特開 2024-109093 アセトバニロン変換酵素遺伝子及びそれを用いた有用物質生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024109093

(43)【公開日】2024-08-13

(54)【発明の名称】アセトバニロン変換酵素遺伝子及びそれを用いた有用物質生産

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20240805BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240805BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240805BHJP

【ＦＩ】

C12N15/52 Z ZNA

C12N1/21

C12P7/42

C12N1/20 A

C12N15/31

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024011624

(22)【出願日】2024-01-30

(31)【優先権主張番号】P 2023012450

(32)【優先日】2023-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 第６８回リグニン討論会リグニン学会第５回年次大会、２０２３年１１月１０日、発表資料 第６８回リグニン討論会リグニン学会第５回年次大会講演集（オンライン）、表紙、目次、抄録、奥付、２０２３年１１月６日公開

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504229284

【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学

(71)【出願人】

【識別番号】304021288

【氏名又は名称】国立大学法人長岡技術科学大学

(74)【代理人】

【識別番号】100149032

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 敏明

(72)【発明者】

【氏名】樋口 雄大

(72)【発明者】

【氏名】園木 和典

(72)【発明者】

【氏名】政井 英司

(72)【発明者】

【氏名】上村 直史

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD30

4B064AD31

4B064AD42

4B064AD43

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA16

4B065AA41X

4B065AA41Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA05

4B065CA10

4B065CA60

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明の目的は、スフィンゴビウム・スピーシーズＳＹＫ－６株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群と比べて、より少ない遺伝子から構成され、かつ高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる遺伝子群及び該遺伝子群を保有する微生物、並びにこれらを利用したバニリン酸の製造方法を提供することにある。
【解決手段】上記目的はアセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子並びにα－ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＣ遺伝子、これらの遺伝子を保有する微生物及び形質転換微生物、並びにそれらを利用した製造方法などにより解決される。
【選択図】図１３Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。

【請求項2】

前記形質転換微生物は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）である、請求項１に記載の形質転換微生物。

【請求項3】

アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項１若しくは２に記載の形質転換微生物に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程
を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法。

【請求項4】

ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。

【請求項5】

前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、請求項４に記載の形質転換微生物。

【請求項6】

アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項４若しくは５に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。

【請求項7】

前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるｐｏｂＡ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、請求項４に記載の形質転換微生物。

【請求項8】

４’－ヒドロキシアセトフェノンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項７に記載の形質転換微生物に作用させることにより、４－ヒドロキシ安息香酸を得る工程
を含む、４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法。

【請求項9】

下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＡ遺伝子。
（１）配列表の配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５０に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列

【請求項10】

下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＢ遺伝子。
（１）配列表の配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５１に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列

【請求項11】

シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）。

【請求項12】

宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び
染色体上にある、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。

【請求項13】

前記バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子は、ｖａｎＡ３遺伝子（配列番号２３）及びｖａｎＢ３遺伝子（配列番号２４）からなる群から選ばれる少なくとも１種のバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子である、請求項１２に記載の形質転換微生物。

【請求項14】

アセトバニロンを、請求項１２又は１３に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。

【請求項15】

宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び
染色体上にある、４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。

【請求項16】

前記４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子は、ＰｏｂＡ１遺伝子（配列番号６１）及びｐｏｂＡ２遺伝子（配列番号６２）からなる群から選ばれる少なくとも１種の４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子である、請求項１５に記載の形質転換微生物。

【請求項17】

４’－ヒドロキシアセトフェノンを、請求項１５又は１６に記載の形質転換微生物に作用させることにより、４－ヒドロキシ安息香酸を得る工程
を含む、４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アセトバニロンからバニリン酸中間体を経てバニリン酸へ変換する反応を触媒するアセトバニロン変換酵素及びそれを用いたバニリン酸等の有用物質の生産系に関する。

【背景技術】

【0002】

カーボンニュートラル社会の実現から、石油原料に代えて非可食バイオマスから機能性材料を製造することが求められている。その中で、非可食バイオマスを原料とした、セルロース誘導体及び脂肪族ポリマー原料の開発が進められている。しかし、これまでに、剛性、耐熱性などが満足できるポリマーはほとんど知られていない。

【0003】

非可食バイオマスの一種にリグニンがある。リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に約１８％～３６％、草本中には約１５％～２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みがなされている。木材などのバイオマスに由来するリグニンには、ｐ－ヒドロキシフェニルリグニン（Ｈ型リグニン）、グアイアシルリグニン（Ｇ型リグニン）及びシリンギルリグニン（Ｓ型リグニン）の３種があることが知られている。

【0004】

リグニンを分解して得られる化合物の中には、分子内に芳香環を有するモノマーとして使用できるものがある。このような芳香族モノマーを原料とするポリマーは、剛性、耐熱性などの機能性が優れたものになり得る。

【0005】

リグニン由来の芳香族モノマーの候補物質の一つとして、バニリン酸がある。バニリン酸を重合してなるポリマーは融点が非常に高いという特徴がある。例えば、バニリン酸を修飾等して得たモノマーを原料として得られる高機能性ポリマーは、融点が高く、機能性が高いことが知られている。しかし、リグニンを分解してもバニリン酸をほとんど得ることができない。

【0006】

リグニンを分解して得られる化合物の中に、アセトバニロンがある。アセトバニロンはリグニンの酸化分解によって生成する主要な芳香族単量体である。針葉樹、広葉樹、草本によらずに、いずれの植物系バイオマスからもアセトバニロンは生成する。例えば、工業レベルで行われている木材パルプ製造工程であるクラフト蒸解などの廃液（黒液）にもアセトバニロンは含まれている。そこで、アセトバニロンをバニリン酸へ変換することができれば、リグニンからのバニリン酸生産においてバニリン酸収率の向上や目的生産物の純度向上に繋がる。

【0007】

例えば、アセトバニロンを資化する能力を有する微生物又はその酵素を用いれば、微生物学的又は生化学的にアセトバニロンをバニリン酸へ変換できる可能性がある。これまでに知られているアセトバニロン資化性の微生物としては、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＳＹＫ－６株（例えば、非特許文献１及び２）、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） ＧＤ０１株（例えば、非特許文献３）、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ） ＧＤ０２株（例えば、非特許文献３及び４）及びアルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．） ＴＧＪ４株（例えば、非特許文献５）がある。しかし、アセトバニロンの変換に関わる酵素メカニズムの詳細が明らかにされているのはスフィンゴビウム・スピーシーズ ＳＹＫ－６株（以下、ＳＹＫ－６株ともよぶ。）とロドコッカス・ロドクラウス ＧＤ０２株（以下、ＧＤ０２株ともよぶ。）のみである。

【0008】

ＳＹＫ－６株は、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子及びａｃｖＦ遺伝子の６遺伝子によりコードされる酵素システムにより、アセトバニロン及びアセトシリンゴンをそれぞれｖａｎｉｌｌｏｙｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ及び３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄへカルボキシル化することが知られている（例えば、非特許文献１）。また、ＳＹＫ－６株は、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子の２遺伝子によりコードされる酵素システムにより、ｖａｎｉｌｌｏｙｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ及び３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄをそれぞれバニリン酸及びシリンガ酸へ変換することができる（例えば、非特許文献２）。したがって、ＳＹＫ－６株は、上記の合計８遺伝子からなるアセトバニロン変換酵素遺伝子群によりコードされる酵素システムにより、アセトバニロンからバニリン酸を生産できる。

【0009】

ＳＹＫ－６株の上記８遺伝子を他の宿主微生物へ導入することにより、ＳＹＫ－６株以外の微生物でアセトバニロンからバニリン酸を合成し得る。そのような宿主微生物として、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３；以下、ＮＧＣ７株ともよぶ。）が挙げられる（例えば、特許文献１）。ＮＧＣ７株は、リグニン由来の芳香族化合物であるｐ－ヒドロキシ安息香酸及びシリンガ酸を分解することができる。また、ＮＧＣ７株は、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を保有することにより、バニリン酸を分解することができる。したがって、ＮＧＣ７株を用いてバニリン酸を生産するには、染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を不活化する必要がある。

【0010】

そこで、本発明者らは、染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を不活化したＮＧＣ７株にＳＹＫ－６株の上記８遺伝子を導入し、得られた形質転換微生物によりアセトバニロンからバニリン酸を生産することを試みた（例えば、特許文献２を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２０２０／０８０４６７号

【特許文献2】国際公開第２０２２／２１０２３６号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Higuchi et al., 08 Aug 2022, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 88, No. 16, e0072422.

【非特許文献2】Higuchi et al., Sep 2019, Metabolic Engineering, Vol. 55, 258-267.

【非特許文献3】Navas et al., 10 Sep 2021, Frontiers in Microbiology, Vol. 12, 735000.

【非特許文献4】Dexter et al., 18 Oct 2022, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 119, No.43, e2213450119

【非特許文献5】Tanihata et al., 23 Apr 2012, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol. 76, No. 4, 838-840.

【非特許文献6】Abe et al., 15 Mar 2005, Journal of Bacteriology, Vol. 187, No. 6, 2030-2037.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

しかし、本発明者らが調べたところによれば、ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を用いたアセトバニロンからのバニリン酸への変換反応は非常に遅いという問題がある。また、ＳＹＫ－６株由来のバニリン酸蓄積株である非特許文献６に記載のＳＹＫ－６ΔｌｉｇＭΔｄｅｓＡ株は、バニリン酸を分解しないものの、バニリン酸のアナログであるシリンガ酸の分解能も失っており、メチオニン非存在下ではＨ型リグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖できない。したがって、ＳＹＫ－６株を用いてバニリン酸を製造しようとする場合、Ｓ型リグニンを多く含む広葉樹などを利用できず、使用できるバイオマスの種類が限られるという問題がある。

【0014】

特許文献２に記載のバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を不活化し、かつＳＹＫ－６株のアセトバニロン酵素遺伝子群を導入してなる形質転換ＮＧＣ７株は、アセトバニロンからバニリン酸を生産することができる。得られた形質転換ＮＧＣ７株は、ＮＧＣ７株の資化性を継続し、シリンガ酸を分解することができ、Ｈ型リグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖できる。

【0015】

しかし、上記形質転換ＮＧＣ７株は、ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群がコードする酵素の活性が低いために、アセトバニロンからのバニリン酸への変換反応は依然として遅い。さらに、ＳＹＫ－６株のアセトバニロン酵素遺伝子群は８遺伝子という多くの遺伝子からなり、該アセトバニロン酵素遺伝子群を用いて他の微生物を形質転換することは、手間がかかり、複雑であるという問題がある。

【0016】

また、これまでに、ＳＹＫ－６株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群と比べて、より少ない遺伝子数により、高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる遺伝子群及び該遺伝子群を保有する微生物は知られていない。

【0017】

そこで、本発明は、スフィンゴビウム・スピーシーズ ＳＹＫ－６株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群と比べて、より少ない遺伝子から構成され、かつ高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる遺伝子群及び該遺伝子群を保有する微生物、並びにこれらを利用したアセトバニロンからのバニリン酸の製造方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明者らは、上記課題の解決を試みるために、日本全国の土壌を採取して、アセトバニロンを資化する可能性がある微生物を単離することについて鋭意検討した。その結果、アセトバニロンを単一炭素源として増殖することができるシュードモナス属微生物の数株を得て、このうち増殖性の良かった株を選択及び単離することに成功した。

【0019】

単離したシュードモナス属微生物について、ＳＹＫ－６株と同様のアセトバニロン変換酵素遺伝子群の存在を確認したところ、驚くべきことに、アセトバニロン変換酵素遺伝子群の各遺伝子と高い配列同一性を有する遺伝子の存在は認められなかった。すなわち、単離したシュードモナス属微生物は、ＳＹＫ－６株とは異なる酵素システムによってアセトバニロンを代謝することが推定された。

【0020】

そこで、さらに試行錯誤を繰り返した結果、本発明者らは遂に、単離したシュードモナス属微生物において、アセトバニロン変換酵素遺伝子群の存在を見出すことに成功した。驚くべきことに、このアセトバニロン変換酵素遺伝子群は、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子が２種類と、α－ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子が１種類との合計３種類の遺伝子からなるものであった。

【0021】

そして、このアセトバニロン変換酵素遺伝子群をバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を不活化した形質転換ＮＧＣ７株に導入したところ、驚くべきことに、特許文献２に記載の形質転換ＮＧＣ７株を用いる場合と比べて、高効率でアセトバニロンからバニリン酸を生産することができた。

【0022】

さらに、単離したシュードモナス属微生物はバニリン酸を資化する性質を有していた。そこで、本発明者らは試行錯誤を繰り返すことにより、単離したシュードモナス属微生物におけるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子の存在を見出し、このバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を不活化したところ、アセトバニロンからバニリン酸を生産することができた。

【0023】

上記した知見及び成功例を基にして、本発明者らは、遂に、本発明の課題を解決するものとして、高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができ、かつ関連する遺伝子数が少ない遺伝子群及び該遺伝子群を保有する微生物、並びにこれらを利用したアセトバニロンからのバニリン酸の製造方法を創作することに成功した。本発明は、これらの本発明者らによって初めて得られた知見及び成功例に基づき完成された発明である。

【0024】

したがって、本発明の一側面によれば、以下の各一態様が提供される。
［１］ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。
［２］前記形質転換微生物は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）である、［１］に記載の形質転換微生物。
［３］アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は［１］若しくは［２］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程
を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法。
［４］ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。
［５］前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、［４］に記載の形質転換微生物。
［６］アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は［４］若しくは［５］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。
［７］前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるｐｏｂＡ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、［４］又は［５］に記載の形質転換微生物。
［８］４’－ヒドロキシアセトフェノンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は［７］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、４－ヒドロキシ安息香酸を得る工程
を含む、４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法。
［９］下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＡ遺伝子。
（１）配列表の配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５０に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
［１０］下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＢ遺伝子。
（１）配列表の配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５１に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
［１１］シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）。
［１２］宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び
染色体上にある、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。
［１３］前記バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子は、ｖａｎＡ３遺伝子（配列番号２３）及びｖａｎＢ３遺伝子（配列番号２４）からなる群から選ばれる少なくとも１種のバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子である、［１２］に記載の形質転換微生物。
［１４］アセトバニロンを、［１２］又は［１３］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。
［１５］宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び
染色体上にある、４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。
［１６］前記４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子は、ＰｏｂＡ１遺伝子（配列番号６１）及びｐｏｂＡ２遺伝子（配列番号６２）からなる群から選ばれる少なくとも１種の４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子である、［１５］に記載の形質転換微生物。
［１７］４’－ヒドロキシアセトフェノンを、請求項１５又は１６に記載の形質転換微生物に作用させることにより、４－ヒドロキシ安息香酸を得る工程
を含む、４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法。

【0025】

また、本発明の別の一側面によれば、以下の各一態様が提供される。
［１］下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＡ遺伝子。
（１）配列表の配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５０に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
［２］下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＢ遺伝子。
（１）配列表の配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５１に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
［３］［１］～［２］に記載のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。
［４］前記形質転換微生物は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）である、［３］に記載の形質転換微生物。
［５］アセトバニロンを、［１］及び［２］に記載のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は［３］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程
を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法。
［６］さらに下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、α－ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、［３］に記載の形質転換微生物。
（１）配列表の配列番号３又は６に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号３又は６に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号３又は６に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５２に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
［７］前記形質転換微生物は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）である、［６］に記載の形質転換微生物。
［８］前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）である、［６］に記載の形質転換微生物。
［９］アセトバニロンを、［１］及び［２］並びに［６］に記載のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は［６］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。
［１０］シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）。
［１１］宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び
染色体上にある、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。
［１２］前記バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子は、ｖａｎＡ３遺伝子（配列番号２３）及びｖａｎＢ３遺伝子（配列番号２４）からなる群から選ばれる少なくとも１種のバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子である、［１１］に記載の形質転換微生物。
［１３］アセトバニロンを、［１０］又は［１１］に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。

【発明の効果】

【0026】

本発明によれば、スフィンゴビウム・スピーシーズ ＳＹＫ－６株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合と比べて、高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる。また、本発明によれば、ＳＹＫ－６株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群よりも少ない遺伝子を利用することから、簡便にアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる。

【0027】

アセトバニロンは、現在の工業レベルで行われている木材パルプ製造工程におけるリグニン分解方法であるクラフト蒸解及びソーダ蒸解後の廃液（黒液）に含まれる主要な芳香族化合物である。しかし、木材パルプ製造過程で発生する黒液は濃縮後に回収ボイラ一で焼却され、熱源として利用されるに留まっている。本発明によれば、これまで工業副産物とされていたアセトバニロンを、有用物質であるバニリン酸への変換を通じて、資源化することが期待される。また、本発明によれば、工業的規模で得られるアセトバニロンから簡便かつ高効率でバニリン酸を生産することができることから、工業的規模でバニリン酸を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1A】図１Ａは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４（シュードモナス・スピーシーズ ＭＨＫ４株）の受託証の写しである。

【図1B】図１Ｂは、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４（シュードモナス・スピーシーズ ＭＨＫ４株）の生存に関する証明書の写しである。

【図2】図２は、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７Δａｐｈ（ｐＳＥＶＡａｃｐＡＢ）株（ＯＤ_６００が１０．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのα－ヒドロキシアセトバニロンへの変換結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始８時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｃ）反応開始８時間後に生成したα－ヒドロキシアセトバニロンのＨＰＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）分析結果を示す。

【図3】図３は、後述する実施例に記載するとおり、アセトバニロン（ＡＶ）とＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ］株（ＯＤ_６００が１０．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸への変換結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始２時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図4】図４は、後述する実施例に記載するとおり、ＡｃｐＡ粗酵素溶液及びアセトバニロン（ＡＶ）を用いた反応結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図5】図５は、後述する実施例に記載するとおり、ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びアセトバニロン（ＡＶ）を用いた反応結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図6】図６は、後述する実施例に記載するとおり、ＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びアセトバニロン（ＡＶ）を用いた反応結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図7】図７は、後述する実施例に記載するとおり、ＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液、ＡｃｐＣ粗酵素溶液及びアセトバニロン（ＡＶ）を用いた反応結果を示した図である。（Ａ）反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ｂ）反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図8A】図８Ａは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図8B】図８Ｂは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図9】図９は、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株及びＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株をアセトバニロンを炭素源とした培地で培養した寒天培地の撮影写真である。

【図10A】図１０Ａは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図10B】図１０Ｂは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図11A】図１１Ａは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株（ＯＤ_６００が１．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図11B】図１１Ｂは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株（ＯＤ_６００が１．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図12A】図１２Ａは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図12B】図１２Ｂは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔ］株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図13A】図１３Ａは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株によるリグニン分解物の分解性を評価し、アセトバニロン（ＡＶ）濃度、バニリン（ＶＮ）濃度、バニリン酸（ＶＡ）濃度及びグルコース濃度並びにＯＤ_６００を経時的に測定した結果を示した図である。

【図13B】図１３Ｂは、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株によるリグニン分解物の分解性を評価し、アセトバニロン（ＡＶ）濃度、バニリン（ＶＮ）濃度、バニリン酸（ＶＡ）濃度及びグルコース濃度並びにＯＤ_６００を経時的に測定した結果を示した図である。

【図14】図１４は、後述する実施例に記載するとおり、ＭＨＫ４株及びＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたバニリン酸（ＶＡ）の分解性の結果を示した図である。

【図15】図１５は、後述する実施例に記載するとおり、ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株（ＯＤ_６００が５．０になるように調製した細胞懸濁液）を用いたアセトバニロン（ＡＶ）からのバニリン酸（ＶＡ）への変換結果を示した図である。

【図16】図１６は、後述する実施例に記載するとおり、ＭＨＫ４株及びＳＹＫ－６株を用いたアセトバニロン（ＡＶ）の分解性の結果を示した図である。

【図17ABCDEFGH】図１７ＡＢＣＤＥＦＧＨは、後述する実施例に記載するとおり、アセトバニロン（ＡＶ）、Ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ヒドロキシアセトフェノン（ＨＡＰ）、３’，５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙ－４’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ及び３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅを基質として、ＡｃｐＡＢ酵素による酵素反応に供した結果を示した図である。

【図17IJKLMNOP】図１７ＩＪＫＬＭＮＯＰは、後述する実施例に記載するとおり、３’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’，５’－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、バニリン酸（ＶＡ）及び４’－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）を基質として、ＡｃｐＡＢ酵素による酵素反応に供した結果を示した図である。

【図18】図１８は、後述する実施例に記載するとおり、α－ヒドロキシアセトバニロンを基質として、ＡｃｐＣ粗酵素溶液による酵素反応に供した結果を示した図である。図１８Ａは、反応開始直後の結果、図１８Ｂは反応開始１時間後の結果を示した図である。

【図19】図１９は、後述する実施例に記載するとおり、２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅを基質として、ＡｃｐＣ粗酵素溶液による酵素反応に供した結果を示した図である。図１９Ａは、反応開始直後の結果、図１９Ｂは反応開始１時間後の結果を示した図である。

【図20】図２０は、後述する実施例に記載するとおり、後述する実施例に記載するとおり、α－ヒドロキシアセトシリンゴンを基質として、ＡｃｐＣ粗酵素溶液による酵素反応に供した結果を示した図である。図２０Ａは、反応開始直後の結果、図２０Ｂは反応開始１時間後の結果を示した図である。

【図21】図２１は、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いた４’－ヒドロキシアセトフェノン（ＨＡＰ）から４－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）への変換反応の結果を示した図である。

【図22】図２２は、後述する実施例に記載するとおり、ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いた４’－ヒドロキシアセトフェノン（ＨＡＰ）及びアセトバニロン（ＡＶ）の混合物から４’－ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）への変換反応の結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、本発明の各態様の詳細について説明するが、本発明は、本項目の事項によってのみに限定されず、本発明の目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

【0030】

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、微生物学分野などの技術分野の当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。

【0031】

「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０％～１００％」は、０％以上であり、かつ、１００％以下である範囲を意味する。「超過」及び「未満」は、その前の数値を含まずに、それぞれ下限及び上限を意味し、例えば、「１超過」は１より大きい数値であり、「１００未満」は１００より小さい数値を意味する。
整数値の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、１の有効数字は１桁であり、１０の有効数字は２桁である。また、小数値は小数点以降の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、０．１の有効数字は１桁であり、０．１０の有効数字は２桁である。

【0032】

「遺伝子の欠失」は、遺伝子が正常に転写されないこと、遺伝子の発現によって産生されるべき酵素（タンパク質）が正常に翻訳されないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。遺伝子の欠失は、例えば、遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、導入などにより遺伝子の構造が変化することによって生じ得る。ただし、遺伝子の欠失は、遺伝子の構造に変化が生じずに、例えば、遺伝子の制御領域をブロックするなどの手段によって遺伝子の発現が抑えられることによっても生じ得る。
「遺伝子の発現」は、転写や翻訳などを介して、遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する酵素（遺伝子によってコードされる酵素）が本来の構造及び活性を備えるように生産されることを意味する。「遺伝子の発現産物」は、遺伝子に対応して生産される酵素を意味する。
「遺伝子の過剰発現」は、遺伝子が導入されたことにより、宿主微生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされる酵素が生産されることを意味する。
「野生型微生物」は、天然に存在する、人為的に遺伝子組換えされていない微生物を意味する。「野生型遺伝子」は、野生型微生物のゲノムＤＮＡ上に本来的に存在する遺伝子を意味する。「野生型酵素」は、野生型遺伝子によってコードされる酵素を意味する。なお、本明細書において、ゲノム及び染色体は同義語である。
「外来遺伝子」は、導入される該微生物がそのゲノムＤＮＡ上に本来的に有していない遺伝子を意味し、異種遺伝子ともよぶ。
「高効率」での変換とは、ある物質が別の物質に迅速に変換すること、及び／又はある物質が別の物質に実質的に完全に変換することを意味する。

【0033】

（アセトバニロン変換酵素遺伝子群の特徴）
本発明者らは、新たなアセトバニロン変換酵素遺伝子群を有する微生物として、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）（以下、ＭＨＫ４株ともよぶ。）を単離した。また、本発明者らは、ＭＨＫ４株が有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群は、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の３遺伝子からなることを解明した。

【0034】

ＭＨＫ４株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群は、アセトバニロンからバニリン酸を生産する上で、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＳＹＫ－６株（以下、ＳＹＫ－６株ともよぶ。）に由来するａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子及びａｃｖＦ遺伝子並びにｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子からなるアセトバニロン変換酵素遺伝子群に対して、以下の特徴がある。

【0035】

ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、（１）アセトバニロンのリン酸化、（２）リン酸化産物の脱リン酸化、（３）脱リン酸化産物のカルボキシル化、（４）カルボキシル化産物へのＣｏＡ付加を伴ったＣα－Ｃβ開裂及び（５）ＣｏＡチオエステルの加水分解反応という少なくとも五段階の反応を経てアセトバニロンをバニリン酸へ変換する。それに対して、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、（１）アセトバニロンのアセチル基の水酸化及び（２）α－ヒドロキシアセトバニロンのヒドロキシメチル基の酸化的開裂というわずか二段階の反応でアセトバニロンをバニリン酸へ変換することが可能である。したがって、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用すると、より迅速にアセトバニロンをバニリン酸へ変換することが期待できる。

【0036】

ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、アセトバニロンのバニリン酸への変換には合計２分子のＡＴＰを要求する。それに対して、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、アセトバニロンのバニリン酸への変換にはＡＴＰを要求しない。したがって、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用すると、微生物は細胞内ＡＴＰの消費を低減しながらアセトバニロンを代謝及び分解することが期待できる。

【0037】

ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、合計８種の酵素遺伝子を宿主微生物に導入して形質転換微生物を作製する。それに対して、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、合計３種の酵素遺伝子を導入して形質転換微生物を作製する。したがって、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込んだプラスミドを宿主微生物に導入する場合、ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群はその全てを１種のプラスミドに組み込むことができないのに対して、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群はその全てを１種のプラスミドに組み込むことが可能である。

【0038】

以上のようなＳＹＫ－６株とＭＨＫ４株との間のアセトバニロン変換酵素遺伝子群の作用メカニズムの違いにより、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込んだプラスミドを宿主微生物としてシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）に導入した形質転換微生物によりアセトバニロンからバニリン酸を変換する場合、ＳＹＫ－６株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群に対して、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群は、簡便かつ高効率でアセトバニロンからバニリン酸を生産することができる。

【0039】

工業レベルでのリグニンの酸化分解によって生成するアセトバニロンについて、微生物による代謝系が明らかにされていたのはＳＹＫ－６株及びＳＹＫ－６株と類似のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を有するＧＤ０２株のみであった。ＳＹＫ－６株等のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、遺伝子数が多くて複雑であり、かつアセトバニロンの変換速度が遅いことから、アセトバニロンからの有用物質生産に貢献できていないのが実情である。しかし、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を利用する場合、ＳＹＫ－６株等のアセトバニロン変換酵素遺伝子群と比べて、より少ない遺伝子で、速やかにアセトバニロンをバニリン酸へ変換できることから、簡便かつ高効率でアセトバニロンからの有用物質生産を行うことが期待される。

【0040】

（ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子）
ＭＨＫ４株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群によるアセトバニロンからバニリン酸への変換は、以下のスキーム（Ｉ）に示されるとおりになされると推定される。

【0041】

【化1】

スキーム（Ｉ）

【0042】

まず、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の遺伝子産物であるＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素により、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する。次いで、ａｃｐＣ遺伝子の遺伝子産物であるＡｃｐＣ酵素により、α－ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する。また、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素により、４’－ヒドロキシアセトフェノン（４’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；ＨＡＰ）を２，４’－ジヒドロキシアセトフェノン（２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ；ＤＨＡＰ）へ変換する。次いで、ＡｃｐＣ酵素により、ＤＨＡＰを４－ヒドロキシ安息香酸（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ；ＨＢＡ）へ変換する。

【0043】

ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、それぞれ単独で機能するのではなく、それぞれサブコンポーネントとして複合体化して、一つの酵素（ＡｃｐＡＢ酵素）として機能する可能性が高い。本明細書では、便宜上、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の遺伝子産物をそれぞれＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素とよぶが、実際にはこれらが複合体化したＡｃｐＡＢ酵素である可能性があり、該可能性は妨げられない。

【0044】

本発明の一態様のａｃｐＡ遺伝子は、ＡｃｐＡ酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子である。本発明の一態様のａｃｐＢ遺伝子は、ＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子である。

【0045】

ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素である。また、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、ＨＡＰ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ及び４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅに対して分解活性を有する。例えば、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、ＨＡＰをＤＨＡＰへ変換する反応を触媒する活性を有する。ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は該活性を有するものである限り、それぞれのアミノ酸配列は特に限定されない。

【0046】

ＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子によってコードされるＡｃｐＡ酵素のアミノ酸配列は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列である。ＭＨＫ４株のａｃｐＢ遺伝子によってコードされるＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列である。

【0047】

ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列は、野生型酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列であってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個であり、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個であり、さらに好ましくは１、２、３、４又は５個である。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。

【0048】

「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

【0049】

野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と配列同一性が５０％以上であり、好ましくは６０％以上又は６５％以上であり、より好ましくは７０％以上又は７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上又は８５％以上であり、なおさらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であるアミノ酸配列などが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。

【0050】

後述する実施例に記載したとおり、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素をそれぞれコードするａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株由来の酸素添加型バニレート Ｏ－デメチラーゼのオキシゲナーゼコンポーネント（ＶａｎＡ）をコードする遺伝子及びオキシドレダクターゼコンポーネント（ＶａｎＢ）をコードする遺伝子とそれぞれ３３．６％及び４４．１％の配列同一性を示した。これらのことから、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、モノオキシゲナーゼ、具体的にはＡｃｐＡ酵素がオキシゲナーゼコンポーネントであり、ＡｃｐＢ酵素がオキシドレダクターゼコンポーネントであると推定される。したがって、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＡ酵素のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネントであると推定される酵素は、ＡｃｐＡ酵素として利用し；ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつモノオキシゲナーゼのオキシドレダクターゼコンポーネントであると推定される酵素は、ＡｃｐＢ酵素として利用してもよい。

【0051】

ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素を入手する方法は特に限定されないが、例えば、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素の発現が認められるＭＨＫ４株などの野生型微生物又はＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物を培養し、次いで培養上清として、若しくは培養後の微生物の破砕物として、又はこれらから精製して、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素を回収することを含む方法などが挙げられる。例えば、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素が培養上清に存在する場合、培養上清から、硫安沈殿などの手段によりＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素を含む酵素濃縮液を得て、次いでゲルろ過クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの手段により分子量を指標としてＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素を分離することができる。なお、配列番号５０及び５１に示すアミノ酸配列を有するＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素の構成元素から算出される理論分子量は、それぞれ約３９，０００及び約３５，０００である。

【0052】

本発明の一態様のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子は、それぞれＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものであれば特に限定されない。ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が生物体内で発現することによりＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素が生産される。

【0053】

ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよく、野生型遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよい。

【0054】

「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列」は、野生型遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡのヌクレオチド配列を意味する。

【0055】

「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。

【0056】

ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８時間～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。

【0057】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子としては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５Ｍ～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０℃～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７Ｍ～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １－３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子を得るための条件を適宜設定することができる。

【0058】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む遺伝子としては、プローブとして使用する野生型遺伝子のヌクレオチド配列を有する遺伝子のヌクレオチド配列と一定以上の配列同一性を有する遺伝子が挙げられ、例えば、野生型遺伝子のヌクレオチド配列と配列同一性が５０％以上であり、好ましくは６０％以上又は６５％以上であり、より好ましくは７０％以上又は７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上又は８５％以上であり、なおさらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上であるヌクレオチド配列を有する遺伝子が挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。

【0059】

野生型遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列としては、例えば、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチド数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子のヌクレオチド配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、さらに好ましくは１、２、３、４又は５個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などを有するヌクレオチド配列を含む。ここで、「ヌクレオチドの欠失」とは配列中のヌクレオチドに欠落又は消失があることを意味し、「ヌクレオチドの置換」は配列中のヌクレオチドが別のヌクレオチドに置き換えられていることを意味し、「ヌクレオチドの付加」とは新たなヌクレオチドが挿入するように付け加えられていることを意味する。

【0060】

野生型遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされる酵素は、野生型遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされる酵素と同じ活性を有するものである。

【0061】

ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の具体的態様は、配列番号１及び２に記載のヌクレオチド配列を有する、ＭＨＫ４株由来のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子である。

【0062】

ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、野生型遺伝子と異なるヌクレオチド配列、例えば、コドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化したヌクレオチド配列を含むものであってもよい。例えば、ＭＨＫ４株由来のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列に対してコドン改変が施されたヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号４及び５に記載のヌクレオチド配列などが挙げられる。コドン改変が施されたヌクレオチド配列は、例えば、宿主微生物において発現し易いようにコドン改変が施されたヌクレオチド配列であることが好ましい。

【0063】

ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子のヌクレオチド配列及び野生型遺伝子が発現する野生型酵素のアミノ酸配列と対象となるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。具体的には、特許文献２の項目（配列同一性を算出するための手段）を参照して求めることができる。

【0064】

（ａｃｐＣ遺伝子）
ａｃｐＣ遺伝子は、ＡｃｐＣ酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子である。

【0065】

ＡｃｐＣ酵素は、α－ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する反応を触媒する活性を有する酵素である。また、ＡｃｐＣ酵素は、ＤＨＡＰをＨＢＡへ変換する反応を触媒する活性を有する。ＡｃｐＣ酵素は該活性を有するものである限り、アミノ酸配列は特に限定されない。

【0066】

ＭＨＫ４株のａｃｐＣ遺伝子によってコードされるＡｃｐＣ酵素のアミノ酸配列は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列である。

【0067】

ＡｃｐＣ酵素のアミノ酸配列は、野生型酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列であってもよい。

【0068】

後述する実施例に記載したとおり、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＣ酵素をコードするａｃｐＣ遺伝子は、バークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＡＺ１１株及びアルカリジェネス・スピーシーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）４ＨＡＰ株の２，４’－ジヒドロキシアセトフェノン・ジオキシゲナーゼ（ＤＡＤ）とそれぞれ８１％及び９９％のアミノ酸配列同一性を示した。このことから、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＣ酵素は、２，４’－ジヒドロキシアセトフェノン・ジオキシゲナーゼであると推定される。したがって、ＭＨＫ４株が有するＡｃｐＣ酵素のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ２，４’－ジヒドロキシアセトフェノン・ジオキシゲナーゼであると推定される酵素は、ＡｃｐＣ酵素として利用してもよい。

【0069】

ＡｃｐＣ酵素は、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素と同様に入手することができる。なお、配列番号５２に示すアミノ酸配列を有するＡｃｐＣ酵素の構成元素から算出される理論分子量は、約２０，０００である。

【0070】

ａｃｐＣ遺伝子は、ＡｃｐＣ酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものであれば特に限定されない。ａｃｐＣ遺伝子が生物体内で発現することによりＡｃｐＣ酵素が生産される。

【0071】

ａｃｐＣ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよく、野生型遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよい。

【0072】

ａｃｐＣ遺伝子の具体的態様は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する、ＭＨＫ４株由来のａｃｐＣ遺伝子である。

【0073】

ａｃｐＣ遺伝子は、野生型遺伝子のヌクレオチド配列に対してコドン、二次構造、ＧＣ含量などが最適化されたヌクレオチド配列を含むものであってもよい。例えば、ＭＨＫ４株由来のａｃｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列に対してコドン改変が施されたヌクレオチド配列としては、配列番号６に記載のヌクレオチド配列などが挙げられる。

【0074】

（遺伝子の由来）
ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子は、例えば、アセトバニロンの分解能を有する微生物及びこれらの酵素の発現が見られる微生物などに由来する。ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の由来微生物としては、例えば、ＭＨＫ４株を含むシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属微生物、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物などが挙げられ、ＭＨＫ４株及びその近縁種が好ましい。ＭＨＫ４株の近縁種は、ＭＨＫ４株と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列の同一性が９９．０％～９９．９％であるシュードモナス属微生物をいう。

【0075】

また、ＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列は、シュードモナス・プチダが保有する遺伝子のヌクレオチド配列と一定の配列同一性を有することから、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の由来微生物はシュードモナス属微生物が好ましい。

【0076】

ＭＨＫ４株のａｃｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列は、バークホルデリア・スピーシーズ ＡＺ１１株及びアルカリジェネス・スピーシーズ ４ＨＡＰ株が保有する遺伝子のヌクレオチド配列と一定の配列同一性を有することから、ａｃｐＣ遺伝子の由来微生物はバークホルデリア属微生物及びアルカリジェネス属微生物が好ましい。なお、ａｃｐＣ遺伝子として、バークホルデリア・スピーシーズ ＡＺ１１株及びアルカリジェネス・スピーシーズ ４ＨＡＰ株が有する２，４’－ジヒドロキシアセトフェノン・ジオキシゲナーゼ遺伝子を使用することができる。

【0077】

ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の由来微生物は、上記に列挙したものを含めて特に限定されないが、これらの遺伝子を導入した形質転換微生物において発現されるＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素が宿主微生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましいことから、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入することによって形質転換すべき宿主微生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。

【0078】

（形質転換微生物）
本発明の別の一態様は、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を外来遺伝子として導入した形質転換微生物である。本発明の第一の態様の形質転換微生物は、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物である。本発明の第二の態様の形質転換微生物は、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物である。以下では、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の組み合わせ、並びにａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の組み合わせを、「アセトバニロン変換酵素遺伝子群」と総称する。

【0079】

形質転換微生物は、宿主微生物に、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を外来遺伝子として導入することにより作製する。

【0080】

宿主微生物は、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を外来遺伝子として導入することができ、かつ導入したアセトバニロン変換酵素遺伝子群を発現することができる微生物であれば特に限定されない。宿主微生物としては、例えば、シュードモナス属微生物、バークホルデリア属微生物、アルカリジェネス属微生物、スフィンゴビウム属微生物、ロドコッカス属微生物、アルスロバクター属微生物、エシェリヒア属微生物、コリネバクテリウム属微生物などが挙げられるが、アセトバニロン分解性の株が属するシュードモナス属微生物、バークホルデリア属微生物、アルカリジェネス属微生物、スフィンゴビウム属微生物、ロドコッカス属微生物及びアルスロバクター属微生物が好ましく、ＭＨＫ４株のアセトバニロン変換酵素遺伝子群を導入かつ発現できることからシュードモナス属微生物がより好ましい。

【0081】

シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３）は、Ｈ型リグニン由来芳香族化合物、Ｓ型リグニン由来芳香族化合物及びＧ型リグニン由来芳香族化合物に対して資化性を有し、リグニンからの有用物質生産に優れている。そこで、宿主微生物は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株であることが好ましい。

【0082】

宿主微生物は、野生型微生物であっても、野生型微生物を遺伝子組換えして得られる形質転換微生物であっても、いずれでもよい。例えば、宿主微生物がバニリン酸を分解する反応を触媒する活性を有する酵素の遺伝子（例えば、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子）を有する場合、該宿主微生物にアセトバニロン変換酵素遺伝子群を導入して得られる形質転換微生物は、バニリン酸を生産しても、分解もするので、バニリン酸を蓄積することが困難である。また、形質転換株の選抜のために薬剤選択を利用する場合は、使用する予定の薬剤に対して耐性を示すように機能する薬剤耐性遺伝子は薬剤選択を困難にする。そこで、宿主微生物は、バニリン酸分解酵素の遺伝子を欠失した微生物及び／又は薬剤耐性遺伝子を欠失した微生物であることが好ましい。ただし、野生型微生物にアセトバニロン変換酵素遺伝子群を導入した後に、バニリン酸分解酵素の遺伝子などを欠失して形質転換微生物を得てもよい。

【0083】

バニレート Ｏ－デメチラーゼは、原則、バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネント（ｖａｎｉｌｌａｔｅ Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）及びバニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネント（ｖａｎｉｌｌａｔｅ Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）からなる。バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネントをコードする遺伝子はｖａｎＡ遺伝子とよばれ、バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネントをコードする遺伝子はｖａｎＢ遺伝子とよばれる。

【0084】

ｖａｎＡ遺伝子が発現するバニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネント（ＥＣ １．１４．１３．８２；以下、ＶａｎＡ酵素ともよぶ。）は、Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを介して供給されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子と、分子状酸素から供給される酸素原子とを利用して、バニリン酸のメチルエーテル結合を開裂し、プロトカテク酸、ホルムアルデヒド及び水を生成する。

【0085】

バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネントは、そのアミノ酸配列中にＲｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ－２Ｓ］ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ ｄｏｍａｉｎ（Ｗ７－Ｖ１０７，ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１２９６）を有し、該ドメイン中のＣ及びＨ（Ｃ４７、Ｈ４９、Ｃ６６、Ｈ６９）がＦｅ－Ｓの結合に関わる。

【0086】

ｖａｎＢ遺伝子が発現するバニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネント（ＥＣ １．１４．１３．８２；以下、ＶａｎＢ酵素ともよぶ。）は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子を抜き取り、酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）へと伝達する酸化還元酵素の一つとして知られている。バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネントは、バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネントであるＶａｎＡ酵素にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子を伝達する。

【0087】

バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネントは、そのアミノ酸配列中に、２Ｆｅ－２Ｓ Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｔｙｐｅ ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｇ２２９－Ｉ３１６、ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１０８５）を有し、該アミノ酸配列中のＣ（Ｃ２６５、Ｃ２７０、Ｃ２７３、Ｃ３０３）がＦｅ－Ｓの結合に関わる。また、バニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネントは、そのアミノ酸配列中に、ＮＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｌ１０９－Ｄ２０１，Ｐｆａｍ ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＦ００１７５）及びＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｔｙｐｅ ＦＡＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（Ｍ１－Ａ１０１、ＰＲＯＳＩＴＥ ｅｎｔｏｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１３８４）を有する。

【0088】

ｖａｎＡ遺伝子の発現産物（ＶａｎＡ酵素）及びｖａｎＢ遺伝子の発現産物（ＶａｎＢ酵素）が共同して機能することでバニレート Ｏ－デメチラーゼ（ＶａｎＡＢ酵素）を構成する。ＶａｎＡＢ酵素は、バニリン酸の脱メチル化を担うが、シリンガ酸を３－Ｏ－メチルガリック酸へ、３－Ｏ－メチルガリック酸をガリック酸へそれぞれ変換することができるので、シリンガ酸 Ｏ－デメチラーゼ、３－Ｏ－メチルガリック酸 デメチラーゼとしても機能することができる。なお、ＳＹＫ－６株はシリンガ酸 Ｏ－デメチラーゼをコードする遺伝子としてｄｅｓＡ遺伝子を有し、バニリン酸／３－Ｏ－メチルガリック酸 Ｏ－デメチラーゼをコードする遺伝子としてｌｉｇＭ遺伝子を有する。

【0089】

ＳＹＫ－６株が有するｄｅｓＡ遺伝子及びｌｉｇＭ遺伝子がコードする酵素は、テトラヒドロ葉酸へのメチル転移反応を触媒し、その反応の進行にはテトラヒドロ葉酸を要求する。テトラヒドロ葉酸の再生にはメチオニン、チミジン、プリン生合成などに要求されるＣ１化合物を供給するＣ１代謝が必要であることから、これらの酵素はＣ１代謝と共役して機能させなければならない。これに対し、ＮＧＣ７株及びＭＨＫ４株が発現するバニレート Ｏ－デメチラーゼは、酸素添加型であり、オキシゲナーゼコンポーネントとオキシドレダクターゼコンポーネントとからなることにより、Ｃ１代謝との共役などを要せず、複雑さが低減されている。

【0090】

以上のとおり、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子は１組の遺伝子セットとして機能すると考えられる。特許文献２に記載があるとおり、ＮＧＣ７株は、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子のセットとして、ｖａｎＡ１遺伝子及びｖａｎＢ１遺伝子の遺伝子セット、ｖａｎＡ２遺伝子及びｖａｎＢ２遺伝子の遺伝子セット、ｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子の遺伝子セット、並びにｖａｎＡ４遺伝子及びｖａｎＢ４遺伝子セットを有すると想定される。ただし、これらの遺伝子セットのうち、ｖａｎＡ４遺伝子及びｖａｎＢ４遺伝子のセットがバニリン酸の分解に深く関与していると考えられる。

【0091】

ＮＧＣ７株が有するＶａｎＡＢ酵素をコードする遺伝子のうち、バニリン酸に直接作用するのはオキシゲナーゼコンポーネントあるｖａｎＡ４遺伝子である。そこで、宿主微生物がＮＧＣ７株である場合、アセトバニロンからバニリン酸の製造を試みる場合は、本発明の一態様の形質転換微生物は、ｖａｎＡ４遺伝子が欠失していることが好ましく、バニリン酸への作用を高度に低減するために、ｖａｎＡ４遺伝子及びｖａｎＢ４遺伝子の両方が欠失していることがより好ましい。ただし、バニリン酸の収率高めること、バニリン酸の分解をより低減することなどが期待できることから、本発明の一態様の形質転換微生物は、ｖａｎＡ４遺伝子及びｖａｎＢ４遺伝子に加えて、その他のｖａｎＡ遺伝子及び／又はｖａｎＢ遺伝子が欠失していることが好ましい。欠失させるその他のｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子は、特許文献２を参照して、得られる形質転換微生物の資化性その他の性質を加味して適宜選択すればよい。

【0092】

一方、ＮＧＣ７株が有するｐｏｂＡ遺伝子は、ＨＢＡをプロトカテク酸へ変換する活性を有するＰｏｂＡ酵素を発現する。ＰｏｂＡ酵素は、４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（ＥＣ １．１４．１３．２又はＥＣ １．１４．１３．３３）の一種である。そこで、最終生産物をＨＢＡとする場合は、本発明の一態様の形質転換微生物は、ｐｏｂＡ遺伝子が欠失していることが好ましい。

【0093】

形質転換微生物を作製する方法、例えば、宿主微生物に遺伝子を導入する方法、宿主微生物の遺伝子を欠失する方法などの方法の詳細は、特許文献２に記載の項目（遺伝子工学的手法による遺伝子のクローニング）、項目（遺伝子を含む組換えベクターの構築）及び項目（形質転換微生物の作製方法）を参照して実施すればよい。なお、組換えベクターを利用する場合、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込んだ組換えベクターは、その他の外来遺伝子（異種遺伝子）を含んでもよい。外来遺伝子は宿主微生物に本来的に存在しない（ｎｏｔ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ）遺伝子であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１１８由来のＤＮＡ断片、具体的にはラクトースプロモーター領域（Ｐ _ｌａｃ ）、薬剤耐性遺伝子、ＲＢＳ配列などが挙げられる。

【0094】

アセトバニロン変換酵素遺伝子群の宿主微生物への導入方法は特に限定されず、例えば、アセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込んだプラスミドベクターなどのＤＮＡコンストラクトが自律的に増殖して遺伝子を発現するように宿主微生物に導入する方法、相同組換えを利用することにより宿主微生物の染色体上にアセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込む方法などが挙げられるが、菌体あたりのアセトバニロンの分解量が増えることから、宿主微生物の染色体上にアセトバニロン変換酵素遺伝子群を組み込む方法が好ましい。

【0095】

（形質転換微生物の具体的な一実施態様）
形質転換微生物の具体的な一態様は、宿主微生物が大腸菌であって、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及び／又はａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物（１）である。形質転換微生物（１）を用いることにより、ＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素を得ることができる。形質転換微生物（１）の具体例は、後述する実施例に記載がある、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ］株及びＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＣ］株である。

【0096】

形質転換微生物の具体的な一態様は、宿主微生物がＮＧＣ７株であって、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物（２）である。形質転換微生物（２）は、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換することができる。また、形質転換微生物（２）は、ＨＡＰをＤＨＡＰへ変換することができる。

【0097】

形質転換微生物の具体的な別の一態様は、宿主微生物がＮＧＣ７株であって、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物（３）である。形質転換微生物（３）は、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンを介してバニリン酸へ変換することができる。ただし、ＮＧＣ７株はバニリン酸の資化能を有することから、形質転換微生物（３）によってはバニリン酸を蓄積することが困難である。形質転換微生物（３）の具体例は、後述する実施例に記載のＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株である。

【0098】

形質転換微生物の具体的な別の一態様は、宿主微生物がｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子、好ましくはｖａｎＡ４遺伝子及びｖａｎＢ４遺伝子が欠失したＮＧＣ７株であって、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物（４）である。形質転換微生物（４）は、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンを介してバニリン酸へ変換することができる。また、形質転換微生物（４）は、４－ヒドロキシ安息香酸などのＨ型リグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖しつつ、フェルラ酸やバニリンなどのＧ型リグニン由来の芳香族化合物及びアセトバニロン又はアセトバニロンを含むＧ型リグニン由来の芳香族化合物の混合物からバニリン酸の製造が可能である。形質転換微生物（４）の具体例は、後述する実施例に記載のＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株である。

【0099】

形質転換微生物の具体的な別の一態様は、宿主微生物がｐｏｂＡ遺伝子が欠失したＮＧＣ７株であって、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物（５）である。形質転換微生物（５）は、ＨＡＰをＤＨＡＰを介してＨＢＡへ変換することができる。また、形質転換微生物（５）は、アセトバニロンなどのＧ型リグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖しつつ、ＨＡＰなどのＨ型リグニン由来の芳香族化合物からＨＢＡの製造が可能である。形質転換微生物（５）の具体例は、後述する実施例に記載のＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株である。

【0100】

（製造方法）
形質転換微生物（１）により得たＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素（以下、ＡｃｐＡＢＣ酵素と総称する場合がある。）を適宜組み合わせて用いることにより、アセトバニロンからα－ヒドロキシアセトバニロンを製造でき、α－ヒドロキシアセトバニロンからバニリン酸を製造でき、及びアセトバニロンからα－ヒドロキシアセトバニロンを経由してバニリン酸を製造できる。本発明の一態様の製造方法は、アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子の発現産物であるＡｃｐＡ酵素及びａｃｐＢ遺伝子の発現産物であるＡｃｐＢ酵素に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法である。本発明の別の一態様の製造方法は、アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子の発現産物であるＡｃｐＡ酵素、ａｃｐＢ遺伝子の発現産物であるＡｃｐＢ酵素及びａｃｐＣ遺伝子の発現産物であるＡｃｐＣ酵素に作用させることにより、バニリン酸を得る工程を含む、バニリン酸の製造方法である。なお、ＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素は、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を利用して、無細胞タンパク質合成系を利用して合成してもよい。

【0101】

形質転換微生物（２）を用いることにより、アセトバニロンからα－ヒドロキシアセトバニロンを製造することができる。本発明の別の一態様の製造方法は、アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する形質転換微生物に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法である。

【0102】

形質転換微生物（３）及び形質転換微生物（４）を用いることにより、アセトバニロンからバニリン酸を製造することができる。本発明の別の一態様の製造方法は、アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程を含む、バニリン酸の製造方法である。本発明の別の一態様の製造方法は、アセトバニロンを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現し、さらに染色体上にあるバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を欠失している形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程を含む、バニリン酸の製造方法である。

【0103】

形質転換微生物（５）を用いることにより、ＨＡＰからＨＢＡを製造することができる。本発明の別の一態様の製造方法は、ＨＡＰを、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現し、さらに染色体上にあるｐｏｂＡ遺伝子を欠失している形質転換微生物に作用させることにより、ＨＢＡを得る工程を含む、ＨＢＡの製造方法である。

【0104】

アセトバニロンは、クラフト蒸解、ソーダ蒸解といったリグニンのアルカリ酸化分解によって得られる分解物に含まれることから、アセトバニロンの供給源は主にＧ型リグニンから成る針葉樹リグニンのアルカリ酸化分解物などの芳香族化合物の混合物であってもよい。

【0105】

アセトバニロンをＡｃｐＡＢＣ酵素に作用させる方法は、アセトバニロンとＡｃｐＡＢＣ酵素とが接触して、ＡｃｐＡＢＣ酵素によってα－ヒドロキシアセトバニロン及び／又はバニリン酸（以下、目的生産物と総称する場合もある。）が生産及び／又は蓄積できる方法であれば特に限定されず、例えば、ｐＨが６．５～８．５、好ましくは７．０～８．０であり、温度が２０℃～４０℃、好ましくは２５℃～３５℃であり、時間が数分間～数時間、好ましくは１０分間～６０分間である条件で、アセトバニロンをＡｃｐＡＢＣ酵素に作用させる方法が挙げられる。

【0106】

アセトバニロンを形質転換微生物に作用させる方法は、アセトバニロンと形質転換微生物とが接触して、形質転換微生物が有するＡｃｐＡＢＣ酵素によって目的生産物が生産及び／又は蓄積できる方法であれば特に限定されないが、例えば、アセトバニロンを含有し、かつ、形質転換微生物の生育に適した培地を用いて、形質転換微生物に適した各種培養条件下で形質転換微生物を培養することによって、目的生産物を製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。

【0107】

宿主微生物がＮＧＣ７株である場合の培養方法は、特許文献２の項目（製造方法）を参照して実施することができる。以下、一部を抜粋して記載する。

【0108】

培地は、シュードモナス属微生物を培養する通常の培地、すなわち、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用でき、例えば、後述する実施例に記載があるようなＭＭｘ－３培地、Ｗｘ最少培地などを利用することができるが、特に限定されない。炭素源は、アセトバニロンのみ、又はアセトバニロンと他のリグニン由来芳香族化合物、糖、有機酸などのその他の炭素源の組み合わせを用いることができる。培地成分には、細胞の増殖や酵素の活性化に必要な成分、例えば、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋などが含まれることが好ましい。鉄イオン、マグネシウムイオンなどを化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。

【0109】

培養条件は、当業者により通常知られるシュードモナス属微生物の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０℃～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１日間～７日間、より好ましくは２日間～５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養などを採用することができるが、通気をするなどして溶存酸素濃度が十分になるような条件で培養することが好ましい。また、アセトバニロンなどの炭素源の減少、目的生産物の増加などに応じて、アセトバニロン、その他の炭素源などを追加する流加培養を採用してもよい。

【0110】

例えば、培地及び培養条件の一例として、炭素源がアセトバニロンのみ、又はアセトバニロン及びグルコースを含むＭＭｘ－３培地又はＷｘ培地であり、温度が２５℃～３５℃であり、振盪速度（撹拌速度）が１００ｒｐｍ～２，０００ｒｐｍであり、時間が１時間～５日間である振盪培養及び撹拌培養などが挙げられる。培地及び培養条件の別の一例として、アセトバニロンを含むＬＢ培地を用いて、溶存酸素濃度が５％～２０％になるようにした振盪培養及び撹拌培養などが挙げられる。

【0111】

培養終了後に培養物から目的生産物を取得する方法は特に限定されない。目的生産物であるα－ヒドロキシアセトバニロン及びバニリン酸は培養液中に蓄積することから、培養物からろ過、遠心分離などの通常の固液分離操作により菌体と培養上清とを分離し、回収した培養上清からカラムを用いた固相抽出や目的生産物が可溶性のある溶媒を用いた溶媒抽出などにより目的生産物を抽出する。

【0112】

抽出溶媒は目的生産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどが挙げられる。

【0113】

目的生産物は沈殿、抽出、蒸留、再結晶、吸着剤など公知の方法や該方法を一部変更した方法などで培養液から分離精製することができる。精製方法の具体的一態様としては、例えば、培養上清に塩酸を加え、ｐＨを２～５に調整した後、ジエチルエーテルを添加して混合する。ジエチルエーテル層をエバポレーターで減圧乾固して、得られた析出物はイオン交換水で洗浄した後、吸引濾過により回収し、減圧乾燥する。乾燥した固体を氷酢酸に溶解して再結晶して、精製バニリン酸を得る。また、Ｇｏｍｅｓらの文献に記載の方法（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２１６、ｐ９２－１０１、２０１９）など合成吸着剤を用いた方法、特開２０１７―１７１５９１号公報に記載の減圧蒸留による方法などでも精製バニリン酸を得ることはできる。

【0114】

目的生産物の定性的又は定量的分析は、後述する実施例に記載されているＨＰＬＣにより実施すればよい。

【0115】

本発明の一態様の形質転換微生物を用いれば、目的生産物を分解することなく、選択的に得ることが可能である。
例えば、形質転換微生物（４）を用いれば、宿主微生物がＮＧＣ７株であり、かつ初発ＯＤ_６００が５．０である場合、１．０ｍＭ アセトバニロンを、１時間以内に、アセトバニロンが検出下限になるように、アセトバニロンをバニリン酸へ変換することができる。
また、形質転換微生物（４）を用いれば、宿主微生物がＮＧＣ７株であり、かつ初発ＯＤ_６００が０．１である場合、５．７ｍＭ バニリン、１．６ｍＭ アセトバニロン及び２．７ｍＭ バニリン酸を、３５時間以内に、アセトバニロンが検出下限になるように、アセトバニロンをバニリン酸へ変換することができる。

【0116】

本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、上記した方法と同様にして、アセトバニロンに代えてＨＡＰを基質として用いることにより、ＨＡＰからＨＢＡを製造することができる。

【0117】

（シュードモナス・スピーシーズ ＭＨＫ４株）
本発明の別の一態様は、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）である。ＭＨＫ４株は、配列番号１～３に記載のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を有し、アセトバニロンを、α－ヒドロキシアセトバニロンを経由して、バニリン酸へ変換することができる。また、ＨＡＰを、ＤＨＡＰを介して、ＨＢＡへ変換することができる。

【0118】

一方、ＭＨＫ４株は、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子である、配列番号２３及び２４に記載のｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子をも有することから、バニリン酸を資化する。そこで、ＭＨＫ４株を利用して、アセトバニロンからバニリン酸を製造する場合は、ＭＨＫ４株のｖａｎＡ３遺伝子及び／又はｖａｎＢ３遺伝子を欠失させることが好ましい。

【0119】

本発明の別の一態様は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び染色体上にある、バニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子、好ましくはｖａｎＡ３遺伝子（配列番号２３）及びｖａｎＢ３遺伝子（配列番号２４）からなる群から選ばれる少なくとも１種のバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子を欠失している形質転換微生物である。本発明の別の一態様は、アセトバニロンを、このような形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程を含む、バニリン酸の製造方法である。

【0120】

さらに、ＭＨＫ４株は、４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子である、配列番号６１及び６２に記載のｐｏｂＡ１遺伝子及びｐｏｂＡ２遺伝子をも有することから、ＨＢＡを資化する。そこで、ＭＨＫ４株を利用して、ＨＡＰからＨＢＡを製造する場合は、ＭＨＫ４株のｐｏｂＡ１遺伝子及び／又はｐｏｂＡ２遺伝子を欠失させることが好ましい。

【0121】

本発明の別の一態様は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４）であり、及び染色体上にある、４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子、好ましくはｐｏｂＡ１遺伝子（配列番号６１）及びｐｏｂＡ２遺伝子（配列番号６２）からなる群から選ばれる少なくとも１種の４－ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ遺伝子を欠失している形質転換微生物である。本発明の別の一態様は、ＨＡＰを、このような形質転換微生物に作用させることにより、ＨＢＡを得る工程を含む、ＨＢＡの製造方法である。

【0122】

（バニリン酸の用途）
本発明の一態様の遺伝子、微生物、形質転換微生物及び製造方法を利用して得られるバニリン酸及びＨＢＡは、種々の産業上有用な化合物に変換することができる。バニリン酸は、重合体に耐熱性及び剛性を付与する芳香環構造を有し、液晶ポリエステルなどの機能性ポリマー合成への利用が期待される。バニリン酸及びバニリン酸を修飾して得られるバニリン酸誘導体は、例えば、それ自体で、又は他の成分と共に使用して、耐熱性プラスチック、耐トラッキングプラスチック、液晶性共重合ポリエステル樹脂などとしての利用が期待される。本発明の一態様の形質転換微生物及び製造方法を利用して得られるα－ヒドロキシアセトバニロンは、バニリン酸の基質として、バニリン酸を製造するために利用できる。なお、ＨＢＡ及びＤＨＡＰもまた、バニリン酸及びα－ヒドロキシアセトバニロンと同様に利用することができる。

【0123】

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

【実施例0124】

［１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＨＫ４株の単離］
北海道、岩手県、宮城県、福島県、茨城県、栃木県、埼玉県、新潟県、長野県、滋賀県を含む日本国内の２７８の地点の土壌をサンプリングした。土壌のサンプリングは、土壌表面から５ｃｍ～１０ｃｍ程度掘り起こした部分を採取することにより実施した。サンプリングした各土壌をＷｘ ｂｕｆｆｅｒ［９．８ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１．７ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４］に加えて懸濁して得たスラリー状懸濁液 １０ｍｇ～３０ｍｇを、５ｍＭ アセトバニロン（以下、「ＡＶ」ともよぶ。）を含む０．５ｍＬのＷｘ液体培地［９．８ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１．７ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１００ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、９．５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１０．７５ｍｇ／Ｌ ＭｇＯ、２ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ_３、１．４４ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．１２ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、０．２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．２８ｍｇ／Ｌ ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０６ｍｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、５１．３μＬ １２Ｎ ＨＣｌ］に添加して、２５℃で７２時間にて振盪培養した。続いて、得られた培養液 ５μＬを、０．５ｍＬのＷｘ液体培地に添加して、２５℃で４８時間にて振盪培養した。目視により培養液の濁りを確認することにより、微生物の増殖が確認できたサンプルの培養液 ０．１ｍＬを、５ｍＭ ＡＶを含む５ｍＬのＷｘ液体培地に接種し、２５℃で４８～９６時間にて振盪培養した。次いで、同様にして微生物の増殖が確認されたサンプルの培養液 ０．１ｍＬを、１０ｍＭ ＡＶを含む５ｍＬのＷｘ液体培地に接種し、２５℃で４８～９６時間にて振盪培養した。次いで、同様にして微生物の増殖が確認されたサンプルの培養液を、１０ｍＭ ＡＶを含むＷｘ寒天培地に塗抹し、静置培養した。培養後、寒天培地上に形成されたコロニーを単離し、唯一の炭素源として５ｍＭ ＡＶを含むＷｘ液体培地で培養して、良好に生育した株と認められたものをＭＨＫ４株として選抜した。

【0125】

［２．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＭＨＫ４株の生物学的分類］
シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ＭＨＫ４株（以下、単にＭＨＫ４株ともよぶ。）は、微生物の識別の表示を「ＭＨＫ４」とし、かつ、受託番号を「受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３７９４」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０２２年１２月９日付けの受託日により寄託されている。ＭＨＫ４について、受託証の写しを図１Ａに示し、生存に関する証明書を図１Ｂに示す。

【0126】

ＭＨＫ４株の性状を調べた試験結果を表１～表３に示す。

【0127】

【表1】

【0128】

【表2】

【0129】

【表3】

【0130】

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の系統解析から、ＭＨＫ４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ ＤｈＡ－５１株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｐｓ ３－１０株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｈｎｉｉ ＩｐＡ－２株及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｏｒｅｉ ＲＷ１０株の１６ＳｒＲＮＡ配列と９７．６％～９９．６％の相同性を示した。

【0131】

ＭＨＫ４株について、テクノスルガ・ラボ社に細菌第一・第二試験を委託し、生理・生化学的性状試験を行った。その結果、ＭＨＫ４株は運動性を有するグラム陰性桿菌であること、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は陽性を示すこと、グルコースを酸化することがわかった（表１、表２）。これらの結果から、ＭＨＫ４株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物の性状と一致した［Ｂａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９３）．“Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．” Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ： Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．］。

【0132】

ＭＨＫ４株について、ＡＰＩ２０ＮＥキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｊａｐａｎ社）を用いた細菌第二段階試験を実施した。その結果、ＭＨＫ４株は、硝酸塩を還元すること、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さないこと、エスクリンを加水分解することがわかった。また、ＭＨＫ４株は、Ｌ－アラビノース、Ｄ－マンノース及びＤ－マンニトールを資化し、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを資化しなかった。また追加試験から、Ｋｉｎｇ’ｓ寒天培地上で蛍光色素を産生する一方、レバン形成、Ｔｗｅｅｎ８０の加水分解、５％ ＮａＣｌ存在下での生育及びレシチナーゼ活性はいずれも陰性を示した（表３）。ＭＨＫ４株が有するこれらの性状は、系統的に近縁である上記４種の菌株とはいずれも相違が認められた［Ｃａｍａｒａ ｅｔ ａｌ． （２００７）． “Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｅｋｅｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｏｒｅｉ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｈｎｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ ｏｒ ｉｓｏｐｉｍａｒｉｃ ａｃｉｄ” Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７：９２３－９３１；Ｍｏｈｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）． “Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ ｒｅｓｉｎ ａｃｉｄｓ” Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２：６８－７８．］。

【0133】

特に、ＭＨＫ４株は、蛍光色素を産生し、硝酸塩を還元し、及びアルギニンジヒドロラーゼ活性を示さない点は、Ｐ．ｍｏｏｒｅｉ及びＰ．ｍｏｈｎｉｉの性状と異なり；Ｌ－アラビノースを資化し、及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを資化しない点において、Ｐ．ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓの性状と異なり；及び、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さず、及びＤ－マンニトールを資化する点において、Ｐ．ｕｍｓｏｎｇｅｎｓｉｓの性状と異なった。

【0134】

以上の生理・生化学性状試験の結果から、ＭＨＫ４株は、これまでに単離されていないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．の一種と推定し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＨＫ４株と名付けた。

【0135】

［３．ＰＳＭＨ＿１６０７（ａｃｐＣ）、ＰＳＭＨ＿１６０８（ａｃｐＡ）及びＰＳＭＨ＿１６０９（ａｃｐＢ）を導入したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＮＧＣ７株のカナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ）欠損株を用いたＡＶ変換］
常法によりＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを調製し、全ヌクレオチド配列を解析した。Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＳＹＫ－６株のＡＶ変換酵素遺伝子群とアミノ酸配列同一性を示す遺伝子をＭＨＫ４株のゲノム配列から検索した。表４に、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＳＹＫ－６株由来のＡＶ変換酵素遺伝子群がコードする酵素とのアミノ酸配列同一性を示したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＨＫ４株由来の遺伝子を示す。

【0136】

【表4】

【0137】

表４に示すとおり、ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡにはＳＹＫ－６株のａｃｖＤ遺伝子と５０％の同一性を示す遺伝子（ＰＳＭＨ＿５０５４）及びｖｃｅＡ遺伝子と３８％の同一性を示す遺伝子（ＰＳＭＨ＿２３０８）がそれぞれ存在した。しかし、ＳＹＫ－６株のａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子、ａｃｖＦ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子と３０％以上の同一性を示す遺伝子は存在しなかった。以上のことから、ＭＨＫ４株は、ＳＹＫ－６株とは異なる酵素システムによってＡＶを代謝することが推定された。

【0138】

ＭＨＫ４株がＳＹＫ－６株とは異なる酵素システムによってＡＶを代謝することが推定されたことから、ＭＨＫ４株を２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅを含む１０ｍＬのＷｘ液体培地で培養した場合と比較して、５ｍＭ ＡＶ及び２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅを含むＷｘ液体培地で培養したときに発現誘導される遺伝子をＲＮＡ－Ｓｅｑ解析によって調べた。表５に５ｍＭ ＡＶ及び２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅを含むＷｘ液体培地で培養した際に発現誘導されていた上位１０遺伝子を示す。

【0139】

【表5】

【0140】

表５に記載の遺伝子のうち、ＰＳＭＨ＿１６０７（ａｃｐＣ）、ＰＳＭＨ＿１６０８（ａｃｐＡ）及びＰＳＭＨ＿１６０９（ａｃｐＢ）からなる遺伝子クラスターが最も高く誘導されていた。ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株由来の酸素添加型バニレート Ｏ－デメチラーゼのオキシゲナーゼコンポーネント（ＶａｎＡ）をコードする遺伝子及びオキシドレダクターゼコンポーネント（ＶａｎＢ）をコードする遺伝子とそれぞれ３３．６％及び４４．１％の配列同一性を示したことから、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の遺伝子産物がモノオキシゲナーゼとして機能することが推定された。

【0141】

ａｃｐＣ遺伝子は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＺ１１株由来の２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＤＡＤ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ６３６６８１．１（バージョン：ＡＢ６３６６８１．１））及びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．４ＨＡＰ株由来のＤＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ１３３８２０（バージョン：ＡＪ１３３８２０．１））とそれぞれ８１％及び９９％のアミノ酸配列同一性を示した。ＡＺ１１株及び４ＨＡＰ株のＤＡＤは、２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのヒドロキシメチル基を酸化的に開裂してそれぞれ４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ及びｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄへ変換する反応を触媒する。ａｃｐＣ遺伝子がコードする酵素がＡＺ１１株及び４ＨＡＰ株のＤＡＤと高いアミノ酸配列同一性を示すことから、２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅと構造が類似するα－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｖａｎｉｌｌｏｎｅをＶＡ及びｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄへ変換する可能性が考えられた。

【0142】

以上のことから、ＭＨＫ４株において、ＡＶはａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の遺伝子産物によって水酸化されてα－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｖａｎｉｌｌｏｎｅに変換された後、ａｃｐＣ遺伝子の遺伝子産物によってバニリン酸（以下、ＶＡともよぶ。）及びｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄへ変換されて代謝されると予想した。

【0143】

ａｃｐＡ／ａｃｐＢ遺伝子セットの発現プラスミドを以下の手順により作製した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２５及び２６のプライマー１及び２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｐＡ／ａｃｐＢ遺伝子セットを含む約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0144】

得られた断片をあらかじめＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＳＥＶＡ２４１＿Ｐ _ｌａｃ （Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８８、ｅ００７２４２２、２０２２を参照；カナマイシン耐性遺伝子を保有）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ａｃｐＡ／ａｃｐＢ遺伝子セットの発現用プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＡＢを作製した。

【0145】

以下のようにして、作製したプラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＡＢを、エレクトロポレーション法によりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０４３；独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター）のカナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈ）欠損株（以下、ＮＧＣ７Δａｐｈ株ともよぶ。）に導入した。なお、ＮＧＣ７Δａｐｈ株は、国際公開番号ＷＯ２０２２／２１０２３６の例１０を参照して作製した。

【0146】

ＬＢ液体培地１０ｍＬで振盪培養して得たＮＧＣ７Δａｐｈ株を、５ｍＬの０．５Ｍ グルコース水溶液で洗浄した後、０．２ｍＬの０．５Ｍ グルコース水溶液に懸濁した。菌体懸濁液とプラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＡＢとを混合し、Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、１０ｋＶの条件で印加した。印加後ただちに１ｍＬのＳＯＣ液体培地（２０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２０ｍＭ グルコース）を加えて、３０℃で１時間振盪培養し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天）上で生育可能な株を選抜した。

【0147】

得られたＮＧＣ７Δａｐｈ（ｐＳＥＶＡａｃｐＡＢ）株を２５ｍｇ／ＬのＫｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液０．１ｍＬを、新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液由来の細胞をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒ［３４．２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ］を用いて洗浄した後、再度ＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００＝１０の細胞懸濁液を１ｍＬ調製した。細胞懸濁液にＡＶを終濃度が０．２ｍＭになるように添加し、得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＡＶ変換反応に供した。反応開始８時間後に、反応液の一部を遠心分離して得た上清について、ＨＰＬＣ分析又はＨＰＬＣ－ＭＳ分析に供した。

【0148】

ＨＰＬＣ分析は、高速液体クロマトグラフ（「Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ」、アジレントテクノロジー社）を用いて測定した。カラムはＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（径 ４．６ｍｍ、長さ １５０ｍｍ、粒径 ０．５μｍ）を使用し、４０℃で保温した。勾配（グラジエント）溶離モード（溶媒Ａ：５％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＯＯＨ、溶媒Ｂ：５０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＯＯＨ）を使用し、溶媒Ａで平衡化した後、分析開始から８分かけて溶媒Ｂの割合を２０％まで上昇させ、その後５分かけて溶媒Ｂの割合を１００％まで上昇させた。移動相の流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長は２８０ｎｍを用いた。

【0149】

ＨＰＬＣ－ＭＳ分析には、高速液体クロマトグラフ（Ａｃｑｕｉｔｙ ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ、日本ウォーターズ社）とタンデム四重極型質量分析計（ＡＣＱＵＩＴＹ ＴＱ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、日本ウォーターズ社）を用いた。カラムはＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－１４０ＨＴＰ ｃｏｌｕｍｎ（径 ２．１ｍｍ、長さ １００ｍｍ、粒径 ２．３μｍ、東ソー社）を使用し、３０℃で保温した。移動相は、９０％ 溶媒Ａ［９９．９％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ］、１０％溶媒Ｂ［９９．９％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ）］のアイソクラティック溶離とした。移動相の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長は２８０ｎｍとした。エレクトロスプレーイオン化法マススペクトロメトリー（ＥＳＩ－ＭＳ）の検出はネガティブイオンモードで行った。検出条件は、ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ，３．０ｋｖ；ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ，１０－４０Ｖ，ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，１２０℃；ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，３５０℃；ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ，６５０ｌｉｔｅｒｓ／ｈ；ｃｏｎｅ ｇａｓ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ，５０ｌｉｔｅｒｓ／ｈとした。

【0150】

結果を図２に示す。反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図２（Ａ）に示し、反応開始８時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図２（Ｂ）に示す。

【0151】

図２（Ａ）及び図２（Ｂ）が示すように、ＨＰＬＣ分析の結果、反応８時間において、保持時間１１．３分に変換産物のピークが検出された。図２（Ｃ）にＨＰＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）分析によって変換産物を解析した結果を示す。図２（Ｃ）が示すように、α－ヒドロキシアセトバニロン（分子量１８２）の［Ｍ－Ｈ］^－と一致するｍ／ｚ １８１のピークが観察されたことから、ａｃｐＡＢ遺伝子の遺伝子産物によって、ＡＶがα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換されたことが示された。

【0152】

ａｃｐＡ／ａｃｐＢ遺伝子セットに加えてａｃｐＣ遺伝子を発現させるためのプラスミドを以下の手順により作製した。

【0153】

ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２７及び２６のプライマー３及び２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｐＣ遺伝子、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子を含む約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0154】

得られた断片をあらかじめＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＳＥＶＡ２４１＿Ｐ _ｌａｃ とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ａｃｐＣ遺伝子、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の発現用プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢを作製した。

【0155】

作製したプラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢを、前記記載の方法の通り、エレクトロポレーション法によりＮＧＣ７Δａｐｈ株へ導入した。

【0156】

得られたＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ］株を２５ｍｇ／ＬのＫｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液由来の細胞をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した後、再度ＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００＝１０の細胞懸濁液を１ｍＬ調製した。細胞懸濁液にＡＶを終濃度が０．２ｍＭになるように添加し、得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＡＶ変換反応に供した。反応開始２時間後に、反応液の一部を遠心分離して得た上清について、上記と同様にＨＰＬＣ分析に供した。

【0157】

結果を図３に示す。反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図３（Ａ）に示し、反応開始２時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図３（Ｂ）に示す。

【0158】

図３（Ａ）及び図３（Ｂ）が示すように、反応２時間において保持時間１２．８分に変換産物としてＶＡのピークが検出されたことから、ａｃｐＣ遺伝子の遺伝子産物によって、ａｃｐＡＢ遺伝子の遺伝子産物によりＡＶから生成したα－ヒドロキシアセトバニロンがＶＡへ変換されたことがわかった。以上のことから、ＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を組み合わせることで、ＡＶをＶＡへ変換できることが示された。

【0159】

［４．ＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素を用いたＡＶ変換］
ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子それぞれを大腸菌で発現させるためのプラスミドを以下の手順により作製した。

【0160】

ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２８及び２９のプライマー４及び５からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｐＡ遺伝子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0161】

ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３０及び３１のプライマー６及び７からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｐＢ遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0162】

ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３２及び３３のプライマー８及び９からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｐＣ遺伝子を含む約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0163】

得られた各断片をあらかじめＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ－１６ｂプラスミド（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法によりそれぞれ連結させることにより、ａｃｐＡ遺伝子発現用プラスミドｐＥ１６ａｃｐＡ、ａｃｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＥ１６ａｃｐＢ及びａｃｐＣ遺伝子発現用プラスミドｐＥ１６ａｃｐＣをそれぞれ作製した。

【0164】

作製したプラスミドｐＥ１６ａｃｐＡ、ｐＥ１６ａｃｐＢ及びｐＥ１６ａｃｐＣを、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入した。

【0165】

得られたＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ］株及びＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＣ］株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい１００ｍｇ／ＬのＡｍｐを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃でＯＤ_６００が０．５になるまで振盪培養した。ＯＤ_６００が０．５になったら、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。またＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株及びＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ］株には、ＦｅＳＯ_４を終濃度が０．１ｍＭになるようにさらに添加した。添加後、各菌株を１５℃で２０時間の振盪培養に供した。

【0166】

得られた各培養液由来の細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を用いて洗浄した後、再度、０．５ｍＬの上記ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。超音波ホモジナイザーを用いて細胞懸濁液中の細胞を破砕し、破砕後の細胞懸濁液を遠心分離に供して得た上清を、それぞれＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びＡｃｐＣ粗酵素溶液とした。各粗酵素溶液のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。

【0167】

各粗酵素溶液の終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになり、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の終濃度が０．４ｍＭになり、及びＡＶの終濃度が０．２ｍＭになるように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）中で混合し、３０℃で、３０分間反応させた。反応後、反応液の一部を分取し、等量のアセトニトリルと混合して反応を停止した。得られた反応溶液を遠心分離に供して得た上清に含まれるＡＶ及び反応産物について、上記と同様にＨＰＬＣ分析に供した。

【0168】

結果を図４～図７に示す。ＡｃｐＡ粗酵素溶液及びＡＶを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図４（Ａ）に示し、反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを図４（Ｂ）に示す。ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びＡＶを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図５（Ａ）に示し、反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを図５（Ｂ）に示す。ＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びＡＶを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図６（Ａ）に示し、反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを図６（Ｂ）に示す。ＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液、ＡｃｐＣ粗酵素溶液及びＡＶを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図７（Ａ）に示し、反応開始３０分後のＨＰＬＣクロマトグラムを図７（Ｂ）に示す。

【0169】

図４～６が示すように、ＡｃｐＡ粗酵素溶液及びＡｃｐＢ粗酵素溶液のいずれか一方を用いた場合と異なり、ＡｃｐＡ粗酵素溶液及びＡｃｐＢ粗酵素溶液の両方を用いた場合は、反応後３０分において保持時間１０．４分に変換産物としα－ヒドロキシアセトバニロンのピークが検出されたことから、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素によって、ＡＶがα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換されたことが示された。

【0170】

図７が示すように、ＡｃｐＡ粗酵素溶液、ＡｃｐＢ粗酵素溶液及びＡｃｐＣ粗酵素溶液を用いた場合は、反応３０分において保持時間１２．２分にＶＡのピークが検出されたことから、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素によって、ＡＶがα－ヒドロキシアセトバニロンに変換された後、ＡｃｐＣ酵素によってα－ヒドロキシアセトバニロンがＶＡに変換されたことが示された。以上のことから、ＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素を組み合わせることで、ＡＶをＶＡへ変換できることがわかった。

【0171】

［５．コドンを最適化したａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子並びに最適なＲｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＲＢＳ）を付加したＤＮＡ配列のＮＧＣ７Δａｐｈ株への導入及びＡＶ変換］
ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子のコドンを解析したところ、ＮＧＣ７株と近縁種であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａゲノム中での使用頻度が全体の１０％以下であったコドンの割合は、それぞれａｃｐＡ遺伝子では１１．４％、ａｃｐＢ遺伝子では１３．５％、ａｃｐＣ遺伝子では５．６％と、高い割合で存在した。そこでＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＬＬＣ）を用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａゲノム中でのコドン使用頻度と同等になるようにａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の塩基配列を改変した。またＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｓｌａｂ．ｎｅｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｅｄｉｃｔ＿ｒｂｓ＿ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）を用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａでの翻訳効率が最大になるようにａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子のそれぞれの開始コドン上流にシャイン・ダルガノ配列を含むＲｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＲＢＳ）配列をそれぞれ設計した。設計したＤＮＡ塩基配列の合成をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社に委託した。

【0172】

合成されたＤＮＡ塩基配列が挿入されたプラスミドをＥｃｏＲＩ消化することで、ａｃｐＣ ^ｏｐｔ遺伝子、ａｃｐＡ ^ｏｐｔ遺伝子及びａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子を含む約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【0173】

得られた断片をあらかじめＥｃｏＲＩで消化したｐＳＥＶＡ２４１＿Ｐ _ｌａｃ にライゲーション反応によって連結させることにより、ａｃｐＣ ^ｏｐｔ遺伝子、ａｃｐＡ ^ｏｐｔ遺伝子及びａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子の発現用プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを作製した。

【0174】

作製したプラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを前記記載の方法の通り、エレクトロポレーション法によりＮＧＣ７Δａｐｈ株に導入した。

【0175】

Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＳＹＫ－６株由来のＡＶ変換酵素遺伝子群のうち、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子及びａｃｖＦ遺伝子を発現するプラスミドｐＳＥＶＡａｃｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８８、ｅ００７２４２２、２０２２を参照）と、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子を発現するプラスミドｐＴＳ０９３ｖｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８８、ｅ００７２４２２、２０２２を参照）を前記の方法の通り、エレクトロポレーション法によりＮＧＣ７Δａｐｈ株に導入した。

【0176】

得られたＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株をそれぞれ２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ又は２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ テトラサイクリン（Ｔｃ）を含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られたそれぞれの培養液０．１ｍＬを２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ又は２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む新しい１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られたそれぞれの細胞懸濁液に、終濃度が１．０ｍＭになるようにＡＶを添加し、得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＡＶ変換反応に供した。

【0177】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た上清について、ＡＶ及びＶＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。

【0178】

ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株の結果を図８Ａに示し、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株の結果を図８Ｂに示す。

【0179】

図８Ａ及び図８Ｂが示すとおり、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた場合は、２４時間の反応でＡＶは約２０％しか変換されなかったのに対して、ＮＧＣ７Δａｐｈ（ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ）株を用いた場合は、反応４時間でＡＶがほぼ完全にＶＡへ変換された。以上のことから、ＭＨＫ４株のＡＶ変換酵素遺伝子群を用いることで、既知のＳＹＫ－６株由来のＡＶ変換酵素遺伝子群を用いる場合より、ＡＶを速やかにＶＡへ変換できることが示された。

【0180】

［６．ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを導入したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＮＧＣ７Δａｐｈ株のＡＶでの生育能］
ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株をそれぞれ２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ又は２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩の振盪培養に供した。得られた培養液のそれぞれ０．１ｍＬを新しい１０ｍＬのＬＢ（２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ又は２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む）に接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液由来の細胞を０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌに懸濁することにより、ＯＤ_６００＝２０．０の細胞懸濁液を０．１ｍＬ調製した。５ｍＭ ＡＶ及び２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ又は２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含むＭＭｘ－３寒天培地［３４．２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４９．３ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５ｇ／Ｌ 寒天］に、得られた細胞懸濁液 ２０μＬを塗り拡げ、３０℃で７２時間培養した。培養後の培地の様子を図９に示す。

【0181】

図９に示すように、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株はほとんど生育が確認されなかったのに対して、ＮＧＣ７Δａｐｈ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株は顕著に生育が確認された。以上のことから、ＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を用いることで、宿主微生物株にＡＶを炭素源として用いて生育できる生育能を付与することができることがわかった。

【0182】

［７．ＮＧＣ７ΔｖａｎＡ１Ｂ１ΔｖａｎＡ４Ｂ４ΔａｐｈΔｖａｎＡ２Ｂ２ΔｖａｎＡ３Ｂ３ΔａｒｅＡ株を用いたＡＶからのＶＡ蓄積性の評価］
プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを用いて、ＮＧＣ７株のＶＡ生産宿主であるＮＧＣ７ΔｖａｎＡ１Ｂ１ΔｖａｎＡ４Ｂ４ΔａｐｈΔｖａｎＡ２Ｂ２ΔｖａｎＡ３Ｂ３ΔａｒｅＡ株（以下、ＮＧＣ７２９株ともよぶ。）を形質転換して、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を得た。

【0183】

ＮＧＣ７ΔｖａｎＡ１Ｂ１ΔｖａｎＡ４Ｂ４ΔａｐｈΔｖａｎＡ２Ｂ２ΔｖａｎＡ３Ｂ３株は、国際公開番号ＷＯ２０２２／２１０２３６の例１０に記載のものを用いた。

【0184】

一方、ＮＧＣ７株のゲノムにはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株由来のバニリンレダクターゼ遺伝子（ＰＰ＿２４２６）と９６．９％の配列同一性を示したアミノ酸配列をコードする遺伝子であるＰＳＮ＿２３８４（ａｒｅＡ遺伝子；配列番号５３）が存在することを確認した。ａｒｅＡ遺伝子の機能によりリグニンの化学分解物に含まれるバニリンが還元されてバニリルアルコールに変換されるため、リグニンの化学分解物からバニリン酸を生産しようとした場合、分解物に含まれるバニリンがバニリルアルコールに変換されてバニリン酸の生産量が低下することが想定される。そこで、バニリンレダクターゼとして機能すると推定されるａｒｅＡ遺伝子を破壊した変異株を作製した。

【0185】

ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５４及び５５のプライマー２６及び２７からなるプライマーセットと、配列番号５６及び５７のプライマー２８及び２９からなるプライマーセットとをそれぞれ用いたＰＣＲ法によって、ａｒｅＡ遺伝子の５’末端上流及びａｒｅＡ遺伝子の３’末端下流の約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。それぞれの断片をあらかじめＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢとＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ａｒｅＡ遺伝子領域欠失株作製用プラスミドｐＫ１８ΔａｒｅＡを作製した。

【0186】

プラスミドｐＫ１８ΔａｒｅＡをＮＧＣ７ΔｖａｎＡ１Ｂ１ΔｖａｎＡ４Ｂ４ΔａｐｈΔｖａｎＡ２Ｂ２ΔｖａｎＡ３Ｂ３株に導入し、ゲノムＤＮＡ上のａｒｅＡ遺伝子の内部領域を欠失したＮＧＣ７ΔｖａｎＡ１Ｂ１ΔｖａｎＡ４Ｂ４ΔａｐｈΔｖａｎＡ２Ｂ２ΔｖａｎＡ３Ｂ３ΔａｒｅＡ株（ＮＧＣ７２９株）を作製した。

【0187】

ａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットをＮＧＣ７２９株のゲノム中に挿入するためのプラスミドを以下の手順により作製した。

【0188】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３４及び３５のプライマー１０及び１１からなるプライマーセットと、配列番号３６及び３７のプライマー１２及び１３からなるプライマーセットをそれぞれ用いたＰＣＲ法によって、ＮＧＣ７株のｖａｎＡ４遺伝子の５’末端上流及びｖａｎＢ４遺伝子の３’末端下流の約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。

【0189】

同様に、プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを鋳型として、配列番号３８及び３９のプライマー１４及び１５からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｔａｃプロモーターの下流にａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットが連結された約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。それぞれの増幅断片を、あらかじめＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１４５、ｐ６９－７３、１９９４を参照）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットをＮＧＣ７２９株のゲノム中に挿入するためのプラスミド（ｐＫ１８ΔｖａｎＡ４Ｂ４：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ）を作製した。

【0190】

常法に従って、作製したプラスミドｐＫ１８ΔｖａｎＡ４Ｂ４：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを、エレクトロポレーション法によりＮＧＣ７２９株に導入し、２５ｍｇ／ＬのＫｍを含むＬＢ寒天培地上で生育可能である株を選抜した。

【0191】

得られたＫｍ耐性株を、２５％のスクロースを含むＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３０℃で２４時間の振盪培養に供した。得られた培養液を、２５％のスクロースを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で静置培養した。コロニーダイレクトＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ上にａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットが挿入されたことが確認できた形質転換体を、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株とした。

【0192】

得られたＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株のそれぞれを、２５ｍｇ／ＬのＫｍを含む、又は含まない１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含む、又は含まない１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁して、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液にＡＶを終濃度が１．０ｍＭになるようにＡＶを添加し、得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＡＶ変換反応に供した。

【0193】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た反応上清について、ＡＶ及びＶＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。

【0194】

ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いた反応結果を図１０Ａに示し、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた反応結果を図１０Ｂに示す。図１０Ａ及び図１０Ｂが示すとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた反応では、両方ともに、１時間の反応でＡＶが完全にＶＡへ変換された。以上のことから、プラスミドでの遺伝子導入及びゲノムＤＮＡへの直接導入によらず、ａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットをＮＧＣ７株のＶＡ生産宿主であるＮＧＣ７２９株に導入することで、ＡＶからのＶＡ生産が可能であることがわかった。

【0195】

また、上記ＡＶ変換反応を、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株のそれぞれについて、ＯＤ_６００が１．０になるように調製した細胞懸濁液１．２ｍＬを用いて行った。

【0196】

ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株の結果を図１１Ａに示し、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株の結果を図１１Ｂに示す。

【0197】

図１１Ａ及び図１１Ｂが示すとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いた場合と比較して、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた場合の方がＡＶからのＶＡの生成速度が速かった。以上のことから、遺伝子をゲノムＤＮＡへ直接導入したＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた方が、ＡＶからのＶＡ生産に適していることがわかった。

【0198】

［８．コドンを最適化したａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子、ａｃｖＦ遺伝子、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子並びに最適なＲＢＳを付加したＤＮＡ配列のＮＧＣ７２９株への導入とＡＶ変換］
ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェアを用いて、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子、ａｃｖＦ遺伝子、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子のコドンが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａゲノム中でのコドン使用頻度と同等になるように塩基配列を設計した。またＲＢＳ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａでの翻訳効率が最大になるように、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子、ａｃｖＦ遺伝子、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子それぞれの開始コドン上流にシャイン・ダルガノ配列を含むＲＢＳ配列をそれぞれ設計した。設計したＤＮＡ塩基配列の合成をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社に委託した。

【0199】

合成されたＤＮＡ塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、配列番号４０及び４１のプライマー１６及び１７からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｃｖＡ ^ｏｐｔ遺伝子及びａｃｖＢ ^ｏｐｔ遺伝子が連結された約３．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0200】

得られた断片をあらかじめＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＳＥＶＡ２４１＿Ｐ _ｌａｃ とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ｐＳＥＶＡａｃｖＡＢ ^ｏｐｔを得た。

【0201】

同様に、合成されたＤＮＡ塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、配列番号４２及び４３のプライマー１８及び１９からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、大腸菌由来ラクトースプロモーターの下流にａｃｖＣ ^ｏｐｔ遺伝子、ａｃｖＤ ^ｏｐｔ遺伝子、ａｃｖＥ ^ｏｐｔ遺伝子及びａｃｖＦ ^ｏｐｔ遺伝子が連結された約４．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0202】

得られた断片をあらかじめＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＳＥＶＡａｃｖＡＢ ^ｏｐｔとＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔを得た。

【0203】

同様に、合成遺伝子が挿入されたプラスミドを鋳型として、配列番号４４及び４５のプライマー２０及び２１からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｖｃｅＡ ^ｏｐｔ遺伝子及びｖｃｅＢ ^ｏｐｔ遺伝子が連結された約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0204】

得られた断片をあらかじめＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＴＳ０９３とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔを得た。

【0205】

得られたプラスミドｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ及びｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔを用いて、ＮＧＣ７２９株を形質転換して、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔ］株を得た。

【0206】

また同様に、プラスミドｐＳＥＶＡａｃｖ及びｐＴＳ０９３ｖｃｅを用いて、ＮＧＣ７２９株を形質転換して、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を得た。

【0207】

得られたＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔ］株及びＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株のそれぞれを、２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含むＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、一晩の振盪培養（１８０ｒｐｍ）に供した。得られたそれぞれの培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供した。得られたそれぞれの培養液由来の細胞をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄した後、再度ＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液に、終濃度が１．０ｍＭになるようにＡＶを添加し、次いで得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＡＶ変換反応に供した。

【0208】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た反応上清について、ＡＶ及びＶＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。

【0209】

ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた反応結果を図１２Ａに示し、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔ］株を用いた反応結果を図１２Ｂに示す。

【0210】

図１２Ａ及び図１２Ｂが示すとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた場合と比較して、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ ^ｏｐｔ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ ^ｏｐｔ］株を用いた場合の方がＡＶからのＶＡ生成速度が遅く、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子、ａｃｖＦ遺伝子、ｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子のコドンの最適化及び最適なＲＢＳを付加した効果は得られなかった。

【0211】

［９．ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた針葉樹サルファイトリグニン分解物モデルからのＶＡ生産性の評価］
ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株及びＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を、２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む、又は含まないＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、一晩の振盪培養（１８０ｒｐｍ）に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む、又は含まないＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体を、ＭＭｘ－３培地を用いて洗浄し、次いで再度ＭＭｘ－３培地に懸濁して、ＯＤ_６００が１０になるように細胞懸濁液 １ｍＬを調製した。

【0212】

２００ｇ／Ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液０．７５ｍＬ及び針葉樹サルファイトリグニン分解物モデル［２９２ｍＭ バニリン（以下、ＶＮともよぶ。）、８１．５ｍＭ ＡＶ、１２６．５ｍＭ ＶＡ）］０．２ｍＬを含むＭＭｘ－３液体培地［３４．２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４９．３ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ］（２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ及び１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む、又は含まない）１０ｍＬに、初期ＯＤ_６００が０．１になるように細胞懸濁液を添加した。得られた細胞を含む培地を、３０℃の振盪培養に供した。

【0213】

培養開始後、一定時間毎にサンプリングし、培養液のＯＤ_６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＡＶ、ＶＮ、ＶＡ及びグルコースの濃度を測定した。ＯＤ_６００は分光光度計（「ＢＩＯｍａｓｔｅｒ ＸＢ－１０」、ＴＯＭＹ ＳＥＩＫＯ社）を用いて測定した。ＡＶ、ＶＮ及びＶＡの濃度は、上記のＨＰＬＣ分析を用いて測定した。グルコース濃度は、「バイオセンサー ＢＦ－５」（王子計測機器社）を用いて測定した。

【0214】

ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた培養結果を図１３Ａに示し、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた培養結果を図１３Ｂに示す。

【0215】

図１３Ａ及び図１３Ｂに示すとおり、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた反応では、培養６８時間においてもＡＶが残存したのに対し、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた場合は、培養３０時間でＡＶが完全にＶＡへ変換された。

【0216】

以上の結果より、リグニン分解物モデルを用いた培養においても、ＭＨＫ４株のＡＶ変換酵素遺伝子群を用いると、ＳＹＫ－６株由来のＡＶ変換酵素遺伝子群を用いる場合と比べて、ＡＶを速やかにＶＡへ変換できることが示された。

【0217】

また培養６８時間時点でのＶＡ収率は、ＮＧＣ７２９［ｐＳＥＶＡａｃｖ＋ｐＴＳ０９３ｖｃｅ］株を用いた場合は９５．７％であり、ＮＧＣ７２９：：Ｐ _ｔａｃ ：ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ株を用いた場合は９９．４％であった。ＶＡの収率は、［６８時間培養後のＶＡ量（ｍｏｌ）］／［培養開始時点のＡＶ量（ｍｏｌ）＋ＶＮ量（ｍｏｌ）＋ＶＡ量（ｍｏｌ）］×１００（％）から算出した。

【0218】

［１０．ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株の作製］
以下の手順により、ＭＨＫ４株からバニレート Ｏ－デメチラーゼ遺伝子（ｖａｎＡＢ）を破壊した変異株である、ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を作製した。

【0219】

酸素添加型のバニレート Ｏ－デメチラーゼは、オキシゲナーゼコンポーネント（ＶａｎＡ）とオキシドレダクターゼコンポーネント（ＶａｎＢ）とから構成される。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株由来のバニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシゲナーゼコンポーネント（ＶａｎＡ）及びバニレート Ｏ－デメチラーゼ オキシドレダクターゼコンポーネント（ＶａｎＢ）の推定アミノ酸配列と配列同一性が高いアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子をＭＨＫ４株のゲノム配列から検索した。検索の結果、ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡには、ＶａｎＡと８７．９％の配列同一性を示したアミノ酸配列をコードしている遺伝子ｖａｎＡ３（ＰＳＭＨ＿１４４５）、ＶａｎＢと７４．７％の配列同一性を示したアミノ酸配列をコードしている遺伝子ｖａｎＢ３（ＰＳＭＨ＿１４４６）があることを確認した。

【0220】

ｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子のそれぞれの遺伝子セットを欠失させたＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を以下の手順により作製した。遺伝子の欠失は、遺伝子の全領域を欠失させることにより行った。

【0221】

ＭＨＫ４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４６及び４７のプライマー２２及び２３からなるプライマーセットと、配列番号４８及び４９のプライマー２４及び２５からなるプライマーセットとをそれぞれ用いたＰＣＲ法によって、ｖａｎＡ３遺伝子の５’末端上流及びｖａｎＢ３遺伝子の３’末端下流の約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。それぞれの断片をあらかじめＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢとＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアッセンブリーとを用いたシームレスクローニング法により連結させることにより、ｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子の遺伝子領域欠失株作製用プラスミドｐＫ１８ΔｖａｎＡ３Ｂ３を作製した。

【0222】

作製したプラスミドｐＫ１８ΔｖａｎＡ３Ｂ３を、前記記載の方法のとおり、エレクトロポレーション法によりＭＨＫ４株に導入し、２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含むＬＢ寒天培地上で生育可能である株を選抜した。

【0223】

得られたＫｍ耐性株を、１０％のスクロースを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で１６～２４時間の振盪培養に供した。得られた培養液を同培地に再度接種し、培養する操作を３回繰り返した。培養後の培養液を、ＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で静置培養した。コロニーダイレクトＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ上のｖａｎＡ３Ｂ３遺伝子の内部領域が欠失したことが確認できた形質転換体を、ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株とした。

【0224】

［１１．ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株が有するＶＡの分解性の評価］
ＭＨＫ４株及びＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を、それぞれＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、２４時間の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しいＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間の振盪培養に供した。

【0225】

得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＷｘ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液に、終濃度が１．０ｍＭになるようにＶＡを添加し、次いで得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによるＶＡ変換反応に供した。

【0226】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た上清について、ＶＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。図１４に測定結果を示す。

【0227】

図１４に示すとおり、ＭＨＫ４株は添加したＶＡを全て分解したが、ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株はＶＡを分解しなかった。以上の結果より、ｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子にコードされるバニレート Ｏ－デメチラーゼが、ＭＨＫ４株のＶＡ分解に関わる酸素添加型のバニレート Ｏ－デメチラーゼであることがわかった。

【0228】

［１２．ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を用いたＡＶからのＶＡ蓄積性の評価］
ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を、ＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、２４時間の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しいＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間の振盪培養に供した。

【0229】

得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＷｘ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液に、終濃度が１．０ｍＭになるようにＡＶを添加し、次いで得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによるＡＶ変換反応に供した。

【0230】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た上清について、ＡＶ及びＶＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。図１５に測定結果を示す。

【0231】

図１５が示すとおり、２時間の反応でＡＶが完全にＶＡへ変換され、ＶＡが蓄積した。以上のことから、ＭＨＫ４ΔｖａｎＡ３Ｂ３株を用いることで、ＡＶからのＶＡ生産が可能であることがわかった。

【0232】

［１３．ＭＨＫ４株とＳＹＫ－６株のＡＶの分解性の評価］
ＭＨＫ４株及びＳＹＫ－６株を、ＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間又は２４時間の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しいＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間又は２４時間の振盪培養に供した。

【0233】

得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＷｘ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＯＤ_６００が５．０になるように細胞懸濁液１．４ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液に、終濃度が１．０ｍＭになるようにＡＶを添加し、次いで得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによるＡＶ変換反応に供した。

【0234】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た上清について、ＡＶの濃度を測定した。ＡＶの濃度は、上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。図１６に測定結果を示す。

【0235】

図１６が示すとおり、ＭＨＫ４株は、ＳＹＫ－６株に比べて、より迅速にＡＶを分解することがわかった。

【0236】

［１４．ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素の基質範囲］
プラスミドｐＥ１６ａｃｐＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）株に導入し、プラスミドｐＥ１６ａｃｐＢ及びシャペロンプラスミドｐＫＪＥ７をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入した。

【0237】

得られたＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株及びＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ＋ｐＫＪＥ７］を、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液０．１ｍＬを、新しい１００ｍｇ／ＬのＡｍｐを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃でＯＤ_６００が０．５になるまで振盪培養した。ＯＤ_６００が０．５になったら、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度が０．５ｍＭになるように添加し、さらにＦｅＳＯ_４を終濃度が０．１ｍＭになるように添加した。添加後、各菌株を１５℃で２０時間の振盪培養に供した。

【0238】

Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株の培養液由来の細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋３ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ溶液を用いて洗浄した後、再度３０ｍＬの同溶液に懸濁した。ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ＋ｐＫＪＥ７］株の培養液由来の細胞は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を用いて洗浄した後、再度２１０ｍＬの同ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。超音波ホモジナイザーを用いてそれぞれの細胞懸濁液中の細胞を破砕し、破砕後の細胞懸濁液を遠心分離に供して上清を得た。

【0239】

得られたＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＡ］株の細胞破砕後の上清を、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム１ｍＬに送液することにより、Ｈｉｓ×１０融合ＡｃｐＡをカラム担体に結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ＋１００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液を上記カラムに送液して夾雑タンパク質を溶出させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ＋５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液を送液してＨｉｓ×１０融合ＡｃｐＡを含む溶出画分を得た。得られた溶出画分を、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムに通して脱塩処理を行った後、Ｈｉｓ×１０融合ＡｃｐＡを含む画分を回収した。回収した画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ３０ｋＤａ ｃｕｔｏｆｆに通し、溶液量が約０．３ｍＬになるまで濃縮をして、得られた濃縮液を精製ＡｃｐＡ溶液とした。

【0240】

同様に得られたＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥ１６ａｃｐＢ＋ｐＫＪＥ７］株の細胞破砕後の上清を、ＨｉＴｒａｐ ＴＡＬＯＮ ｃｒｕｄｅカラムに送液することにより、Ｈｉｓ×１０融合ＡｃｐＢをカラム担体に結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋１００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液を送液して夾雑タンパク質を溶出させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液を送液してＨｉｓ×１０融合ＡｃｐＢを含む溶出画分を得た。得られた溶出画分を、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムに通して脱塩処理を行った後、Ｈｉｓ×１０融合ＡｃｐＢを含む画分を回収した。回収した画分に３ｍＭとなるようにｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌを加えた後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ３０ｋＤａ ｃｕｔｏｆｆに通し、溶液量が約０．３ｍＬになるまで濃縮をして、得られた濃縮液を精製ＡｃｐＢ溶液とした。得られた各精製タンパク質溶液のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。

【0241】

精製ＡｃｐＡ溶液の終濃度が５０μｇ／ｍＬになり、精製ＡｃｐＢ溶液の終濃度が１３４．３μｇ／ｍＬになり、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の終濃度が０．４ｍＭになり、及び各基質の終濃度が０．２ｍＭになるように５０ｍＭ ＧＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）中で混合し、得られた混合液を３０℃で、１時間反応させた。基質にはそれぞれＡＶ、ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、ＨＡＰ、３’，５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙ－４’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’，５’－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、ＶＡ及びＨＢＡをそれぞれ用いた。反応後、反応液の一部を分取し、等量のアセトニトリルと混合して反応を停止した。得られた反応溶液を遠心分離に供して得た上清に含まれる各基質及び反応産物について、ＨＰＬＣ分析に供した。

【0242】

上記のようにして、各基質を、ＡｃｐＡＢ酵素による酵素反応に供した結果を、図１７ＡＢＣＤＥＦＧＨ及び図１７ＩＪＫＬＭＮＯＰに示す。なお、図１７ＡＢＣＤＥＦＧＨには図１７Ａ～Ｈが含まれ、図１７ＩＪＫＬＭＮＯＰには図１７Ｉ～Ｐが含まれる。具体的には、ＡＶを基質として酵素溶液を含まない条件での反応開始直後及び反応開始１時間後、酵素溶液を含む条件での反応開始１時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図１７Ａに示す。同様に、Ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、ＨＡＰ、３’，５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙ－４’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’，５’－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、ＶＡ及びＨＢＡを基質とした場合のＨＰＬＣクロマトグラムをそれぞれ図１７Ｂ～Ｐに示す。

【0243】

図１７Ａ、図１７Ｃ、図１７Ｅ、図１７Ｋ及び図１７Ｌが示すように、精製ＡｃｐＡ溶液及び精製ＡｃｐＢ溶液からなる酵素溶液を用いた場合は、反応１時間においてそれぞれ保持時間１０．６分、７．９分、５．５分、１２．２分及び１４．７分に変換産物のピークが検出された。このことから、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素は、ＡＶ、ＨＡＰ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ及び４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅの分解能（変換能）を有することがわかった。

【0244】

一方、図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｆ、図１７Ｇ、図１７Ｈ、図１７Ｉ、図１７Ｊ、図１７Ｍ、図１７Ｎ、図１７Ｏ及び図１７Ｐが示すように、ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙ－４’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、３’，４’，５’－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ、ＶＡ及びＨＢＡを基質とした場合は、変換産物のピークが検出されなかったことから、ＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素はこれらの基質の変換能を有さないことがわかった。

【0245】

［１５．ＡｃｐＣ酵素の基質範囲］
ＡｃｐＣ粗酵素溶液の終濃度が５０μｇ／ｍＬになり、基質として用いたα－ヒドロキシアセトバニロン、２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ又はα－ヒドロキシアセトシリンゴンの終濃度が０．２ｍＭになるように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）中で混合し、得られた混合液を３０℃で、１時間反応させた。反応後、反応液の一部を分取し、等量のアセトニトリルと混合して反応を停止した。得られた反応溶液を遠心分離に供して得た上清に含まれる各基質及び反応産物について、上記と同様にＨＰＬＣ分析に供した。

【0246】

上記のようにして、各基質を、ＡｃｐＣ酵素による酵素反応に供した結果を図１８～図２０に示す。具体的には、ＡｃｐＣ粗酵素溶液及びα－ヒドロキシアセトバニロンを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図１８Ａに示し、反応開始１時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図１８Ｂに示す。ＡｃｐＣ粗酵素溶液及び２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図１９Ａに示し、反応開始１時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図１９Ｂに示す。ＡｃｐＣ粗酵素溶液及びα－ヒドロキシアセトシリンゴンを用いた反応開始直後のＨＰＬＣクロマトグラムを図２０Ａに示し、反応開始１時間後のＨＰＬＣクロマトグラムを図２０Ｂに示す。

【0247】

図１８及び図１９が示すように、α－ヒドロキシアセトバニロン及び２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅを基質として用いた場合は、それぞれ反応１時間において保持時間８．２分及び７．１分にＶＡ及びＨＢＡのピークが検出された。このことから、ＡｃｐＣ酵素がα－ヒドロキシアセトバニロンをＶＡへ、２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅをＨＢＡへ変換することがわかった。

【0248】

一方、図２０が示すように、α－ヒドロキシアセトシリンゴンを基質とした場合は、変換産物のピークが検出されなかった。このことから、ＡｃｐＣ酵素はα－ヒドロキシアセトシリンゴンの変換能を有さないことがわかった。

【0249】

［１６．ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを導入したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ株を用いたＨＡＰからのＨＢＡ蓄積性の評価］
ＮＧＣ７株のゲノムにはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株由来のＨＢＡ・モノオキシゲナーゼ遺伝子（ＰＰ＿３５３７）と９４．４％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子であるＰＳＮ＿３５４２（ｐｏｂＡ遺伝子；配列番号５８）が存在することを確認した。そこで、ＨＢＡの分解能を欠失させるためにｐｏｂＡ遺伝子を破壊した変異株を作製した。

【0250】

ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５９及び６０のプライマー３０及び３１からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｐｏｂＡ遺伝子及びその開始コドンから５’末端側に約０．５ｋｂｐ、そして終始コドンから３’末端側に約０．５ｋｂｐを含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１１８にライゲーション反応により連結させることでｐＵＣ１１８＋ｐｏｂＡを作製した。

【0251】

次いで、ｐＵＣ１１８＋ｐｏｂＡをＳａｃＩで切断することにより、ｐｏｂＡの内部領域を約０．３ｋｂｐ欠失させたのちにセルフライゲーションすることでｐＵＣ１１８＋ΔｐｏｂＡを作製した。ｐＵＣ１１８＋ΔｐｏｂＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢにライゲーション反応により連結させ、ｐｏｂＡ遺伝子領域欠失株作製用プラスミドｐＴＳ２２０を作製した。

【0252】

常法に従って、作製したプラスミドｐＴＳ２２０を、エレクトロポレーション法によりＮＧＣ７株に導入し、２５ｍｇ／ＬのＫｍを含むＬＢ寒天培地上で生育可能である株を選抜した。

【0253】

得られたＫｍ耐性株を、１０％のスクロースを含む１０ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬをさらに同培地に接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供する操作を２回繰り返した。得られた培養液をＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で静置培養した。コロニーダイレクトＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ上のｐｏｂＡ遺伝子領域の欠失が確認できた形質転換体を、ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ株とした。

【0254】

プラスミドｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを用いて、得られたＮＧＣ７ΔｐｏｂＡを形質転換して、ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を得た。

【0255】

得られたＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を、２５ｍｇ／ＬのＫｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩の振盪培養に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含む１０ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体をＭＭｘ－３ ｂｕｆｆｅｒに懸濁して、ＯＤ_６００が２．０になるように細胞懸濁液１．２ｍＬを調製した。得られた細胞懸濁液に終濃度が１．０ｍＭになるようにＨＡＰを添加し、得られた混合液を３０℃、１，５００ｒｐｍで振盪することによりＨＡＰ変換反応に供した。

【0256】

反応開始後、一定時間毎にサンプリングし、反応液を遠心分離して得た反応上清について、ＨＡＰ及びＨＢＡの濃度を上記と同様にＨＰＬＣ分析により測定した。

【0257】

ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を用いたＨＡＰからＨＢＡへの変換反応の結果を図２１に示す。図２１が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株は、２４時間の反応で約８４％のＨＡＰをＨＢＡへ変換した。以上のことから、ａｃｐＣ ^ｏｐｔ／ａｃｐＡ ^ｏｐｔ／ａｃｐＢ ^ｏｐｔ遺伝子セットをＮＧＣ７株のＨＢＡ生産宿主であるＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ株に導入することで、ＨＡＰからのＨＢＡ生産が可能であることがわかった。

【0258】

［１７．ａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔを導入したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ株を用いたＨＡＰ及びＡＶの混合物からのＨＢＡ生産性の評価］
ＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ［ｐＳＥＶＡａｃｐＣＡＢ ^ｏｐｔ］株を、２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含むＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、一晩の振盪培養（１８０ｒｐｍ）に供した。得られた培養液０．１ｍＬを新しい２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍを含むＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃、１６時間の振盪培養に供した。得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収し、得られた菌体を、ＭＭｘ－３培地を用いて洗浄し、次いで再度ＭＭｘ－３培地に懸濁して、ＯＤ_６００が１０になるように細胞懸濁液 １ｍＬを調製した。

【0259】

２００ｇ／Ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液０．７５ｍＬ、１００ｍＭ ＨＡＰ溶液 ０．１ｍＬ、１００ｍＭ ＡＶ溶液 ０．１ｍＬを含むＭＭｘ－３液体培地［３４．２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４９．３ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ］（２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ及び１５ｍｇ／Ｌ Ｔｃを含む）１０ｍＬに、初期ＯＤ_６００が０．１になるように細胞懸濁液を添加した。得られた細胞を含む培地を、３０℃の振盪培養に供した。

【0260】

培養開始後、一定時間毎にサンプリングし、培養液のＯＤ_６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＨＡＰ、ＡＶ、ＨＢＡ、ＶＡ及びグルコースの濃度を測定した。ＯＤ_６００は分光光度計（「ＢｉｏＳｐｅｃ－ｍｉｎｉ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＣＯ．Ｌｔｄ．）を用いて測定した。ＨＡＰ、ＡＶ、ＨＢＡ及びＶＡの濃度は、上記のＨＰＬＣ分析を用いて測定した。グルコース濃度は、上記のバイオセンサー ＢＦ－５を用いて測定した。

【0261】

ＨＡＰ及びＡＶの混合物からのＨＢＡ生産試験の培養結果を図２２に示す。図２２に示すとおり、培養７２時間においてＨＡＰ及びＡＶが完全に消費され、ＨＢＡのみが蓄積した。これにより、ＮＧＣ７株のＨＢＡ生産宿主であるＮＧＣ７ΔｐｏｂＡ株に導入することで、ＨＡＰ及びＡＶの混合物から、ＨＢＡのみを蓄積できることが示された。

【0262】

なお、培養７２時間時点でのＨＢＡ収率は、１０２％であった。ＨＢＡの収率は、７２時間培養後のＨＢＡ量（ｍｏｌ）／培養開始時点のＨＡＰ量（ｍｏｌ）×１００（％）から算出した。

【0263】

［１８．まとめ］
上記例１～例１７を通じて、以下の事項が確認された。
日本各地からサンプリングした土壌から、ＡＶを資化する新しい菌株であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＨＫ４株を単離した。
ＭＨＫ４株は、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＳＹＫ－６株が有するＡＶ変換酵素遺伝子群（ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＤ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子及びａｃｖＦ遺伝子並びにｖｃｅＡ遺伝子及びｖｃｅＢ遺伝子）のうち、ａｃｖＡ遺伝子、ａｃｖＢ遺伝子、ａｃｖＣ遺伝子、ａｃｖＥ遺伝子及びａｃｖＦ遺伝子並びにｖｃｅＢ遺伝子と配列同一性が３０％以上ある遺伝子を有していなかった。
ＭＨＫ４株は、ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子を保有することにより、ＡＶをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換した。
ＭＨＫ４株は、ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を保有することにより、ＡＶをＶＡへ変換した。
ａｃｐＡ遺伝子及びａｃｐＢ遺伝子の遺伝子産物であるＡｃｐＡ酵素及びＡｃｐＢ酵素によって、ＡＶをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換した。
ａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の遺伝子産物であるＡｃｐＡ酵素、ＡｃｐＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素によって、ＡＶをＶＡへ変換した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＮＧＣ７株にＳＹＫ－６株が有するＡＶ変換酵素遺伝子群を導入した形質転換体はＡＶのＶＡへの変換効率は低かったのに対して、ＮＧＣ７株にＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入した形質転換体はＡＶのＶＡへの変換効率は非常に高かった。
ＮＧＣ７株にＳＹＫ－６株が有するＡＶ変換酵素遺伝子群を導入した形質転換体はＡＶを炭素源として増殖しなかったのに対して、ＮＧＣ７株にＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入した形質転換体はＡＶを炭素源として増殖した。
ｖａｎＡＢ遺伝子を欠失したＮＧＣ７株へのＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子の導入により、プラスミド導入及びゲノム導入のいずれの導入形式であっても、ＡＶからＶＡへの変換が可能であった。
１．６ｍＭ ＡＶを含む針葉樹サルファイトリグニン分解物モデルを用いた場合、ＮＧＣ７株にＳＹＫ－６株が有するＡＶ変換酵素遺伝子群を導入した形質転換体はＡＶをほとんど消費しなかったのに対して、ＮＧＣ７株にＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入した形質転換体はＡＶを完全に消費した。また、この場合のＶＡの収率は、ＮＧＣ７株にＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入した形質転換体の方が大きかった。
ＭＨＫ４株は、ｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子が発現することにより、ＶＡを資化した。
ＭＨＫ４株のｖａｎＡ３遺伝子及びｖａｎＢ３遺伝子を欠失した形質転換体は、ＡＶからＶＡを生産した。
ＭＨＫ４株は、ＳＫＹ－６株に比べて、より迅速にＡＶを分解した。
ＡｃｐＡＢ酵素は、ＡＶ、ＨＡＰ、３’，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ及び４’－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｏｐｈｅｎｏｎｅに対して分解活性を有した。
ＡｃｐＣ酵素は、α－ヒドロキシアセトバニロン及び２，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅをそれぞれＶＡ及びＨＢＡへ変換した。
ｐｏｂＡ遺伝子を欠失したＮＧＣ７株にＭＨＫ４株のａｃｐＡ遺伝子、ａｃｐＢ遺伝子及びａｃｐＣ遺伝子を導入した形質転換体は、ＨＡＰ単独又はＨＡＰ及びＡＶの混合物からＨＢＡを生産した。
ＡｃｐＡＢ酵素及びＡｃｐＣ酵素並びにこれらを発現する微生物を用いれば、リグニンのアルカリ酸化分解により得られるＨ核由来アセトフェノン類（例えば、ＨＡＰなど）及びＧ核由来アセトフェノン類（例えば、ＡＶなど）から、分子内にカルボキシル基及びヒドロキシ基を有することからモノマーとして利用可能な有用物質を生産できることがわかった。

【0264】

［１９．配列表］
配列表に記載の配列は以下の表６Ａ～表６Ｄに示すとおりである。

【0265】

【表6A】

【0266】

【表6B】

【0267】

【表6C】

【0268】

【表6D】

【産業上の利用可能性】

【0269】

本発明の一態様の遺伝子、微生物、形質転換微生物及び製造方法を利用することによって、リグニン由来の芳香族化合物であるアセトバニロンを含むバイオマスから、バニリン酸が得られる。バニリン酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、耐熱性及び剛性のあるプラスチック、コーティング剤などの用途があるバニリン酸誘導体の原料として利用することができる。同様に、本発明は、リグニン由来の芳香族化合物であるＨＡＰからＤＨＡＰを介してＨＢＡを得るために利用することができる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17ABCDEFGH】

【図17IJKLMNOP】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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