嚢の数が非常に少なくなり、形成されている頂嚢も、未発達の分生子形成数が少ないものしかない状態であった。一方、２つの抑圧変異株では正常な頂嚢が形成されており、そこにｗｔＲＡ同様に大量の分生子が形成されていた。このように抑圧変異株では、電子顕微鏡レベルで観察しても、分生子形成が回復していることが分かった。また、抑圧変異株では頂嚢がｗｔＲＡよりも密集して形成されている様子が見られた。そのため抑圧変異株では、コロニー全体としての分生子形成量が野生型株であるｗｔＲＡ株よりも多くなることが示唆された。

【実施例0061】

抑圧変異株とＤＲＡ株の次世代ゲノムシーケンス解析による抑圧変異原因遺伝子候補の同定

【0062】

２．１．次世代ゲノムシーケンス解析
２つの変異株における抑圧変異の原因遺伝子候補を絞り込むため、親株であるＤＲＡ株と２つの抑圧変異株の次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析を実施した（図８）。各検体をＹＰ液体培地にて３日間振とう培養後、プロメガ社のＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し菌体よりゲノムＤＮＡを抽出した。これをさらにＲＮａｓｅＡにより処理し、混入しているＲＮＡを分解したのち、キアゲン社のＤＮｅａｓｙミニカラムにて精製した。この精製ゲノムＤＮＡを用いて次世代ゲノムシーケンス用のライブラリーを調製し、イルミナ社のＨｉ－Ｓｅｑ２５００を用いた１００ｂｐ－ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄリードによるシーケンス解析を実施した。各検体の全リード数は、２２．８Ｍから２６．９Ｍで、いずれの検体もＱ３０を超える塩基の割合は９２％以上であった。次に、ショートリードのシーケンス結果を、既知のアスペルギルス・ニデュランスのゲノム配列にマッピングした。マッピング時のリファレンス配列には、アスペルギルス・ニデュランスＦＧＳＣ Ａ４株のゲノムシーケンスのデータを使用した（Ｇａｌａｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３８， １１０５）。各検体のマッピング率は９４．４％ から９８．４％であり、５０× Ｄｅｐｔｈ以上を達成している割合は最も低いサンプルで９０．８％であった。

【0063】

２．２．各抑圧変異株において特異的にみられる変異の同定
マッピングデータより、シーケンスの品質が低いことにより生じたと考えられるエラーを除外したのち、各変異株に特異的に生じている変異を同定した（表１及び２）。

【0064】

ゲノムシーケンス解析により見出された変異箇所
Ａ．変異株 Ｂにおいて見出された変異部位（Ｎｏ．１ ｖｓ Ｎｏ．２）

【表1】

【0065】

Ｂ．変異株 Ｄ株において見出された変異部位（Ｎｏ．１ ｖｓ Ｎｏ．３）

【表2】

【0066】

変異株 Ｂでは、親株であるＤＲＡ株と比べて４か所の変異が見られ、そのうち遺伝子上への変異は３か所であった。また、変異株 Ｄではゲノム上に３か所の変異が見られ、そのうち遺伝子上への変異は１か所であった。２つの抑圧変異株で変異が生じていた遺伝子の中で、ＡＮ５８４９には、変異株 Ｂでは３１１～３１７の間でのＣの１塩基欠失、変異株 Ｄでは２８７０～２８７６の間でのＣの１塩基挿入の変異が導入されていた。ＡＮ５４８９は配列番号１に示す全長３，５７１ｂｐの７つのエクソンより構成される遺伝子であり、配列番号２に示す１，０７７残基のアミノ酸よりなる、Ｚｎ₂Ｃｙｓ₆型の推定転写制御因子をコードする遺伝子であった。

【0067】

各抑圧変異株のｓｒｄＡ上に生じた変異の遺伝子産物への影響をそれぞれ調べた。変異株 Ｂの変異は、ｓｒｄＡのエクソン１でフレームシフトとプレターミネーションを引き起こし、結果として本遺伝子産物のＤＮＡ結合ドメインや核移行シグナルなどの機能性部位を含む大部分の領域を欠失させるものであった。一方、変異株 Ｄの変異については、エクソン６上でフレームシフトとプレターミネーションを引き起こし、結果として本遺伝子産物のＣ末端領域に存在する核移行シグナルを欠失させるものであった。このように、変異株 Ｂと変異株 Ｄで見られたｓｒｄＡ上への変異は、いずれも本遺伝子産物の構造に影響を及ぼすものであったため、ＡＮ５８４９は各変異株における抑圧変異の原因遺伝子の有力な候補であると考えられた。そのため本遺伝子をｓｒｄＡ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｓｅＡ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）と名付け、さらなる解析を行った。

【0068】

変異株 ＢおよびＤのｓｒｄＡ上で変異が見られた領域を、アスペルギルス属糸状菌のｓｒｄＡオーソログ間で比較した結果を図９に示した。なお前述の通り、各抑圧変異株でのｓｒｄＡの変異は、いずれもエクソン上のものであることが分かったため、本比較はいずれもイントロンを含まないｃＤＮＡの配列を用いて実施した。比較に使用したアスペルギルス属糸状菌におけるｓｒｄＡオーソログの遺伝子配列のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ アクセッション番号は、アスペルギルス・ニデュランス：ＸＭ＿０５０６１２６９８．１、アスペルギルス・アクレアタス：ＸＭ＿０２０２０２２５９．１、アスペルギルス・クラバツス：ＸＭ＿００１２６７７３３．１、アスペルギルス・フィシェリ：ＸＭ＿００１２６０３１３．１、アスペルギルス・フミガタス：ＸＭ＿７５００４６．１、アスペルギルス・グラウクス：ＸＭ＿０２２５４９６８７．１、アスペルギルス・ニガー：ＸＭ＿００１３９０５９９．２であった。また、アスペルギルス・オリゼのｓｒｄＡの遺伝子配列については、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑにＸＭ＿０２３２３３１５４として登録が有るが、これは５８５ｂｐしかない短い部分配列であった。そのためＸＭ＿０２３２３３１５４のデータと近縁種であるアスペルギルス・フラバスのｓｒｄＡの遺伝子配列（ＸＭ＿０４１２９４８９４）、そしてアスペルギルス・オリゼの第７番染色体ＳＣ０１１の配列（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＰ００７１７１．１）をもとに、３，２０４ｂｐよりなるアスペルギルス・オリゼのｓｒｄＡのイントロンを含まない遺伝子配列をマニュアルで予測した（配列番号９）。これをアスペルギルス・オリゼのｓｒｄＡの遺伝子配列として使用し、図９に示す塩基配列のアラインメントの作成に使用した。その結果、いずれの抑圧変異株での変異部位の配列についても、アスペルギルス属糸状菌間で保存されておらず、むしろアスペルギルス・ニデュランスにおいて同一塩基が連続する特徴的な配列であったため、他のアスペルギルス属糸状菌のｓｒｄＡオーソログよりも対象部位への自然変異が導入されやすい状況にあった可能性が有ると思われる。