(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024109749
(43)【公開日】2024-08-14
(54)【発明の名称】眼障害におけるＷＮＴシグナル伝達の調節
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240806BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240806BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240806BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20240806BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P27/02
A61K39/395 N
C07K16/24
C07K16/18
A61K45/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024082595
(22)【出願日】2024-05-21
(62)【分割の表示】P 2021547095の分割
【原出願日】2020-02-11
(31)【優先権主張番号】62/803,835
(32)【優先日】2019-02-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519271621
【氏名又は名称】スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ヤン リー
(72)【発明者】
【氏名】シェンジアン トゥー
(72)【発明者】
【氏名】スンジン リー
(72)【発明者】
【氏名】ウェン－チェン イェー
(57)【要約】
【課題】眼障害におけるＷＮＴシグナル伝達の調節を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子を用いて眼障害を治療する方法を提供する。特に、眼障害は網膜症である。また、投与方法および医薬組成物も提供される。
【選択図】図５
【解決手段】本発明は、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子を用いて眼障害を治療する方法を提供する。特に、眼障害は網膜症である。また、投与方法および医薬組成物も提供される。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月１１日に出願された米国仮出願第６２／８０３，８３５号の優先権を主張するものであり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年２月１１日に出願された米国仮出願第６２／８０３，８３５号の優先権を主張するものであり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙媒体ではなくテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿０１３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２０２０年２月１０日に作成され、約２７ＫＢで、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙媒体ではなくテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿０１３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２０２０年２月１０日に作成され、約２７ＫＢで、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【0003】
本発明は、様々な眼障害を治療するためのＷＮＴシグナル調節因子を提供する。特に、網膜症としても知られる眼の血管疾患のための治療が提供される。
【背景技術】
【0004】
脊椎動物の網膜は、眼底にある神経組織の薄い層である。これは、視覚刺激の検出を担い、視覚情報処理のための最初のステーションである。その適切な機能のために、網膜血管構造は、栄養素および酸素の不可欠な供給源である。網膜は代謝的に活性が非常に高い。膨大な量の酸素を消費する光受容体のために、網膜は、１グラムあたり体内の他のどの器官よりも最も高い酸素消費速度を示す。効果的な栄養素および酸素として機能するために、網膜血管構造は、網膜内に、一方の側に三つの平面の血管叢、他方に脈絡膜毛細血管からなる固定概念的な構造として位置付けられる。内部血管新生は、最初は網膜の硝子体表面で始まり、原始血管叢を生じる。血管叢の表面の放射状の拡張後、網膜への血管の垂直方向の貫入は、内網状層（ＩＰＬ）および外網状層（ＯＰＬ）で二つの追加的な網膜内毛細血管叢を形成する。血管と網膜との間の機能的および構造的関係により、迷入血管発生または血管障害は、網膜の機能に直接関連しており、これは様々なタイプの網膜症および変性を引き起こす。
【0005】
ＷＮＴシグナル伝達は、網膜の血管発生の重要な経路として関連付けられてきた。ヒトおよび齧歯類の研究からの遺伝的証拠の増加が、網膜血管構造におけるＷＮＴシグナル伝達の重要性をさらに裏付けている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １．ｐｉｉ：Ｓ１３５０－９４６２（１８）３００４６－６）。ＷＮＴシグナル伝達に関与する受容体（Ｆｚｄ４、Ｌｒｐ５、Ｔｓｐａｎ１２）またはリガンド（ノルリン）のいずれかをコードする遺伝子におけるヒトの突然変異は、様々な遺伝性硝子体網膜症をもたらす。遺伝子（Ｆｚｄ４、Ｌｒｐ５、Ｔｓｐａｎ１２、ノルリン）の個々の遺伝的な突然変異マウスも、ヒト網膜症に見られる迷入血管構造の典型的な表現型を示している。これにより、網膜症の疾患進行をより良く理解できただけでなく、ＷＮＴシグナル調節を介して網膜症治療の可能性も開かれた。
【0006】
網膜症、特に糖尿病性網膜症は、早期と後期に分けることができる。非増殖性網膜症としても知られる早期では、網膜の微小血管にわずかな悪化がある場合があり、血管の一部が膨張して、周囲の網膜組織に液体が漏出する場合がある。後期の網膜症は、網膜領域における著しい新血管新生のほかに、微小動脈瘤および出血を伴う（例えば、Ｇｒａｄｉｎｇ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｒｅｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｏｌｏｒ Ｆｕｎｄｕｓ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ－Ａｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｉｒｌｉｅ Ｈｏｕｓｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．（１９９１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，９８（５），７８６－８０６を参照）。
【0007】
家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）は、眼内血管構造の形成が乏しい遺伝性眼疾患である。ＦＥＶＲ患者の５０％超が、Ｆｚｄ４、Ｌｒｐ５、Ｔｓｐａｎ１２、またはノルリンをコードする遺伝子のうちの一つに突然変異を示す。ＷＮＴシグナルリガンドであるノルリンは、眼内での正常な網膜血管新生のためにＦｚｄ４／Ｌｒｐ５／Ｔｓｐａｎ１２から構成される受容体複合体を介して内皮細胞にシグナルを伝達する。しかしながら、ＦＥＶＲ患者では、ノルリン、Ｆｚｄ４、Ｌｒｐ５、または／およびＴｓｐａｎ１２のうちの一つをコードする遺伝子の突然変異が、網膜内で未成熟の血管発生を引き起こす。結果としてもたらされる無血管領域の形成は、網膜虚血性領域を作り出し、これは網膜への一次損傷である。虚血状態は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）の産生を誘発し、新血管新生および血管房形成につながる。新たに生成された異常な形成された血管は容易に破壊されて、滲出および出血による網膜の二次損傷につながる可能性がある。糖尿病性網膜症（ＤＲ）の疾患進行はまた、ＦＥＶＲまたは他の遺伝性血管奇形または欠乏性疾患と類似している。高血糖症は網膜血管損傷を誘発し、血管閉塞、虚血、新血管新生、および出血につながり、最終的に網膜症につながる。
遺伝子データは、眼内での適切な血管構造の確立におけるＷＮＴシグナル伝達の重要性を示唆してはいるが、発生後のＷＮＴシグナル伝達の活性化が血管構造の改善につながるかどうかは不明である。一定の報告では、ＷＮＴシグナル伝達を作動するよりもむしろ拮抗することが網膜症に有益であると示唆さえしている。したがって、網膜症の疾患進行とＷＮＴシグナルの関与を理解することは、新しい治療の可能性にもつながる。網膜症の適切な治療のために、病期に応じて、ＷＮＴ作動薬および拮抗薬シグナル伝達を制御する必要性が存在する。本発明は、網膜症の病期進行の異なる段階において、ＷＮＴシグナル伝達の作動作用および拮抗作用を制御する方法を提供する。
遺伝子データは、眼内での適切な血管構造の確立におけるＷＮＴシグナル伝達の重要性を示唆してはいるが、発生後のＷＮＴシグナル伝達の活性化が血管構造の改善につながるかどうかは不明である。一定の報告では、ＷＮＴシグナル伝達を作動するよりもむしろ拮抗することが網膜症に有益であると示唆さえしている。したがって、網膜症の疾患進行とＷＮＴシグナルの関与を理解することは、新しい治療の可能性にもつながる。網膜症の適切な治療のために、病期に応じて、ＷＮＴ作動薬および拮抗薬シグナル伝達を制御する必要性が存在する。本発明は、網膜症の病期進行の異なる段階において、ＷＮＴシグナル伝達の作動作用および拮抗作用を制御する方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１８ Ｄｅｃ １．ｐｉｉ：Ｓ１３５０－９４６２（１８）３００４６－６
【非特許文献2】Ｇｒａｄｉｎｇ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｒｅｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｏｌｏｒ Ｆｕｎｄｕｓ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ－Ａｎ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｉｒｌｉｅ Ｈｏｕｓｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．（１９９１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，９８（５），７８６－８０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、部分的には、網膜症の徴候における迷入血管形成を調節するためのＷＮＴシグナル伝達の作動薬および拮抗薬の使用に基づく。
【0010】
本発明は、対象者への改変ＷＮＴシグナル調節因子の投与を含む、網膜症に罹患した対象者を治療する方法を提供する。一定の実施形態では、ＷＮＴシグナル調節因子は、改変ＷＮＴ作動薬または改変ＷＮＴ拮抗薬である。さらなる実施形態では、改変ＷＮＴ作動薬およびＷＮＴ拮抗薬は、一つ以上のＦｚｄ受容体に結合する結合組成物と、一つ以上のＬＲＰ受容体またはＴｓｐａｎ１２受容体に結合する結合組成物とを含む。さらなる実施形態では、改変ＷＮＴ作動薬の結合組成物は、Ｆｚｄ４結合組成物、Ｌｒｐ５結合組成物、Ｌｒｐ６結合組成物、ＬＲＰ５／６結合組成物、およびＴｓｐａｎ１２結合組成物からなる群から選択される。
【0011】
一部の実施形態では、改変ＷＮＴ作動薬またはＷＮＴ拮抗薬は、網膜症の早期および／または後期に独立して投与される。代替的な実施形態では、ＷＮＴ作動薬およびＷＮＴ拮抗薬は、網膜症の早期および／もしくは後期に順次投与されるか、またはＷＮＴ作動薬およびＷＮＴ拮抗薬は、網膜症の早期および／もしくは後期で同時投与される。さらなる実施形態では、ＷＮＴ作動薬は、ＷＮＴ拮抗薬の前または後に投与される。
【0012】
一部の実施形態では、ＷＮＴ作動薬および／またはＷＮＴ拮抗薬は、ＶＥＧＦおよび／またはＡｎｇ２のいずれかに特異的な結合組成物と共に投与される。一定の実施形態では、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２に特異的な結合組成物は、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２活性の拮抗薬である。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦ拮抗薬は、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ラムシルマブ、およびタニビルマブからなる群から選択される。その他の実施形態では、Ａｎｇ２拮抗薬は、ネスバクマブ、ＡＭＧ７８０、およびＭＥＤＩ３６１７からなる群から選択される。
【0013】
一定の実施形態では、網膜症は網膜血管疾患である。一部の実施形態では、網膜血管疾患は、血管発生の阻害によって引き起こされる。代替的な実施形態では、網膜血管疾患は、過剰な血管新生によって引き起こされる。特定の実施形態では、網膜血管疾患は、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、滲出性硝子体網膜症、ノリエ病、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、網膜静脈閉塞症、およびコーツ病からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図2-1】図２Ａ～図２Ｈは、示されたＷＮＴ代理分子およびＲＳＰＯで処理した細胞内でのＷＮＴシグナル伝達活性を、ＳｕｐｅｒＴｏｐ Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）測定法によって測定したものを示すグラフである。図２Ａ～図２Ｄは、様々なｍｏｎｏ－ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物および２０ｎＭのＲＳＰＯで処理した非形質移入ＨＥＫ２９３細胞内でのＷＮＴシグナル伝達活性がほとんどない、または全くないことを示す。対照的に、図２Ｅ～図２Ｈは、様々なＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物および２０ｎＭのＲＳＰＯで処理したときに、ＷＮＴシグナル伝達活性を有するヒトＦＺＤ４遺伝子で形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を示す。
【図2-2】同上。
【図4-1】図４Ａ～図４Ｐは、ＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するｂＥｎｄ．３細胞（血管研究で使用されるマウス脳内皮細胞株）内でのＷＮＴシグナル伝達活性（図４Ａ～図４Ｄ）およびＡｘｉｎ２発現（図４Ｅ～図４Ｈ）、またはＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＨＲＭＥＣ（初代ヒト網膜微小血管内皮細胞）内でのＷＮＴシグナル伝達活性（図４Ｉ～図４Ｌ）およびＡｘｉｎ２発現（図４Ｍ～図４Ｐ）を示す。
【図4-2】同上。
【図4-3】同上。
【図4-4】同上。
【図6】図６Ａ～図６Ｆは、ｂＥｎｄ．３細胞（図６Ａ～図６Ｃ）またはＨＲＭＥＣ細胞（図６Ｄ～図６Ｆ）内での、ＲＳＰＯ添加の有る場合、または無い場合の、ＷＮＴシグナル伝達活性に対する、様々なＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物を用いた処理の効果を示す。
【図7A】図７Ａ～図７Ｂは、酸素誘導性網膜症モデルのラットモデルにおける様々なＦＺＤ４ ＷＮＴ代理分子を使用した実験設計を示す。図７Ａは、酸素誘導性網膜症モデルのタイムラインを示し、図７Ｂは、研究群の詳細を提供する。
【図7B】同上。
【図8A】図８Ａ～図８Ｂは、抗ＶＥＧＦまたは ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理分子のいずれかで治療した後の網膜血管成長および病理学的網膜前新血管新生を示す。図８Ａは、ラット網膜フラットマウントの蛍光染色を示す。図８Ｂは、血管成長および新血管新生のコンピュータ支援画像解析による定量分析を示す。
【図8B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0015】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形の用語である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、対応する複数形への言及を含む。
【0016】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により組み込まれる。
【0017】
Ｉ．定義
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性への結合、遺伝子発現を刺激する能力への結合、抗原活性への結合、他の分子の活性の調節などを記述する、または指す場合がある。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば、接着を調節または維持する活性、または細胞、例えば、細胞膜または細胞骨格の構造を維持する活性も指す場合がある。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］などを意味しうる。
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性への結合、遺伝子発現を刺激する能力への結合、抗原活性への結合、他の分子の活性の調節などを記述する、または指す場合がある。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば、接着を調節または維持する活性、または細胞、例えば、細胞膜または細胞骨格の構造を維持する活性も指す場合がある。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］などを意味しうる。
【0018】
本明細書で使用される場合、「投与する」、または「導入する」、または「提供する」という用語は、対象者の細胞（複数可）、組織、および／または器官への、または対象者への組成物の送達を指す。こうした投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われうる。
【0019】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原エピトープに特異的に結合するために必要な可変領域配列を含む単離した結合体または組換え結合剤を意味する。したがって、抗体は、例えば、特異的標的抗原に結合するなど、望ましい生物活性を呈する任意の形態の抗体またはその断片である。それ故に、最も広範な意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびにｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ２を含むがこれらに限定されない抗体断片を、望ましい生物活性を示す限り、網羅する。
【0020】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、例えば、無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線形抗体（例えば、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合断片、すなわち「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化する能力を反映する意味である残留「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋結合可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。
【0021】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合されることができる分子または分子の一部を指し、３０追加的に、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成するために動物中でさらに使用することができる。一定の実施形態では、結合剤（例えば、ＷＮＴ代理分子もしくはその結合領域、またはＷＮＴ拮抗薬）は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識するときに、抗原を特異的に結合するとされる。
【0022】
本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原、特に一つ以上のＦｚｄ受容体、またはＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６に結合する、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖、またはＶＨＨ／ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（Ｎａｂ）のうち少なくとも一つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。これに関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、一つ以上のＦｚｄ受容体、またはＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合する抗体由来のＶＨおよびＶＬのうち１個、２個、３個、４個、５個、または６個すべてのＣＤＲを含みうる。
【0023】
本明細書で使用される場合、「生物学的活性」および「生物学的に活性」という用語は、細胞中の特定の生物学的要素に帰する活性を指す。例えば、ＷＮＴ作動薬またはその断片もしくは変異体の「生物学的活性」は、ＷＮＴシグナルを模倣または増強する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体の生物学的活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体が、例えば、結合、酵素活性など、その本来の機能を達成する能力を指す。第三の例として、遺伝子調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列などの生物学的活性は、調節要素またはその機能的断片もしくは変異体が、それぞれ、それが動作可能に連結される遺伝子の発現の翻訳を調節、すなわち、促進、増強、または活性化する能力を指す。
【0024】
本明細書で使用される場合、「二機能性抗体」という用語は、一つの抗原部位に対する特異性を有する第一のアームと、異なる抗原部位に対する特異性を有する第二のアームとを含む抗体を指し、すなわち、二機能性抗体は二重特異性を有する。
【0025】
本書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７－５４０（１９８３）を参照）によって、二つの異なるモノクローナル抗体の化学的共役（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４（６０１２）：６２８－６３１（１９８５）を参照）によって、あるいはＦｃ領域に突然変異を導入するノブイントゥホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）または類似したアプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）によって生成される完全長抗体であって、複数の異なる免疫グロブリン種をもたらし、そのうちどれか一つのみが機能的二重特異性抗体であるものを指す。二重特異性抗体は、その二つの結合アームのうちの一つ（一対のＨＣ／ＬＣ）で一つの抗原（またはエピトープ）に結合し、その第二のアーム（異なる対のＨＣ／ＬＣ）で異なる抗原（またはエピトープ）に結合する。この定義により、二重特異性抗体は、二つの別個の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方）を有し、それが結合する各抗原に対して一価である。
【0026】
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどにおいて必要とされることを意味するが、例えば、組成物、方法、キットなどを特許請求の範囲内で形成するためにその他の要素を含んでもよい。例えば、プロモーターに動作可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサー要素、他の遺伝子、リンカードメインなどの他の要素を含みうる発現カセットである。
【0027】
「から本質的になる」とは、例えば、組成物、方法、キットなどの基礎特性および新規特性に実質的に影響しない、指定された材料または工程に記述された組成物、方法、キットなどの範囲の限定を意味する。例えば、プロモーターに動作可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子と、ポリアデニル化配列と「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響を与えない限り、例えばリンカー配列などの追加的な配列を含んでもよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」、変異体または突然変異体であるポリペプチド断片は、それが誘導された完全長無感作ポリペプチドに基づき、列挙された配列について、配列の境界部にプラスマイナス約１０個のアミノ酸残基を有し、例えば、列挙された境界のアミノ酸残基よりも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個少ない残基数、または列挙された境界のアミノ酸残基よりも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個多い残基数のアミノ酸配列を有する。
【0028】
「からなる」とは、請求項に特定されていない任意の要素、工程、または成分の組成物、方法、またはキットからの除外を意味する。例えば、列挙された配列「からなる」ポリペプチドまたはポリペプチドドメインは、列挙された配列のみを含有する。
【0029】
「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与える場合があり、事実上、増強または抑制しうる。当該技術分野で公知の制御要素としては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、一定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、普通はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始する能力を有するＤＮＡ領域である。
【0030】
「発現ベクター」は、本明細書に記載される、または当該技術分野で公知のベクター、例えばプラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどであり、目的の遺伝子産物をコードする領域を含み、意図された標的細胞における遺伝子産物の発現に影響を与えるために使用される。発現ベクターはまた、標的内の遺伝子産物の発現を促進するために、コード化領域に動作するように可能に連結された制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的化配列なども含む。制御要素と、発現のために動作可能に連結される遺伝子（複数可）との組合せは、時に、「発現カセット」と称され、その多数が当該技術分野で公知であり、かつ利用可能であり、または当該技術分野で利用可能な構成要素から容易に構築することができる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの枠組みをする四つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触しうるが、抗原結合部位への、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基へのＶ領域の折り畳みは、ＦＲが主に担う。ＦＲ内では、一定のアミノ残基および一定の構造的特徴は非常によく保存される。これに関して、すべてのＶ領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突き出たループモチーフとして示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼす、一定の「正準の」構造に保存されたＦＲの構造的領域があることが一般的に認識される。さらに、一定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
【0032】
「個体」、「宿主」、「対象者」、「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト霊長類（類人猿およびヒトを含む）、哺乳類競技動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウマ）、哺乳類家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳類ペット（イヌ、ネコなど）、および齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれに限定されない哺乳動物を指す。
【0033】
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然起源および非天然起源）を含む、均質な抗体集団を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、その変異体、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成も含み、この免疫グロブリン分子は、本明細書に開示のＷＮＴ代理分子を含めた、エピトープに結合する必要な特異性および能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む。これは、抗体の供給源または抗体が作製される様態（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、遺伝子導入動物などによる）に関して限定されることは意図していない。この用語は、免疫グロブリン全体だけでなく、上記で「抗体」の定義の下で記述されている断片なども含む。
【0034】
本明細書で使用される場合、「未変性」または「野生型」という用語は、野生型細胞、組織、器官または生物体内に存在するヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）、または遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）を指す。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、未変性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の突然変異体を指し、すなわち、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列との１００％未満の配列同一性を有する。言い換えると、変異体は、基準ポリヌクレオチド配列、例えば、未変性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する少なくとも一つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、変異体は、完全長未変性ポリヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、または７０％以上の配列同一性、例えば、完全長未変性ポリヌクレオチド配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドでもよい。別の例として、変異体は、完全長未変性ポリペプチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、完全長未変性ポリペプチド配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドでもよい。変異体はまた、基準（例えば、未変性）配列の断片と７０％以上の配列同一性、例えば、未変性配列と７５％または８０％以上の同一性（８５％、９０％、または９５％以上など）、例えば、９８％または９９％の同一性を共有する基準（例えば未変性）配列の変異体断片も含んでもよい。
【0035】
「動作するように連結」または「動作可能に連結」は、遺伝的要素の並置を指し、要素は、それらが予期される様態での動作が許容される関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターは、コード領域に動作するように連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在しうる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との共役を含む。
【0037】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組立の前または後に付与されうる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、互換的に二本鎖分子および一本鎖分子を指す。別途指定または要求が無い限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、または予測される、二つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
【0038】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する一定のパーセントの「配列同一性」を有し、これは、二つの配列を比較するときに整列させると、その塩基またはアミノ酸のパーセントが同じであることを意味する。配列類似性は、多くの異なる様態で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを使用して整列させることができる。別の整列アルゴリズムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（米国ウィスコンシン州マディソンにある、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全子会社）で入手可能なＦＡＳＴＡである。整列のための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ）の一部門）に記載がある。特に興味深いのは、配列のギャップを許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列のギャップを許容するアルゴリズムの一つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ整列法を使用したＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照。
【0039】
興味深いのは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１））の局所相同性アルゴリズムを使用して配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティは、一般に１～５の範囲であり、普通は２～４であり、多くの実施形態では３である。ギャップ伸長ペナルティは、一般的に約０．０１～０．２０の範囲であり、多くの事例では０．１０である。プログラムは、比較するために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを使用して決定されることが好ましい。このプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（米国ウィスコンシン州マディソン）からも入手可能である。
【0040】
別の目的のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載がある。配列同一性のパーセントは、以下のパラメータに基づき、ＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、および結合ペナルティ：３０．０。
【0041】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を指令するために十分な最小配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、ユビキタスであってもよく、これは広範囲の細胞、組織および種内で強力な活性であるか、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であることを意味する。プロモーターは、継続的活性を意味する「構成的」であってもよく、またはプロモーターが生物的要因または非生物的要因の存在または非存在によって活性化することも、または無効化することもできることを意味する「誘導性」であってもよい。また、本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と連続的であってもよく、または連続的でなくてもよいエンハンサー配列も含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を与え、未変性遺伝子の５’領域または３’領域に位置しうる。
【0042】
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え体」は、ポリヌクレオチドが、クローニング工程、制限工程またはライゲーション工程、および自然界に存在するポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。
【0043】
「治療」、「治療する」などの用語は、本明細書では、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味するために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する、例えば、疾患またはその症状が対象者に発生する可能性を低減するという点で、予防的であってもよく、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で、治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を網羅し、これには（ａ）疾患にかかりやすい場合があるにもかかわらず、まだ罹患していると診断されていない対象者における疾患の発生の防止、（ｂ）疾患の阻害、すなわち、その進行の阻止、または（ｃ）疾患の緩和、すなわち、疾患の退縮の発生が含まれる。治療剤は、疾患または損傷の開始前、開始中、または開始後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に興味深い。こうした治療は、罹患した組織における機能が完全に喪失する前に実施されることが望ましい。主題の療法は、疾患の症候期の間、および一部の事例では、疾患の症候期後に投与されることが望ましい。
【0044】
本明細書で使用される場合、「網膜血管疾患」という語句は、眼、特に、迷入血管構造形成によって引き起こされる網膜の疾患である。一部の態様では、迷入血管構造は、血管構造の発生の阻害によって引き起こされ、他の態様では、迷入血管構造は過剰な血管新生によって引き起こされる。
【0045】
本発明の実施は、別途指示がない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、分子生物学技法、微生物学、生化学および免疫学の従来の技法を採用する。こうした技法は、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）などの文献中に詳細に説明されており、これらの各々は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0046】
本発明のいくつかの態様が、例示のための適用例を参照して以下に説明される。当然のことながら、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、および方法が明記されている。しかしながら、当業者であれば、本発明を、特定の詳細のうちの一つ以上を用いずに、または他の方法を用いて実施することができることを容易に認識するであろう。本発明は、いくつかの行為は、異なる順序で、および／または他の行為もしくは事象と同時に起こる場合があるため、行為または事象の例示された順序付けによって限定されない。さらに、例示されたすべての行為または事象が、本発明に従って方法論を実施するために必要とされるわけではない。
【0047】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述する目的のみのためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形（“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”）は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む」（“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”）、「有する」（“ｈａｖｉｎｇ”、“ｈａｓ”、“ｗｉｔｈ”）、という用語、またはそれらの変形は、発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のいずれかに使用される限りにおいて、こうした用語は、「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）という用語と類似した様態で包含的であることが意図される。
【0048】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、当該技術分野の慣行によれば、「約」とは、１以内、または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が明細書および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が仮定されるべきである。
【0049】
本明細書で言及される全ての刊行物は、その刊行物がそれに関して引用される方法および／または資料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限りにおいて、組み込まれた出版物の任意の開示に優先することが理解される。
【0050】
あらゆる任意的な要素を除外するように、特許請求の範囲を立案しうることが、さらに注記される。したがって、この記述は、請求項要素の列挙、または「負」の限定の使用に関連した、「単に」、「のみ」などの排他的用語を使用するための先行的基礎としての役割を果たすことを意図している。
【0051】
別途指示が無い限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者が使用することになるのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法を採用する。
【0052】
ＩＩ．一般
本発明は、ＦＥＶＲおよび他の遺伝的障害、ＤＲ、およびＡＭＤを含むがこれに限定されない、網膜症を治療するためにＷＮＴシグナルを調節する方法を提供する。特に、本発明は、網膜症の進行における迷入新血管新生を阻害するためのＷＮＴ／ｂ－カテニン作動薬および／または拮抗薬を提供する。
本発明は、ＦＥＶＲおよび他の遺伝的障害、ＤＲ、およびＡＭＤを含むがこれに限定されない、網膜症を治療するためにＷＮＴシグナルを調節する方法を提供する。特に、本発明は、網膜症の進行における迷入新血管新生を阻害するためのＷＮＴ／ｂ－カテニン作動薬および／または拮抗薬を提供する。
【0053】
ＷＮＴ（「ウィングレス関連統合部位」、または「ウィングレスおよびＩｎｔ－１」、または「ウィングレス－Ｉｎｔ」）リガンドおよびそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛、肺、およびその他多くの組織を含む、数多くの不可欠な器官および組織の発生、ホメオスタシス、および再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１２４８０１２によって検討される）。ＷＮＴシグナル伝達経路の調節は、変性疾患および組織損傷の治療の可能性がある。
【0054】
治療としてのＷＮＴシグナル伝達を調節することに対する課題のうちの一つは、複数のＷＮＴリガンドおよびＷＮＴ受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ １－１０（Ｆｚｄ１－１０）の存在であり、多くの組織が複数の重複するＦｚｄを発現する。正準のＷＮＴシグナルはまた、Ｆｚｄに加えて、様々な組織で広く発現される共受容体として、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）にも関与している。
【0055】
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ １～４は、ＷＮＴシグナルを増幅するリガンドのファミリーである。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎの各々は、一方の末端に亜鉛およびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）またはリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）を含有し、他方の末端にロイシンリッチな反復を含有するＧタンパク質結合受容体４－６（ＬＧＲ４－６）を含有する受容体複合体を介して作用する（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ ２０１４，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７－１６１により検討される）。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎはまた、追加的な作用機序を通して作用する場合もある。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、分解のためにＷＮＴ受容体（Ｆｚｄ１－１０およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６）を特異的に標的化する二つの膜結合型のＥ３リガーゼである。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４－６への結合は、三元複合体のクリアランスまたは隔離を引き起こし、これが、ＷＮＴ受容体からＥ３リガーゼを除去し、ＷＮＴ受容体を安定化し、結果としてＷＮＴシグナルの増強をもたらす。各Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎは、二つのＦｕｒｉｎドメイン（１および２）を含有し、Ｆｕｒｉｎドメイン１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、Ｆｕｒｉｎドメイン２はＬＧＲ４－６に結合する。Ｆｕｒｉｎドメイン１および２を含有するＲ－ｓｐｏｎｄｉｎの断片は、ＷＮＴシグナル伝達を増幅するのに十分である。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ効果はＷＮＴシグナルに依存するが、ＬＧＲ４－６およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の両方は様々な組織に広く発現するため、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎの効果は組織特異的ではない。
【0056】
一部の実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達拮抗薬または作動薬は、一つ以上のＦｚｄ受容体を結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を阻害または増強する結合剤またはエピトープ結合ドメインを含むことができる。一定の実施形態では、薬剤または抗体は、それが結合するヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（複数可）内のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に特異的に結合する。さらに、ＬＲＰに対するエピトープ結合ドメインを含有する拮抗薬性結合剤も使用することができる。一部の実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニン拮抗薬は、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３および一つ以上のＦＺＤ受容体または一つ以上のＬＲＰ共受容体を結合する結合剤またはエピトープ結合ドメインを保有し、ＦＺＤ受容体またはＬＲＰ受容体の分解を促進する。この分子はまた、標的化のための細胞型特異的エピトープに結合する結合ドメインを含有することもできる。Ｅ３リガーゼ作動薬性抗体またはその断片は、単一分子であってもよく、または他のＷＮＴ拮抗薬、例えばＦｚｄ受容体拮抗薬、ＬＲＰ受容体拮抗薬などと組合わされてもよい。
【0057】
当該技術分野で周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域上に位置する少なくとも一つのエピトープ結合ドメインを介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片であって、エピトープ結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＤＶＤ－Ｉｇ、その合成変異体、天然起源の変異体、エピトープ結合ドメインを含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む、免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成を含む断片も包含する。遺伝子融合（国際特許出願第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，１９９３）によって構築される多価または多重特異性断片の「ダイアボディ」もまた、本明細書で企図される抗体の特定の形態である。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディも本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９－５８８３，１９８８）；ＰＣＴ出願第ＵＳ９２／０９９６５号；国際特許出願第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９－１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６を参照。
【0058】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を産生し、そのうちの二つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。本開示の一定の実施形態による使用のためのＦｖ断片は、ＩｇＭ免疫グロブリン分子、また稀にＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質分解切断によって生成することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当該技術分野で公知の組換え技法を使用してより一般的に誘導される。Ｆｖ断片は、未変性抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持する抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６－２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６。
【0059】
一定の実施形態では、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体が企図される。例えば、Ｋａｐｐａ ｂｏｄｙｓ（Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９－５７（１９９７））；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １３：５３０５－９（１９９４））；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０：６４４４－８（１９９３））；またはジャヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５－５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１－５２（１９９２））は、望ましい特異性を有する抗体の選択に関して、本明細書の教示に従い、標準的な分子生物学の技法を使用して調製されうる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体が作製されてもよい。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲおよびフレームワーク領域を含みうる一方、二重特異性抗体は、一つの結合ドメインを介して一つ以上のＦｚｄ受容体に特異的に結合し、第二の結合ドメインを介して第二の分子に特異的に結合するものが作製されてもよい。これらの抗体は、組換え分子生物学的技法を介して生成されてもよく、または物理的に一緒に共役されてもよい。
【0060】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：ＶＬヘテロ二量体であり、これはペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される。Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９－５８８３。抗体Ｖ領域に由来する、自然に凝集したが、化学的に分離された軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳むｓｃＦｖ分子に変換するための化学構造を識別するための、数多くの方法が記述されてきた。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号、および同第５，１３２，４０５号、ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照。
【0061】
一定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ダイアボディの形態である。ダイアボディはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免役グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一のドメインと、免役グロブリン重鎖の結合領域を含む第二のドメインを含み、二つのドメインはリンクしているが（例えば、ペプチドリンカーによって）、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、多量体内の一つのポリペプチドの第一のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第二のドメインとの会合によって形成される（国際特許出願第９４／１３８０４号）。
【0062】
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））からなる。
【0063】
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６－４４９（１９９３））で（例えば、化学的に、または混成ハイブリドーマから調製）製造できる、従来の二重特異性抗体であってもよく、または上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域なしで、構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する。
【0064】
二重特異性ダイアボディは、大腸菌中で容易に構築および発現することができるため、二重特異性の全抗体とは対照的に、特に有用でありうる。適切な結合特異性のダイアボディ（および抗体断片などのその他多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（国際特許出願第９４／１３８０４号）を使用してライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、例えば、抗原Ｘに対して向けられた特異性で一定に保たれる場合、他方のアームが変化し、適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製することができる。二重特異性の全抗体は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）工学（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６－６２１（１９９６））によって作製されうる。
【0065】
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供されてもよい。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ Ｕｔｒｅｃｈｔ（オランダ）を参照、例えば、米国特許公開第２００９０２２６４２１号も参照）。この独自の抗体技術は、現在の小さい抗体フォーマットより長い治療ウィンドウが予期される安定したより小さい抗体フォーマットを作り出す。ＩｇＧ４抗体は不活性とみなされ、それ故に免疫系と相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を除去することによって修飾されて、対応する無傷のＩｇＧ４（ＧｅｎＭａｂ、ユトレヒト）に対して別個の安定性特性を有する半分子断片を得てもよい。ＩｇＧ４分子を半減させると、同種抗原（例えば、疾患標的）に結合できる一つの領域のみがＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上に残り、したがってＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の一つの部位にのみに一価的に結合する。
【0066】
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖のＣＤＲセットを含み、それぞれが重鎖と軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）セットの間に介在し、それらはＣＤＲに支持を提供し、相互に対してＣＤＲの空間的関係を画定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の三つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から生じるこれらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々のＣＤＲセットを含む、６個のＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを、本明細書では「分子認識ユニット」と呼ぶ。多数の抗原－抗体複合体の結晶解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広範囲な接触を形成することが示され、最も広範囲な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触である。それ故に、分子認識ユニットは、抗原結合部位の特異性を主に担う。
【0067】
本明細書で使用される場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの枠組みをする四つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合抗原と接触しうるが、抗原結合部位への、特にＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基へのＶ領域の折り畳みは、ＦＲが主に担う。ＦＲ内では、一定のアミノ残基および一定の構造的特徴は非常によく保存される。これに関して、すべてのＶ領域配列は、約９０個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突き出たループモチーフとして示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、ＣＤＲループの折り畳み形状に影響を及ぼす、一定の「正準の」構造に保存されたＦＲの構造的領域があることが一般的に認識される。さらに、一定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関与することが知られている。
【0068】
「モノクローナル抗体」は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然起源および非天然起源）を含む、均質な抗体集団を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体を包含するだけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、その変異体、モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子のその他任意の修飾構成も含み、この免疫グロブリン分子は、本明細書に開示のＷＮＴ代理分子を含めた、エピトープに結合する必要な特異性および能力の抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む。これは、抗体の供給源または抗体が作製される様態（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、遺伝子導入動物などによる）に関して限定されることは意図していない。この用語は、免疫グロブリン全体だけでなく、上記で「抗体」の定義の下で記述されている断片なども含む。
【0069】
一定の実施形態では、本開示の抗体は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の形態を取りうる。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）技術は、当初は、ラクダ科（例えば、ラクダおよびラマ）が重鎖のみからなる完全機能性抗体を保有し、それゆえ軽鎖を欠くという発見および同定に続いて開発された。これらの重鎖のみの抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）と二つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３）を含む。クローン化および単離された単一可変ドメインは、完全な抗原結合能力を有し、かつ非常に安定している。これらの単一可変ドメインは、その固有の構造的および機能的な特性により、「Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」の基礎を形成する。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、単一遺伝子によりコードされ、かつ例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照）、カビ（例えば、アスペルギルス属またはトリコデルマ属）、および酵母（例えば、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ハンゼヌラ属またはピキア属（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照）などほぼすべての原核生物および真核生物宿主において効率よく生成される。生成プロセスは拡張可能であり、何キログラムもの量のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が生成されてきた。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、長い保存寿命を有する、すぐに使用できる溶液として製剤化されうる。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）法（例えば、国際特許出願第０６／０７９３７２号を参照）は、Ｂ細胞の自動化されたハイスループット選択に基づいて、望ましい標的に対してＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を生成するための独自の方法である。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、ラクダ科特異的な重鎖のみの抗体の単一ドメイン抗原結合断片である。ＶＨＨ抗体とも呼ばれるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、典型的には約１５ｋＤａの小さいサイズを有する。
【0070】
企図される別の抗体断片は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）であり、これは二つのモノクローナル抗体の機能と特異性を一つの分子実体に組合わせる改変タンパク質である。ＤＶＤ－Ｉｇは、各軽鎖および重鎖が、ＩｇＧ中の一つの可変ドメインではなく、短いペプチド結合を介して縦一列に並んだ二つの可変ドメインを含有することを除いて、ＩｇＧ様分子として設計される。二つの可変ドメインの融合の配向およびリンカー配列の選択は、分子の機能的活性および効率的な発現に重要である。ＤＶＤ－Ｉｇは、製造および精製のための単一の種として、従来の哺乳類発現システムによって産生することができる。ＤＶＤ－Ｉｇは、親抗体の特異性を有し、インビボで安定であり、ＩｇＧ様の物理化学的および薬物動態学的な特性を示す。ＤＶＤ－Ｉｇおよびその作製方法は、Ｗｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０－１２９７（２００７）に記載されている。
【0071】
一定の実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化される。これは、一般的に組換え技法を使用して調製され、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全可変ドメイン、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植されたＣＤＲのみのいずれかを含んでもよい。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、または一つ以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。これはヒト個体における免疫原としての定常領域を除去するが、異質の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：４２２０－４２２４；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ （１９８８）８６：１００２９－１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３－３２７）。本明細書に開示される抗ＦｚｄまたはＬＲＰ抗体のヒト化のための例示的な方法は、米国特許第７，４６２，６９７号に記載されている方法を含む。
【0072】
別のアプローチは、ヒト由来の定常領域の提供だけでなく、ヒト形態に可能な限り近づけるように再形成するための可変領域の修飾にも焦点を当てる。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、問題のエピトープに応答して変化する三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することと、所与の種において相対的に保存され、かつＣＤＲの足場を推定的に提供する、四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接して結合能力を決定することとが知られている。特定のエピトープに関して非ヒト抗体が調製される場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、修飾されるヒト抗体中に存在するＦＲ上に移植することによって、「再構成」または「ヒト化」することができる。このアプローチの様々な抗体への適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１－８５６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３－３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：１２４－１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：４１８１－４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６－２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２８６９－２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５－４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９－１１５４によって報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体由来の６個のＣＤＲをすべて含有するヒト化マウス抗体）を保存する。その他の実施形態では、ヒト化抗体は、もとの抗体に関して改変される一つ以上のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個、６個）を有し、これはまた、もとの抗体からの一つ以上のＣＤＲ「に由来する」一つ以上のＣＤＲとも称される。
【0073】
一定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体であってもよい。これに関して、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に動作可能に連結された、または別の方法で融合された抗体の抗原結合断片を含む。一定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源のものである。その他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、ならびにＩｇＭを含む親抗体とは異なるＩｇクラス由来であってもよい。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの一つ以上からのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体に関して上述したように、キメラ抗体の抗原結合断片は、本明細書に記載される抗体のＣＤＲのうちの一つ以上（例えば、本明細書に記載される抗体の１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲ）のみを含んでもよく、または可変ドメイン全体（ＶＬ、ＶＨまたはその両方）を含んでもよい。
【0074】
免疫グロブリンＣＤＲおよび可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、およびその更新版（インターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で閲覧可）により決定されうる。
【0075】
一定の実施形態では、拮抗薬または作動薬結合剤は、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、一定の実施形態では、複数のＦＺＤに結合する本明細書に記載されるＦＺＤ結合剤または抗体は、約１００ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下のＫＤでそれらのＦＺＤに結合する。一定の実施形態では、結合剤は、一つ以上のその標的抗原に、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ２０以下のＥＣ５０で結合する。
【0076】
本発明の抗体または他の薬剤は、当該技術分野で公知の任意の方法によって特異的結合について試験することができる。使用することができる免疫測定法としては、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析、ＦＡＣＳ分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫放射線測定法、蛍光免疫測定法、およびプロテインＡ免疫測定法などの技法を使用した競合および非競合の測定システムが挙げられるが、これらに限定されない。かかる測定法は、当該技術分野で日常的であり周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。この全文は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0077】
例えば、標的抗原への抗体の特異的結合は、ＥＬＩＳＡ法を使用して決定されてもよい。ＥＬＩＳＡ測定法は、抗原の調製と、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの抗原によるコーティングと、抗体または他の結合剤（酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に共役されたもの）のウェルへの追加と、一定期間の培養と、抗原の存在の検出とを含む。一部の実施形態では、抗体または薬剤は、検出可能な化合物に共役されず、代わりに、第一の抗体または薬剤を認識する第二の共役された抗体がウェルに追加される。一部の実施形態では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体または薬剤でウェルをコーティングして、検出可能な化合物に共役された第二の抗体を、コーティング済のウェルに抗原を追加した後で、追加することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを増加させるように修飾されうるパラメータだけでなく、当該技術分野で公知の他のＥＬＩＳＡ法の変形についても知識を有するであろう（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ １１．２．１を参照）。
【0078】
標的抗原に対する抗体または他の薬剤の結合親和性および抗体－抗原相互作用のオフレートは、競合結合測定法によって決定することができる。競合結合測定法の一例は、放射免疫測定法であり、この試験法は、非標識抗原の量の増加が存在する中での、目的の抗体を用いた、標識抗原（例えば、Ｆｚｄ、ＬＲＰ）またはその断片もしくは変異体の培養と、それに続く標識抗原に結合された抗体の検出とを含む。抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット解析によってデータから決定することができる。一部の実施形態では、ＢＬＩ分析を使用して、抗体または薬剤の結合オンレートおよびオフレートを決定する。ＢＬＩ動態解析は、表面上に抗原が固定化されたチップからの抗体の結合および解離の分析を含む。
【0079】
一定の実施形態では、ＷＮＴ作動薬は、その全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開公報第ＷＯ２０１９１２６３９８号に開示されているものから選択される。特定の実施形態では、ＷＮＴ作動薬は、図１Ａに図示した構造を有し、かつ／または図１Ｂに開示されたＷＮＴ作動薬のいずれかについて開示された配列を含む。一部の実施形態では、ＷＮＴ作動薬は、配列番号１～８のいずれかに開示される配列に対し、少なくとも９０％の同一性（例えば、９５％、９８％、または１００％の同一性）を有する配列を含み、配列中、リーダー配列は斜体で表示され、リンカー配列は下線が付いており、ＶＨＨ／ｓｄＡｂ配列またはＶＨ配列またはＶＬ配列は太字である。
【化1-1】
【化1-2】
【0080】
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載されるＷＮＴ拮抗薬分子または作動薬分子と、一つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物も開示されている。
本明細書に記載されるＷＮＴ拮抗薬分子または作動薬分子と、一つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む医薬組成物も開示されている。
【0081】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子をコードする核酸配列と、一つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物も開示されている。一定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。その他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コード配列に動作するように連結されたプロモーターを含む発現カセットである。
【0082】
一部の実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬は、ＷＮＴシグナル伝達経路中の様々な分子に結合する様々なエピトープ結合断片を組み込んだ、改変組換えポリペプチドである。例えば、ＷＮＴ拮抗薬は、Ｆｚｄ４受容体および／またはＬＲＰ受容体に結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を阻害する抗体またはその断片であってもよい。Ｆｚｄ４およびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ／ｓｄＡｂｓなど）は、一つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に結合されてもよい。
【0083】
逆に、改変ＷＮＴ作動薬／拮抗薬は、ＷＮＴシグナル伝達経路の様々な分子に結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を増強するエピトープ結合断片を組み込んだ組換えポリペプチドとすることもできる。例えば、ＷＮＴ作動薬は、Ｆｚｄ受容体および／またはＬＲＰ受容体に結合し、かつＷＮＴシグナル伝達を増強する抗体またはその断片とすることができる。Ｆｚｄ抗体断片およびＬＲＰ抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ／ｓｄＡｂｓなど）は、一つの分子上で、直接または様々なサイズのリンカーと一緒に結合されてもよい。
【0084】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子をコードする核酸配列と、一つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含むポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、例えばウイルスベクターを含む医薬組成物も開示されている。一定の実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬分子をコードする核酸配列、およびＷＮＴ作動薬をコードする核酸配列は、例えば発現カセットなどの同じポリヌクレオチド中にある。
【0085】
本開示は、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子をコードする核酸に動作するように連結されたプロモーターと、一つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を含む医薬組成物をさらに企図する。特定の実施形態では、医薬組成物は、ＷＮＴ拮抗薬およびＷＮＴ作動薬をコードする核酸配列に動作するように連結されたプロモーターを含む、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。一定の実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬分子をコードする核酸配列、およびＷＮＴ作動薬分子をコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド、例えば、発現カセット、および／または同じ細胞中に存在する。特定の実施形態では、細胞は、治療される対象者から得られた異種細胞または自己細胞である。
【0086】
特定の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。本開示は、第一の活性薬剤としてのＷＮＴ拮抗薬分子の送達のための第一の分子、および第二の分子としてのＷＮＴ作動薬を含む医薬組成物を企図する。第一の分子および第二の分子は、同じタイプの分子であってもよく、または異なるタイプの分子であってもよい。例えば、一定の実施形態では、第一および第二の分子はそれぞれ独立して以下のタイプの分子、すなわち、ポリペプチド、有機小分子、第一または第二の活性薬剤（随意にＤＮＡまたはｍＲＮＡ、随意に修飾ＲＮＡ）をコードする核酸、第一または第二の活性薬剤（随意に発現ベクターまたはウイルスベクター）をコードする核酸配列を含むベクター、第一または第二の活性薬剤（随意に発現カセット）をコードする核酸配列を含む細胞から選択されうる。
【0087】
主題の分子は、単独で、または組み合わせて、一般的に安全で、非毒性で、かつ望ましい製剤の調製に有用な、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、および試薬と組み合わせることができ、哺乳類、例えば、ヒトまたは霊長類の使用に許容可能な賦形剤を含む。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合、ガス状とすることができる。こうした担体、希釈剤、および賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。補助的な活性化合物も、製剤に組み込むことができる。製剤に使用される溶液または懸濁液は、無菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など）、抗菌化合物（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）、抗酸化物質（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート化合物（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）、洗剤（凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ ２０など）、および張度を調整するための化合物（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は無菌である。
【0088】
医薬組成物は、無菌注射用溶液または分散液の即時調整のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末をさらに含みうる。静脈内投与のために、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。一部の事例では、組成物は無菌であり、かつシリンジに引き込むこと、またはシリンジから対象者に送達することができるように、流体であるべきである。一定の実施形態では、これは、製造および保存の条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）を組成物中に含むことによって、内部組成物の持続性の吸収をもたすことができる。
【0089】
無菌液は、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬抗体またはその抗原結合断片（またはポリヌクレオチドをコードするもの、もしくはポリヌクレオチドを含む細胞）を、必要に応じて、上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせを用いて適切な溶媒中に必要量で組み込み、その後に濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体と、上記で列挙したものから必要とされる他の成分とを含有する無菌媒体に組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末に加えて、前もって滅菌濾過されたその溶液から追加的な任意の望ましい成分をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。
【0090】
一実施形態では、医薬組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤など、身体からの急速な排除から抗体またはその抗原結合断片を保護する担体を用いて調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用できる。こうした製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容可能な担体としても使用できる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【0091】
投与の容易さおよび用量の均一性のために、医薬組成物を単位剤形で製剤化することが有利でありうる。本明細書で使用される場合、単位剤形は、治療される対象者のための単位用量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して望ましい治療効果を生成するために計算された所定量の活性抗体またはその抗原結合断片を含有する。単位剤形の仕様は、抗体またはその抗原結合断片の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびにこうした活性抗体またはその抗原結合断片を、個体の治療のために配合する当該技術分野に固有の制限によって決定付けられ、かつそれらに直接的に依存する。
【0092】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー（例えば、シリンジ、例えば、プレフィルドシリンジ）内に、投与説明書と一緒に入れることができる。
【0093】
本開示の医薬組成物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時には、生物学的に活性な抗体またはその抗原結合断片を（直接的または間接的に）提供することができる任意の他の化合物を包含する。
【0094】
本開示は、本明細書に記載されるＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子の薬学的に許容可能な塩を含む。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本開示の化合物の生理学的および薬学的に許容可能な塩、すなわち、親化合物の望ましい生物活性を保持し、かつそれに対して望ましくない毒性効果を付与しない塩を指す。様々な薬学的に許容可能な塩が当該技術分野で公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（およびその最近の版）、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載がある。また、適切な塩の検討のためには、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ”ｂｙ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００２）を参照。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成される。
【0095】
陽イオンとして使用される金属としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。アミンは、Ｎ－Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９を参照）。前述の酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を、従来の様態で塩を生成するのに十分な量の望ましい塩基と接触させることによって調製される。遊離酸型は、塩形態を酸と接触させ、従来的の様態で遊離酸を単離することによって再生されてもよい。遊離酸型は、極性溶媒への溶解性などの一定の物理的特性において、それらのそれぞれの塩形態とは多少異なるが、それ以外は、塩は、本開示の目的のために、それぞれの遊離酸と同等である。
【0096】
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、治療的に有効な量のＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子またはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸塩およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝剤、防腐剤、ならびに他のタンパク質と混合したものを含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖類などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。この製剤は、４℃で少なくとも６カ月間安定であることが好ましい。
【0097】
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、無菌水、およびＧｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７に記載のあるものなど当業者に公知のその他の緩衝剤などの緩衝剤を含む。緩衝剤のｐＨは６．５～７．７５の範囲内であってもよく、好ましくは７～７．５であり、最も好ましくは７．２～７．４である。
【0098】
ＩＶ．使用方法
本開示はまた、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子を使用して、例えば、ＷＮＴシグナル伝達経路を調節し、例えば、ＷＮＴシグナル伝達を増減させる方法、および様々な治療的設定でのＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子の投与のための方法を提供する。本明細書において、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子を使用した治療方法が提供される。一つの実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子は、不適切または制御不能なＷＮＴシグナル伝達に関与する疾患を有する対象者に提供される。
本開示はまた、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子を使用して、例えば、ＷＮＴシグナル伝達経路を調節し、例えば、ＷＮＴシグナル伝達を増減させる方法、および様々な治療的設定でのＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子の投与のための方法を提供する。本明細書において、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子を使用した治療方法が提供される。一つの実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子は、不適切または制御不能なＷＮＴシグナル伝達に関与する疾患を有する対象者に提供される。
【0099】
一定の実施形態では、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子は、組織または細胞におけるＷＮＴシグナル伝達経路を遮断または増強するために使用されうる。ＷＮＴシグナル伝達経路の拮抗作用は、細胞または組織におけるＷＮＴシグナル伝達の減少または阻害を含みうる。ＷＮＴシグナル伝達経路の作動作用は、例えば、組織または細胞におけるＷＮＴシグナル伝達の増加またはＷＮＴシグナル伝達の増強を含みうる。それ故に、一部の態様では、本開示は、細胞においてＷＮＴシグナル伝達経路を拮抗／作動する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に開示されるＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子またはその薬学的に許容可能な塩との、組織または細胞の接触を含み、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子は、ＷＮＴシグナル伝達経路拮抗薬／作動薬である。一部の実施形態では、接触は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで生じる。特定の実施形態では、細胞は培養細胞であり、接触はインビトロで生じる。
【0100】
ＷＮＴ拮抗薬／作動薬分子は、網膜症の治療に使用されうる。特に、ＷＮＴシグナル伝達の活性化は、眼の血管発生中の網膜血管新生にとって必要である。ノルリン、Ｆｚｄ４、Ｌｒｐ５、またはＴｓｐａｎ１２の遺伝子欠失は、表在網膜表面上の血管発生だけでなく、網膜の深層への血管の貫入をも有意に退縮させる。さらに、未成熟な血管新生により生成された無血管領域は、虚血誘導性新血管新生を引き起こす。したがって、ＷＮＴ作動薬または／および拮抗薬の適時の制御された投与は、網膜症の疾患進行を退縮させるだけでなく、疾患の改善にもつながることになる。特定の実施形態では、ＷＮＴ作動薬／拮抗薬は、対象者の網膜症の疾患進行の早期または後期のいずれかで投与される。
【0101】
ＷＮＴ作動薬および拮抗薬性の両方は、単剤療法として単独に、または順次に投与されてもよい。網膜の無血管領域を示す病気の発症の早期で作動薬を投与すると、血管形成を刺激／安定化し、血管を無血管因子から保護することになる。一方で、新血管新生を示す後期に拮抗薬を投与すると、網膜の迷入血管再生を阻害する可能性がある。したがって、作動薬および拮抗薬の両方の順次治療は、疾患を調節するための一つの可能性のある選択肢である。代表的な投与スケジュールでは、作動薬がまず無血管化期に投与され、その後、新血管新生期に拮抗薬が適用される。逆の役割を試験するために、ＷＮＴ作動薬および拮抗薬を、逆配列順序で対象者に投与する。しかしながら、血管構造の安定化に対するＷＮＴの可能性のある効果を考慮すると、新血管新生期における作動薬の投与も検討される。
【0102】
網膜血管疾患には、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、滲出性硝子体網膜症、ノリエ病、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、網膜静脈閉塞症、およびコーツ病が含まれる可能性があるが、これらに限定されない。
【0103】
本発明はまた、ＦＥＶＲおよび／またはＤＲに対する公知の治療との併用治療を提供する。例えば、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬は、抗ＶＥＧＦ抗体を含むが、これに限定されない網膜症に対する現在の療法と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体はまた、対象者にＷＮＴ作動薬／拮抗薬と組み合わせても投与される。低酸素誘導性ＶＥＧＦおよび Ａｎｇ２発現は、病理学的新血管新生の重要な手がかりであり、実際に、拮抗薬Ａｎｇ２抗体は、網膜症患者の治療用に検討されている（Ｇａｄｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１５ Ａｕｇ；５６（９）：５３９０－４００）。抗ＶＥＧＦ抗体または抗Ａｎｇ２抗体は、本発明の分子と順次または同時に投与することができる。ＶＥＧＦ拮抗薬には、限定されないが、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ラムシルマブ、およびタニビルマブが含まれ、Ａｎｇ２拮抗薬には、限定されないが、ネスバクマブ、ＡＭＧ７８０、およびＭＥＤＩ３６１７が含まれる。
【0104】
さらなる実施形態では、拮抗薬および／または作動薬の分子はまた、網膜組織特異的受容体または細胞表面分子を認識する組織標的化部分、例えば、抗体またはその断片を組み込んでもよい。
【0105】
治療剤（例えば、ＷＮＴ拮抗薬／作動薬）は、疾患または損傷の開始前、開始中、または開始後に投与されてもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に興味深い。こうした治療は、罹患した組織における機能が完全に喪失する前に実施されることが望ましい。主題の療法は、疾患の症候期の間、および一部の事例では、疾患の症候期後に投与されることが望ましい。一部の実施形態では、主題の方法は、治療的利益、例えば、障害の発症の防止、障害の進行の停止、障害の進行の逆転などをもたらす。一部の実施形態では、主題の方法は、治療的利益が達成されたことを検出する工程を含む。当業者であれば、こうした治療有効性の手段が、修飾される特定の疾患に適用可能であることを理解し、また治療有効性の測定に使用する適切な検出方法を認識するであろう。
【0106】
本明細書において参照される、および／または出願データシートに列挙される、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0107】
前述から、当然のことながら、本開示の特定の実施形態は、例示の目的で本明細書に記述されているが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされうる。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【0108】
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照して最もよく理解されるが、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【実施例0109】
実施例１
Ｉ．一般的方法
分子生物学における標準方法が記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ。標準方法は、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．にも記載があり、これは細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異原性（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について記載されている。
Ｉ．一般的方法
分子生物学における標準方法が記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ。標準方法は、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．にも記載があり、これは細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異原性（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について記載されている。
【0110】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製の方法が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ｐｐ．４５－８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（上記）。リガンド／受容体の相互作用を特徴解析するための標準的な技法が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。
【0111】
蛍光活性化細胞ソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含むフローサイトメトリー用の方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ’ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照。核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、および抗体を含む、例えば、診断試薬として使用するための核酸の修飾に適した蛍光試薬が、利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ。
【0112】
免疫系の組織学の標準方法が記載されている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，Ｐａ．；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照。
【0113】
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列の整列を決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）；Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１６：７４１－７４２； Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ１６：７４１－７４２；Ｗｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７－１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３－４６９０を参照。
【0114】
ＩＩ．ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物
単一特異性ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物（３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、３ＳＤ１０－３６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６、および４ＳＤ１－３６）を、ＰＣＴ特許公開公報第２０１９１２６３９８号に記載されているとおりに構築した。図１Ａは、使用したＷＮＴ代理分子の構造の図形表現を提供し、図１Ｂは、ＷＮＴ代理物中に存在するＦｚｄ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを示し、示されたＷＮＴ代理物中に存在する配列を提供する表である。ＦＺＤ４受容体の特異性を、以下に記載するとおりに試験した。
単一特異性ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物（３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、３ＳＤ１０－３６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６、および４ＳＤ１－３６）を、ＰＣＴ特許公開公報第２０１９１２６３９８号に記載されているとおりに構築した。図１Ａは、使用したＷＮＴ代理分子の構造の図形表現を提供し、図１Ｂは、ＷＮＴ代理物中に存在するＦｚｄ結合ドメインおよびＬＲＰ結合ドメインを示し、示されたＷＮＴ代理物中に存在する配列を提供する表である。ＦＺＤ４受容体の特異性を、以下に記載するとおりに試験した。
【0115】
ＷＮＴシグナル伝達活性は、以前に報告したように、ＷＮＴ応答性プロモーター（２９３ＳＴＦ）によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＨＥＫ２９３細胞株（２９３ＳＴＦ）を使用して測定された（例えば、Ｊａｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ５４５：２３４－２３７）を参照。簡潔に述べると、２９３ＳＴＦ細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルプレート中のウェル当たり１０，０００個の密度で播種し、次いで２０ｎＭのＲｓｐｏと共に、３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、４ＳＤ１－３、または４ＳＤ１－２６により処理した。細胞を、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、活性を、供給業者が提案する手順を使用して、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。データは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。ＦＺＤ４の過剰発現について、細胞をＣＭＶプロモーター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製ＯＨｕ２１８０７）下でヒトＦＺＤ４遺伝子を含有するプラスミドで過渡的に形質移入し、その後、形質移入の２４時間後にＳＴＦ測定法用に９６ウェルプレートに分割した。図２Ａ～図２Ｄは、非形質移入２９３ＳＴＦ細胞においてＷＮＴシグナル伝達活性がないことを示す。対照的に、ＦＺＤ４受容体で過渡的に形質移入された細胞は、ＷＮＴシグナル伝達を示した（図２Ｅ～図２Ｈ）。
【0116】
親またはＦＺＤ４過剰発現２９３ＳＴＦ細胞からのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４００４）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１７５４０５０）を使用して産生された。ヒトＦＺＤ４発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４４４４９６３）およびＨｓ００２０１８５３＿ｍ１ ＦＺＤ４プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して測定された。値は、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｍ１プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して構成的なＡＣＴＩＮ Ｂ遺伝子の発現に対して正規化した。図３は、ＦＺＤ４の発現に対する、細胞を過渡的に形質移入するＦＺＤ４の遺伝子発現レベルを図示する。
【0117】
ＩＩＩ．追加細胞株におけるＷＮＴ活性
ＷＮＴシグナル伝達活性を、ｂＥｎｄ．３（血管研究で使用されるマウス脳内皮細胞株）またはＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＨＲＭＥＣ（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：初代ヒト網膜微小血管内皮細胞）細胞を使用して測定した。細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーターをコードするＳＴＦプラスミドを用いて、最小限のプロモーターおよび七つのＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位のコンカテマーの制御下で過渡的に形質移入された。形質移入細胞を、処置の２４時間前に９６ウェルプレート中のウェル当たり１０，０００個の密度で播種し、次いで３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６、またはＷＮＴ３ａにより処理した。細胞を、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、活性を、供給業者が提案する手順を使用して、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。データは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。図４Ａ～図４Ｈは、ｍｏｎｏＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物で処理されたｂＥｎｄ．３細胞におけるＷＮＴシグナル伝達活性およびＡｘｉｎ２発現の増加を示す。図４Ｉ－４Ｐは、ＨＲＭＥＣ細胞における類似のＷＮＴシグナル伝達とＡｘｉｎ２発現の増加を示す。
ＷＮＴシグナル伝達活性を、ｂＥｎｄ．３（血管研究で使用されるマウス脳内皮細胞株）またはＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するＨＲＭＥＣ（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：初代ヒト網膜微小血管内皮細胞）細胞を使用して測定した。細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーターをコードするＳＴＦプラスミドを用いて、最小限のプロモーターおよび七つのＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位のコンカテマーの制御下で過渡的に形質移入された。形質移入細胞を、処置の２４時間前に９６ウェルプレート中のウェル当たり１０，０００個の密度で播種し、次いで３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６、またはＷＮＴ３ａにより処理した。細胞を、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、活性を、供給業者が提案する手順を使用して、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。データは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。図４Ａ～図４Ｈは、ｍｏｎｏＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物で処理されたｂＥｎｄ．３細胞におけるＷＮＴシグナル伝達活性およびＡｘｉｎ２発現の増加を示す。図４Ｉ－４Ｐは、ＨＲＭＥＣ細胞における類似のＷＮＴシグナル伝達とＡｘｉｎ２発現の増加を示す。
【0118】
ｂＥｎｄ．３およびＨＲＭＥＣ細胞由来のＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４００４）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１７５４０５０）を使用して生成した。ＨＲＭＥＣで示されたヒト遺伝子発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４４４４９６３）、およびＨｓ００２６８９４３＿ｓ１ ＦＺＤ１、Ｈｓ００３６１４３２＿ｓ１ ＦＺＤ２、Ｈｓ００１８４０４３＿ｍ１ ＦＺＤ３、Ｈｓ００２０１８５３＿ｍ１ ＦＺＤ４、Ｈｓ００２５８２７８＿ｓ１ ＦＺＤ５、Ｈｓ００１７１５７４＿ｍ１ ＦＺＤ６、Ｈｓ００２７５８３３＿ｓ１ ＦＺＤ７、Ｈｓ００２５９０４０＿ｓ１ ＦＺＤ８、Ｈｓ００２６８９５４＿ｓ１ ＦＺＤ９、Ｈｓ００２７３０７７＿ｓ１ ＦＺＤ１０、Ｈｓ００１８２０３１＿ｍ１ ＬＲＰ５、Ｈｓ００２３３９４５＿ｍ１ ＬＲＰ６、Ｈｓ００６１０３４４＿ｍ１ ＡＸＩＮ２プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して測定した。値は、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｍ１プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して構成的なＡＣＴＩＮ Ｂ遺伝子の発現に対して正規化した。ｂＥｎｄ．３細胞で示されたマウス遺伝子発現を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４４４４９６３）およびＭｍ００４４５４０５＿ｓ１ Ｆｚｄ１、Ｍｍ０２５２４７７６＿ｓ１ Ｆｚｄ２、Ｍｍ００４４５４２３＿ｍ１ Ｆｚｄ３、Ｍｍ００４３３３８２＿ｍ１ Ｆｚｄ４、Ｍｍ００４４５６２３＿ｓ１ Ｆｚｄ５、Ｍｍ００４３３３８７＿ｍ１ Ｆｚｄ６、Ｍｍ００４３３４０９＿ｓ１ Ｆｚｄ７、Ｍｍ０１２３４７１７＿ｓ１ Ｆｚｄ８、Ｍｍ０１２０６５１１＿ｓ１ Ｆｚｄ９、Ｍｍ００５５８３９６＿ｓ１ Ｆｚｄ１０、Ｍｍ０１２２７４７６＿ｍ１ Ｌｒｐ５、Ｍｍ００９９９７９５＿ｍ１ Ｌｒｐ６、Ｍｍ００４４３６１０＿ｍ１ Ａｘｉｎ２プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して測定した。値は、Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）を使用して構成的なＡｃｔｉｎ Ｂ遺伝子の発現に対して正規化した。Ａｘｉｎ２発現のデータは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれｂＥｎｄ．３細胞およびＨＲＭＥＣにおけるＷＮＴ受容体の発現を示す。
【0119】
ＩＶ．ＦＺＤ４ ＷＮＴ代理活性に対するＲＳＰＯの効果
ＷＮＴシグナル伝達活性は、ＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するｂＥｎｄ．３またはＨＲＭＥＣ細胞を使用して測定された。細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーターをコードするＳＴＦプラスミドを用いて、最小限のプロモーターおよび七つのＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位のコンカテマーの制御下で過渡的に形質移入された。形質移入された細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルプレート中内にウェル当たり１０，０００の密度で播種し、次いで、Ｒ２Ｍ３－３、Ｒ２Ｍ３－２６、３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６（例えば、国際特許公開公報第２０１９１２６３９８号を参照）により、２０ｎＭ Ｒｓｐｏと一緒に、またはこれを用いずに処理した。細胞を、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、活性を、供給業者が提案する手順を使用して、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。データは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。図６Ａ～図６Ｆは、両方のタイプの内皮細胞内で異なるＦＺＤ４ＷＮＴ代理物を用いたＲＳＰＯの添加が、ＷＮＴシグナル伝達活性にほとんど有意な効果を及ぼさなかったことを示す。
ＷＮＴシグナル伝達活性は、ＷＮＴ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するｂＥｎｄ．３またはＨＲＭＥＣ細胞を使用して測定された。細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーターをコードするＳＴＦプラスミドを用いて、最小限のプロモーターおよび七つのＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位のコンカテマーの制御下で過渡的に形質移入された。形質移入された細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルプレート中内にウェル当たり１０，０００の密度で播種し、次いで、Ｒ２Ｍ３－３、Ｒ２Ｍ３－２６、３ＳＤ１０－３、３ＳＤ１０－２６、４ＳＤ１－３、４ＳＤ１－２６（例えば、国際特許公開公報第２０１９１２６３９８号を参照）により、２０ｎＭ Ｒｓｐｏと一緒に、またはこれを用いずに処理した。細胞を、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、活性を、供給業者が提案する手順を使用して、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。データは、三重の平均±標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰によって適合した。図６Ａ～図６Ｆは、両方のタイプの内皮細胞内で異なるＦＺＤ４ＷＮＴ代理物を用いたＲＳＰＯの添加が、ＷＮＴシグナル伝達活性にほとんど有意な効果を及ぼさなかったことを示す。
【0120】
Ｖ．酸素誘導性網膜症
出生から８時間以内に、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの同腹仔の仔とその母親を酸素曝露チャンバーに移し、そこで１４日間（すなわち、Ｐ１－Ｐ１４）にわたって、５０％および１０％の酸素に２４時間間隔で交互に供した。生後１４日目、すなわちＰ１４（０）に、酸素曝露ラットを室内空気に戻した。それらはさらに６日間、Ｐ１４（１）からＰ１４（６）まで室内空気中に留めた。同齢のラットの同腹仔も、対照としての役目を果たすために室内空気（ＲＡ）中で維持した。３群のラットの各眼は、Ｐ７において、３ｕｇの抗ＥＧＦＰ Ａｂ、０．３ｕｇの４ＳＤ１－０３、または３ｕｇの４ＳＤ１－０３の硝子体内注射を受け、一方で別群のラットはＰ１４（０）において抗ＶＥＧＦ治療の硝子体内注射を受けた（例えば、図７Ａおよび７Ｂに示した実験設計を参照）。
出生から８時間以内に、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの同腹仔の仔とその母親を酸素曝露チャンバーに移し、そこで１４日間（すなわち、Ｐ１－Ｐ１４）にわたって、５０％および１０％の酸素に２４時間間隔で交互に供した。生後１４日目、すなわちＰ１４（０）に、酸素曝露ラットを室内空気に戻した。それらはさらに６日間、Ｐ１４（１）からＰ１４（６）まで室内空気中に留めた。同齢のラットの同腹仔も、対照としての役目を果たすために室内空気（ＲＡ）中で維持した。３群のラットの各眼は、Ｐ７において、３ｕｇの抗ＥＧＦＰ Ａｂ、０．３ｕｇの４ＳＤ１－０３、または３ｕｇの４ＳＤ１－０３の硝子体内注射を受け、一方で別群のラットはＰ１４（０）において抗ＶＥＧＦ治療の硝子体内注射を受けた（例えば、図７Ａおよび７Ｂに示した実験設計を参照）。
【0121】
処置後、全てのラットをＰ１４（６）に犠牲にし、その時点で、高分解能デジタル画像のコンピュータ支援画像解析を使用して、イソレクチンＢ４染色網膜フラットマウントで正常な網膜内血管成長および病理学的網膜前新血管新生（ＮＶ）の両方を評価した。ＴＡ：総面積。図８Ａ～図８Ｂは、０．３μｇの４ＳＤ１－３が、抗ＶＥＧＦ治療と同程度に新生血管房形成を阻害することを示す。これはＦＺＤ４ ＷＮＴ代理物治療が、このモデルの網膜症において抗ＶＥＧＦ治療と同等の効果を有することを実証する。
【0122】
上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書において参照され、かつ／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために、様々な特許、出願、および公報の概念を採用するために、必要に応じて修正することができる。これらの変更およびその他の変更は、上記に詳述した説明に照らし、実施形態に対して行うことができる。
【0123】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するものとして解釈されるべきではなく、こうした特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象者における網膜症を治療する方法であって、前記対象者への改変ＷＮＴシグナル調節因子の投与することを含む、方法。
（項目２）
前記ＷＮＴシグナル調節因子が、改変ＷＮＴ作動薬または改変ＷＮＴ拮抗薬である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬が、一つ以上のＦｚｄ受容体に結合する結合組成物と、一つ以上のＬＲＰ受容体またはＴｓｐａｎ１２受容体に結合する結合組成物とを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記改変ＷＮＴ作動薬の前記結合組成物が、Ｆｚｄ４結合組成物、Ｌｒｐ５結合組成物、Ｌｒｐ６結合組成物、ＬＲＰ５／６結合組成物、およびＴｓｐａｎ１２結合組成物からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に独立して投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および前記改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に順次投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および前記改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に同時投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＷＮＴ作動薬が、前記ＷＮＴ拮抗薬の前または後に投与される、項目６に記載の方法。
（項目９）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記ＷＮＴ作動薬および／または前記ＷＮＴ拮抗薬が、ＶＥＧＦおよび／またはＡｎｇ２のいずれかに特異的な結合組成物と共に投与される、項目１～７のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２に特異的な前記結合組成物が、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２活性の拮抗薬である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ラムシルマブ、およびタニビルマブからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ａｎｇ２拮抗薬が、ネスバクマブ、ＡＭＧ７８０、およびＭＥＤＩ３６１７からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記網膜症が網膜血管疾患である、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記網膜血管疾患が、血管発生の阻害によって引き起こされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記網膜症が、過剰な血管新生によって引き起こされる、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記網膜血管疾患が、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、滲出性硝子体網膜症、ノリエ病、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、網膜静脈閉塞症、およびコーツ病からなる群から選択される、項目１３または項目１４に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象者における網膜症を治療する方法であって、前記対象者への改変ＷＮＴシグナル調節因子の投与することを含む、方法。
（項目２）
前記ＷＮＴシグナル調節因子が、改変ＷＮＴ作動薬または改変ＷＮＴ拮抗薬である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬が、一つ以上のＦｚｄ受容体に結合する結合組成物と、一つ以上のＬＲＰ受容体またはＴｓｐａｎ１２受容体に結合する結合組成物とを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記改変ＷＮＴ作動薬の前記結合組成物が、Ｆｚｄ４結合組成物、Ｌｒｐ５結合組成物、Ｌｒｐ６結合組成物、ＬＲＰ５／６結合組成物、およびＴｓｐａｎ１２結合組成物からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に独立して投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および前記改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に順次投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記改変ＷＮＴ作動薬および前記改変ＷＮＴ拮抗薬が、前記網膜症の早期および／または後期に同時投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＷＮＴ作動薬が、前記ＷＮＴ拮抗薬の前または後に投与される、項目６に記載の方法。
（項目９）
改変ＷＮＴ作動薬および改変ＷＮＴ拮抗薬を投与することを含み、前記ＷＮＴ作動薬および／または前記ＷＮＴ拮抗薬が、ＶＥＧＦおよび／またはＡｎｇ２のいずれかに特異的な結合組成物と共に投与される、項目１～７のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２に特異的な前記結合組成物が、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２活性の拮抗薬である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＶＥＧＦ拮抗薬が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ラムシルマブ、およびタニビルマブからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ａｎｇ２拮抗薬が、ネスバクマブ、ＡＭＧ７８０、およびＭＥＤＩ３６１７からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記網膜症が網膜血管疾患である、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記網膜血管疾患が、血管発生の阻害によって引き起こされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記網膜症が、過剰な血管新生によって引き起こされる、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記網膜血管疾患が、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、滲出性硝子体網膜症、ノリエ病、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、網膜静脈閉塞症、およびコーツ病からなる群から選択される、項目１３または項目１４に記載の方法。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【外国語明細書】