特開2024-109827ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞とその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024109827
(43)【公開日】2024-08-14
(54)【発明の名称】ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞とその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240806BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240806BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240806BHJP
C12N 5/16 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240806BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240806BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240806BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240806BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/16
A61P35/00
A61P37/06
A61P31/00
A61K39/395 N
A61K48/00
A61K31/7088
A61K35/17
C07K19/00
【審査請求】有
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024084149
(22)【出願日】2024-05-23
(62)【分割の表示】P 2022549899の分割
【原出願日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】202010527572.0
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011209420.2
(32)【優先日】2020-11-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523087364
【氏名又は名称】バイオヘン セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＨＥＮＧ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ＃４－２１０， Ｇｏｖｅｒｎｏｒｓ Ｓｑｕａｒｅ， ２３ Ｌｉｍｅ Ｔｒｅｅ Ｂａｙ Ａｖｅｎｕｅ， ＰＯ Ｂｏｘ ３２３１１， Ｇｒａｎｄ Ｃａｙｍａｎ ＫＹ１－１２０９ （ＫＹ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000497
【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】周亜麗
(72)【発明者】
【氏名】陳功
(72)【発明者】
【氏名】姜小燕
(72)【発明者】
【氏名】任江涛
(72)【発明者】
【氏名】賀小宏
(72)【発明者】
【氏名】王延賓
(72)【発明者】
【氏名】韓露
(57)【要約】 （修正有）
【課題】従来の遺伝子改変免疫細胞と比較して、被験者の体内のＮＫ細胞の殺傷作用を顕著に抑制し、それによってＨｖＧＤのリスクを低減することができるＮＫ阻害性分子、及び該分子を発現する遺伝子改変免疫細胞を提供する。
【解決手段】ＮＫ阻害性分子であって、１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体に特異的に結合して、ＮＫ阻害性分子による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する。遺伝子改変免疫細胞であって、本発明のＮＫ阻害性分子を発現し、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。該遺伝子改変免疫細胞の、がん、感染症または自己免疫疾患の治療における使用を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】ＮＫ阻害性分子であって、１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体に特異的に結合して、ＮＫ阻害性分子による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する。遺伝子改変免疫細胞であって、本発明のＮＫ阻害性分子を発現し、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。該遺伝子改変免疫細胞の、がん、感染症または自己免疫疾患の治療における使用を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫ阻害性分子であって、
１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する、ＮＫ阻害性分子。
１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する、ＮＫ阻害性分子。
【請求項2】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体、或はＮＫＩＲの天然リガンドまたはそれに含まれるＮＫＩＲ結合領域である、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項3】
前記ＮＫＩＲは、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー、免疫チェックポイント受容体、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、Ｌｙ４９ファミリーメンバーおよびキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択される、請求項１または２に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項4】
前記ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＢおよびＣＤ９４から選択され、前記ＫＩＲファミリーメンバーは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３から選択され、前記ＬＩＲファミリーメンバーは、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８から選択され、前記ＮＫＲ－Ｐ１ファミリーメンバーは、ＮＫＲ－Ｐ１ＢおよびＮＫＲ－Ｐ１Ｄから選択され、前記免疫チェックポイント受容体は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３から選択され、前記ＳＩＧＬＥＣファミリーメンバーは、ＳＩＧＬＥＣ７、およびＳＩＧＬＥＣ９から選択され、前記Ｌｙ４９ファミリーメンバーは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、およびＬｙ４９Ｇ４から選択される、請求項３に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項5】
前記ＮＫＩＲは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＰＤ１、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、およびＫＬＲＧ１から選択される、請求項３または４に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項6】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメントであり、前記抗体またはその機能的フラグメントは、無傷の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ、またはナノ抗体から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項7】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＲ１、ＫＩＲ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、および／またはＫＬＲＧ１を標的とする抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項8】
（ｉ）前記ＮＫＧ２Ａを標的とする抗体は、（１）配列番号７２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号７５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉ）前記ＬＩＲ１を標的とする抗体は、（１）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉｉ）前記ＫＩＲを標的とする抗体は、配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、
（ｉｖ）前記ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体は、（１）配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１３６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（４）配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（５）配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１７８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（６）配列番号１８８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１９０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１９３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、および／または
（ｖ）前記ＫＬＲＧ１を標的とする抗体は、（１）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１５１に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１５２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１６１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（４）配列番号１６７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６９に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１７２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含む、
請求項７に記載のＮＫ阻害性分子。
（ｉｉ）前記ＬＩＲ１を標的とする抗体は、（１）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉｉ）前記ＫＩＲを標的とする抗体は、配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、
（ｉｖ）前記ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体は、（１）配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１３６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（４）配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（５）配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１７８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（６）配列番号１８８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１９０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１９３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、および／または
（ｖ）前記ＫＬＲＧ１を標的とする抗体は、（１）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１５１に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１５２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１６１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（４）配列番号１６７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６９に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１７２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含む、
請求項７に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項9】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、およびそれらに含まれるＮＫＩＲ結合領域から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項10】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、シアル酸、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｆ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域およびＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択される、請求項９に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項11】
（ｉ）前記ＨＬＡ－Ｅの細胞外領域は、配列番号３１または３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉ）前記ＨＬＡ－Ｇの細胞外領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）Ｅ－カドヘリン細胞外領域は、配列番号３９または４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｖ）ＰＤ－Ｌ１細胞外領域は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｖ）ＰＤ－Ｌ２細胞外領域は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する、
請求項１０に記載のＮＫ阻害性分子。
（ｉｉ）前記ＨＬＡ－Ｇの細胞外領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）Ｅ－カドヘリン細胞外領域は、配列番号３９または４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｖ）ＰＤ－Ｌ１細胞外領域は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｖ）ＰＤ－Ｌ２細胞外領域は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する、
請求項１０に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬのタンパク質の膜貫通ドメインから選択される、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項13】
前記共刺激ドメインは、ＬＴＢ、ＣＤ９４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、およびそれらの組み合わせのタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項14】
前記ＮＫ阻害性分子は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項15】
前記ＮＫ阻害性分子は細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項16】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される、請求項１４または１５に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項17】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１４または１５に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子をコードする、核酸分子。
【請求項19】
請求項１８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項20】
（１）請求項１～１７のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子を発現し、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする遺伝子改変免疫細胞。
【請求項21】
前記遺伝子改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体をさらに発現し、前記キメラ抗原受容体がリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項22】
（１）ＮＫ阻害性分子およびキメラ抗原受容体の融合タンパク質を発現する、前記融合タンパク質がＮＫ阻害性リガンド、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする遺伝子改変免疫細胞。
【請求項23】
前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項24】
前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２３に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項25】
前記ＭＨＣ関連遺伝子はＢ２Ｍを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドは、Ｂ２Ｍおよび非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子の細胞外領域の融合分子である、請求項２４に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項26】
前記非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇである、請求項２５に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項27】
前記ＮＫ阻害性分子は、配列番号４６～５３からなる群から選択される提示ペプチドをさらに含む、請求項２５に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項28】
前記遺伝子改変免疫細胞の少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項29】
ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３から選択される１種または複数種の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項30】
前記リガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＡＣ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＶＥＧＦ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＰ４０、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＣＤ１３３、ＩＦＮＡＲ１、ＤＬＬ３、ｋａｐｐａ軽鎖、ＴＩＭ３、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｔＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ抗原、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ－１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＤＬ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される標的に結合する、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項31】
前記標的は、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン、Ｃｌｕａｄｉｎ１８．２、ＲＯＲ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３０に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項32】
前記遺伝子改変免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項33】
前記遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞またはαβ－Ｔ細胞である、請求項３２に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項34】
請求項１～１７のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子、請求項１８に記載の核酸分子、請求項１９に記載のベクター、または請求項２０～３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞、および一種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項35】
がん、感染症または自己免疫疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子、請求項１８に記載の核酸分子、請求項１９に記載のベクターまたは請求項２０～３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は免疫療法の分野に属する。より具体的には、本発明は、１つ以上のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子に関する。ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞を死滅させることを阻害する。
【背景技術】
【0002】
近年、癌免疫療法技術は急速に発展しており、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）関連の免疫療法は、血液腫瘍の治療において優れた臨床効果を達成している。ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、腫瘍抗原を認識できるようにｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を遺伝子改変し、一定数に増幅した後、患者に戻して癌細胞を殺し、腫瘍治療の目的を達成する。
【0003】
２０１７年に、２種の自家ＣＡＲ－Ｔ療法が、米国でＦＤＡの承認を取得した。一種はＢ細胞急性白血病用で、もう一種はびまん性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫用である。これら２種のＣＡＲ－Ｔ細胞は優れた臨床治療効果を持っているが、非常に高価で、調製期間が長いため、大規模な使用は非常に困難である。したがって、上記の問題を解決するには、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ製品を開発する必要がある。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、健康なドナーの末梢血から分離されたＴ細胞を利用して調製できるため、同種異系の再注入が実現し、患者の治療待ち時間が大幅に短縮される。また、健康なドナーから得られたＴ細胞の生存率と機能は、患者由来のＴ細胞よりも優れており、ＣＡＲ感染率を高め、治療効果を高めることができる。
【0004】
しかし、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔセルの開発は、依然として次の２つの問題がある。（１）人工ＣＡＲ－Ｔ細胞が患者に進入し、ある程度増殖した後、患者の正常な細胞または組織を攻撃し、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性がある。（２）患者の正常な免疫系は、同種異系由来のＣＡＲ－Ｔ細胞を拒絶し、宿主対移植片反応（ＨｖＧＤ）を引き起こす可能性がある。現在、ＨｖＧＤに対して、主にＣＤ５２、またはＨＬＡをノックアウトすることにより、抑えまたは回避する。具体的には、ＣＤ５２のノックアウトにより、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞がアレムツズマブ（ＣＤ５２抗体）に耐性をもつようにすることができるため、アレムツズマブを使用して患者のＴ細胞を枯渇させときに、導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞を殺傷することを防ぐことができる。しかし、アレムツズマブを使用する場合、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ製品の製造および治療コストの増加になる。一方、ＨＬＡ分子をノックアウトすることは、抗体または他の処理を使用しない場合にＣＡＲ－Ｔ細胞が患者のＴ細胞によって除去されるのを防ぐことができるが、ＨＬＡ分子がノックアウトされた細胞は、患者のＮＫ細胞によって認識され、拒絶反応を引き起こす。
【0005】
したがって、従来のユニバーサルＣＡＲ細胞療法をさらに改善する必要があり、特にＣＡＲ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を低減し、それによってＨｖＧＤのリスクをさらに低減または回避する。
【発明の概要】
【0006】
第１の態様において、本発明提は、ＮＫ阻害性分子を提供する。ＮＫ阻害性分子は、１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む。前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する。
【0007】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメント、あるいはＮＫＩＲの天然リガンドまたはそれに含まれるＮＫＩＲ結合フラグメントである。一実施形態において、前記ＮＫＩＲは、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３）、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー（例えば、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー（例えば、ＮＫＲ－Ｐ１ＢおよびＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴおよびＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えば、ＳＩＧＬＥＣ７、およびＳＩＧＬＥＣ９）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、Ｌｙ４９ファミリーメンバー（例えば、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、およびＬｙ４９Ｇ４）、およびキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択される。好ましくは、前記ＮＫＩＲは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、およびＫＬＲＧ１から選択される。より好ましくは、前記ＮＫＩＲは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＬＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、およびＫＬＲＧ１から選択される。
【0008】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体であり、前記抗体が無傷の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ、またはナノ抗体である。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＲ１、ＫＩＲ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、および／またはＫＬＲＧ１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。
【0009】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲの天然リガンド、またはそれに含まれるＮＫＩＲ結合フラグメントである。好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、免疫チェックポイントリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１など）、およびそれらに含まれるＮＫＩＲ結合領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、シアル酸、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、およびそれらに含まれるＮＫＩＲ結合領域である。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、シアル酸、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域およびＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＥＣ１、およびＥＣ２を含むＥ－カドヘリン細胞外領域であり、より好ましくはＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、およびＥＣ５を含むＥ－カドヘリン細胞外領域である。
【0010】
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子に含まれる膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４であるタンパク質の膜貫通ドメイン、およびＮＫＩＲ天然リガンドの膜貫通ドメイン、例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬの膜貫通ドメインから選択される。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択される。
【0011】
一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号９または１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0012】
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子に含まれる共刺激ドメインは、ＬＴＢ、ＣＤ９４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、およびそれらの組み合わせであるタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインから選択される。好ましくは、本発明の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７８、またはそれらの組み合わせに由来するものである。
【0013】
一実施形態において、前記共刺激ドメインは、配列番号１３または１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0014】
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。他の実施形態において、ＮＫ阻害性分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【0015】
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄであるタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。
【0016】
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１７または１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0017】
本発明は、上記のＮＫ阻害性分子をコードする核酸、および前記核酸を含むベクターをさらに提供する。
【0018】
第２の態様において、本発明提は、遺伝子改変免疫細胞を提供する。遺伝子改変免疫細胞は、（１）本発明のＮＫ阻害性分子を発現し、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる、ことを特徴とする。一実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をさらに発現する。
【0019】
一態様において、本発明提は、遺伝子改変免疫細胞を提供する。前記遺伝子改変免疫細胞は、（１）本発明のＮＫ阻害性分子およびキメラ抗原受容体の融合タンパク質を発現し、前記融合タンパク質が、ＮＫ阻害性リガンド、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる、ことを特徴とする。
【0020】
一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせである。
【0021】
一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【0022】
好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子および少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。前記少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、およびそれらの組み合わせから選択される。前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせである。一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、およびＣＩＩＴＡの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２ＭおよびＲＦＸ５の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0023】
一実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫおよび免疫チェックポイント遺伝子、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする。好ましくは、前記遺伝子改変免疫細胞のＣＤ５２、ｄＣＫ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、またはそれらの組み合わせが阻害されまたはサイレンシングされる。
【0024】
一実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ １７９ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＡＣ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＶＥＧＦ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＰ４０、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＣＤ１３３、ＩＦＮＡＲ１、ＤＬＬ３、ｋａｐｐａ軽鎖、ＴＩＭ３、ｔＥＧＦＲ、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＮＫＧ２ＤＬ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１ １Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ－１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される標的と結合する。
【0025】
一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。好ましくは、前記遺伝子改変免疫細胞は、Ｔ細胞であり、例えば、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞である。
【0026】
一態様において、本発明は、活性剤とする本発明のＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞、および１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0027】
一態様において、本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供する。この方法は、有効量の、本発明によるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクター、遺伝子改変免疫細胞または医薬組成物を被験者に投与することを含む。したがって、本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患を治療するための薬剤の製造におけるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクター、遺伝子改変免疫細胞の使用を包含する。
【0028】
一実施形態において、前記がんは、固形腫瘍または血液腫瘍である。より具体的には、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がんおよびＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸癌、絨毛がん、結腸癌および直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮または子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がんおよび他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択される。
【0029】
一実施形態において、前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。
【0030】
一実施形態において、前記自己免疫疾患には、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎症、悪性貧血、および全身性エリテマトーデスなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0031】
本発明の利点は、本発明のＮＫ阻害性分子が、ＮＫ阻害性リガンドのみを発現することと比較して、共刺激ドメインをさらに含むことであり、これにより、被験者のＮＫ細胞による遺伝子改変免疫細胞の殺害をさらに減らす／阻害することができ、ＮＫ阻害性分子が細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合でも、遺伝子改変免疫細胞による被験者のＮＫ細胞の殺害を強化することができ、それによってＨｖＧＤのリスクをより良く減らし、真の同種異系再注入を達成する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】Ｅ０－ＵＮＫｉ－ＴおよびＥ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅの発現レベルを示すものである。
【図2】Ｇ０－ＵＮＫｉ－ＴおよびＧ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｇの発現レベルを示すものである。
【図3】ＥＣａｄ０－ＵＮＫｉ－ＴおよびＥＣａｄ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＥ－カドヘリンの発現レベルを示すものである。
【図4】Ａ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図5】ＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞におけるＫＬＲＧ１の発現レベルを示すものである。
【図6】ＮＫ細胞の殺傷に対する本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞の阻害効果を示すものである。二元配置分散分析を使用し、Ｔ検定で統計分析を行った。＊はＰ値が０．０５未満であることを示し、＊＊はＰ値が０．０１未満であることを示し、＊＊＊はＰ値が０．００１未満であることを示し、有意水準に達する。
【図7】Ａ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ａ ＳｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図8】Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅの発現レベルを示すものである。
【図9】ＮＫ細胞の殺傷に対する本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞の阻害効果を示すものである。二元配置分散分析を使用し、Ｔ検定で統計分析を行った。＊はＰ値が０．０５未満であることを示し、＊＊はＰ値が０．０１未満であることを示し、＊＊＊はＰ値が０．００１未満であることを示し、有意水準に達する。
【図10】本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞とＮＫ細胞との共培養後のＩＦＮ－γ放出のレベルを示すものである。二元配置分散分析を使用し、Ｔ検定で統計分析を行った。＊＊＊はＰ値が０．００１未満であり、有意水準に達していることを示す。
【図11】本発明ＫＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＫＩＲ ｓｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図12】本発明のＬＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－１－ＴおよびＬＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－２－Ｔ細胞におけるＬＩＲ１ ｓｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図13】ＮＫ細胞の殺傷に対する本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞の阻害効果を示すものである。
【図14】ＳＣ７Ｇ４－Ｔ細胞、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４－Ｔ細胞およびＫ１Ｇ４－Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図15】ＮＫ細胞の殺傷に対するＳＣ７Ｇ４－Ｔ細胞、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４－Ｔ細胞、およびＫ１Ｇ４－Ｔ細胞の抑制効果を示すものである。
【図16】ＰＤＬ１－Ｔ細胞におけるＰＤＬ１の発現レベルを示すものである。
【図17】ＮＫ細胞増殖に対するＰＤＬ１－Ｔ細胞の阻害効果を示すものである。
【図18】ＮＫｉ－Ｂ細胞およびＮＫｉ－Ｈｕｈ７細胞におけるＫＩＲ ｓｃＦｖの発現レベルを示すものである。
【図19】ＮＫ細胞の殺傷に対するＮＫｉ－Ｂ細胞とＮＫｉ－Ｈｕｈ７細胞の抑制効果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0033】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0034】
ＮＫ阻害性分子
１種または複数種のＨＬＡクラスＩ分子の発現が減少または排除された細胞が、ＮＫ細胞によって非自己として認識され、したがって標的となって殺傷される可能性があるという報告があった。したがって、１種または複数種のＮＫ阻害性分子の前記細胞での発現は、ＮＫ細胞に殺傷されないように前記細胞を保護することができる。
１種または複数種のＨＬＡクラスＩ分子の発現が減少または排除された細胞が、ＮＫ細胞によって非自己として認識され、したがって標的となって殺傷される可能性があるという報告があった。したがって、１種または複数種のＮＫ阻害性分子の前記細胞での発現は、ＮＫ細胞に殺傷されないように前記細胞を保護することができる。
【0035】
したがって、第１の態様において、本発明は、１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子を提供する。前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害する。
【0036】
本明細書において、「ＮＫ阻害性リガンド」という用語は、ＮＫＩＲに結合し、ＮＫ細胞機能（例えば、殺傷機能）を阻害することができる分子を指す。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメント、あるいはＮＫＩＲの天然リガンドまたはそれに含まれるＮＫＩＲ結合フラグメントである。ＮＫＩＲの非限定的な例として、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＩＭ）を有するかまたはそれに結合するＮＫ細胞表面受容体を含む。このような受容体として、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３）、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー（例えば、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー（例えば、ＮＫＲ－Ｐ１ＢおよびＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴおよびＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えば、ＳＩＧＬＥＣ７、およびＳＩＧＬＥＣ９）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、Ｌｙ４９ファミリーメンバー（例えば、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、およびＬｙ４９Ｇ４）、およびキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）を含むが、これらに限定されない。
【0037】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメントであり、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス化抗体、キメラ抗体およびその機能的フラグメントが挙げられる。抗体またはその機能的フラグメントの例として、無傷の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＨ、またはＶＬ）、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、およびナノ抗体から選択される。
【0038】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４成分を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、またはＣＤ９４を標的とする抗体である。ＮＫＧ２／ＣＤ９４は、ＣＤ９４がジスルフィド結合を介して他のＮＫＧ２サブユニットと結合して構成されたヘテロダイマーである。ＣＤ９４の細胞質領域は７アミノ酸残基しかなく、シグナルを伝達する構造を持っていない。ＮＫＧ２ファミリーは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆなどメンバーを含み、そのうち、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｂは、高い相同性を有する同じ遺伝子の異なるスプライスである。ＮＫＧ２Ａ／２Ｂの細胞質尾部には、ＳＨＰ１またはＳＨＰ－２を動員することによって抑制性シグナルを伝達する２つのＩＴＩＭが含まれている。ＮＫＧ２Ａ／２Ｂの天然リガンドはＨＬＡ－Ｅである。ＮＫＧ２Ａ／２Ｂは、活性化受容体ＮＫＧ２Ｃよりも高い親和性でリガンドに結合するため、ＮＫ細胞の抑制性受容体と活性化受容体の両方がＨＬＡ－Ｅを発現する標的細胞に結合できる場合、抑制性ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４が優勢になり、最終的にＮＫ細胞の活性を阻害する。当業者で周知のＮＫＧ２Ａ抗体を本発明に使用することができる。例えば、Ｚ２７０（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能）、Ｚ１９９（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡから入手可能）、２０Ｄ５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡから入手可能）、Ｐ２５（Ｍｏｒｅｔｔａｅｔａｌ，Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙから入手可能）などが挙げられる。
【0039】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ａを標的とする抗体であり、（１）配列番号７２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号７５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（２）配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８３に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ａを標的とする抗体であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号３、７または６８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。前記重鎖可変領域は、配列番号１、５、６７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、配列番号１および３を含む抗ＮＫＧ２Ａ抗体であり、配列番号５、および７を含む抗ＮＫＧ２Ａ抗体であり、または配列番号６７、および６８含む抗ＮＫＧ２Ａ抗体である。
【0040】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＫＩＲ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質であり、その構造として細胞外領域、膜貫通ドメイン、細胞質領域が含まれる。細胞外領域に含まれるＩｇ様ドメインの数によって、ＫＩＲはＫＩＲ２ＤサブファミリーとＫＩＲ３Ｄサブファミリーに分けることができる。細胞質領域の長さによって、ＫＩＲはＫＩＲ２ＤＬ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＬ、ＫＩＲ３ＤＳなどの長い（Ｌ）タイプと短い（Ｓ）タイプに分けることもできる。ここで、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３の細胞質領域には２つの免疫受容体チロシンベースの抑制性モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＩＭ）が含まれ、ＫＩＲ２ＤＬ５の細胞質領域には、抑制性ＫＩＲ受容体であるＩＴＩＭが１つ含まれる。具体的には、阻害性ＫＩＲ受容体の細胞質領域に含まれるＩＴＩＭがリン酸化時に、ホスファターゼＳＨＰ１、およびＳＨＰ２を動員し、細胞基質の脱リン酸化を引き起こし、結果、細胞毒性作用やサイトカイン分泌などのＮＫ細胞エフェクター機能を阻害しまたは終了させる。発現レベルが個人によって異なるが、ＫＩＲは大部分のＮＫ細胞で発現される。同一個体内でも、異なるＮＫ細胞は異なるタイプのＫＩＲを発現し、同一ＮＫ細胞はいくつかの異なるＫＩＲ分子を発現する可能性がある。ＫＩＲの認識リガンドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃの特定の多型エピトープを含む古典的なＨＬＡクラスＩ分子である。例えば、ＫＩＲ３ＤＬ２はＨＬＡ－Ａ対立遺伝子－Ａ３および－Ａ１１を認識し、ＫＩＲ３ＤＬ１はＨＬＡ－Ｂｗ－４を認識し、ＫＩＲ２ＤＬ１はＨＬＡ－Ｃｗ２、ＨＬＡ－Ｃｗ４およびＨＬＡ－Ｃｗ６アイソフォームを認識する。ＫＩＲのマウスホモログはｇｐ４９Ｂ１であり、長さが３３５アミノ酸で、細胞質領域に２つのＩＴＩＭ構造が含まれている。好ましい実施形態において、ＫＩＲを標的とする抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５、およびｇｐ４９Ｂ１からなる群から選択される１つまたは複数を標的とする抗体である。当業者で周知のＫＩＲ抗体を本発明に使用することができる。例えば、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３を標的とし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，ＦｒａｎｃｅおよびＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから入手可能）、ＥＢ６（ＫＩＲ２ＤＬ１を標的とし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，ＦｒａｎｃｅおよびＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから入手可能）、ＡＺ１３８（ＫＩＲ３ＤＬ１を標的とし、Ｍｏｒｅｔｔａｅｔａｌ，Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙから入手可能）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２を標的とし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能）、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１を標的とし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，ＦｒａｎｃｅおよびＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから入手可能）などが挙げられる。
【0041】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドはＫＩＲを標的とする抗体であり、配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドはＫＩＲを標的とする抗体であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。前記重鎖可変領域は、配列番号５９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、配列番号５８、および配列番号５９を含む抗ＫＩＲ抗体であり、そのアミノ酸配列が例えば配列番号５７または６０に示される。
【0042】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＬＩＲは、免疫グロブリン様転写物（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、ＩＬＴ）または単球－マクロファージ抑制性受容体（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＭＩＲ）とも言う。ＬＩＲファミリーには８つのメンバーが含まれ、そのうち、ＬＩＲ１（ＩＬＴ２とも呼ばれる）、ＬＩＲ２（ＩＬＴ４とも呼ばれる）、ＬＩＲ３（ＩＬＴ５とも呼ばれる）、ＬＩＲ５（ＩＬＴ３とも呼ばれる）、およびＬＩＲ８の細胞質領域に２～４つのＩＴＩＭ構造が含まれる。そのうち少なくとも１つは、抑制性ＬＩＲ受容体であるＶＸＹＸＸＬ／Ｖモチーフである。ＬＩＲ－１は、ＮＫ細胞株ＮＫＬによる、ＨＬＡクラスＩ分子を発現する標的細胞に対する殺傷と、ＣＤ１６を介したＮＫＬの活性化を阻害できる報告があった。マウスにおけるＬＩＲのホモログは、ＰＩＲ－ＡおよびＰＩＲ－Ｂを含むＰＩＲ（Ｐａｉｒｅｄ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、ここで、ＰＩＲ－ＡがＦｃＲγホモダイマーの協力下で活性化シグナルを伝達し、ＰＩＲ－Ｂがその細胞質領域に含まれる４つのＩＴＩＭ構造を介して抑制性シグナルを伝達する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８またはＰＩＲ－Ｂを標的とする抗体である。
【0043】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＩＲ１を標的とする抗体であり、（１）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（２）配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＩＲ１を標的とする抗体であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号６１または６５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。前記重鎖可変領域は、配列番号６２または６４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、抗ＬＩＲ１抗体であり、そのアミノ酸配列が配列番号６３または６６に示される。ＬＩＲファミリーメンバーを標的とする当分野で既知の他の抗体も本発明に使用できる。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、免疫チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。好ましい実施形態において、ＮＫの阻害性リガンドは、ＰＤ－１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＰＤ－１は主に活性化したＮＫ細胞で発現し、ＣＤ２８ファミリーに属し、２６８アミノ酸からなるＩ型膜貫通型糖タンパク質である。その構造は、主に細胞外免疫グロブリン可変領域（ＩｇＶ）のような構造、疎水性膜貫通領域、および細胞内領域を含む。細胞内領域の尾部には２つの独立のチロシン残基があり、Ｎ末端のチロシン残基はＩＴＩＭの形成に関与し、Ｃ末端のチロシン残基は免疫受容体チロシンベースのスイッチングモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＳＭ）の形成に関与している。ＰＤ－１がそのリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）に結合した後、ＰＤ－１のＩＴＳＭドメインにおけるチロシンのリン酸化が促進され、下流のプロテインキナーゼＳｙｋおよびＰＩ３Ｋの脱リン酸化が引き起こされ、下流のＡＫＴ、ＥＲＫなどの経路の活性化が阻害され、結果、ＮＫの活性が阻害される。
【0044】
好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＴＩＧＩＴを標的とする抗体または機能的フラグメントである。ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞外免疫グロブリン可変領域（ＩｇＶ）ドメイン、１型膜貫通ドメイン、およびＩＴＩＭと免疫グロブリンチロシンテール（ＩＴＴ）モチーフを持つ細胞内領域により構成されている。リガンド（例えば、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３）に結合すると、細胞内阻害シグナルの伝達を誘導し、ＮＫ細胞の活性を阻害する。
【0045】
好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＡＧ３を標的とする抗体または機能的フラグメントである。ＬＡＧ３は、タンパク質Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、活性化したＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、形質細胞様樹状細胞に発現する１型膜貫通タンパク質である。ＬＡＧ３の４つのＩｇＧドメインは、ＣＤ４分子と高い構造的相同性を有しているが、それらのアミノ酸相同性は２０％未満である。研究によると、ＬＡＧ３はＴ細胞とＮＫ細胞の増殖および永続的記憶に対して負の調節作用を有する。リガンド（例えばＦＧＬ１）によって活性化されると、腫瘍細胞などの「悪い細胞」の免疫系の追跡から逃れることを促進できる。
【0046】
好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＴＩＭ３を標的とする抗体または機能的フラグメントである。ＴＩＭ３は、ＴＩＭファミリーの受容体タンパク質であり、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、先天免疫細胞（樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、単球）の表面に発現する。ＴＩＭファミリーのメンバーは３つの遺伝子によってコードされる。具体的には、ＨＡＶＣＲ１はＴＩＭ１をコードし、ＨＡＶＣＲ２はＴＩＭ３をコードし、ＴＩＭＤ４はＴＩＭ４をコードする。ＴＩＭ３には、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）、ガレクチン－９（ｇａｌｅｃｔｉｎ－９またはＧａｌ－９）、ＨＭＧＢ１、およびＣＥＡＣＡＭ－１などの多種のリガンドがある。ＮＫ細胞で発現した場合、ＴＩＭ３が機能不全のＮＫ細胞のマーカーである可能性があると考えられており、ＴＩＭ３の遮断はＮＫ細胞の機能不全を逆転させることが証明された。
【0047】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＲ－Ｐ１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＮＫＲ－Ｐ１は、ヒト、マウス、ラットのＮＫ細胞で発現するＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である。現在、マウスの６つのＮＫＲ－Ｐ１メンバー、即ちＮＫＲ－Ｐ１Ａ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｃ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｄ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｅ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｆが検出されたが、ヒトではＮＫＲ－Ｐ１Ａ（ＣＤ１６１とも呼ばれる）のみが検出された。ＮＫＲ－Ｐ１分子の細胞外領域は、Ｃ型レクチン様スーパーファミリーのＮＫ受容体ドメイン（ＮＫＤ）であり、Ｌｙ４９、Ｃｄ６９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２分子と構造が類似している。ＮＫＲ－Ｐ１は主にホモダイマーの形で存在しているが、ヒトＮＫＲ－Ｐ１Ａは単量体の形のものが存在する可能性がある。ＮＫＲ－Ｐ１ファミリー分子の細胞質領域は、異なる種で異なる構造を持っている。例えば、ＮＫＲ－Ｐ１ＢおよびＮＫＲ－Ｐ１Ｄの細胞質領域は、ＩＴＩＭモチーフを含み、チロシンのリン酸化によりＳＨＰ－１を動員して、抑制性シグナルを伝達する。一方、ＮＫＲ－Ｐ１Ｃは、膜貫通領域の正に帯電したアミノ酸を介してＦｃ受容体に結合し、それによってＳｙｋを動員して活性化シグナルを伝達する。したがって、好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、またはＮＫＲ－Ｐ１Ｄを標的とする抗体である。
【0048】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＣＥＡＣＡＭ１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＣＥＡＣＡＭ１は、ＣＤ６６ａ、胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）またはＣ－ＣＡＭ１とも呼ばれ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーのメンバーであり、免疫球タンパク質（Ｉｇ）スーパーファミリーに属している。活性化されたＮＫ細胞では、ＣＥＡＣＡＭ１の発現がアップレギュレーションされ、その同種親和性の相互作用（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）がリンパ球の細胞毒性効果の阻害に繋がる。ＣＥＡＣＡＭ１は、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、およびＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡ）タンパク質を含む他の既知のＣＥＡＣＡＭタンパク質と相互作用する。ヒトでは、これまでに１１の異なるＣＥＡＣＡＭ１スプライスバリアントが検出された。ＣＥＡＣＡＭ１アイソフォームの命名は、細胞外免疫グロブリン様ドメインの数（例えば、４つの細胞外免疫グロブリン様ドメインを持つＣＥＡＣＡＭ１はＣＥＡＣＡＭ１－４と呼ばれる）と細胞質尾部の長さ（例えば、細胞質尾部が長いＣＥＡＣＡＭ１－４はＣＥＡＣＡＭ１－４Ｌと呼ばれ、細胞質尾部が短いＣＥＡＣＡＭ１－４はＣＥＡＣＡＭ１－４Ｓと呼ばれる）に関連している。ＣＥＡＣＡＭ１のＮ末端ドメインはシグナルペプチドの直後から始まり、その構造はＩｇＶ型と考えられている。
【0049】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＳＩＧＬＥＣを標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ヒトで１６種のＳＩＧＬＥＣタンパク質が同定され、マウスで９種のＳＩＧＬＥＣタンパク質が同定された。前記ＳＩＧＬＥＣタンパク質は、アミノ末端Ｖ型ドメインを含む２～１７個の細胞外Ｉｇドメインで構成されている。前記Ｖ－型ドメインはシアル酸結合部位を含む。Ｓｉｇｌｅｃは、一般的に２つのグループに分けられ、Ｓｉｇｌｅｃ１、Ｓｉｇｌｅｃ２、Ｓｉｇｌｅｃ４、Ｓｉｇｌｅｃ１５により構成される第１のサブセット、およびＳｉｇｌｅｃ３、Ｓｉｇｌｅｃ５、Ｓｉｇｌｅｃ６、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ８、Ｓｉｇｌｅｃ９、Ｓｉｇｌｅｃ１０、Ｓｉｇｌｅｃ１１、Ｓｉｇｌｅｃ１２、Ｓｉｇｌｅｃ１４、Ｓｉｇｌｅｃ１６を含むＣＤ３３関連の第２のサブセットである。Ｓｉｇｌｅｃ７は、ｐ７５、ＣＤ３２８、またはＡＩＲＭとも呼ばれ、細胞外Ｎ末端Ｉｇ様Ｖ型ドメイン、２つのＩｇ様Ｃ２型ドメイン、および１つのＩＴＩＭモチーフと１つのＩＴＩＭ様モチーフ領域を含む細胞質内細胞質領域を含む。Ｓｉｇｌｅｃ７は、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、好中球で構成的に発現する。Ｓｉｇｌｅｃ７がＮＫ細胞を介した腫瘍クリアランスに対して抑制効果があることは観察された。Ｓｉｇｌｅｃ９の構造はＳｉｇｌｅｃ７と非常に似ており、それらのＮ末端のＶグループＩｇドメインは約７７％の総アミノ酸配列同一性を有し、異なるシアル酸結合特異性が示される。ＮＫ細胞の機能研究により、Ｓｉｇｌｅｃ９結合シアル酸リガンドを発現する腫瘍細胞がＮＫ細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷を阻害することが実証された。多くのヒト腫瘍は、Ｓｉｇｌｅｃ９に結合するシアル酸リガンドを強力にアップレギュレートし、腫瘍が免疫を回避でき、癌が進行する。
【0050】
好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、当分野で知られている、Ｓｉｇｌｅｃ７またはＳｉｇｌｅｃ９を標的とする抗体である。例えば、抗Ｓｉｇｌｅｃ７抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ７／ＣＤ３２８抗体（ＡＦ１１３８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、クローン＃１９４２１２（ＭＡＢ１１３８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、クローン＃１９４２１１（ＭＡＢ１１３８１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、クローンＺ１７６（Ａ２２３３０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、６－４３４（３３９２０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＲＥＡ２１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｓ７．７（ＭＣＡ５７８２ＧＡ、ＢｉｏＲａｄ）、１０Ｂ２２０１（ＭＢＳ６０４７６４、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）、８Ｄ８（ＭＢＳ６９０５６２、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）、１０Ｂ２２０２（ＭＢＳ６０８６９４、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）、５－３８６（ＭＢＳ２１４３７０、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）に由来するものである。抗Ｓｉｇｌｅｃ９は、ＭＡＢ１１３９（クローン＃１９１２４０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＦ１１３９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｄ１８（ＳＣ－３４９３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｙ－１２ＳＣ３４９３８（ＳＣ３－４９３８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＢ １９７９８１（Ａｂｅａｍ）、ＡＢ９６５４５（Ａｂｅａｍ）、ＡＢ８９４８４（クローン＃ＭＭ０５５２－６Ｋ１２、Ａｂｅａｍ）、ＡＢ １３０４９３（Ａｂｅａｍ）、ＡＢ１１７８５９（クローン＃３Ｇ８、Ａｂｅａｍ）、Ｅ１０－２８６（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に由来するものである。Ｓｉｇｌｅｃ７とＳｉｇｌｅｃ９の細胞外構造の類似性を考慮すると、両方を標的とする抗体も、本発明のＮＫ阻害性リガンドとして作用することができる。
【0051】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体であり、（１）配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１３６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（４）配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（５）配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１７８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（６）配列番号１８８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１９０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１９３に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。上記の抗体（１）－（４）はＳＩＧＬＥＣ７を標的とし、抗体（５）－（６）はＳＩＧＬＥＣ７とＳＩＧＬＥＣ９の両方を標的とする。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号１０８、１２８、１３７、１４６、１８２、１８５または１９４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。前記重鎖可変領域は、配列番号１０９、１２９、１３８、１４７、１８３、１８６または１９５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、抗ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９または両方の抗体であり、そのアミノ酸配列が配列番号１１０、１３０、１３９、１４８、１８４、１８７または１９６に示されるものである。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＡＩＲ１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＬＡＩＲ１は１０個のエキソンを含み、２８７アミノ酸からなるＩ型膜貫通糖タンパク質をコードし、単一の細胞外Ｃ２型Ｉｇ様ドメインを含み、その後に単一の膜貫通ドメインにリンクしたストークドメインとシグナル伝達を抑制する２つの膜貫通ＩＴＩＭモチーフとが続く。ＬＡＩＲ１は、ＬＩＲおよびＫＩＲファミリーのメンバーとある程度の構造的相同性を有しており、つまり、これらの分子が同じ祖先遺伝子に由来する可能性がある。ＬＡＩＲ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびヒトＣＤ３４＋細胞を含む造血前駆細胞に発現する。ＩＴＩＭモチーフが存在するため、これまでのヒトとマウスでの研究により、ＬＡＩＲ１が免疫抑制の役割を果たすことがわかっている。さらなる研究により、ＬＡＩＲ１は静止状態のＮＫ細胞を阻害するだけでなく、活性化されたＮＫ細胞による標的細胞に対する殺傷も阻害することが示された。
【0052】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｌｙ４９を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。Ｌｙ４９はＩＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、ジスルフィド結合を介してホモダイマーを形成し、ヒトＫＩＲと同様の機能を果たし、つまり、ＭＨＣ－Ｉ分子リガンドと相互作用してシグナルを伝達し、ＮＫ細胞の活性を調節する。これまでのところ、マウスＬｙ４９ファミリーには１１のメンバー、つまりＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｂ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｄ、Ｌｙ４９Ｅ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ、Ｌｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｉ、Ｌｙ４９Ｐ、Ｌｙ４９Ｑが含まれる。ここで、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ、Ｌｙ４９Ｑはいずれも細胞質領域においてＩＴＩＭモチーフを含み、チロシンキナーゼＳＨＰ－１に結合して活性化させ、リン酸化チロシンの生成を妨げることでＮＫ細胞の活性化を阻害する。したがって、好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ、またはＬｙ４９Ｑを標的とする抗体である。
【0053】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＫＬＲＧ１を標的とする抗体またはその機能的フラグメントである。ＫＬＲＧ１は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の活性を調節するＩＩ型膜貫通タンパク質表面共抑制性受容体である。その細胞外部分にＣ型レクチンドメインが含まれ、既知のリガンドがカドヘリンであり、その細胞内部分に免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインが含まれている。Ｃ型肝炎患者の末梢血中のＮＫ細胞でのＫＬＲＧ１受容体の発現は、ＮＫ細胞の数の減少および機能の低下を促進する可能性があることが文献の報告があった。そのメカニズムは、主にＮＫ細胞の増殖を阻害し、ＮＫ細胞のアポトーシスを促進し、ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの放出を減少させることである。
【0054】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＫＬＲＧ１を標的とする抗体であり、（１）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１５１に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１５２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１６１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（４）配列番号１６７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６９に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１７２に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＫＬＲＧ１を標的とする抗体であり、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。前記軽鎖可変領域は、配列番号１１７、１５５、１６４または１７３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。前記重鎖可変領域は、配列番号１１８、１５６、１６５または１７４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、抗ＫＬＲＧ１抗体である。そのアミノ酸配列が配列番号１１９、１５７、１６６または１７５に示されるものである。
【0055】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲ天然リガンドまたはそれに含まれるＮＫＩＲ結合領域（例えば、細胞外領域）であり、このような天然リガンドとして、非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇ）、カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、免疫チェックポイントリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１）などを含むが、これらに限定されない。
【0056】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子またはその細胞外領域であり、より好ましくは非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子のα１およびα２ドメインである。非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子は、同じ染色体領域６ｐ２１．３、第６染色体の短腕に位置している。非共有結合によって結合された重鎖（α鎖）と軽鎖（ベータ鎖、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされる）で構成されている。α鎖は、細胞外領域（α１、α２、α３ドメインを含む）、膜貫通ドメイン、細胞質領域の３つの部分を含む。ここで、α１とα２は、抗原結合溝を形成し、溝に入る抗原ペプチドへの結合に関与し、α３は、免疫グロブリンの定常領域ドメインと相同であり、Ｔ細胞表面分子ＣＤ８に結合する。非古典的なＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇの３つのメンバーを含む。ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞表面のＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に結合することによりＮＫ細胞の活性を調節する。ＨＬＡ－Ｅの機能は、ＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、および－Ｇ）のリーダー配列に由来するペプチドに結合し、阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの相互作用によりＮＫ細胞に提供し、それにより、ＮＫ細胞による正常レベルのＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞に対する溶解を阻害する。生理学的条件下で、の抑制性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対するＨＬＡ－Ｅの親和性は、活性化受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに対する以前の親和性よりも顕著に高いため、ＨＬＡ－Ｅの発現レベルのアップレギュレーションは、ＮＫ細胞の殺傷効果から標的細胞を保護することができる。ＨＬＡ－ＦはＮＫ阻害性受容体ＩＬＴ２およびＩＬＴ４に結合でき、この結合がＩＬＴ２およびＩＬＴ４抗体によって効果的に阻害されることができる。ＨＬＡ－Ｆの機能はまだ調査中ですが、ＩＬＴ２、およびＩＬＴ４への結合が免疫抑制効果を持っている可能性があると推測されている。ＨＬＡ－Ｇは、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＲ－１、ＬＩＲ－２、ＫＩＲ２ＤＬ１などの多種のＮＫ抑制性受容体を認識できる。研究によると、胎児細胞の表面にあるＨＬＡ－Ｇ分子は、母体のＮＫ細胞の表面にあるＫＩＲに結合することにより、ＮＫ細胞の殺傷活性を阻害し、それによって母体にＨＬＡ半異種胎児に対する免疫耐性をもたらす可能性がある。また、メラノーマ、肉腫、リンパ腫などの固形腫瘍の細胞表面に高度に発現するＨＬＡ－Ｇ分子により、腫瘍細胞がＮＫ細胞の殺傷と溶解作用から逃げることも可能である。
【0057】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域であり、配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはそのコード配列が配列番号３２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。他の実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域の変異体（Ｙ８４Ｃ変異を含む）であり、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはそのコード配列が配列番号３４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0058】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域であり、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはそのコード配列は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0059】
一実施形態において、遺伝子改変免疫細胞の内因性Ｂ２Ｍをノックアウトし、非古典的なＨＬＡクラスＩ分子を発現してＮＫ阻害性リガンドとする場合、同義変異（即ち、ヌクレオチド配列の変化のみでアミノ酸配列の変化はない）を持つＢ２Ｍ遺伝子を導入することにより非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子と複合体を形成して阻害機能を発揮し、同時に、同義変異を持つＢ２Ｍ遺伝子により、内因性Ｂ２Ｍを標的とする遺伝子編集ツールによるノックアウトを回避することもできる。この実施形態では、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｂ２Ｍと非古典的なＨＬＡクラスＩ分子の細胞外領域の融合分子を含む。例えば、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｂ２ＭとＨＬＡ－Ｅ細胞外領域またはＨＬＡ－Ｇ細胞外領域の融合分子を含む。一具体的な実施形態において、Ｂ２ＭとＨＬＡ－Ｅ細胞外領域の融合分子を含み、好ましくは、前記ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域がＹ８４Ｃ変異（配列番号３３）を含む。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、配列番号４６～５３からなる群から選択される提示ペプチド、ならびにＢ２ＭとＨＬＡ－Ｅ細胞外領域の融合分子を含む。Ｂ２Ｍ遺伝子の同義変異のための方法は、当業者で周知のものを用いる。好ましい実施形態において、Ｂ２Ｍは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。同義的に変異したＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３８に示されるものである。
【0060】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは破骨細胞阻害レクチン（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｌｅｃｔｉｎ、ＯＣＩＬ）またはそのＮＫＩＲ結合ドメインである。マウスＯＣＩＬは、ＯＣＩＬ（Ｃｌｒ－ｂとも呼ばれる）、ＯＣＩＬｒＰ１（Ｃｌｒ－ｄとも呼ばれる）、およびｍＯＣＩＬｒＰ２（Ｃｌｒ－ｇとも呼ばれる）の３つのメンバーを含む。ＯＣＩＬは各組織で広く発現しており、その発現パターンがＭＨＣ－Ｉ分子と類似する。ＯＣＩＬはＮＫＲ－Ｐ１Ｂ／Ｄのリガンドである。研究によると、腫瘍細胞にＯＣＩＬを発現させると、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を抑制でき、ＯＣＩＬ特異的抗体はこの抑制効果を逆転させることができる。
【0061】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、カドヘリンまたはその細胞外領域であり、例えば、Ｅ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄ）、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄ）またはＲ－カドヘリン（Ｒ－ｃａｄ）であり、好ましくはＥ－カドヘリンの細胞外領域である。カドヘリンは、主に均一な細胞間接着を媒介するカルシウム依存性膜貫通タンパク質の一種であり、ＮＫ阻害性受容体ＫＬＲＧ１に結合する。カドヘリン分子は、約７２３～７４８アミノ酸からなるＩ型膜タンパク質であり、構造としてリガンド結合に関与する細胞外領域、膜貫通ドメイン、および高度に保存された細胞質領域を含む。ここで、細胞外領域にはいくつかのカドヘリンリピートドメイン（ＥＣ）があり、リガンド結合に関与する４～５アミノ酸残基からなるリピート配列が含まれる。ヒトＥ－カドヘリンはＣＤＨ１遺伝子によってコードされ、現在、カドヘリンファミリーの中で最も研究されているメンバーである。したがって、好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリンの細胞外領域であり、ＥＣ１、およびＥＣ２を含む。より好ましくは、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリンの細胞外領域であり、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、およびＥＣ５を含む。より好ましくは、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－Ｃａｄであり、配列番号３９または４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはそのコード配列は、配列番号４０または４２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0062】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドはコラーゲンまたはそのＮＫＩＲ結合ドメインであり、ＬＡＩＲ１に結合する。コラーゲン分子は、３つのα鎖で構成されるトリマーであり、α鎖がそれぞれ（グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリン）ｎリピート配列を含む。ＬＡＩＲ１は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐリピート配列を認識してそれと相互作用する。このリピート配列が広く存在するため、ＬＡＩＲ１は多種のコラーゲン分子に広く結合することが証明された。コラーゲンＸＶＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＸＩＩＩなどの膜貫通コラーゲン、およびコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩなどの非膜貫通コラーゲンを含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞または腫瘍間質細胞が多種のコラーゲン分子を高度に発現することが多く、これは、免疫細胞の表面にある抑制性受容体ＬＡＩＲ１に結合することで抑制性シグナルを免疫細胞に伝達し、免疫回避の目的を達成する可能性がある。
【0063】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドはシアル酸またはそのＮＫＩＲ結合領域であり、ＳＩＧＬＥＣファミリーメンバー（例えば、ＳＩＧＬＥＣ７、および／またはＳＩＧＬＥＣ９）に結合する。シアル酸は脊椎動物の自然免疫系の重要な成分であり、ＮＫ細胞の殺傷活性は腫瘍細胞の表面のシアル化に関連している。腫瘍細胞のシアル化は、腫瘍細胞とＮＫ細胞との間の物理的相互作用を妨げるだけでなく、腫瘍細胞の表面の、ＮＫ細胞と結合できる活性化リガンドをマスクすることもできる。また、腫瘍細胞の表面でのシアル化により、腫瘍細胞とＮＫ細胞との間の免疫シナプスの形成が阻害され、それによって腫瘍に対するＮＫ細胞の毒性が弱まる。研究によれば、腫瘍細胞の表面でのシアル化は、シグレックを介した免疫抑制シグナルを誘発することにより、ＮＫ細胞の殺傷活性を阻害することができることがわかった。Ｓｉｇｌｅｃ７はほとんどのＮＫ細胞の表面に発現し、腫瘍細胞の表面がα－２，８グリコシド結合によって結合されたシアル酸でＮＫ細胞の表面のＳｉｇｌｅｃ７と結合した後、ＮＫ細胞の活性化を阻害し、腫瘍細胞がＮＫ細胞による殺傷機能から逃れることが可能となる。
【0064】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２またはその細胞外領域であり、ＰＤ１に結合する。ＰＤ－Ｌ１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および血管内皮細胞、膵島細胞、免疫特権部位（例えば、胎盤、精巣、眼）などの非造血細胞で構成的に低発現する。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦなどの炎症性サイトカインはＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができる。ＰＤ－Ｌ２は、活性化されたマクロファージと樹状細胞でのみ発現する。腫瘍細胞自体がＰＤ－Ｌ１の発現をアップレギュレーションすることができる。腫瘍微小環境での炎症性サイトカインもＰＤ－Ｌ１およびＰＤＬ２の発現を誘導することができる。腫瘍細胞表面でのＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のアップレギュレーションされた発現は、ＰＤ－１による免疫抑制シグナルの伝達を引き起こし、ＮＫ細胞の殺傷活性を阻害することができる。好ましい実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域またはＰＤ－Ｌ２細胞外領域であり、配列番号７０または７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0065】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドはＣＤ１５５、ＣＤ１１２またはＣＤ１１３またはそのＮＫＩＲ結合領域であり、いずれもＴＩＧＩＴに結合する。ＣＤ１５５はＴＩＧＩＴの高親和性リガンドである。腫瘍表面で高度に発現するＣＤ１５５がＮＫ表面のＴＩＧＩＴに結合すると、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果が阻害される。ＣＤ１１２およびＣＤ１１３もＴＩＧＩＴに結合し、ただし、親和性が比較的弱い。
【0066】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ガレクチン９（Ｇａｌ－９とも呼ばれる）またはそのＮＫＩＲ結合領域であり、ＴＩＭ３に結合する。Ｇａｌ－９は、多くの造血細胞によって広く発現しおよび分泌されるＣ型レクチンであり、細胞表面タンパク質の炭水化物部分に結合する。ＴＩＭ３では、Ｇａｌ－９がそのＩｇＶドメインにおける炭水化物モチーフに結合し、ＴＩＭ３陽性ＮＫ細胞にカルシウム流入と細胞死を誘導する。ＴＩＭ３／Ｇａｌ－９の相互作用が免疫応答の抑制に役割を果たすことがよく証明された。
【0067】
一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＦＧＬ１またはそのＮＫＩＲ結合領域であり、ＬＡＧ３に結合する。ＦＧＬ１は、フィブリノーゲンファミリーに属し、ＬＡＧ３の新たに発見されたリガンドであるが、血小板結合部位やトロンビン感受性部位などの特徴的なドメインはない。ＦＧＬ１タンパク質は、主に腫瘍細胞に分布しており、腫瘍間質では発現が低い。ＦＧＬ１／ＬＡＧ３相互作用は、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－１経路とは独立した別の腫瘍免疫逃避経路であり、この経路を遮断すると、ＰＤ－１経路を遮断することと相乗効果を発揮する。
【0068】
本明細書において、用語の「膜貫通ドメイン」は、免疫細胞（例えば、リンパ球またはＮＫＴ細胞）の表面でのキメラ抗原受容体の発現を可能にし、標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然のものまたは合成のものであり得、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体が標的抗原に結合するときにシグナル伝達を行うことができる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えばＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＮＫＩＲ天然リガンドの膜貫通ドメインに由来し得、例えば、非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦおよびＨＬＡ－Ｇ）、カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、コラーゲン、ＯＣＩＬなどの膜貫通ドメインが挙げられる。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択される。或いは、膜貫通ドメインは合成のものであり得、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し、より好ましくは、配列番号９または１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いは前記膜貫通ドメインのコード配列は、配列番号１０または１２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0069】
一実施形態において、本発明のＮＫ阻害性分子は、ＮＫ阻害性リガンドと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含み得る。本明細書において、用語の「ヒンジ領域」は、一般的に、膜貫通ドメインをリガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、リガンド結合ドメインにより高い柔軟性とアクセス可能性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸含み得、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。ヒンジ領域は、全部または一部が天然分子に由来し得、例えば、全部または一部がＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域に由来し、または全部または一部が抗体定常領域に由来する。或いは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または合成されたヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくは、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＩｇＧ４ヒンジを含み、配列番号２５、２７または２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはＣＤ２８ヒンジのコード配列は、配列番号２６、２８または３０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも少７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0070】
本発明のＮＫ阻害性分子は、共刺激ドメインを含む。したがって、ＮＫ阻害性リガンドがＮＫＩＲに結合すると、一方、ＮＫＩＲのシグナル伝達領域を介して抑制性シグナルをＮＫ細胞に伝達して、標的細胞（例えば本発明の遺伝子改変免疫細胞）に対する殺傷を低減することができ、他方、ＮＫ阻害性分子に含まれる共刺激ドメインを介して、標的細胞（例えば本発明の遺伝子改変免疫細胞）の内部に刺激シグナルを伝達し、増殖および生存を刺激し、それによってＮＫ細胞の殺傷によりよく抵抗する。以前の研究により、ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＩＬＴ２などの抑制性受容体を標的とする抗体を使用すると、ＨＬＡ－ＥやＨＬＡ－Ｇなどの抑制性分子の結合部位への結合をめぐって競合したり、抑制効果を中和したりし、ＮＫ細胞を活性化する役割を果たすことができることがわかっている。これと逆に、本発明者らは、ＮＫ阻害性受容体を標的とするＮＫ阻害性分子を発現させることにより、ＮＫ細胞を阻害できることを初めて発見した。本発明は、共刺激ドメインを有さないＮＫ阻害性分子に対して、共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子のほうが、ＮＫ細胞の殺傷効果に対する阻害効果がより優れることをさらに発見した。
【0071】
共刺激ドメインは、共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメインであり得、前記共刺激分子の細胞内部分全体またはその機能的フラグメントを含む。「共刺激分子」は、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合することによりＴ細胞の共刺激応答（例えば、増殖）を媒介する同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、クラスＩ ＭＨＣ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例として、ＬＴＢ、ＣＤ９４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、およびそれらの組み合わせのタンパク質に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、本発明の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７８またはその組み合わせに由来するものであり、より好ましくは４－１ＢＢ、ＣＤ２８またはその組み合わせに由来するものである。一実施形態において、本発明の共刺激ドメインは、配列番号１３または１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いは該共刺激ドメインのコード配列は、配列番号１４または１６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0072】
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。他の実施形態において、ＮＫ阻害性分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。即ち、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。この実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドとＮＫＩＲとの結合は、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを介して、活性化シグナルを標的細胞（例えば、本発明の遺伝子改変免疫細胞）に伝達し、標的細胞によるＮＫ細胞に対する殺傷を促進し、それによってＮＫ細胞の殺傷に対する抑制効果をさらに高める。
【0073】
本明細書において、用語の「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能的シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を実行することを指示するタンパク質部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインが抗原に結合した後の一次細胞内シグナル伝達に関与し、免疫細胞の活性化と免疫応答をもたらす。言い換えれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ阻害性分子を発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することに関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【0074】
一実施形態において、本発明の細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原受容体結合後に一緒に作用して一次シグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、および同じまたは類似の機能を有する任意の合成配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、多数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ、ＩＴＡＭ）を含むことができる。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例として、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを含む。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、このシグナル伝達ドメインは、配列番号１７または１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いはそのコード配列は、配列番号１８または２０に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0075】
一実施形態において、本発明のＮＫ阻害性分子はシグナルペプチドをさらに含み得、これにより、Ｔ細胞などの細胞で発現される場合、新生タンパク質が小胞体にガイドされ、続いて細胞表面にガイドされる。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含むことができ、単一のα－ヘリックスを形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的に、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、転座中または転座後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成することができる。そして、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼによって消化される。本発明において有用なシグナルペプチドは、当業者で周知のものを用い、例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲαなどに由来するシグナルペプチドが挙げられる。一実施形態において、本発明において有用なシグナルペプチドは、配列番号２１または２３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、或いは該シグナルペプチドのコード配列は、配列番号２２または２４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0076】
少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の阻害またはサイレンシング
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、例えば、少なくとも１種のＭＨＣ遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、または少なくとも１種のＭＨＣ遺伝子と相互作用しまたはその発現を調節する遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、例えば、少なくとも１種のＭＨＣ遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、または少なくとも１種のＭＨＣ遺伝子と相互作用しまたはその発現を調節する遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0077】
主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）は元々、移植反応において主要な役割を果たすタンパク質として特徴づけられ、すべての高等脊椎動物の表面に発現し、マウスではＨ－２と呼ばれ、ヒト細胞ではＨＬＡと呼ばれる。ＭＨＣは主にクラスＩとクラスＩＩの２種類がある。クラスＩＭＨＣタンパク質は、２種のタンパク質のヘテロダイマーであり、一種がＭＨＣＩ遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質α鎖であり、もう一種がＭＨＣ遺伝子クラスター内にない遺伝子によってコードされる細胞外タンパク質のベータ２ミクロスフェアタンパク質鎖である。α鎖は３つのドメインを含み、外来ペプチドが２つのＮ末端の最も変化しやすいドメインα１、α２に結合する。クラスＩＩＭＨＣタンパク質もヘテロダイマーであり、ＭＨＣ複合体内の遺伝子によってコードされる２つの膜貫通タンパク質を含む。クラスＩＭＨＣ／抗原複合体は細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用し、クラスＩＩＭＨＣはヘルパーＴ細胞に抗原を提示する。また、クラスＩＭＨＣタンパク質は、ほぼすべての有核細胞と血小板（およびマウスの赤血球）で発現する傾向があるが、クラスＩＩＭＨＣタンパク質はより選択的に発現する。一般的に、クラスＩＩＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、一部のマクロファージと単球、ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ）、樹状細胞に発現する。
【0078】
ヒトクラスＩＨＬＡ遺伝子クラスターは、３つの主要遺伝子座Ｂ、ＣおよびＡを含む。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃは、クラスＩＨＬＡ重鎖パラログである。クラスＩ分子はＭＨＣα重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃによってコードされる）、および軽鎖（β－２微球タンパク質、Ｂ２Ｍによってコードされる）で構成されるヘテロダイマーである。重鎖は膜に固定されており、約４５ ｋＤａであり、８つのエクソンを含んでいる。エクソン１はリーダーペプチドをコードし、エクソン２および３はα１、およびα２ドメインをコードし、両方ともペプチドに結合し、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通領域をコードし、エクソン６および７は細胞質尾部をコードする。エクソン２およびエクソン３内の多型は、各クラスの分子のペプチド結合特異性をもたらす。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、およびＢ２Ｍからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。
【0079】
ヒトクラスＩＩＨＬＡクラスターは、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの３つの主要な遺伝子座を含み、クラスＩクラスターおよびクラスＩＩクラスターの両方とも多型である。ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、およびＨＬＡ－ＤＲＡは、クラスＩＩＨＬＡα鎖パラログに属する。クラスＩＩ分子は、外因性ペプチドを提示することにより免疫系で主要な役割を果たし、おもに抗原提示細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、マクロファージなど）で発現する。クラスＩＩ分子は、いずれも膜に固定されているα鎖とベータ鎖からなるヘテロダイマーであり、α鎖は約３３～３５ ｋＤａで、５つのエクソンを含む。エクソン１はリーダーペプチドをコードし、エクソン２および３は２つの細胞外領域をコードし、エクソン４は膜貫通ドメインをコードし、エクソン５は細胞質尾部をコードする。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲＡからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。
【0080】
クラスＩおよびＩＩＭＨＣの発現は、多種のアクセサリータンパク質にも依存する。例えば、Ｔａｐ１およびＴａｐ２サブユニットは、ペプチド抗原をクラスＩＨＬＡ複合体にロードするために必要なＴＡＰトランスポーター複合体の一部である。ＬＭＰ２およびＬＭＰ７プロテアソームサブユニットは、ＨＬＡに表示するためのペプチドへの抗原のタンパク質分解において役割を果たす。ＬＭＰ７を減少させると、細胞表面でのＭＨＣクラスＩの発現が減少することが示されている。ＭＨＣクラスＩＩの発現は、ＲＦＸ複合体、ＣＩＩＴＡなどのいくつかの正の制御因子によって誘導および発現される。ＲＦＸ複合体は、ＲＦＸＡＮＫ（ＲＦＸＢとも呼ばれる）、ＲＦＸ５、およびＲＦＸアクセサリタンパク質（ＲＦＸＡＰとも呼ばれる）の３つのサブユニットで構成されている。ＲＦＸ複合体は、他の転写因子とＭＨＣクラスＩＩ分子のプロモーターとの結合を促進し、プロモーター結合の特異性を高めることにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を促進する。ＣＩＩＴＡはＭＨＣクラスＩＩ発現のマスターコントローラーである。ＣＩＩＴＡは、酸性アミノ酸が豊富なＮ末端と、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒが豊富なＰＳＴ領域と、中央のＧＴＰ結合領域と、Ｌｅｕリピート配列（ＬＲＲ）が豊富なＣ末端とを含む。末端酸性領域とＰＳＴ領域は転写活性化領域である。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。
【0081】
したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指し、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0082】
一実施形態において、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0083】
Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は、すべてのＴ細胞の表面にある特徴的なマーカーであり、ＣＤ３と非共有結合してＴＣＲ／ＣＤ３複合体を形成し、抗原提示細胞表面における特異的なＭＨＣ－抗原ペプチド複合体と結合して特異的な抗原刺激シグナルを生成し、Ｔ細胞を活性化し、殺傷の役割を果たす。ＴＣＲは２つの異なるペプチド鎖で構成されるヘテロダイマーであり、通常はα／β型とγ／δ型の２つのカテゴリーに分けられ、末梢Ｔリンパ球の９５％以上がＴＣＲα／βを発現する。ＴＣＲα鎖はＴＲＡＣ遺伝子によってコードされ、β鎖はＴＲＢＣ遺伝子によってコードされる。ＴＣＲの各ペプチド鎖は、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域、細胞質領域を含み、細胞質領域が非常に短く、抗原刺激シグナルを伝達する能力をもたない。ＴＣＲ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性がＶ領域に存在する。Ｖ領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つの超可変領域があり、そのうち、ＣＤＲ３は、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接決定できるように変異が最も大きい。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識するとき、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識してそれと結合し、ＣＤＲ３が抗原ペプチドに直接結合する。ＣＤ３は、γ、δ、ε、およびζの４種のサブユニットを含み、通常、ダイマーεγ、εδ、およびζζの形で存在する。この４種のサブユニットは、いずれも保存された免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）を含み、そのうちの２つのチロシン残基がチロシンプロテインキナーゼによってリン酸化されてＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。したがって、一実施形態において、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。
【0084】
好ましい実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子および少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。前記少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、およびそれらの組み合わせから選択される。前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【0085】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、およびそれらの組み合わせから選択される。前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される。一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。一実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、およびＣＩＩＴＡの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２ＭおよびＲＦＸ５の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0086】
一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子および任意のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子に加え、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、および免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられる。
【0087】
遺伝子の発現を阻害する方法または遺伝子をサイレンシングさせる方法は、当業者で周知のものを用い、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素を介したＤＮＡフラグメント化、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなどの技術による遺伝子の不活性化を含むが、これらに限定されない。
【0088】
キメラ抗原受容体
【0089】
他の態様において、本発明の、ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体をさらに発現し得る。即ち、この実施形態において、遺伝子改変免疫細胞は、ＮＫ阻害性分子およびキメラ抗原受容体を発現し、好ましくは、前記遺伝子改変免疫細胞の少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0090】
本明細書において、用語の「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指し、ハイブリッドポリペプチドが一般的に１つ以上のリガンド結合ドメイン（例えば、抗体の抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、各ドメインがリンカーによって連結されている。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞および他の免疫細胞の特異性と反応性を非ＭＨＣ制限的な方法で選択された標的に向け直すことができる。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲ細胞に抗原処理と無関係の抗原認識能力を与えることによって、腫瘍の逃避の主要なメカニズムを回避できる。また、Ｔ細胞内で発現するとき、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖と有利にダイマー化しない。
【0091】
本明細書において、「リガンド結合ドメイン」は、リガンド（例えば、抗原）に結合できる任意の構造またはその機能的変異体を指す。リガンド結合ドメインは抗体構造であり得、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、およびそれらの機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない。例えば、リガンド結合ドメインは、無傷の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＨまたはＶＬ）、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎおよびＤＡＲＰＩＮなどを含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、およびナノ抗体から選択される。本発明において、リガンド結合ドメインは、一価または二価であり得、そして単一特異性、二重特異性または多重特異性の抗体であり得る。
【0092】
「Ｆａｂ」は、パパインによる免疫グロブリン分子の切断時に生成される２つの同じのフラグメントのいずれかを指し、ジスルフィド結合によって連結された無傷の軽鎖および重鎖のＮ末端部分からなり、重鎖のＮ末端部分が、重鎖可変領域とＣＨ１を含む。インタクトなＩｇＧと比較して、ＦａｂにはＦｃフラグメントがなく、移動度と組織浸透性が高く、抗体効果を媒介することなく抗原に一価で結合できる。
【0093】
「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーによって連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）から構成される抗体である。リンカーの最適な長さおよび／またはアミノ酸組成を選択することができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域折り畳みと相互作用に大きく影響する。実際、比較的に短いリンカー（例えば、５－１０アミノ酸）を使用すれば、鎖内の折り畳みを防ぐことができる。リンカーのサイズと組成の選択については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／０２０２５８およびＷＯ２００７／０２４７１５を参照でき、そのすべての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ｓｃＦｖは、任意の順でリンクされたＶＨおよびＶＬを含み、例えば、ＶＨ－リンカー－ＶＬ、またはＶＬ－リンカー－ＶＨを含むことができる。
【0094】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、軽鎖が自然に欠損し、１つの可変重鎖（ＶＨＨ）と２つの一般的なのＣＨ２およびＣＨ３領域のみを含む抗体を指し、「重鎖抗体」とも呼ばれる。
【0095】
「ナノ抗体」または「Ｎｂ」は、元の重鎖抗体と同じ構造安定性および抗原結合活性を有し、標的抗原に結合できる既知の最小単位である、単一にクローンしおよび発現されたＶＨＨ構造を指す。
【0096】
用語の「機能的バリアント」または「機能的フラグメント」は、基本的に親アミノ酸配列を含むが、該親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（即ち、置換、欠失または挿入）を含む変異体を指す。前記変異体が親アミノ酸配列の生物学的活性を保持することを条件とする。例えば、抗体の場合、その機能的フラグメントはその抗原結合部分である。一実施形態において、好ましくは、前記アミノ酸修飾は、保存的修飾である。
【0097】
本明細書において、「保存的修飾」という用語は、該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に有意に影響を与えたり、変更したりしないアミノ酸修飾を指す。これらの保存的修飾は、アミノ酸の置換、追加、および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当分野で既知の標準的な技術によって、本発明のキメラ抗原受容体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義され、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。保存的修飾は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または関与する残基の両親媒性の類似性に基づいて選択することができる。
【0098】
したがって、「機能的バリアント」または「機能的フラグメント」は、親アミノ酸配列と少なくとも７５％同一であり、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、親アミノ酸の生物学的活性、例えば、結合活性を保持する。
【0099】
本明細書において、「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する度合いを指し、通常、パーセンテージで表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、まったく同じ配列の２つのコピーは、１００％の同一性を有する。いくつかのアルゴリズムは、標準的なパラメータを使用して配列の同一性を決定できることが当業者であれば自明です。例えば、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）およびＣｌｕｓｔａｌＷが挙げられる。
【0100】
リガンド結合ドメインの選択は、認識する、具体的な病状に関連する標的細胞における細胞表面マーカー、例えば腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原によって決まる。したがって、一実施形態において、本発明のリガンド結合ドメインはＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１ １Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される１つまたは複数の標的に結合する。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。標的とされる抗原に応じて、本発明のＣＡＲは、その抗原に特異的なリガンド結合ドメインを含むように設計することができる。例えば、ＣＤ１９が標的となる抗原である場合、ＣＤ１９抗体を本発明のリガンド結合ドメインとして使用することができる。
【0101】
本発明において有用なＣＡＲに含まれる膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および任意のヒンジ領域、シグナルペプチドなどの定義は、上記を参照できる。
【0102】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間を調節するためのスイッチ構造をさらに含むことができる。例えば、スイッチ構造は、ダイマー化ドメインの形をとることができ、それと対応するリガンドに結合することによってコンフォメーション変化を誘発し、細胞外結合ドメインを露出させて標的抗原に結合させ、それによってシグナル伝達経路を活性化する。或いは、スイッチドメインを使用して、それぞれ結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインと接続してもよく、スイッチドメインが互いに結合する場合だけ（例えば、誘導化合物の存在下で）、結合ドメインとシグナル伝達ドメインとがダイマーによって連結され、シグナル伝達経路を活性化することができる。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形態であり得る。マスキングペプチドは、細胞外結合ドメインをマスクして、標的抗原への結合を阻止することができ、マスキングペプチドが、例えばプロテアーゼによって切断されると、細胞外結合ドメインが露出され、「通常」のＣＡＲ構造となることができる。当業者に知られている各種のスイッチ構造も本発明に使用することができる。
【0103】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、自殺遺伝子を含み得、即ち、外因性物質によって誘導され得る細胞死シグナルを発現させ、必要な場合（例えば、重度の毒性副作用が発生した場合）に、ＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、ＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８などの挿入されたエピトープの形をとることができ、必要に応じて、これらのエピトープを標的とする抗体または試薬を加えることによりＣＡＲ細胞を排除することができる。自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子により、ガンシクロビル治療によって誘発されて細胞死を引き起こすことが可能である。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７などの化学誘導薬によってダイマー化するように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化してアポトーシスを引き起こすことが可能である。当業者に知られている各種の自殺遺伝子を本発明に使用することができる。
【0104】
必要に応じて、ＮＫ阻害性分子が細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつ細胞がＣＡＲを発現するとき、本発明のＮＫ阻害性分子およびＣＡＲが、例えば共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインである、結合領域以外の他の構造を共用することができる。したがって、この実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、（１）本発明のＮＫ阻害性分子およびキメラ抗原受容体の融合タンパク質を発現し、前記融合タンパク質が、ＮＫ阻害性リガンド、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインをみ、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0105】
核酸およびベクター
本発明は、本発明のＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列を含む核酸分子をさらに提供する。任意で、前記核酸分子は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列をさらに含み得る。
本発明は、本発明のＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列を含む核酸分子をさらに提供する。任意で、前記核酸分子は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列をさらに含み得る。
【0106】
本明細書において、用語の「核酸分子」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの配列を含み、例えば修飾または非修飾のＲＮＡ、またはＤＮＡであり、それぞれ一本鎖および／または二本鎖形態の線状または環状、またはそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）である。したがって、本発明による核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、それらの組み合わせまたは誘導体（例えば、ＰＮＡ）を含む。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ、またはＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡである。
【0107】
核酸は、通常のホスホジエステル結合または非通常の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものようなアミド結合）を含み得る。本発明の核酸は、１種または複数種の修飾された塩基をさらに含み得、例えばトリチル化塩基および滅多にみられない塩基（例えば、イノシン）が挙げられる。化学的、酵素的、または代謝的修飾を含む他の修飾であってもよく、本発明の多鎖ＣＡＲがポリヌクレオチドから発現できればよい。核酸は単離された形で提供することができる。一実施形態において、核酸は、転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなどの調節配列を含み得る。
【0108】
所望の宿主細胞（例えば、免疫細胞）において最適な発現を行い、或いは細菌、酵母または昆虫細胞での発現に使用するように、本発明の核酸配列に対してコドン最適化してもよい。コドン最適化とは、ターゲティング配列に存在する、特定の種の高発現遺伝子でまれなコドンを、その種の高発現遺伝子で一般的なコドンで置き換え、置換前後のコドンが同じアミノ酸をコードすることを指す。したがって、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用嗜好によって決まる。
【0109】
本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターをさらに提供する。任意で、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列およびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列が、同じベクターまたは異なるベクターに位置する。
【0110】
本明細書において、用語の「ベクター」は、（外因性）遺伝物質を宿主細胞に移すためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、該宿主細胞において、前記核酸分子が例えば複製および／または発現することができる。
【0111】
ベクターは通常、ターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば、相同組換えによってまたは特定の部位の配列に特異的にターゲティングするハイブリッドリコンビナーゼを使用することによって、単離された核酸を細胞の内部に送達する媒体である。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞における異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列）の転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に使用されるベクターである。本発明に使用できるベクターは当分野で既知のものを使用することができ、市販のものを使用することができる。一実施形態において、本発明のベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ、ポリオーマウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）、ファージ、ファージミド、コスミド、および人工染色体（ＢＡＣおよびＹＡＣを含む）を含むが、これらに限定されない。通常、ベクター自体はヌクレオチド配列であり、インサート（導入遺伝子）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「バックボーン」として機能する比較的大きな配列である。通常、遺伝子改変ベクターは、宿主細胞において自律複製する起点（ポリヌクレオチドの安定の発現が望まれる場合）、選択マーカー、および制限酵素切断部位（例えば、マルチクローニング部位、ＭＣＳ）を含む。ベクターは、プロモーター、ポリアデニル化テール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペロン、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列および／またはタンパク質精製タグなどのエレメントをさらに含んでもよい。一具体的な実施形態において、前記ベクターは、インビトロで転写されたベクターである。
【0112】
遺伝子改変免疫細胞
本発明はまた、本発明のＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞をさらに提供し、ここで、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。一実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、１つ以上のリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をさらに発現する。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
本発明はまた、本発明のＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞をさらに提供し、ここで、少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。一実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、１つ以上のリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をさらに発現する。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0113】
一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子および任意のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子に加え、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、および免疫チェックポイント遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられる。
【0114】
必要に応じて、ＮＫ阻害性分子が細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつ細胞がＣＡＲを発現する場合、本発明のＮＫ阻害性分子およびＣＡＲは、結合領域以外の他の構造を共用することができ、例えば、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる。したがって、この実施形態において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、（１）本発明のＮＫ阻害性分子およびキメラ抗原受容体の融合タンパク質を発現し、前記融合タンパク質がＮＫ阻害性リガンド、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。好ましい実施形態において、前記遺伝子改変免疫細胞は、少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされる。
【0115】
本明細書において、用語の「免疫細胞」は、免疫系の、１種または複数種のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞、または臍帯血などの幹細胞源から得られた免疫細胞であり得る。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は任意のＴ細胞であり得、例えばインビトロで培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、またはインビトロで培養されたＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などのＴ細胞株からのＴ細胞、または被験者から得られたＴ細胞である。被験者の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、腫瘍などの多種の供給源から入手できる。Ｔ細胞は濃縮されまたは精製されることもできる。Ｔ細胞は、発達のどの段階のものであってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞などを含むが、これに限定されない。好ましい実施形態では、免疫細胞はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えばＦｉｃｏｌｌ分離などの当業者で既知の様々な技術を使用して被験者の血液から得ることができる。
【0116】
ＮＫ阻害性分子および任意選択のキメラ抗原受容体は、当分野で既知の従来の方法（例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換などによって）を使用して免疫細胞に導入することができる。「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。一例として、ＲＮＡトランスフェクションがあり、即ち、ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルス法に使用される。用語の「形質導入」は、一般に、ウイルスを介した核酸分子またはポリヌクレオチドの転移を説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔または「穴」を開いて、物質の取り込みを可能にすることに関わる。トランスフェクションは、リン酸カルシウムの使用、エレクトロポレーション、細胞の押し出し、またはカチオン性脂質を材料と混合して、細胞膜と融合してそれらの積荷を内部に沈着させるリポソームを生成することによって実行できる。真核生物宿主細胞をトランスフェクトするための例示的な技術として、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションが含まれる。用語の「形質転換」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の細菌への非ウイルス性の移動、非動物の真核細胞（植物細胞を含む）への移動を説明するために使用される。したがって、形質転換は細菌または非動物の真核細胞の遺伝子変化であり、細胞膜が周囲から直接取り込んで、そして外因性遺伝物質（核酸分子）を取り込むことにより発生する。形質転換は人工手段で実現することができる。形質転換が起こるためには、細胞または細菌が有能な状態にある必要がある。原核生物の形質転換の場合、熱ショックを介した取り込み、無傷の細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションの技術を利用することができる。
【0117】
キットおよび医薬組成物
本発明は、本発明のＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞を含むキットを提供する。
本発明は、本発明のＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞を含むキットを提供する。
【0118】
好ましい実施形態において、本発明のキットは、説明書をさらに含む。
【0119】
本発明は、ＮＫ阻害性分子、遺伝子改変免疫細胞、活性剤としての本発明の核酸分子またはベクター、および１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、医薬組成物または薬剤の調製におけるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞の使用を包含する。
【0120】
本明細書において、用語の「薬学的に許容される賦形剤」は、被験者および有効成分と薬理学的および／または生理学的に適合性がある（即ち、望ましくない局所的または全身的作用を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる）ベクターおよび／または賦形剤を指し、当分野で既知のもの（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）を使用できる。薬学的に許容される賦形剤の例として、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング、吸着剤、付着防止剤、流動促進剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張化剤、吸収遅延剤、安定剤および張性調整剤が含まれるが、これに限定されない。本発明の所望の医薬組成物を調製するために適切な賦形剤を選択することは当業者で周知のことである。本発明の医薬組成物に使用する例示的な賦形剤として、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水が含まれる。一般に、適切な賦形剤の選択は、使用される活性剤、治療される疾患、および医薬組成物の所望の剤形に特に依存する。
【0121】
本発明による医薬組成物は、多種の経路による投与に適する。通常、投与は非経口的に行われる。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下または鼻腔内の投与を含む。
【0122】
本発明による医薬組成物は、固体、液体、気体または凍結乾燥の形態などの各種の形態に調製することができる。特に、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒、丸剤、懸濁液、乳濁液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス、チンキ剤または液体エキス抽出物の形態、または必要な投与方法に特に適するの形態である。本発明の既知の、医薬品を製造するためのプロセスは、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣製造、研磨、乳化、カプセル化、包埋、または凍結乾燥のプロセスを含む。本明細書に記載される免疫細胞を含む医薬組成物は、通常、溶液の形態で提供され、好ましくは、薬学的に許容される緩衝液を含む。
【0123】
本発明による医薬組成物は、疾患の治療および／または予防に適する１種または複数種の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。組み合わせに適する薬剤の好ましい例として、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどのペプチド細胞毒素；ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０、および２１３、アクチニウム２２５、およびアスタチン２１３などの放射性核種；抗体指向酵素プロドラッグなどのプロドラッグ；血小板第４因子、黒色腫成長刺激タンパク質などの免疫刺激剤；抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントなどの抗体またはそのフラグメント、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、相同タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメインおよびウイルス／細菌ペプチドなどの既知の抗癌剤が含まれる。また、本発明の医薬組成物は、化学療法、放射線療法などの１種または複数種の他の治療方法と組み合わせて使用することもできる。
【0124】
治療への応用
本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供する。この方法は、有効量の、本発明によるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクター、遺伝子改変免疫細胞または医薬組成物を被験者に投与することを含む。したがって、本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患を治療するための薬剤の製造におけるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞の使用を包含する。
本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供する。この方法は、有効量の、本発明によるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクター、遺伝子改変免疫細胞または医薬組成物を被験者に投与することを含む。したがって、本発明は、癌、感染症または自己免疫疾患を治療するための薬剤の製造におけるＮＫ阻害性分子、核酸分子、ベクターまたは遺伝子改変免疫細胞の使用を包含する。
【0125】
一実施形態において、有効量の本発明の免疫細胞および／または医薬組成物を被験者に直接投与する。
【0126】
他の実施形態において、本発明の治療方法は、エクスビボ治療である。具体的には、この方法は以下のステップを含む。（ａ）免疫細胞を含むサンプルを提供する。（ｂ）前記免疫細胞の少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子および少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現を、インビトロで阻害しまたはサイレンシングし、本発明のＮＫ阻害性分子および任意選択のキメラ抗原受容体を前記免疫細胞に導入し、改変された免疫細胞を取得する。（ｃ）前記改変された免疫細胞を被験者に投与する。好ましくは、ステップ（ａ）で提供される免疫細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞から選択される。そして、前記免疫細胞は、当分野で既知の通常の方法によって、被験者のサンプル（特に血液サンプル）から得ることができる。また、本発明のキメラ抗原受容体およびＮＫ阻害性分子を発現することができ、本明細書に記載の所望の生物学的エフェクター機能を実行することができる他の免疫細胞を使用することもできる。また、免疫細胞は、一般に、被験者の免疫系に適合するものを選択し、即ち、前記免疫細胞は、免疫原性応答を誘発しないものが好ましい。例えば、「汎用レシピエント細胞」を使用でき、即ち、所望の生物学的エフェクター機能的を実行する、普遍的に適合し、インビトロで成長および増幅できるリンパ球を使用することができる。このような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を取得および／または提供することが不要である。ステップ（ｃ）のエクスビボ導入は、エレクトロポレーションを介して本明細書に記載の核酸またはベクターを免疫細胞に導入し、または免疫細胞をウイルスベクターで感染させることによって実施することができる。前記ウイルスベクターは、前述のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。他の方法として、トランスフェクション試薬（リポソームなど）または一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用もある。
【0127】
一実施形態において、前記免疫細胞は、自己細胞または同種異系細胞、好ましくはＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、またはＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。
【0128】
本明細書において、「自家」という用語は、ある個体に由来する材料が、後でその同一個体に再導入されることを指す。
【0129】
本明細書において、「同種異系」という用語は、任意の材料が、該材料を導入する個体と同じ種で異なる動物または異なる患者に由来するものであることを指す。１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が異なる場合、２つ以上の個体は互いに同種異系のものｎであると見なされる。場合によっては、同じ種の各個体からの同種異系材料の遺伝子上の異なりは、抗原相互作用を発生させるのに十分である。
【0130】
本明細書において、用語の「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、癌の動物モデルである被験者として有利に使用することができる。好ましくは、被験者はヒトである。
【0131】
一実施形態において、前記がんは、リガンド結合ドメインと結合する標的の発現に関連するがんである。例えば、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がんおよびＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌および直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（胃腸がんを含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腺がん、扁平上皮がん）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む）、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、唇、舌、口、咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮または子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がんおよびその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度の小さな非切断細胞ＮＨＬ、大きなしこりＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、および標的発現に関連する他の疾患を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の遺伝子改変免疫細胞または医薬組成物で治療することができる疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓がん、胃がんなどである。
【0132】
一実施形態において、前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。
【0133】
一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎症、悪性貧血、および全身性エリテマトーデスなどを含むが、これらに限定されない。
【0134】
一実施形態において、前記方法はさらに、１種または複数種の追加の化学療法剤、生物学的薬剤、薬物または治療を前記被験者に投与することを含む。この実施形態において、化学療法剤、生物学的薬剤、薬物または治療は、放射線療法、外科手術、抗体剤および／または小分子、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0135】
以下、添付の図面を参照しながら例を挙げて本発明をで詳細に説明する。なお、当業者は、添付の図面および実施例は、例示的なものにすぎず、本発明を限定するものではない。本出願の実施例および実施例の特徴は、矛盾がない限り、互いに組み合わせることができる。
【0136】
本発明のすべての例で使用されるＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ロット番号１７－５４４２－０２）による白血球アフェレーシスを利用して健康なドナーから単離された初代ヒトＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であった。
【0137】
実施例１：ＮＫ阻害性分子を発現し、ＴＣＲ／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩをノックアウトするＵＮＫｉ－Ｔ免疫細胞の構築
【0138】
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、ＮＫ阻害性リガンド、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号２７）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号１１）のコード配列を合成し、それをｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号Ａ１３６０）に順にクローニングし、ここで、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリンの細胞外領域（配列番号４１、ＥＣａｄ０プラスミドに対応する）、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ｅ細胞外領域の融合分子（提示ペプチド配列番号４６、Ｂ２Ｍ 配列番号３７、およびＨＬＡ－Ｅ細胞外領域変異体配列番号３３を含み、Ｂ２Ｍの核酸配列は、Ｅ０プラスミドに対応する同義変異の配列番号３８である）、またはＢ２ＭおよびＨＬＡ－Ｇ細胞外領域の融合分子（Ｂ２Ｍ 配列番号３７、およびＨＬＡ－Ｇ細胞外領域配列番号３５を含み、Ｂ２Ｍの核酸配列は、Ｇ０プラスミドに対応する同義変異の配列番号３８である）である。ＥＣａｄ０、ＥＯ、およびＧ０プラスミドにＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）をさらに含み、ＥＣａｄ２８、Ｅ２８、およびＧ２８プラスミドのそれぞれを得た。シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
【0139】
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、抗ＮＫＧ２Ａ－ｓｃＦｖ（配列番号５および７を含む）、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号２９）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号１１）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、それをｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号Ａ１３６０）に順クローニングし、Ａ２８プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
【0140】
３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号３１９８５－０７０）を滅菌チューブに加えて上記のプラスミドを希釈した後、プラスミド：ウイルスパッケージングベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１の比率でパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２６０）、およびエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２５９）を加えた。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、ロット番号０６３６６２３６００１）を加え、すぐに均一に混合し、室温下で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試薬混合物を２９３Ｔ細胞のフラスコに滴下した。ウイルスを２４時間および４８時間で収集し、プールし、超遠心分離（２５０００ ｇ、４°Ｃ、２．５時間）して、濃縮レンチウイルスを得た。
【0141】
ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、３７℃、５％ＣＯ２培養条件下１日間培養した。そして、濃縮レンチウイルスを添加し、３日間連続培養した後、ＮＫ阻害性分子を発現するＴ細胞が得られた。
【0142】
そして、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、ＮＫ阻害性分子を発現するＴ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３コンポーネント（具体的にはＴＲＡＣ遺伝子）とＭＨＣ関連遺伝子（具体的にはＢ２ＭとＲＦＸ５）をノックアウトした。具体的には、ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ Ｐｕｌｓｅ Ｍａｘエレクトロポレーション機（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を使用して、４００Ｖ、０．７ｍｓで１０ｕｇ Ｃａｓ９タンパク質および１０ｕｇ ｓｇＲＮＡ（３．３ｕｇ ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（配列番号４３）＋３．３ｕｇ Ｂ２ｍ ｓｇＲＮＡ（配列番号４４）＋３．３ｕｇ ＲＦＸ５ｓｇＲＮＡ（配列番号４５））を活性化ＮＫｉ－Ｔ細胞にエレクトロトランスフェクトした。エレクトロトランスフェクトの直後に、ＮＫｉ－Ｔ細胞を１ｍｌの予熱した培地に入れ、ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、トリプルノックアウトＵＮＫｉ－Ｔ細胞が得られた。ＣＲＩＳＰＲシステムを使用したＴＣＲ／Ｂ２Ｍ／ＲＦＣ５ノックアウトを伴う野生型Ｔ細胞（すなわち、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞）および遺伝子ノックアウトを伴わない野生型Ｔ細胞（すなわち、ＮＴ細胞）をコントロールとして使用した。
【0143】
本実施例によって調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞に含まれるＮＫ阻害性分子の構造を表１に示する。
【0144】
【表1】
【0145】
１１日後、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５５９１６）抗体、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｉ（Ｒ＆Ｄロット番号ＦＡＢ７０９８Ｐ）、およびＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＤＲ,ＤＰ,ＤＱ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号３６１７１４）抗体を使用して、ＵＮＫｉ－Ｔ細胞、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞およびＮＴ細胞におけるＴＣＲ／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩの発現効率をフローサイトメーターで調べた。その結果を表２に示す。
【0146】
【表2】
【0147】
表２から、本発明によって調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＴＣＲ／Ｂ２Ｍ／ＲＦＸ５の発現が効果的に阻害されまたはサイレンシングされることが分かった。
【0148】
また、フローサイトメーターを使用し、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｅ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄロット番号３４２６０４）でＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を検測し（図１）、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｇ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄロット番号３３５９０６）でＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｇ発現を検測し（図２）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎロット番号１３－５７００）、およびＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号Ａ－１１００１）でＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＥ－カドヘリン発現を検測し（図３）、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１０９－０６５－０９７）、およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ発現を検測した（図４）。
【0149】
図１～４から、本発明により調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＮＫ阻害性分子はいずれも有効に発現されていることが分かった。
【0150】
実施例２．ＵＮＫｉ－Ｔ細胞のＮＫ細胞の殺傷に対する阻害効果
【0151】
本実施例で使用したエフェクター細胞はＮＫ９２細胞であった。ＮＫ９２細胞株はＥ－カドヘリンの受容体であるＫＬＲＧ１を発現しないため、ＫＬＲＧ１を過剰発現するＮＫ９２細胞を最初に調製した。
【0152】
ＫＬＲＧ１（配列番号５４）をコードする核酸配列を合成し、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号Ａ１３６０）に順次クローニングし、シーケンシングにより、標的配列が正しく挿入されていることを確認した。該ベクターをＳｐｅＩ酵素で消化し、精製、回収して、線形化されたベクターを得た。そして、メーカーの推奨に従って、線形化されたベクトルをテンプレートとして使用し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ(R) Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号ＡＭ１３４５）を用いてｍＲＮＡを調製し、Ｆａｓｔｐｕｒｅ ｃｅｌｌ／Ｔｉｓｓｕｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔキット（Ｖａｚｙｍｅ、ロット番号ＲＣ１０１－０１）で精製し、精製したｍＲＮＡが得られた。そして、ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ Ｐｕｌｓｅ Ｍａｘエレクトロポレーション機（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を使用して、２０ｕｇの上記の調製された精製ｍＲＮＡを２００Ｖで２ｍｓ間でＮＫ９２細胞にエレクトロトランスフェクトして、ＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞を得た。１６時間後、ＫＬＲＧ１の発現を検測した。結果を図５に示す。ＫＬＲＧ１でトランスフェクトされていないＮＫ９２細胞をコントロールとする。
【0153】
図５からわかるように、ＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞はＫＬＲＧ１を効率的に発現できた。
【0154】
そして、本発明により調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞のＮＫ細胞の殺傷に対する阻害効果を、以下の方法に従って調べた。本発明により調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ －Ｔ細胞をＦａｒ－Ｒｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号Ｃ３４５６４）で標識した。そして、標識されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞とＭｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングし、２：１のエフェクター細胞－標的細胞比でＮＫ９２細胞（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、またはＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖを発現するためのＵＮＫｉ－Ｔ細胞とＭｏｃｋ Ｔ細胞）またはＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞（Ｅ－カドヘリンを発現するためのＵＮＫｉ－Ｔ細胞）を共培養した。１６～１８時間後、培養物におけるＴ細胞の割合をフローサイトメーターで検測し、ＮＫ細胞のＴ細胞に対する殺傷率を計算した。結果を図６に示す。
【0155】
図６からわかるように、ＮＫ阻害性分子を発現しないＭｏｃｋ Ｔ細胞と比較して、ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、Ｅ－カドヘリンなどの阻害性リガンドを含むＮＫ阻害性分子を発現するＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を大幅に低減させることができる。さらに、阻害性リガンドおよび膜貫通ドメインのみを発現するＴ細胞と比較して、共刺激ドメインの加入は、Ｔ細胞によるＮＫ細胞の殺傷に対する阻害をさらに大幅に高めることができる（Ｇ０ ｖｓ Ｇ２８、Ｅ０ ｖｓ Ｅ２８、ＥＣａｄ０ ｖｓ ＥＣａｄ２８を参照）。したがって、本発明によって調製される阻害性リガンド、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子は、ＵＮＫｉ－Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を有意に低減し、ＨｖＧＤのリスクを効果的に低減することができる。
【0156】
実施例３．ＮＫ細胞に対するＵＮＫｉ－Ｔ細胞の殺傷効果
実施例１に記載の方法に従って調製されたＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－ＴおよびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、さらにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１７）を含む点でのみＥ２８－ＵＮＫｉ－ＴおよびＡ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞と相違する。
実施例１に記載の方法に従って調製されたＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－ＴおよびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、さらにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１７）を含む点でのみＥ２８－ＵＮＫｉ－ＴおよびＡ２８－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞と相違する。
【0157】
（１）ＮＫ阻害性分子の発現の検測
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１０９－０６５－０９７）およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ発現を検測した（図７）。フローサイトメーターを使用し、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｅ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄロット番号３４２６０４）でＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を検測した（図８）。
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１０９－０６５－０９７）およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ発現を検測した（図７）。フローサイトメーターを使用し、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｅ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄロット番号３４２６０４）でＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を検測した（図８）。
【0158】
上記の結果から、本発明により作製されたＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＮＫ阻害性分子が有効に発現できる。
【0159】
（２）ＣＤ１０７ａの発現の検測
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）は、細胞質基質に高濃度の、小胞の形で存在する細胞傷害性顆粒が含まれ、リソソーム関連膜タンパク質Ｉ（ＣＤ１０７ａ）は小胞膜タンパク質の主成分である。ＣＴＬ細胞が標的細胞を殺傷するとき、傷害性顆粒が細胞膜に到達して細胞膜と融合し（このときＣＤ１０７ａ分子が細胞膜表面に輸送される）、顆粒内容物の放出が引き起こされ、結果、標的細胞の死になる。このため、ＣＤ１０７ａ分子は、ＣＴＬ細胞脱顆粒の高感度マーカーであり、細胞の殺傷活性を反映することができる。
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）は、細胞質基質に高濃度の、小胞の形で存在する細胞傷害性顆粒が含まれ、リソソーム関連膜タンパク質Ｉ（ＣＤ１０７ａ）は小胞膜タンパク質の主成分である。ＣＴＬ細胞が標的細胞を殺傷するとき、傷害性顆粒が細胞膜に到達して細胞膜と融合し（このときＣＤ１０７ａ分子が細胞膜表面に輸送される）、顆粒内容物の放出が引き起こされ、結果、標的細胞の死になる。このため、ＣＤ１０７ａ分子は、ＣＴＬ細胞脱顆粒の高感度マーカーであり、細胞の殺傷活性を反映することができる。
【0160】
１×１０５個の細胞／ウェルの濃度で標的細胞（ＮＫ９２細胞）を９６ウェルプレートに播種し、そして、１：１の比率で各ウェルにＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞を入れ、同時に、１０μｌ ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５５８０１）を加え、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で共培養した。１時間後、Ｇｏｉｇｓｔｏｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５１－２０９２ＫＺ）を加えてさらに２．５時間インキュベートした。その後、各ウェルに５μｌ ＡＰＣ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号：５５５３６９）、および５μｌ ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号：５６１００５）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、ＣＤ１０７ａの発現をフローサイトメーターで調べた。結果を図９Ａ（ＣＤ４＋Ｔ細胞毒性）および図９Ｂ（ＣＤ８＋Ｔ細胞毒性）に示す。
【0161】
上記の結果から、ＮＫ阻害性分子を発現しないＭｏｃｋ Ｔ細胞は標的細胞に対してほとんど殺傷しないことがわかった。逆に、本発明により調製したＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞と標的細胞とを共培養した後、ＣＤ１０７ａの発現率が有意に上昇し、本発明によるＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、ＮＫ細胞に対する殺傷効果が顕著である。
【0162】
（３）ＩＦＮ－γの分泌の検測
標的細胞（ＮＫ９２細胞）を９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞を各ウェルに１：１の比率で加え、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で共培養し、細胞共培養上清を１８～２４時間後に収集した。
標的細胞（ＮＫ９２細胞）を９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞を各ウェルに１：１の比率で加え、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で共培養し、細胞共培養上清を１８～２４時間後に収集した。
【0163】
捕捉抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号５０６５０２）を使用して９６ウェルプレートに播種し、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗体溶液が除去た。２％ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ、ロット番号Ｖ９００９３３－１ｋｇ）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）溶液を２５０μＬ加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。各ウェルに５０μＬの細胞共培養上清または標準液を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、各ウェルに５０μＬの検出抗体Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ抗体（ＭＤ－１）（Ｂｉｏｔｉｎ）（ａｂｃａｍ、ロット番号ａｂ２５０１７）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。さらにＨＲＰ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号４０５２１０）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、上清を捨て、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）を加え、５回洗浄した。各ウェルに５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加えた。暗所で室温で３０分間反応した後、１ｍｏｌ／Ｌの Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに５０μＬ加えて反応を停止させた。反応を停止してから３０分以内に、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ ｎｍでの吸光度を検測し、標準曲線（標準品の読み取り値と濃度により描画し）によりサイトカインの含有量を計算した。結果を図１０に示す。
【0164】
上記の結果から、本発明のＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞のサイトカインＩＦＮ－γの放出レベルは、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞のレベルよりはるかに高く、これは、ＮＫ９２標的細胞に対する殺傷効果が有意に高くなった。
【0165】
実施例４．ＫＩＲまたはＬＩＲ１を標的とするＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびそのＮＫ細胞の殺傷に対する阻害効果
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、抗ＫＩＲ－ｓｃＦｖ（配列番号５５、および５６を含む）または抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号５７および５８を含み、または配列番号５９および６０を含む）、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号２９）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号９）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＫＩＲＧ４、ＬＩＲＧ４－１およびＬＩＲＧ４－２プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、抗ＫＩＲ－ｓｃＦｖ（配列番号５５、および５６を含む）または抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号５７および５８を含み、または配列番号５９および６０を含む）、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号２９）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号９）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＫＩＲＧ４、ＬＩＲＧ４－１およびＬＩＲＧ４－２プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
【0166】
実施例１のノックアウトおよび感染法に従ってＵＮＫｉ－Ｔ細胞を調製し、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５５９１６）抗体、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｉ（Ｒ＆Ｄロット番号ＦＡＢ７０９８Ｐ）、およびＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＤＲ,ＤＰ,ＤＱ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号３６１７１４）抗体を使用して、フローサイトメーターによってＵＮＫｉ－Ｔ細胞、モックＴ細胞およびＮＴ細胞におけるＣＤ３／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩの発現効率を調べた。結果を表３に示す。
【0167】
【表3】
【0168】
表３から、本発明によって調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞およびモックＴ細胞におけるＣＤ３／ＨＬＡ－Ｉ／ＨＬＡ－ＩＩの発現が効果的に阻害されまたはサイレンシングされたことがわかった。
【0169】
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１０９－０６５－０９７）、およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＫＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるｓｃＦｖ発現を検測した。結果を図１１に示す。ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ロット番号１６０１４－Ｈ０２Ｈ）を一次抗体として用い、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号４０９３０６）を二次抗体として用い、ＬＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－１Ｔ細胞およびＬＩＲＧ４－ＵＮＫｉ－２Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現を検測した。結果を図１２に示す。図１１および図１２から、本発明によって調製されたＵＮＫｉ－Ｔ細胞のｓｃＦｖがいずれも有効に発現されていることが分かった。
【0170】
実施例２の方法に従ってＵＮＫｉ－Ｔ細胞とＮＫ９２細胞を共培養し、ＮＫ細胞の殺傷に対するＵＮＫｉ－Ｔ細胞の阻害効果を調べた。結果を図１３に示す。上記の結果から、Ｍｏｃｋ Ｔと比較して、本実施例で調製されたＫＩＲ（図１３Ａ）またはＬＩＲ１（図１３Ｂ）を標的とするＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を大幅に低減させることができる。
【0171】
実施例５．ＳＩＧＬＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、またはＫＬＲＧ１を標的とするＴ細胞とそのＮＫ細胞の殺傷に対する阻害効果
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、抗ＳＩＧＬＥＣ７－ｓｃＦｖ（配列番号１３０）、抗ＳＩＧＬＥＣ７／ＳＩＧＬＥＣ９－ｓｃＦｖ（配列番号１８４）または抗ＫＬＲＧ１－ｓｃＦｖ（配列番号１１９）、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号２９）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号９）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＳＣ７Ｇ４、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４、およびＫ１Ｇ４プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号２１）、抗ＳＩＧＬＥＣ７－ｓｃＦｖ（配列番号１３０）、抗ＳＩＧＬＥＣ７／ＳＩＧＬＥＣ９－ｓｃＦｖ（配列番号１８４）または抗ＫＬＲＧ１－ｓｃＦｖ（配列番号１１９）、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号２９）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号９）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＳＣ７Ｇ４、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４、およびＫ１Ｇ４プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
【0172】
上記プラスミドを実施例１の方法に従ってＴ細胞に移し、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトして、ＮＫ阻害性分子を発現するとともにＢ２ＭがノックアウトされたＮＫｉ－Ｔ細胞（すなわち、ＳＣ７Ｇ４－Ｔ細胞、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４－Ｔ細胞およびＫ１Ｇ４－Ｔ細胞）を得た。Ｂ２ＭがノックアウトされただけのＴ細胞をネガティブコントロール（ＮＴ）として使用した。
【0173】
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１１５－０６６－０７２）、およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＳＣ７Ｇ４、ＳＣ７／ＳＣ９Ｇ４およびＫ１Ｇ４Ｔ細胞におけるｓｃＦｖ発現を検測した。結果を図１４に示す。上記の結果から、本発明によって調製されたＮＫｉ－Ｔ細胞のｓｃＦｖがいずれも有効に発現されていることが分かった。
【0174】
実施例２に記載の方法に従って、上記のＮＫｉ－Ｔ細胞とＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞とを共培養して、そのＮＫ細胞殺傷に対する阻害効果を調べた。結果を図１５に示す。上記の結果から、ＮＴと比較して、本実施例によって調製されたＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはＫＬＲＧ１を標的とするＴ細胞は、ＮＫ細胞のＴ細胞に対する殺傷効果を大幅に低減することができる。
【0175】
実施例６．ＰＤ－１を標的とするＴ細胞とＮＫ細胞増殖に対するそれらの阻害効果
ＰＤＬ１シグナルペプチド（配列番号１２１）、ＰＤＬ１細胞外領域（配列番号７０）、ＰＤＬ１膜貫通領域（配列番号１２０）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、ｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＰＤＬ１プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
ＰＤＬ１シグナルペプチド（配列番号１２１）、ＰＤＬ１細胞外領域（配列番号７０）、ＰＤＬ１膜貫通領域（配列番号１２０）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号１３）のコード配列を合成し、ｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、ロット番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順次クローニングし、ＰＤＬ１プラスミドが得られ、シーケンシングにより、プラスミドに標的配列が正しく挿入されていることを確認した。
【0176】
上記プラスミドを実施例１の方法に従ってＴ細胞に移して、ＮＫ阻害性分子を発現するＮＫｉ－Ｔ細胞、すなわちＰＤＬ１－Ｔ細胞を得た。Ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１Ａｎｔｉｂｏｄｙ（メーカー：ソレイボ、ロット番号：１００８４－Ｒ３１２－Ａ）を用いてその発現を調べた。結果を図１６に示す。上記の結果から、ＰＤＬ１は有効に発現されている。未処理のＴ細胞をネガティブコントロール（ＮＴ）として使用した。
【0177】
上記のＮＫｉ－Ｔ細胞を培養し、細胞マイトマイシンＣで処理し、２つの同種異系由来のＰＢＭＣ（ｄｏｎｏｒ１およびｄｏｎｏｒ２）をＦａｒ－Ｒｅｄで標識し、Ｔ細胞：ＰＢＭＣ＝１：２の比率で共培養を行った。２～３日ごとにハーフ培地交換処理を行っていた。８日後、細胞をカウントし、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３（メーカー：ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号：３１７３０８）、およびＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ５６（メーカー：ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号：３６２５４６）を使用して染色し、その後、ＮＫ細胞集団比をフローサイトメトリーにより調べた。細胞の総数＊ＮＫ細胞集団比によってＮＫ細胞の数を計算した。結果を図１７に示す。上記の結果から、ＰＤ－１を標的とするＮＫｉ－Ｔ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を顕著に阻害することができる。
【0178】
実施例７．ＫＩＲを標的とするＢ細胞およびＨｕｈ７細胞のＮＫ細胞殺傷に対する阻害効果
【0179】
実施例４で調製したＫＩＲＧ４プラスミドを、実施例１の方法に従って、Ｂ細胞およびＨｕｈ７細胞（肝臓がん細胞）に移し、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトして、ＮＫ阻害性分子を発現するとともにＢ２ＭがノックアウトされたＮＫｉ－Ｂ細胞とＮＫｉ－Ｈｕｈ７細胞を得た。Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされただけのＢ細胞およびＨｕｈ７細胞（ＮＣ細胞）をネガティブコントロールとして使用した。
【0180】
Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１０９－０６５－０９７）、およびＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ、ロット番号５５４０６７）でＮＫｉ－Ｂ細胞およびＮＫｉ－Ｈｕｈ７細胞におけるｓｃＦｖ発現を検測した。結果を図１８に示す。上記の結果から、ＮＫ阻害性分子は、Ｂ細胞およびＨｕｈ７細胞において有効に発現されていることが分かった。
【0181】
実施例２の方法に従って上記で調製した細胞とＮＫ細胞を共培養し、ＮＫ細胞の殺傷効果に対する上記細胞の阻害効果を調べた。結果を図１９に示す。上記の結果から、ＮＣ細胞と比較して、本実施例によって調製されたＮＫｉ－Ｂ細胞およびＮＫｉ－Ｈｕｈ７細胞は、いずれもＮＫ細胞の殺傷効果を大幅に低減することができる。
【0182】
なお、上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明を限定することを意図するものではないことに留意されたい。当業者にとって、本発明は、様々な変化および変更を有し得る。本発明の精神および原理の範囲内で行われる変更、均等置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれることが当業者であれば理解できる。
【配列表フリーテキスト】
【0183】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫ阻害性分子であって、
１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害し、前記ＮＫ阻害性分子は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、ＮＫ阻害性分子。
１つまたは複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドがＮＫ阻害性受容体（ＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＫＩＲ）に特異的に結合して、ＮＫ細胞による、前記ＮＫ阻害性分子を発現する遺伝子改変免疫細胞に対する殺傷を阻害し、前記ＮＫ阻害性分子は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、ＮＫ阻害性分子。
【請求項2】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲの天然リガンド、ＮＫＩＲを標的とする抗体、またはそれに含まれるＮＫＩＲ結合領域である、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項3】
前記ＮＫＩＲは、免疫チェックポイント受容体、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、Ｌｙ４９ファミリーメンバーおよびキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択される、請求項１または２に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項4】
前記免疫チェックポイント受容体は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３から選択され、前記ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＢおよびＣＤ９４から選択され、前記ＫＩＲファミリーメンバーは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３から選択され、前記ＬＩＲファミリーメンバーは、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８から選択され、前記ＮＫＲ－Ｐ１ファミリーメンバーは、ＮＫＲ－Ｐ１ＢおよびＮＫＲ－Ｐ１Ｄから選択され、前記ＳＩＧＬＥＣファミリーメンバーは、ＳＩＧＬＥＣ７、およびＳＩＧＬＥＣ９から選択され、前記Ｌｙ４９ファミリーメンバーは、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、およびＬｙ４９Ｇ４から選択される、請求項３に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項5】
前記ＮＫＩＲは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、およびＫＬＲＧ１から選択される、請求項３または４に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項6】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＩＲを標的とする抗体またはその機能的フラグメントであり、前記抗体またはその機能的フラグメントは、無傷の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ、またはナノ抗体から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項7】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＲ１、ＫＩＲ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、および／またはＫＬＲＧ１を標的とする抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項8】
（ｉ）前記ＮＫＧ２Ａを標的とする抗体は、（１）配列番号７２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号７５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号７８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉ）前記ＬＩＲ１を標的とする抗体は、（１）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉｉ）前記ＫＩＲを標的とする抗体は、配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、
（ｉｖ）前記ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体は、（１）配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１３６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（４）配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（５）配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１７８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（６）配列番号１８８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１９０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１９３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、および／または
（ｖ）前記ＫＬＲＧ１を標的とする抗体は、（１）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１５１に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１５２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１６１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（４）配列番号１６７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６９に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１７２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含む、
請求項７に記載のＮＫ阻害性分子。
（ｉｉ）前記ＬＩＲ１を標的とする抗体は、（１）配列番号９０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または、（２）配列番号９６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、
（ｉｉｉ）前記ＫＩＲを標的とする抗体は、配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８７に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、
（ｉｖ）前記ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９またはその両方を標的とする抗体は、（１）配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１０７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１２７７に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１３１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１３３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１３４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１３６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（４）配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１４２に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１４３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（５）配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７７に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１７８に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７９に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１８０に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１８１に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（６）配列番号１８８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１８９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１９０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１９１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１９３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含み、および／または
（ｖ）前記ＫＬＲＧ１を標的とする抗体は、（１）配列番号１１１に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１２に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（２）配列番号１４９に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１５１に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１５２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｈ３、（３）配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６０に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１６１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６２に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６３に示されるＣＤＲ－Ｈ３、または（４）配列番号１６７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１６８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１６９に示されるＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１７０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１７１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１７２に示されるＣＤＲ－Ｈ３、を含む、
請求項７に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項9】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、およびそれらに含まれるＮＫＩＲ結合領域から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項10】
前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域、ＰＤ－Ｌ２細胞外領域、シアル酸、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｆ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、およびＥ－カドヘリン細胞外領域から選択される、請求項９に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項11】
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１細胞外領域は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ２細胞外領域は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）前記ＨＬＡ－Ｅの細胞外領域は、配列番号３１または３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｖ）前記ＨＬＡ－Ｇの細胞外領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｖ）Ｅ－カドヘリン細胞外領域は、配列番号３９または４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する、
請求項１０に記載のＮＫ阻害性分子。
（ｉｉ）ＰＤ－Ｌ２細胞外領域は、配列番号７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）前記ＨＬＡ－Ｅの細胞外領域は、配列番号３１または３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｉｖ）前記ＨＬＡ－Ｇの細胞外領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有し、
（ｖ）Ｅ－カドヘリン細胞外領域は、配列番号３９または４１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％または１００％の配列同一性を有する、
請求項１０に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬのタンパク質の膜貫通ドメインから選択される、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項13】
前記共刺激ドメインは、ＬＴＢ、ＣＤ９４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、およびそれらの組み合わせのタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１に記載のＮＫ阻害性分子。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子をコードする、核酸分子。
【請求項15】
請求項１４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項16】
（１）請求項１～１３のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子を発現し、および（２）少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする遺伝子改変免疫細胞。
【請求項17】
前記遺伝子改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体をさらに発現し、前記キメラ抗原受容体がリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項18】
前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項19】
前記少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１８に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項20】
前記ＭＨＣ関連遺伝子はＢ２Ｍを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドは、Ｂ２Ｍおよび非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子の細胞外領域の融合分子である、請求項１９に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項21】
前記非古典的なＨＬＡ－Ｉ分子は、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇである、請求項２０に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項22】
前記ＮＫ阻害性分子は、配列番号４６～５３からなる群から選択される提示ペプチドをさらに含む、請求項２０に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項23】
前記遺伝子改変免疫細胞の少なくとも１種のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされ、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項24】
ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３から選択される１種または複数種の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを特徴とする、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項25】
前記リガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ａ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＡＣ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＶＥＧＦ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＥＧＰ４０、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４、ＣＤ１３３、ＩＦＮＡＲ１、ＤＬＬ３、ｋａｐｐａ軽鎖、ＴＩＭ３、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｔＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ抗原、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＷＴ－１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＤＬ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される標的に結合する、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項26】
前記標的は、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン、Ｃｌｕａｄｉｎ１８．２、ＲＯＲ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２５に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項27】
前記遺伝子改変免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項28】
前記遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞またはαβ－Ｔ細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項29】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、または請求項１６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞、および一種または複数種の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項30】
がん、感染症または自己免疫疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＮＫ阻害性分子、請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクターまたは請求項１６～２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変免疫細胞の使用。